KR20110114346A - 비파 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물 - Google Patents
비파 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 비파 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 비파 추출물은 암세포를 이용하여 측정한 항암효과 즉, 암세포에 대한 세포사멸 효과가 있고, 암전이 저해 효과가 우수한 것으로 확인되었을 뿐만 아니라, 천연물 추출물이므로 부작용과 안전성 관련 문제가 거의 없고 실험결과 세포 독성도 없으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 상기 약학 조성물은 암을 치료, 예방 또는 개선하기 위하여 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 항암효과가 있는 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
암은 제어되지 않는 세포성장으로 특징 지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양(tumor)이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 정상조직 또는 기관으로 침윤하여 파괴시키고 새로운 성장장소를 만들 수 있어 개체의 생명을 빼앗아 갈 수 있는 질환 군을 총칭한다.
이러한 암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있고, 의학 기술 또한 혁신적으로 발전하고 있음에도 불구하고, 암의 발생 및 암에 의한 사망은 계속 증가추세에 있다. 세계 보건 기구의 최근 통계 자료에 의하면 전세계적으로 연간 약 1천만 명 이상의 새로운 암환자가 발생하는 것으로 알려져 있으며, 우리나라에서도 암은 가장 높은 사망원인으로 연간 약 십만 명 이상이 진단되고, 약 6만 명 이상이 암에 의해 사망하고 있다.
암의 발생요인으로는 여러 가지가 있으며, 유전인자 또는 면역학적 요인 등의 내적 요인과 화학물질, 방사선 또는 바이러스 등의 외적 요인으로 구분되기도 한다. 특히, 최근 암 환자의 증가와 관련하여, 현대 사회에서 암이 발생되는 원인은 유전적 요인보다 환경적 요인이 더 큰 비중을 차지하고 있는 것으로 알려져 있고, 특히 식생활에서 오는 발암율은 환경적 요인의 36%로서 매우 높은 것으로 알려져 있어서, 현대 사회에서의 생활환경이 근원적으로 변화되지 않는 이상 이러한 암의 발병률 및 암에 의한 사망자 수의 증가추세는 계속해서 유지될 것으로 보인다. 특히, 암은 조기에 발견되지 못할 경우 완치가 거의 불가능하고, 병이 진전될수록 환자와 가족의 고통과 경제적 손실이 막대하며, 의료 보험의 재정고갈 등 사회적으로도 큰 비용을 초래한다는 점에서 암의 예방과 조기 치료의 중요성은 더욱 강조되고 있는 실정이다.
최근에는 암의 발생과 전이, 암세포의 생리, 암의 진단과 치료에 대한 연구와 함께 식품을 비롯한 항암 효과를 지니는 물질 검색을 통하여 새로운 암 치료제가 개발되고 있는 추세이다. 구체적으로, 종양의 혈액공급을 중단시키는 것을 목표로 한 약물인 혈관신생억제제(angiogenesis inhibitor)가 있다. 또한, 암세포의 성장 또는 암세포가 다른 조직으로 퍼져나가는 암전이에 필요한 산소와 영양분을 공급받기 위해, 혈관 형성(angiogenesis)이 요구되며, 이러한 혈관 형성에는 내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 또는 세포간 접착 분자(intracellular adhesion molecule, ICAM) 등이 밀접하게 관련되어 있다. 또한, 암의 전이(침윤)에는 유로키나제 플라스미노겐 활성물(urokinase plasminogen activator, uPA)이 관련되어 있으며, 암의 전이과정에서 수반되는 암세포 부착에는 인테그린-알파(Integrin-α)가 관련되어 있다.
암이 발병되어 진행이 계속될 경우 수술 등의 외과적 치료법과 함께 약물처방 등과 같은 화학적 치료법이나 방사선치료 등을 병행하여 집중적인 치료를 해야 하지만, 이와 같은 약물 치료 등과 같은 화학적 치료법에 사용되는 암세포 사멸제 등은 그 독성 등의 후유증을 배제할 수 없으므로, 안정성과 치료효과 모두를 담보하기 위하여, 이러한 다양한 접근방법에 기초한 암 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있기 때문이다.
암화(carcinogenesis)과정은 다단계로 이루어지는 것으로 예상되는데, 각 단계마다 특이적인 분자 또는 세포수준에서의 변화를 수반한다. 상기 암화 과정은 크게 (a) 발암물질에 의해 DNA에 돌연변이가 유도되는 개시단계, (b) 양성 종양 (benign tumor)이 나타나는 촉진단계, (c) 양성종양이 악성종양 (malignant tumor)으로 변환되는 진행단계와 (d) 악성 정도의 증가 및 전이로의 진행단계와 같이 다단계로 진행되는 것으로 추정된다.
현재 보고된 항암제를 포함한 치료제는 주로 상기 악성종양으로 변환되는 진행단계에서 악성종양에 해당하는 암세포를 제거하기 위한 물질들이 주를 이루고 있다.
그러나, 상기 암세포는 정상세포와 많은 면에서 그 성질이 유사하므로 정상세포에는 피해를 주지 않고 암세포만을 제거하는 것은 쉬운 일이 아니다.
기존 암세포의 제거를 위해 사용되는 화학요법은 주로 항암물질을 환자에게 투여하는 방법으로, 종래 보고된 약 40 여종의 화학물질은 강한 세포독성을 나타내 정상세포에 대해서도 강한 세포독성을 나타내므로, 많은 부작용을 유발하는 문제점이 있다. 특히, 암세포의 특징 중 하나인 유전적인 불안정성은 암세포 스스로가 화학요법제에 대한 내성을 유도하는 원인으로 보고되어, 항암제 투여를 통한 암치료의 문제점으로 보고되어 있다.
따라서, 암세포 자체에 대한 사멸효과를 강조하던 기존 항암 치료제에 대한 연구에 수술요법과 연관을 맺어 암세포의 전이를 막아 다른 기관으로 악성 종양이 전이되는 것을 차단하는 연구가 추가되고 있는 실정이다. 암세포의 전이를 차단할 경우, 유방암이나 위암 등과 같이 외과적 수술에 의해 해당 부위의 악성 종양을 제거함으로써 환자의 생존율을 현저하게 증가시킬 수 있기 때문이다. 이러한 접근방법으로 최근 암세포의 침윤이나 혈관신생을 억제하는 것을 목적으로 하는 항암제의 개발을 위한 연구가 진행되고 있다.
한편, 기존 화학요법에 사용되는 화학물질의 경우 강한 세포독성으로 인하여 많은 부작용이 유발되므로, 종래 천연물, 특히 식물 또는 식물생약으로부터 항암제를 개발하려는 연구가 이루어지고 있다. 이러한 천연물 유래 항암제로 대표적인 것은 주목나무에서 분리한 택솔(Taxol; 파클리탁셀)이 있으나, 암세포 사멸뿐만 아니라 신체 내 다른 정상세포에도 작용하기 때문에 다른 질환을 유발할 수 있는 문제점을 안고 있으며, 물에 대한 용해도가 낮아서 독성 및 부작용이 심각한 것으로 보고되어 있다.
상기와 같은 요구에 부응하기 위하여, 본 발명은 암세포 사멸효과 뿐만 아니라 암 전이를 차단할 수 있으면서도, 부작용이 문제되지 않는 천연물 유래 항암 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천연물 즉, 식물 유래 유효성분을 포함하는 항암 조성물을 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 비파 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물을 제공한다.
본 발명의 발명자들은 상기 비파 추출물은 인간의 유방암 세포인 MDA-MB-231 세포 및 MCF-7 세포를 이용하여 Cell Proliferation Assay를 수행한 결과 암세포 사멸효과가 있고, 상기 MDA-MB-231 세포 및 MCF-7 세포를 이용하여 Cell Adhesion assay, Cell Wounding migration assay 및 Cell Invasion assay를 수행한 결과 암세포의 부착, 전이 및 침윤을 효과적으로 제어할 수 있는 것으로 확인되었으며, 암세포의 저촉저해를 통해 암전이를 저해할 수 있는 것으로 보고된 메탈로프로테아제(Metalloproteinase)인 기질금속단백분해효소(Matrix metalloproteinase, MMP)의 활성을 확인한 결과, MMP-9의 활성을 효과적으로 억제하여, 암세포의 전이를 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 천연물로부터 유래된 것으로 부작용이 문제될 가능성도 낮다는 것을 확인하여, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 비파 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다.
상기 비파(Eriobotrya japonica)는 장미과 상록소교목에 속하는 식물로, 가지가 굵고 잎 뒷면과 더불어 연한 노란빛을 띤 갈색 털이 빽빽이 난다. 잎은 어긋나고 거꾸로 세운 듯한 넓은 바소꼴이며, 가장자리에 이 모양 톱니가 있고, 열매는 구형 또는 타원형으로 식용으로 사용된다. 상기 비파는 비파 씨 또는 비파 잎일 수 있고, 바람직하게는 비파 잎일 수 있다. 상기 비파 잎의 경우 비파 씨에 비하여 암세포 저해효과가 우수할 뿐만 아니라 암 전이와 관련하여, 암세포 부착(Cell Adhesion assay), 암세포 이동(Cell Wounding migration assay) 및 암세포 침윤(Cell Invasion assay)과 관련된 실험한 결과, 비파 잎에 비하여 암세포 부착, 암세포 이동 및 암세포 침윤에 대한 저해 효과가 현저하게 우수한 것으로 확인되었으므로, 비파 잎은 비파 씨에 비하여 현저하게 우수한 항암효과가 있는 것으로 확인되었다.
