KR101151701B1

KR101151701B1 - 허수타노놀을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선용 조성물

Info

Publication number: KR101151701B1
Application number: KR1020090006636A
Authority: KR
Inventors: 이민원; 최영욱; 서성준; 이도익; 방효원; 이정수; 이종찬; 명순철; 이미경; 주성수; 최선은
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2009-01-28
Filing date: 2009-01-28
Publication date: 2012-06-15
Also published as: US20100190729A1; KR20100087552A

Abstract

본 발명은 허수타노놀을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명 조성물의 유효성분인 허수타노놀 및 오레고닌은 아토피성 피부염에서 증가되는 호산성백혈구(eosinophil)의 수를 감소시키며, 아토피성 피부염의 병변과 관련된 면역 조절 사이토카인 IL-4, 5, 10 및 13의 발현량을 조절하는 효능을 갖는다. 또한, 허수타노놀 및 오레고닌은 아토피성 피부염의 마우스 동물 모델에서 MBD(mouse beta-defensin)-1, 2, 3의 발현을 증가시키며, COX-2 및 iNOS의 발현을 감소시키는 효과를 보인다. 본 발명의 유효성분인 허수타노놀 및 오레고닌은 우수한 아토피성 피부염 개선 및 치료용 약물, 화장품 및 식품으로 개발이 가능하다.

허수타노놀, 오레고닌, 아토피성 피부염, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, 호산성 백혈구

Description

허수타노놀을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선용 조성물{Composition for Treating Atopic Dermatitis Comprising Hirsutanonol as an Active Ingredient}

본 발명은 허수타노놀을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선용 조성물에 관한 것이다.

허수타노놀(hirsutanonol)은 Alnus 속 식물의 수피로부터 추출되는 디아릴헵타노이드(diarylheptanoid) 골격을 갖는 화합물 중 하나이다. 1972년 Asakawa는 A. pendula의 꽃으로부터 alnustone을 비롯한 4종의 새로운 형태의 디아릴헵타노이드의 골격을 가진 화합물을 분리하였고, 1973년 Miyake 등은 A. hirsuta의 녹색수피로부터 허수타노놀(hirsutanonol) 및 허수테논(hirsutenone)을 분리하여 보고하였다(Suga, T., Iwata, N. and Asakaw, Y. : Chemical constituents of male flower of Alnus pendula. Bull. Chem. Soc. Jap., 45, 2058-2060, 1972).

한편, 1998년에 Doug 등은 디아릴헵타노이드가 강력한 혈소판 응집억제 작용 을 갖고 있음을 밝혔다(Doug, H., Chen, S. X., Xu, H. X., Kadota, S. and Namba, T. : A new antilplatelet diarylheptanoid from Alpinia blepharocalyx. J. Nat. Prod. 61, 142-144, 1998)

또한, 1998년에 Lee 등은 새로운 PKC alpha inhibitor로써 디아릴헵타노이드를 보고하였다(Lee, K. K., Bahler, B. D., Hofmann, G. A., Mattern, M. R., Johnson, R. K. and Kingston, D. G. I. : Isolation and structure elucidation of new PKCα inhibitor from Pinus flexilis. J. Nat. Prod. 61, 1407-1409, 1998)

또한, 1999년에 Surh 및 2000년 Ishida 등은 디아릴헵타노이드 화합물의 항-종양 활성이 있음을 보고하였다(Chun, K.-S., Sohn, Y.-S., Kim, H.-S., Kim, O.-H., Park, K.-K., Lee, J.-M., Lee, J., Lee, J.-Y., Moon, A., Lee, S.-S. and Surh, Y.-J. : Antitumor promoting potential of naturally occuring diarylheptanoids structurally related to curcumin, Mutation Research, 428, 49-57, 1999; Ishida, J. Kozuka, M., Wang, H.-K., Konoshima, T., Tokuda, H., Okuda, M., Mou, X. Y., Nishino, H., Sakurai, N., Lee, K.-S. and Nagai, M. : Antitumor-promoting effects of cyclic diarylheptanoids on Epstein-Barr virus activation and two-stage mouse skin carcinogenesis, Cancer Letters, 159, 135-140, 2000).

아토피라는 용어는 어원상 "이상한" 또는 "부적절한"이란 의미를 갖는 용어이다. 아토피성 피부염은 대부분 유아기나 소아 때 발생하여 호전과 악화를 반복 하는 비교적 흔한 만성 염증성 피부질환으로, 아토피의 개인 또는 가족력, 심한 가려움증 및 습진의 3가지 특징으로 진단할 수 있으며 감염, 정신적인 스트레스, 계절과 기후변화, 자극 및 알레르기에 의해 악화될 수 있다.

아토피 피부염의 병인론은 아직 확실히 밝혀 있지 않지만, 현재까지의 연구에 의하면 IgE 항체의 증가에 따른 과감작 반응에 의하거나, 세포매개성 면역기능의 저하로 나타나는 T 림프구의 불균열 분화에 의한 기능적 결여, 피부에 존재하는 아드레날린 수용체의 차단 등이 발병의 원인이라는 설 등이 있다. 따라서, 아토피 피부염은 면역학적인 이상이 관여하는 유전적인 질환으로 생각되고 있다.

아토피성 피부염의 치료 및 관리를 위해, 대부분의 피부과 진료 시 피부 표면의 수분을 유지시켜주는 보습제와 함께 염증반응을 호전시키기 위한 스테로이드 호르몬 즉, 국소 부신피질호르몬 제제를 동시에 처방하는 하는 것이 일반적이다. 하지만, 국소 부신피질호르몬을 장기간 사용하는 경우, 피부 위축, 혈관 확장, 색소 탈실 및 팽창 선조의 발생 등 다양한 피부 부작용을 야기 시킨다는 문제점이 있다. 따라서, 이러한 부작용을 나타내지 않으면서, 항염증 효능을 보유하는 아토피 치료용 원료나 제약의 개발 필요성이 꾸준히 대두되고 있는 상황이다.

허수타노놀 화합물이 항암 작용과 항산화 효능을 갖는다는 것은 공지되어 있으나, 아직까지 아토피성 피부염과 관련하여 생리활성 효과를 나타낸다는 보고는 되어 있지 않다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시 되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 천연 추출물로부터 아토피성 피부염 치료 활성을 갖는 물질을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 오리나무 수피 추출물 중의 디아릴헵타노이드(diarylheptanoid)계 화합물인 허수타노놀(hirsutanonol)이 아토피성 피부염에 관련된 면역 사이토카인의 발현량을 조절할 수 있음을 확인하였고, 이러한 조절 작용을 통해 아토피성 피부염을 완화 또는 치료할 수 있음을 실험적으로 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 허수타노놀을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 허수타노놀의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 아토피성 피부염의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 허수타노놀의 화장품학적 유효량; 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 아토피성 피부염 개선용 화장품학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 허수타노놀을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 천연 추출물로부터 아토피성 피부염 치료 활성을 갖는 물질을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 오리나무 수피 추출물 중의 디아릴헵타노이드계 화합물인 허수타노놀(hirsutanonol)이 아토피성 피부염에 관련된 면역 사이토카인의 발현량을 조절할 수 있음을 확인하였고, 이러한 조절 작용을 통해 아토피성 피부염을 완화 또는 치료할 수 있음을 실험적으로 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 허수타노놀(hirsutanonol)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.

