CN114907202B - 花椒活性提取物、花椒多酚及其组合物的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了根据活性追踪法分离、富集并最终确定其结构的花椒多酚及其制备方法；本发明还公开了含此类花椒多酚的组合物及其在抗炎、止痒类化妆品和/或药品上的应用，这种应用是通过提高NHDF细胞活力、抑制NHDF细胞内ROS含量、抑制NHDF细胞炎性细胞因子分泌、抑制NHDF细胞NF‑κB信号通路激活、和/或降低血清中IgE水平等得以实现的。本发明中，含多种花椒多酚化合物的组合物表现出协同增效作用，其在抗炎、止痒方面具有重要意义。

Description

花椒活性提取物、花椒多酚及其组合物的制备和应用

技术领域

本发明涉及花椒活性提取物、花椒多酚及其组合物的制备和应用，更具体地讲，本发明涉及花椒活性提取物、花椒多酚、其组合物和其制备方法、以及它们在制备具有抗炎、止痒作用的化妆品/药品中的应用。

背景技术

小儿湿疹是婴幼儿常见、多发的慢性炎症性皮肤病之一，其主要症状为皮肤红斑、丘疹、水疱。严重情况下，会出现糜烂且伴有瘙痒。小儿湿疹发病部位多在头面、耳后，严重者可发生在躯干、四肢。老年皮肤瘙痒症是老年人中的常见病、多发病，是一种无原发性皮损，仅有皮肤瘙痒或继发性抓痕、结痂的皮肤病。老年皮肤瘙痒症轻则皮肤瘙痒难耐、干燥脱皮，重则引起失眠，导致精神不振。

中医药治疗皮肤病历史悠久、经验丰富，在控制反复发作性皮肤病，延长复发时间，减轻化学药物带来的副作用方面有着卓越的效果。

花椒具有食用和药用价值，具有止痛、杀虫、止痒等广泛应用。花椒富含的多酚化合物具有清除自由基、抗炎、抗氧化等功能。

例如，中国专利201410193570.7公开了一种水产品专用生物保鲜剂及其使用方法，该生物保鲜剂包含：壳聚糖0.6-1.2％、茶多酚0.3-0.5％、甘油1-2％、花椒提取物12-15％和花椒叶提取物4-8％，余量为竹醋液。该专利的生物保鲜剂采用纯天然植物成分，不含抗生素和常规杀菌剂，具有广谱抗菌效果，能有效抑制水产品在低温保存过程中脂肪的氧化酸败。

中国专利201710754237.2公开了一种消炎抗菌治疗灰指甲的凝胶剂及其制备方法，该凝胶剂含有：羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、甘油、氮酮、硝酸咪康唑、芦荟油、沙棘果油、白醋、大蒜提取液、苦参提取液、透骨草提取液、花椒提取液、百部提取液、艾叶提取液、地肤子提取液、凤仙花提取液、蒸馏水、75％乙醇、尿素、尼泊金甲酯和尼泊金乙酯。该专利的凝胶剂吸收快，顺应性好，对灰指甲的防治疗效确切，能使患者的灰指甲得到明显的改善。

中国专利申请201911014609.3公开了一种花椒提取物的制备方法及其在化妆品的应用，包括以下步骤：D1制备花椒粉末，D2水蒸气蒸馏除去挥发油，D3分离蒸煮液，D4醇提取，D5去除麻味物质，D6制备醇提取物B，D7制备花椒提取物。上述方法制备的粉末状花椒提取物和膏状花椒提取物，应用到化妆品中，提供抗过敏、止痒、抗菌、消炎、淡斑的效果。

中国专利201911285658.0公开了一种消炎面膜，包括面膜纸和面膜液；其中，面膜液包括花椒提取物、磷脂和辅料。该专利消炎面膜的制备方法包括对花椒粉末的水蒸气蒸馏、提取物的脂质体制备、蒸馏后水层再进行超声波提取、浸泡面膜纸等步骤，所制得的面膜具有消炎、抗氧化效果，同时面膜不结块不出现絮状物。

中国专利202010551170.4公开了花椒提取物中活性成分WGX50的新用途。发明人通过不同浓度WGX50对角质形成细胞的细胞毒性进行测试和对黑素细胞的细胞毒性进行测试后，进行了基于角质形成细胞的保湿基因测试、基于黑素细胞的美白基因测试和基于UVB刺激角质形成细胞的抗炎测试，发现了WGX50具有保湿、美白和抗炎的功能。这种WGX50新功能的发现为多功能化妆品的制备提供了潜在方案。

