KR20120071841A - 먼나무 잎 추출물 또는 카페오일 유도체를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 먼나무(Ilex rotunda) 잎 추출물 또는 카페오일(caffeoyl) 유도체를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물인 3,4-디-카페오일퀴닌산, 3,5-디-카페오일퀴닌산, 또는 3,4,5-트리-카페오일퀴닌산은 강력한 항산화 활성, 자유 라디칼 소거활성을 가지고 있을 뿐만 아니라, Th2 사이토카인인 IL(interleukin)-2, IL-4, IL-13 및 IFN-γ의 발현을 농도 의존적 방식으로 억제함으로써 매우 뛰어난 아토피 치료 활성을 가진다. 또한, 본 발명의 유효성분은 천연물 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물이므로 인체 적용시 부작용 발생이 매우 적다.

Description

먼나무 잎 추출물 또는 카페오일 유도체를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Treating or Preventing Atopic Dermatitis Comprising Extract from Ilex rotunda Leaf or Caffeoyl Derivatives}

본 발명은 먼나무 잎 추출물 또는 카페오일 유도체를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 먼나무(Ilex rotunda) 잎 추출물 또는 3,4-디-카페오일퀴닌산, 3,5-디-카페오일퀴닌산, 또는 3,4,5-트리-카페오일퀴닌산을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 치료, 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

아토피 피부염(Atopic dermatitis)은 주로 유아와 소아기에 발병하는 만성 재발성 피부염으로서, 주로 비정상적인 피부혈관 반응과 면역학적 반응을 동반하고 홍반, 부종, 심한 소양증, 피부건조증, 습진을 동반하는 피부 질환이다(Bieber et al., 2002). 특히, 5세 이하의 영, 유아에서 높은 발생 빈도를 보이며, 약 10 - 20％의 유병율을 지니는 것으로 알려져 있고, 일반적으로 성인이 되면서 그 발병율이 감소하는 것으로 나타나고 있으나, 성인에서도 1-3％의 유병율이 나타나는 것으로 보고되어, 전체 인구의 약 2-5％에서 아토피 피부염이 나타나는 것으로 보고되어 있다. 이러한 아토피 피부염은 1892년 Besnier가 만성 또는 재발성의 습진성 피부염으로 처음 기술한 후, 1923년 Cooke와 Coca는 이에 대해 유전적 경향이 있음을 발견하고 혈청병이나 실험적 아나팔락시스 같은 다른 알레르기와 구분하고자, "이상하다(strange or eccentric disease)" 라는 뜻의 그리스어 "atopy"를 사용함으로서 본격적으로 사용되기 시작하였다. 아토피 피부염의 직접적인 원인은 아직 정확하게 규명되지 않았으나 계절, 주거 환경, 온도, 습도, 음식, 알러젠, 미생물 등 외부적인 환경요인과 유전적요인, 면역학적 이상, 피부장벽 기능손상, 아토피 피부염 환자 스트레스 등의 내부적인 요인이 복합적으로 작용하는 것으로 알려지고 있다.

한편, 아토피 피부염을 유발하는 유전자에 대한 증거는 아직까지 없으나, 약 70％의 환자에서 가족 중의 아토피 피부염이 발견된다. 가족력이 없는 환자와 있는 환자는 임상적으로 큰 차이가 없지만 가족력이 없는 경우에 비교적 예우가 양호한 것으로 알려져 있으며, 임상적으로 상염색체 우성 유전을 보인다는 주장이 있으나 아버지 보다는 어머니의 영향이 보다 크게 나타나는 것으로 보고되고 있다.

아토피 피부염의 면역학적 기전은 Th1/Th2 세포간의 불균형, 랑게르한스 세포 자극 증가, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 등의 사이토카인 체계 이상 등이 제시되고 있다. 그 외에 프로스타글란딘(prostagladin) 이상, 각질형성세포의 내인적 이상 등과 함께 말초 혈액의 비정상적인 IgE의 증가, 대식세포의 활성화, 호산구 및 eosinophil cationic protein(ECP)의 증가 소견을 관찰할 수 있다. 이 중에서도 Th 1(Helper type 1 T cell)과 Th 2(helper type 2 T cell)에서 유래하는 사이토카인인 IL(interleukin)-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 등이 아토피 피부염의 병변 부위 피부에서 과증식되어 있는 것이 보고되면서, Th1/Th2 불균형에 의한 면역학적 이상이 아토피 피부염의 주요 원인인 것으로 제시되고 있다. 최근에는 아토피 피부염 환자에서의 혈청 IgE치의 비정상적인 증가, 세포 면역의 중추적 역할을 담당하는 T 림프구의 수적, 기능적 장애 등이 보고된 바 있다.

