KR102131076B1

KR102131076B1 - 십자과 식물 추출물과 Cu(II) 금속화합물과의 복합체를 유효성분으로 함유한 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102131076B1
Application number: KR1020180129058A
Authority: KR
Inventors: 김기옥; 홍승현; 양다운; 주홍구
Original assignee: 재단법인 제주테크노파크
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2020-07-07
Also published as: KR20200047065A

Abstract

본 발명은 십자과(Brassicaceae family) 식물 추출물과 Cu(II) 금속화합물과의 복합체를 유효성분으로 함유한 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 흑무 거피 추출물과 Cu(II) 금속화합물의 혼합처리구에서 강력한 활성산소종(ROS) 유도와 세포자멸사 유도를 확인함으로써, 흑무 거피(peel) 속에 함유된 글루코시놀레이트 성분이 금속이온 킬레이트제로서 구리(Cu) 암 줄기세포를 표적화할 수 있음을 확인함으로써, 상기 글루코시놀레이트 성분이 함유된 십자과(Brassicaceae family) 식물로부터 유래된 추출물과 Cu(II) 금속화합물과의 복합체를 유효성분으로 함유함에 따라 부작용이 최소화된 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

Description

십자과 식물 추출물과 Cu(II) 금속화합물과의 복합체를 유효성분으로 함유한 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING COMPLEX OF BRASSICACEAE FAMILY PLANT EXTRACT AND Cu(II) COMPOUND AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 십자과(Brassicaceae family) 식물 추출물과 Cu(II) 금속화합물과의 복합체를 유효성분으로 함유한 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 글루코시놀레이트 성분이 함유된 십자과(Brassicaceae family) 식물 중 흑무 거피(peel) 추출물과 Cu(II) 금속화합물의 혼합처리구에서 강력한 활성산소종(ROS) 유도와 세포자멸사를 유도하여 우수한 항암 및 함염증성 질환에 유효함으로 확인하고, 원료가 식소재로부터 유래되어 부작용이 최소화된, 십자과 식물 추출물과 Cu(II) 금속화합물과의 복합체를 유효성분으로 함유한 약학적 조성물에 관한 것이다.

생체 내 금속킬레이트 화합물은 주로 금속화합물의 치환(metal compound substitution)과 -SH(sulfhydryls)기의 상호작용으로 복합체를 형성하여, 세포에서 생물학적 막의 지질 과산화를 유도하는 활성 산소 종(reactive oxygen species, 이하, "ROS"라 함) 생성을 유도하여 산화, 인산화의 억제, 전자 전달 시스템의 파괴, DNA 및 단백질과 상호 작용하여 억제, 단백질 기능을 억제할 수 있다.

이중 철(Fe)의 경우는 헤모글로빈이나 싸이토크롬 합성에 사용되며 적혈구의 생산, 번식생리, 면역계, 호르몬 생산, 효소체계에 관여하는 매우 중요한 영양소이다.

아연(Zn)의 경우는 주요 효소의 구성 물질이며 호르몬 합성, 저장, 분비를 촉진하고 단백질 핵산의 합성과 대사에 관여하며 생식기관의 발육과 기능을 가능케 하고 면역 체계를 유지하는 등 신진 대사에 없어서는 안될 중요한 영양소이다.

구리(Cu)는 혈구의 조성에 관계 효소의 성분이며 특히, 성장 촉진에 없어서는 안될 매우 중요한 영양소이다.

따라서, 이상의 주요 미네랄이 결핍되면 면역기능의 저하 생리기능 이상으로 성장과 증식에 문제가 발생하게 된다.

식물로부터 유래된 화학물질(Phytochemical) 중 하나인 커큐민(Curcumin)은 알츠하이머 질병(AD)를 예방하는 대표적인 천연물로 알려져 있으며, 사례로는 켜큐민을 섭취하는 인도인 70∼79세 이상 집단에서 AD(Alzheimers disease) 발병률이 동일연령의 미국인 집단에서보다 4.4배 낮다는 보고서에서는 커큐민이 신경세포보호와 Aβ(Amyroid β peptide) 축적을 막는다고 보고하고 있다.

커큐민(1,7-bis(4-hydroxy-3-methyphenyl)-1,6 heptadiene-2,5 dione)은 이온금속과 반응할 수 있는 부위로서 페놀성 하이드록실(Phenolic hydroxyl), 에놀성 프로톤(enolic proton), 케톤 및 2 개의 카보닐 그룹, 알파-메틸렌 그룹을 가지고 있다. 이들 중 페놀계와 에놀계 수산기는 금속 킬레이트를 형성하는 능력을 가지고 있다. 이때, 커큐민과 Cu-킬레이트의 최대 농도는 3∼12μM이고, Fe와 커큐민-킬레이트의 최대 농도는 2.5∼5μM 수준에서 최대상호 작용을 갖는데, 커큐민-금속 킬레이트 화합물의 향상된 라디칼 소거효능과 효과적으로 결합하는 능력은 커큐민에 대한 잠재적인 신경세포를 보호한다.

또 다른 킬레이트 천연물으로는 폴리페놀 중에 녹차에 포함된 EGCG(epigallocatechin-3-gallate)로서, Fe 및 Cu와 같은 금속이온에 결합하여 강력한 금속 킬레이터 기능을 수행한다.

또한, 합성화합물로서 디설피람(Disulfiram, 이하 "DSF"라 함)은 1951년도에 미국 FDA에서 알코올중독 치료제로 승인된 약물로서, 그 기작은 음주 시 체내에 아세트알데히드(ALDH2 억제)가 축적되어 음주를 조절하는 약물로 알려져 있으며, 이외에도 코카인중독, 금속유도접촉피부염, 포도막염, 악성종양치료(Prostate cancer, breast cancer, colorectal cancer)에 효능을 보이고 있다.

상기 DSF 약물의 구조는 하기 화학식 1로 표시되는 바와 같이, S=C-S-S-C=S 형태로서 대칭구조를 이루고 있으며 ALDH2(aldehyde dehydrogenase) 효소와 이황화 결합(disulfide bond)을 통해 효소활성을 억제하게 된다. 특히, 알코올 중독을 위한 의약품으로 사용되는 DSF(Disulfiram)는 산화 질소에 민감한 -SH(sulfhydryl) 그룹의 황이 구리(Cu)에 반응하는 것이다.

화학식 1

DSF 킬레이트 메카니즘을 살펴보면, 혈청이 있는 상태에서 빠르게 감소되어 DDC(diethyldithiocarbamate)의 두 분자를 형성한다. DDC는 주로 Cu(II)와 Zn(II)의 2가 금속이온과 매우 강한 킬레이터로 작용한다. 그러나 인 비트로(in vitro) 세포 연구에서 DSF는 구리 보충제가 없는 즉, 혈청이 없는 배지에서 암 세포주에 세포 독성을 완전히 잃게 되는데, 이때, Cu 이온이 산화 환원 반응에서 중요한 역할을 한다. 상기 DDC가 Cu와 접촉하면 이들 사이의 킬레이트 반응은 DNA, 단백질 및 지질을 손상시켜 암 세포 죽음을 초래하는 활성산소(ROS)의 생성을 유발한다.

ROS는 높은 화학적 반응성으로 인하여 매우 짧은 수명을 가지는 매우 일시적인 화학 종으로서, 조직 내 매우 짧은 거리까지만 침투할 수 있다. 암세포를 표적으로 하기 위해서는 DSF와 Cu의 반응이 암세포 내부 또는 암세포 근처에서 일어나야 한다.

