KR102119307B1 - 버드나무속 식물 추출물을 이용한 항염증용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은, LPS(lipopolysaccharide)로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 cells)에서 농도 의존적으로 NO 생성을 억제하고 염증매개인자인 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하며, MAPKs(JIN 및 ERK) 활성화를 억제하는 활성을 가진 버드나무속 식물 추출물을 이용한 항염증용 조성물을 개시한다.

Description

버드나무속 식물 추출물을 이용한 항염증용 조성물{Composition for Anti-inflammation Using Extract of Salix sp. Plant}

본 발명은 버드나무 속 식물(Salix sp.) 식물 추출물을 이용한 항염증용 조성물에 관한 것이다.

염증은 물리적인 외상, 유해한 화학물질, 박테리아, 곰팡이, 바이러스에 의한 감염이나 생체 내 대사산물 중의 자극성 물질에 의하여 야기되는 병리적 상태에 대응하여 나타나는 국소적인 생체의 방어 반응이다. 염증은 손상된 조직과 이동하는 세포(migrating cells)로부터 생산되는 다양한 염증 매개 인자에 의하여 촉발된다. 염증 반응 시에는 염증 부위에 혈장이 축적되어 세균이 분비한 독성을 희석시키며, 혈류가 증가하고, 홍반, 통증, 부종, 발열 등의 증상이 수반되게 된다. 정상적인 경우에 생체는 염증 반응을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키지만, 그렇지 못한 경우에는 만성 염증과 같은 질병 상태로 진행되기도 한다.

최근 분자생물학의 발달로 분자적 수준에서 염증 반응에 대한 많은 연구가 이루어져 있다.

염증 반응에는 다양한 생화학적 현상이 관여하지만, 특히 대식세포(Macrophage)는 화학적 자극 등에 의하여 산화질소(NO)와 여러 염증성 사이토카인을 생성하여 염증반응에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Ito T., et al., Curr Drug Traget Inflamm Allergy, 2(3):257-265, 2003). 산화질소는 산화질소의 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)의 작용에 의하여 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 합성되는데, NOS는 몇 가지 이소 형태가 존재한다. 뇌에 존재하는 bNOS(brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관 내피계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등은 체내에서 항상 일정수준으로 발현되고 있으며, 이들에 의해 소량 생성되는 일산화질소(NO)는 혈압 조절 작용, 신경 전달 작용, 학습, 기억 등과 관련된 다양한 생리 반응을 수행함으로써 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 수행한다. 이에 반하여 어떤 자극에 의하여 그 발현이 유도되는 iNOS(induced NOS)는 NO를 과다 생성하며, iNOS에 의해 과다 생성된 산화질소는 수퍼옥사이드(superoxide)와 반응하여 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 형성하고 이는 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 입힘으로써 염증과 암을 포함한 다양한 병리적 과정에 관여한다(Gupta SC et al., Exp Biol Med., 236:658-671, 2011; Riehemann et al., FEBS Lett., 442:89-94, 1999;Stamleret al., Science, 258:1898-1902, 1992).

한편 시클로옥시게나제(cyclooxygenase, COX)는 COX의 기능과 함께 하이드로퍼옥시다제(hydroperoxidase, HOX) 활성을 가지고 아라키돈산으로부터 중간체인 PGG₂와 PGH₂를 합성하며, 이들 화합물로 PGE₂, PGF₂, PGD₂, 프로스타시클린 및 트롬복산A₂(thromboxane A2, TxA2)를 생성하는데, COX에도 2종류의 이소 형태가 존재한다. COX-1은 대부분의 조직에 항시 발현되어 세포 보호 작용에 필요한 프로스타글란딘(PGs)을 합성하는 데 반하여, COX-2는 염증 반응 시 신속히 그 발현이 유도되어 PGE₂ 등을 생성함으로써 염증 반응을 일으키는 데 중요한 역할을 수행한다(Weisz A., Biochem. J., 316:209-215, 1996;(Miller M. J. et al., Mediators of inflammation, 4:387-396, 1995: Appleton L. et al., Adv. Pharmacol., 35:27-28, 1996).