아토피 피부염의 면역학적 요인으로는 T 세포 성숙 결핍설, CD8+ 억제 T 세포의 수적 감소 등이 제안된 바 있으나, 최근엔 CD4+ T 세포의 역할이 더욱 중요한 것으로 알려지고 있다. 즉 B 세포로부터 IgE 의 생성을 유도하는 IL-4, B 세포로부터 IgE 생성을 촉진하는 IL-5, IgE 생성을 증폭시키는 IL-6 등을 분비하는 T 세포는 CD4+ T 세포 중 Th2 세포인데, 아토피 환자의 말초 혈액 및 피부 병변으로부터 분리한 항원 특이 T 세포 클론이 Th2로 밟혀졌고, 이 세포들에서 IL-4 등의 Th2 사이토카인들이 분비된다는 사실이 입증되었다.

인체의 외부 침입에 대한 방어 기작인 면역 체계는 T 세포의 활성화를 중심으로 이루어진다고 알려져 있다. Th1 세포가 생산하는 Th type 1 사이토카인은 Th1 세포의 분화를 유도하는 반면, Th2 세포의 증식과 분화를 억제하며, 반대로 Th2 세포가 생산하는 Th type 2 사이토카인은 Th2 세포의 증식과 분화를 유도하는 반면 Th1 세포의 분화를 억제한다고 알려져 있다. 이와 같은 상호 견제를 통해 균형을 이루며 Th1과 Th2 면역반응을 조절하므로, 이 균형이 깨어지게 되면 Th1/Th2 불균형으로 인한 여러 가지 면역질환을 겪게 되는 것으로 이해될 수 있다. 아토피 피부염은 Th2 면역세포의 활성이 우세한 질환이며, 피부염 발생 단계에서 IL-4와 같은 Th2 사이토카인이 증가되어 아토피 피부염 진행을 유도하는 것으로 알려져 있는데 IL-4는 IgE의 발현을 증가시키고, 증가된 IgE는 바만세포 및 호산구와 호중구의 탈과립화(degranulation)를 유발하여 히스타민과 같은 염증성 물질의 분비를 촉진시키게 된다. 또한 IL-4는 비만세포와 CD4⁺ T helper 세포를 생산하게 되어 결국 탈과립화가 일어나는 비만 세포와 호산구가 피부 조직에 다수 침윤되며 표피의 과각질화가 유도된다고 보고되어 있다. IFN-γ는 Th1 사이토카인으로 IL-4의 발현을 억제시키며, Th0 세포가 Th1 세포로 분화하게 하는데 중요한 역할을 하고 있으며 IL-4의 발현을 억제함으로써 T 세포들이 Th2로 분화하지 못하게 한다. 정상적인 상태에서는 IL-4와 IFN-γ의 발현이 균형을 이루고 있지만 아토피 피부염이 발생하게 되면 IL-4의 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서, IL-4의 발현을 낮추고 IFN-γ의 발현을 증가시켜 두 사이토카인의 균형을 이루게 하면 아토피 피부염을 치료할 수 있는 것으로 받아들여지고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 천연물로부터 아토피 피부염의 치료물질을 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 먼나무(Ilex rotunda) 잎 추출물과, 이로부터 분리된 카페오일(caffeoyl) 유도체 화합물이 아토피 피부염 유발성 Th2 사이토카인인 IL(interleukin)-2, IL-4, IL-13 및 IFN-γ의 발현을 농도 의존적 방식으로 억제하여 항아토피 활성을 가진다는 것을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 먼나무(Ilex rotunda) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항아토피 피부염 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 3,4-디-카페오일퀴닌산, 3,5-디-카페오일퀴닌산, 또는 3,4,5-트리-카페오일퀴닌산을 유효성분으로 포함하는 항아토피 피부염 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 3,4-디-카페오일퀴닌산(3,4-di-caffeoylquinic acid), 3,5-디-카페오일퀴닌산(3,5-di-caffeoylquinic acid), 또는 3,4,5-트리-카페오일퀴닌산(3,4,5-tri-caffeoylquinic acid)을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 치료, 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 먼나무(Ilex rotunda) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 치료, 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 천연물로부터 아토피 피부염의 치료물질을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 먼나무(Ilex rotunda) 잎 추출물과, 이로부터 분리된 카페오일(caffeoyl) 유도체 화합물이 아토피 피부염 유발성 Th2 사이토카인인 IL(interleukin)-2, IL-4, IL-13 및 IFN-γ의 발현을 농도 의존적 방식으로 억제하여 항아토피 활성을 가진다는 것을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 조성물의 유효성분의 추출에 사용되는 "먼나무(Ilex rotunda)" 는 감탕나무(Awuifoliaceae)과에 속하는 쌍떡잎 식물로서, 높이가 10 m에 달하며, 상록 활엽 교목으로, 가지는 암갈색이며 털이 없다. 잎은 어긋 나고 타원형이며 밑은 쐐기 모양이거나 둥글고 끝은 날카로우며 톱니가 없다. 잎자루가 길며 광택이 있고 잎맥 은 희미한 특징을 가지고 있다.