또한, DDC 및 Cu 반응에서 생성된 ROS 이외에, DDC 및 Cu 반응에서 유래된 바이오(N, N- 디 에틸 디티오 카르 바 마토)Cu(II)-DDC 복합체도 암세포에서 세포 독성을 보인다.

DDC와 Cu 사이의 킬레이트 반응과 Cu-DDC 복합체의 형성에는 DDC의 -SH(sulfhydryl) 기와 결합한다. 경구 투여 후, DSF는 위장관계 및 문맥의 혈류에서 즉시 감소되어 DDC를 형성한다. 상기 DDC는 간에서 풍부하게 되고 즉시 S-Me-DDC(S-methyl-DDC)와 S-메틸화 전이효소(S-methyl-transferase) 및 글루쿠로닐 전이효소(glucuronyl transferase)에 의한 gluconidated DDC로 효소적으로 변환되거나 완전히 디에틸 아민과 카르보닐 이황화물로 분해된다.

최근에 항암제로 활발히 연구되고 있는 구리(Cu)와 DSF 킬레이트 복합체(Copper dirhyldithiocarbamate)는 Cu/Zn-SOD 활성, NF-

B 활성억제, MMPs (matrix metalloproteinases) 억제, PI3K(phosphoinositide 3-kinase) 활성억제, P-gp (P-glycoprotein) 억제를 통한 약물저항성 약화, 프로테아좀 관련 효소(proteasomal enzymes) 활성억제, DNA 메틸화 전이효소(DNA methyltransferases) 억제, XIAP의 발현억제, eIF4G1 수준의 감소, MDR1, 국소이성질화효소(topoisomerase), NPL4를 억제, MAPK 키나아제 경로를 조절한다.

DSF는 Cu와 결합할 수 있다는 사실 외에도, Cu 이온투과담체(ionophore)로 작용하여 Ctr1에 독립적인 방식으로 세포 내 Cu 축적을 촉진한다는 것이 알려져 있다.

그러나 항암제로 Cu를 사용하는 것은 매력적이지만, Cu의 세포 내 수송은 Cu 운반자에 의한 엄격한 제어로 인해 주요 도전 과제이기도 하다.

DSF-Cu 킬레이트 복합체 형성 메커니즘에 대한 하나의 시나리오는 친유성 DSF가 세포 내 Cu와 함께 세포자멸사 유발 Cu(DEDTC)2 복합체를 형성하기 위해 암세포로 침투한다는 것이다. 유방을 포함한 많은 암세포가 정상 조직보다 높은 수준의 Cu를 가지고 있기 때문에, DSF가 들어간 후에 Cu(DEDTC)2의 증가로 DSF가 암세포를 선택적으로 표적화할 수 있게 한다.

DSF-Cu가 암세포자멸사를 유도하는 메커니즘으로는, XIAP의 양성 전사 조절자인 NF

B의 억제는 또한 XIAP의 하향조절(down-regulation)이다. 또한, XIAP는 세포 스트레스 동안 단백질 해독 인자인 eIF4G1 활성으로 과발현된다. eIF4G1 과발현이 종양 색전 형성 및 IBC의 전이성에서 중요한 요소이기 때문에 IBC 세포에서 DSF-Cu에 의한 eIF4G1 수준의 감소시켜 종양의 공격성을 감소시킨다.

DSF-Cu는 또한 암 줄기세포(CSCs), 종양 형성 및 전이 잠재력 증가 및 화학 요법 및 표적 치료에 대한 저항성과 관련 있는 ALDH1 활성을 억제한다.

또한 CSCs는 낮은 기저 수준의 ROS를 나타내며, 일부 연구에서는 ALDH1A1이 줄기 세포에서 산화 스트레스를 다시 보호하는데 중요한 역할을 한다. 따라서 ALDH는 항 종양 요법, 특히 산화 환원 조절 세포에서 중요한 표적이 된다.

Cu-글루코네이트(Cu-gluconate)의 경구 투여와 함께, 나노 캡슐화된 DSF는 마우스 유방암, 간암, 난소 암, 폐암 및 뇌암 모델에서 현저하게 강한 항암 효능을 보인다. 미토콘드리아 산화 인산화의 산물인 반응산소종(ROS)은 세포 증식과 생존을 포함한 수많은 생물학적 사건에서 세포 내 전달자로서 중요한 역할을 하는데, 상기 ROS가 과도하게 생성되면 지질, 단백질, DNA가 과산화되어 세포 손상과 세포자멸사가 일어난다.

종양 세포는 대개 정상 세포보다 ROS 수준이 높기 때문에 ROS의 증가는 DSF/Cu와 같은 ROS 유도제는 세포 항산화 물질을 배출시켜, 종양 세포의 세포자멸사를 일으킬 수 있다.

MAPK 군의 중요한 구성원인 C-jun NH2 말단 키나아제(JNK) 또한 ROS 매개 세포자멸사가 JNK 경로의 지속적인 활성화와 밀접하게 관련되어 있음이 입증되었다.

신약 개발을 위한 시간과 비용으로 인해, 약물 재배치는 항암제 개발을 위한 최근 몇 년 동안 매력적인 전략이 되었다.

DSF는 알데히드 탈수소 효소(ALDH)를 특이적으로 억제하고 알코올로부터 보호되는 아세트알데히드의 추가 분해를 차단한다. 또한, DSF는 프로테아좀(proteasome)/ NFκB 경로, MDR1, topoisomerase, MMP, NPL4를 억제하고, MAP 키나아제 경로를 조작한다. 그것은 암 줄기 세포(CSCs)를 박멸하고 저항성 암 세포주에서 화학 저항을 현저하게 역전시키며, 암 세포에서의 세포 독성은 구리 의존성을 보인다.

특히, DSF-Cu 킬레이트 복합체는 위장, 산성 종양 환경에서 DSF는 즉시 Cu(II)를 킬레이트하는 DEDTC-Cu 복합체로 전환되어, DSF 자체보다 더 안정화되어 항암 작용을 촉진하나, 이러한 작용은 정상 조직에 대한 중대한 독성을 나타내므로, DSF의 Cu 사용을 제한한다.

글루코시놀레이트(Glucosinolate)는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물로서, 십자과 식물에서 많이 생성되는 황(sulphur) 화합물이다. 특히 채소류, 향신료 또는 기름 공급원으로 재배되는 작물에서 다양한 발견되는데, 현재까지 보고된 글루코시놀레이트의 종류는 120 여종으로 알려져 있다.

화학식 2

또한 글루코시놀레이트는 미로시나아제(myrosinase) 효소에 의해 당(glucose)이 분해되고, pH와 ESP에 의해서 다양한 분해산물(epithionitrille, Thiocyanates, nitriles, isothiocyanates, oxazolldine-thione)이 발생된다. 이처럼 글루코시놀레이트에 대한 화학적 구조나 생리활성연구는 매우 활발하게 진행되고 있으면서도 금속화합물과 킬레이트에 대한 연구는 전무한 실정이다.

최근 치료용 연구가 활성화 되고 있는 DSF-Cu 킬레이트 복합체로 인한 항암 작용은 정상 조직에 대한 중대한 독성을 나타내므로, 신체에 안전한 천연소재로부터 원료가 탐색될 필요가 있다.