中国专利202010998482.X公开了一种毛刺花椒提取物的制备方法及其用途。该专利利用毛刺花椒树皮的甲醇总提取物、石油醚萃取物及正丁醇萃取物具有一定的抗假丝酵母菌活性，进一步探索毛刺花椒中具有药效活性的物质基础，为合理开发利用这一植物资源提供依据，同时为制备抗菌药物提供一种新的来源。

然而，花椒提取物成分复杂，非多酚类物质可能会影响其清除自由基、抗炎、抗氧化等活性的发挥。

因此，有必要基于活性追踪方法对花椒清除自由基、抗炎、抗氧化类活性成分进行分离、提取，开发具有清除自由基、抗炎、抗氧化、缓解皮肤瘙痒、舒缓类的化妆品原料或者药物。

发明内容

本发明的发明目的之一是提供利用活性追踪法制备的花椒多酚及其制备方法；本发明的另一发明目的是提供通过活性分析制备的花椒活性提取物；本发明的再一发明目的是提供上述花椒多酚和其组合物以及花椒活性提取物在制备抗炎、止痒类化妆品或药品中的应用。

一方面，为了实现上述的发明目的，本发明提供了由花椒通过活性追踪法制备的、下述结构式中式I至式IV所示的花椒多酚，其中：

式I所示的花椒多酚命名为花椒多酚-1，简写为HJDF-1,其结构式如下所示：

式II所示的花椒多酚命名为花椒多酚-2，简写为HJDF-2，其结构式如下所示：

式III所示的花椒多酚命名为花椒多酚-3，简写为HJDF-3，其结构式如下所示：

式IV所示的花椒多酚命名为花椒多酚-4，简写为HJDF-4，其结构式如下所示：

另一方面，为了实现上述的发明目的，本发明还提供了一种制备上述花椒多酚的方法，该花椒多酚是在下述的花椒活性提取物的基础上制得的。其中，花椒活性提取物是通过包括如下过程的方法利用活性分析法制备的：

(1)将花椒粉碎；

(2)粉碎后的花椒用乙醇-水进行渗漉提取；

(3)合并减压浓缩步骤(2)所得的提取液，得到浸膏；

(4)用水混悬步骤(3)所得的浸膏，得到混悬液；

(5)步骤(4)所得的混悬液用氯仿进行萃取，萃取液浓缩后得氯仿萃取物；

(6)将氯仿萃取物通过硅胶柱层析分离，采用氯仿-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，得到若干馏分；

(7)构建2,4-二硝基氯苯诱导的正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)的损伤模型，评价步骤(6)所得各馏分的活性；

其中，该步骤(7)所得的具有最佳保护活性的馏分即为花椒活性提取物。花椒活性提取物是指花椒35％乙醇提取物，经氯仿萃取后再经氯仿-甲醇(V:V-55:45)的洗脱组分。

其中，步骤(5)中选用氯仿进行萃取也是在活性分析的基础上选择的：第一步，先将步骤(4)所得的混悬液依次用乙酸乙酯、氯仿进行萃取，将各萃取液浓缩后分别得乙酸乙酯萃取物、氯仿萃取物；第二步，基于构建的2,4-二硝基氯苯(DNCB)暴露正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)的损伤模型，评价第一步中所得乙酸乙酯萃取物、氯仿萃取物的保护活性，发现氯仿萃取物具有更佳的保护活性。

(8)将步骤(7)所得的花椒活性提取物采用制备型HPLC分离纯化得式I所示的花椒多酚-1、式II所示的花椒多酚-2、式III所示的花椒多酚-3、式IV所示的花椒多酚-4。

在本发明的制备过程中，步骤(1)所使用的花椒是半干的或干燥的，优选为干燥花椒。

在本发明的制备过程中，步骤(2)中花椒与乙醇-水的质量比可以为1:(20-100)。

在本发明的制备过程中，步骤(2)中所采用的乙醇-水为25％-60％的乙醇，优选为30％-50％的乙醇，更优选为35％-40％的乙醇，例如35％的乙醇。此处，所说的乙醇浓度为体积浓度，例如35％的乙醇是指乙醇与水的体积比为35:65。

