KR101518129B1 - 강판귀로부터 분리된 디보사이드 에이 화합물을 포함하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

강판귀로부터 분리된 디보사이드 에이 화합물을 포함하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 강판귀로부터 분리된 디보사이드 에이 화합물을 포함하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 디보사이드 에이 화합물은 항산화 활성과 더불어 다양한 자가 면역 질환의 원인이 되는 세포인 Th17의 분화를 억제하는 면역 조절 활성을 나타내므로 류마티스 관절염, 건선, 다발성 경화증 등과 같은 자가면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물, 기능성 식품 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 디보사이드 에이 화합물은 NO(nitric oxide) 생성을 억제하여 항염 효과가 있는바, 염증성 장질환, 접촉 피부염 등과 같은 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물, 화장품학적 조성물, 기능성 식품 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

강판귀로부터 분리된 디보사이드 에이 화합물을 포함하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Preventing or Treating Autoimmune Disease or Inflammatory Diseases Comprising Diboside A Compounds Isolated from Persicaria Perfoliata}
본 발명은 강판귀로부터 분리된 디보사이드 에이 화합물을 포함하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 강판귀로부터 분리된 6-O-피-쿠머로일-글르코사이드,1-O-플루토스-(1,3-피-쿠머로일, 6-페루로일)을 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
강판귀(Persicaria perfoliata)는 마디풀목, 마디풀과의 한해살이 덩굴 식물로 한국, 중국, 일본 등에서 주로 서식한다. 이 식물의 이명으로는 며느리배꼽, 사광이풀 등이라 불리며, 과거 며느리배꼽의 어린 잎사귀를 식용으로 사용하였으며 그 맛은 신맛이 난다고 보고되고 있다. 또한 전통적으로, 중국에서는 며느리배꼽의 줄기를 건조하여 해열 및 해독의 목적으로 사용되어 졌으며, 이를 한약명으로 강판귀라 불렀다. 주로, 며느리배꼽은 민간에서 해독제, 해열제, 이뇨제 등으로 사용되어 왔으며, 기침이나 백일해 등 호흡기 질환에도 사용되어 왔다. 기존의 마디풀과 식물에 성분 연구를 통해 ferulic acid, vanillic acid, quercetin, caffeic acid, protocatechuic acid 등이 함유되어 있다고 보고된 바 있으나 며느리 배꼽의 경우 성분 연구가 많이 이뤄져 있지 않으며, 또한 활성 연구로도 간단한 항산화 및 항염, 항균 활성이 추출물에서만 보고된바 있다.
1993년 Rouvier등(J Immunol)에 의해 설치류에서 처음 분리된 IL-17은 활성화된 T세포에서 분비되는 염증성 사이토카인으로 사람의 경우 155개의 아미노산으로 구성되어 있다. IL-17은 면역 세포의 NF-ĸB와 MAP kinases를 활성화 시키는 역할과 IL-6, PTGS2/COX-2 및 nitric oxide의 분비를 촉진하는 것으로 알려져 있는데, IL-17 계열의 사이토카인은 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (also called IL-25)와 IL-17F로 구성되어 있으며 이들은 모두 유사한 단백질 구조를 갖고 있다.
IL-17에 대한 초기 연구에서는 세포 타입에 따라서 MCP-1, CXC 계열의 케모카인들과 함께 작용하여 IL-1β, TNF, IL-6, 및 colony-stimulating factor의 분비를 촉진하기 때문에 초기 면역 반응 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. 실제 IL-17R이 결핍된 경우 Klebsiella나 Citrobacter등에 감수성이 높아지는 것을 확인하였다(Ye et al., 2001, J Exp Med; Happel et al., 2005, J Exp Med).