십자과(Brassicaceae family)에 속하는 대표적인 식용작물로서 무(radish)는 스페인, 중국, 터키, 러시아 등 전 세계적으로 분포되어 재배되고 있다. 이러한 십자과(Brassicaceae family) 채소는 이소티오시아네이트(Isothyocianate)와 인돌(indole) 화합물이 세포 내 특정효소를 조절하고 세포자멸사를 조절하며 세포주기를 차단한다고 보고되어 있다.

이에, 본 발명자는 앞선 보고에서는 십자과 채소 중에서 흑무(Black Radish, Raphanus sativus L. var. niger)에 대한 효능연구를 통해 간 해독 효과를 입증하여 간 기능 개선용 조성물[특허문헌 1] 및 항 염증 효과를 이용한 함염증용 조성물[특허문헌 2]을 보고한 바 있다.

따라서, 본 발명자들은 십자과 채소 중 흑무 추출물에 대한 약학적 조성물로서의 가능성을 연구한 결과, 종래 치료용 연구가 활성화 되고 있는 DSF-Cu 킬레이트 복합체와의 유사한 거동을 확인하고, 강력한 활성산소종(ROS) 생성과 함께 세포자멸사를 유도하므로 약학적 조성물로서 유용함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제2018-0045595호 (2018.05.04. 공개) 대한민국 공개특허 제2018-0045770호 (2018.05.04. 공개)

본 발명의 목적은 십자과 식물 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체를 유효성분으로 함유한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 십자과(Brassicaceae family) 식물 추출물 및 Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체를 유효성분으로 함유한 약학적 조성물을 제공한다.

상기 십자과 식물이 브로콜리, 양배추, brussels sprouts), 콜리 플라워, 콜라드 그린(collard greens), 케일, 콜라비, 갓(mustard greens), 무, 흑무, 순무(turnip) 및 루타바가(rutabaga)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 채소류인 것이다.

본 발명에서는 상기 십자과 채소에서 바람직하게는 흑무(Black Radish, Raphanus sativus L. var. niger) 추출물을 사용하나 이에 한정되지는 아니할 것이다.

더욱 바람직하게는 흑무 거피(Peel) 추출물을 사용하는 것이다. 이때, 상기 흑무 거피 추출물은 총 폴리페놀 함량이 1,000㎍/㎖ 이상 함유된 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 흑무 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체는 활성산소종(ROS)의 생성을 촉진하여 세포자멸사(apoptosis) 거동을 구현한다. 이때, 상기 활성산소종(ROS)의 생성에 의해 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 인산화를 통한 암 세포자멸사 거동을 가지며, 상기 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성에 의해 Bax(Bcl-2 Antagonist X) 단백질이 활성화되어 암 세포자멸사를 유도한다.

본 발명에 있어서, 상기 흑무 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체는 Akt 단백질(단백질 인산화효소B) 활성 억제효과를 가지는 약학적 조성물이다.

본 발명의 약학적 조성물은 간암, 유방암, 난소 암, 폐암, 뇌암 및 위암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환에 유효한 항암용 약학적 조성물로 유용하다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 LPS 처리구에서 NO 생성 억제를 통해 염증관련성 관절염 및 동맥경화에 유효한 약학적 조성물이다.

본 발명의 약학적 조성물은 십자과 식물 중 십자과 채소류, 더욱 바람직하게는 흑무 추출물과 Cu(II) 금속화합물의 혼합처리구에서 강력한 활성산소종(ROS) 유도와 세포자멸사 유도를 확인함으로써, 우수한 항암효과 및 항염증성 효과를 구현한다.

종래 치료용 연구가 활성화 되고 있는 DSF-Cu 킬레이트 복합체와의 유사한 거동을 확인함으로써, 십자과 식물에 함유된 글루코시놀레이트 성분이 금속이온 킬레이트제로서 작용하여 구리(Cu) 암 줄기세포를 표적화 할 수 있다.

또한, 종래 DSF-Cu 킬레이트 복합체가 위장, 산성 종양 환경에서 함암 작용 촉진하나 중대한 독성을 보이는 반면, 본 발명은 원료가 식소재인 십자과 채소류, 바람직하게는 흑무 추출물을 이용함으로써, 부작용을 근본적으로 최소화할 수 있다.

도 1은 본 발명의 흑무 거피 추출물(101)의 총 페놀 함량 분석결과이고,
도 2는 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 의한 세포생존율분석 결과로서, FBS 미포함 배지에서 배양한 결과이고,
도 3은 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 의한 세포생존율분석 결과로서, FBS 포함 배지에서 배양한 결과이고,
도 4는 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체를 이용하여 간암세포(hepG2)에서의 세포생존율을 분석한 결과이고,
도 5는 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체를 이용하여 인간 유방암세포(MDA-MB-231)에서의 세포생존율 분석 결과이고,
도 6은 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 의한 NO 생성 저해능 결과이고,
도 7은 흑무의 부위별 추출물 (a)는 검정무 추출물(115)이고, (b)는 무종자 추출물(139)에 대한 NO 생성 저해능 결과이고,
도 8은 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 대한 세포자멸사 실험결과이고,
도 9 및 도 10은 도 8의 세포자멸사에 관한 조건별 이미지 촬영결과이고,
도 11은 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체의 농도별 활성산소 생성률에 관한 이미지결과이고,
도 12는 도 11의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 대한 활성산소 생성율 대비 결과이고,
도 13은 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 대한 세포자멸사 관련 단백질 활성에 관한 웨스턴 블롯결과를 나타낸 것이고,
도 14는 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 대한 세포자멸사 관련 단백질 발현에 관한 웨스턴 블롯결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 십자과(Brassicaceae family) 식물 추출물 및 Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체를 유효성분으로 함유한 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용하는 십자과 식물은 글루코시놀레이트 성분이 함유된 소재이며, 바람직하게는 브로콜리, 양배추, brussels sprouts), 콜리 플라워, 콜라드 그린(collard greens), 케일, 콜라비, 갓(mustard greens), 무, 흑무, 순무(turnip) 및 루타바가(rutabaga)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 십자과 채소류인 것이다.

본 발명의 실시예에서는 십자과 채소류 중에서 흑무(Black Radish, Raphanus sativus L. var. niger)를 사용하며, 이때 흑무 추출물은 흑무 거피(peel) 추출물(101), 흑무 전체를 포함한 흑무 추출물(115), 흑무 종자 추출물(139)을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 흑무 거피 추출물(101)을 사용하는 것이다.

도 1은 본 발명의 흑무 거피 추출물(101)의 총 페놀 함량 분석결과로서, 흑무 거피(peel) 추출물은 총 폴리페놀 함량이 1,000㎍/㎖ 이상 함유된다. 이때 폴리페놀 성분은 Fe 및 Cu와 같은 금속이온에 대한 금속 킬레이터 기능을 수행할 수 있다.

본 발명의 흑무 추출물은 흑무 추출 부위를 물, 알코올 특히, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF),

디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물이다.

이외에, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다.

분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다.

또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 압착물의 수분이나 용매 추출물의 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다.

본 발명에 있어서, 상기 흑무 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체는 활성산소종(ROS)의 생성을 촉진하여 세포자멸사(apoptosis) 거동을 가지는 약학적 조성물이다.

도 2는 본 발명의 흑무 거피 추출물(101)에 대한 세포생존율분석 결과로서, FBS 미포함 배지에서 배양한 결과이고, 도 3은 본 발명의 흑무 거피 추출물(101)에 대한 세포생존율분석 결과로서, FBS 포함 배지에서 배양한 결과를 나타낸다.