[화학식 1]

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 조성물은 유효성분으로서 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 오레고닌(oregonin)을 더욱 포함한다.

[화학식 2]

단, 상기 화학식 2에서 'Xyl'은 자일로스(xylose)를 의미한다.

본 발명 조성물의 유효성분인 허수타노놀 또는 오레고닌은 천연물, 예를 들어 오리나무(Alnus japonica)의 수피로부터 추출된 것을 사용할 수 있으나, 화학적으로 합성된 것도 추출된 것과 동일한 효과를 나타낸다는 것은 당업자에게 자명하다.

본 발명에서 오리나무 수피 추출물은 천연물 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다. 본 발명의 오리나무 수피 추출물을 분리하기 위한 추출 용매로는 추출공정에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있는데, 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출되는 것이 바람직하다.

본 발명 조성물의 유효성분인 허수타노놀 및 오레고닌은 아토피성 피부염에서 증가되는 호산성백혈구(eosinophil)의 수를 감소시키며, 아토피성 피부염의 병 변과 관련된 면역 조절 사이토카인 IL-4, 5, 10 및 13의 발현량을 조절하는 효능을 갖는다. 또한, 허수타노놀 및 오레고닌은 아토피성 피부염 마우스 동물모델에서 MBD (mouse beta-defensin)-1, 2, 3의 발현을 증가시키며, COX-2 및 iNOS의 발현을 감소시키는 효과를 보인다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 유효성분 화합물이 아토피성 피부염 치료 또는 예방 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 화합물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학 적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-200 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부외용 제형을 갖는다. 피부외용 제형은 특별히 한정되지 않으며 바람직하게는 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형이다.

본 발명의 조성물은 화장품학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "화장품학적 유효량"은 상술한 유효성분 화합물이 아토피성 피부염 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화장품학적 조성물은 유효성분 화합물 이외에 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명의 화장품학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크 림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품학적 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물 특히 기능성 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로 서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 아토피성 피부염의 개선에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명 아토피성 피부염 개선용 조성물의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(i) 본 발명의 조성물은 공지 화합물 허수타노놀 및 오레고닌의 아토피성 피부염의 새로운 개선 용도를 제시한다.

(ii) 본 발명 조성물의 유효성분인 허수타노놀 및 오레고닌은 아토피성 피부염에서 증가되는 호산성백혈구(eosinophil)의 수를 감소시키며, 아토피성 피부염의 병변과 관련된 면역 조절 사이토카인 IL-4, 5, 10 및 13의 발현량을 조절하는 효능을 갖는다.

(iii) 본 발명 조성물의 유효성분인 허수타노놀 및 오레고닌은 아토피성 피부염 마우스 동물모델에서 MBD (mouse beta-defensin)-1, 2, 3의 발현을 증가시키고, COX-2 및 iNOS의 발현을 감소시키는 효과를 보인다.

(iv) 본 발명 조성물의 유효성분인 허수타노놀 및 오레고닌은 우수한 아토피성 피부염 개선 및 치료용 약물, 화장품 및 식품으로 개발이 가능하다.

본 발명은 허수타노놀 또는 오레고닌을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피 부염 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 유효성분인 허수타노놀 및 오레고닌은 아토피성 피부염에서 증가되는 호산성백혈구(eosinophil)의 수를 감소시키며, 아토피성 피부염의 병변과 관련된 면역 조절 사이토카인 IL-4, 5, 10 및 13의 발현량을 조절하는 효능을 갖는다. 또한, 허수타노놀 및 오레고닌은 아토피성 피부염 마우스 동물모델에서 MBD(mouse beta-defensin)-1, 2, 3의 발현을 증가시키고, COX-2 및 iNOS의 발현을 감소시키는 효과를 보인다. 본 발명 조성물의 유효성분인 허수타노놀 및 오레고닌은 우수한 아토피성 피부염 개선 및 치료용 약물, 화장품 및 식품으로 개발이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

1. 실험재료

허수타노놀 및 오레고닌의 추출에 사용한 오리나무(Alnus japonica) 수피는 2008년 6월 서울 동작구 수달산에서 채집하여 식물학적 감정을 거친 것을 사용하였 다.

2. 기기 및 시약

본 발명의 실험에 사용한 기기 및 시약은 다음의 표 1에 정리하였다.

[표 1] 본 발명의 실험에 사용한 기기 및 시약

Balance	Sartorius AC211S (Germany)
Centrifuge	Eppendorff 5415D (Germany)
Liquid chromatography mass spectrometer	API 3000 triple quadrupole liquid chromatography mass spectrometry (Canada)
¹H-NMR spectrometer	Varian Gemini 2000, 300㎒ (USA) Bruker AMX-500, 500㎒ (Germany) Solvent: DMSO-d ₆ , D₂O, Acetone-d ₆ Internal standard: TMS
¹³C-NMR spectrometer	Varian Gemini 2000, 75㎒ (USA) Bruker AMX-500, 125㎒ (Germany) Solvent : DMSO-d ₆ , D₂O, Acetone-d ₆ Internal standard : TMS
TLC Adsorbent	Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, Germany)
TLC Solvent(v/v)	CHCl₃ : MeOH : H₂O = 70 : 30 : 4 CHCl₃ : MeOH : H₂O = 6 : 4 : 1 Benzene : Ethylformate : Formic acid = 1 : 7 : 1
TLC Detection	Ethanolic-FeCl₃ solution 10％-H2SO4 in ethanol (heating) UV-lamp (254㎚)
Gels	Sephadex LH-20 (25-100㎛, Pharmacia, Sweden) MCI gel CHP 20P (75-150μ. Mitsubishi. Japan)

3. 추출물의 제조 및 활성성분의 분리

채취한 직후의 신선한 오리나무 수피(5.15 kg)를 80％ 아세톤으로 실온에서 24 시간 동안 3회 추출하여 여과한 후, 그 추출액을 감압 농축하여 추출물(489.77g)을 얻었다. 이 추출물을 물에 현탁하여 감압 여과한 후 수용성 부분에 대하여 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)를 실시하였 다. 용매는 30％ 메탄올에서부터 메탄올을 10％씩 올려 100％까지 농도를 높였으며, TLC 방법으로 확인하여 총 4개의 서브-분획(sub-fraction)으로 나누었다. 오레고닌 TLC 반응을 나타내고, DPPH 활성이 우수한 분획 2 (Fr. 2)에 대해서는 MCl-gel CHP 20P (0→100% methanol, gradient system) 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 최종 오레고닌(oregonin)(39.99 g)을 획득하였으며, 수율은 0.78％의 수율을 기록하였다. 허수타노놀 TLC 반응이 나타났으며 오레고닌과 마찬가지로 DPPH 활성이 우수한 분획 4 (Fr. 4)에 대해서 MCl-gel CHP 20P (30%→100% methanol, gradient system) 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 최종 허수타노놀(0.16 g)을 획득하여 수율은 0.003%를 기록하였다. 도 1a에 오리나무 수피로부터 추출물을 얻고 이 추출물로부터 활성성분 허수타노놀 및 오레고닌을 분리하는 과정을 도시하였다.