그러나 자가 면역 질환에서 IL-17의 중요성이 밝혀지기 시작한 것은 Nakae등이 IL-17 유전자가 적중된 생쥐의 경우 항원 특이적인 T 세포의 반응이 손상된다는 보고를 하면서 부터이다(Immunity, 2002). 또한 이후 연구 결과들에 따르면 IL-17은 류마티스성 관절염(Nakae et al., J Immunol. 2002; Bush et al., Arthritis Rhuem. 2002), 뇌척수염(Komiyama et al., J Immunol, 2006), 다발성 경화증(Lock et al., Nat Med, 2002), 건선(Zaba et al., J Clin Invest, 2007) 그리고 염증성 장질환(Fina et al, Gastroenterology, 2008)등과 같은 자가 면역 질환의 발생이 증가하는 것을 밝혔다.
IL-17을 분비하는 Th17 세포의 분화 과정은 원시 T 세포를 anti-CD3/CD28, IL-6 및 TGF-β로 자극에 의해서 시작된다. Th17 세포의 분화에 필요한 신호 전달 물질로는 STAT3, 전사 조절 인자는 RORA(RAR-related orphan receptor A)와 RORC(RAR-related orphan receptor C)와 IRF4 등이 알려져 있다(Mathur et al., J Immunol, 2007; Ivanov et al., Cell, 2006; Huber et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008).
TGF-β는 Th17 세포의 분화 외에 Th17의 경쟁 관계에 있는 Treg 세포의 분화에도 필요한 사이토카인이므로 Th17 세포의 분화에는 IL-6의 역할이 중요하게 작용 할 것이다(Korn et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2008). 또한 분화가 완료된 뒤 Th17 세포의 분열과 유지를 위해서는 IL-21, 22, 23과 같은 추가적인 사이토카인을 필요로 한다(Bettelli et al., Curr Opin Immunol. 2007).
Th1 세포와 Th2 세포가 서로 견제를 하며 면역 체계의 균형을 유지하는 것과 마찬가지로 Th17 세포와 Treg 세포는 서로의 분화를 견제하며 균형을 유지하게 된다. 이러한 균형이 무너져 면역학적 불균형이 초래되는 경우 자가 면역 질환의 발생 확률이 증가하게 된다. 그러므로 자가 면역 질환의 치료제 개발을 위해서는 Th17 세포의 활성을 억제하는 것은 매우 효과적인 질환 치료제를 제공해 줄 수 있음을 시사한다.
상기에서 기재한 바와 같이, 자가면역질환을 치료하기 위한 천연물 소재를 개발하는 것이 주요한 과제의 대상이 되고 있고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국공개특허 제10-2012-0098311호), 아직 미비한 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
[화학식 1]
Figure 112014114444692-pat00020
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
[화학식 1]
Figure 112014114444692-pat00021
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112014114444692-pat00022
본 발명의 일 구현예로, 상기 자가면역 질환은 T 세포에 의해 매개되는 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 화학식 1의 화합물은 IL(interleukin)-2 또는 IL-17의 분비를 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화학식 1의 화합물은 STAT3 단백질의 인산화를 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화학식 1의 화합물은 자유라디칼 소거 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112014114444692-pat00023
더욱이, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112014114444692-pat00024
본 발명의 일 구현예로, 상기 화학식 1의 화합물은 NO(nitric oxide) 생성 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 화장품학적 조성물인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 디보사이드 에이 화합물은 항산화 활성과 더불어 다양한 자가 면역 질환의 원인이 되는 세포인 Th17의 분화를 억제하는 면역 조절 활성을 나타내므로 류마티스 관절염, 건선, 다발성 경화증 등과 같은 자가면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물, 기능성 식품 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 디보사이드 에이 화합물은 NO(nitric oxide) 생성을 억제하여 항염 효과가 있는바, 염증성 장질환, 접촉 피부염 등과 같은 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물, 화장품학적 조성물, 기능성 식품 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 디보사이드 에이의 항산과 효능을 평가하기 위한 자유라디칼 소거능을 측정한 실험결과이다.
도 2는 디보사이드 에이의 항염 효능을 평가하기 위한 대식세포로부터 nitrite의 유리 억제능을 측정한 실험결과이다.
도 3은 anti-CD3 및 CD28의 자극에 의한 T세포 증식을 억제하는 디보사이드 에이의 효과를 확인한 실험결과이다.