상기 결과로부터, 세포배양액에 FBS 포함된 조건에서 FBS 미포함 조건에서보다 세포자멸사(cell apoptosis) 또는 세포 성장 억제결과를 보이며, 종래, Cu(II)-DSF 킬레이트 거동과 유사하게, Cu(II)-흑무 거피 추출물(101)과의 혼합처리구에서 세포자멸사 또는 세로성장을 조절할 수 있음을 제시한다.

이러한 결과를 토대로, 도 4에는 간암세포(hepG2)에서의 세포생존율을 분석한 결과,

Cu(II)-흑무 거피 추출물(101)과의 혼합처리구에서 간암세포(hepG2)에 대한 현저한 세포독성 활성거동을 확인할 수 있다.

또한, 도 5는 유방암세포(MDA-MB-231)에서의 세포생존율 분석 결과로서, Cu(II)-DSF 킬레이트 거동대비, Cu(II)-흑무 거피 추출물(101)과의 혼합처리구에서 유방암세에 대한 현저한 세포독성 활성거동을 확인할 수 있다.

또한, 도 6 및 도 7은 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 의한 NO 생성 저해능 결과로서, Cu(II)-DSF 킬레이트 거동보다 흑무 거피 추출물과 Cu(II) 금속화합물의 혼합처리구에서 NO 생성이 현저히 낮은 거동을 확인할 수 있다.

또한, 흑무 추출물(115) 및 흑무 종자 추출물(139)의 혼합처리구 역시 유사한 NO 생성 저해 거동을 보인다.

또한, 도 8은 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 대한 세포자멸사 실험결과로서, 항암 치료제 용도로 사용되는 Cu(II)-DSF 킬레이트가 세포독성에 의한 세포자멸사를 유도한 바와 같이, 거동보다 흑무 거피 추출물과 Cu(II) 금속화합물의 혼합처리구에서도 대등한 세포 독성을 제시한다.

도 9 및 도 10은 이러한 세포자멸사에 관한 조건별 이미지 촬영결과로서, 흑무 거피 추출물과 Cu(II) 금속화합물의 혼합처리구의 농도 의존적으로 세포수의 감소를 확인할 수 있다.

또한, 도 11은 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체의 농도별 활성산소종의 생성률에 관한 이미지이고, 도 12는 도 11의 활성산소 생성률을 도시한 결과로서, Cu(II)-DSF 킬레이트와 대등이상의 높은 활성산소종(ROS)의 생성률을 확인할 수 있다.

도 13은 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 대한 세포자멸사 관련 단백질 활성에 관한 웨스턴 블롯결과로서, 활성산소종(ROS)의 생성에 의해 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 인산화를 통한 암 세포자멸사 거동을 가지며, 상기 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성에 의해 Bax(Bcl-2 Antagonist X) 단백질이 활성화되어 암 세포자멸사를 유도한다.

도 14는 본 발명의 흑무 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 대한 세포자멸사 관련 단백질 발현에 관한 웨스턴 블롯결과이며, 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체는 Akt 단백질(단백질 인산화효소B) 활성 억제효과를 확인할 수 있다.

이상의 결과로부터, 본 발명의 흑무 추출물, 바람직하게는 흑무 거피 추출물과 Cu(II) 금속화합물(Cu(II)-gluconate)의 혼합처리구는 공지된 DSF-Cu(II) 킬레이트 복합체 거동과 유사하거나 우수한 항암효능 및 항염증 효과를 제시한다.

즉, 흑무 거피 속에 많은 글루코시놀레이트(glucosinolate)가 함유되어 있고 황 성분을 함유하고 있어, DSF의 황 성분과 Cu(II)- 금속화합물(Cu(II)- gluconate)간의 킬레이트 형성과 동일한 메커니즘으로, 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체로 형성됨을 이해할 수 있다.

이상의 결과로부터 본 발명은 십자과 식물 추출물 및 Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체를 유효성분으로 함유한 약학적 조성물은 식재료로부터 우수한 항암 및 항염증 효과가 달성되므로 부작용을 최소화할 수 있다.

특히, 본 발명은 흑무 거피 속에 함유된 글루코시놀레이트 성분이 금속이온 킬레이트제로서 구리(Cu) 암 줄기세포를 표적화 할 수 있음을 제시한다.

이상의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체를 유효성분으로 함유한 함암용 약학적 조성물은 간암, 유방암, 난소 암, 폐암, 뇌암 및 위암으로 이루어진 군에서 선택된 질환에 유효한 항암용 약학적 조성물이고, 염증관련 관절염 및 동맥경화에 유효하다.

본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 투여 경로는 국소 경로, 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로일 수 있으며, 두 가지 이상의 경로를 조합하여 사용할 수도 있다. 두 가지 이상 경로의 조합의 예는 투여 경로에 따른 두 가지 이상의 제형의 약물이 조합된 경우로서 예컨대 1차로 어느 한 약물은 정맥 내 경로로 투여하고 2차로 다른 약물은 국소 경로로 투여하는 경우이다.약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 "대한민국약전"을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유, 에탄올, 그리세롤 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라적절한 결합제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 희석제 등을 포함시킬 수 있다. 적절한 결합제로서는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페리스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 글루코스, 옥수수 감미제, 소듐 알지네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 들 수 있고, 윤활제로서는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 초산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈쿰, 스테아르산, 그것의 마그네슘염과 칼슘염, 폴리데틸렌글리콜 등을 들 수 있으며, 붕해제로서는 전분, 메틸 셀룰로스, 아가(agar), 벤토나이트, 잔탄 검, 전분, 알긴산 또는 그것의 소듐 염 등을 들 수 있다. 또 희석제로서는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소비톨, 셀룰로스, 글라이신 등을 들 수 있다.본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 수성 등장 용액 또는 현탁액을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 담체로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사

용할 수 있다.약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg∼10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg∼1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.

본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 흑무 거피 추출물 제조

흑무의 원료는 성산일출봉농협에서 재배된 흑무를 2월에 수확 후, 흑무 거피(peel) 부분을 80% 주정을 이용하여 실온에서 24시간 추출한 후 감압 농축하여 흑무 거피 추출물(Black Radish Peel extract; BRPE)(101)을 제조하였다[수율 4~5%].

<실시예 2> 흑무 동결건조 추출물 제조

흑무의 원료는 성산일출봉농협에서 재배된 흑무를 2월에 수확 후, 과육과 거피를 포함한 흑무 전체를 80% 주정을 이용하여 실온에서 24시간 추출한 후 동결건조 추출물(115)을 제조하였다[수율 31~34%].

<실시예 3> 흑무 종자 추출물 제조

흑무의 원료는 성산일출봉농협에서 구입한 흑무 종자를 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여, 무종자 추출물(139)을 제조하였다.

<실험예 1> 총 페놀함량 측정

총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis법을 이용하여 비색 정량하였다.

추출물 100㎕에 증류수 900㎕를 넣어 전체 부피가 1㎖가 되도록 희석하였다. 여기에 시약(Folin-Ciocalteus’ phenol reagent) 100㎕를 첨가하여 실온에서 약 3분간 반응시키고, Na₂CO₃용액 (7%, w/v) 200㎕를 혼합한 후 증류수 700 ㎕를 넣어 실온에서 1시간 반응시켰다. UV 분광기를 이용하여 720nm에서 흡광도 측정하여 분석하였으며, 총 폴리페놀 함량은 갈산(gallic acid)를 표준물질로 하여 작성한 표준검정곡선을 통해 추출물의 총 폴리페놀 함량을 분석하였다.