在本发明的制备过程中，步骤(6)中氯仿萃取物经硅胶柱色谱分离时，选用的硅胶可为80-100目或200-300目或300-400目，优选的硅胶为200-300目或300-400目，更优选的硅胶为或200-300目。

在本发明的制备过程中，步骤(8)中采用制备型HPLC分离纯化时，用甲醇-水进行梯度洗脱。

作为本发明制备方法的一种具体实施方式，可采用花椒(干)5kg，粉碎，用乙醇(35％)浸泡并超声提取48h，合并减压浓缩提取液，得浸膏；总浸膏用适量水混悬，依次用乙酸乙酯、氯仿进行萃取，将各萃取液浓缩后分别得乙酸乙酯萃取物，氯仿萃取物；构建DNCB诱导的NHDF细胞损伤模型，评价乙酸乙酯萃取物、氯仿萃取物的保护活性；将具有最佳保护活性的氯仿萃取物通过硅胶(200-300目)柱层析分离，采用氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，得到馏分Fr.1-12；基于前期构建的DNCB诱导的NHDF细胞损伤模型，评价Fr.1-12保护活性；最佳保护活性的Fr.6(氯仿-甲醇(V:V-55:45)洗脱组分)标记为花椒活性提取物；获得的花椒活性提取物先后采用制备型HPLC(MeOH-H₂O)分离纯化得花椒多酚-1(1102mg)、花椒多酚-2(951mg)、花椒多酚-3(989mg)及花椒多酚-4(778mg)。

在本发明中，花椒多酚可以从花椒中基于活性追踪法分离提取得到，为其制备提供了一个新的途径。

再一方面，为了实现上述的发明目的，本发明还提供了一种用于舒缓、抗炎、止痒的花椒多酚的组合物，该组合物包括如式I至式IV所示的花椒多酚中的至少一种。

进一步地，在本发明的花椒多酚的组合物中，还包括前述的花椒活性提取物。

更优选地，在本发明的花椒多酚的组合物中，式I至式IV所示的花椒多酚的质量比为1:(1-100):(1-100):(1-100)。

进一步优选地，在本发明的花椒多酚的组合物中，式I至式IV所示的花椒多酚的质量比为1:(1-50):(1-50):(1-50)。

例如，在本发明的花椒多酚的组合物中，式I至式IV所示的花椒多酚的质量比大致为1:1:1:1，但此处并非是严格执行的比例，可以上下有一定的波动。

本发明中，含有多种花椒多酚化合物的组合物表现出协同增效的作用。

又一方面，为了实现上述的发明目的，本发明还提供了上述花椒活性提取物或上述花椒多酚的组合物在制备抗炎、止痒类化妆品或药品中的应用。

在本发明的应用中，该应用可通过提高NHDF细胞活力、抑制NHDF细胞内ROS含量、抑制NHDF细胞炎性细胞因子分泌、抑制NHDF细胞NF-κB信号通路激活、和/或降低血清中IgE水平而得以实现。

在本发明的应用中，用于舒缓、抗炎、止痒类的化妆品或药品可为外用制剂，其形式可为喷剂、慕斯、膏剂、乳剂、或液体制剂。

在本发明的应用中，止痒所涉及的痒症是指由皮炎、湿疹、荨麻疹、或皮肤干燥症之类皮肤病所引起的痒症。

在本发明的应用中，所采用的外用制剂可以为相应的缓控释剂，其形式为用于涂抹给药的包合物、脂质体、微球、纳米粒、或乳剂。

在本发明的应用中，止痒药品可以为复方制剂，其包括辅料以及上述的花椒活性提取物和/或上述的花椒多酚组合物。

在本发明的应用中，花椒活性提取物或花椒多酚的组合物可以作为化妆品或护肤品的添加剂，加入至化妆品或护肤品中，作为舒缓、抗炎、止痒的有效成分。

相对于现有技术，本发明至少具有如下的有益效果：

(1)本发明提供了花椒多酚化合物及其组合物，细胞实验结果表明花椒多酚化合物及其组合物能抑制2,4-二硝基氯苯诱导的正常人皮肤成纤维细胞(NHDF细胞)相关炎性因子过度分泌，抑制2,4-二硝基氯苯诱导的正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)氧化应激及氧化损伤，发挥抗氧化、抗炎活性；