도 4는 T 세포가 anti-CD3 및 CD28의 자극을 받아 활성화 되면서 분비하는 T 세포 증식 사이토카인인 IL-2의 분비를 억제하는 디보사이드 에이의 효과를 확인한 실험결과이다.
도 5은 비장 세포가 anti-CD3/CD28, IL-6 및 TGF-β에 의해 Th17 세포로 분화되는 과정에서 분비되는 IL-17을 디보사이드 에이가 억제하는 것을 보여주는 실험 결과이다.
도 6은 비장 세포가 anti-CD3/CD28 및 IL-6의 자극에 의해 Th17 세포 분화를 촉진하는 신호 전달 물질인 STAT3 단백질의 인산화를 억제하는 디보사이드 에이의 효과를 확인한 실험결과이다.
도 7은 Imiquimod(상품명 알다라 크림)의 연속적 도포는 피부 조직 내에 Th17 세포의 분화를 촉진하게 되며 이로 인해 건선과 유사한 피부염이 발생하게 되는데 디보사이드 에이가 억제하는 것을 보여주는 실험결과이다.
본 발명자들은 천연물로부터 항염 및 항접촉 피부염 활성을 갖는 활성 화합물을 발굴하기위해 연구 노력한 결과, 강판귀로부터 쿠머로일(coumaroyl)기를 갖는 디보사이드 에이(diboside A) 화합물을 분리하였고, 상기 화합물이 T 세포의 증식을 억제하며 T 세포의 활성을 조절하는 활성을 가지는 것을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112014114444692-pat00025
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 자가면역 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 자가면역 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로 상기 화학식 1로 표시되는 화합물인 디보사이드 에이를 포함하며, 보다 구체적으로는 6-O-피-쿠머로일-글르코사이드,1-O-플루토스-(1,3-피-쿠머로일, 6-페루로일)이다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 디보사이드 에이는 천연물, 예를 들어 강판귀(Persicaria perfoliata)로부터 추출된 것을 사용할 수 있으나, 화학적으로 합성된 것도 추출된 것과 동일한 효과를 나타낸다는 것은 당업자에게 자명하다.
본 발명에서 강판귀 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 강판귀 추출물을 추출하기 위한 추출용매로는 추출공정에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있으며, 둘 이상의 서로 다른 용매를 순차적으로 사용하여 추출할 수도 있는데, 바람직하게는, 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올), 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄(CH2Cl2), 클로로포름, 헥산(Hexane) 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 강판귀 추출물로부터 유효성분인 화학식 1로 표시되는 디보사이드 에이 화합물은 통상적인 화합물의 분리 정제 방법에 의해 얻을 수 있다. 예컨대, 실리카겔 또는 셀라이트(celite)겔 컬럼을 이용한 여과(filtration), 액체 컬럼 크로마토그래피를 이용한 크기배제(size-exclusion) 크로마토그래피, 이온교환(ion-exchange) 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 이들 크로마토그래피의 조합을 이용하여 분리 정제할 수 있다. 천연물 추출물로부터 분리된 단일 화합물은 EI MS (Electron Ionization Mass Spectroscopy), CI (Chemical Ionization Mass Spectroscopy), FABI (Fast Atom Bombardment Ionization), ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry)와 같은 질량분석법과, 적외선 분광법(IR Sectrum), 핵자기공명법(NMR, Nuclear Magnetic Resonance), CD (Circular Dichroism) 등의 방법을 이용하여 그 구조를 동정하여 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 강판귀 추출물로부터 디보사이드 에이 화합물을 분리 동정한 후(실시예 1 및 2 참조), 이의 효능을 확인한 결과, 본 발명의 디보사이드 에이 화합물이 DPPH 라디칼 소거, IL-2, IL-17의 분비 억제 및 STAT3 단백질의 인산화를 억제하는 효능을 가짐을 확인하였다(실시예 3, 5 및 6 참조). 