도 1은 본 발명의 흑무 거피 추출물의 총 페놀 함량 분석결과로서, 실시예 1의 흑무 거피의 주정추출물(S101)은 1159.5㎍/㎖인 반면에, 실시예 2의 흑무 비건조 추출물(S115)에서는 899.5㎍/㎖ 함량을 확인하였다.

따라서 흑무 거피의 주정추출물에서 약 250㎍이상의 폴리페놀 성분함량이 높게 확인되었다.

<실험예 2> 세포생존율 분석

1) 세포배양

실험에 사용한 세포(murine macrophage cell line RAW264.7)는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입하였으며, 10% FBS(fetal bovine serum)과 100unit/㎖ penicillinstreptomycin(Gibco Inc., Grand Island, NY, USA)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium, Gibco Inc.)을 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였다.

염증 활성 실험에 사용된 세포(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7, 간세포인 HepG2와 3T3L1 세포주는 KCLB(Korean Cell Line Bank)로부터 분양 받아 1% penicillin-streptomycin과 10% FBS(fetal bovine serum)이 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s minimal essential medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대 배양 하였다.

간세포 (HepG2) 배양은 MEM 배지에 10% FBS, 1%P/S를 첨가하여 세포주를 유지하였으며, 3T3L1 세포는 DMEM 배지에 10% Bovine Serum, 1% P/S를 첨가히여 세포를 유지하였으며 배양조건은 37℃, 5% CO2항온기에서 배양 유지하였다.

2) MTT 및 세포독성 분석

세포생존율분석은 RAW 264.7 세포를 1×10⁵ cells/㎖로 조절한 후 96 웰 플레이트에 접종하고 여러 농도의 시료(Cu, DSF, 흑무 추출물)로 1시간 동안 처리한 후 LPS(lipopolysaccharide) 500 ng/㎖를 가하여 24시간 배양한 후, 30㎕ MTT 용액(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide)을 넣고 4시간 반응 후 배양액을 제거하였다. 이후 200㎕ DMSO을 넣어 MTT formazan crystals을 완전히 녹인 후 570nm에서 측정하였다.

도 2는 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 의한 세포생존율분석 결과로서, FBS 미포함 배지에서 배양한 결과를 나타낸 것이다.

MTT 방법을 이용하여 세포생존율 분석하기 위해서는 세포배양액 DMEM에 10% FBS(fetal bovin serum)을 첨가 또는 미첨가 상태에서 하기 화학식 3으로 표시되는 Cu(II)-글루코네이트(gluconate), DSF, 흑무 추출물을 농도별로 처리한 후 20 시간 후에 분석한 결과, (a) 10% FBS가 포함되지 않은 배지에서 배양한 세포생존율은 Cu-gluconate (20uM), DSF(20uM) 처리구에는 대조군(control)보다 10∼13% 정도 감소하였다.

화학식 3

그러나 하기 화학식 4로 표시되는 DSF-Cu 킬레이트 복합체로서, 혼합처리구 Cu(20uM)-DSF(20uM)와 Cu(10uM)-DSF(10uM)에서는 세포생존율이 각각 12.5%, 12.1%로서 매우 낮게 관찰되었다.

화학식 4

반면에, 실시예1의 흑무 거피 추출물(101) 1000㎍/㎖, 500㎍/㎖ 처리구에서는 세포생존율이 74.7% 및 91.9%으로 확인되었다.

또한, 실시예1의 흑무 거피 추출물(101)과 Cu(II)-글루코네이트의 혼합처리구 101-Cu(1000㎍/㎖-20uM), 101-Cu(1000㎍/㎖-10uM), 101-Cu(1000㎍/㎖-5uM)에서 세포생존율은 각각 17.5%, 34.9%, 63.6%를 보여 구리 농도 의존적으로 세포 성장이 억제됨을 확인하였다.

한편, 실시예1의 흑무 거피 추출물(101) 처리농도를 500㎍/㎖ 낮추고 구리 농도별로 처리한 결과, 101-Cu(500㎍/㎖-20uM), 101-Cu(500㎍/㎖-10uM), 101-Cu(500㎍/㎖-5uM)에서 세포생존율이 각각 41.1%, 59.2%, 123%를 확인되는바, 세포배양액에 FBS가 없는 상태에서는 구리 농도와 흑무 거피 추출물(101)의 혼합처리구에서는 상호 의존적으로 세포 성장 또는 세포자멸사를 조절하는 것으로 관찰되었다.

도 3은 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 의한 세포생존율분석 결과로서, FBS 포함 배지에서 배양한 결과를 나타낸 것으로서, 10% FBS가 포함된 배지에서 배양한 세포생존율은 Cu-글루코네이트(20uM)에서는 104.3%, DSF(20uM) 처리구에는 90.5%로서 FBS가 없는 배지조건에서보다 증가되었다. 그러나 혼합처리구Cu(20uM)-DSF(20uM)와 Cu(10uM)-DSF(10uM)에서는 각각 7.1%, 5.7%로 매우 낮게 세포생존율이 관찰되었다.

또한, 실시예1의 흑무 거피 추출물(101) 단독으로 농도별(1000㎍/㎖, 500㎍/㎖) 처리구에서는 세포생존율이 78.3% 및 97.7%을 보여, FBS가 미포함 조건과 유사한 경향을 보였다.

반면에, 실시예1의 흑무 거피 추출물(101)과 Cu(II)-글루코네이트의 혼합처리구 101-Cu(1000㎍/㎖-20uM), 101-Cu(1000㎍/㎖-10uM), 101-Cu(1000㎍/㎖-5uM) 세포생존율은 각각 18.3%, 22.4%, 39.9%를 보여 구리 농도 의존적으로 세포 성장 억제와 FBS가 미포함 배지에서보다 세포성장이 현저하게 억제되었다.

또한, 흑무 거피 추출물(101) 처리 농도를 500㎍/㎖ 낮추고 구리농도별 처리한 경우, 101-Cu(500㎍/㎖-20uM), 101-Cu(500㎍/㎖-10uM), 101-Cu(500㎍/㎖-5uM)에서의 세포생존율은 각각 36.1%, 79.1%, 74.1%를 보였다.

이상의 도 2 및 도 3의 결과는 세포배양액에 FBS 포함된 조건에서는 FBS 미포함 조건에서보다 세포자멸사(cell apoptosis) 또는 세포 성장 억제결과를 보였다. 따라서 FBS 포함된 조건에서 구리-DSF 킬레이트가 잘 이루어지는 것으로 사료되며, 구리- 흑무 거피 추출물(101)과의 킬레이트도 이루어지는 것으로 사료된다.

상기 결과로부터, RAW 267.4 세포에서의 구리 킬레이터(chelator)로서 DSF 뿐만 아니라 흑무 거피 추출물도 강력한 킬레이트를 이루고 있어, 세포자멸사 또는 세로성장을 조절할 수 있음을 뒷받침한다.

도 2 및 도 3의 결과를 토대로, 인간 간암 세포(human liver cancer cell, HepG2)에서 MTT 방법을 이용하여 세포생존율을 분석하였다. 세포배양액 DMEM에 10% FBS(fetal bovin serum) 첨가 또는 미첨가 상태에서 Cu(II)-글루코네이트, DSF, 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101)을 농도별로 처리한 후 20시간 후에 분석 하였다.

도 4는 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체를 이용하여 간암세포(hepG2)에서의 세포생존율을 분석한 결과이다.