본 발명에서 먼나무 잎 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다.

본 발명의 먼나무 잎 추출물을 추출하기 위한 추출 용매로는 추출공정에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있는데, 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출되는 것이 바람직하다.

본 발명의 유효성분 화합물 3,4-디-카페오일퀴닌산, 3,5-디-카페오일퀴닌산, 또는 3,4,5-트리-카페오일퀴닌산은 천연물, 예를 들어, 먼나무(Ilex rotunda)의 잎으로부터 추출된 것을 사용할 수 있으나, 화학적으로 합성된 것도 추출된 것과 동일한 효과를 나타낸다는 것은 당업자에게 자명하다.

본 발명의 화합물은 예를 들어 먼나무(Ilex rotunda) 잎 추출물로부터 통상적인 화합물의 분리 정제 방법에 의해 얻을 수 있다. 예컨대, 실리카겔 또는 셀라이트(celite)겔 컬럼을 이용한 여과(filtration), 액체 컬럼 크로마토그래피를 이용한 크기배제(size-exclusion) 크로마토그래피, 이온교환(ion-exchange) 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 친화(affinity) 크로마토그래피 또는 이들 크로마토그래피의 조합을 이용하여 분리 정제할 수 있다. 천연물 추출물로부터 분리된 단일 화합물은 MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight Mass Spectroscopy), EI MS (Electron Ionization Mass Spectroscopy), CI (Chemical Ionization Mass Spectroscopy), FABI (Fast Atom Bombardment Ionization)와 같은 질량분석법과, 적외선 분광법(IR Sectrum), 핵자기공명법(NMR, Nuclear Magnetic Resonance), CD (Circular Dichroism) 등을 이용하여 최종적으로 동정할 수 있다.

하기 본 발명의 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명 조성물의 유효성분인 3,4-디-카페오일퀴닌산, 3,5-디-카페오일퀴닌산, 또는 3,4,5-트리-카페오일퀴닌산은 Th2 사이토카인인 IL(interleukin)-2, IL-4, IL-13 및 IFN-γ의 발현을 농도 의존적 방식으로 억제함으로써 아토피 피부염 치료 활성을 가진다. 상기 활성 화합물을 포함하는 먼나무(Ilex rotunda) 잎 추출물도 아토피 피부염 치료 활성을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 조성물은 아토피 피부염의 치료 또는 예방 용도의 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제공될 수 있으며, 유효성분인 먼나무 잎 추출물 또는 상기 활성 화합물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 아토피 피부염의 치료를 위해 적용되는 점을 감안하면, 조성물의 투여는 피부에 국소적으로 도포되어 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부 외용 제형을 갖는다. 피부외용 제형은 특별히 한정되지 않으며 바람직하게는 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형이다.