따라서, 본 발명의 디보사이드 에이는 T세포의 증식 및 활성화를 억제하면서 동시에 Th-17 세포의 분화를 억제하는 효능을 가지는바, 자가면역 질환, 바람직하게는 T 세포에 의해 매개되는 자가면역질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 자가면역질환으로는 예컨대, 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 건선, 전신성홍반성낭창(systemic lupus erythematosis), E-과면역글로불린혈증증후군(hyperimmunoglobulin E), 하시모토씨 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 그레브스 병(Grave' s Disease), 다발성경화증(multiple sclerosis), 경피증(Scleroderma), 전신성 경피증(progressive systemic sclerosis), 중증근무력증(myasthenia gravis), 제1형 당뇨(type I diabetes), 포도막염(uveitis), 알레르기성 뇌척수염(allergic encephalomyelitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 백반증(Vitilligo), 굿패스쳐 신드롬(Goodpasture syndrome), 베제트병(Becet' s Disease), 크론병(Crohn' s Disease), 강직성 척추염(Ankylosing Spondylitis), 포도막염(Uveitis), 혈소판 감소성 자반증(Thrombocytopenic purpura), 심상성 천포창(Pemphigus vulgaris), 소아당뇨병(Diabetes), 자가면역성 용혈성 빈혈(Autoimmune Anemia), 크라일로글로불린증(Cryoglobulinemia), 부신백질이영양증(ALD), 전신성 홍반성 낭창(Systemic Lupus Erythematosus,SLE) 등이 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 상기 화학식 1로 표시되는 디보사이드 에이 화합물을 포함하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100mg/kg (체중)이다. 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다. 본 발명의 약학적 조성물에서 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112014114444692-pat00026
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 이때 상기 기능성 식품 조성물은 자가면역 질환 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 유효성분을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 기능성 식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112014114444692-pat00027
본 명세서에서 사용되는 용어 "염증" 또는 "염증반응"은 어떤 장애성 자극에 대한 생체조직의 방어반응을 의미하며, 형태학적으로는 국소조직의 퇴행성 변화, 순환장애와 삼출(渗出), 조직증식의 세 가지를 병발하는 병변이다.
NO는 생체내에서 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 NOS(nitric oxide synthase)에 의해 합성되며, 면역기능 조절, 혈관확장, 신경전달, 혈액응고와 같은 역할을 하나, 염증발생 부위에서는 과도하게 생성된 NO에 의해서 염증질환이 악화된다. 본 발명의 항염 조성물의 유효성분인 상기 화학식 1로 표시되는 디보사이드 에이 화합물은 하기 구체적인 실시예(실시예 4 참조)에서 입증된 바와 같이 우수한 NO(nitric oxide) 생성 억제 효능을 갖는다.
따라서, 본 발명의 항염 조성물은 항염 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 염증성 장질환, 접촉 피부염, 만성 폐쇄성 폐질환, 알레르기 등의 염증성 질환을 예방, 개선, 또는 치료용 약학적 조성물, 기능성 식품 조성물, 화장료 조성물 등의 용도로 사용될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
하나의 양태로서, 본 발명의 항염 조성물은 약제학적 조성물 또는 기능성 식품 조성물의 형태로 사용될 수 있으며, 이는 전술한 내용과 동일하다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 항염 조성물은 화장품학적 조성물의 형태로 사용될 수 있으며, 이때, 본 발명의 화장품학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장품학적 조성물에 함유된 화장품학적으로 유효한 담체는 제형에 따라, 당업계에서 통상적으로 이용되는 담체가 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품학적 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 강판귀 추출물로부터 디보사이드 에이(Diboside A) 화합물 분리
건조한 강판귀(6 kg)를 분쇄하여 80% 아세톤으로 실온에서 3회 추출하여 여과한 후 그 추출액을 감압 농축하여 추출물 340g을 얻었다. 그 추출액을 감압 농축한 후 70% MeOH-Hexane, 70% MeOH-Chloroform에 용매 분획하여, 3개의 분획(Hexane layer, Chloroform layer, 70% MeOH layer)으로 나누었고, 그 중 Chloroform layer를 Silica gel 컬럼크로마토그래피를 이용하여, 용매는 Hexane-Ethyl Acetate= 10:1~1:1까지 농도를 높였으며, TLC를 실시하여 6개의 분획(Fr.1, Fr.2, Fr.3, Fr.4, Fr.5, Fr.6)으로 나누었고, 그 중 분획 Fr. 4 를 DaiSogel ODS-B with MPLC (60% MeOH → 100% MeOH, gradient system) 컬럼크로마토그래피를 통해서 디보사이드 에이(Diboside A) 화합물(566 mg)을 얻었다.
