KR102117560B1 - 켈락톤 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
켈락톤 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 켈락톤(khellactone) 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 켈락톤은 3종류의 PCD(programmed cell death) 모두의 유도를 통해 항암제 내성 유방암 등을 포함하는 다양한 암에 대한 치료 효과가 있으며, 더욱이 정상세포에서는 현저히 낮은 민감성을 나타내므로, 상기 켈락톤은 인체에 독성 및 부작용이 없는 신규 항암제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 켈락톤(khellactone) 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 조성물, 및 특히 항암제 내성 유방암을 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
암은 다양한 치료방법이 개발되었음에도 불구하고, 전 세계적으로 여전히 인간의 건강을 심각하게 위협하고 있다. 현재 주요 암 치료법으로는 외과적 수술, 방사선 치료, 호르몬 요법 및, 화학 요법이 있으며, 그 중 화학 요법은 하나 이상의 항암제를 사용하여 암을 직접 치료하거나 증상을 완화시키는 방법이다. 전통적인 화학요법제는 암세포 분열 및 대사를 방해하거나, 핵산 또는 단백질의 생합성을 억제함으로써, 암 세포에 대한 세포독성을 나타내게 된다. 그러나 이러한 화학 요법제는 하기 두 가지 주요한 문제점들을 가진다.
첫 번째 문제점으로, 항암제에 대하여 암세포가 저항성을 가지게 되는 점이다. 암세포는 항암제로 인한 세포 죽음(Cell death)에 대해 저항성이 발생함으로써, 종양 발생을 촉진시키고 악화시킨다. 일반적으로, 종양은 외과적 제거 후, 방사선 및 화학 요법으로 나머지 종양 세포를 제거할 수 있으나, 일부 암의 경우, 동일한 요법의 추가 치료에 대한 저항성으로 인해 암이 재발하게 된다.
화학 요법에서 암세포는 그 종류에 따라 항암제에 대한 감수성이 매우 다른 것으로 나타났으며, 암세포 중 다수의 유형은 세포 죽음의 한 유형에 대한 강한 저항을 보이며 결국 세포 사멸을 극복하게 된다. 수년 동안, 암 연구에서 주로 세포 사멸(apoptosis)에 대한 연구가 집중되어 왔고, 현재 이용 가능한 대부분의 항암제는 종양 세포의 세포 사멸를 유발하도록 설계되었다. 그러나 많은 악성 암세포는 p53 결함 또는 세포 사멸 기작에 필수 효소들인 케스페이지(caspase)들의 부재등으로 인해 항암 약물에 강한 내성을 획득하게 된다. 이와 같이 다수의 종양은 화학요법을 진행하는 동안 세포 사멸을 유발하는 약물에 대해 저항성을 획득하는 경우가 많이 발견된다. 따라서, 이러한 저항성을 극복하기 위한 전략 중 하나는, 세포 사멸(apoptosis)과 같은 한 종류의 세포 사멸뿐만 아니라 여러 다른 유형들의 세포 사멸들을 동시에 유발하는 항암제 발견이나 개발을 목표로 삼는 것이다. 오랫동안 세포 사멸은 프로그램된 세포 사멸(programmed cell death; PCD)과 프로그램되지 않은 세포 괴사(necrosis)의 두 가지 유형으로 분류되었으나, 현재는 그 개념에 현저한 변화가 있어왔다.
진핵 세포는 다양한 신호 경로를 통해 다양한 자극과 환경에 따라 다양한 PCD를 겪는 것으로 알려져 있다. PCD는 주로 3 가지 유형(유형 1: 케스페이지 의존적 세포 사멸, 유형 2: 오토파지 매개적 세포 사멸(autophagy-mediated cell death), 및 유형 3/4: 케스페이지 독립적 괴사/세포사멸적괴사(necrosis/necroptosis))으로 분류된다. 세포 사멸은 사멸 수용체(death receptor)-매개 외재경로 또는 미토콘드리아-매개 고유 경로를 통해 진행된다. 괴사/세포사멸적괴사는 RIP1(receptor-interacting protein 1) 및 RIP3에 의해 프로그래밍 된 괴사성 세포 사멸의 대안적인 형태이다. 괴사는 오랫동안 프로그램되지 않은 세포괴사로 간주되어 왔다. 그러나 괴사도 일종의 PCD라는 새로운 증거가 제시되었으며, Xin Teng에 의해 necroptosis라는 이름의 괴사성 세포 사멸의 새로운 타입의 PCD로 제안되었다.
오토파지(Autophagy)는 세포 사멸을 촉진할 뿐만 아니라 세포 생존도 촉진하고, 이러한 이중적 효과가 암에서는 완벽하게 알려져 있지 않으나, 오토파지 매개적 세포 사멸은 세포 사멸을 유도하기 위한 autophagic machinery에 사용됨이 알려져 있다.
최근의 많은 연구자들은 이러한 세 가지 PCD 경로가 세포 사멸의 메커니즘으로서 서로 연결되어 있음을 제시하고 있으므로, 이러한 모든 사실을 고려할 때 한 종류의 세포 사멸에 대한 암세포의 저항성을 없애고, 결국 보다 효과적인 항암제를 개발하기 위해서는 암세포에서 세 가지 PCD들 모두를 유도할 수 있는 새로운 항암제 개발이 요구된다.
또한, 두 번째 문제점으로, 정상 조직에 대한 독성 여부이다. 현재 이용 가능한 많은 항암제는 화학적 화합물이며, 이들 중 많은 종류가 장기적인 치료 후 인간에게 부작용을 일으킨다. 따라서, 독성과 부작용이 없는 새로운 항암제의 개발이 요구되고 있다. 이에 식물 추출물 유래 물질들이 주목받고 있으며, 많은 연구자들은 전통 약물 식물을 이용한 항암제 개발을 진행하고 있다.