(2)本发明提供了花椒多酚化合物及其组合物，动物实验结果表明花椒多酚化合物及其组合物能延长皮肤瘙痒模型小鼠瘙痒潜伏搔抓时间，减轻皮肤瘙痒小鼠搔抓次数。其中，花椒多酚组合物活性高于花椒多酚化合物。花椒多酚化合物及其组合物治疗后，各用药组小鼠血清炎性因子(IL-6、IL-1β、TNF-α及IFN-γ)含量较皮肤瘙痒模型组降低，说明花椒多酚化合物及其组合物具有抗炎功效。同时，花椒多酚组合物的抗炎、缓解皮肤瘙痒活性强于花椒多酚化合物的；

(3)本发明的花椒多酚化合物可从花椒中提取得到，来源丰富；而花椒多酚组合物可由花椒多酚化合物组合获得，且花椒多酚化合物制备工艺简单、操作方便，便于在抗炎、止痒类药品或化妆品中应用。下面将结合具体实施方式和附图对本发明技术方案进行清楚、完整描述。本领域技术人员可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅是本发明一部分的实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明的精神，本领域的普通技术人员可以在不作出创造性劳动的前提下进行相应的替换、变换、改变或改进，但这些替换、变换、改变或改进，仍属于本发明的保护范围。

附图说明

图1是花椒多酚-1的HR-ESI-MS谱；

图2是花椒多酚-1的¹H NMR谱；

图3是花椒多酚-1的¹³C NMR谱；

图4是花椒多酚-1的DEPT-135NMR谱；

图5是花椒多酚-1的¹H-¹H COSY NMR谱；

图6是花椒多酚-1的HSQC谱；

图7是花椒多酚-1的HMBC谱；

图8是花椒多酚-2的HR-ESI-MS谱；

图9是花椒多酚-2的¹H NMR谱；

图10是花椒多酚-2的¹³C NMR谱；

图11是花椒多酚-2的DEPT-135NMR谱；

图12是花椒多酚-2的¹H-¹H COSY NMR谱；

图13是花椒多酚-2的HSQC谱；

图14是花椒多酚-2的HMBC谱；

图15是花椒多酚-3的HR-ESI-MS谱；

图16是花椒多酚-3的¹H NMR谱；

图17是花椒多酚-3的¹³C NMR谱；

图18是花椒多酚-3的DEPT-135NMR谱；

图19是花椒多酚-3的¹H-¹H COSY NMR谱；

图20是花椒多酚-3的HSQC谱；

图21是花椒多酚-3的HMBC谱；

图22是花椒多酚-4的HR-ESI-MS谱；

图23是花椒多酚-4的¹H NMR谱；

图24是花椒多酚-4的¹³C NMR谱；

图25是花椒多酚-4的DEPT-135NMR谱；

图26是花椒多酚-4的¹H-¹H COSY NMR谱；

图27是花椒多酚-4的HSQC谱；

图28是花椒多酚-4的HMBC谱；

图29显示了花椒多酚组合物抑制DCNB诱导的NHDF细胞活力显著降低；

图30显示了花椒多酚组合物抑制DCNB诱导的NHDF细胞内ROS含量升高；

图31显示了花椒多酚组合物抑制DCNB诱导的NHDF细胞前炎性细胞因子含量升高；

图32显示了花椒多酚组合物抑制DCNB诱导的NHDF细胞NF-κB信号通路激活；

图33显示了花椒多酚组合物调控2,4-二硝基氯诱导的小鼠血清IgE及炎性因子含量变化。

具体实施方式

本发明具体实施方式中所采用的主要试验仪器和主要材料来源为：化合物的核磁检测用Bruker AV-500或Bruker AV-400MHz核磁共振仪测定核磁(NMR)，并以TMS为内标(德国Bruker公司)；用Agilent 6210LC/MSD TOF型质谱仪测定高分辨质谱；用ThermoFinnigan LCQ Advantage MAX质谱仪(美国Thermo公司)测定质谱(ESI-MS)；HPLC采用Dionex型高效液相色谱仪(美国Dionex公司)；PHPLC采用Varian制备型高效液相色谱仪(美国Varian公司)和Agilent 1100LC/MSD型高校色谱仪(美国Agilent公司)；Cosmosil C-1(8250mm×4.6mm,5μm)色谱柱。Sephadex LH-20层析填料购于Pharmacia公司；ODS柱色谱材料购于德国Merck公司；柱色谱用硅胶购于青岛海洋化工厂；核磁用氘代试剂购自美国CIL公司；所用试剂均为分析纯和色谱纯。