실시예 2. 디보사이드 에이( Diboside A) 화합물의 구조 동정
실시예 1에서 얻은 디보사이드 에이(Diboside A) 화합물의 1H 및 13C-NMR spectra를 측정하였고, 그 결과는 하기와 같다.
① 1H-NMR (600 MHz, Aceton-d 6 + D2O)
1H-NMR (600 MHz, Aceton-d 6):δ7.735 (1H, d, J= 15.6 Hz, H-7""'), 7.681 (1H, d, J= 15.6 Hz, H-7"), 7.644 (1H, d, J= 15.6 Hz, H-7"'), 7.681 (1H, d, J= 15.6 Hz, H-7""), 7.565 (2H, d, J= 8.4 Hz, H-2",3"), 7.514 (2H, d, J= 8.4 Hz, H-2"', 3"'), 7.473 (2H, d, J= 8.4 Hz, H-2"", 3""), 7.327 (1H, d, J= 1.8 Hz, H-2'""), 7.111 (1H, dd, J= 1.8, 8.4 Hz, H-6'""), 6.882 (2H, d, J= 8.4 Hz, H-5", 6"), 6.863 (2H, d, J= 8.4 Hz, H-5"', 6'"), 6.856 (2H, d, J= 8.4 Hz, H-5"", 6""), 6.832 (1H, d, J= 8.4 Hz, H-5"'"), 6.557 (1H, d, J= 15.6 Hz, H-8""'), 6.445 (1H, d, J= 15.6 Hz, H-8"), 6.421 (1H, d, J= 15.6 Hz, H-8"'), 6.349 (1H, d, J= 15.6 Hz, H-8""), 5.665 (1H, d, J= 9.0 Hz, H-3), 5.547 (1H, d, J= 3.6 Hz, H-1'), 4.752 (1H, d, J= 8.4 Hz, H-4), 4.723 (1H, dd, J= 1.8, 12.0 Hz, H-1), 4.639 (1H, dd, J= 1.8, 12.0 Hz, H-1), 4.577 (1H, dd, J= 7.8, 12.0 Hz, H-6), 4.336 (1H, m, H-5'), 4.300 (2H, m, H-6'), 4.286 (1H, m, H-5), 4.239 (1H, dd, J=7.8, 12.0 Hz, H-6), 3.860 (3H, s, OMe), 3.737 (1H, t, J=8.4 Hz, H-2'), 3.395 (1H, m, H-4')
② 13C-NMR (150 MHz, Aceton-d 6 + D2O)
δ167.1, 167.8, 166.3, 166.3 (9", 9"', 9"'', 9""'), 160.1, 159.9, 159.9 (4", 4"', 4""), 149.2 (4""'), 147.9 (3""'), 146.0, 145.3, 145.3, 145.2 (7", 7"', 7"", 7""'), 130.4 (2", 6"), 130.2 (2"', 6"'), 130.1 (2"", 6""), 126.5 (1""'), 125.8 (1", 1"'), 125.7 (1""), 123.3 (6""'), 115.8 (8", 8"', 8""), 115.1 (8""'), 114.6 (3", 3"'), 114.1 (3"'), 114.0 (5", 5'"), 113.6 (5""), 110.4 (2""'), 102.2 (2), 91.8 (1'), 79.9 (5), 77.6 (3), 73.9 (5'), 72.8 (3'), 71.6 (4), 71.0 (2'), 70.8 (4'), 64.7 (1), 64.6 (6), 64.4 (6'), 55.4 (OMe)
상기 결과에 의해, 실시예 1에서 얻은 디보사이드 에이(Diboside A) 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 6-O-피-쿠머로일-글르코사이드,1-O-플루토스-(1,3-피-쿠머로일, 6-페루로일)로 확인되었다.
