KR20100049454A

KR20100049454A - 암 치료 및 예방용 약학적 조성물 및 이를 포함하는 암 개선 및 예방용 건강기능식품

Info

Publication number: KR20100049454A
Application number: KR1020080108612A
Authority: KR
Inventors: 남종현
Original assignee: 남종현
Priority date: 2008-11-03
Filing date: 2008-11-03
Publication date: 2010-05-12
Also published as: KR101031140B1; CA2684177A1; US20100112097A1; CN101721513B; JP2010106024A; MX2009011901A; HK1141991A1; CN101721513A

Abstract

본 발명은 암 치료 및 예방용 약학적 조성물 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 개선 및 예방용 건강기능식품에 대한 것이다. 본 발명의 조성물은 홍경천, 백화사설초 및 육종용을 포함하여 발암억제 유전자의 발현을 증가시키므로 암 세포의 성장을 억제하여 암의 치료 및 예방에 효과가 있다. 또한, 암 세포의 증식만을 억제하고 정상세포에는 영향이 없으며 생약재 성분으로 장기간 복용하거나 다량 복용하여도 부작용이 적다.

건강기능음료로 제조시에는 음용이 용이하고 휴대 및 섭취가 간편하다는 장점이 있다.

암 세포, p53 단백질, p21 단백질

Description

암 치료 및 예방용 약학적 조성물 및 이를 포함하는 암 개선 및 예방용 건강기능식품{Pharmaceutical composition for preventing and treating cancer and health functional food containing thereof for preventing and improving cancer}

본 발명은 암 치료 및 예방용 약학적 조성물 및 이를 포함하는 암 개선 및 예방용 건강기능식품에 대한 것으로, 구체적으로는 홍경천 및 백화사설초를 포함하여 발암억제 유전자의 발현을 증가시켜 암 세포의 증식을 억제하고 부작용이 적은 암 치료 및 예방용 약학적 조성물 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 개선 및 예방용 건강기능식품에 관한 것이다.

암은 생체로부터 영양을 공급받지만, 생체와는 독립적으로 과잉 증식하며, 생체를 파괴하는 생체조직에서 발생한 비정상적인 조직의 덩어리이다. 신체의 모든 장기는 수많은 세포로 구성되어 있는데 신체의 정상적인 세포가 비정상적인 세포로 되면서 무질서하게 분열 증식하여 많은 세포를 만들므로 암이 발생하게 된다. 암의 발병에는 유전적 소인도 깊이 관여하지만 환경적 요인 또한 큰 영향을 미치며 선진국일수록 암의 발병이 증가하는 경향을 보이고 있다. 암의 발병 원인으로는 농약, 살충제등의 사용량 및 식품내 잔유량 증가, 식품 보존제, 착색제, 방부제등이 첨가된 가공식품의 소비증가, 수질, 토양, 대기오염의 증가, 현대인의 스트레스증가, 활동량의 감소 그리고 풍요로운 식생활로 인한 비만등이 보고되어 있다. 최근에는 정상적인 세포의 신호 전달체계에 이상이 발생하거나 암을 일으킬 수 있는 암 유전자가 활동하게 되는 경우, 또는 암 억제 유전자에 문제가 발생할 경우 암이 생긴다고 알려져 있다.

암을 치료하는 방법으로는 외과적 치료, 화학적 치료 및 방사선 치료가 있는데, 외과적 치료는 암의 초기상태의 제거에는 효과적이나 경우에 따라서는 장기를 제거해야 하는 등의 부작용과 전이를 방지할 수 없는 문제가 있으며, 방사선 치료의 경우도 특정 부위의 암 치료에는 치료 효과가 높은 장점이 있는 반면 방사선의 조사로 인한 새로운 발암 위험성과 전이를 방지할 수 없다는 점 및 치료시 환자의 고통을 수반한다는 문제가 있다. 화학적 치료법의 경우 보통 항암제라 불리는 약의 형태가 일반적인데, 항암제는 암 세포에만 작용하는 것이 아니고 환자의 정상세포에도 독성을 발휘하는 것이 부작용으로 알려져 있다. 따라서, 항암제의 개발은 암조직에의 높은 선택성과 더불어 그 독성을 최소화하는 방향으로 신약의 개발이 이루어지고 있다.

천연재료 성분은 독성 및 부작용이 적은 것으로 알려져 최근에는 천연재료에서 항암성분을 추출하거나 가공하여 각종 의약제 또는 드링크제로 개발하려는 연구 가 활발하다. 그러나, 일부 생약제를 함유하는 드링크제는 암 세포뿐만 아니라 정상 세포에도 작용하여 머리카락이 빠지는 등의 독성이나 부작용이 있을 수 있고, 고가의 생약제를 사용함으로써 시판가격이 너무 비싸 널리 보급되지 못하는 등의 문제점이 있었다.

상기의 문제점을 해결하고자 본 발명의 목적은, 홍경천 및 백화사설초를 포함하여 정상세포에는 부작용이 없고 암 세포에만 작용하며, 발암억제 유전자의 발현을 증가시켜 암세포의 활성을 억제시키는 암 치료 및 예방용 조성물과 이를 포함하는 암 개선 및 예방용 건강기능식품을 제공하는데 있다.