实施例1花椒活性提取物的制备

花椒(干)5kg，粉碎，用乙醇(35％)浸泡并超声提取48h，合并减压浓缩提取液，得浸膏。总浸膏用适量水混悬，依次用乙酸乙酯、氯仿进行萃取，将各萃取液浓缩后分别得乙酸乙酯萃取物，氯仿萃取物。

基于前期构建的DNCB诱导的NHDF细胞损伤模型，评价乙酸乙酯萃取物，氯仿萃取物保护活性。

将具有最佳保护活性的氯仿萃取物通过硅胶(200-300目)柱层析分离，采用氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，得到馏分Fr.1-12。

基于前期构建的DNCB诱导的NHDF细胞损伤模型，评价馏分Fr.1-12保护活性。

实验最佳保护活性的Fr.6(氯仿-甲醇(V:V-55:45)洗脱组分)标记为花椒活性提取物。

实施例2花椒多酚化合物的分离、制备

将实施例1获得的花椒活性提取物先后采用制备型HPLC(MeOH-H₂O)分离纯化得花椒多酚-1(1102mg)、花椒多酚-2(951mg)、花椒多酚-3(989mg)及花椒多酚-4(778mg)。

花椒多酚-1的结构鉴定：

请参阅图1-图7。花椒多酚-1为淡黄色油状物；HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z337.1988[M+H]⁺(C₁₉H₂₉O₅,理论计算值:337.2010)确定分子式为C₁₉H₂₈O₅，不饱和度为6。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)谱中共显示26个质子信号。δ_H13.29(1H,s)提示有1个苯环上的羟基氢信号；此外，该化合物还有1个烯烃质子信号δ_H5.22(1H,m)；3组亚甲基质子信号[δ_H3.27(2H,d,J＝7.3Hz),2.70(2H,d,J＝6.8Hz),1.79(2H,overlapped)]；6个甲基质子信号[δ_H3.74(3H,s),2.67(3H,s),1.78(3H,s),1.66(3H,s),1.35(6H,s)]，其中2个是连氧甲基信号[δ_H3.74(3H,s),2.67(3H,s)]。

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)谱中共出现19个碳信号，结合DEPT-135谱可知其分别为9个季碳、1个次甲基、3个亚甲基和6个甲基。低场区可见δ_C203.4的1个酮羰基信号；δ_C122.6,131.2为1对双键碳信号；δ_C160.9,159.2,159.0,112.9,108.6,106.5可推测为苯环的碳信号。

分析NMR数据得知，化合物存在一个异戊二烯基片段[δ_H5.22(1H,m),3.27(2H,d,J＝7.3Hz),1.78(3H,s),1.66(3H,s)]。因此推测该化合物可能为苯环侧链取代基团的双键还原成单键的产物。

在HMBC谱中，可以观察到H-2″(δ_H1.79)与C-1″(δ_C17.2),C-3″(δ_C75.6)有相关，同时还可以看到H-4″/5″(δ_H1.35)与C-2″(δ_C32.2),C-3″(δ_C75.6)有相关。可证实此结构中存在一个3-甲基-3-羟基丁基片段。

同时，在HMBC谱中还可以观察到H-1″(δ_H2.70)与C-5′(δ_C106.5),C-6′(δ_C159.2)有相关，可证实该片段连接在C-5′位。

综合以上数据，证实了苯环上取代基团的结构，从而推断出该化合物结构。结合1D和2D NMR谱信息，对化合物进行了全归属(表1)。

表1花椒多酚-11D and 2D NMR数据(CDCl₃,δin ppm)