그 결과, Cu-글루코네이트(10uM), DSF(10uM) 처리구에는 대조군(control)과 유의성있는 차이는 관찰되지 않았다. 그러나 혼합처리구인 Cu(10uM)-DSF(20uM)와 Cu(10uM)-DSF(10uM), Cu(10uM)-DSF(5uM)에서는 세포생존율이 각각 18%, 12%, 26%로서 매우 낮게 관찰 되었다.

또한, 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101) 1000㎍/㎖와 500㎍/㎖에 10uM Cu와의 혼합처리시, 세포생존율은 각각 36% 및 62%로서 흑무 거피 추출물과 구리 혼합처리는 간암세포(hepG2)에 대한 세포독성 활성거동을 확인하였다.

도 5는 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체를 이용하여 인간 유방암(MDA-MB-231) 세포에서의 세포생존율 분석 결과이다. 그 결과, 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101) 1000㎍/㎖와 500㎍/㎖에 10uM Cu와의 혼합처리시, 세포생존율은 각각 24.0% 및 44.8%로서, DSF10μM에 10uM Cu와의 혼합처리구 결과 55.2 대비 현저한 세포독성 활성을 확인하였다.

<실험예 3> NO(nitric oxide) 생성 저해능 측정

NO 생성 저해능은 RAW 264.7 세포를 1×10⁵ cells/㎖로 조절한 후 48 월 플레이트에 접종하고 여러 농도의 단일시료(Cu, DSF, 흑무 거피 추출물, 무종자 추출물(139), 흑무 추출물(115)) 또는 혼합시료 (DSF-Cu, 흑무 거피 추출물(101))-Cu를 1시간 동안 처리한 후 LPS(lipopolysaccharide) 500 ng/㎖를 가하여 24시간 배양한 후 생성된 NO를 그리스(Griess) 시약을 이용하여 측정하였다.

도 6은 본 발명의 거피 흑무 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 의한 NO 생성 저해능 결과로서, 구체적으로 살펴보면, (a) 먼저 LPS(500ng/㎖) 처리구에서 생성된 NO량을 100%로 기준하여 각각의 시료 처리된 세포에서 비교분석 하였다. Cu(II)-글루코네이트 20uM, 10uM 처리구에서 NO 생성량은 112%, 109%로 나타났다.

또한, DSF 20uM, 10uM 처리구에서의 NO 생성은 58, 85%로 억제되었고, Co-DSF 혼합처리구 DSF-Cu(20uM-10uM), DSF-Cu(10uM-5uM), DSF-Cu(5uM-2.5uM)에서 NO생성은 45%, 50%, 47% 결과를 보였다. 이러한 결과는 구리 단일 금속화합물은 ROS를 증가시켜 NO생성을 촉진시키고, DSF 단일 화합물은 NO 생성을 현저하게 억제시켰으며, DSF-Cu 혼합처리구에서는 DSF 단일처리구보다 현저하게 NO 생성을 억제한 결과를 확인할 수 있었다. 따라서 상기 결과로부터, DSF-Cu가 킬레이트되어 세포성장 및 세포자멸사(cell apoptosis)에 기인될 것이다.

반면에, (b)는 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101)과 Cu 각각 또는 복합처리한 세포에서 NO 생성율을 분석한 결과를 도시한 것으로서, 흑무 거피 추출물 단독 실험구에서는 46%, 101-Cu(1000ug/㎖-20uM), 101-Cu(500ug/㎖-20uM)의 혼합처리구에서는 각각 2% 및 6%로 NO 생성은 현저히 억제되었다.

도 7은 흑무의 부위별 추출물에 대한 NO 생성 저해능 결과를 나타낸 것으로서, (a)는 실시예 2의 흑무 동결건조 추출물(115)이고, (b)는 실시예 3의 무종자 추출물(139)이다.

그 결과, 흑무의 부위별 추출물 역시 모두 NO 생성을 억제하였으나, 혼합처리구에서 추출물의 농도가 500ug/㎖이면, 단독 추출물 수준의 결과를 보이므로, 킬레이트 효과가 미흡한 것으로 확인되었다.

<실험예 4> 세포자멸사(cell apoptosis) 분석

RAW 264.7 세포를 1×10⁵ cells/㎖로 조절한 후 12 월 플레이트에 올리고 24시간 후 여러 농도의 시료로 16시간 동안 처리하여 사진촬영하고, 0.4% Trypan blue(Gibco Life Technologies)를 혼합 사용하여 Hemocytometer로 세포을 카운팅하였다.

도 8은 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 대한 세포자멸사 실험결과로서, 비처리구(con)와 단일 화합물인 Cu 또는 DSF(disulfiram) 처리구에서는 미세한 증식 및 억제효과을 보였다. 이러한 결과는 MTT 분석결과와도 일치하여 Cu와 DSF처리에서는 염증세포성장에는 관여하는 세포자멸사 기작에는 효과가 없는 것을 뒷받침한. 또한, 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101) 농도별 단독 처리구 역시 15% 내외 성장억제 효과를 보이나 농도증가 대비 세포성장에 지장을 초래하지 않은 것을 확인하였다.

그러나 101-Cu(1000ug/㎖-20uM), 101-Cu(1000ug/㎖-10uM)의 혼합처리구에서는 80%이상 세포자멸사를 유도하였다.

도 9 및 도 10은 도 8의 세포자멸사에 관한 조건별 이미지 촬영결과로서, 세포형태를 보면 혼합처리구(DSF-CU), 모두 정상세포보다 섬유화(flibrosis)가 관찰되지 않고 있으며, 세포숫자가 현저히 감소되었다[도 9]. 또한, 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101)-Cu와의 혼합처리구에서는 한 세포에서 세포형태를 보면, DSF-Cu 혼합처리구와 동일하게 세포형태는 세포독성에 의한 세포자멸사를 유도하였다[도 9]. 이러한 결과는 도 9의 DSF-Cu 혼합처리구에서의 세포독성 효과와 거의 대등한 결과로 확인된다.

따라서 흑무 거피 속에는 많은 글루코시놀레이트(glucosinolate)가 함유하고 있는데, 상기 화합물들의 특징은 황(sulfer) 화합물을 함유하고 있어 DSF-Cu 킬레이트 복합체를 형성한 것처럼, 흑무 거피 추출물(101)-Cu 복합체에 의한 활성산소(ROS) 생성에 기인된 세포자멸사 결과를 보이는 것으로 사료된다.

<실험예 5> 활성산소(Reactive Oxygen Species, ROS)의 생성 저해능 측정

세포 내 활성산소의 농도변화를 측정하기 위하여, 형광 염료 프로브(dye probe)는 DCF-DA(Dichlorofluorescin diacetate, sigma)를 사용하였다. 먼저 12-월 플레이트(SPL, Inc., Seoul, Korea)에서 RAW 264.7세포(murine macrophage cell)가 5×10⁵ cells/㎖가 되도록 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

24시간 배양 후 흑무 추출물, Cu(II)-글루코네이트, DSF(disulfiram) 각각 또는 혼합하여 농도별로 RAW 264.7 세포에 처리한 후 PBS로 2회 세척하여 수확한 후 분석기(flow cytometry, Bector Dickinson)를 이용하여 활성산소(ROS)의 변화량을 분석하였다.

그 결과, 각 ROS 생성률은 대조군(control)에서는 2%, 10uM DSF 처리구에서는 6.2%, 10uM Cu-글루코네이트 처리구에서는 4.2%, 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101) 처리구에서는 14.6%를 보였다.

그러나 DSF(10uM)-Cu(10uM) 혼합처리구에서 ROS 발생은 47.1%로서 단일 처리구보다 8 내지 12배 높게 발생되었다.