최근 연구에서는 대식세포의 활성화가 MAPKs(mitogen-activated protein kinases)와 관련되어 있다고 보고되어 있다(KSBB J. 2015, 30:182-190). MAPKs는 각종 세포증식인자, 발암 촉진제 등의 자극에 의하여 활성화되는 세린-트레오닌 단백질 인산화 효소로, 주요하게는 ERK(extra cellular signal-regulated kinase), JNK(c-jun NH₂-terminal kinase), p-38 등이 있으며, 대식세포가 LPS에 의해 자극을 받으면 신속하게 활성화되어 염증성 사이토카인의 생성을 유도한다(KSBB J. 2015, 30:182-190; Microbiol. Biotechnol. Lett. 2016, 44(4), 479-.487).

현재 항염증제로서 널리 사용되고 있는 비스테로이드성 소염제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDS)는 위장관 장애, 간장애, 신장애 등의 심각한 부작용을 야기한다고 알려져 있다(Rainsford KD., Subcell biochem., 42:3-27, 2007; Guruprasad P. Aithal.,Rheumatology., 7:139-150, 2011; Praveen P. N. Rao et al.,Pharmaceuticals., 3:1530-1549, 2010).

따라서 항염 활성을 가지면서 부작용이 적고 효과가 지속적인 새로운 약물의 개발이 여전히 필요하다고 할 수 있다.

버드나무(salix)속에 속하는 우리나라 자생식물은 선버들(Salix subfragilis Andersson)을 비롯하여 44종이 자생하고 있다. 일반적으로 널리 알려져 있는 살리실산(salicylic acid)는 버드나무(salix)속 중 흰버드나무(Salix Alba)의 수피에서 분리한 살리신(salicin)에서 유래하였다. 흰버드나무는 우리자라에는 자생하고 않고 유럽, 중앙아시아, 아프리카에 분포하고 있다.

본 발명에서는 국내에서 자생하는 버드나무 속 식물의 항염증 활성을 개시한다.

본 발명의 목적은 버드나무 속 식물 추출물을 이용한 항염증용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 버드나무 속 식물 추출물이, LPS(lipopolysaccharide)로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 cells)에서 농도 의존적으로 NO 생성을 억제하고 염증매개인자인 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하며, MAPKs(JIN 및 ERK) 활성화를 억제함을 확인함으로써 완성된 것이다.

전술한 바를 고려할 때, 본 발명은 버드나무 속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것으로, 특히 선버들(Salix subfragilis Andersson) 추출물, 버드나무(Salix koreensis ANDERSS) 추출물, 왕버들(Salix chaenomeloides Kimura) 추출물, 참오글잎버들(Salix siuzevii Seem) 추출물, 갯버들(Salix gracilistyla) 추출물 또는 키버들(Salix koriyanagi Kimura) 추출물을 유효성분으로 항염증용 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서, "버드나무 속 식물 추출물"이란 추출 대상인 버드나무 속 식물의 줄기, 가지, 잎, 열매, 꽃, 뿌리, 수피(줄기, 가지 및/또는 뿌리의 껍질) 등을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매, 특히 60% 내지 90%의 에탄올 수용액으로 추출(침지 또는 증류)하여 얻어진 것을 의미한다.

또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서, "항염증"은 아래에서 정의되는 염증성 질환의 개선(증상의 경감), 치료, 그러한 질환의 발병 억제 또는 지연을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, 상기 "염증성 질환"이란 외부의 물리·화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염 또는 자가면역에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 염증 반응이 일으키는 병리적 증상으로서 정의될 있다. 이러한 염증 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6 등의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유종, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염(아토피성 피부염 포함), 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다.

본 발명의 항염증용 조성물은 그 유효성분을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 염증성 질환의 개선 활성 등을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 염증성 질환 등의 개선, 치료, 또는 그러한 병리적 증상의 발병 억제/지연 등 의도한 의료적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 항염증용 조성물은 유효성분 이외에, 항염증 효과의 상승·보강을 위하여 또는 항알러지 활성, 피부 보호 활성(자외선에 의한 피부 손상 억제, 피부 보습 등) 등 유사활성의 부가를 통한 복용이나 섭취의 편리성을 증진시키기 위하여, 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성을 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