[화학식 1]
Figure 112014114444692-pat00028

실시예 3. 항산화 효능 평가
상기 실시예 1 및 2를 통해 분리 동정한 디보사이드 에이 화합물의 항산화 효능을 평가하기 위해 하기와 같이 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다.
즉, DPPH는 분자 내에 안정한 라디칼을 함유하지만 항산화활성이 있는 물질과 만나면 라디칼이 제거 되는데 이때 DPPH의 흡광도의 변화를 측정하여 항산화 효과를 확인할 수 있다. DPPH는 이때 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 프리라디칼로서 cystin, glutathion과 같은 황을 함유한 아미노산과 ascorbic acid, BHA, BHT 등에 의해 환원되어 탈색되므로 이러한 색도의 변화를 통하여 다양한 천연 소재로부터 항산화 물질을 검색하는 데 많이 이용되고 있다.
상기 실시예에서는 Hatano의 방법에 의하여 디보사이드 에이 시료는 최종 농도가 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μl/ml이 되도록 6가지 농도로 조제한 후 각 시료 10 μL에 0.1 mM DPPH 용액 (99.5% ethanol) 180 μL을 가한 후 vortex mixer로 10초간 진탕한 후 37℃에서 30분 동안 incubation 시킨 후 ELISA reader (TECAN, Sazburg, Austria)를 이용하여 518 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 표 1 및 도 1에 나타내었다. 한편, 양성대조군으로는 비타민 C(Vitamin C)를 사용하였다.
시료 DPPH 라디칼 소거능(μM)
6-O-피-쿠머로일-글르코사이드,1-O-플루토스-
(1,3-피-쿠머로일, 6-페루로일)		 14.87 ± 0.52
비타민 C (양성대조군) 22.41 ± 2.00
표 1 및 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 디보사이드 에이 화합물은 양성 대조군 보다 DPPH 라디칼 소거능이 우수함을 확인할 수 있었고, 상기 결과로부터 본 발명의 디보사이드 에이 화합물은 우수한 항산화 효능을 가짐을 알 수 있었다.
실시예 4. 항염 효능 평가
상기 실시예 1 및 2를 통해 분리 동정한 디보사이드 에이 화합물의 항염 효능을 평가하기 하기와 같이 NO 생성 억제 활성의 IC50 값을 측정하였다.
즉, 리포폴리사카라이드(LPS, lipopolysaccharide) 및 INF-γ를 이용하여 RAW 264.7 세포의 NOS(nitric oxide synthase)를 발현시키고 생성된 NO의 양을 Griess의 방법으로 측정하였다. Griess 시약(1% 설파닐아민, 0.1% N-(1-나프틸)-에틸렌 디아민 디히드로클로라이드, 2.5% H3PO4)는 NO를 산화시켜 NO2로 변화시키며, 생성된 NO2는 540 nm에서 흡광도를 측정하여 그 농도를 NaNO2의 검량선을 이용하여 구했다. 보다 구체적으로, RAW 264.7 세포를 5 X 104/ml 농도로 배양한 후, 1 X 104/ml 농도로 희석하여 96 웰에 160 μl씩 넣고 2 시간 동안 배양하여 세포들이 부착되도록 한 후, LPS(1 μl/ml) 10 μl, INF-γ(1 μl/ml) 10 μl 및 양성 대조군인 LNMMA(NO 생성 억제 시약)을 포함한 각각의 시료를 20 μl씩 첨가하고 20 시간 배양 후, 배양액에 생성되어 있는 NO의 양을 Griess 시약을 이용하여 정량하였고, 그 결과를 표 2 및 도 2에 나타내었다.