4.구조동정

4.1. 오레고닌

분리한 활성성분 오레고닌은 갈색의 무정형 분말형태이었다. MS 데이터 및 NMR 데이터는 다음과 같았다.

[α]²⁰ _D : -17.5°(c=1.0, MeOH)

Negative FAB MS : m/z 477 [M-H]^-

¹H-NMR (300 MHz, Acetone-d₆+D₂O) : δ 6.74-6.71 (4H in total, H- 2',2'',5',5''), 6.53-6.50 (2H in total, m, H-6'',6'), 4.31 (1H, d, J=7.8Hz, xyl-1), 4.14 (1H, m, H-5), 3.86 (1H, dd, J=11.4, 6.1Hz xyl-5e), 3.54 (1H, m, xyl-4), 2.83-2.52 (8H in total, H-1,2,4,7), 1.80-1.76 (2H in total, m, H-6)

¹³C-NMR (75 MHz, Acetone-d6 + D₂O) : 아래 표 2에 기재함.

4.2. 허수타노놀

분리한 허수타노놀은 갈색의 무정형 분말이었다. MS 데이터 및 NMR 데이터는 다음과 같았다.

[α]²⁰ _D : -25.2°(c = 1.0, MeOH)

Negative FAB MS : m/z 345 [M-H]^-

¹H-NMR (300 MHz, Acetone-d ₆ ) : δ 6.75-6.71 (4H in total, m, H-2',2'',5',5''), 6.54-6.51 (2H in total, m, H-6',6''), 4.06 (1H, m, H-5), 2.76-2.52 (8H in total, m, H-1,2,4,7), 1.72-1.65 (2H in total, m, H-6)

¹³C-NMR (75 MHz, Acetone-d₆ + D₂O) : 아래 표 2에 기재함.

[표 2] : 허수타노놀 및 오레고닌의 ¹³C-NMR 데이터

Carbon number	Oregonin	Hirsutanonol
heptane moiety C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7	29.7 46.1 210.6 48.2 76.1 38.3 31.4	29.5 42.6 211.3 50.7 67.7 40.0 31.7
Diphenyl moiety C-1' C-1'' C-2' C-2'' C-3' C-3'' C-4' C-4'' C-5' C-5'' C-6' C-6''	133.9 134.9 116.1 116.2 145.9 145.9 144.0 144.3 116.4 116.5 120.5 120.4	133.8 134.7 116.1 116.2 145.8 145.8 143.8 144.0 116.2 116.3 120.3 120.2
Sugar moiety C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6	104.0 74.6 77.5 70.8 66.6 (xyl)

* 75MHz (Acetone-d ₆ ₊D₂O)

도 2a에는 오레고닌의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼 데이터를 나타내었다. 도 2b에는 허수타노놀의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼 데이터를 나타내었다. 허수타노놀 및 오레고닌의 NMR 데이터와 MS 데이터가 문헌과 일치하였으므로 최종 구조 동정하였다.

5. 활성성분 스탁 용액(stock solution)의 제조

분리한 활성성분 허수타노놀은 비배당체로서 물에 쉽게 녹지 않아 10％ DMSO를 사용하여 10mg/ml의 농도로 녹인 후 DMSO의 최종농도가 0.1％ 미만이 되도록 최종 용액을 제조하여 용매의 간섭현상을 최대한 배제하였다. 분리한 활성성분 오레고닌은 배당체로서 물에 쉽게 녹아 증류수에 10mg/ml의 농도로 녹여 스탁 용액을 제조하여 보관 후 적절한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.

6. 세포배양

허수타노놀 및 오레고닌의 면역조절활성은 면역관련 세포주를 배양한 후 세포주를 대상으로 인 비트로(in vitro)에서 확인하였다. 인간 T 세포(Jurkat), 랫트 비만세포(rat mast cell, RBL-2H3), 생쥐 대식세포(RAW264.7), 인간 각질세포 (HaCat) 및 생쥐 비장세포(mouse splenocyte, Balb/c)를 사용하였으며, 세포 각각의 배양 방법 및 조건은 당업자에게 공지된 통상의 방법 및 조건을 따랐다.

7. 오레고닌 포함 제형의 제조

7.1. HPLC 분석 조건 및 검량선의 작성

오리나무 수피로부터 분리 정제한 오레고닌(oregonin)을 메탄올에 용해시켜 스탁용액(stock solution)(100 ㎍/㎖)을 조제하고, 이를 희석하여 1, 5, 10, 25, 50 ㎍/㎖의 농도의 표준용액을 조제하였다. 이동상은 아세토니트릴과 0.3％ 증류수의 혼합액 (70 : 30 v/v)을 사용하였으며, 검출파장은 280 nm, 주입용량은 20 ㎕, 유속은 1 ㎖/min으로 하였다. 이 조건에서 오레고닌의 보유시간(retention time)은 5.1 분이었다. HPLC 분석을 통해, 각 농도와 피크영역(peak area)를 바탕으로 검량선을 작성하였으며, 농도범위 1-50 ㎍/㎖에서 양호한 직선성(R²= 0.997)을 나타내었다. 도 2c에 오레고닌의 HPLC 분석결과를 나타내었다.

7.2. 오레고닌 주사 제형의 제조

주사(injection)를 통한 오레고닌의 효능 평가 시험을 위해 0.1, 1.0％(w/v) 오레고닌을 포함하는 수성 주사제를 하기 표 3의 조성에 따라 제조하였다. 오레고닌 10, 100 mg을 각각 칭량하여 적당량의 주사용 멸균 증류수에 각각 용해시켰다. 이어서 NaOH 용액을 소량 가하여 pH를 6.5 - 7.4 사이로 보정하고 주사용 멸균 증류수를 가하여 10으로 제조하였다. 약물의 함량은 HPLC 분석법을 통해 확인하였다.

[표 3] 오레고닌 주사 제형의 조성

성분	함유량(％)
오레고닌	0.1-1.0
NaOH	q.s.
주사용수	q.s.
전체	100

7.3. 오레고닌 연고 제형의 제조

오레고닌의 함량은 1 ％(w/w)로 고정하였다. O/W 크림 연고는 다음의 방법으로 제조하였다. O/W 크림의 조성은 표 4의 성분비율로 제조하였다. 폴리글리세릴-3-메틸글루코오스디스테아레이트, 스테아린산, 세탄올 및 유동 파라핀을 조성에 따라 첨가하고, 65℃ 에서 가온하여 유상을 제조한 후, 글리세린, 정제수, 오레고닌을 넣고 65℃ 에서 가온하여 완전히 용해시켜 수상을 제조하였다. 같은 온도에서 유상을 수상에 가하고 균질기(homogenizer)를 사용하여 수 분간 유화시킨 후 냉각하여 O/W 크림을 제조하였다.