상기 비파 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 일 예로 비파의 꽃, 잎, 가지, 뿌리, 열매 또는 껍질이나 이의 분쇄물, 바람직하게는 비파의 잎에 추출용매를 가함으로써 제조하거나 추출용매로 추출하여 제조한 조추출물에 분획용매를 가하여 분획하여 제조된 것일 수 있다.
상기 추출용매는 물 및 유기용매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 5의 알코올, 상기 알코올의 희석수, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매와 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 5의 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소프로판올 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 알코올 희석수는 알콜을 30 내지 99.9%(v/v)로 물에 희석한 것일 수 있다.
본 발명의 비파 추출물의 추출용매는 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 알코올 희석수 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 내지 5의 알코올 희석수로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 45 내지 85% 에탄올 수용액일 수 있다. 비파 에탄올 수용액 추출물의 경우 비파 물 추출물에 비하여 암세포 성장저해 효과가 우수할 뿐만 아니라 달리 실험동물을 이용하여 측정한 결과 종양 발생 억제 효과 및 세포 조직의 비정상적 변화를 억제할 수 있는 효과가 우수한 것으로 확인되었으므로, 에탄올 또는 에탄올 수용액이 물에 비하여 비파 추출물의 용매로 바람직한 것이 확인되었다.
상기 추출과정은 일 예로, 4℃ 내지 120℃, 또는 50℃ 내지 90℃, 또는 60℃ 내지 80℃에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 추출시간은 특별히 한정되지는 않으나, 10분 내지 60시간일 수 있다.
본 발명의 비파 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 구체적으로는 냉침추출법, 온침추출법, 열 추출법, 초음파 추출법 등일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다.
또한, 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수 있다. 상기 분획 시 용매는 2종 이상 사용할 수 있으며, 용매의 극성에 따라 순차적으로 사용하거나 혼합하여 사용하여, 각 용매 추출물을 제조할 수 있다.
상기 분획용매는 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 부탄올, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 클로로포름 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 클로로포름일 수 있다. 상기 클로로포름은 다른 용매에 비하여 암세포 성장억제 효과 즉, 항암효과가 현저하게 우수하고, 에틸아세테이트도 물 또는 부탄올에 비하여 항암효과가 우수한 것으로 확인되었다.
상기 제조된 추출물 또는 상기 분획과정을 수행하여 수득한 분획물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일 예로 회전 증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있으며, 상기 건조는 일 예로 동결건조법으로 수행할 수 있다.
상기 항암 조성물의 유효성분인 비파 추출물은 항암 활성이 우수할 뿐만 아니라, 식용으로 사용될 수 있는 천연식물을 이용하여 제조한 것이므로 부작용 등이 문제될 가능성이 적고, 안전성이 우수하므로, 상기 항암 조성물은 암의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물 또는 암의 개선 또는 예방을 위한 식품 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 항암 조성물 또는 상기 비파 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물은 유효성분으로 상기 항암 조성물 또는 상기 비파 추출물을 단독으로 포함할 수 있으며, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 암은 악성 종양(malignant tumor)이라고도 하며, 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 덩어리로 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산되거나 전이되어 생명을 위협하게 되는 질환을 의미하고, 상기 암은 암종(carcinoma)과 육종(sarcoma)을 포함하며, 일 예로 유방암, 위암, 간암, 폐암, 대장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 뇌척수종양, 두경부암, 흉선종, 식도암, 췌장암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병 및 다발성 골수종 등일 수 있다.
상기 암 치료 또는 예방용 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용될 수 있다. 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하고, 소화기관, 배설기관 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하며, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 항암 조성물 또는 상기 비파 추출물은 상기 암 치료 또는 예방용 조성물 내에 단독으로 사용될 수 있으며, 그 외 약리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 항암 조성물 또는 상기 비파 추출물을 포함하는 조성물이 약제로 사용되거나, 의약 또는 약학적 용도로 사용되는 경우, 상기 항암 조성물 또는 상기 비파 추출물은 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 사용될 수 있다.
이 경우 상기 조성물 내 상기 항암 조성물 또는 상기 비파 추출물의 함량은 0.001 중량 % 내지 99.9 중량 %, 0.1 중량% 내지 99 중량% 또는 1 중량% 내지 20 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 조성물의 사용태양 및 사용방법에 따라 상기 항암 조성물 또는 상기 비파 추출물의 함량은 약학적으로 유효한 양 또는 바람직한 양으로 적절히 조절하여 사용될 수 있다.
상기 ‘약학적으로 허용되는’이란 생리학적으로 허용되고 동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 또한, 상기 암 치료 또는 예방용 조성물은 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, pH 조절제, 영양제, 비타민, 전해질, 알긴산 및 그의 염, 펙트산 및 그의 염, 보호성 콜로라이드, 글리세린, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분들은 상기 항암 조성물 또는 상기 비파 추출물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 공지의 항암제로 사용되는 물질을 더욱 포함할 수 있다.
상기 암 치료 또는 예방용 조성물이 약제로 사용하는 경우 투여방법은 경구 또는 비경구 모두 가능하며, 일 예로는 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.
또한, 상기 암 치료 또는 예방용 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으며, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 일반적으로는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제(TABLETS), 알약, 연질 또는 경질 캅셀제(CAPSULES), 환제(PILLS), 산제(POWDERS) 및 과립제(GRANULES) 등이 포함되고, 이러한 제제는 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제(SUSTESIONS), 내용액제, 유제(EMULSIONS) 및 시럽제(SYRUPS) 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 형태는 크림(CREAM), 로션제(LOTIONS), 연고제(ONITMENTS), 경고제(PLASTERS), 액제(LIQUIDS AND SOULTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 유동엑스제(FRUIDEXTRACTS), 엘릭서(ELIXIR), 침제(INFUSIONS), 향낭(SACHET), 패취제(PATCH) 또는 주사제(INJECTIONS) 등의 형태일 수 있다.
더 나아가, 본 발명의 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 제형화될 수 있다.
상기 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 일 예로 1일 유효성분을 기준으로 하였을 때 0.1 mg/kg(체중) 내지 500 mg/kg(체중), 0.1 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 1 mg/kg(체중) 내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항암 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다. 상기 본 발명의 항암 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 개선 또는 예방용 식품 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 예로는 식품, 식품첨가제, 음료 또는 음료첨가제를 들 수 있다.
본 명세서에서 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이다.
상기 항암 조성물 또는 상기 비파 추출물이 포함될 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영아식 또는 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료, 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 항암 조성물 또는 상기 비파 추출물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 첨가제는 본 발명의 상기 항암 조성물 또는 상기 비파 추출물 100 중량부 당 0 내지 20 중량부, 바람직하게는 0.00001 내지 15 중량부 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.
상기 기능성 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 상기 항암 조성물 또는 상기 비파 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 중량부 내지 20 중량부, 바람직하게는 1 중량부 내지 18 중량부, 더욱 바람직하게는 5 중량부 내지 12 중량부 포함될 수 있다.