시료 NO 생성 저해능(μM)
6-O-피-쿠머로일-글르코사이드,1-O-플루토스-
(1,3-피-쿠머로일, 6-페루로일)		 50.88 ± 2.19
L-NMMA (N-Methylarginine) (양성대조군) 15.07 ± 0.86
실시예 5. 디보사이드 에이에 의한 면역 세포 활성 조절 효능 평가
5-1. 실험 준비
하기 실험들을 위해 실험동물로부터 비장 세포를 분리하였다. 즉, 실험동물은 6-7 주령의 Balb/C 마우스를 오리엔트바이오(성남, 대한민국)에서 공급받아 사용하였다. 실험동물은 22-24℃, 습도 50%에서 사료와 물을 충분히 공급해 주며 사육하였다. Balb/C 마우스로부터 적출한 비장은 mesh를 이용하여 잘게 파쇄한 뒤 Cell strainer(SPL, 대한민국)를 사용하여 결합 조직 등을 제거한 뒤 원심 분리하여 비장 세포를 얻었다. 얻어진 비장세포에 10ml의 ACK 용액을 첨가하여 상온에서 5분간 반응시켜 적혈구를 제거한 뒤 2차 원심 분리하여 비장세포를 분리하였다.
5-2. 디보사이드 에이의 T세포 증식 억제능 측정
비장 세포에 존재하는 T 세포를 자극하기 위해 100 μl(1μg/ml)의 anti-CD3 (eBioscicence, USA)으로 코팅된 96 well plate에 2×105 cells/well의 농도로 비장 세포를 분주하였다. 디보사이드 에이는 70% 에탄올에 50mM의 stock을 준비한 뒤 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 및 1.5625 μM의 농도로 처리해 주었다. 한 시간 뒤 100ng(1mg/ml)의 anti-CD28을 첨가한 뒤 48 시간 배양하였다.
비장 세포의 증식 억제 활성의 측정은 EZ-Cytox(대일이화학, 대한민국) 용액을 사용하여 측정하였다. 보다 구체적으로, 48시간의 배양을 마친 각 plate에 EZ-cytox용액 10μl를 첨가한 뒤 골고루 섞어주고 37℃ 인큐베이터에서 2-4시간 동안 반응하였다. 발색이 이루어지면 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포 성장 억제 정도를 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 디보사이드 에이를 처리한 경우, T세포의 증식이 유의적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.
5-3. 디보사이드 에이의 T 세포 유래 사이토카인 억제 활성 측정
상기 실시예 5-2와 동일한 방법으로 Anti-CD3와 anti-CD28로 자극하고, 디보사이드 에이를 처리한 배양액을 이용하여 T 세포 성장 사이토카인인 IL-2를 측정하였다. 사이토카인의 측정은 eBioscience (San Diego, CA, USA)사의 ELISA kit를 사용하여 제조사의 가이드라인에 따라 측정하였다. 보다 구체적으로, ELISA용 플레이트에 1X 포획용 항체를 50 μl씩 분주한 뒤 4℃에서 16시간 반응시켰다. 코팅된 각 웰을 세척용 완충액으로 3회 세척하고 블로킹(blocking) 용액을 50 μl씩 분주한 뒤 상온에서 1시간 반응시켰다. 이를 다시 세척용 완충액으로 3회 세척하고 배양액을 50 μl씩 분주한 뒤 상온에서 2-3시간 반응시켰다. 세척 후 1X 검출용 항체를 50 μl씩 분주한 뒤 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후 1X 아비딘(avidin)-HRP 항체를 50 μl씩 분주한 뒤 상온에서 30분간 동안 반응시켰다. 세척 후 기질 반응 용액을 50 μl씩 분주한 뒤, 암소에서 보관하며 충분한 발색이 이루어진 뒤에 황산 용액으로 반응을 정지시켰다. 발색 반응 정지 후 eMAX ELISA 판독기(Molecular devices, CA, USA)를 사용하여 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 분비된 IL-1β의 양은 표준 곡선을 사용하여 정량화하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 디보사이드 에이를 처리한 경우, IL-2 생성이 유의적으로 억제됨을 확인할 수 있었고, 상기 결과로부터, 디보사이드 에이는 T 세포 성장 사이토카인인 IL-2의 생성을 억제시켜 T세포의 증식을 억제한다는 것을 알 수 있었다.