상기의 목적을 달성하고자 본 발명은,

홍경천 및 백화사설초를 포함하는 암 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 홍경천은 총 조성물 100 중량부에 대하여 10 내지 70 중량부로 포함될 수 있다.

상기 백화사설초는 총 조성물 100 중량부에 대하여 20 내지 80 중량부로 포함될 수 있다.

상기 암 치료 및 예방용 약학적 조성물은 육종용을 더 포함할 수 있다.

상기 육종용은 총 조성물 100 중량부에 대하여 10 내지 40 중량부로 포함될 수 있다.

상기 암 치료 및 예방용 약학적 조성물은 사상자, 토사자 및 원지로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물을 더 포함할 수 있다.

상기 사상자, 토사자 또는 원지는 총 조성물 100 중량부에 대하여 5 내지 15 중량부로 포함될 수 있다.

상기 암 치료 및 예방용 약학적 조성물은 발암억제 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다.

상기 암은 췌장암, 간암, 위암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 폐암 또는 전립선암일 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하고자 본 발명은,

상기 암 치료 및 예방용 약학적 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 개선 및 예방용 건강기능식품을 제공한다.

상기 건강기능식품은 건강기능음료일 수 있다.

또한, 상기 건강기능식품은 천연차일 수 있다.

상기 암 치료 및 예방용 약학적 조성물의 추출물은 건강기능식품 또는 건강기능음료 총 100 중량부에 대하여 0.001 내지 30 중량부로 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 암 세포의 증식만 억제할 뿐 정상세포에는 영향을 미치지 않고 천연물로 이루어져 장기간 복용하거나 다량 복용하더라도 종래의 항암제보다 부작용이 작다. 건강기능식품의 형태로 제조가 가능하므로 차등의 음료로 제조하면 미감이 개선되어 음용이 용이하고 간편하여 항암제를 손쉽게 복용할 수 있는 장점이 있다.

또한, 발암억제 유전자의 발현을 증가시켜 암세포의 활성을 억제하므로 암의 치료 및 예방에 효과적이다. 특히, 췌장암의 경우 치료를 위해 수술, 방사선 및 화학요법등이 시행되고는 있지만 아직까지 어떤 효과적인 치료법도 개발되어 있지 않은 바, 본 발명의 조성물은 췌장암 치료 및 보조치료제로서 사용을 기대할 수 있다.

암의 치료 및 예방에만 효과적인 것이 아니라, 간기능이 강화되는 등 부대효과를 얻을 수 있고, 기존에 드링크류에 함유되는 생약제보다 가격이 저렴하므로 상업화에도 유리하다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 암 치료 및 예방용 약학적 조성물은 홍경천 및 백화사설초를 포함한다.

상기 본 발명의 암 치료 및 예방용 약학적 조성물은 발암억제 유전자의 발현을 증가시켜 암세포의 증식을 억제하므로 암의 치료 및 예방에 효과가 있다. 천연물로 이루어져 암 세포의 활성을 억제할 뿐 정상세포에는 영향을 미치지 않아 부작용이 적다.

상기 홍경천(Rhodiola sachalinesis)은 참들꽃이라고도 불리우며, 해발 1800 내지 2300m 의 고산지대에서 자생하는 다년생 초본식물로서 홍경천의 생리활성물질은 발암억제 유전자인 p53, p21 및 Bax 의 발현을 증가시켜 암 세포의 증식을 억제한다.

특정 유전자의 활성화와 억제는 종양의 발생과 발달의 원인이 되는데, 발암유전자(oncogene)는 암 성장을 촉진하는 반면 종양억제 유전자(tumor-suppressor gene)는 암 성장을 억제한다. 대표적인 발암억제 유전자에는 p53, p21 및 Bax 가 있다.

도 1 은 p53 의 활성화에 의한 세포 사멸 및 세포 주기 조절 메카니즘을 나타낸 모식도이다. p53은 가장 잘 알려진 종양억제 유전자인데 세포주기를 조절하고 세포사멸을 유도함으로써 세포가 악성형질로 전환되지 않도록 보호하는 역할을 담당하고 있으며, p53 유전자의 변이 및 결손은 인간 암종에서 가장 흔한 유전자 이상의 하나이다. 세포에 DNA 손상이 가해지면 p53의 발현은 급격히 증가하고, 그 결과 p53의 하위 유전자중의 하나인 p21의 발현이 유도됨으로써 세포주기는 G1 시기에 정지하게 된다. p21 과 더불어 p53의 조절을 받는 하위 유전자로는 세포사멸을 유도하는 CD95/FAS, Bax, Noxa, Capase-1 및 Capase-6 등이 있다. 또한, p53은 DNA 회복(DNA excision repair)에 관여하는 GADD45를 활성화시켜 DNA손상 회복을 촉진함으로써 유전자 안정성을 유지하도록 한다.

p21은 p53의 하위 유전자중의 하나로 세포주기 진행을 G1기에서 억제한다. 세포주기는 G1기, S기, G2기, M기로 나뉘어 진행되는데, 세포가 G1기에서 정지할 것인지 혹은 G1기에서 S기로 이행하여 세포증식을 할 것인지는 retinoblastoma(Rb)의 인산화와 밀접한 관련이 있다. 비인산화 상태의 pRb는 전사조절인자인 E2F와 결합하여 E2F의 기능을 억제함으로써 세포가 S기로 진입하는데 필요한 유전자들의 발현을 억제하게 되고 그 결과 세포 주기는 G1기에 정지하게 된다. 그러나 cyclin과 cyclin-dependent kinase(CDK)복합체에 의해서 pRb가 인산화되면 E2F와 더 이상 결합하지 못하고 그에 따라 유리된 E2F의 활성화로 인해 세포는 S기에 필요한 여러 유전자들의 전사가 활성화되어 세포주기가 진행된다. 이 과정에서 p21은 cyclin-CDK 복합체의 활성을 억제함으로써 pRb의 인산화를 억제하기 때문에 E2F 는 불활성화 상태로 계속 pRb 에 결합되어 있음으로써 세포주기는 G1 기에 정지하게 된다. 따라서, 발암 유전자의 증식이 억제될 수 있다.