또한, 도 11은 본 발명의 흑무 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체의 농도별 활성산소 생성율에 관한 이미지결과로서, 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101) (500ug/ml)에 Cu를 농도별 101 (500ug/ml)+ Cu20uM, 101 (500ug/ml)+ Cu 10uM, 101 (500ug/ml)+ Cu 5uM로 처리한 결과, 각각 77.2%, 82.8%, 75.5%로 높은 ROS 발생률을 확인하였다.

도 12는 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 대한 활성산소 생성율의 대비결과로서, 이러한 결과는 본 발명의 흑무 거피 추출물(101)이 강력한 활성산소(ROS) 유도와 함께 세포자멸사를 유도함으로써, 항암제 약물조성물로서의 가능성을 뒷받침한다.

최근 치료용 연구가 활성화 되고 있는 DSF-Cu 킬레이트 복합체는 위장, 산성 종양 환경에서 DSF는 즉시 Cu(II)를 킬레이트하는 DEDTC-Cu 복합체로 전환되어, DSF 자체보다 더 안정화되어 항암 작용을 촉진하나, 이러한 작용은 정상 조직에 대한 중대한 독성을 나타내므로, DSF의 Cu 사용을 제한한다. 그러나 본 발명은 식재료인 흑무로부터 거피 추출물과의 Cu(II)-글루코네이트 복합체를 형성하고, 그 거동이 종래 DSF유사하므로, 항암제로서 적용 가능하다.

<실험예 6> 웨스턴 블롯 분석

RAW 264.7 세포를 1×10⁵ cells/mL로 조절한 후 6- 월 플레이트에 올리고 24시간 후 여러 농도의 흑무 추출물 시료로 16시간 동안 처리하였다. Cu, DSF(disulfiram), 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101)의 처리시간을 1, 3, 8, 24시간 동안 처리한 후 세포를 수집하였다.

세포를 2회 PBS(phosphate buffered saline)으로 세척한 후 RIPA buffer(1% phosphatease inhibitor cocktail) 넣고 세포용해(cell lysis)시켰다. 그리고 14,000rpm에서 10분간 원심분리 후 상등액을 채취하여 단백질을 준비하였다. 상기 단백질을 정량 후 30∼50㎍의 단백질에 해당하는 용해물(lysate)를 8∼12% 젤(Mini-Gel)에 로딩하여 SDS-PAGE에서 전기영동을 실시하였다.

나일론 맴브레인을 이용하여 단백질을 전이 시킨 후 면역블롯(immunobloting)을 실시 하였다. 멤브레인 블록킹은 5% 스킨밀크(skin milk)가 함유된 TTBS(0.1% Tween 20 함유 TBS)에서 1시간 동안 실시하였다. 1차 항체로는 NOS2, COX-2 및 β-actin과 2차 항체인 HRP가 결합된 anti-rabbit lgG는 모두 Santa Cruz Biotechnology사의 제품을 사용하였다. 2차 항체로는 HRP-conjugated된 anti-rabbit, anti-goat, anti-mouse IgG를 1:2,000배 희석하여 상온에서 반응 후 TTBS로 3회 세척 후 ECL kit(intron, korea)로 반응 후 X-ray 필름에 노출시켰다.

모든 데이터는 평균±표준편차로 표기하였고, 각 군의 차이는 분산분석, 다중범위 검정(Duncan’s multiple range test)으로, 상관관계 지수는 피어슨 상관계수(Pearson correlation coefficient)에 의해 유의성 검정을 실시하였다. 모든 실험은 3회 반복 실시하였고, 모든 통계자료는 SPSS program(ver. 12, SPSS inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분석하였다.

도 13은 본 발명의 흑무 거피 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 대한 세포자멸사 관련 단백질 활성에 관한 웨스턴 블롯결과를 나타낸 것으로서, 1차 항체인 phospho-p65, p65(NFkB), phospho-ERK, ERK, phospho-JNK, JNK, Caspase-3, caspase-9을 이용하여 면역블롯을 실시한 결과, NFkB 신호전달에서 p65 발현 및 인산화는 염증인자 형성에 중요한 인자로서 LPS 처리시 급속히 활성화되어 염증성 사이토카인 및 인자을 생성한다.

도 13에서 관찰하여보면, phospho-p65 활성은 비처리구에 비해 변화는 없으나 Cu-101(1000㎍/㎖) 처리구에서 약간의 억제하는 경향성을 보이고 있으며, 단백질 발현은 DSF-Cu 혼합처리구와 고농도 Cu-101(1000㎍/㎖)처리구에서 억제되었다.

또한, MAPK(Mitogen-activated protein kinase) 신호전달에는 ERK(extracellular signal-regulated kinase), JNK(c-JUN N-terminal kinase), p38 등이 포함되며 다양한 싸이토카인(cytokine), 성장 팩터, 세포자극 등에 의해서 활성화가 이루어진다.

특히, JNK와 p38 활성은 cell stress response, growth arrest, cell apoptosis을 유도하는 것으로 알려져 있다. ERK(p44/42) 활성은 phospho-ERK항체을 이용하여 면역블롯을 수행하였다.

대조군(control)대비 Cu, DSF, 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101) 단독 또는 혼합처리구 모두에서 phospho-ERK(p42/44)가 활성화되었다. 특히, DSF-Cu 혼합처리구에서는 강력한 인산화가 유도되었다.

또한, Cu-101 혼합처리구에서의 phospho-ERK활성은 Cu 농도의존적으로 활성이 나타냈다. 따라서 DSF-Cu 킬레이트 형성이 phospho-ERK을 강력하게 유도하는 것으로 사표되는 바와 같이, 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101)과 Cu 킬레이트로 인하여 ERK(p42/44) 활성을 유도하는 것으로 확인하였다.

또한, Phospho-SAPK/JNK(Thr183/tyr185) 항체를 이용하여 JNK 활성화를 분석하였다. 대조군을 포함한 단일처리구(Cu, DSF, 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101))에서는 활성화가 관찰되지 않았다.

그러나 혼합처리구(DSF-Cu, 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101)-Cu에서는 강력하게 JNK 활성이 유도되었다. 이러한 결과는 DSF-Cu 킬레이트로 인하여 JNK 인산화가 유도결과는 Liu et al(2012)이 Glioblastma 세포에서 MAPK pathway 연구결과와 일치하였다. 또한, 또 다른 연구팀인 Cheriyan et al(2014)이 Malignant pleural mesothelioma(MPM)에서 DSF-Cu 킬레이트 연구에서도 종양세포 성장억제와 더불어 phospho-JNK가 강하게 발현되어 proapoptosis를 유도하였다.

따라서 강한 JNK 인산화는 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101)-Cu 복합체 형성으로 ROS 생성에 기인된 것으로 사료된다.

또한, 세포자멸사(cell apoptosis) 기작에서 Bax는 Bcl-2 family 속하는 세포질성 단백질로서 미토콘트리아의 pro-apoptosis 과정에서 미토콘트리아 막에 구멍을 형성하여 시토크롬(cytochrome) c와 다른 세포자멸사 팩터 방출을 촉진시켜 세포자멸사를 유도 한다. Bax 발현은 대조군과 24시간 단일처리구(Cu, DSF, 101)에서는 변화가 없으나, 혼합처리구(DSF-Cu, Cu-101)에서는 현저하게 시간 의존적으로 발현되었다.