또한, 상기 항암 조성물 또는 상기 비파 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 개선 또는 예방용 식품 조성물에 있어서, 상기 항암 조성물 또는 상기 비파 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.00001 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 음료 조성물의 경우 식품 전체의 부피 100 ml를 기준으로 0.001 g 내지 50 g, 바람직하게는 0.01 g 내지 10 g의 비율로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 비파 추출물은 암세포에 대한 세포성장실험(Cell Proliferation Assay) 분석결과 암세포 사멸효과를 가지며, 암세포를 이용한 암세포 부착(Cell Adhesion assay), 암세포 이동(Cell Wounding migration assay) 및 암세포 침윤(Cell Invasion assay)에 대한 유의적 억제능을 가지며, 동물실험에 의해 측정한 결과 유의적으로 암의 발생을 억제하는 것으로 확인되었을 뿐만 아니라, 식품으로 이용가능한 천연물로부터 유래된 것으로 부작용이 문제될 가능성도 낮으므로, 암 특히 암이 전이되기 전단계에서는 치료가 용이하나, 암이 전이된 후에는 사망률이 현저하게 상승되는 유방암 또는 위암을 포함한 다양한 암의 치료, 개선 및 예방을 위하여 여러 방면으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, MDA-MB-231 세포주 및 MCF-7 세포주를 이용하여, 비파 추출물의 부위별 항암효과 즉, 암세포 성장저해 효과를 확인하기 위하여, 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 상기 그래프에서 가로축의 수치는 비파 추출물의 투여량(㎍/mL)을 나타내는 수치이고, 세로축의 수치는 각 실험군에서 측정된 세포의 수를 비파 추출물을 투여하지 않은 대조군(DMSO 투여군 또는 control)에 대한 상대값으로 환산한 값으로, 도 1a는 MDA-MB-231 세포주에 대한 측정결과이고, 도 1b는 MCF-7 세포주에 대한 측정결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, MDA-MB-231 세포주 및 MCF-7 세포주를 이용하여, 비파 추출물의 용매별 항암효과 즉, 암세포 성장저해 효과를 확인하기 위하여, 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 상기 그래프에서 가로축의 수치는 비파 추출물의 투여량(㎍/mL)을 나타내는 수치이고, 세로축의 수치는 각 실험군에서 측정된 세포의 수를 비파 추출물을 투여하지 않은 대조군(DMSO 투여군 또는 control)에 대한 상대값으로 환산한 값으로, 도 2a는 MDA-MB-231 세포주에 대한 측정결과이고, 도 2b는 MCF-7 세포주에 대한 측정결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, MDA-MB-231 세포주를 이용하여, 비파 추출물의 분획물의 분획용매별 항암효과 즉, 암세포 성장저해 효과를 확인하기 위하여, 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 상기 그래프에서 가로축의 수치는 비파 분획물의 분획용매의 종류를 나타내는 것이고, 세로축의 수치는 각 실험군에서 측정된 세포의 수를 비파 추출물을 투여하지 않은 대조군(DMSO 투여군 또는 control)에 대한 상대값으로 환산한 값이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, MDA-MB-231 세포주를 이용하여, 비파 추출물의 클로로포름 분획물의 농도에 따른 항암효과 즉, 암세포 성장저해 효과를 확인하기 위하여, 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 상기 그래프에서 가로축의 수치는 비파 추출물의 클로로포름 분획물의 투여량(㎍/mL)을 나타내는 수치이고, 세로축의 수치는 각 실험군에서 측정된 세포의 수를 비파 추출물의 클로로포름 분획물을 투여하지 않은 대조군(DMSO 투여군 또는 control)에 대한 상대값으로 환산한 값이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, MDA-MB-231 세포주 및 MCF-7 세포주를 이용하여, 비파 추출물의 항암효과 즉, 암세포 부착(adhesion) 저해효과를 확인하기 위하여, 부착된 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 상기 그래프에서 가로축의 수치는 비파 추출물의 투여량(㎍/mL)을 나타내는 수치이고, 세로축의 수치는 각 실험군에서 측정된 세포의 수를 비파 추출물을 투여하지 않은 대조군(DMSO 투여군 또는 control)에 대한 상대값으로 환산한 값으로, 도 5a는 MDA-MB-231 세포주에 대한 측정결과이고, 도 5b는 MCF-7 세포주에 대한 측정결과이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따른, MDA-MB-231 세포주 및 MCF-7 세포주를 이용하여, 비파 추출물의 항암효과 즉, 암 전이(migration) 저해효과를 확인하기 위하여, 암세포수의 이동 정도를 촬영한 사진으로, 상기 도 6a 및 도 6b는 MDA-MB-231 세포주에 대한 사진으로, 도 6a는 비파 잎 추출물의 결과이고, 도 6b는 비파 씨 추출물의 결과이며, 사진 하단 부분은 비파 추출물의 투여량(㎍/mL)량을 나타내는 수치이고, 상기 도 6c 및 도 6d는 MCF-7 세포주에 대한 사진으로, 도 6c는 비파 잎 추출물의 결과이고, 도 6d는 비파 씨 추출물의 결과이며, 사진 상단 부분은 배양시간을 나타내고, 사진 가운데 부분은 비파 추출물의 투여량(㎍/mL)을 나타내는 수치이다.
도 7는 본 발명의 일 실시예에 따른, MDA-MB-231 세포주 및 MCF-07 세포주를 이용하여, 비파 추출물의 항암효과 즉, 암세포의 침윤을 억제하여 암 전이를 저해하는 효과를 확인한 것으로, 도 7a는 MDA-MB-231 세포주를 이용하여 암 세포의 침윤 여부를 촬영한 사진이고, 도 7c는 MCF-07 세포주를 이용하여 암 세포의 침윤 여부를 촬영한 사진으로, 사진의 하단에 표시된 수치는 비파 추출물의 종류 및 투여량(㎍/mL)량을 나타내는 수치이고, 도 7b는 MDA-MB-231 세포주를 이용하여 침윤된 암세포수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 7c는 MCF-07 세포주를 이용하여 침윤된 암세포수를 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 상기 그래프에서 가로축의 수치는 비파 추출물의 투여량(㎍/mL)을 나타내는 수치이고, 세로축의 수치는 각 실험군에서 침윤한 세포의 수를 비파 추출물을 투여하지 않은 대조군(DMSO 투여군 또는 control)에 대한 상대값으로 나타낸 수치이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, MDA-MB-231 세포주를 이용하여, 비파 추출물의 항암효과 즉, 암세포의 침윤을 억제하여 암 전이를 저해하는 효과를 확인하기 위하여, 암세포 내에 활성화된 MMP-2 및 MMP-9의 양을 확인한 사진으로, 사진 좌측의 표시는 단백질의 종류를 나타내고, 사진 우측의 표시는 세포의 종류를 나타내며, 사진 가운데의 숫자는 비파 추출물의 종류 및 투여량(㎍/mL)을 구분하는 표시이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 실험동물의 상태를 확인하기 위하여 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 상기 그래프에서 가로축의 사육기간을 나타내고, 세로축의 수치는 측정값(체중 또는 식이 섭취량)이나 계산값(식이효율, FER)을 나타내며, NC는 양성대조군(Normal+Control)을 의미하고, DC는 음성대조군(DMBA+Control)을 의미하며, DE는 비파 에탄올 추출물을 의미하고, DW는 비파 물 추출물을 의미하며, Control은 대조식이인 AIN 식이만을 섭취시킨 실험동물을 의미하고, DMBA는 DMBA를 주입하여 암을 유발한 실험군을 의미하며, 도 9a는 체중을 측정한 결과이고, 도 9b는 식이 섭취량을 측정한 결과이며, 도 9c는 식이효율(food efficiency ratio, FER)을 계산한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, 실험동물을 이용하여 비파 추출물의 항암효과를 확인한 그래프로, 상기 그래프에서 가로축은 실험군의 종류를 나타내고, 세로축의 수치는 실험동물 마리 당 확인된 종양 수를 의미하며, DC는 음성대조군(DMBA+Control)을 의미하고, DE는 비파 에탄올 추출물을 의미하며, DW는 비파 물 추출물을 의미하고, Control은 대조식이인 AIN 식이만을 섭취시킨 실험동물을 의미하고, DMBA는 DMBA를 주입하여 암을 유발한 실험군을 의미한다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, 실험동물을 이용하여 비파 추출물의 항암효과를 확인한 사진으로, 실험동물의 조직 절편을 헤마톡실린 및 이오신(Hematoxylin & Eosin, H&E)으로 염색한 사진이고, DC는 음성대조군(DMBA+Control)을 의미하며, DE는 비파 에탄올 추출물을 의미하고, DW는 비파 물 추출물을 의미하며, Control은 대조식이인 AIN 식이만을 섭취시킨 실험동물을 의미하고, DMBA는 DMBA를 주입하여 암을 유발한 실험군을 의미한다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, 실험동물을 이용하여 비파 추출물의 항암효과를 확인하기 위하여 실험동물의 조직절편의 조직학적 등급을 표시한 그래프로, DC는 음성대조군(DMBA+Control)을 의미하며, DE는 비파 에탄올 추출물을 의미하고, DW는 비파 물 추출물을 의미하며, Control은 대조식이인 AIN 식이만을 섭취시킨 실험동물을 의미하고, DMBA는 DMBA를 주입하여 암을 유발한 실험군을 의미하며, 상기 도 12a는 실험동물의 조직 절편의 tubule formation과 관련된 조직학적 등급을 나타낸 그래프이고, 도 12b는 실험동물의 조직 절편의 nuclear pleomorphism과 관련된 조직학적 등급을 나타낸 그래프이며, 도 12c는 실험동물의 조직 절편의 mitotic rate과 관련된 조직학적 등급을 나타낸 그래프이고, 도 12d는 실험동물의 조직 절편의 전체 조직학적 등급을 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른, 실험동물을 이용하여 비파 추출물의 항암효과를 확인한 사진으로, BrdU IHC kit를 이용하여 조직절편에 대한 면역 조직 화학적 검사를 수행한 사진이고, DC는 음성대조군(DMBA+Control)을 의미하며, DE는 비파 에탄올 추출물을 의미하고, DW는 비파 물 추출물을 의미하며, Control은 대조식이인 AIN 식이만을 섭취시킨 실험동물을 의미하고, DMBA는 DMBA를 주입하여 암을 유발한 실험군을 의미한다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른, 실험동물을 이용하여 비파 추출물의 항암효과를 확인한 그래프로, BrdU IHC kit를 이용하여 조직절편에 대한 면역 조직 화학적 검사를 수행한 후, 염색된 세포를 계수한 결과를 나타내는 그래프로, DC는 음성대조군(DMBA+Control)을 의미하며, DE는 비파 에탄올 추출물을 의미하고, DW는 비파 물 추출물을 의미하며, Control은 대조식이인 AIN 식이만을 섭취시킨 실험동물을 의미하고, DMBA는 DMBA를 주입하여 암을 유발한 실험군을 의미한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, MDA-MB-231 세포주 및 MCF-7 세포주를 이용하여, 비파 추출물의 용매별 항암효과 즉, 암세포 성장저해 효과를 확인하기 위하여, 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 상기 그래프에서 가로축의 수치는 비파 추출물의 투여량(㎍/mL)을 나타내는 수치이고, 세로축의 수치는 각 실험군에서 측정된 세포의 수를 비파 추출물을 투여하지 않은 대조군(DMSO 투여군 또는 control)에 대한 상대값으로 환산한 값으로, 도 2a는 MDA-MB-231 세포주에 대한 측정결과이고, 도 2b는 MCF-7 세포주에 대한 측정결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, MDA-MB-231 세포주를 이용하여, 비파 추출물의 분획물의 분획용매별 항암효과 즉, 암세포 성장저해 효과를 확인하기 위하여, 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 상기 그래프에서 가로축의 수치는 비파 분획물의 분획용매의 종류를 나타내는 것이고, 세로축의 수치는 각 실험군에서 측정된 세포의 수를 비파 추출물을 투여하지 않은 대조군(DMSO 투여군 또는 control)에 대한 상대값으로 환산한 값이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, MDA-MB-231 세포주를 이용하여, 비파 추출물의 클로로포름 분획물의 농도에 따른 항암효과 즉, 암세포 성장저해 효과를 확인하기 위하여, 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 상기 그래프에서 가로축의 수치는 비파 추출물의 클로로포름 분획물의 투여량(㎍/mL)을 나타내는 수치이고, 세로축의 수치는 각 실험군에서 측정된 세포의 수를 비파 추출물의 클로로포름 분획물을 투여하지 않은 대조군(DMSO 투여군 또는 control)에 대한 상대값으로 환산한 값이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, MDA-MB-231 세포주 및 MCF-7 세포주를 이용하여, 비파 추출물의 항암효과 즉, 암세포 부착(adhesion) 저해효과를 확인하기 위하여, 부착된 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 상기 그래프에서 가로축의 수치는 비파 추출물의 투여량(㎍/mL)을 나타내는 수치이고, 세로축의 수치는 각 실험군에서 측정된 세포의 수를 비파 추출물을 투여하지 않은 대조군(DMSO 투여군 또는 control)에 대한 상대값으로 환산한 값으로, 도 5a는 MDA-MB-231 세포주에 대한 측정결과이고, 도 5b는 MCF-7 세포주에 대한 측정결과이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따른, MDA-MB-231 세포주 및 MCF-7 세포주를 이용하여, 비파 추출물의 항암효과 즉, 암 전이(migration) 저해효과를 확인하기 위하여, 암세포수의 이동 정도를 촬영한 사진으로, 상기 도 6a 및 도 6b는 MDA-MB-231 세포주에 대한 사진으로, 도 6a는 비파 잎 추출물의 결과이고, 도 6b는 비파 씨 추출물의 결과이며, 사진 하단 부분은 비파 추출물의 투여량(㎍/mL)량을 나타내는 수치이고, 상기 도 6c 및 도 6d는 MCF-7 세포주에 대한 사진으로, 도 6c는 비파 잎 추출물의 결과이고, 도 6d는 비파 씨 추출물의 결과이며, 사진 상단 부분은 배양시간을 나타내고, 사진 가운데 부분은 비파 추출물의 투여량(㎍/mL)을 나타내는 수치이다.