Bax 단백질은 세포사멸을 관장하는 가장 핵심적인 인자로 세포질에 활성을 띈 p53 발현 단백질이 존재하면 Bax 단백질의 활성이 증가된다. Bax 단백질의 활성 증가는 세포 내부에 존재하는 미토콘드리아의 세포막에 구멍을 형성한다. 미토콘드리아는 전자전달계를 통해 세포의 생존과 활동에 필요한 에너지인 ATP를 생산하는 곳이기 때문에, 미토콘드리아 막에 형성된 구멍으로 인해 세포가 생존하기 어렵게 된다. 따라서, 종양세포에 Bax 단백질의 발현이 증가되면 세포 사멸을 촉진함으로로써 종양세포가 제거되게 된다.

상기 홍경천은 전초를 사용할 수 있으며, 잎, 줄기 또는 뿌리등 어느 특정부위를 사용할 수도 있다.

상기 홍경천은 추출하여 추출물의 형태로 첨가할 수 있으며, 추출물을 동결 건조 또는 열풍 건조하여 수분 함량 5 내지 20% 미만으로 분말화시켜 첨가할 수도 있다. 또한, 추출하지 않고 홍경천 자체를 첨가하거나 동결건조 또는 열풍건조등 당업계에 공지된 분말화 방법을 사용하여 홍경천을 분말화하여 본 발명의 조성물에 첨가할 수도 있다. 상기 추출은 당업계에 공지된 방법이 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 유기용매 추출법을 사용할 수 있다. 상기 유기용매로는 음용시 인체에 무해한 물, 에탄올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 에탄올은 10 내지 70% 농도의 에탄올을 사용할 수 있으며, 25 내지 100℃ 의 온도에서, 5 내지 20 시간 추출하는 것이 바람직하다.

상기 홍경천은 총 조성물 100 중량부에 대하여 10 내지 70 중량부로 포함될 수 있다. 10 중량부 미만으로 첨가되면 발암억제 유전자의 발현을 증가시켜 암의 예방 및 치료에 효과적이라는 본 발명의 목적을 달성하기가 힘들고, 70 중량부를 초과하여 첨가되면, 건강기능식품등에 첨가되었을 때 홍경천 특유의 맛과 향이 진하여 미감을 해칠 수 있으며, 사용량 대비 효과의 증가정도가 미미하다.

상기 백화사설초는 발암 유전자의 성장을 억제하는 효과를 가지고 있으며, 상기 홍경천과 동시에 사용시 암 치료 및 예방 효과의 상승작용이 있다. 또한, 장기 복용이나 대량 복용시에도 부작용이 거의 없다는 장점이 있다.

상기 백화사설초는 추출물의 형태로 첨가되거나, 추출물을 분말화하여 첨가할 수 있으며, 추출하지 않고 백화사설초 자체를 첨가하거나 당업계에 알려진 통상의 방법으로 분말화하여 첨가할 수도 있다. 추출하는 경우 당업계에 공지된 추출법이 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 물, 10 내지 70% 농도의 에탄올 또는 물과 에탄올의 혼합물을 사용한 용매 추출법을 이용할 수 있다.

상기 백화사설초는 총 조성물 100 중량부에 대하여 20 내지 80 중량부로 포함될 수 있다. 20 중량부 미만으로 첨가되면 암 치료 및 예방의 효과가 미미하고, 80 중량부를 초과하여 첨가되면 백화사설초 함량의 증가에 비해 항암효과의 증가가 미미하고 약한 설사를 유발할 수 있다.

본 발명의 암 치료 및 예방용 약학적 조성물은 육종용을 더 포함할 수 있다.

상기 육종용은 상기 홍경천 및 백화사설초와 병행 사용시 암 세포의 성장을 억제하는 효과를 상승시키는 작용을 한다.

상기 육종용은 추출물의 형태로 첨가되거나, 추출물을 분말화하여 첨가할 수 있으며, 추출하지 않고 육종용 자체를 첨가하거나 당업계에 알려진 통상의 방법으로 육종용을 분말화하여 첨가할 수도 있다. 추출하는 경우 당업계에 공지된 추출법이 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 물, 10 내지 70% 농도의 에탄올 또는 상기 성분들의 혼합물을 사용한 유기용매 추출법을 이용할 수 있다.