본 발명의 조성물은 아토피 피부염의 개선용 화장품 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효성분과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 먼나무(Ilex rotunda) 잎 추출물 또는 카페오일(caffeoyl) 유도체를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물 3,4-디-카페오일퀴닌산, 3,5-디-카페오일퀴닌산, 또는 3,4,5-트리-카페오일퀴닌산은 강력한 항산화 활성, 자유 라디칼 소거활성을 가지고 있을 뿐만 아니라, Th2 사이토카인인 IL(interleukin)-2, IL-4, IL-13 및 IFN-γ의 발현을 농도 의존적 방식으로 억제함으로써 매우 뛰어난 아토피 치료 활성을 가진다. 또한, 본 발명의 유효성분은 천연물 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물이므로 인체 적용시 부작용 발생이 매우 적다.

도 1a, 도 1b 및 도 1c는 본 발명 화합물 1에 대한 NMR 및 MS 데이터이다.
도 2a, 도 2b 및 도 2c는 본 발명 화합물 2에 대한 NMR 및 MS 데이터이다.
도 3a, 도 3b 및 도 3c는 본 발명 화합물 1에 대한 NMR 및 MS 데이터이다.
도 4는 생쥐 비장세포에 대한 세포독성효과를 LDH(Lactate dehydrogenase) 분비 측정을 통해 측정한 결과이다. 비장세포(splenocyte)를 24시간 동안 1, 5, 10 μM의 농도의 화합물 1 ~ 3 (IR 1 ~ 3)으로 처리하고, 비장세포의 LDH 분비를 490nm 에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. 막대는 3회 독립적 측정의 평균값을 나타낸다. IR1 : 화합물 1, IR2: 화합물 2, IR3: 화합물 3이다.
도 5는 본 발명 화합물에 대해 DPPH 라디칼 소거활성을 1분 또는 2분 동안 측정한 결과를 보여준다. 본 발명 화합물의 DPPH 자유라디칼 소거능은 최대 2분간 다양한 농도 0.1 - 1 μM에서 측정하였다. 아스코르브산(Vitamin C)는 양성대조군으로 사용하였다. 실험의 결과는 평균±표준편차로 표현하였다(n=3). IR 1 : 화합물 1, IR 2: 화합물 2, IR 3: 화합물 3이다.
도 6는 본 발명 화합물 1, 2 및 3의 존재하에서 Cu²⁺/H₂O₂으로 BSA 단백질 처리 후 SDS-PAGE 프로파일 결과를 보여준다. SDS-PAGE 젤상에서 Cu²⁺/H₂O₂ 처리없이 얻은 단백질과 화합물 1, 2 및 3 샘플을 다양한 농도로 처리한 단백질의 분리결과가 나타나있다. 아스코르브산(50 μM)을 양성대조군으로 사용하였다. 최종 단계에서 BSA를 포함한 모든 반응물을 2 시간 동안 인큐베이션하고, 10％ SDS-PAGE상에서 전기영동하였다.
도 7은 세포증식을 측정한 실험결과이다. 생쥐 비장세포를 96-웰 플레이트에 접종하고, 화합물 1, 3 및 3을 0.1 내지 1000 μM의 농도에서 처리하고, 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 450 nm에서 농도에 따른 세포증식 효과를 측정하였다. 3회의 반복된 독립적인 실험의 결과이다.
도 8은 생쥐 비장세포내에서 사이토카인 mRNA 발현을 측정한 결과이다. 세포들을 실험방법에서 설명된 방법에 따라 24시간 동안 배양하였다. 사이클로스포린 A(cyclosporine A)를 양성대조군으로 사용하였다. IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-13 및 β-액틴에 대해, 분리한 mRNA를 real-time RT-PCR을 사용하여 분석하였다. 실험결과들은 β-액틴을 표준유전자로 사용하여 Comparative cycle count (Ct, cycle number threshold)에 의해 내부적으로 확인하였다. 실험결과들은 평균ㅁS.D.으로 나타내었다(n=3).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