도 7는 본 발명의 일 실시예에 따른, MDA-MB-231 세포주 및 MCF-07 세포주를 이용하여, 비파 추출물의 항암효과 즉, 암세포의 침윤을 억제하여 암 전이를 저해하는 효과를 확인한 것으로, 도 7a는 MDA-MB-231 세포주를 이용하여 암 세포의 침윤 여부를 촬영한 사진이고, 도 7c는 MCF-07 세포주를 이용하여 암 세포의 침윤 여부를 촬영한 사진으로, 사진의 하단에 표시된 수치는 비파 추출물의 종류 및 투여량(㎍/mL)량을 나타내는 수치이고, 도 7b는 MDA-MB-231 세포주를 이용하여 침윤된 암세포수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 7c는 MCF-07 세포주를 이용하여 침윤된 암세포수를 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 상기 그래프에서 가로축의 수치는 비파 추출물의 투여량(㎍/mL)을 나타내는 수치이고, 세로축의 수치는 각 실험군에서 침윤한 세포의 수를 비파 추출물을 투여하지 않은 대조군(DMSO 투여군 또는 control)에 대한 상대값으로 나타낸 수치이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, MDA-MB-231 세포주를 이용하여, 비파 추출물의 항암효과 즉, 암세포의 침윤을 억제하여 암 전이를 저해하는 효과를 확인하기 위하여, 암세포 내에 활성화된 MMP-2 및 MMP-9의 양을 확인한 사진으로, 사진 좌측의 표시는 단백질의 종류를 나타내고, 사진 우측의 표시는 세포의 종류를 나타내며, 사진 가운데의 숫자는 비파 추출물의 종류 및 투여량(㎍/mL)을 구분하는 표시이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 실험동물의 상태를 확인하기 위하여 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 상기 그래프에서 가로축의 사육기간을 나타내고, 세로축의 수치는 측정값(체중 또는 식이 섭취량)이나 계산값(식이효율, FER)을 나타내며, NC는 양성대조군(Normal+Control)을 의미하고, DC는 음성대조군(DMBA+Control)을 의미하며, DE는 비파 에탄올 추출물을 의미하고, DW는 비파 물 추출물을 의미하며, Control은 대조식이인 AIN 식이만을 섭취시킨 실험동물을 의미하고, DMBA는 DMBA를 주입하여 암을 유발한 실험군을 의미하며, 도 9a는 체중을 측정한 결과이고, 도 9b는 식이 섭취량을 측정한 결과이며, 도 9c는 식이효율(food efficiency ratio, FER)을 계산한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, 실험동물을 이용하여 비파 추출물의 항암효과를 확인한 그래프로, 상기 그래프에서 가로축은 실험군의 종류를 나타내고, 세로축의 수치는 실험동물 마리 당 확인된 종양 수를 의미하며, DC는 음성대조군(DMBA+Control)을 의미하고, DE는 비파 에탄올 추출물을 의미하며, DW는 비파 물 추출물을 의미하고, Control은 대조식이인 AIN 식이만을 섭취시킨 실험동물을 의미하고, DMBA는 DMBA를 주입하여 암을 유발한 실험군을 의미한다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, 실험동물을 이용하여 비파 추출물의 항암효과를 확인한 사진으로, 실험동물의 조직 절편을 헤마톡실린 및 이오신(Hematoxylin & Eosin, H&E)으로 염색한 사진이고, DC는 음성대조군(DMBA+Control)을 의미하며, DE는 비파 에탄올 추출물을 의미하고, DW는 비파 물 추출물을 의미하며, Control은 대조식이인 AIN 식이만을 섭취시킨 실험동물을 의미하고, DMBA는 DMBA를 주입하여 암을 유발한 실험군을 의미한다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, 실험동물을 이용하여 비파 추출물의 항암효과를 확인하기 위하여 실험동물의 조직절편의 조직학적 등급을 표시한 그래프로, DC는 음성대조군(DMBA+Control)을 의미하며, DE는 비파 에탄올 추출물을 의미하고, DW는 비파 물 추출물을 의미하며, Control은 대조식이인 AIN 식이만을 섭취시킨 실험동물을 의미하고, DMBA는 DMBA를 주입하여 암을 유발한 실험군을 의미하며, 상기 도 12a는 실험동물의 조직 절편의 tubule formation과 관련된 조직학적 등급을 나타낸 그래프이고, 도 12b는 실험동물의 조직 절편의 nuclear pleomorphism과 관련된 조직학적 등급을 나타낸 그래프이며, 도 12c는 실험동물의 조직 절편의 mitotic rate과 관련된 조직학적 등급을 나타낸 그래프이고, 도 12d는 실험동물의 조직 절편의 전체 조직학적 등급을 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른, 실험동물을 이용하여 비파 추출물의 항암효과를 확인한 사진으로, BrdU IHC kit를 이용하여 조직절편에 대한 면역 조직 화학적 검사를 수행한 사진이고, DC는 음성대조군(DMBA+Control)을 의미하며, DE는 비파 에탄올 추출물을 의미하고, DW는 비파 물 추출물을 의미하며, Control은 대조식이인 AIN 식이만을 섭취시킨 실험동물을 의미하고, DMBA는 DMBA를 주입하여 암을 유발한 실험군을 의미한다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른, 실험동물을 이용하여 비파 추출물의 항암효과를 확인한 그래프로, BrdU IHC kit를 이용하여 조직절편에 대한 면역 조직 화학적 검사를 수행한 후, 염색된 세포를 계수한 결과를 나타내는 그래프로, DC는 음성대조군(DMBA+Control)을 의미하며, DE는 비파 에탄올 추출물을 의미하고, DW는 비파 물 추출물을 의미하며, Control은 대조식이인 AIN 식이만을 섭취시킨 실험동물을 의미하고, DMBA는 DMBA를 주입하여 암을 유발한 실험군을 의미한다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐으로 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으므로, 이는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 비파추출물의 제조
비파(Eriobotrya japonica)를 부위별로 수득하여, 비파 추출물을 제조하였다.
보다 구체적으로, 비파 잎은 대한민국 목포대학교 약초원으로부터 수득하였고, 비파 씨는 대한민국 전라남도 완도에서 재배된 것을 채취하였다. 실험자료의 표준품은 목포대학교 한약자원학과 표본실에 보관하고 있다.
비파 에탄올 추출물은 상기 비파 씨 및 비파 잎을 80% 메탄올 수용액으로 80℃에서 4시간 동안 열탕 추출하여 제조하였고, 비파 잎을 50% 에탄올 수용액으로 80℃에서 4시간 동안 열탕 추출하여 제조하였으며, 비파 물 추출물은 상기 비파 잎을 100℃에서 4시간 동안 열탕 추출하여 제조하였다. 상기 제조된 추출물은 45℃의 수욕상에서 감압농축하고, 동결건조기(freeze dryer system)를 이용하여 48시간 동안 건조시켜 분말 시료를 수득하였다. 상기 제조된 분말은 -20℃의 냉동고에서 보관하였다.