상기 육종용은 총 조성물 100 중량부에 대하여 10 내지 40 중량부로 포함될 수 있다. 10 중량부 미만으로 포함되면 암 세포의 성장을 억제하는 효과를 상승시키는 정도가 미미하며, 40 중량부를 초과하여 첨가되면 특이한 냄새가 있어 본 발명의 조성물을 건강기능식품등에 첨가시 기호도를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 암 치료 및 예방용 약학적 조성물은 사상자, 토사자 및 원지로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물을 더 포함할 수 있다. 상기 사상자, 토사자 또는 원지등의 물질을 더 포함함으로써 암의 치료 및 예방효과를 더욱 상승시킬 수 있다.

상기 사상자는 신장을 따뜻하게 하고 양기를 돋우며 항염증의 효과도 있어 피부습진 및 알레르기성 피부염의 치료에도 활용이 된다. 본 발명에서 사상자는 혈관 신생 억제 작용을 하는 것으로 보인다. 암의 전이는 혈관의 생성을 통해 일어나므로 혈관 신생 억제 작용이 우수한 사상자를 항암제로 사용하는 경우 암의 전이를 방지하고 암의 치료에도 효과를 나타낼 수 있다.

상기 토사자는 종기, 자양강장등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 토사 자에 의해 항체가 조기에 형성될 수 있어 항암 효과를 상승시킬 수 있다.

상기 원지는 원지과에 속하는 학명 Polygala tenuifolia Willd. 의 뿌리로서 심기안정에 효과가 있고, 발암 억제유전자의 발현 증가 효과를 상승시키는 작용을 하는 것으로 보인다.

상기 사상자, 토사자 또는 원지는 추출물의 형태로 본 발명의 조성물에 포함되거나 추출물을 동결건조 또는 열풍건조하여 분말화하여 첨가할 수도 있으며, 추출하지 않고 사상자, 토사자 또는 원지 자체를 건조하여 분말화한 뒤 첨가할 수도 있다.

상기 사상자, 토사자 또는 원지는 총 조성물 100 중량부에 대하여 5 내지 15 중량부로 포함될 수 있다. 5 중량부 미만으로 포함되면 암의 치료 및 예방효과를 상승시키려는 첨가 목적을 달성시키기가 어렵고, 15 중량부를 초과하여 첨가되면 첨가량에 비해 항암효과가 향상되는 정도가 미미하다.

본 발명의 암 치료 및 예방용 약학적 조성물은 필요에 따라 감초, 꿀, 당귀, 오미자, 인삼, 홍삼, 대추, 생강등의 성분을 선택적으로 더 포함할 수 있다.

상기 성분들은 다른 약들의 작용을 조화시킬 목적으로도 사용되며, 미감을 개선시키기 위해서도 사용될 수 있다.

본 발명의 암 치료 및 예방용 약학적 조성물은 췌장암, 전립선암, 위암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 폐암 및 간암에 효과적일 수 있다. 특히, 췌장암, 전립 선암 및 간암에 효과적이다.

췌장암의 경우 낮은 농도에서도 항암효과를 나타내므로 화학적 치료 및 방사선 치료등 다양한 치료법이 시행되고 있으나, 효과적인 치료법이 개발되고 있지 않은 췌장암의 치료제 및 보조치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 암 치료 및 예방용 약학적 조성물은 상기에서 기재한 생약 재료들을 개별적으로 추출하여 추출물이나 분말 형태로 첨가하는 방법외에 상기 생약재들을 씻은 후 세절하여 혼합하고 혼합된 생약제를 추출하여 추출물 형태로 제조할 수 있다. 추출법은 당업계에 공지된 방법이 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 물, 10 내지 70 % 의 에탄올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하는 용매 추출법을 이용할 수 있다.

또한, 상기 추출물을 농축하고 동결건조 또는 열풍건조하여 분말 형태로 제조할 수도 있다.

상기 추출 및 분말화 과정을 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

생약제를 깨끗이 세척하고, 불순물이나 오염물을 제거하기 위해 30 내지 70% 의 에탄올, 바람직하게는 50% 의 에탄올에 60℃ 이하의 온도에서 30 분 내지 4 시간 정도 침지시킨 후, 80 내지 100℃ 에서 1 내지 10 시간 추출한다. 추출후에 5000 내지 10000 rpm 으로 5 내지 30 분간 원심분리하고 상등액을 여과한 뒤, 30 내지 70℃에서 75°Brix가 되도록 감압농축한다. 상기 농축액을 수분함량이 10% 이하가 되도록 열풍건조하거나, -40℃ 이하에서 동결건조하여 분말화한다.

본 발명의 암 치료 및 예방용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합될 수 있다. 약학적 조성물에 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제를 추가로 포함할 수 있으며, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제등으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 암 치료 및 예방용 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며 유효성분으로서 체중 1kg 당 0.01 내지 10 g 의 양을 1 회 내지 수회에 걸쳐 투여할 수 있다. 투여량 또는 복용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 암 개선 및 예방용 건강기능식품은 상기 암 치료 및 예방용 약학적 조성물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 상기 건강기능식품은 건강기능음료의 형태로 제조될 수 있다. 상기 건강기능음료의 일 예로써 상기 암 치료 및 예방용 약학적 조성물을 유효성분으로 포함하는 천연차를 제조할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 또는 건강기능음료는 암의 개선 및 예방에 효과가 있으면서도, 부작용이 없을 뿐더러 특히 음료의 경우 용이하고 간편하게 섭취할 수 있으며 가격이 저렴하다.