[표 4] 오레고닌 연고 제형의 조성

성분(Ingredients)	함량(Formulation)(％)
Polyglyceryl-3 methylglucose distearate	3
Stearic acid	5
Cetyl alcohol	2
Mineral oil	7
Glycerin	10
Water	73

8. 아토피성 피부염 동물 모델

8.1. 진드기 패치( mite patch )

오레고닌의 아토피성 피부염 치료 활성을 실험적으로 확인하기 위해 마우스에 진드기 패치를 부착하여 아토피성 피부염을 일으킨 후 이를 실험동물 모델로 사용하였다. 인간의 아토피성 피부염 유발 물질인 진드기 유래성분을 갖는 패치를 5주령의 마우스에 적용하였다. 등 부분의 털을 제거한 후 진드기 패치를 부착하였다. 2 주 적용후에 아토피성 피부염과 유사한 피부 손상이 관찰되었다. 18 주후에 약물을 적용하면서 진드기 패치를 제거하였다.

8.2. NC/Nga 마우스

오레고닌의 아토피성 피부염 치료 활성을 실험적으로 확인하기 위해 당업계 에 공지된 아토피성 피부염 동물 모델인 NC/Nga 마우스(Vestergaard C, Yoneyama H, Murai M, Nakamura K, Tamaki K, Terashima Y, Imai T, Yoshie O, Irimura T, Mizutani H and Matsushima K. Overproduction of Th2-specific chemokines in NC / Nga mice exhibiting atopic dermatitis-like lesions, J Clin Invest 104(8),1097-105; 1999)를 사용하였다.

9. 호산성 백혈구 계수(Eosinophil Count)

모세관 튜브(Capillary tube)에 마우스 혈액을 채취하고, 마우스 전혈 30 ㎕에 식염수(saline) 150 ㎕를 첨가하여 6배 희석하였다. Sysmex XE-2100 hematology analyzer를 이용하여 호산성백혈구(eosinophil)를 계수하였다. 호산성백혈구의 산출은 말초혈액 도말 슬라이드를 제작하고, Wright-Giemsa 염색을 한 후 200개의 백혈구를 감별 계산하여 행하였다.

10. ELISA 측정

혈청은 대동맥의 혈액을 채취하여 준비하였다. 림피구(lymphocyte)는 비장(spleen)으로부터 채취한 후 배양하였다. 간략하게 설명하면, 비장을 적출하여 분쇄한 후 메쉬(mesh)를 통과시켜 단일 세포로 분리하였다. 적혈구 용해 완충액(RBC lysis buffer)를 첨가하여 적혈구를 용해시킨 후 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 1 X 10⁶ 세포를 RPMI 배지(1 ㎖) 에서 24 웰 플레이트에서 배양하였다. 3일 후에 배양된 세포를 포함하는 배지를 사용하여 실험을 진행하였다.

11. Real-time PCR

Real-time PCR 실험에 사용된 프라이머는 다음과 같다.

프라이머	서 열
MBD-1 (362bp)	5'-ACA TAA AGG ACG AGC GAT GG-3' (sense)
	5'-TGC AGA TGG GGT GTC ATA GA-3' (anti-sense)
MBD-2 (199bp)	5'-GCC ATG AGG ACT CTC TGC TC-3' (sense)
	5'-AGG GGT TCT TCT CTG GGA AA-3 (anti-sense)
MBD-3 (169bp)	5'-TCA GAT TGG CAG TTG TGG AG-3' (sense)
	5'-GCT AGG GAG CAC TTG TTT GC-3' (anti-sense)
iNOS (203bp)	5'-CTG ATG CCT CTT CCA GGT GT-3' (sense)
	5'-GAG GGA GCC CTT TCT GAA TC-3' (anti-sense)
COX-2 (593bp)	5'-CCA CCC ATG GCA AAT TCC ATG GCA-3' (sense)
	5'-GGT GCT GCT TGT TAG GAG GTC AAG TAA AGG GC-3'(anti-sense)
GAPDH (598bp)	5'-CCA CCC ATG GCA AAT TCC ATG GCA-3' (sense)
	5'-CCC TGT TGC TGT AGC CGT AT-3' (anti-sense)

총 RNA(total RNA)는 다음의 단계를 통해 제조하였다. 조직에 TRIZol 시약 1㎖을 처리하고 클로로포름(Chloroform) 200㎕를 넣고 4℃에서 15 분간 12,000 rpm에서 원심분리(centrifugation) 한 후, 상층액을 새로운 튜브에 넣고 1/2의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가한 후 4℃에서 15분간 12,000rpm에서 다시 원심분리하였다. 이어서, 상층액을 버린후 분리한 총 RNA에 DEPC water을 첨가하였다.

cDNA는 다음의 단계를 거쳐 제조하였다. 제조한 총 RNA를 DEPC-DW 30 ㎕에 용해시키고 3 ㎍의 총 세포 RNA를, 1 ㎕의 역전사효소(reverse transcriptase), 2 ㎕의 10X 완충액, 2 ㎕의 10mM dNTP (dNTP mix), 1 ㎕의 oligo dT primer, 0.5 ㎕의 RNase 억제제, 4 ㎕의 25 mM MgCl₂를 포함하는 20 ㎕ 부피의 반응혼합액에서 역전사 반응을 수행하였다.

제조한 cDNA 각 2 ㎕를 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 반응은 59℃에서 1분을 행하고, 94℃에서 1분의 45 사이클 행한 후, 최종 연장(extension)단계는 72℃에서 1 분간 행하였다.

12. 웨스턴 블로팅 (Western Blotting)

피부세포를 포함하는 피부 조직을 용해시키고 이를 원심분리기를 이용하여 원심분리한 후 상등액을 취하여 이에 대해 15％ SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 행하였다. MBD-1,2,3, COX-2 및 iNOS를 분석하기 위해, 젤 전기영동상에서 분리된 단백질들을 니트로셀룰로오스막으로 이동시켰고 1차 항체 (1:1000 in BSA, goat polyclonal anti-MBD(mouse beta defensin) 1, 2, or 3 antibody, rabbit polyclonal anti-COX-2 antibody, rabbit polyclonal iNOS antibody; Chemicon, CA, USA) 및 2차 항체 (1:2000 in BSA, anti-goat IgG, anti-rabbit IgG; Chemicon, CA, USA)와 순차적으로 반응시켰다.