비파 클로로포름 분획물은 상기 수득한 50% 에탄올 수용액 500 ml에 물 500 ml를 첨가하고, 클로로포름(CHCl3) 1,000 ml를 첨가한 후, 분배하여 클로로포름 층을 수득하는 방법으로 제조하였다. 비파 에틸아세테이트 분획물은 상기 클로로포름 층을 제거한 후, 남은 수용액 층에 에틸아세테이트(EtoAc) 1,000 ml를 첨가하고 분배하여, 에틸아세테이트 층을 수득하는 방법으로 제조하였다. 비파 부탄올 분획물은 상기 에틸아세테이트 층을 제거한 후, 남은 수용액 층에 부탄올(BuOH) 1,000 ml를 첨가하고 분배하여, 부탄올 층을 수득하는 방법으로 제조하였다. 상기 부탄올 층을 제거하고 남은 수용액을 비파 물 분획물로 수득하였다. 상기 제조된 분획물은 45℃의 수욕상에서 감압농축하고, 동결건조기(freeze dryer system)를 이용하여 48시간 동안 건조시켜 분말 시료를 수득하였다. 상기 제조된 분말은 -20℃의 냉동고에서 보관하였다.
<실시예 2> 세포주 및 배양조건
상기 세포의 배양(Cell culture)에 사용된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), FBS(fetal bovine serum), RPMI 및 페니실린-스트렙토마이신은 Gibco/BRL(USA)에서 구입하였다.
상기 실시예 1에서 제조된 비파 추출물의 항암효과를 측정하기 위한 인간의 유방암세포인 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포는 ATCC에서 구입하였다.
상기 MDA-MB-231 세포 및 MCF-7 세포는 각각 10% FBS가 포함된 DMEM 배양액을 사용하여 배양하였고, 37℃의 습윤한 CO₂배양기(5% CO₂ 및 95% air 조건)에서 배양하였다. 상기 세포는 계대배양을 하였고, 배지는 2일마다 교환하였다. 보다 구체적으로, 상기 세포가 배양접시의 약 80%가 차게 배양된 후, PBS(Phospate Bufferd Saline, pH 7.4)로 세포의 단층을 2번 씻어내고, 0.25% 트립신(trypsin) 및 2.56 mmol/L EDTA를 이용하여 1분 동안 처리하여 세포가 배양접시로부터 떨어지면, FBS를 포함하는 상기 배양액 동량을 넣고 1,000 rpm의 조건으로 5분간 원심분리하였다. 상기 원심분리를 통해 얻은 세포는 뭉치지 않게 풀어준 후, 새 배지에 희석하여 계대 배양하였다.
<실시예 3> 항암효과 측정1 - Cell Proliferation Assay
상기 실시예 1에서 제조된 각종 비파 추출물의 항암효과를 측정하기 위하여, 인간의 유방암세포인 MDA-MB-231 세포주 및 MCF-7 세포주를 이용하여 실험을 수행하였다.
우선, 상기 실시예 2에서 배양한 세포를 60,000 cells/well의 밀도로 6 well culture plate에 분주하여, 24시간 배양하였다. 상기 24시간 경과 후, 아무런 처리를 하지 않은 대조군과 다양한 농도의 상기 실시예 1의 비파 추출물을 처리하면서 5일간 더 배양하였다. 상기 비파 추출물은 각 농도별로 DMSO에 용해하여 사용하였다. 상기 배양기간 동안 배양액은 날마다 교환하였고, 상기 배양액의 교환시에 상기 실시예 1의 비파 추출물을 첨가하였다. 대조군으로는 Dimethyl Sulphoxide(DMSO, Sigma, USA)를 상기 비파 추출물과 동량으로 처리하였다. 상기 5일간 배양 후, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 트립신 및 EDTA를 이용하여 세포를 모은 후, Coulter particle count(Coulter Corp, USA)를 이용하여 세포수를 계수하였다. 상기 세포수의 계수결과는 총 3회 반복하였으며, 상기 반복하여 측정한 값이 평균값을 결과값으로 하였다.
우선, 비파의 각 부위 별 항암 효과를 측정하기 위하여, 실시예 1에서 제조된 비파 잎 80% 메탄올 수용액 추출물 및 비파 씨 80% 메탄올 수용액 추출물을 첨가하면서, 상기 방법으로 5일간 배양한 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 도 1은 DMSO를 처리한 대조군에서 측정된 세포수를 기준(100%)으로 하여, 상기 추출물의 종류 및 농도별 세포수를 대조군에 대한 비교값으로 나타내었다.
상기 도 1에 나타낸 바와 같이, 비파 잎 추출물은 비파 씨 추출물에 비하여 현저하게 우수한 항암효과가 확인되었다. 보다 구체적으로, 상기 MDA-MB-231 세포주를 이용하여 측정한 도 1a에 나타낸 바와 같이, 1 ㎍/ml(추출물 건조 중량/DMSO 부피)의 농도의 추출물을 처리한 경우에 비파 잎 추출물은 유의적인 암세포(MDA-MB-231 세포주)의 감소가 확인되었고, 25 ㎍/ml를 처리한 경우에 대조군의 50% 이하의 암세포만이 생존하는 것으로 확인되었다. 또한, 비파 씨 추출물에서도 암세포의 감소가 확인되었다. 비파 씨 추출물의 경우, 100 ㎍/ml를 처리한 경우에 대조군의 약 70% 정도의 세포수가 확인된 반면, 비파 잎의 경우에는 10 ㎍/ml만을 처리하여도 대조군의 약 80% 이하의 세포수가 확인되었고, 비파 씨 추출물은 200 ㎍/ml를 처리한 경우에 비로소 대조군의 50% 이하의 암세포만이 생존하는 것으로 확인되었으나, 비파 잎 추출물의 경우에는 25 ㎍/ml를 처리한 경우에 대조군의 약 40% 이하의 암세포가 생존하는 것으로 확인되어 비파 잎 추출물의 항암 효과가 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 상기 MCF-7 세포주를 이용하여 측정한 도 1b에 나타낸 바와 같이, 1 ㎍/ml(추출물 건조 중량/DMSO 부피)의 농도의 추출물을 처리한 경우에 비파 잎 추출물은 대조군의 약 60% 정도의 암세포만이 생존하는 것으로 확인되어 유의적인 암세포(MCF-7 세포주)의 감소가 확인되었다. 또한, 비파 씨 추출물에서도 암세포의 감소가 확인되었다. 보다 상세하게, 비파 잎 추출물의 경우, 25 ㎍/ml를 처리한 경우에 대조군에 비해 약 60% 정도의 성장억제 효과가 나타났고, 50 ㎍/ml를 처리한 경우에 대조군에 비해 약 80% 정도의 성장억제 효과가 나타났다. 비파 씨 추출물은 25 ㎍/ml를 처리한 경우까지는 대조군과 미비한 차이만을 나타냈으나, 50 ㎍/ml를 처리한 경우부터는 유의적인 성장억제 효과가 확인되었다.
상기 결과로부터, 비파 잎 추출물은 비파 씨 추출물에 비하여, 현저한 항암효과를 갖는 것으로 확인되었다.
또한, 비파 추출물의 용매에 따른 항암 효과를 측정하기 위하여, 실시예 1에서 제조된 비파 잎 50% 에탄올 수용액 추출물 및 비파 잎 물 추출물을 첨가하면서, 상기 방법으로 5일간 배양한 결과를 도 2에 나타내었다. 메탄올의 경우 식품 또는 의약품에 포함될 유효성분의 추출용매로 부적당하므로, 메탄올 대신 에탄올을 사용하였다. 상기 도 2는 상기 도 1과 같이 DMSO를 처리한 대조군에서 측정된 세포수를 기준으로 하여, 상기 추출용매의 종류 및 농도별 세포수를 대조군(Control)에 대한 비교값으로 나타내었다.
상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 비파 에탄올 추출물은 비파 물 추출물에 비하여 현저하게 우수한 항암효과가 확인되었다.
보다 구체적으로, 상기 MDA-MB-231 세포주를 이용하여 측정한 도 2a에 나타낸 바와 같이, 50 ㎍/ml(추출물 건조 중량/DMSO 부피)의 농도의 추출물을 처리한 경우에 비파 잎 에탄올 수용액 추출물은 유의적인 암세포(MDA-MB-231 세포주)의 감소가 확인되었고, 150 ㎍/ml를 처리한 경우에 대조군의 50% 이하의 암세포만이 생존하는 것으로 확인되었다. 또한, 비파 잎 물 추출물에서도 암세포의 감소가 확인되었다. 비파 잎 물 추출물의 경우, 150 ㎍/ml를 처리한 경우까지는 유의적인 차이를 나타내지 못하고, 200 ㎍/ml를 처리한 경우에 약 20%의 성장억제효과를 나타내어, 200 ㎍/ml 이상 처리한 경우에 암세포 성장 억제 효과가 있는 것으로 확인되었다. 비파 잎 에탄올 추출물을 200 ㎍/ml 농도로 처리한 경우에 대조군의 약 40% 이하의 암세포가 확인되어, 60% 이상의 성장억제효과가 있는 것으로 확인되었다.
또한, 상기 상기 MCF-7 세포주를 이용하여 측정한 도 2b에 나타낸 바와 같이, 50 ㎍/ml(추출물 건조 중량/DMSO 부피)의 농도의 추출물을 처리한 경우에 비파 잎 에탄올 수용액 추출물은 유의적인 암세포(MDA-MB-231 세포주)의 감소가 확인되었고, 200 ㎍/ml를 처리한 경우에 대조군의 약 40% 이하의 암세포만이 생존하는 것으로 확인되었다. 또한, 비파 잎 물 추출물에서도 암세포의 감소가 확인되었다. 비파 잎 물 추출물의 경우, 300 ㎍/ml를 처리한 경우까지는 약 20%의 성장억제효과를 나타내었고, 400 ㎍/ml를 처리한 경우에 약 40%의 성장억제효과를 나타내었다.