본 발명의 암 치료 및 예방용 약학적 조성물은 건강기능식품 또는 건강기능음료 총 100 중량부에 대하여 0.001 내지 30 중량부로 첨가될 수 있다. 0.001 중량부 미만으로 첨가되면 암 개선 및 예방효과가 미미하며, 30 중량부를 초과하여 첨가되면, 상기 조성물 특유의 향 및 맛으로 인해 식품의 맛을 해쳐 음용이나 섭취가 용이하지 않을 수 있다.

이하 실시예와 비교예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이는 본 발명의 설명을 위한 것일뿐, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.

<실시예 1> 암 치료 및 예방에 효과적인 조성물을 추출물로 제조

홍경천 30 g, 백화사설초 20 g, 육종용 30 g 및 원지 10 g 을 물로 세척한 후 건조시켜 세절하고 50℃ 에서 50% 에탄올에 1 시간 정도 침지시킨 후, 50% 에탄올로 50℃에서 10 시간 동안 추출하였다. 상기 추출물에 꿀 10 g 을 첨가하여 암 치료 및 예방에 효과적인 조성물을 추출물 형태로 제조하였다. 상기 추출물의 수분 함량은 25%이다.

<실시예 2 > 암 치료 및 예방에 효과적인 조성물을 분말로 제조

상기 실시예 1 에서 제조한 추출물을 7500 rpm으로 15 분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 여과하고, 60℃에서 70 기압으로 감압 농축하였다. 상기 농축액을 70℃ 에서 30분간 열풍건조하여 수분 함량이 5%가 되도록 분말화하였다.

<실시예 3 내지 6> 건강기능음료의 제조

상기 실시예 1 에서 제조한 추출물 및 실시예 2 에서 제조한 분말을 하기 표 1 의 조성비로 혼합하고 총 부피가 140 ㎖가 되도록 물로 희석하여 건강기능음료를 제조하였다.

	실시예 1 의 추출물(g)	실시예 2 의 조성물 분말(g) (추출물로 환산시 질량)	총 추출물의 함량/음료100g (g)
실시예 3	10	0.5 (0.633)	7.6
실시예 4	10	1 (1.267)	8.0
실시예 5	20	2 (2.533)	16.0
실시예 6	30	4 (5.067)	25.0

<실험예 1> 세포증식 억제 효력 확인

상기 실시예에서 제조된 건강기능음료의 암세포주의 증식(proliferation) 억제 효력은 MTT assay 를 이용하여 측정하였다. 인간 췌장암 세포주(Pancreatic carcinoma cell line)인 PANC1 세포, 인간 간암 세포주(Hepatocellular carcinoma cell line)인 HepG2 세포, 그리고 인간 전립선암 세포주(Prostate cancer cell line)인 PC-3 세포를 96 well microplate 에 1.5×10⁴ cells/well 의 농도로 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건을 유지시켜 주면서 24시간 동안 배양하였다. Well 에 세포가 80% 자라면 상기 실시예 3 내지 6 에서 제조된 건강기능음료를 0.01 mg/㎖, 0.1 mg/㎖, 1 mg/㎖ 의 농도로 처리하고 24 시간 동안 배양하였다.

세포 성장 억제 효력을 측정하기 위하여 5mg/㎖ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dimethyltetrazolium bromide(MTT; sigma, USA) 용액을 각 well에 20㎕ 씩 첨가하고 37℃ 에서 4 시간 동안 배양하였다. 이후, microplate 의 배지를 모두 제거하고 각 well마다 200㎕ 의 dimethyl sulfoxide(DMSO)용액을 첨가하였다. MTT 용액에 의해 형성된 formazan 과 DMSO 용액의 발색반응은 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 2 및 도 2 와 같다.

상기 표 2 는 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료로 처리하지 않은 배지에서 24시간 동안 배양한 세포의 생존율(100%)을 기준으로 실시예의 건강기능음료로 24시간 동안 처리한 세포의 생존율을 비교한 결과이다. 상기 표 2 에 의하면 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료 모두 PANC1 세포의 증식을 억제하는 것으로 나타났다. PC-3 세포의 경우에는 0.1 mg/㎖ 의 농도로 처리한 경우에는 실시예 5 및 6 의 기능성건강음료 시료로 처리한 경우만 세포 생존률이 감소되었고, HepG2 세포의 경우 1.0 mg/㎖ 의 농도로 처리한 경우에만 세포 생존율이 감소하였다.

도 2 의 결과는 상기 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료로 처리하기 전의 세포 생존율(viability)을 기준(100%)으로 하여 상기 실시예의 건강기능음료로 처리하지 않은 상태로 24시간 배양한 세포와 상기 실시예의 건강기능음료로 처리한 세포들의 생존율을 백분율로 환산하여 비교한 결과이다. 도 2 에 의하면, 실시예의 시료로 처리하지 않은 경우 PANC1 세포, HepG2 세포, 그리고 PC-3 세포의 생존율은 각각 140.5%, 116.6% 및 148.4%로 처리하기 전보다 세포 증식이 증가하였다. PANC1 세포의 경우 본 발명의 조성물을 포함하는 실시예 3 내지 6의 건강기능음료로 처리한 경우 세포 생존율은 시료를 처리하기 전보다 감소하였고, 시료의 농도가 증가할수록 증식이 더욱 억제되는 농도의존적 경향을 나타내었다. PC-3 세포 및 HepG2 세포의 경우 0.01 mg/㎖, 0.1 mg/㎖ 의 농도로 처리한 경우 세포 생존율이 감소하지 않았고 1 mg/㎖ 의 농도로 처리한 경우만 세포 생존율이 감소하였다.