1. 활성화합물의 분리

먼나무 잎 3 Kg을 80％ 메탄올(MeOH)을 용매로 사용하여 실온에서 2회 추출하였다. 추출액을 여과한 후 감압 농축하여 추출물(418.22g)을 얻었다. 농축한 추출물을 다시 여과하여 여과층(filter layer)(310.43g)과, 비-여과층(non-filter layer) 92g를 얻었다. 여과층(310.43g)을 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토 그래피(column chromatography) (0→100％ MeOH, gradient system)를 실시하여 6개의 분획(Fr 1, Fr 2, Fr 3, Fr 4, Fr 5, Fr6)으로 각각 분리하였다. 이 분획들 중에서 우수한 활성을 나타낸 분획-6 (Fr-6)(9.67g) 중 3 g을 재결정(recrystallization)를 실시하여 화합물 3 ( compound 3)(1.38g)을 얻었다. 가장 우수한 활성을 나타낸 분획-5 (Fr-5) (20.57g)에 대해서는 Daisogel ODS-B MPLC system(30→100％ MeOH, gradient system)을 이용하여 6 개의 분획(Fr 5-1, Fr 5-2, Fr 5-3, Fr 5-4, Fr 5-5)으로 분리하였다. 이 분획들 중에서 분획 Fr 5-3을 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(column chromatography) (0→100％ MeOH, gradient system)를 실시하여 7 개의 분획(Fr 5-3-1 ~ Fr 5-3-7)으로 나누었으며, 다시 Daisogel ODS-B MPLC system(30→100％ MeOH, gradient system)을 실시하여 분획 Fr 5-3-4에서 화합물 2 (compound 2)(3.58g)을 얻었다. 또한 Fr 5-3-4 에서 화합물 1 ( compound 1)(6.34g)을 얻었다. 이들 화합물을 동결건조 시킨 후 100 μM (in DMSO)에 용해하여 스톡 샘플(stock sample)로 사용하였다. 샘플(sample)의 안정성을 위해 본 연구에 사용되기 전까지 -70℃에서 보관하였고, 실험 중에는 4℃ 냉장보관을 하면서 사용하였다.

2. 실험동물

본 연구에 시용된 동물실험은 충북대학교 실험동물윤리위원회의 승인을 득하여 동 기관의 동물윤리강령에 따라 수행하였고, 수의사 및 1급 실험동물관리기사 자격증 소지자와의 협동연구로 수행하였다. Balb/c는 5주령의 수컷눙(주) 중앙실험동물로부터 구입하여 일주일간의 순화기간을 거친 후 실험에 사용하였다.

3. 세포실험

생쥐 비장세포는 Balb/c 종으로부터 분리하였다. 즉, 추출된 비장을 시린지플런저(syringe plunger)로 세밀히 분쇠한 후 적혈구 제거를 위해 적혈구용해완충액(Red Blood Cell Lysis buffer) (eBioscience, USA)를 첨가하여 적혈구를 완전히 용해하였다. 이어서 비장세포(splenocytes)의 성장배지인 10％-FBS RPMI 1640 배지로 재현탁시키고, 이를 분주하여 약 2시간 동안 안정화시켜 세포들이 약물에 안정적으로 반응을 할 수 있도록 하였다. 이어서, 상기 분리한 화합물을 전처리하고, T 세포의 활성을 위해 항-CD3 항체(eBioscience, USA)를 1 μg/ml의 농도로 첨가하여, 면역억제효과를 관찰하였다. 세포는 습도 95％, CO₂ 5％ 및 37℃의 조건하에서 배양하였다.

4. 세포 증식 분석

생쥐 Balb/c로부터 분리한 비장세포를 96-웰 플레이트에 웰당 10⁵개의 세포를 각각 분주한 후, B 세포 증식인자인 LPS (lipopolysaccharide)와 T 세포 증식인자인 ConA (concanavalin A)를 1 μg/ml의 농도로 각각 첨가하여, 화합물 1 내지 3의 면역세포(T 세포/B 세포) 활성능을 측정하였다. 측정도구로서는 살아있는 세포의 디히드로게나아제(dehydrogenase)의 활성을 측정하는 CCK (Cell Counting Kit-8, Dojindo, Japan)을 사용하여 흡광도 450 nm에서 측정하여 비교하였다.