상기 결과로부터, 비파 물 추출물에 비하여 비파 에탄올 추출물의 항암 효과가 더욱 뛰어나, 비파 추출물을 제조하기 위한 용매는 물 보다는 알코올 또는 알코올 수용액이 바람직한 것으로 확인되었다. 식품 또는 의약품의 유효성분으로 사용될 수 있다는 점에서 상기 비파 잎 추출물의 추출 용매로는 에탄올 수용액 또는 에탄올이 바람직하다.
또한, 물 추출물에 비하여 항암효과가 뛰어난 것으로 확인된 비파 에탄올 수용액 추출물의 분획물의 분획용매에 따른 항암 효과를 측정하기 위하여, 실시예 1에서 제조된 비파 잎 50% 에탄올 수용액 추출물의 분획물 100 ㎍/ml을 첨가하면서, 상기 방법으로 5일간 배양한 결과를 도 3에 나타내었다. 상기 도 3은 상기 도 1과 같이 DMSO를 처리한 대조군(Control)에서 측정된 세포수를 기준으로 하여, 상기 추출용매의 종류 및 농도별 세포수를 대조군에 대한 비교값으로 나타내었다.
상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 비파 에탄올 추출물의 분획물 중, 클로로포름 분획물이 가장 항암효과가 우수하였고, 에틸아세테이트 분획물도 다른 분획용매에 비하여 항암효과가 우수한 것으로 확인되었다.
보다 구체적으로, 상기 MDA-MB-231 세포주를 이용하여 측정한 도 3에 나타낸 바와 같이, 100 ㎍/ml(추출물 건조 중량/DMSO 부피)의 농도의 분획물을 처리한 경우에 클로로포름 분획물의 경우 세포가 전혀 확인되지 아니하여, 다른 분획용매에 비하여 현저하게 우수한 항암효과가 있는 것으로 확인되었다. 또한, 에틸아세테이트 분획물의 경우, 대조군의 50% 이하의 암세포만이 생존하는 것으로 확인되어, 우수한 항암효과를 갖는 것으로 확인되었다. 또한, 부탄올 분획 및 물 분획의 경우에도 대조군에 비하여 항암효과가 있는 것으로 확인되었다.
상기 분획물 모두에 대하여 암세포 성장억제효과가 확인되었고, 특히 클로로포름 분획물 및 아세테이트 분획물의 경우 암세포 성장억제효과 즉, 항암효과가 다른 분획용매에 비하여 현저하게 우수한 것으로 확인되었다.
상기 가장 항암효과가 우수한 것으로 확인된 클로로포름 분획물의 농도 별 암세포 성장억제효과를 상기와 같은 방법으로 확인하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 비파 잎 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물을 10 ㎍/ml 농도로 처리한 경우에 대조군의 약 70% 이하의 암세포가 확인되어, 30% 이상의 성장억제효과가 있는 것으로 확인되었으며, 상기 결과는 물 분획물 또는 부탄올 분획물을 100 ㎍/ml 농도로 처리한 것보다 우수한 결과이다. 또한, 상기 클로로포름 분획물을 25 ㎍/ml 농도로 처리한 경우에 대조군의 약 50% 이하의 암세포가 확인되어, 50% 이상의 성장억제효과가 있는 것으로 확인되었으며, 상기 결과는 에틸아세테이트 분획물을 100 ㎍/ml 농도로 처리한 경우와 대등하였다. 또한, 상기 클로로포름 분획물을 50 ㎍/ml 농도로 처리한 경우에 약 70% 이상의 성장억제효과가 있는 것으로 확인되었다.
비파 에탄올 추출물의 분획물의 용매별 항암 효과를 비교한 상기 결과로부터, 클로로포름이 분획용매로 가장 우수한 것으로 확인되었고, 에틸아세테이트도 다른 용매에 비하여 우수한 것으로 확인되었다.
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실시예
4> 항암효과
측정2
- 암세포 부착(
adhesion
) 억제효과 측정
상기 실시예 1에서 제조된 비파 추출물의 암세포 부착억제 효과를 측정하기 위하여, 상기 MDA-MB-231 세포주 및 MCF-7 세포주를 이용하여 Cell Adhesion Assay를 수행하였다.
우선, 12 well culture plate를 30 ㎍의 Matrigel(Becton Dikinson, USA)로 코팅한 후, 비특이적 결합 부위를 없애기 위하여 상기 Matrigel로 코팅한 plate를 0.1% Bovine serum Albumine(BSA, Sigma A7906, USA)를 함유한 serum free DMEM/RPMI로 37℃에서 90분간 재수화(re-hydration)시키고, 상기 실시예에서 사용된 배양액으로 세척(washing)하였다.
상기 실시예 2에서 배양한 세포를 트립신 및 EDTA를 이용하여 상기 실시예 2의 방법으로 분리한 후 세포를 수득하고, 상기 0.1% BSA를 함유한 serum free DMEM/RPMI 배양액을 이용하여 풀어준 후(재부유시킨 후), 상기 12 well culture plate의 각 well에 2×105 cells/well의 밀도로 분주하였다. 상기 세포를 분주한 후, 상기 실시예 1의 비파 잎 추출물 및 비파 씨 추출물을 각각 10 ㎍/ml, 25㎍/ml 및, 50㎍/ml씩 처리하고, 37℃의 습윤한 CO₂배양기(5% CO₂ 및 95% air 조건)에서 90분간 배양하였다. 상기 90분이 경과된 후, 배양액을 제거하고 부착되지 않은 세포를 제거하기 위하여 상기 PBS를 이용하여 세척하였다. 상기 PBS로 세척한한 후, 립신 및 EDTA를 이용하여 상기 실시예 2의 방법으로 culture plate에 부착된 세포를 분리하였다. 상기 분리된 세포를 원심분리하여 수득하고, 상기와 같은 방법으로 다시 풀어준 후(재부유시킨 후), Coulter particle count를 이용하여 상기 실시예 3의 방법으로 세포수를 계수하였다. 상기 세포수의 계수과정은 총 3회 반복하였으며, 상기 반복하여 측정한 값이 평균값을 결과값으로 하였다.
상기 결과값을 DMSO를 처리한 대조군에서 측정된 세포수를 기준(100%)으로 하여 비교하여 도 5에 나타내었다.
상기 도 5에 나타낸 바와 같이, 비파 잎 추출물은 비파 씨 추출물에 비하여 현저하게 우수한 항암효과가 확인되었다. 보다 구체적으로, 상기 MDA-MB-231 세포주를 이용하여 측정한 도 5a에 나타낸 바와 같이, 10 ㎍/ml(추출물 건조 중량/DMSO 부피)의 농도의 추출물을 처리한 경우에 비파 잎 추출물은 유의적인 암세포의 부착억제 효과를 나타내었다. 비파 씨 추출물의 경우 25 ㎍/ml를 처리한 경우까지는 유의적인 부착억제 효과를 나타내지 못하였고, 50 ㎍/ml을 처리한 경우에서만 유의적인 부착억제 효과가 확인되었다.
또한, 상기 MCF-7 세포주를 이용하여 측정한 결과인 도 5b에 나타낸 바와 같이, 10 ㎍/ml의 농도의 추출물을 처리한 경우에 비파 잎 추출물은 유의적인 암세포의 부착억제 효과를 나타내었고, 50 ㎍/ml의 농도의 추출물을 처리한 경우에 약 50%의 암세포에 대한 부착억제 효과를 나타내었다. 비파 씨 추출물의 경우, 약간의 부착억제 효과를 나타내었으나, 50 ㎍/ml을 처리한 경우에서도 유의적인 억제 효과는 확인되지 아니하였다.
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실시예
5> 항암효과
측정3
- 암세포 전이(
migration
) 억제효과 측정
상기 실시예 1에서 제조된 비파 추출물의 암세포 전이억제 효과를 측정하기 위하여, 상기 실시예 2에서 배양한 MDA-MB-231 세포주 및 MCF-7 세포주를 이용하여 Cell Wounding migration Assay를 수행하였다.
세포의 이동성은 정상 세포에서는 태아발달과 상처조직의 회복 등에 필수적이나, 암과 관련해서는 생리적으로 조절되는 수준을 벗어난 비정상적인 암세포의 이동성은 암 전이를 촉진시키게 되므로, 암 치료를 제한하게 만드는 요소이다. 따라서, 비파 추출물이 혈관주위의 ECM 분해 또는 세포 이동에 관여하는 효소의 활성 저해에 의해, 암세포의 전이 즉, 이동(migration)을 저해하는지 여부를 scratch wound assay를 이용하여 확인하였다.