실험결과

1. 오레고닌의 인 비트로 활성 평가

1.1. 세포 독성 평가

오레고닌의 세포독성 분석은 LDH 분석(LDH assay)을 통해 행하였다. LDH(lactate dehydrogenase)는 세포가 용해될 때 방출되는 안정한 세포질 효소이다. LDH 측정 방법은 ⁵¹Cr 측정방법과 유사하다. 즉, 분비되어 나온 LDH를 커플링 된 효소 반응에 의해 테트라졸륨염(tetrazolium salt)을 적색의 포르마잔(formazan)산물로 변환시키는데, 이때 측정되는 흡광도는 용해된 세포의 수와 비례하게 된다. 측정된 흡광도에 의해 측정대상 물질의 세포독성이 간접적으로 측정된다.

오레고닌의 세포독성을 LDH 분석에 의해 측정한 결과는 도 3에 나타내었다. 오레고닌 용액을 10 - 1000 μg/㎖의 농도로 인간 T 세포인 Jurkat 세포에 처리하고, LDH 분석을 수행한 결과, 250 μg/㎖의 농도에서는 세포독성이 낮은 것을 확인하였다. 이에 의해 오레고닌의 최대 유효량을 250 μg/㎖로 하여 실험을 수행하였다.

1.2. 일산화질소(NO) 제거능 평가

오레고닌의 항산화효과를 간접적으로 확인하기 위해 일산화질소(nitric oxide, NO) 공여자인 SNAP(S-nitrosol-N-acetylpenicillamine)와 오레고닌을 함께 처리한 후 경시적으로 나타나는 이산화질소의 양을 정량하여 오레고닌의 NO 제거능을 측정하였다. 일산화질소의 양은 지정된 시점에서 Gries reagent로 정량하여 각 실험군간 효과를 비교하였다. 구체적으로, 1mM의 SNAP, 50μM의 Vitamin C, 1-500μg/㎖의 오레고닌을 사용하여 각 농도로 처리한 후, 37℃에서 0, 1, 2, 4, 8 시간 간격으로 반응시킨 후, NO 탐색시약인 Griess reagent를 섞어 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 측정값은 NO 표준곡선(standard curve)으로부터 계산하였다. 각 그룹의 NO 변화량을 각 시점에서 측정하여 경시적 변화를 관찰하였다.

도 4에서 나타난 실험결과에 의하면 오레고닌은 매우 우수한 일산화질소 제거능을 갖는다 것을 알 수 있었다.

1.3. 항산화능 평가

오레고닌에 대해서 항산화능을 평가하였다. 항산화능 평가는 BSA(bovine serum albumin) 분해 테스트를 통해 행하였다. BSA(bovine serum albumin) 분해 테스트는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 의한 손상으로부터 단백질이나 효소를 보호하는 항산화 물질의 효능을 금속이온촉매반응을 이용해 확인하는 방법이다. 표적 단백질로서 BSA를 0.5 μg/mL 농도가 되도록 하고, Cu² ⁺(100 μM), H₂O₂ (2.5 mM)을 첨가한 후, 오레고닌을 농도별로 가하여 함께 인큐베이션 하였다. 이어서, 반응물을 10％ SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel)에서 전기 영동하여 BSA 단백질의 분해 저해 정도를 확인하였다. 양성대조군으로서는 항산화 효과가 우수한 비타민 C(Vitamin C, 1mM)를 사용하였다. 도 5의 결과에 나타난 바와 같이 오레고닌의 우수한 BSA 분해 억제효과가 확인되었으며, 양성대조군인 비타민 C (Vit. C)의 최종 투여농도가 1 mM의 고농도임을 감안할 때 오레고닌은 우수한 항산화 효과를 갖는 것으로 확인되었다.

1.4. 사이토카인 발현 조절능 평가

아토피 피부염 환자에서는 Th2 사이토카인인 IL-4가 증가하고 상대적으로 Th1 사이토카인인 IL-2 및 IFN-γ가 감소한다. 따라서, 오레고닌이 상기 아토피성 피부염에서 발현되는 사이토카인들의 조절능력이 있는지 확인하였다. 오레고닌을 인간 T 세포인 Jurkat 세포주에 처리한 후 Th 1 분비 사이토카인인 IL-2의 발현 양상을 ELISA 방법을 통해 확인하였고, 아토피성 피부염과 관련있는 Th 2 사이토카인인 IL-4의 발현조절 효과도 함께 측정하였다. 도 6의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 오레고닌은 TCR 활성화 및 PMA/inomycin 활성화된 T 세포에서 IL-2 발현을 효과적으로 억제하였다(도 6의 패널 A 및 B). 또한, 오레고닌은 비만세포인 RBL-2H3에서 Th2 사이토카인인 IL-4의 발현을 억제하였다(도 6의 패널 C).

2. 허수타노놀의 인 비트로 활성 평가

2.1. 세포증식 억제 효과 평가

CCK 분석(CCK assay)를 통해 Jurkat 세포에 대한 허수타노놀의 세포증식억제 효과를 측정하였다. 도 7에서 나타난 바와 같이, 허수타노놀은 50 μg/㎖ 이상의 농도에서 세포증식억제 효과가 나타났다. 따라서, 허수타노놀의 인 비트로 활성 평가 실험시 농도는 50 μg/ml 전후의 농도로 결정하였다.

2.2. Th1 사이토카인 IL-2 발현 억제능 평가

IL-2는 Th 1 세포에서 발현되는 사이토카인(cytokine)으로서 T 세포의 증식활성에 중요한 인자이다. 생쥐의 비장세포(splenocyte)로부터 1차 배양하고, anti-CD3 mAb로 활성화된 비장 T 세포(splenic T cell)에 허수타노놀을 처리한 후, ELISA 방법을 통해 IL-2 발현 억제 효능을 측정하였다. 양성대조군으로서 IL-2 분비 억제 효과가 우수한 사이클로스포린 A(cyclosporine A, CsA)를 사용하였다. 측정 결과는 도 8에 나타내었다. 도 8의 결과에 나타난 바와 같이, 허수타노놀의 농도가 50 μg/㎖ 또는 100 μg/㎖의 경우 CsA에 비해 더 높은 IL-2 분비 억제 효과가 나타났다. 특히 세포독성 문제가 없는 50 μg/㎖의 농도에서 매우 우수한 IL-2 분비 억제효능이 확인되었다.

2.3. Th1 및 Th2 세포 사이토카인 발현 억제능 평가

아토피 피부염의 급성 및 만성 병변유발에 중요한 역할을 담당하는 Th 세포에서 발현하는 사이토카인에 대한 허수타노놀의 조절 능력을 확인하였다. 즉, Th1 사이토카인인 IL-2와 Th2 사이토카인인 IL-4, IL-10 및 IL-13에 대한 mRNA의 발현양을 측정하였다. 비장 림프세포 중에서 anti-CD3 mAb에 의해 활성화되는 T 세포를 표적(target)으로 하였다. IL-2, IL-4, IL-10 및 IL-13의 mRNA 분석에 사용된 프라이머 서열은 다음의 표와 같다.