5-4. 디보사이드 에이의 Th-17 세포의 분화 억제능 측정
비장 세포에 존재하는 T 세포를 자극하기 위해 100 μl(1μg/ml)의 anti-CD3 (eBioscicence, USA)로 코팅된 96 well plate에 2×105 cells/well의 농도로 비장 세포를 분주하였다. 디보사이드 에이는 70% 에탄올에 50mM의 stock을 준비한 뒤 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 및 1.5625 μM의 농도로 처리해 주었다. 한 시간 뒤 100ng의 anti-CD28, 2ng 및 IL-6 및 0.5ng의 TGF-β를 첨가한 뒤 72 시간 배양하고 배양액으로 유리된 IL-17의 양을 ELISA로 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 디보사이드 에이를 처리한 경우, IL-17 생성이 유의적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 디보사이드 에이의 STAT3( Signal transducer and activator of transcription 3) 단백질의 인산화 억제능 측정
먼저, 마우스의 비장 세포는 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 분리하였다. Anti-CD3가 코팅된 6 well plate에 2×106 cells/well의 농도로 분주하고 디보사이드 에이를 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 및 1.5625 μM의 농도로 전 처리해 주었다. 1시간 후 1 μg의 anti-CD28과 10ng의 IL-6를 첨가하여 30분간 추가 배양 한 뒤 RIPA beffer를 사용하여 단백질을 분리한 뒤 웨스턴 블롯을 통해 인산화 정도를 비교하였다.
보다 구체적으로, 준비된 단백질 50μg은 SDS-PAGE 전기영동 후 PVDF membrane에 transfer했다. Transfer가 끝난 membrane을 5% skim milk (blocking buffer) 10 ml에 30 분 동안 blocking하고 0.1% Tween 20을 포함하는 PBS로 5분 3회 세척하였다. 세척한 멤브레인에 STAT3 인산화 폼을 인지하는 항체(Cell signalling technology, USA)를 각각 5% 젤라틴 용액으로 1000:1로 희석하여 2 시간 동안 상온에서 반응시키고 0.1% Tween 20을 포함하는 PBS로 5분 3 회 세척하였다. HRP가 붙은 2차 항체를 skim milk buffer에 1000:1로 희석하여 1 시간 상온에서 반응시키고. 다시 0.1% Tween 20을 포함하는 PBS로 5분 3회 세척하였다. 세척을 마친 membrane은 ECL detection solution(INTRON)을 이용하여 X-ray 필름에 감광시킨 뒤 현상하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 디보사이드 에이를 처리한 경우, STAT3 단백질의 인산화가 억제됨을 확인할 수 있었다.
실시예 7. 건선 모델에서 디보사이드 에이의 치료 활성 측정
디보사이드 에이의 자가 면역 질환의 치료효과는 건선형 피부 질환 모델을 사용하여 확인하였다. 동물 모델은 60mg의 5% imiquimod(IMQ) 크림(Aldara, 3M)을 털을 제거한 Balb/C 마우스(7W, Female)의 등 부위에 1일 1회 5일간 오전에 도포하였다(van der Fits, J Immunol, 2009). 디보사이드 에이의 치료효과는 2.5% 크림 제형을 1일 1회 10mg씩 오후에 도포한 뒤 실험 마지막 날에 피부 조직을 채취하여 H&E 조직 염색을 통해 표피의 변화를 관찰하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 디보사이드 에이를 도포하는 경우 건선이 유의적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 건선 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112014114444692-pat00029
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  3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 IL(interleukin)-2 또는 IL-17의 분비를 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 STAT3 단백질의 인산화를 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 자유라디칼 소거 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 건선 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112014114444692-pat00030
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Food Chemistry. 2012. Vol.132, pp.433-438.*
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