우선, 200,000 cells/well의 밀도로 6 well culture plate에 분주하여, 상기 실시예 2의 배지를 이용하여 배양하였다. 상기 plate의 90 내지 92% 정도 자랐을 때, 상기 배양접시를 200 ㎕ 피펫(pipet)의 팁(tip)을 이용하여 긋고, PBS로 3회 세척하였다. 상기 세척 후, Fibronection(Becton Dikinson, USA) 16 ㎍/ml를 함유한 10% FBS DMEM/RPMI 배지에 상기 실시예 1의 비파 잎 추출물 및 비파 씨 추출물을 각각 10 ㎍/ml, 25㎍/ml 및, 50㎍/ml씩 처리하고, 37℃의 습윤한 CO₂배양기(5% CO₂ 및 95% air 조건)에서 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 세포의 이동여부를 위상차 현미경을 이용하여 10배(10X)로 확대하여 관찰하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
상기 도 6a는 상기 MDA-MB-231 세포주를 이용하여 측정한 결과이고, 상기 도 6b는 상기 MCF-7 세포주를 이용하여 측정한 결과이다. 상기 도 6에 나타낸 바와 같이, 비파 잎 추출물 및 비파 씨 추출물은 농도 의존적으로 유방암 세포주(MDA-MB-231 세포주 및 MCF-7 세포주)의 이동을 저해하는 것으로 확인되었다.
상기 결과에 의하면 비파 추출물은 암세포의 이동성을 감소시킴으로써, 암세포의 침윤과 다른 전이단계에서 암의 전이를 억제할 수 있는 것으로 확인되었고, 따라서 비파 추출물은 암 전이 단계 전에서 수술 등에 의해 치료하는 경우 그 치료 효과가 우수한 유방암 또는 위암의 치료와 관련하여 단순히 암세포에 대한 성장억제 또는 사멸효과가 있는 물질에 비하여 우수한 효과를 갖는 것으로 평가되었다.
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실시예
6> 항암효과
측정4
- 암세포 침윤(
invasion
) 억제효과 측정
상기 실시예 1에서 제조된 비파 추출물의 암세포 침윤억제 효과를 측정하기 위하여, 상기 실시예 2에서 배양한 MDA-MB-231 세포주 및 MCF-7 세포주를 이용하여 Cell Invasion Assay를 수행하였다.
상기 암세포 침윤 억제효과는 암세포의 matrigel 장벽을 가로질러 이동하는 능력을 matrigel이 미리 코팅되어진 modified Boyden chamber(Becton Dikinson, USA)를 이용하여 측정하였다. 상기 Boyden chamber는 upper chamber인 8 ㎛ Falcon cell culture inserts(Becton Dikinson, USA)와 lower chamber인 24 well plates(Becton Dikinson, USA)로 구성되어 있다.
우선, cell culture insert를 25㎍의 Matrigel로 코팅한 후, 비특이적 결합 부위를 없애기 위하여 Matrigel로 코팅된 cell culture insert를 0.1% BSA를 함유한 serum free DMEM/ RPMI로 37℃에서 90분간 재수화(re-hydration)시키고, 상기 실시예에서 사용된 배양액으로 세척하였다.
상기 실시예 2에서 배양한 세포(MDA-MB-231 세포주 및 MCF-7 세포주)를 트립신 및 EDTA를 이용하여 상기 실시예 2의 방법으로 분리한 후, 세포를 수득하고, 상기 0.1% BSA를 함유한 serum free DMEM/RPMI 배양액을 이용하여 풀어준 후(재부유시킨 후), 상기 cell culture insert의 각 well에 2×105 cells/well의 밀도로 분주하였다. 상기 세포를 분주한 후, 상기 실시예 1의 비파 잎 추출물 및 비파 씨 추출물을 각각 cell culture inserts에 처리하였다. 상기 lower chmber는 20 ㎍/㎖ fibronectin이 포함된 10% FBS로 처리한 후, 37℃의 습윤한 CO₂배양기(5% CO₂ 및 95% air 조건)에서 24시간 동안 배양하였다.
상기 24시간이 경과한 후, 상기 upper chamber에서 이동하지 못한 세포를 면봉으로 조심스럽게 닦아내고, matrigel을 침투한 세포는 10% formalin이 포함된 PBS로 고정시킨 후, 0.5% crystal violet으로 염색하였다. 상기 염색 결과를 위상차 현미경 이용하여 10배(10X) 및 20배(20X배)로 관찰하고, Coulter particle count를 이용하여 상기 실시예 3의 방법으로 침윤한 세포수를 계수하였다. 상기 세포수의 계수과정은 총 3회 반복하였으며, 상기 반복하여 측정한 값이 평균값을 결과값으로 하였다.
상기 염색한 결과를 촬영한 사진을 도 7a 및 도 7c에 나타내었고, 상기 결과값을 DMSO를 처리한 대조군에서 측정된 세포수를 기준(100%)으로 하여 비교한 그래프를 도 7b 및 도 7d에 나타내었다.
상기 도 7에 나타낸 바와 같이, 비파 잎 추출물은 비파 씨 추출물에 비하여 현저하게 우수한 항암효과가 확인되었다. 보다 구체적으로, 상기 MDA-MB-231 세포주를 이용하여 측정한 도 7b에 나타낸 바와 같이, 10 ㎍/ml(추출물 건조 중량/DMSO 부피)의 농도의 추출물을 처리한 경우에 비파 잎 추출물 및 비파 씨 추출물은 유의적인 암세포의 침윤억제 효과를 나타내었다. 또한, 25 ㎍/ml를 처리한 경우 및 50 ㎍/ml을 처리한 경우에서 비파 잎 추출물은 비파 씨 추출물에 비하여 유의적으로 우수한 항암효과가 확인되었다.
또한, 상기 MCF-7 세포주를 이용하여 측정한 결과인 도 7d에 나타낸 바와 같이, 10 ㎍/ml의 농도의 추출물을 처리한 경우에 비파 잎 추출물은 유의적인 암세포의 침윤억제 효과를 나타내었고, 비파 씨 추출물의 경우 25 ㎍/ml의 농도의 추출물을 처리한 경우부터 유의적인 암세포의 침윤억제 효과가 확인되었다. 비파 잎 추출물을 10 ㎍/ml의 농도로 처리한 경우와 비파 씨 추출물을 50 ㎍/ml의 농도로 처리한 경우에 유사한 암세포 침윤억제 효과가 확인되었다.
<실시예 7> 항암효과 측정5 - 기질금속단백분해효소의 활성 저해효과 측정
상기 실시예 6에서 확인된 암세포 침윤 억제효과를 다시 확인하기 위하여, 암세포의 침윤과 관련된 단백질인 기질금속단백분해효소(Matrix metalloproteinase, MMP), 구체적으로 MMP-2와 MMP-9의 활성 변화를 gelatin zymography법을 통하여 측정하였다.
암세포의 침윤은 암세포의 부착과 함께 암전이의 중요한 단계로, 암세포의 침윤 단계에서는 기저막과 기질 단백질의 변성이 일어나며, 상기 암세포의 침윤은 단백분해 효소에 의해 진행된다. 따라서, 상기 기질금속단백분해효소인 MMP-2와 MMP-9의 활성 여부 및 변화는 암세포의 침윤과 밀접한 관계가 있다.
상기 MMP-2와 MMP-9는 국소침윤을 하기 위해 필수적으로 요구되는 ECM의 분해와 관련하여, ECM의 주요성분인 collagen type IV를 기질로 분해할 수 있는 효소이다.
보다 구체적으로, 상기 MDA-MB-231세포를 12 well culture plate의 각 well에 2×105 cells/well의 밀도로 분주하고 80%정도 자랐을 때 상기 실시예 1의 비파 잎 추출물 및 비파 씨 추출물을 각각 10 ㎍/ml, 25 ㎍/ml 및 50/ml씩 처리하고, 37℃의 습윤한 CO₂배양기(5% CO₂ 및 95% air 조건)에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 상층액을 취하여 0.1%(w/v) 농도의 gelatin이 포함된 SDS-PAGE를 이용하여 전기 영동하여, 단백질을 분리하였다. 상기 전기 영동 후, gel을 2.5% Triton X-100용액에서 1시간 동안 씻어낸 다음 developing buffer에서 37℃로 24시간 배양하였다. 상기 배양 후, Coomassie 염색과 탈색을 통하여 MMP-2 및 MMP-9의 활성 정도를 확인하였다. 상기 확인결과를 도 8에 나타내었다. 상기 MMP-2는 72 kDA의 크기를 갖고 있고, 상기 MMP-9는 92 kDa의 크기를 갖고 있다.
상기 도 8에 나타낸 바와 같이, MMP-2의 경우, 비파 씨 추출물은 50 ㎍/ml의 농도에서 유의적인 감소가 확인된 반면, 비파 잎 추출물은 10 ㎍/ml를 투여한 경우에도 MMP-2의 활성을 저해할 수 있는 것으로 확인되었다. 또한, MMP-9의 경우, 비파 씨 추출물은 25 ㎍/ml의 농도부터 유의적인 감소가 확인된 반면, 비파 잎 추출물은 10 ㎍/ml를 투여한 경우에도 MMP-9의 활성을 유의적으로 감소시키는 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터, 비파 추출물은 암의 전이와 관련 단백질 특히, 암세포의 침윤과 관련된 단백질인 MMP-2 및 MMP-9의 활성을 억제하여, 암세포의 침윤을 저해할 수 있는 것으로 확인되었고, 특히 비파 잎 추출물의 경우에는 소량의 첨가에 의해서도 MMP-2 및 MMP-9의 활성을 유의적으로 억제할 수 있는 것으로 확인되었다다.