이러한 결과는 파파다키스(Papadakis)외 보고된 JNK(c-jun N-terminal protein apoptosis) 활성에 의해서 pro-apoptosis 시그날인 Bax 단백질이 활성화되어 세포의 세포자멸사가 유도된다고 보고된바있다[FEBS letter, 2006].

또한, Caspase-9(initator) 단백질은 Bax에 의해 미토콘트리아에서 방출된 시토크롬(cytochrome) c에 의해서 활성화되어 Caspases 3, 6, 7(effect)가 활성화 된다.

pro-caspase-9 역시 대조군을 포함한 단일처리구(Cu, DSF, 101)에서는 변화가 없으나 혼합처리구에서는 현저하게 감소되었다. 따라서 DSF-Cu와 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101)-Cu의 킬레이트에 의해서 phosppho-JNK, phospho-ERK, Bax가 활성화 되어 pro-caspase-9을 cleaved form으로 바뀌게 되면서 감소한 것으로 확인되었다.

도 14는 본 발명의 거피 흑무 추출물-Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체에 대한 세포자멸사 관련 단백질 발현에 관한 웨스턴 블롯결과를 나타낸 것이다.

PTEN(phosphatase and tensin homologue)의 주요기능은 Pi-3 Kinase 활성화하는 인지질3인산(phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate)을 탈인산화시켜 PDK와 Akt 활성을 조절하여 세포의 성장과 생존, 분화, 암세포 억제 등을 수행한다. 따라서 PTEN 활성은 Akt 활성을 억제하여 세포성장에 많은 장애를 가져온다.

또한, AKT kinase는 anti-apoptosis에 직간접으로 관여하는 단백질로서 BAD, Bcl-XL, Bim, caspase-9, MDM2 등을 인산화시켜 세포의 세포자멸사를 억제 시킨다.

이외에도 글루코스 대사, 인슐린 대사, 세포증식, 염증조절, 세포 주기조절, 혈관신생, 세포 생존 등에 관여하는 단백질을 조절하는 것으로 보고되었다. 실질적으로 많은 암세포주 또는 암 조직에서 AKT는 과발현되어 있거나 본질적으로 활성화되어 있다. 유방암 세포주에서는 Her2 overexpression으로 PI3K/AKT가 활성화되어 있으나 PTEN 유전자 발현의 거의 일어나지 않는다.

Akt 와 PTEN 발현 분석:

도 14에서 보이는 바와 같이, PTEN 발현은 대조군을 포함한 단일처리구(Cu, DSF, 101)에서는 변화가 없으나 혼합처리구에서는 현저하게 감소되었다. 특히, DSF-Cu 혼합처리구에서는 매우 강력하게 억제하고 있어서 PI3K/AKT 의존성 악성종양, 암, 종양치료제로서 사용할 수 있다고 사료된다. 또한 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101)-Cu과의 킬레이트에서도 고농도에서 억제양상을 보였다.

그리고 AKT 발현 및 phospho-AKT 분석에서도 혼합처리구에서 현저하게 발현 억제가 관찰되었다. 그러나 phospho-Akt는 DSF-Cu 혼합처리구에서만 유일하게 관찰되었다. 따라서 DSF-Cu 킬레이트 복합체가 PTEN을 강력하게 억제함으로써, PI3K/AKT 경로가 활성화된 것으로 사료된다.

ALDH2 발현 분석:

암 줄기세포(cancer stem cells, CSC)를 다양한 화학요법(chemotherapeutic)에서 세포 내 미세소관(microtubele) 저항성으로 인하여 암 치료에 걸림돌로 작용하고 있다. 최근 이런 내성기작을 갖는 원인이 P-glycoprotein(P-gp)이 과잉발현인 것으로 밝혀졌다. 그리고 CSC의 약물내성은 ALDH의 높은 발현 수준에 기인된 것으로 보고된 바 있다. ALDH 활성은 다양한 암세포 유형에서 CSC이 표지인자임을 보여주는 증거가 있다.

도 14에서 보이는 바와 같이, 단일처리구에서는 발현양상이 변화가 없으나, DSF-Cu 혼합처리구에서는 강력하게 발현을 억제하고 있으며, 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101)-Cu 혼합처리구에서는 농도와 시간별 모두 억제하는 경향을 보였다.

Nrf2 발현 분석:

Nrf2-ARE (Nrf2, nuclear factor-erythroid-2-related factor; ARE, antioxidant response element) 신호전달 기작은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)과 반응질소종(reactive nitrogen species, RNS)의 과도한 생산을 포함하는 산화 스트레스에 대한 세포 손상을 피하기 위한 세포 생존 반응이다.

불활성 상태의 Nrf2는 세포질 내에서 Nrf2-Keap1 복합체 형태로 존재한다. 그리고 Nrf2 활성화를 유도하는 커큐민, 레스베라트롤 및 시스테인 티올 변형 화합물이 자극하면 Keap1으로부터 Nrf2의 해리되어 세포질에서 핵으로 이동하여 ARE 프로모터 영역에 binding하여 다양한 해독유전자들을 활성화시킨다.

대표적으로 알려진 유전자로는 NQO1, 글루타티온 S-전달효소, 테레오독신, 헴산화효소(HO-1)과 같은 항산화 효소가 있다. 최근에, Nrf2의 기능이 알려지면서 해독/항산화 효소의 발현을 가속화시키고 세포의 증식을 유도하는 다양한 인간 암세포에서 발견되었다.

유망한 chemopeventive로 작용하는 천연화합물류로는 페놀 및 황 함유 화합물이다. 페놀 화합물은 항암 작용을 비롯한 여러 생물학적 활성에 잘 알려져 있다. Nrf2/Keap1 신호 전달을 통한 2 단계 해독 및 항산화 방어 효소의 유도 경로는 폴리페놀의 암 화학예방효과에 대한 가장 중요한 분자기작 중 하나로 인식되어 왔다.

커큐민과 레스베라트롤은 여러 유형의 화학적 예방특성을 지닌 천연 화합물로 광범위하게 연구되어 왔고, 화학적으로 유도된 여러 동물 발암 모델에서 종양 발생의 억제는 녹차 폴리페놀에 대해서도 입증된 바 있다.

Epigallocatechin-3-gallate (30)와 epicatechin-3-gallate (31)은 ARE 매개 루시퍼 라제 활성의 강력한 유도를 보이는 Nrf2 활성화제로 알려져 있다.

이에, 본 발명의 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101)을 농도별 처리 후 분석한 결과, 대조군과 DSF 처리구에서는 Nrf2가 유도되지 않았으나, Cu 처리구에서는 대조군 대비 현저하게 발현되었다. 또한, 실시예 1의 흑무 거피 추출물(101)-Cu와의 단독 또는 혼합처리구 모두에서 Nrf2는 현저하게 발현되었다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims

십자과(Brassicaceae family) 식물 추출물 및 Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체를 유효성분으로 함유하며,
상기 십자과 식물 추출물이 흑무(Black Radish, Raphanus sativus L. var. niger) 추출물이고,
상기 Cu(II) 금속화합물이 킬레이트된 복합체는 Cu(Ⅱ)-글루코네이트 또는 Cu-DSF이며,
암 질환, 염증관련 관절염 및 동맥경화로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 질환에 유효한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 흑무 추출물이 흑무 거피 추출물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 킬레이트된 복합체가 활성산소종(ROS)의 생성촉진을 통한 세포자멸사(apoptosis) 거동을 가지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암 질환은 간암, 유방암, 난소 암, 폐암, 뇌암 및 위암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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