이에, 본 발명자들은 천연물 유래 신규 항암제를 개발하기 위해 노력한 결과, 엔질리카 아무렌시스(Angelica amurensis) 뿌리 줄기의 클로로포름 가용성 분획물로부터 분리한 시스-켈락톤(cis-khellactone) 화합물이 PCD 모두의 유도를 통해 항암제 내성 유방암 등을 포함하는 다양한 암에 대한 치료 효과가 있으며, 더욱이 정상세포에서는 시스-켈락톤의 민감성이 현저히 낮은 것은 확인함으로써, 상기 켈락톤을 인체에 독성 및 부작용이 없는 신규 항암제로 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 켈락톤(khellactone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 암 예방 또는 개선용 건강식품을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 켈락톤(khellactone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 켈락톤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명의 켈락톤(khellactone)은 3종류의 PCD(programmed cell death) 모두의 유도를 통해 항암제 내성 유방암 등을 포함하는 다양한 암에 대해 치료 효과가 있으며, 더욱이 정상세포에서는 현저히 낮은 민감성을 나타내므로, 상기 켈락톤을 인체에 독성 및 부작용이 없는 신규 항암제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 시스-켈락톤(cis-khellactone)의 분자 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 시스-켈락톤의 MCF7과 MDA-MB-231의 유방암 세포주 및, MCF10A 정상 세포주에서 세포 증식 및 생존율에 미치는 효과를 확인한 도이다:
MCF7(A), MDA-MB-231(B) 및 MCF10A(C) 세포의 성장 곡선은 표시된 농도의 시스-켈락톤을 처리한 후 나타내었고, MCF7, MDA-MB-231 및 MCF10A 세포에 24, 48 또는 72 시간 동안 DMSO 단독(대조군) 또는 1, 2.5, 5, 10 또는 20 μg/ml의 시스-켈락톤을 처리하였다. 지시된 시간 후에, 세포를 수집하고 생존력을 평가하였다. 번호는 각 세포주의 생존한 세포수를 나타낸다.
도 3은 다양한 농도로 시스-켈락톤을 처리한 후, MCF7, MDA-MB-231 및 MCF10A 세포의 현미경 사진을 나타낸 도이다:
MCF7, MDA-MB-231 및 MCF10A 세포(2 × 104)를 6-웰 조직 배양 접시에 플레이팅하고 융합 단층(confluent monolayer)을 형성시켰다. 그런 다음, 상기 세포에 24, 48 또는 72 시간 동안 1, 2.5, 5, 10 또는 20 μg/ml의 시스-켈락톤을 처리 또는 비처리(무처리 대조군)하였다. MCF7(A), MDA-MB-231(B) 및 MCF10A(C) 세포를 현미경으로 촬영하였다(Black bar = 100 μm). 세 번의 실험 중, 대표 실험 결과 하나를 표시하였다.
도 4는 15 종의 암 세포주에서 시스-켈락톤을 처리 후, 세포 생존력, 증식 및 세포 독성 분석 결과를 나타낸 도이다:
각각의 세포주(2 × 104/ml)를 96-웰 조직 배양 접시에 24 시간 동안 배양 한 다음, DMSO 단독(대조군) 또는 10 또는 20 ㎍/ml의 시스-켈락톤을 24 시간 또는 48시간 동안 처리하였다;
D10 media는 10% 소 태아 혈청(FBS)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양한 군; 및
D10 + DMSO는 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 DMSO가 첨가된 DMEM 배지에서 배양한 군.
도 5는 MCF7 및 MDA-MB-231 암세포에서 세 가지 유형의 프로그램 세포 사멸(세포 사멸, 오토파지 매개적 세포 사멸, 및 괴사/세포사멸적괴사)에 대한 시스-켈락톤의 효과를 확인한 도이다:
MCF7 및 MDA-MB-231 세포를 배양하고, 24 시간 또는 48 시간 동안 2.5, 5 및 10 μg/ml의 시스-켈락톤을 처리하였고, 대조군 세포에는 DMSO만을 처리하였다. 세포 용해물은 웨스턴 블랏을 이용하여, PCD 유형별 조절 단백질을 확인하였다(세포 사멸에 대한 PARP, 오토파지에 대한 p62 및 LC3, 괴사/세포사멸적괴사에 대한 CypA).
도 6은 활성 산소종(ROS)과 미토콘드리아 막전위(MMP)의 세포 수준에 대한 시스-켈락톤 효과를 확인한 도이다:
A. MCF7 및 MDA-MB-231 세포에 시스-켈락톤을 처리 후 ROS 생산 증가효과;
MCF7 및 MDA-MB-231 세포를 완전 배지에서 24 시간 동안 배양 한 다음, 시스-켈락톤을 24 시간 동안 5 ㎍/ml 처리하였고, 대조군 세포는 DMSO만을 처리하였다. 세포를 회수하고 2.5 x 104 MCF7 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. ROS 수준은 DCFH-DA를 첨가한 후에 측정하였다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험으로부터 평균 ± 표준 편차로 나타냈다(P <0.05).
B. MCF7 및 MDA-MB-231 세포에 시스-켈락톤 처리 후 MMP 감소 효과; 및
MCF7 및 MDA-MB-231 세포를 96-웰 조직 배양 접시에서 DMEM 배지로 배양한 후, 5 μg/ml의 시스-켈락톤을 2 시간 동안 처리하였다. Mito-ID Membrane Potential Dye Loading Solution을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30 분 동안 배양하였다. MMP는 Gemini XPA Microplate Reader로 형광을 측정하여 평가하였다. 양성 대조군의 경우, 4 μM carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone을 사용했다. 데이터는 세 번의 독립적 실험에서 평균 ± SD로 나타냈다(P <0.05).
C. 시스-켈락톤 처리 후 미토콘드리아 분획;
미토콘드리아 분획화는 미토콘드리아 및 세포질 분획 마커로서 각각 HSP60 및 γ- 튜불린을 사용하여 공지된 방법을 이용하여 수행하였다.
도 7은 동물 모델을 이용한 시스-켈락톤 항종양 활성을 나타낸 도이다:
A. 누드 마우스에 시스-켈락톤 처리 후, 종양 부피 변화 확인; 및
MDA-MB-231 암 세포를 마우스에 주입한 후, 종양의 부피가 약 50 ~ 100 mm3 일 때, 3일에 1회 시스-켈락톤(1, 3 또는 5 mg/kg의 용량)을 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하였다. 대조군은 정상 생리 식염수만을 처리하였다(* P <0.01, n = 5, Student 's t test).
B. 5 개의 주요 기관 (심장, 폐, 간, 비장, 신장)과 종양의 H & E 염색 결과;
초기 약물 투여 후 30 일째에 마우스를 희생시키고 조직 샘플을 즉시 수집 하였다. 스케일 바 = 140 μm.
도 8은 엔질리카 아무렌시스(Angelica amurensis) 유래 시스-켈락톤이 세 가지 유형의 PCD를 유도하는 기전을 나타낸 도이다.