따라서, 췌장암 세포주는 상기 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료를 0.01 mg/㎖로 희석한 것으로 처리하여도 그 증식이 억제된다고 볼 수 있으나, 전립선암 및 간암 세포주의 경우 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료를 0.01 mg/㎖ 및 0.1 mg/㎖의 농도로 희석하여 처리한 경우에는 세포 증식 억제 효력이 나타나지 않음을 알 수 있다.

<실험예 2> 세포의 형태학적 관찰

세포의 형태학적 관찰을 통해 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료의 세포성장 억제 효과를 관찰하였다. PANC1 세포를 3.0×10⁶cells/well 의 농도로 100mm culture dish에 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건을 유지시켜 주면서 24시간 동안 배양하였다. Culture dish에 세포가 80% 자라면 상기 실시예 3 내지 6 에서 제조된 건강기능음료를 1 mg/㎖ 의 농도로 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료로 처리된 세포를 PBS buffer로 2번 washing후 역상현미경(EVOS digital inverted microscope)를 이용하여 2 개의 배율로 세포의 형태를 관찰하였다. 그 결과는 도 3 에 나타내었다.

도 3 에서 세포주위가 흐트러지고 세포 수가 줄어든 부분은 화살표로 표시하였다.‘처리전’은 시료를 처리하여 24 시간 동안 배양하기 전의 상태를 의미하고, ‘무처리’는 상기 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료로 처리하지 않고 24 시간 동안 배양한 상태를 의미한다. 도 3 에 의하면, 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료로 처리하지 않은 세포의 경우 세포의 성장이 더욱 증가하였고 암세포들이 조밀하게 정상적으로 성장하는 것이 관찰되었다. 이에 반해, 상기 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료로 처리한 경우 세포 주위가 흐트러지고 세포가 죽는 것을 관찰할 수 있었다. 실시예 6 의 건강기능음료로 처리한 경우 실시예 3 내지 5 로 처리한 경우보다 세포수의 감소가 크게 일어난 것으로 보아 본 발명의 조성물의 농도가 증가할수록 암세포 성장 억제 효과가 우수함을 알 수 있다.

<실험예 3> 발암억제인자의 발현에 미치는 영향 확인

Western blot 방법을 이용하여 실시예 3 내지 6 의 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 건강기능음료가 인간 암세포주에서 p53에 의해 조절을 받는 하위 유전자인 p21 및 Bax의 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. PANC1 세포, HepG2 세포, 그리고 PC-3 세포를 3.0×10⁶cells/well 의 농도로 100mm culture dish에 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건을 유지시켜 주면서 24시간 동안 배양하였다. Culture dish에 세포가 80% 자라면 상기 실시예 3 내지 6 에서 제조된 건강기능음료를 1 mg/㎖ 의 농도로 처리하고 24 시간 동안 배양한 후에 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 PBS buffer 로 3번 washing하였으며, 40 내지 80㎕의 lysis buffer를 첨가한 후에 가볍게 pipetting 해주었다. 얼음에서 30분 동안 incubation 시키고 30 초간 sonication 과정을 실시한 뒤에 13,000 rpm, 4℃ 조건에서 15분동안 원심분리하여 세포질 분획을 분리하였다. 분리된 세포질 분획은 BCA 시약을 이용하여 단백질 양을 정량하였으며, 각각의 분획 35 ㎍을 15% SDS-PAGE gel 에서 전기영동을 하여 단백질을 분리하였다. 이후, semi-dry 기계를 이용하여 분리된 단백질은 nitrocellulose(NC) membrane으로 옮기고 NC membrane 은 blocking buffer 로 4℃ 에서 overnight blocking 해준 뒤에 1X TBS-T 로 washing 하였다. p21 및 bax 의 1차 antibody를 1X TBS-T buffer에 1:1200으로 희석한 후, 4℃에서 overnight동안 반응시켰다. 1차 antibody 반응이 끝난 NC membrane을 1X TBS-T buffer로 4℃에서 10분씩 3 번 washing 한 후, 2차 antibody 반응을 4℃에서 2시간 동안 진행시켰다. p21에 대한 2차 antibody 는 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG 를 사용하였다. Bax 에 대한 2차 antibody는 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated rabbit anti-goat IgG를 사용하였다. 반응이 끝나면, Western Blotting Luminol Reagent와 반응시킨 후, X-ray 필름에 현상하여 단백질 밴드를 확인하였다. 그 결과는 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료로 처리하지 않은 대조군에서의 p21 및 Bax 단백질의 발현을 기준(1.0)으로하여 도 4 및 도 5 에 나타내었다.

도 4 에 의하면, PANC1 세포, PC-3 세포 및 HepG2 세포 모두에서 상기 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료로 처리한 경우 처리하지 않은 세포에 비해 p21 단백질의 발현이 증가하였다. PANC1 세포는 실시예 4 의 시료로 처리한 경우 처리하지 않은 경우보다 약 2.4 배가 증가해 가장 많이 증가하였고, 실시예 5 및 6 으로 처리한 경우도 약 2 배 정도 증가하였다(도 4.(A)). HepG2 세포에서도 p21의 발현은 증가하였으나(도 4.(C)), PC-3 세포에서는 PANC1 및 HepG2 만큼 p21의 발현이 증가하지 않았다(도 4.(B)).