이러한 화합물 또는 추출물에는 각국 약전(한국에서는 "대한민국약전"), 각국 건강기능식품공전(한국에서는 식약처 고시인 "건강기능식품 기준 및 규격"임) 등의 공정서에 실려 있는 화합물 또는 추출물, 의약품의 제조·판매를 규율하는 각국의 법률(한국에서는 "약사법"임)에 따라 품목 허가를 받은 화합물 또는 추출물, 건강기능식품의 제조·판매를 규율하는 각국 법률(한국에서는 「건강기능식품에관한법률」임)에 따라 개별적으로 기능성을 인정받은 화합물 또는 추출물이 포함된다. 예컨대 한국 건강기능식품공전상의 '관절염 개선' 기능성을 가진 MSM(dimethylsulfonylmethane), '관절염 개선' 기능성과 '피부 보습' 기능성을 가진 N-아세틸글루코사민 등과, 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따라 '과민 면역반응 완화'로 개별적으로 기능성을 인정받은 Enterococcus faecalis 가열 처리 건조 분말, 구아바 잎 추출물 등의 복합물, 다래 추출물, 소엽 추출물, 피카오프레토 분말 등의 복합물, PLAG(1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetyl-rac-glycerol) 등과, '과민피부상태 개선'으로 개별적으로 기능성을 인정받은 L. sakei Probio 65, 감마리놀렌산 함유 유지, 과채 유래 유산균인 L.plantarum CJLP133, 프로바이오틱스 ATP 등이 이러한 화합물 또는 추출물에 해당할 것이다.

이러한 화합물 또는 천연 추출물은 본 발명의 항염증용 조성물에 그 유효성분과 함께 하나 이상 포함될 수 있다.

본 발명의 항염증용 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구르트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다.

또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따른 건강기능식품이거나, 한국 「식품위생법」의 식품공전(식약처 고시 「식품의 기준 및 규격」)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조·유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 「식품위생법」임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 「식품첨가물 기준 및 규격」)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.

감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.

그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산 칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화 크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 투여 경로는 국소 경로, 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로일 수 있으며, 두 가지 이상의 경로를 조합하여 사용할 수도 있다. 두 가지 이상 경로의 조합의 예는 투여 경로에 따른 두 가지 이상의 제형의 약물이 조합된 경우로서 예컨대 1차로 어느 한 약물은 정맥 내 경로로 투여하고 2차로 다른 약물은 국소 경로로 투여하는 경우이다.

약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 "대한민국약전"을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유, 에탄올, 그리세롤 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라적절한 결합제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 희석제 등을 포함시킬 수 있다. 적절한 결합제로서는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페리스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 글루코스, 옥수수 감미제, 소듐 알지네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 들 수 있고, 윤활제로서는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 초산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈쿰, 스테아르산, 그것의 마그네슘염과 칼슘염, 폴리데틸렌글리콜 등을 들 수 있으며, 붕해제로서는 전분, 메틸 셀룰로스, 아가(agar), 벤토나이트, 잔탄 검, 전분, 알긴산 또는 그것의 소듐 염 등을 들 수 있다. 또 희석제로서는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소비톨, 셀룰로스, 글라이신 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 수성 등장 용액 또는 현탁액을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 담체로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.

약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어서, 화장료 조성물로 파악할 수 있다. 본 발명의 조성물이 화장품 조성물로 파악될 경우 그 용도는 염증성 피부 트러블 억제, 염증성 피부 자극 완화 등의 용도로 이해될 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 파악될 경우에도 그 화장료 조성물은 그 용도상, 법률상 임의의 제품 구분을 띨 수 있으며, 구체적으로 피부 트러블 개선, 아토피 피부염 개선 등의 용도를 가진 기능성 화장품, 비기능성 일반 화장품 등일 수 있다. 제품 형태에 있어서도 임의의 제품 형태를 띨 수 있는데, 구체적으로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등의 제품 형태를 띨 수 있다. 구체적인 제품 형태에 있어서는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형 등일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 비타민, 색소 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되는데, 구체적으로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 항염증 활성을 나타내는 그 유효성분을 포함하는 것을 제외하고는 당업계에 통상적으로 행하여지는 화장료 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 버드나무 속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물에 관한 것으로, 특히 선버들(Salix subfragilis Andersson) 추출물, 버드나무(Salix koreensis ANDERSS) 추출물, 왕버들(Salix chaenomeloides Kimura) 추출물, 참오글잎버들(Salix siuzevii Seem) 추출물, 갯버들(Salix gracilistyla) 추출물 또는 키버들(Salix koriyanagi Kimura) 추출물을 유효성분으로 항산화용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 항산화용 조성물과 관련하여 추출물의 의미, 유효량, 구체적인 제품 형태 등에 대해서는 전술한 바의 본 발명의 항염증용 조성물에서 설명한 바가 그대로 준용된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 버드나무 속 식물 추출물을 이용한 항염증용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 항염증용 조성물은 염증성 질환의 개선 등의 용도, 염증성 피부 자극의 완화 용도 등으로 식품, 화장품, 약품 등으로 제품화될 수 있다.