도 9는 MCF7과 MDA-MB-231 세포의 이동에 대한 시스-켈락톤의 억제 효과를 나타낸 도이다:
MCF7 및 MDA-MB-231 세포를 60-mm 조직 배양 접시에 플레이트하고, 융합 단층을 형성시켰다. 그런 다음, 상기 세포를 2.5, 5 또는 10 μg/ml의 시스-켈락톤을 처리하고, 형태학적 변화를 현미경으로 촬영했다. 플라스틱 마이크로 피펫의 팁으로 긁음으로써 상처 단층에 도입하고, 상처 크기가 감소할 때까지 표시된 간격으로 플레이트를 사진화함으로써 이동 속도를 정량화 하였다(스케일 바 = 100 ㎛).
도 2는 시스-켈락톤의 MCF7과 MDA-MB-231의 유방암 세포주 및, MCF10A 정상 세포주에서 세포 증식 및 생존율에 미치는 효과를 확인한 도이다:
MCF7(A), MDA-MB-231(B) 및 MCF10A(C) 세포의 성장 곡선은 표시된 농도의 시스-켈락톤을 처리한 후 나타내었고, MCF7, MDA-MB-231 및 MCF10A 세포에 24, 48 또는 72 시간 동안 DMSO 단독(대조군) 또는 1, 2.5, 5, 10 또는 20 μg/ml의 시스-켈락톤을 처리하였다. 지시된 시간 후에, 세포를 수집하고 생존력을 평가하였다. 번호는 각 세포주의 생존한 세포수를 나타낸다.
도 3은 다양한 농도로 시스-켈락톤을 처리한 후, MCF7, MDA-MB-231 및 MCF10A 세포의 현미경 사진을 나타낸 도이다:
MCF7, MDA-MB-231 및 MCF10A 세포(2 × 104)를 6-웰 조직 배양 접시에 플레이팅하고 융합 단층(confluent monolayer)을 형성시켰다. 그런 다음, 상기 세포에 24, 48 또는 72 시간 동안 1, 2.5, 5, 10 또는 20 μg/ml의 시스-켈락톤을 처리 또는 비처리(무처리 대조군)하였다. MCF7(A), MDA-MB-231(B) 및 MCF10A(C) 세포를 현미경으로 촬영하였다(Black bar = 100 μm). 세 번의 실험 중, 대표 실험 결과 하나를 표시하였다.
도 4는 15 종의 암 세포주에서 시스-켈락톤을 처리 후, 세포 생존력, 증식 및 세포 독성 분석 결과를 나타낸 도이다:
각각의 세포주(2 × 104/ml)를 96-웰 조직 배양 접시에 24 시간 동안 배양 한 다음, DMSO 단독(대조군) 또는 10 또는 20 ㎍/ml의 시스-켈락톤을 24 시간 또는 48시간 동안 처리하였다;
D10 media는 10% 소 태아 혈청(FBS)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양한 군; 및
D10 + DMSO는 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 DMSO가 첨가된 DMEM 배지에서 배양한 군.
도 5는 MCF7 및 MDA-MB-231 암세포에서 세 가지 유형의 프로그램 세포 사멸(세포 사멸, 오토파지 매개적 세포 사멸, 및 괴사/세포사멸적괴사)에 대한 시스-켈락톤의 효과를 확인한 도이다:
MCF7 및 MDA-MB-231 세포를 배양하고, 24 시간 또는 48 시간 동안 2.5, 5 및 10 μg/ml의 시스-켈락톤을 처리하였고, 대조군 세포에는 DMSO만을 처리하였다. 세포 용해물은 웨스턴 블랏을 이용하여, PCD 유형별 조절 단백질을 확인하였다(세포 사멸에 대한 PARP, 오토파지에 대한 p62 및 LC3, 괴사/세포사멸적괴사에 대한 CypA).
도 6은 활성 산소종(ROS)과 미토콘드리아 막전위(MMP)의 세포 수준에 대한 시스-켈락톤 효과를 확인한 도이다:
A. MCF7 및 MDA-MB-231 세포에 시스-켈락톤을 처리 후 ROS 생산 증가효과;
MCF7 및 MDA-MB-231 세포를 완전 배지에서 24 시간 동안 배양 한 다음, 시스-켈락톤을 24 시간 동안 5 ㎍/ml 처리하였고, 대조군 세포는 DMSO만을 처리하였다. 세포를 회수하고 2.5 x 104 MCF7 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. ROS 수준은 DCFH-DA를 첨가한 후에 측정하였다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험으로부터 평균 ± 표준 편차로 나타냈다(P <0.05).
B. MCF7 및 MDA-MB-231 세포에 시스-켈락톤 처리 후 MMP 감소 효과; 및
MCF7 및 MDA-MB-231 세포를 96-웰 조직 배양 접시에서 DMEM 배지로 배양한 후, 5 μg/ml의 시스-켈락톤을 2 시간 동안 처리하였다. Mito-ID Membrane Potential Dye Loading Solution을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30 분 동안 배양하였다. MMP는 Gemini XPA Microplate Reader로 형광을 측정하여 평가하였다. 양성 대조군의 경우, 4 μM carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone을 사용했다. 데이터는 세 번의 독립적 실험에서 평균 ± SD로 나타냈다(P <0.05).
C. 시스-켈락톤 처리 후 미토콘드리아 분획;
미토콘드리아 분획화는 미토콘드리아 및 세포질 분획 마커로서 각각 HSP60 및 γ- 튜불린을 사용하여 공지된 방법을 이용하여 수행하였다.
도 7은 동물 모델을 이용한 시스-켈락톤 항종양 활성을 나타낸 도이다:
A. 누드 마우스에 시스-켈락톤 처리 후, 종양 부피 변화 확인; 및
MDA-MB-231 암 세포를 마우스에 주입한 후, 종양의 부피가 약 50 ~ 100 mm3 일 때, 3일에 1회 시스-켈락톤(1, 3 또는 5 mg/kg의 용량)을 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하였다. 대조군은 정상 생리 식염수만을 처리하였다(* P <0.01, n = 5, Student 's t test).
B. 5 개의 주요 기관 (심장, 폐, 간, 비장, 신장)과 종양의 H & E 염색 결과;
초기 약물 투여 후 30 일째에 마우스를 희생시키고 조직 샘플을 즉시 수집 하였다. 스케일 바 = 140 μm.
도 8은 엔질리카 아무렌시스(Angelica amurensis) 유래 시스-켈락톤이 세 가지 유형의 PCD를 유도하는 기전을 나타낸 도이다.
도 9는 MCF7과 MDA-MB-231 세포의 이동에 대한 시스-켈락톤의 억제 효과를 나타낸 도이다:
MCF7 및 MDA-MB-231 세포를 60-mm 조직 배양 접시에 플레이트하고, 융합 단층을 형성시켰다. 그런 다음, 상기 세포를 2.5, 5 또는 10 μg/ml의 시스-켈락톤을 처리하고, 형태학적 변화를 현미경으로 촬영했다. 플라스틱 마이크로 피펫의 팁으로 긁음으로써 상처 단층에 도입하고, 상처 크기가 감소할 때까지 표시된 간격으로 플레이트를 사진화함으로써 이동 속도를 정량화 하였다(스케일 바 = 100 ㎛).