도 5 를 참조하면, 실시예 3 내지 6 의 시료로 처리하여도 Bax 단백질의 발현은 크게 증가하지 않았다. 단, PC-3 세포와 HepG2 세포는 실시예 5 의 시료로 처리한 경우 Bax 단백질의 발현이 증가되었다.

상기 결과를 보면 본 발명의 조성물에 의한 암 세포 성장 억제는 Bax 단백질의 발현 증가에 의한 것보다는 p21 단백질의 발현 증가에 의한 세포주기 정지에 의한 영향이 더 큼을 알 수 있다.

<실시예 4> in vivo 모델에서 먹이 섭취량과 음용수 섭취량 측정

누드마우스에 인간 췌장암 세포인 PANC1을 5×10⁵cells/0.2 ㎖ 의 농도로 좌우 앞다리 피하지방층에 접종하였다. 인간 간암 세포주 HepG2는 7.5×10⁵cells/0.2 ㎖ 의 농도로 등쪽 피하지방층에 접종하였으며, 인간 전립선암 세포주 PC-3는 5×10⁵cells/0.2 ㎖ 의 농도로 좌우 뒷다리 피하지방층에 접종하였다(도 6). 1 개의 대조군과 4 개의 실험군으로 분리하여 2주 동안 실험을 진행하였다. 대조군은 멸균 증류수를 음용수로 공급하였으며, 실험군은 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료를 1 mg/㎖ 의 농도가 되도록 멸균 증류수에 희석하여 음용수로 공급하였다. 약물을 공급하는 동안 먹이 섭취량과 음용수 섭취량을 기록하여 그 결과를 도 7 및 도 8 에 나타내었다.

도 7 및 8 에 의하면, 실험 개시후 6일째 까지는 대조군과 실험군 모두 먹이섭취량과 음용수 섭취량은 차이가 없이 일정하였다. 그러나, 이후 시간이 지날수록 대조군의 먹이 섭취량과 음용수 섭취량은 지속적으로 감소하였으나, 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료를 섭취한 실험군은 감소하다가 다시 증가하거나 혹은 감소하지 않고 실험기간 동안 일정한 섭취량을 유지하였다.

<실험예 5> 종양 성장 억제에 미치는 영향

상기 실험예 5 와 같은 방법으로 암 세포를 이식한 누두마우스에 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료를 1 mg/㎖ 의 농도로 2 주 동안 음용수로 지속적으로 공급한 후, 동물을 희생하였다. 희생했을 당시 대조군과 실험군의 모습을 사진으로 나타내었고, 종양은 화살표로 표시하였다(도 9). 좌우 앞다리에는 인간 췌장암 세포주를 접종하였고, 좌우 뒷다리에는 인간 전립선암 세포주를 접종하였다. 도 9 에서 (A)는 멸균증류수를 공급한 대조군이고, (F)는 대조군, (G)는 실시예 5 의 건강기능음료를 섭취한 개체, (H)는 실시예 6 의 건강기능음료를 섭취한 개체를 확대한 것이다.

본 발명의 조성물이 종양 성장 억제에 미치는 영향을 살펴보고자 상기에서 동물 희생시 떼어낸 종양조직의 무게를 측정하였다. 그 결과는 도 10 내지 12 에 나타내었다.

암세포를 이식하고 15일 경과후에 종양이 형성된 개체의 비율을 살펴본 결과, 암세포를 주사한 전체 개체중에서 75%는 췌장암이 발생하였고 96.7%는 전립선암이 발생하였다. 그러나, 간암은 전체 개체중 0.1% 만이 발생하였는데, 이는 간암세포주인 HepG2 세포의 낮은 생존율에 기인한 것으로 생각되어진다.

도 10 및 11 에 의하면, 실시예 3 내지 6 의 건강기능성 음료를 섭취한 경우 대조군보다 췌장암 평균 종양의 무게가 감소하였고, 실시예 6 의 건강기능성 음료를 섭취한 경우 췌장암 종양의 무게가 가장 감소하였다. 즉, 본 발명의 조성물의 함량이 높아질수록 항암효과가 증가한다.

도 10 및 12 에 의하면, 실시예 3, 4 및 6 의 건강기능음료를 섭취한 경우 대조군보다 전립선암 종양의 무게가 적었으나 실시예 5 의 건강기능음료를 섭취한 실험군의 경우 대조군보다도 종양무게가 커진 것을 관찰할 수 있다.

따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 동일 농도에서 전립선암보다 췌장암에 그 효과가 클 것으로 기대된다.

<실험예 6> p53 및 p21 단백질의 발현에 미치는 영향

상기 실험예 5 와 같은 방법으로 암 세포를 이식한 누드마우스에 2주 동안 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료를 포함하는 음용수를 공급한 후, 누드마우스에서 적출한 췌장암 조직에서 p53 및 p21 단백질의 발현의 변화를 Western blot 방법을 통해 확인하였다. 그 결과는 도 13 에 나타내었다.