IL-2	sense	5'-agatgaacttgcacctctgcg-3'
IL-2	anti-sense	5'-gggcttgttgagatgctttg-3'
IL-4	sense	5'-gtcactgacggcacagagcta-3'
IL-4	anti-sense	5'-ggactcattcatggtgcagctt-3'
IL-10	sense	5'-aagagagctccatcatgcctggct-3'
IL-10	anti-sense	5'-aatcgatgacagcgcctcagc-3'
IL-13	sense	5'-tcatggcgctctgggtgactgcag-3'
IL-13	anti-sense	5'-aggccaaagctgaggcatctccct -3'

도 9의 결과에서 나타난 바와 같이, 허수타노놀은 50 μg/㎖과 100μg/㎖에서 IL-2, IL-4, IL-10 및 IL-13의 mRNA 발현 억제효능을 보였으며, 100μg/㎖에서는 CsA와 동등한 억제효과를 보였다.

2.4. β-헥소사미니다아제 분석

허수타노놀의 랫트 비만 세포(RBL-2H3)에서의 과립감소 테스트(degranulation test)를 위해 β-헥소사미니다아제 분석(β-hexosaminidase assay)을 행하였다. β-헥소사미니다아제 분석에 의하면 비만세포(mast cell)의 활성 및 과립감소를 측정할 수 있다. 도 10의 결과에 나타난 바와 같이, β-헥소사미니다아제의 수준은 100 μg/㎖의 허수타노놀 농도에서 최고로 억제되는 결과를 보였다. 이러한 효능은 CsA에 비해 약 20배 억제효과가 있는 것이다.

2.5. 항산화능 평가

허수타노놀의 항산화능을 확인하기 위해, H₂O₂/Cu²⁺로부터 생성되는 라디칼(radical)의 제거 효능을 측정하였다. 즉, 생성된 라디칼과 함께 포함된 BSA (bovine serum albumin)가 분해될 때 허수타노놀이 이러한 단백질의 분해를 어느 정도 억제하는지를 측정함으로써 항산화 효과를 결정하였다. 도 11의 결과에서 보여지는 바와 같이, 허수타노놀이 고농도가 될수록 BSA 보호효과가 증가되었으나, 양성대조군인 비타민 C(Vit. C)에 비해 보호 효과는 낮은 것으로 관찰되었다. 그러나, 허수타노놀이 100 μg/㎖의 농도에서 뚜렷한 BSA 보호효과를 나타내었다.

2.6. T 세포 활성화 마커의 억제능 평가

허수타노놀의 T 세포 조기활성인자(early activation marker) CD25, CD69의 발현 억제능을 유세포분석(flow cytometric analysis, FACS)를 통해 확인하였다. 즉, 기저수준(basal), CsA, 허수타노놀(50, 100 μg/㎖)에서 CD25 및 CD69의 발현 수준을 비교하여 측정하였다. CsA는 매우 강력한 발현억제 효능을 나타내어 실험군에 대한 비교군으로 사용하였다. 도 12에 실험결과를 나타내었다. 허수타노놀은 농도 100 μg/㎖에서 기저수준과 CsA 비교할 때 CD25/CD69에서 매우 우수한 발현억제효과를 나타내었다.

3. 오레고닌의 인 비보 활성 평가

3.1. 동물모델에서의 아토피성 피부염의 육안 평가

아토피성 피부염에 대한 오레고닌의 치료 효능을 조사하기 위해, 아토피성 피부염을 유발시킨 동물모델 마우스에 오레고닌을 4주 동안 복강내 투여 또는 피부 도포를 행한 후에, 아토피성 피부염 발생 부위 외관을 육안 관찰에 의해 피부염의 호전여부를 평가하였다. 오레고닌의 투여 및 도포한 그룹에서 오레고닌 비-투여 음성대조군과 비교하여 아토피성 피부염이 호전되는 결과를 얻었다. 즉, 주사제 형태로 오레고닌 0.1 및 1％ 투여한 경우(도 13b, 도 13c)가 음성대조군인 PBS를 주사한 경우(도 13a)에 비해 아토피성 피부염이 현저히 향상되는 결과를 확인하였다. 또한, 연고제 형태로 오레고닌 1％를 피부에 도포한 경우(도 13f)가 음성대조군(baseline) 도포의 경우(도 13e)에 비해 아토피성 피부염이 현저히 개선되는 결과를 얻었다. 도 13g는 양성대조군으로서 아토피성 피부염을 유발시킨 마우스에 프란콜(plancol)을 도포제 형태로 투여한 후에 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다.

3.2. 호산성백혈구 수 측정

아토피성 피부염을 유발시킨 동물모델 NC/Nga 마우스에 오레고닌을 4주 동안 복강내 투여 또는 피부 도포하고, 투여 또는 도포 전 및 후의 마우스로부터 혈액을 채취하여 호산성백혈구(eosinophile)의 수를 측정하였다. 오레고닌의 투여 또는 도포 전에 비하여, 투여 또는 도포 후에 호산성 백혈구의 수가 급격히 줄어든 것을 확인하였다(도 14a 및 도 14b 참조).

3.3. 인터루킨(interleukin, IL)-4, IL-5, IL-10, IL-13의 수준 측정

아토피성 피부염을 유발시킨 동물모델 NC/Nga 마우스 피부에 오레고닌을 4 주간 복강내 투여 또는 피부 도포한 후, 마우스로부터 혈액 및 비장을 채취하여 혈청 및 비장세포(splenocyte)에서의 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13의 수준을 ELISA를 통해 측정하였다. 오레고닌을 투여 또는 도포한 그룹에서, IL-4, IL-5, 및 IL-13의 수준이 음성대조군에 비해 낮게 측정되었다(15a, 15b, 15d). 그러나, IL-10의 경우 오레고닌을 투여 또는 도포한 그룹이 음성대조군에 비해 IL-10의 수준이 증가하였다(도 15c).

IL-4는 활성화된 B 세포 및 T 세포의 증식을 촉진하며 초기(naive) T 세포(CD4+ T 세포)의 Th2 세포로의 분화를 촉진하는 작용을 한다. 아토피성 피부염 환자에서 IL-4 수준은 증가하는데, 본 발명의 오레고닌은 IL-4 수준을 감소시킴으로써 알러지(allergy) 반응을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있다.

IL-5는 B 세포의 성장을 자극하여 면역글로블린의 분비를 촉진하는 작용을 하며, 호산성백혈구의 활성화에 핵심 매개자로 역할하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 오레고닌은 IL-5 수준을 감소시킴으로써 아토피성 피부염 환자에서 높게 나타나는 호산성백혈구의 수를 감소시킬 수 있는 효과를 가짐을 확인하였다.

IL-10은 인간 사이토카인 합성 억제자(human cytokine synthesis inhibitory factor, CSIF)로도 알려진 항-염증성 사이토카인이며, 대식세포(macrophage) 및 T 헬퍼 타입 1(Th 1) 세포에서 만들어지는 IFN-γ, IL-2, IL-3, TNFα 및 GM-CSF와 같은 친-염증 사이토카인의 합성을 억제한다. 본 발명의 오레고닌은 IL-10 수준을 증가시킴으로써 항염증 효능을 나타낼 수 있음을 확인하였다.