도 1은 버드나무 속 식물 추출물의 Raw264.7에 대한 세포독성 측정 결과이다.
도 2는 LPS로 자극된 대식세포에서 버드나무 속 식물 추출물의 NO 생성 억제 활성을 보여주는 결과이다.
도 3은 대식세포에서 버드나무 속 식물 추출물의 ROS 생성 억제 활성을 보여주는 결과이다.
도 4는 LPS로 자극된 대식세포에서 버드나무 속 식물 추출물의 iNOS 발현 억제 활성을 보여주는 결과이다.
도 5는 LPS로 자극된 대식세포에서 버드나무 속 식물 추출물의 COX-2 발현 억제 활성을 보여주는 결과이다.
도 6 및 도 7은 LPS로 자극된 대식세포에서 버드나무 속 식물 추출물의 MAPKs(JIN 및 ERK) 인산화 억제 활성을 보여주는 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예> 버드나무 속 식물 추출물 준비

본 실험에 사용된 버드나무 속 식물은 버드나무 속 식물 건조 분말에 10배 중량의 70% 에탄올을 실온에서 24시간 동안 3회 추출 후 여과 (Whatman No.2)한 여액을 rotary vacuum evaporator (EYELA. Japan)로 농축 후 동결건조 하여 실험 때까지 -20℃에 보관하여 사용하였다.

구체적인 버드나무 속 식물, 추출 부위 등은 아래의 표 1을 참조할 수 있다.

< 실험예 > 살리신 함량 측정, 항염증 활성 등

<실험예 1> 살리신 함량 분석 및 항염증 활성의 평가

1. 실험 방법

1.1 살리신 함량 측정

살리신 함량 분석은 "의약품등 분석법의 밸리데이션에 대한 가이드라인"에 따라 수행되었다. 실험에 사용한 표준품은 D-(-)-Salicin(시그마, S0625-5G)를 사용하였다. 살리신 분석을 위한 HPLC 조건은 표 2와 같다.

1.2 RAW264.7 세포 배양 및 분화

Murine의 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로 부터 구입하였고, DMEM에 10% inactivated fetal bovine serum과 1% penicillin/streptomycin을 첨가한 배지를 배양액으로 37℃, 5% CO₂ ncubator (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 배양하였다.

실험과정의 모든 세포는 80~90% 정도의 밀도로 자랄 때까지 계대 배양하였고, 20 passages를 넘기지 않은 세포만 사용하였다.

1.3 세포독성 평가

추출물의 세포독성은 탈수소 효소작용에 의해 노란색의 수용성 기질인 Tetrazolium salts(WST-1)을 formazan으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하여 간접적으로 세포생존율을 측정하는 WST-1 cell proliferation assay 방법을 통해 측정하였다.

RAW 264.7 cell을 1×10⁶ cells/mL 농도로 well plate에 분주하고 24시간 배양 후, FBS free 배지에 추출물을 농도별(10, 50, 100 μg/mL)로 첨가한 후 24시간 배양하였다. 그 후 WST-1 시약을 첨가하여 37℃에서 1시간 동 안 반응시킨 후 ELISA reader를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정 하였다

1.4 추출물 처리에 의한 NO 생성량 평가

배양액 내의 nitrite 농도를 griess 반응을 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 2.5×10⁵ cells/mL로 조절한 후 24-well plate에 접종하고 5% CO₂ incubator에서 24시간 전 배양하였다. FBS free 배지에 추출물을 농도별(10, 25, 50 μg/mL)로 희석하여 처리한 후 1시간 후에 0.1 μg/mL의 LPS를 처리하여 24시 간 재 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후, 동량의 griess 시약 (1% sulfanilamide + 0.1% naphthylendiamine dihydrochloride, 1:1)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시키고, microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도는 sodium nitrite (NaNO₂)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다.