도 13 은 실시예 3 내지 6 의 시료를 섭취하지 않은 대조군에서 p53 과 p21 단백질의 발현을 기준으로 하여(1.0), 실시예 3 내지 6 의 시료를 처리했을 경우의 증가율을 환산하여 비교한 것이다. 도 13 에 의하면, Western blot 결과, 실시예 3 내지 6 의 건강기능음료로 처리한 경우 p53 과 p21 단백질의 발현이 대조군에 비해 높아진 것을 알 수 있다. 특히 실시예 5 및 6 의 건강기능 음료를 섭취한 실험군의 경우 p53 단백질 발현이 대조군에 비해 2.0 배, 3.0 배 증가하였다. p53 의 하위 유전자인 p21의 경우 모든 실험군에서 대조군에 비해 6 배이상 단백질의 발현이 증가하였다.

따라서, 본 발명의 약학적 조성물이 발암억제인자의 단백질 발현을 증가시킴으로써 암 세포의 성장을 억제시킴을 알 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 약학적 조성물은 발암억제 유전자의 발현을 증가시켜 암 세포의 증식을 억제하는 효과가 있으며, 췌장암, 간암 및 전립선암등에 효과가 있음을 알 수 있다. 특히 췌장암의 경우 적은 농도에서도 그 효과가 좋았다.

도 1 은 p53 의 활성에 의한 세포 사멸 및 세포 주기 조절 메카니즘을 나타낸 모식도이다.

도 2 는 실시예 3 내지 4 의 시료를 농도를 달리하여 인간 췌장암 세포주, 간암 세포주 및 전립선암 세포주에 처리하고 24 시간 배양한 후 처리전 세포 생존률(100%)을 기준으로 세포 생존률을 백분율로 나타낸 그래프이다.

도 3 은 실시예 3 내지 4 의 시료를 PANC1 세포에 처리후 24 시간 동안 배양하고 세포의 형태를 현미경으로 관찰한 결과이다.

도 4 는 인간 암 세포주에서 p21 단백질의 발현정도를 실시예의 시료로 처리한 것과 처리하지 않은 것을 비교하여 나타낸 것이다.

도 5 는 인간 암 세포주에서 Bax 단백질의 발현정도를 실시예의 시료로 처리한 것과 처리하지 않은 것을 비교하여 나타낸 것이다.

도 6 은 누드마우스에 인간 암 세포주를 이식하는 그림이다.

도 7 은 암세포 이식 마우스모델에서 실시예의 본 발명의 암 치료 및 예방용 약학적 조성물을 포함하는 건강기능음료가 먹이 섭취량이 미치는 영향을 나타낸다.

도 8 은 암세포 이식 마우스모델에서 실시예의 본 발명의 암 치료 및 예방용 약학적 조성물을 포함하는 건강기능음료가 음용수 섭취량이 미치는 영향을 나타낸다.

도 9 는 암세포 이식 누드마우스 모델에 2 주 동안 본 발명의 암 치료 및 예방용 약학적 조성물을 포함하는 건강기능음료를 음용하게 한 후, 희생했을 당시의 모습을 나타낸 것이다.

도 10 은 암세포를 이식한 누드마우스 모델에서 종양을 적출하여 그 무게를 측정한 것이다.

도 11 은 암세포를 이식한 누드마우스 모델에서 췌장암 조직을 적출하여 무게를 측정한 것이다.

도 12 는 암세포를 이식한 누드마우스 모델에서 전립선암 조직을 적출하여 무게를 측정한 것이다.

도 13 은 암세포를 이식한 누드마우스 모델에서 췌장암 조직을 적출하여 p53 및 p21 단백질 발현에 미치는 영향을 살펴본 것이다.

Claims

홍경천 및 백화사설초를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료 및 예방용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,

상기 홍경천이 총 조성물 100 중량부에 대하여 10 내지 70 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 암 치료 및 예방용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,

상기 백화사설초가 총 조성물 100 중량부에 대하여 20 내지 80 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 암 치료 및 예방용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,

육종용을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료 및 예방용 약학적 조성물.
제4항에 있어서,

상기 육종용이 총 조성물 100 중량부에 대하여 10 내지 40 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 암 치료 및 예방용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,

사상자, 토사자 및 원지로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료 및 예방용 약학적 조성물.
제6항에 있어서,

상기 사상자, 토사자 또는 원지가 총 조성물 100 중량부에 대하여 5 내지 15 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 암 치료 및 예방용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,

상기 암 치료 및 예방용 약학적 조성물이 발암억제 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 암 치료 및 예방용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,

상기 암이 췌장암, 간암, 위암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 폐암 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는 암 치료 및 예방용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,

상기 조성물이 추출물 또는 분말 형태인 것을 특징으로 하는 암 치료 및 예방용 약학적 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 개선 및 예방용 건강기능식품.
제11항에 있어서,

상기 건강기능식품이 건강기능음료인 것을 특징으로 하는 암 개선 및 예방용 건강기능식품.
제11항에 있어서,

상기 건강기능식품이 천연차인 것을 특징으로 하는 암 개선 및 예방용 건강기능식품.
제11항에 있어서,

상기 조성물의 추출물이 건강기능식품 또는 건강기능음료 총 100 중량부에 대하여 0.001 내지 30 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 암 개선 및 예방용 건강기능식품.