이하, 본 발명의 용어를 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방"은 조성물의 투여로 발병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에 있어서, "개선" 또는 "치료"란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 켈락톤(khellactone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 켈락톤은 엔질리카 아무렌시스(Angelica amurensis)로부터 분리하거나, 시판되는 것, 또는 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것 어느 것을 이용하여도 무방하며, 천연물 유래 물질이므로, 독성을 나타내지 않고, 인체에 무해하며, 하기 [화학식 1]로 기재되는 화학식을 가지는 켈락톤 또는 [화학식 2]로 기재되는 화학식을 가지는 시스-켈락톤(cis-khellactone)인 것이 바람직하다.
[화학식 1]
[화학식 2]
또한, 상기 켈락톤은 프로그램된 세포 사멸(programmed cell death; PCD)을 유도하는 것이 바람직하고, 상기 PCD는 오토파지(Autophagy), 세포 사멸(apoptosis) 및 괴사/세포사멸적괴사(necrosis/necroptosis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 의미하는 것으로, 본 발명의 켈락톤의 상기 3종류의 PCD 모두를 유도함으로써, 항암제 내성 암을 포함하는 다양한 암에 대하여 효과를 나타낸다.
또한, 상기 켈락톤은 ROS(reactive oxygen species)를 증가시키고, MMP(mitochondrial membrane potential)를 감소시켜, 상기 3종류의 PCD를 유도한다.
또한, 상기 유방암은 항암제 내성 유방암인 것이 보다 바람직하다.
아울러, 본 발명의 구체적인 실시예에서 본 발명자들은 엔질리카 아무렌시스(Angelica amurensis)로부터 시스-켈락톤(cis-khellactone)을 분리한 후(도 1 참조), 항암제 내성 유방암세포에 대한 효과를 확인한 결과, 시스-켈락톤은 저농도에서 상기 암 세포 증식을 억제하고, 정상 세포에 대한 독성을 최소화하면서 고농도에서 세포 사멸을 유도함을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조).
또한, 다양한 암 세포주에서 시스-켈락톤의 항암 활성을 확인한 결과, 시스-켈락톤은 유방암, 대장암, 자궁경부암, 신장암 등에 유의적인 항암활성을 나타냄을 확인하였다(도 4 참조).
또한, 시스-켈락톤의 의한 세 가지 타입의 PCD(programmed cell death) 유도 효과를 확인한 결과, 시스-켈락톤은 저농도에서 세포 성장과 이동을 억제하고, 고농도에서 3 가지 타입의 PCD 모두를 촉진함으로써, 항암제로 사용될 수 있음을 확인하였다(도 5 및 도 9 참조).
또한, 시스-켈락톤이 세 가지 타입의 PCD를 어떠한 기전으로 유도하는지 확인한 결과, 활성산소종과 미토콘드리아 막전위 수준 조절을 통해 PCD를 유도할 수 있음을 확인하였다(도 6 참조).
또한, 이종 이식 모델을 통한 항암 효과를 확인한 결과, 시스-켈락톤은 정상 조직 및 장기에 대한 독성을 최소화하면서 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다(도 7 참조).
따라서, 본 발명의 켈락톤은 3종류의 PCD(programmed cell death) 모두의 유도를 통해 항암제 내성 유방암 등을 포함하는 다양한 암에 대한 치료 효과가 있으며, 더욱이 정상세포에서는 현저히 낮은 민감성을 나타내므로, 상기 켈락톤을 인체에 독성 및 부작용이 없는 신규 항암제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 켈락톤뿐만 아니라, 이의 약학적으로 허용되는 염, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 라세미체, 또는 입체이성질체를 모두 포함한다.
본 발명의 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 켈락톤은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 켈락톤을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출 된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 켈락톤에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 mg 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 켈락톤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명의 켈락톤은 3종류의 PCD(programmed cell death) 모두의 유도를 통해 항암제 내성 유방암을 포함하는 다양한 암에 대한 치료 효과가 있으며, 더욱이 정상세포에서는 현저히 낮은 민감성을 나타내므로, 상기 켈락톤을 인체에 독성 및 부작용이 없는 유방암 예방 또는 개선용 건강식품으로 사용할 수 있다.
본 발명의 켈락톤이 첨가되는 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 켈락톤은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 건강식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 10 g이다.
또한, 본 발명에 따른 건강식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나, 본 발명의 켈락톤 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 엔질리카 아무렌시스(
Angelica amurensis
)로부터 시스-켈락톤(cis-khellactone)의 분리
엔질리카 아무렌시스(1.5 kg)의 뿌리 줄기를 건조시키고, 2일 동안 동결 건조시킨 다음, 1주일에 걸쳐 실온에서 메탄올로 3회(각각 5 L) 추출하였다. 메탄올 추출물을 Whatman No. 1 여과지를 사용하여 Buchner funnel를 통해 여과하였다. 또한, 메탄올 추출 후, 잔사(211.4 g)를 물로 희석시키고 클로로포름(38.3 g)에 분배시켰다.
클로로포름 가용성 추출물은 고정상으로 작용하는 실리카 겔(10 x 40 cm, 230-400 메쉬)에서 용매계(solvent system)(hexane(5 L), hexane-CH2Cl2(1:1 v/v, 5 L), CH2Cl2(5 L), CH2Cl2-MeOH(19:1 v/v, 5 L), CH2Cl2-MeOH(15:5 v/v, 5 L), CH2Cl2-MeOH(1:1 v/v, 5 L), CH2Cl2-MeOH(5:15 v/v, 5 L), CH2Cl2-MeOH(1:19 v/v, 5 L), MeOH(2 L))을 이용하여 클로로포름-가용성 추출물을 크로마토그래피하여 9개 분획물을 수득하였다.
또한, F06[CH2Cl2-MeOH(15:5 v/v)로 용출; 7.4 g]을 실리카겔(5 x 40 cm, 230-400 메쉬, 20:1에서 1:1 v/v의 n-hexane-EtOAc 농도구배, 최종 100% MeOH)에서 크로마토그래피를 수행하여 TLC 프로파일에 기초하여 14 개의 하위 분획(Fr : 06-01 ~ Fr : 06-14)을 수득하였다. 그런 다음, 이전 보고된 내용과 스펙트럼 데이터를 비교하여, 주요 화합물인 시스-켈락톤을 분리하였다(도 1).