5. LDH (Lactate dehydrogenase) 분석

LDH (lactate dehydrogenase)는 세포 용해가 일어날 때 방출되는 안정한 세포질 효소이다. 본 실시예에서 사용한 LDH의 측정 방법은 ⁵¹Cr 측정법과 유사한 방법이다. 즉, 분비되어 나온 LDH를 커플된 효소 분석법(coupled enzyme assay)에 의해 테트라졸륨 염(tetrazolium salt)을 적색 포르마잔(formazan) 산물로 바꾸어준다. 이 때 490 nm에서 측정되는 흡광도는 용해된 세포의 수와 비례함으로 특정 약물에 의한 세포독성여부를 확인할 수 있다. 본 실시예서는 96 세포독성키트(cytotoxicity kit)(Promega, USA)를 사용하여, HaCat 세포에서 세포독성 및 IC₅₀을 관찰하였다.

6. DPPH 라디칼 소거활성 분석

DPPH 라디칼은 안정한 유기 질소라디칼이며 짙은 보라색을 띄는 용액이다. 이 자유라디칼에 대한 소거활성 (scavenging activity)을 측정하기 위해 각 용량별 및 시간별 반응 후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다. 본 실시예에서는 0.3 mM DPPH를 메탄올에 녹여 각 용량별 SAB와 반응을 하였다.

7. 히드록실 라디칼 매개 산화 분석 (Hydroxyl radical-mediated oxidation assay)

이 실험은 금속촉매이온반응을 유도하여 생성된 산화물질이 단백질(bovine serum albumin, BSA)을 공격하게 하여 산화정도를 측정하는 실험법이다. 즉, Cu²⁺와 H₂O₂를 혼합한 후 실험 물질을 넣어 37℃에서 2시간 반응시킨 후, BSA를 첨가하여 추가적으로 2시간 더 반응시킨 후, 단백질 분해 억제능을 측정하였다. 반응 결과물은 10％ SDS-PAGE에서 분리한 후 쿠마시블루(Coomassie blue) 염색을 통해 단백질 분해 정도를 측정하였다.

8. Real-Time PCR

항-CD3 단클론항체에 의해 자극된 생쥐의 비장세포(splenocyte)로부터 Trizol 방법 (Invitrogen, USA)을 통해 총 RNA를 추출하였다. 총 부피 20 ㎕으로 하여 Improm-II 역전사 시스템(Promega, USA) 및 올리고 dT 프라이머를 사용하여 1μg의 총 RNA를 역전사시켜 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 하기 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 실시하였으며(Bioneer, Korea), 정량 real-time PCR 반응은 SYBR Green PCR master mix (Qiagen, USA)가 포함된 20㎕ 반응혼합액내에서 Rotor-Gene 6000(Corbett Research, Australia)을 이용하여 수행하였다. 각각의 real-time-PCR 마스터 믹스(master mix)는 10 ㎕의 2X 효소 마스터믹스, 7.0 ㎕의 RNase-free water, 1 ㎕의 각각의 프라이머(각각 10 pM) 및 1 ㎕의 희석 주형(template)가 포함되도록 하였다. PCR은 95℃에서 10분간 전-인큐베이션(pre-incubation) 단계와, 95℃에서 15초, 52℃에서 15초간 어닐링(annealing) 및 72℃에서 10초간 연장(extension)의 45 사이클 단계를 수행하였다. 예상되는 PCR 생성물 형성을 확인하기 위해 융해곡선(melting curve) 분석을 사용하였고, 모든 분석에서 생성된 생성물은 크기(size)가 정확한지 확인하기 위해 1.2％ 아가로스젤 전기영동에 의한 추가 테스트를 행하였다. 내부-작동 칼리브레이터(inter-run calibrator)를 사용하였고 PCR 효율을 얻기 위해 각 유전자에 대한 표준 곡선을 생성하였다. 샘플의 비교 발현 수준은 Rotor-Gene 6000 Series Software 1.7를 사용하여 계산하였고, β-액틴에 대한 비교값으로 표현하여 각 실험 사이의 변이를 보정하였다. 실험 샘플들에 대한 데이터는 내부조절유전자의 백분율로서 표현하였다.