IL-13은 다양한 세포 타입에서 분비되며 특히 T 헬퍼 타입 2 (Th2) 세포에서 주로 분비되며, 알러지성 염증 질환에서 중요한 매개자로 작용한다. 본 발명의 오레고닌은 IL-13 수준을 감소시킴으로써 아토피성 피부염과 같은 알러지성 염증 질환의 치료 효능을 나타낼 수 있음을 확인하였다.

3.4. Real time PCR에 의한 MBD-1, 2, 3, COX-2 및 iNOS 발현 측정

아토피성 피부염을 유발시킨 동물모델 NC/Nga 마우스 피부에 오레고닌을 4주 동안 복강내 투여 또는 피부 도포한 후의 마우스 피부 세포를 채취하여 MBD-1, 2, 3, COX-2 및 iNOS의 발현 수준을 Real time PCR을 이용하여 측정함으로써 면역반응 조절 효능을 확인하였다.

MBD (mouse beta-defensin)는 표피, 기관지 및 비뇨생식기 조직의 상피세포에서 주로 발현되고 비만세포(mast cell)을 자극하여 히스타민(histamin)과 프로스타글란딘 D2(prostaglandin D2)의 방출을 촉진하며, 상피에서 세균의 번식을 억제하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. COX(Cyclooxygenase)는 프로스타노이드(prostanoid)라고 불리는 생물학적 매개물질의 형성에 관여하는 효소이다. COX-1은 신체의 항상성을 유지하는 기능을 갖는 반면, COX-2는 면역반응에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase)는 미생물 침입에 대한 최초의 면역반응에 중요한 역할을 하는 대식세포(macrophage)를 조절하는 NO(nitrix oxide)를 생성하는 효소이다. 실험결과 오레고닌을 복강내 투여 또는 피부 도포한 마우스의 경우 MBD-1, 2, 3의 발현이 증가되었고(도 16a 내지 도 16c), 반면, COX-2 및 iNOS의 발현이 감소하였음을 확인하였다(도 16d 및 도 16e).

3.5. 웨스턴 블로팅에 의한 MBD -1, 2, 3, COX -2 및 iNOS 발현양 측정

아토피성 피부염을 발생시킨 동물모델 NC/Nga 마우스에 오레고닌 리포좀을 4주 동안 복강내 투여 또는 피부 도포한 후의 마우스 피부 세포를 채취하여 MBD-1, -2, -3, COX-2 및 iNOS의 발현 수준을 웨스턴 블로팅(western blotting)을 이용하여 측정함으로써 이 화합물의 면역반응 조절 효능을 확인하였다. Real time PCR 에 의한 측정결과와 동일하게, 오레고닌을 복강내 투여 및 피부 도포한 마우스에서 MBD-1, 2, 3, COX-2 및 iNOS의 발현은 감소하였음을 확인하였다(도 17a 내지 도 17e).

상기한 실험결과들에 의하면 본 발명의 허수타노놀 및 오레고닌은 아토피성 피부염과 관련된 면역반응의 조절을 통해 아토피성 피부염을 개선 또는 치료할 수 있는 능력을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1a은 오리나무(Alnus japonica)의 수피로부터 오레고닌(oregonin)을 추출하여 분리 정제하는 과정을 도시한 도면이다.

도 2a는 오리나무 수피로부터 추출 분리 정제한 오레고닌의 ¹H-NMR 측정 결과 및 ¹³C-NMR 측정 결과이다. 도 2b는 오리나무 수피로부터 추출 분리 정제한 허수타노놀의 ¹H-NMR 측정 결과 및 ¹³C-NMR 측정 결과이다. 도 2c는 오레고닌의 HPLC (high performance liquid chromatography)의 분석 결과이다.

도 3은 Jurkat 세포에 대한 오레고닌의 세포독성을 LDH(lactate dehydrogenase) 분석 결과이다. Jurat 세포를 접종한 후 오레고닌과 함께 37℃에서 24 시간 5％ CO₂를 포함하는 가습 분위기(humidified atmosphere)에서 인큐베이션하였다. GO : 오레고닌.

도 4는 오레고닌의 일산화질소(Nitric Oxide, NO) 제거능 분석 결과이다. 일산화질소(NO) 공여자인 SNAP(S-nitrosol-N-acetylpenicillamine) 200μM 용액과, 아스코르브산(Vitamin C) 용액 50 M 및 게니스테인(genistein)용액 10 M을 준비하였다. 반응 최종 부피를 15O μl로 맞추고 37 ℃에서 0-8 시간 동안 반응시키고, 반응 후, 각 샘플 50 μl를 동일한 양의 Griess reagent와 혼합하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 5은 오레고닌의 BSA 분해 테스트 결과이다. 히드록실-라디칼 매개 산화 분석(hydroxyl radical-mediated oxidation experiments)는 금속 촉매 반응을 통해 행하였다. BSA(bovine serum albumin)를 최종 농도 0.5 mg/㎖로 150 mM 포스페이트 완충액(pH 7.3)에 녹였다. BSA 용액을 오레고닌의 존재 또는 부존재하에 100 μM Cu²⁺ 및 2.5 mM 과산화수소(hydroperoxide, H₂O₂)와 함께 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 50 μg/ml의 아스코르브산을 1X PBS에 직접 용해시키고 대조군 항산화제로 사용하였다. 반응을 개봉된 튜브내에서 행한 후 37℃로 유지되는 진탕 수조에 두었다. 이어서, 각 실험군을 10％ SDS-PAGE상에 로딩하고, 0.01％ Coomassie blue로 염색하였다.

도 6는 오레고닌에 의한 IL-2 및 IL-4 발현 억제 효능을 측정한 결과이다. 패널 A 및 B은 IL-2의 양을 검출한 결과이다. 96-웰 플레이트에서 ELISA 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 검출하였다. 최적의 T 세포 활성화를 위해, Jurkat 세포를 anti-CD3 mAb 및 anti-CD26 mAb 코팅된 96-웰 플레이트에 접종한 후에, 오레고닌을 첨가하였다. 패널 C는 RBL-2H3 세포에서 RT-PCR을 사용하여 IL-4 mRNA의 발현양을 검출한 결과이다. PCR 프라이머는 제조자의 지시에 따라 다음과 같이 제조하였다. sense : 5'-cacggatgtaacgacagccctctg-3', anti-sense : 5'-gcgtggactcattcacggtgcagc-3'.

도 7은 허수타노놀의 세포증식억제 효과를 측정한 결과이다. 한 웰당 1 X 10⁴세포의 농도로 Jurat 세포를 96웰 플레이트상에 플레이팅한 후, 2％ FBS DMEM 배지로 허수타노놀의 첨가 또는 무첨가 조건하에서 배양하였다. 세포수는 3개의 중복된 웰에서 감소된 WST-8(Dojindo, Japan)의 흡광도(450nm)를 이용하여 측정하였다.