<실시예 2> 세포주, 세포 배양 및 암세포주에 시스-켈락톤처리
9개의 유방암세포주(MCF7, MDA-MB-231, BT20, BT549, T47D, SKBR3, MDA-MB-453, HS578T 및 MDA-MB-468), 2개의 대장암 세포주(HCT116 및 HT-29), 2개의 자궁경부암 세포주(HeLa 및 SiHa), 인간 배아 신장 세포주(HEK293T 및 HEK293), 및 정상 인간과 마우스 세포주(MEF 및 NIH3T3)를 10% 소 태아 혈청(FBS)(Gibco BRL, USA)과 1% 항생제-항균제 용액(Gibco BRL, Cat # 15240-062, USA)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium; WelGENE Inc., Korea) 배지에서 배양하였다. 정상 인간 MCF10A 유방 상피 세포주를 20 ng/ml 표피 성장 인자(EGF) (Sigma-Aldrich, Cat # E9644), 100 ng/ml의 콜레라독소(cholera toxin)(Sigma-Aldrich, Cat # C-8052, 미국), 10 ㎍/ml 인슐린(Sigma-Aldrich, Cat # I-9278, 미국), 0.5 mg/ml의 하이드로코르티손(hydrocortisone)(Sigma-Aldrich, Cat # H-0888, 미국), 5 % 말혈청(horse serum)(Invitrogen, Cat # 16050-122, 한국) 및 1% 항생제 - 항균제가 보충된 DMEM/F-12 배지(Gibco BRL, Cat # 11330-032, USA)에서 배양하였다.
모든 세포는 37℃에서 95% 공기와 5% CO2로 구성된 가습상태에서 배양되었다. SiHa 세포주는 한국 세포주 은행(KCLB # 30035)에서 얻었다. 다른 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, ATCC)으로부터 구입하였다. 대조군으로 DMSO를 모든 세포주에 처리하였고, 시스-켈락톤은 표시된 시간 동안 1, 2.5, 5, 10 또는 20 μg/ml을 각각 세포에 처리하였다.
<실시예 3> 세포 생존력 분석(Cell viability analysis)
세포 생존력은 제조사의 지시에 따라 Cell Viability, Proliferation & Cytotoxicity Assay Kit(EZ-CYTOX, Cat# EZ-3000, DoGen, Korea)을 이용하여 분석하였고, 실험은 3번 반복 수행하였다.
구체적으로, 세포(2 × 104/웰)를 DMEM 배지를 함유하는 96-웰 플레이트에서 배양시킨 후, 시스-켈락톤을 다양한 농도로 처리하였다. 24 또는 48 시간 후, 10 ㎕의 CCT를 배지에 첨가하고, 세포를 CO2 배양기에서 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존력은 Gemini XPA Microplate Reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 생존 세포의 수는 트리판 블루(trypan blue) 염색법을 사용하여 확인하였다.
<실시예 4> 오토파지(Autophagy), 세포 사멸(apoptosis) 및 괴사/세포사멸적괴사(necrosis/necroptosis)의 분석
오토파지, 세포 사멸 및 괴사/세포사멸적괴사는 각각 이에 상응하는 조절 단백질 또는 바이오마커인 오토파지 분석를 위한 p62 및 LC3, 세포 사멸 분석을 위한 PARP, 괴사/세포사멸적괴사 분석을 위한 CypA를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 한편, 괴사/세포사멸적괴사는 necroptotic 세포에서 방출되는 세포 외(extracellular) CypA 단백질의 수준을 측정함으로써 확인하였다.
<실시예 5> 웨스턴 블랏
세포를 원심분리하고, 차가운 PBS로 세척한 후, RIPA(radioimmunoprecipitation assay) 용해 완충액을 이용하여 용해시켰다. 단백질 분석 키트(Bio-Rad, Korea)를 이용하여 단백질 양을 정량하였다. 각 시료는 SDS-PAGE를 거쳐 Immobilon Transfer Membrane(Millipore, Cat # IPVH00010)으로 옮겨졌다. 필터를 상응하는 각각의 항체와 함께 배양하고, PowerOpti-ECL 웨스턴 블랏팅 검출 시약(Bio-Rad, Korea)을 사용하여 면역 검출을 수행하였다. 본 발명에서 사용한 항체는 하기와 같다: PARP(Cell Signaling, Cat#9542S), BAX(Santa Cruz Biotechnology, sc-7480), BAK(Cell signaling, Cat#3814S), cyclophilin A (CypA)(Enzo Life Sciences, BML-SA296), LC3(Enzo Life Sciences, ALX-803-082), p62/SQSTM1(Cell Signaling, Cat#5114), VDAC1(Santa Cruz Biotechnology, Cat. sc-32063, HSP60(Santa Cruz Biotechnology, Cat. sc13966), β-actin(Santa Cruz Biotechnology, Cat. sc-47778), 및 γ-tubulin(Santa Cruz Biotechnology, Cat. sc-7396).
<실시예 6> 활성 산소종(ROS) 측정
MCF7 및 MDA-MB-231 세포를 시스-켈락톤으로 24시간 동안 처리한 후, 수집하고, PBS로 세척한 다음, 15 분간 원추형 튜브에서 1,000 rpm으로 2 분간 원심분리 하였다. PBS 50 μl에 약 5 × 104 세포를 96-웰 플레이트에 옮기고, 200 μM의 2′,7′-dichlorodihydro-fluorescein diacetate(DCFH-DA) 50 μl를 다중 채널 피펫 (PIPETMAN, Gilson)으로 각각의 웰에 주입하여, DCFH-DA 농도 각 웰당 100 μM로 맞추었다. ROS 수준은 Gemini XPA Microplate Reader로 30 분 동안, 5분 간격으로 485 nm의 여기 파장 및 535 nm의 방출 파장에서 형광 세기를 측정함으로써 확인하였다.
<실시예 7> 미토콘드리아 막전위(mitochondrial membrane potential; MMP) 측정
MMP는 Mito-ID Membrane Potential Cytotoxicity Kit(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA)를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, MCF7 및 MDA-MB-231 세포를 DMEM이 들어 있는 96-웰 조직 배양 접시(SPL Life Science, Korea)에서 배양 한 후, 2 시간 동안 시스-켈락톤을 처리하였다. Mito-ID Membrane Potential Dye Loading Solution을 각 웰에 넣고 실온에서 30 분간 배양하였다. 미토콘드리아 (Mitochondria)는 Mito-ID 염료의 응집 후 주황색 형광 신호를 생성한다. MMP는 480 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방출 파장을 사용하여 Gemini XPA Microplate Reader로 형광을 측정하여 평가하였다.