유전자	프라이머	염기서열	유전자 크기	접근번호
IL-2	F	5’-GCTCTACAGCGGAAGCACAG (서열번호: 1)	235 bp	NM_008366
	R	5’-GTCAAATCCAGAACATGCCG (서열번호: 2)
IFN-γ	F	5’-GTTCTGGGCTTCTCCTCCTG (서열번호: 3)	245 bp	NM_008337
	R	5’-CTGGCTCTGCAGGATTTTCA (서열번호: 4)
IL-4	F	5’-ATATCCACGGATGCGACAAA (서열번호: 5)	252 bp	NM_021283
	R	5’-AAGCCCGAAAGAGTCTCTGC (서열번호: 6)
IL-13	F	5’-TGCCATCTACAGGACCCAGA (서열번호: 7)	270 bp	NM_008355
	R	5’-CTGAGGCATCTCCCTTCCTC (서열번호: 8)
β-액틴	F	5’-CTAGGCACCAGGGTGTGATG (서열번호: 9)	291 bp	NM_007393
	R	5’-CTACGTACATGGCTGGGGTG (서열번호: 10)

실험 결과

1. 화합물의 분리 및 동정

분리한 본 발명의 화합물 1, 2 및 3은 각각, 3,4-디카페오일퀴닌산(3,4-di-caffeoylquinicacid), 3,5-디카페오일퀴닌산(3,5-di-caffeoylquinicacid), 및 3,4,5-트리카페오일퀴닌산(3,4,5-tri-caffeoylquinicacid)인 것으로 확인되었다. 아래 표 2 내지 표 4에 상기 화합물들의 ¹H 및 ¹³C NMR 분석 데이터를 정리하여 나타내었다. 아래 표 5에 본 발명의 화합물을 구조식으로 나타내었다. 하기 실시예의 실험결과에서 IR 1은 화합물 1, IR 2는 화합물 2, IR 3은 화합물 3으로 혼용하여 기재한다.

2. 세포독성 분석 (LDH 분석)

본 발명 화합물 1 내지 3의 세포독성을 확인하기 위해 생쥐 비장세포를 이용하여 세포손상을 나타내주는 LDH (Lactate dehydrogenase)의 분비를 측정하였다. 실험 결과 화합물 1 내지 3은 10μM 이하의 농도에서 세포독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다(도 4 참조). 본 실시예에서는 각 화합물의 적정 농도를 5 μM 내외로 결정하였다.

3. DPPH 라디칼 소거능 분석

본 실험에서는 DPPH에 포함되어있는 다량의 자유라디칼의 소거능을 확인하여 항산화효과를 관측하였다. DPPH 라디칼 소거능 분석(DPPH radical scavenging assay)는 비세포성 실험법으로서 항산화효과를 스크리닝할 때 일반적으로 사용되는 방법 중 하나이다. 도 5에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물 1 내지 3은 저농도인 1 μM 미만에서 50 μM의 양성대조군(Vitamin C)과 유사한 정도의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내어 매우 유효한 라디칼 소거능(항산화 효과)을 가지는 것으로 확인되었다.

4. 히드록실 라디칼 매개 산화 분석(Hydroxyl radical-mediated oxidation assay)결과

본 실험은 금속촉매이온반응을 유도하여 생성된 산화물질이 단백질(bovine serum albumin)을 공격하게 하여 특정 물질의 산화능을 측정하는 실험이다. 본 발명의 화합물을 처리하여 산화물질에 의한 단백질의 분해를 억제하는 지를 확인하였다. 도 6의 SDS-PAGE 실험결과에서 나타난 바와 같이 본 발명의 화합물 1, 2 및 3 모두에서 10μM 이상 처리 시에 유효한 산화반응 억제효과가 있음을 확인하였다. 이는 강력한 항산화제인 아스코르브산(ascorbic acid)(50 μM)과 비교하였을 때 저농도에서 매우 우수한 항산화 효과가 있음을 입증하는 결과이다.