1.5 추출물처리에 의한 ROS 생성억제 평가

RAW264.7 세포를 96-well plate에 1×10⁵ cells/mL의 농도로 희석하여 100㎕씩 분주한 후 37℃, 5% CO2 incubator 에서 24시간 배양한다. 배양 후 배지를 모두 제거하고 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 농도별(10, 25, 50μg/mL)로 희석된 시료를 well 당 100ul씩 처리하여 준 후 24 시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 PBS 200㎕를 넣은 후 3회 세척하였다. DMSO 에 녹아 있는 DCFH-DA 를 20uM (in PBS)로 희석하여 well에 100μL 넣은 후 37℃, 5% CO₂ incubator 에서 20분간 배양하였다. DCFH-DA를 제거한 후 PBS 200~300㎕를 넣어 3회 세척한 후, 100uM의 H₂O₂를 (in PBS) 희석하여 각 well에 100㎕를 넣은 후 incubator에서 5분간 배양한 후, ELISA reader를 이용하여 형광값(485nm/535nm)을 측정하여 NC(negative control)의 배수 값으로 나타내었다.

1.6 Western blot을 통한 iNOS, COX-2 단백질 발현 측정

세포질 내 생성되는 iNOS와 COX-2의 발현량에 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포에 LPS(0.1 μg/mL)와 추출물(10, 25, 50 μg/mL)를 처리한 후, iNOS, COX-2 단백질 발현량 측정을 위해서는 20시간 동안 배양하였다.

배양이 끝난 세포를 수집하여 3회 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 후, Protease and phosphatase inhibitor(Thermo science)가 첨가된 RIPA buffer(Sigma)를 이용하였으며, 30분간 4℃에서 lysis시킨 후 15,000rpm에서 30분간 원심분리하여 얻어진 상층액은 10 % SDS polyacrylamide gel로 전기영동을 통해 단백질을 분리한 뒤 Nitro cellulose membranes (#1620112, BIO-RAD, Germany)으로 transfer하였다. 1차 항체는 Actin(SC-1616, SCBT, USA) , iNOS (#610333, BD, USA), COX-2(SC-1747, SCBT, USA) 항체를 사용하였고 2차 항체로는 HRP-conjugated anti-rabbit(1:5000)와 HRP-conjugated anti-goat (1:5000)을 사용하였다. 각각의 단백질 발현양은 Chemidoc XRS+ with Image Lab software(BIO-RAD, USA)를 이용하여 분석하였다.

1.7 Western blot을 통한 MAPKs(JNK, ERK, p38) 인산화 분석

인산화된 MAPKs의 발현량을 알아보기 위하여 RAW 264.7세포를 1×10⁶ cells/mL으로 18시간 전 배양하고 추출물을 농도별로 처리하여 15분 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포를 수집하여 3회 phosphate buffered saline(PBS)으로 세척한 후, Protease and phosphatase inhibitor(Thermo science)가 첨가된 RIPA buffer(Sigma)를 이용하였으며, 30분간 4℃에서 lysis시킨 후 15,000rpm에서 30분간 원심분리하여 얻어진 상층액은 10% SDS polyacrylamide gel로 전기영동을 통해 단백질을 분리한 뒤 Nitro cellulose membranes(#1620112, BIO-RAD, Germany)으로 transfer하였다. 1차 항체는 pERK(#9101, Cell signaling, USA), ERK(#9102, Cell signaling, USA), p-p38(#9211, Cell signaling, USA), p38(#9212, Cell signaling, USA), pJNK(#9251, Cell signaling, USA)와 JNK(#9258, Cell signaling, USA) 항체를 사용하였고 2차 항체로는 HRP-conjugated anti-rabbit(1:5000)을 사용하였다. 각각의 단백질 발현양은 Chemidoc XRS+ with Image Lab software(BIO-RAD, USA)를 이용하여 분석하였다.