<실시예 8> 미토콘드리아 분획의 제조
세포를 2,000 rpm에서 5 분간 원심분리하고, 차가운 PBS에서 세척하고, hypotonic lysis buffer(220 mM mannitol, 10 mM HEPES, 2.5 mM PO4H2K, 1 mM EDTA, 68 mM sucrose, 및 1 mM PMSF)에 재현탁시켰다. 그런 다음, 60-90 분 동안 얼음에 보관하고, 4℃에서 5 분 동안 1,000 x g에서 원심 분리한 후, 펠릿(pellet)을 미토콘드리아 분획 버퍼에 재현탁시키고, 얼음에서 1 시간 인큐베이션하는 동안 30분마다 약 20회 피펫팅 하였다. 1300 × g, 4℃에서 5 분간 원심 분리하여 세포 파편을 제거한 후, 상등액을 신선한 튜브에 옮기고 10,000 ~ 14,000 × g에서 5 분간 4℃에서 원심 분리하였다. 이 시점에서, 상층액 및 펠릿은 각각 세포질 및 미토콘드리아 분획을 나타낸다. 더 나은 순도를 위해 상등액을 동일한 프로토콜에 따라 다시 원심 분리하였다. 펠렛을 RIPA 완충액으로 재현탁하고 상기 <실시예 5> 와 동일한 방법으로 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.
<실시예 9>
In vivo
항암 활성
시스-켈락톤의 항암 활성을 MDA-MB-231 유방암 마우스를 이용하여 확인하였다. 총 20마리의 마우스를 5마리씩 대조군 및 치료군 1~3군으로 각각 나누고, 각각 다른 농도의 시스-켈락톤을 처리하였다. 종양의 크기가 약 50 ~ 100 mm3 일 때 치료군의 마우스에게 시스-켈락톤(1, 3 또는 5 mg/kg 용량)을 꼬리 정맥을 통해 3일에 1 회 정맥 주사했다. 대조군에는 생리 식염수를 주사하였다. 종양 크기를 30일 동안 매일 측정하였고, 종양 부피는 a×b2/2로 계산하였으며, 여기서 a 및 b는 각각 최대 및 최소 직경을 나타낸다. 약물 투여 30일 후에 마우스를 희생시켰다. 심장, 폐, 간, 비장 및 신장을 포함하는 조직 샘플을 병리학적 분석을 위해 즉시 수집하였다.
<실시예 10> 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(eosin)(H&E) 염색
H&E 염색은 표준 절차에 따라 수행하였다. 구체적으로, MDA-MB 231 이종이식된 누드마우스를 희생시킨 후, 심장, 폐, 간, 비장, 신장 및 종양의 조직을 4% 파라포름알데히드에서 24 시간 동안 고정시키고, PBS 완충액에서 세척 한 다음 파라핀에 포배하였다. 조직 샘플은 다음 5 μm로 절편하고, H&E로 염색하였다.
<실험예 1> 항암제 내성 유방암세포에 대한 시스-켈락톤의 효과 확인
시스-켈락톤의 세포 독성은 항암제 내성 MCF7 및 MDA-MB-231 인간 유방암 세포 및, MCF10A 정상 세포주의 증식 및 생존에 미치는 영향을 평가함으로써 확인하였다. 특히 MCF7은 많은 세포 사멸을 유도하는 항암제에 대해 높은 저항성을 가지고 있기 때문에 선택하였고, 한편, 이러한 저항성은 세포 사멸 및, 괴사/세포사멸적괴사의 과정에서 핵심 단백질인 케스페이지3(caspase3) 및 RIP3의 부재에 기인한 것으로 사료된다.
구체적으로, 상기 3개의 세포주를 24 mm 배양 접시에 플레이트하고, 24 시간 동안 융합 단층(confluent monolayer)을 형성시켰다. 그런 다음, 상기 세포들을 0, 24, 48, 및 72시간 동안 다양한 농도의 시스-켈락톤(0, 1, 2.5, 5, 10, 20, 30, 40, 50 또는 100 μg/ml) 존재 또는 비존재하에서 배양하였다.
먼저, 형태학적 변화는 현미경으로 관찰한 결과, 시스-켈락톤은 MCF7 및 MDA-MB-231 세포에 강한 세포 독성 효과를 나타내지만, MCF10A 세포에는 세포 독성 효과를 나타내지 않는 것을 확인하였다.
다음으로, 시스-켈락톤이 세포 성장과 형태학적 변화에 미치는 영향을 시간과 농도에 따라 평가한 결과, 도 2A 및 도 2B에 나타낸 바와 같이, 상대적으로 낮은 농도에서 시스-켈락톤(2.5 또는 5 μg/ml)은 MCF7 및 MDA-MB-231 세포의 증식이 DMSO 단독으로 처리 한 세포와 비교하여 유의적으로 지연되었다(도 2A 및 2B). 또한 상대적으로 높은 농도(10 또는 20 μg/ml)로 72 시간 처리한 결과, 상기 세포 수가 감소하여 세포 사멸이 유도됨을 확인하였다(도 2A 및 2B).
따라서, 시스-켈락톤은 시간 및 농도 의존적으로 암세포의 증식 및 생존을 크게 억제함을 확인하였다.
다만, 정상세포인 MCF10A 세포는 1 내지 5 μg/ml의 시스-켈락톤을 처리하여도, 세포 사멸이 나타나지 않음을 확인하였다(도 2C).
또한, 현미경을 통해 세포를 확인한 결과, 도 3A, 3B 및 3C에 나타낸 바와 같이 시스-켈락톤으로 처리 한 세포는 수축과 세포막의 뒤틀림 현상(membrane blebbing)을 포함하여 세포 사멸의 전형적인 형태를 나타내었고, 24 시간 후 배지에서 많은 박리 및 부유 세포가 검출되었다. 이를 통해, 시스-켈락톤이 세포 증식과 생존에 농도 의존적으로 영향을 미침을 확인하였다.
그러나 중요하게도, MCF10A 정상 세포는 MCF7 및 MDA-MB-231 세포와 비교할 때 시스-켈락톤 영향을 받지 않았으며, 이는 정상 세포에는 시스-켈락톤이 영향을 미치지 않음을 알 수 있다. 따라서 시스-켈락톤이 정상 세포에 악영향을 미치지 않으면서 암세포 성장 및 증식을 억제하고 지연시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
결론적으로, 시스-켈락톤은 저농도에서 암 세포 증식을 억제하고 정상 세포에 대한 독성을 최소화하면서 고농도에서 세포 사멸을 유도함으로써 항암제로서의 역할을 수행하는 것을 확인하였다.