도 8은 허수타노놀의 IL-2 발현 억제 효능을 측정한 결과이다. 1.5 X 10⁴ 세포의 농도로 96-웰 플레이트상에 생쥐 비장세포를 배양하였다. 이어서, T 세포 활성화를 위해 anti-CD3 mAb를 첨가한 웰 및 모든 웰에 CsA (50 nM) 및 허수타노놀을 첨가하였다. 이어서, 세포들을 72 시간 동안 인큐베이션한 후, 각 웰로부터 상등액을 취하여 ELISA 분석을 행하였다.

도 9는 허수타노놀의 Th1 및 Th2 세포 사이토카인 발현 억제능을 측정한 결과이다. 생쥐 비장세포를 웰당 1 X 10⁵ 세포 농도로 12-웰(RT-PCR) 플레이트상에 배양하였다. 이어서, T 세포 활성화를 위해 anti-CD3 mAb를 첨가한 웰 및 모든 웰에 CsA (50 nM) 및 허수타노놀 (50-100 μg/㎖)을 첨가하고, 24 시간 인큐베이션한 후, RT-PCR 분석을 행하였다. GAPDH는 내부 표준물질로 사용하였다.

도 10은 허수타노놀에 대한 β-헥소사미니다아제 분석 결과이다. β-헥소사미니다아제(beta-hex) 분석은 RBL-2H3 세포주에 대한 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 즉, 상등액 일정량을 취한 후 절단되는 경우에 발색(405 nm)하는 beta-hex기질(p-nitrophenyl N-acetyl-beta-D-glucosaminide; Sigma)과 인큐베이팅하여 beta-hex 활성을 측정하였다. 흡광도 측정은 서로 다른 양의 beta-hex 방출량을 보여준다.

도 11은 허수타노놀의 항산화 효과를 BSA의 분해 보호 정도를 측정하여 간접 적으로 관찰한 결과이다. 100 μM Cu²⁺ 및 2.5 mM 과산화수소(H₂O₂)와 다양한 양(1, 50, 100/200 ug/mL)의 허수타노놀을 포함하는 pH 7.3의 37.5 mM 포스페이트 완충액 0.1㎖에, BSA(Sigma) 50 μg을 첨가하고 37℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 양성 대조군으로서 비타민 C (50ug/㎖)을 사용하였다. 반응 혼합물을 10％ SDS젤상에서 분리하고, 단백질 밴드를 0.01％ Coomassie blue로 염색하였다. Vit.C는 비타민 C; M은 마커이다.

도 12는 허수타노놀의 CD25/CD69 발현 변화를 분석한 유세포 분석결과이다. 비장세포를 anti-CD3 mAb로 허수타노놀의 존재 또는 부존재하에서 자극하였다. 허수타노놀은 50 및 100 μg/㎖로 처리하였고 CsA는 50 nM로 처리하였다. 24 시간 인큐베이션한 후에, CD25 및 CD69 발현 세포의 백분율을 유세포분석기로 측정하였다.

도 13a는 음성대조군으로서 아토피성 피부염을 유발시킨 마우스에 PBS를 주사제 형태로 투여한 후에 피부염 치료 효능을 관찰한 사진이다. 도 13b는 아토피성 피부염을 유발시킨 마우스에 오레고닌 0.1％ 주사제를 투여한 후에 아토피성 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다. 도 13c는 아토피성 피부염을 유발시킨 마우스에 오레고닌 1％를 주사제 형태로 투여한 후에 아토피성 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다. 도 13d는 양성대조군으로서 아토피성 피부염을 유발시킨 마우스에 덱사메타손(dexamethasone)를 주사제 형태로 투여한 후에 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다. 도 13e는 음성대조군으로서 아토피성 피부염을 유발시킨 마우스에 활성성분 없는 도포제를 도포한 후 아토피성 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다. 도 13f는 아토피성 피부염을 유발시킨 마우스에 오레고닌 1％를 도포제 형태로 투여한 후에 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다. 도 13g는 양성대조군으로서 아토피성 피부염을 유발시킨 마우스에 프란콜(plancol)을 도포제 형태로 투여한 후에 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다.

도 14a 및 도 14b는 NC/Nga 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone) 및 프란콜(plancol), 실험군으로 0.1％, 1％ 오레고닌을 주사제 및 도포제의 형태로 각각 투여하기 전 및 투여한 후의 마우스로부터 혈액을 채취하여 호산성 백혈구(eosinophile)의 비율 및 개수를 측정한 결과이다.

도 15a 내지 도 15d는 NC/Nga 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone) 및 프란콜(plancol), 및 실험군으로 0.1％, 1％ 오레고닌을 주사제 및 도포제의 형태로 투여 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스로부터 혈액 및 비장(spleen)을 채취하여 혈청과 림프구에서 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13의 수준을 ELISA로 측정한 결과이다.

도 16a 내지 도 16e는 NC/Nga 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone) 및 프란콜(plancol), 및 실험군으로 0.1％, 1％ 오레고닌을 주사제 및 도포제의 형태로 투여한 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스의 피부를 채취하여 MBD-1, 2, 3, COX-2, iNOS의 수준을 Real-time PCR로 측정한 결과이다.

도 17a 내지 도 17e는 NC/Nga 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone) 및 프란콜(plancol), 및 실험군으로 0.1％, 1％ 오레고닌을 주사제 및 도포제의 형태로 각각 투여한 후 마우스로부터 피부를 채취하여 MBD-1, 2, 3, COX-2 및 iNOS의 수준을 웨스턴 블로팅으로 측정한 결과이다.

Claims

(a) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 화학식 1의 화합물은 Th2 사이토카인 IL-4, IL-10, 또는 IL-13의 수준 감소 효능 또는 비만세포(mast cell)의 활성화 억제 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.

[화학식 1]
제 1 항에 있어서, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물의 약제학적 유효량을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.

[화학식 2]

단, 상기 화학식 2에서 'Xyl'은 자일로스(xylose)를 의미한다.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 피부 외용 제형을 가지며, 상기 피부 외용 제형은 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
(a) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 화장품학적 유효량; 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하며 화학식 1의 화합물은 Th2 사이토카인 IL-4, IL-10, 또는 IL-13의 수준 감소 효능 또는 비만세포(mast cell)의 활성화 억제 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 개선용 화장품학적 조성물.

[화학식 1]
제 5 항에 있어서, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물의 화장품학적 유효량을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.

[화학식 2]

단, 상기 화학식 2에서 'Xyl'은 자일로스(xylose)를 의미한다.
제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장품학적 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하며 화학식 1의 화합물은 Th2 사이토카인 IL-4, IL-10, 또는 IL-13의 수준 감소 효능 또는 비만세포(mast cell)의 활성화 억제 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 개선용 기능성 식품 조성물.

[화학식 1]
제 8 항 에 있어서, 유효성분으로서 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.

[화학식 2]

단, 상기 화학식 2에서 'Xyl'은 자일로스(xylose)를 의미한다.