2. 실험 결과

2.1 살리신 함량 분석 결과

버드나무 속 식물의 살리신 함량을 측정한 결과를 아래의 표 3에 나타내었다. 살리신은 함염 활성을 나타내는 것으로 알려진 물질로, 아래 표에서 확인되듯이 대부분의 버드나무 속 식물 추출물에서 살리신이 검출되었으나, 참오글잎버들 가지 추출물, 참오글잎버들 꽃 및 잎 혼합 추출물, 갯버들 가지 추출물에서는 검출되지 않았다.

2.2 세포독성 평가 결과

세포독성 평가 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 확인되는 바와 같이, 참오글입버들 및 키버들 잔가지 추출물에서 100μg/mL의 농도에서 80% 이하의 세포생존을 나타내었으며 그 외 시료에서는 세포독성이 나타나지 않았다. 이후 시험에서는 세포독성이 없는 50μg/mL 이하의 농도에서 진행하였으며, 양성대조군으로는 살리신을 사용하였다.

2.3 NO 생성 억제 평가 결과

NO 생성 억제 평가 결과를 도 2에 나타내었는데, 도 2에서 확인되는 바와 같이, 양성대조군을 비롯한 모든 버드나무 속 식물 추출물이 농도 의존적으로 NO 생성 억제 활성을 나타내었다.

2.4 ROS 생성 억제 평가 결과

ROS 생성 억제 평가 결과를 도 3에 나타내었는데, 도 3에서 확인되는 바와 같이, 대체로 버드나무 속 식물 추출물은 농도 의존적으로 ROS 생성 억제 활성을 보였다.

2.5 iNOS 및 COX-2 단백질 발현량 측정 결과

iNOS 및 COX-2 단백질 발현량 측정 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었는데, 양성대조군을 제외하고 모든 버드나무 속 식물 추출물은 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현을 억제하였다.

2.6 MAPKs 인산화 분석 결과

MAPKs 인산화 분석 결과를 도 6 및 7에 나타내었는데, 버드나무 속 식물 추출물은 대체로 농도 의존적으로 JIN 및 ERK의 인산화(활성화)를 억제하였다.

<실험예 2> 항산화 활성 실험

1. 실험 방법 - DPPH assay

준비된 시료를 3.15, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/ml의 농도로 메탄올에 녹여 제조한 시료에 0.2 mM의 DPPH를 가하고 실온에서 30분간 반응하였다. 반응이 끝난 뒤 515 nm에서 흡광도 (Multiplater spectrophotometer ELx800TM, BioTek, USA)를 측정하여 농도에 따른 DPPH 라디칼 소거능을 아래식으로 확인하였다. 시료를 첨가하지 않은 음성대조군과 비교하여 자유라디칼 소거활성은 백분율로 나타내고, 양성대조군으로 아스코빅산(ascorbic acid), 쿼세틴(quercetin)을 사용하였다.

소거활성 (%) = [1-(A1-A2)/A0]×100

A0: Control의 흡광도

A1: Sample의 흡광도

A2: Blank(without sample)의 흡광도

2. 실험 결과

상기 DPPH 소거 활성 실험 결과를 50% 소거 활성에 해당하는 농도인 IC₅₀으로 아래의 표 4에 나타내었다. 아래의 표를 참조하여 보면, 왕버들 수피 추출물의 DPPH 소거 활성(IC₅₀=8.63 μg/ml)이 가장 높았다.

Claims (7)

1. 버드나무 속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하되,
   상기 버드나무 속 식물 추출물은 (i) 선버들 가지 추출물, (ii) 선버들 꽃과 잎 혼합 추출물, (iii) 왕버들 가지 추출물, (iv) 왕버들 꽃과 잎 혼합 추출물, (v) 왕버들 수피 추출물, (vi) 참오글잎버들 가지 추출물, (vii) 참오글잎버들 꽃과 잎 혼합 추출물, (viii) 갯버들 가지 추출물, (ix) 갯버들 꽃과 잎 혼합 추출물, (x) 키버들 가지 추출물, 및 (xi) 키버들 꽃과 잎 혼합 추출물로 구성된 군에서 선택된 추출물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 버드나무 속 식물의 잎을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 얻어진 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 혼합용매는 70% 에탄올일 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
   
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
   
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
   
7. 왕버들 수피 추출물을 유효성분으로 하는 항산화용 식품 조성물.
   
   

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