<실험예 2> 다양한 암 세포주에서 시스-켈락톤의 항암 활성 확인
MCF7 및 MDA-MB-231 암세포에서 세포 독성을 갖는 시스-켈락톤이 다른 암세포에서도 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 15종의 세포를 대상으로 실험을 진행하였다.
구체적으로, 상기 15종의 세포주를 10% 소 태아 혈청(FBS)이 첨가된 DMEM 배지 또는, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 DMSO가 첨가된 DMEM 배지에 24시간 또는 48시간 배양하여 대조군으로 사용하였고, 실험군으로는 10 또는 20 μg/ml의 시스-켈락톤을 상기 세포주에 24시간 또는 48시간 처리한 후, 각각 MTT 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 시스-켈락톤을 처리한 암 세포에서는 24시간 또는 48시간 처리한 세포주 모두에서 유의적인 세포독성을 나타났지만, 무처리 대조군 세포에서는 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 4).
따라서, 시스-켈락톤은 다양한 암에 대한 항암 활성을 나타냄을 확인하였다.
<실험예 3> 시스-켈락톤의 의한 세 가지 타입의 PCD(programmed cell death) 유도 효과 확인
시스-켈락톤이 항암 활성을 확인한 후, 항암 활성의 기본 메커니즘을 확인하였다.
구체적으로, <실험예 1> 및 <실험예 2>를 통해 시스-켈락톤의 농도가 10 μg/ml보다 높으면 세포 사멸을 유의하게 유도한다는 것을 확인하였고, 시스-켈락톤이 유도할 수 있는 세포 사멸의 타입을 결정하기 위해 MCF7 및 MDA-MB-231 암 세포주에 24 시간 및 48 시간 동안 DMSO 단독(대조군) 또는 2.5, 5 또는 10 μg/ml의 시스-켈락톤을 처리하였다. 그런 다음, 전체 세포 용해물을 제조하고, 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 시스-켈락톤은 노출 시간과 농도에 의존적으로 세 가지 타입의 PCD(세포 사멸, 오토파지 매개적 세포 사멸 및, 괴사/세포사멸적괴사)를 모두 유발함을 확인하였다(도 5).
구체적으로, MCF7 및 MDA-MB-231 암 세포에 시스-켈락톤을 10 μg/ml 이상의 농도로 처리하면 24 시간 후에 유의적으로 세포 사멸(cell death)이 유도되었다(도 5). 또한, 시스-켈락톤의 짧은 노출 시간은 오토파지와 세포 사멸을 유발하는 반면, 48 시간 장시간 처리시, 괴사/세포사멸적괴사를 유도함을 확인하였다(도 5). 또한, 시스-켈락톤 처리는 24 시간 처리 후 p62의 발현 수준과 LC3-I 대 LC3-II의 전환율을 감소시켰으므로, 오토파지가 유도된 PCD의 첫 번째 유형임을 확인하였다(도 5). 아울러, 2.5, 5, 및 10 μg/ml의 시스-켈락톤 처리는 24 시간 및 48시간에서 절단된 PARP의 수준을 증가시켰고, CypA 단백질의 세포 외 환경으로의 방출은 두 세포주 모두에서 48시간의 처리 후 유의적으로 증가하여 괴사/세포사멸적괴사를 유발하는 것을 확인하였다(도 5).
결론적으로, 시스-켈락톤 처리가 암세포를 3 가지 타입의 PCD에 보다 민감하게 만드는 것을 확인하였고, 아울러, MCF7 및 MDA-MB-231 암세포에 2.5 μg/ml 또는 5 μg/ml 시스-켈락톤을 처리한 후, 기존의 상처 치유 분석법을 사용하여 시스-켈락톤이 세포 이동에 미치는 영향을 확인한 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 시스-켈락톤은 세포 이동을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 9).
따라서, 시스-켈락톤은 저농도에서 세포 성장과 이동을 억제하고, 고농도에서 3 가지 타입의 PCD 모두를 촉진함으로써, 항암제로 사용될 수 있음을 확인하였다.
<실험예 4> 활성산소종과 미토콘드리아 막전위 수준 조절을 통한, 시스-켈락톤의 PCD 조절 효과 확인
시스-켈락톤이 세 가지 타입의 PCD를 어떠한 기전으로 유도하는지 확인하였다.
먼저, 미토콘드리아의 주요 기능(ROS와 MMP의 수준 조절)에 시스-켈락톤의 효과에 초점을 맞추었다. 진핵 세포에서는 미토콘드리아가 세 가지 타입의 세포 사멸에 중요한 역할을 수행하는 것이 알려져 있다. 미토콘드리아 대사는 세포 생존을 돕기 위해 생리적 ROS를 생성하고, ROS는 세포 신진 대사, 세포 신호 전달 및 항상성 조절에 중요한 역할을 한다. 그러나 ROS 수준은 스트레스 환경(예 : 자외선 노출, 열 노출 또는 영양 스트레스)에서 유의적으로 증가하여, ROS 수준에 따라 세포 구조와 궁극적으로 세 가지 타입의 PCD에 유의적인 손상을 입힌다. 다소 높은 수준의 ROS는 오토파지를 통해 세포 사멸을 하고, 매우 높은 ROS 수준은 외인성 및 내인성 경로 모두를 통해 세포 사멸을 유도하며, 더 높은 ROS 수준은 괴사/세포사멸적괴사를 일으킬 수 있음이 알려져 있다.
따라서, 시스-켈락톤이 암세포에서 ROS 생성을 조절하는지 확인하였다.
구체적으로, MCF7 및 MDA-MB-231 세포를 완전배지에서 배양하고, 시스-켈락톤(5 ㎍/ml)을 처리한 후, 세포 내 ROS 함량을 DCFH-DA로 확인하였다.
그 결과, 도 6A에 나타낸 바와 같이, 시스-켈락톤 처리가 MCF10A 정상 세포와 비교하여 암세포 주에서 훨씬 높은 수준의 ROS를 유도한다는 것을 확인하였다(도 6A). ROS 수준은 MCF7 및 MDA-MB-231 세포에서 각각 무처리 대조군 세포와 비교하여 각각 약 4 및 2배 더 높았다. 이와 반대로, ROS 수준은 MCF10A 세포에서 약간 감소하는 것을 확인하였다(도 6A). 이러한 결과로부터 시스-켈락톤 처리가 암 세포에서 훨씬 높은 수준의 ROS 생성을 유도하므로, 정상 MCF10A 세포와 비교하여 악성 세포에 더 강력한 세포 사멸 신호를 제공할 수 있음을 확인하였다.