<실시예 8> 항염효과 측정6 - 동물실험
8-1. 실험동물의 사육
실험동물은 이유한 Sprague-Dawley계(SD) 흰쥐 암컷을 (주)Harlan(대한민국)에서 공급받아 사육하였다. 상기 실험동물은 3군으로 구분하여, 생후 3주째부터 대조식이인 AIN 식이를 섭취시킨 대조군(Control, NC 또는 DC)와 상기 AIN 식이와 비파 잎 에탄올 추출물을 섭취시킨 실험군(DE) 및 상기 AIN 식이와 비파 잎 물 추출물을 섭취시킨 실험군(DW)으로 구분하여 사육하였다. 추출물 투여량은 200 mg/kg(시료량/실험동물의 체중) 용량으로 매일 같은 시간에(오전 10시) 6주 동안 경구 투여 하였으며, 식이와 물은 매일 신선한 것으로 공급하였다. 생후 50일째, DMBA를 50 mg/kg 용량으로 존데를 이용하여 위로 주입하여 유방암을 유도하였다. 상기 실험동물의 사육실은 온도, 습도, 채광을 일정하게 유지하였고, 상기 실험동물은 DMBA 투여 후 12주 동안 즉, 총 16주간 사육하였다.
8-2. 체중,
식이섭취량
, 수분섭취량 및
식이효율
측정
상기 실시예 8-1의 실험동물의 체중, 식이섭취량, 수분섭취량 및 식이효율은 전날 공급분에서 남은 양을 빼는 방법으로 매주 1회 측정하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 상기 식이효율(Food Efficiency Ration, FER)은 실험동물의 평균 체중증가량을 평균 식입 섭취량으로 나눈 값(body weight gain(g)/food intake(g))을 의미한다.
상기 도 9에 나타낸 바와 같이, 체중(도 9a), 식이섭취량(도 9b) 및 식이효율(도 9c)의 경우 전체적으로 유의적인 차이를 나타내지 아니하였고, 특히 유방 종양을 유도한 생후 7주 이후부터도 체중, 식이섭취량 및 식이효율의 측면에서 유의적인 차이가 나타나지 아니하였다. 상기 결과로부터 비파 추출물의 투여 및 종양 유도를 위한 DMBA의 투여는 실험동물의 생육 자체에는 영향을 미치지 아니한 것으로 확인되어, 본 발명의 비파 추출물의 투여 시에 부작용 등의 문제가 발생되지 아니할 것으로 예상되었다.
8-3. 종양 개수 및 지방 조직의 형태학적 변화 관찰
상기 사육 기간이 끝난 실험동물은 희생 전 12시간 절식시킨 후 희생시켰다. 상기 실험동물을 희생시킨 직후, 혈액을 채혈하여 혈청을 얻고, 털과 피부를 제거한 후, 종양을 모두 떼어내어 종양 개수를 확인하였다. 상기 피부를 제거하고 유선과 종양조직을 절제한 후, 10% 중성 포르말린 용액을 이용하여 고정하고, 통상적인 파라핀 고정(paraffin format)을 거쳐 4 ㎛ 크기로 조직절편을 만든 후, 헤마톡실린 및 이오신(Hematoxylin & Eosin, H&E)으로 염색하고, 염색 후 종양의 조직학적 등급을 비교하였다.
상기 조직절편에 대한 면역 조직 화학적 검사는 BrdU IHC kit(CHEMICON International, Inc., USA)를 이용하여 실시하였다. 우선, 4 ㎛ 크기의 조직절편에 대해 탈파라핀 과정 및 재수화(rehydration)과정을 수행한 후, 3% 과산화 수소/메탄올 용액에서 30분간 배양(incubation)하고, 10 mmol/L citrate buffer(pH6.0)에 담근 후 10분 동안 microwave하였다.
상기 조직절편을 PBS를 이용하여 씻어낸 후, 1차 항체(primary antibody: anti-BrdU andtibody)로 면역 염색하였다. 항원-항체 복합체를 ABC kit(Vector Laboratories, USA)를 이용하여 avidin-biotin peroxidase complex solution으로 시각화(visualize)하였다. 상기 절편을 증류수로 헹구고, Mayers hematoxylin으로 대조 염색하였다.
상기 종양 개수를 확인한 결과를 도 10에 나타내었다. 상기 도 10에 나타낸 바와 같이, 실험동물 희생 후 확인된 종양 수는 시료 대신 물을 투여한 대조군(DC)의 경우 종양 수가 3.88개로 높게 나왔으며, 비파 잎 물 추출물을 투여한 실험군(DW)의 경우 종양 수가 3개로 대조군에 비해서는 다소 낮게 나왔다. 또한, 비파 잎 에탄올 50% 수용액을 투여한 실험군(DE)의 경우에는 종양 수가 1.63개로 나타나 대조군뿐만 아니라 비파 잎 물 추출물을 투여한 실험군에 비해서도 유의적으로 낮게 나타나, 실험관내 실험(in vitro)에 의해 항암 효과가 우수할 것으로 확인된 결과가 실험동물을 이용한 실험에서도 재확인되었다.
암을 치료함에 있어서 예후 인자들은 환자들의 향후 경과를 예측하고 치료방침을 결정하는 중요한 예측 수단이다. 이와 관련하여, 유방암의 예후 인자로 알려진 종양의 조직학적 등급과 관련하여, 상기 조직 절편에 대해 tubule formation, nuclear pleomorphism 및 mitotic rate의 관점에서 점수화하여 Ⅰ 내지 Ⅲ의 등급을 결정하였다. 상기 H&E 염색결과를 나타내는 사진을 도 11에 나타내었고, 상기 조직학적 등급에 대한 측정 결과를 하기 표 1 및 도 12에 나타내었다.
| Group(분류) | 실험동물 수(마리) | Tumor Grade | ||
| I | II | III | ||
| DC | 8 | 0 | 1 | 7 |
| DE | 10 | 0 | 2 | 8 |
| DW | 6 | 0 | 1 | 5 |
상기 도 12a에 나타낸 바와 같이, tubule formation과 관련하여, 대조군(DC)에 비하여 비파 추출물을 투여한 군에서 모두 유의적으로 수치가 감소되었다. nuclear pleomorphism(도 12b) 및 mitotic rate(도 12c)의 경우에는 비파 추출물을 투여한 군, 구체적으로 비파 잎 에탄올 추출물 및 비파 잎 물 추출물의 순으로 수치가 감소되었으나, 감소 정도가 큰 의미를 갖지는 아니하였다. 상기 도 11, 도 12d 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 전체 조직학적 등급의 경우 비파 잎 에탄올 추출물의 수치가 가장 낮아 항암효과를 갖는 것으로 확인되었고, 비파 잎 물 추출물의 경우에도 대조군에 비해서는 낮은 수치가 확인되어 항암효과를 갖는 것으로 확인되었다.
상기 BrdU IHC kit를 이용하여 조직절편에 대한 면역 조직 화학적 검사를 수행한 결과는 도 13 및 도 14에 나타내었다. 상기 BrdU(5-bromo-2-deoxyuridine)는 티미딘 유사체(thymidine analogue)로, S-phase에서 티미딘 대신에 결합될 수 있으므로, 세포의 증식을 측정하는 지표로 이용되고 있으며, BrdU에 대한 단클론 항체(monoclonal antibody)를 이용하여 면역조직화학염색을 수행함으로써, BrdU labelling index로 세포의 증식 정도를 평가할 수 있다. 상기 면역조직화학염색을 수행한 사진을 도 13에 나타내었고, 상기 면역조직화학염색을 통하여 염색된 세포를 계수한 결과를 나타내는 그래프를 도 14에 나타내었다.
상기 도 13에 나타낸 바와 같이, 대조군(DC)의 경우, solid mass에서 많은 BrdU 양성 세포들을 보여, 상기 유방암 세포는 solid mass에서 주로 세포 증식을 수행하는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 도 14에 나타낸 바와 같이, 대조군(DC군)에 비하여, 비파 잎 에탄올 추출물 투여군(DE) 및 비파 잎 물 추출물 투여군(DW)에서는 BrdU 양성 세포들의 개체수가 유의적인 차이를 보이며 감소하였고, 특히 비파 잎 에탄올 추출물의 경우에는 대조군 뿐만 아니라 비파 잎 물 추출물에 비해서도 현저하게 감소하는 것이 확인되었다.
상기 결과로부터 비파 추출물 특히, 비파 잎 에탄올 수용액 추출물은 암세포 사멸(생성억제) 뿐만 아니라, 암의 진행과정에 필수적으로 수반되는 암세포의 전이, 침윤 및 부착을 효과적으로 저해하여 항암효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다.
Claims (7)
- 비파 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 비파 추출물은 비파 잎을 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올 및 이의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 추출용매로 추출한 것인 항암 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 비파 추출물은 비파 잎을 45% 내지 85% 에탄올 수용액으로 추출한 것인 항암 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 비파 추출물은 비파 잎에 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올 및 이의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 가하여 추출한 추출물에 클로로포름 및 에틸아세테이트로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 가하여 분획한 분획물인 항암 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 비파 추출물은 비파 잎 에탄올 수용액 추출물에 클로로포름을 가하여 분획한 클로로포름 분획물인 항암 조성물. - 제1항의 항암 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물.
- 제1항의 항암 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 개선 또는 예방용 식품 조성물.
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| WO2012134167A2 (ko) * | 2011-03-28 | 2012-10-04 | 주식회사 한국전통의학연구소 | 비파엽 추출물을 포함하는 폐암 치료용 조성물 및 건강 기능성 식품 |
| CN103599236A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-02-26 | 赵冬梅 | 一种治疗肝胃不和型胃癌的中药及其制备方法 |
| CN104352590A (zh) * | 2014-10-22 | 2015-02-18 | 王喜功 | 一种治疗肝癌的中药配方及其制备方法 |
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-
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- 2010-04-13 KR KR1020100033946A patent/KR20110114346A/ko not_active Application Discontinuation
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