5. 세포 증식 분석

면역세포인 T 세포 및 B 세포의 증식여부를 관찰하여 본 발명의 화합물 1, 2 및 3의 면역활성능을 측정하였다. 도 7에서 나타난 바와 같이, 고농도인 100μM 이상에서 세포증식에 반하는 세포독성이 있는 것으로 판단되며, 예상 적정농도인 10 μM에서 각 면역세포(T 세포 및 B 세포)의 증식효과가 관찰되었다. 도 7의 실험결과에 의하면 화합물 1, 2, 3 모두가 T 세포 증식에 유효할 것으로 판단되며, 화합물 2 및 3의 경우 보다 높은 T 세포 활성능을 가질 것으로 판단되었다.

6. 비장세포에서 Real-Time PCR 분석

면역세포들이 모여 있는 비장세포로부터 T-세포 의존적 반응을 유도하기 위해, 항-CD3 항체를 처리하여 real-time PCR을 이용한 T 헬퍼(helper) 세포의 사이토카인 mRNA 발현 패턴을 분석하였다. 본 실험에 사용한 동물은 Balb/c 생쥐이며, 비장 적출과 함께 RBC 용해(lysis)를 통해 단일세포 분리를 수행 후 실험에 사용하였다. 도 8의 결과에서와 같이 화합물 1(IR 1), 화합물 2(IR 2), 및 화합물 3(IR 3) 처리에 의해, Th 사이토카인인 IL-2, IL-4, IL-13 및 IFN-γ 등의 발현이 농도 의존적으로 억제되고 있음이 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 화합물 1, 2, 및 3은 상기 Th 사이토카인의 발현을 억제함으로써 면역반응 억제작용을 통해 아토피 피부염의 치료 활성을 가지는 것으로 판단되었다. 특히, 화합물 2(IR 2)의 경우 매우 효과적으로 Th 세포 사이토카인의 발현을 억제함으로써 항아토피 활성이 매우 클 것으로 기대되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

1. 김태정, 한국의 자원식물Ⅱ, 서울대출판부, (1996), p.299

2. 박영하, 우리나라나무이야기, 이비컴, (2004) p.123

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4. Munehiro nakatani, Shuichi hatanaka, Hajime komura, Takashi kubota, Tsunao Hase, The Structure of routungenoside, a new bitter triterpene glucoside from ilex rotunda, bull.chem. soc. Jpn., 62. 469-473 (1989)

5. Munehiro Nakatani, Yoshiaki Urata and Tsunao Hase, THREE CAFFEOYL TANNINS FROM ILEX ROTUNDA, Phys. & Chem, No. 21. p.127-131, (1988)

6. Yoshihiro Chuda, Hiroshi Ono, Mayumi Ohnishi-Kameyama, Tadahiro Nagata, and Tojiro Tsushida., Structural Identification of Two Antioxidant Quinic Acid Derivatives from Garland (ChrysanthemumcoronariumL.) .,J.Agric.FoodChem.,44(8), pp2037-2039 (1996)

7. Robinson WE Jr, Cordeiro M, Abdel-Malek S, Jia Q, Chow SA, Reinecke MG, Mitchell WM., Dicaffeoylquinic acid inhibitors of human immunodeficiency virus integrase: inhibition of the core catalytic domain of human immunodeficiency virus integrase., 50(4), 846-55, (1996)

8. Kim, Kum-Lan, Choe, Tae-Boo., Studies of Xanthium strumarium extract suppressing Th17-cell differentiation and anti-dermatitic effect in BMAC-induced Atopy Dermatitis of NC/Nga Mice., KSBB Journal [KCI 등재] 제24권 제4호,. pp.383-392, (2009)

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Claims (8)

1. 3,4-디-카페오일퀴닌산(3,4-di-caffeoylquinic acid), 3,5-디-카페오일퀴닌산(3,5-di-caffeoylquinic acid), 또는 3,4,5-트리-카페오일퀴닌산(3,4,5-tri-caffeoylquinic acid)을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 치료, 예방 또는 개선용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 아토피 피부염의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 피부 외용 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 아토피 피부염의 개선용 화장품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 먼나무(Ilex rotunda) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 치료, 예방 또는 개선용 조성물.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 아토피 피부염의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 피부 외용 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
8. 제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 아토피 피부염의 개선용 화장품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   

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