또한, MMP가 또한 세 가지 타입의 PCD 모두와 관련되기 때문에 시스-켈락톤이 MMP 수준에 미치는 영향을 확인하였다.
그 결과, 도 6B에 나타낸 바와 같이, 시스-켈락톤 처리는 암 세포주에서 MMP를 급격히 감소시켰지만, 정상 세포에서는 효과를 나타내지 않음을 확인하였다(도 6B).
<실험예 5> ROS의 세포 수준 및 MMP에 대한 시스-켈락톤의 작용기전 확인
시스-켈락톤이 어떻게 ROS의 세포 수준 및 MMP에 영향을 미치는지 확인하였다.
구체적으로, 도 6C에 나타낸 바와 같이 PCD개시에 중요한 역할을 하는 다양한 미토콘드리아 단백질의 수준을 확인하였고, 시토크롬 c, BAX, BAK 및 VDAC1(voltage-dependent anion channel 1) 단백질이 시스-켈락톤 처리에 영향을 받는다는 것을 확인하였다(도 6C).
한편, 많은 자극에 의해 유도된 세포 사멸은 MRC(mitochondrial respiratory chain) 단백질의 지속적인 파괴, ROS 생성의 증가, MMP의 손실, 시토크롬 c 방출 및 궁극적으로는 세포 사멸을 초래할 수 있는 초기 미토콘드리아 활성화와 관련되어 있다. 미토콘드리아에서 시토크롬 c의 방출은 세포 사멸과 괴사/세포사멸적괴사를 포함한 세포 사멸 과정의 중요한 초기 단계이다. 많은 종류의 세포성 스트레스가 미토콘드리아에서 시토크롬 c의 시토졸로의 방출을 유도하여 카스파제 활성화를 촉진시키고, 세포 사멸과 괴사/세포사멸적괴사를 촉진한다. 이 과정은 Bcl-2 계열의 단백질(예 : BAX, BAK, Bcl-2 및 Bcl-xL)의 동적 변화, 투과성 전이 채널(permeability transition channels)의 개방 및 MMP의 손실과 관련된다.
이에, 시스-켈락톤이 BAX와 BAK의 수준을 증가시키나, Bcl-2 및 Bcl-xL에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다. pro-apoptotic 단백질 BAX의 올리고머 형태가 시토크롬 C 방출을 자극한다는 것은 알려져 있다. 또한, 미토콘드리아 외막 단백질인 VDAC1의 수준이 시스-켈락톤 처리에 반응하여 미토콘드리아에서 증가한다는 것을 확인하였다.
VDAC1은 외부 미토콘드리아 막에 위치하고 있는 것으로 알려져 있으며, 세포 사멸의 조절을 포함하여 세포에서 몇 가지 중요한 기능을 수행한다. VDAC1은 미토콘드리아를 매개로 하는 세포 사멸의 핵심 역할을 담당하며, 미토콘드리아 전구 세포 사멸 단백질을 세포질로 방출하는 데 참여한다(예 : 시토크롬 c, AIF, 및 Smac/DIABLO).
최근 새로운 연구 결과, 상기 채널의 과발현과 조절 장애가 암을 포함한 다양한 질병 및 세포 사멸로 이어질 수 있음이 밝혀졌다. 또한, VDAC1 oligomerization은 세포 사멸의 유도와 함께 크게 증가한다.
따라서, 시스-켈락톤이 미토콘드리아 기능, 세포 ROS 유도 및 MMP 억제를 조절함으로써 MCF7 및 MDA-MB-231 암세포에서 세 가지 유형의 PCD를 모두 유도한다는 것을 확인하였다.
<실험예 6> 이종 이식 모델을 이용한 시스-켈락톤의 생체 내 항암 효과 확인
생체 내에서 시스-켈락톤의 항암 효과를 확인하기 위하여, 이종 이식 모델을 제조한 후, 시스-켈락톤의 항암 활성을 MDA-MB 231 종양 보유 마우스에서 확인하였다.
구체적으로 도 7A에 나타낸 바와 같이, 종양의 부피가 약 50 ~ 100 mm3 일 때 마우스에 1, 3 또는 5 mg/kg 시스-켈락톤을 처리했다. 종양 성장 억제는 무처리 대조군과 비교하여, 모든 시스-켈락톤 처리군에서 85%까지 억제된 것을 확인하였다(P <0.01)(도 7A).
처리량이 상이한 3개 그룹 사이에서 종양 성장 억제에 유의적인 차이는 발견되지 않았으며, 이는 시스-켈락톤이 적은 용량으로도 종양 성장을 억제할 수 있는 것을 나타낸다.
또한, 도 7B에 나타낸 바와 같이, 조직 학적 분석 결과, 시스-켈락톤 처리군에서 5 개의 대표 기관이 대조군과 유사한 세포 독성 효과를 나타내어 시스-켈락톤이 정상 세포가 아닌 종양에만 영향을 미친다는 사실이 밝혀졌다 (도 7B).
따라서, 시스-켈락톤은 정상 조직 및 장기에 대한 독성을 최소화하면서 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.
Claims (10)
- 켈락톤(khellactone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 항암제 내성 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 켈락톤은 하기 [화학식 1]로 기재되는 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는, 항암제 내성 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]
.
- 제 1항에 있어서, 상기 켈락톤은 하기 [화학식 2]로 기재되는 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는, 항암제 내성 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 2]
.
- 제 1항에 있어서, 상기 켈락톤은 시스-켈락톤(cis-khellactone)인 것을 특징으로 하는, 항암제 내성 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 켈락톤은 프로그램된 세포사멸(programmed cell death; PCD)을 유도하는 것을 특징으로 하는, 항암제 내성 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 PCD는 오토파지(Autophagy), 세포 사멸(apoptosis) 및 괴사/세포사멸적괴사(necrosis/necroptosis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 항암제 내성 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 켈락톤은 ROS(reactive oxygen species)를 증가시키고, MMP(mitochondrial membrane potential)를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 항암제 내성 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 켈락톤은 정상세포에 민감성이 낮은 것을 특징으로 하는, 항암제 내성 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- 켈락톤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 항암제 내성 유방암 예방 또는 개선용 건강식품.
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| Chen et al., Drug Design, Development and Therapy, 2017, 11, 1891-1904 (2017.6.23.)* |
| Lee et al., Phytotherapy Research, 2007, 21(5), 406-409 (2007.01.18.)* |
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