综合以上的结构解析，鉴定化合物的结构如式I所示，本发明中命名为花椒多酚-1。

花椒多酚-2的结构鉴定：

请参阅图8-图14。花椒多酚-2为淡黄色油状物，HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z337.1983[M+H]⁺(C₁₉H₂₉O₅,理论计算值:337.2010)确定分子式为C₁₉H₂₈O₅，不饱和度为6。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)谱中共显示26个质子信号。δ_H13.80(1H,s)提示有1个苯环上的羟基氢信号；此外，该化合物还有2个烯烃质子信号[δ_H6.52(1H,d,J＝16.2Hz),6.62(1H,dd,J＝16.2,6.9Hz)]；2组亚甲基质子信号[δ_H2.72(2H,t,J＝6.3Hz),1.79(2H,t,J＝6.3Hz)]；6个甲基质子信号[δ_H3.74(3H,s),2.68(3H,s),1.39(6H,s),1.09(6H,d,J＝6.7Hz)]，其中2个是连氧甲基信号[δ_H3.74(3H,s),2.68(3H,s)]。

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)谱出现19个碳信号，结合DEPT-135谱可知其分别为8个季碳、3个次甲基、2个亚甲基和6个甲基。低场区可见δ_C203.6的1个酮羰基信号；δ_C142.1,116.2为1对双键碳信号；δ_C161.6,159.5,159.0,110.1,108.5,106.6可推测为苯环的碳信号。

NMR数据与化合物花椒多酚-1对比，发现碳化学位移非常相似。除了都有2,4-二羟基苯乙酮的骨架之外，二者也都存在一个3-甲基-3-羟基丁基片段[δ_H2.72(2H,t,J＝6.3Hz),1.79(2H,t,J＝6.3Hz),1.39(6H,s)]。两者的区别在于与化合物花椒多酚-1比，苯环上C-3′位上化学位移变化较大，由δ_C112.9变成δ_C110.1，因此初步推测C-3′位的取代基发生了变化。同时，花椒多酚-2缺少2个亚甲基碳信号(δ_C17.2,32.2)，多出1组双键碳信号(δ_C116.2,142.1)。因此推测该化合物可能为花椒多酚-1的C-1″′,2″′位氧化成双键的产物。

在¹H-¹H COSY谱中，H-2″′(δ_H6.62)与H-1″′(δ_H6.52)有相关，同时可见H-3″′(δ_H2.44)与H-2″′(δ_H6.62),H-4″′/5″′(δ_H1.09)有相关，可推测该化合物中有一个3-甲基-1-丁烯基团。

在HMBC谱中可以观察到H-1″′(δ_H6.52)与C-2′(δ_C161.6),C-3′(δ_C110.1),C-4′(δ_C159.0)有相关，可证实该片段连接在C-3′位。

综合以上数据，证实了苯环上的取代基团的结构，从而推断出该化合物结构。结合1D和2D NMR谱信息，对花椒多酚-2进行了全归属(表2)。

表2花椒多酚-2 1D and 2D NMR数据(CDCl₃,δin ppm)

综合以上的结构解析，鉴定化合物的结构如式II所示，命名为花椒多酚-2。

花椒多酚-3的结构鉴定：

请参阅图15-图21。花椒多酚-3为淡黄色油状物，HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z337.2010[M+H]⁺(C₁₉H₂₉O₅,理论计算值:337.2010)确定分子式为C₁₉H₂₈O₅，不饱和度为6。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)谱中共显示27个质子信号。δ_H13.36(1H,s)提示有1个苯环上的羟基氢信号；此外，该化合物还有4组亚甲基质子信号[δ_H2.71(2H,t,J＝6.7Hz),2.65(2H,m),1.79(2H,t,J＝6.7Hz),1.65(2H,m)]；6个甲基质子信号[δ_H3.75(3H,s),2.68(3H,s),1.36(6H,s),1.26(6H,s)]，其中2个是连氧甲基信号[δ_H3.75(3H,s),2.68(3H,s)]。

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)谱中共出现19个碳信号，结合DEPT-135谱可知其分别为9个季碳、4个亚甲基和6个甲基。低场区可见δ_C203.6的1个酮羰基信号；δ_C160.8,159.3,158.8,113.8,108.7,106.6可推测为苯环的碳信号。

将花椒多酚-3的NMR数据与花椒多酚-1对比，发现碳化学位移非常相似。两者的区别在于与花椒多酚-1比，花椒多酚-3缺少1组双键碳信号(δ_C122.6,131.2)，多出2个碳信号(δ_C42.5,71.2)。因此推测该化合物可能为花椒多酚-1上苯环C-3′侧链取代基团发生改变的产物。

在HMBC谱中，可以观察到H-2″′(δ_H1.65)与C-1″′(δ_C17.4),C-3″′(δ_C71.2),C-4″′/5″′(δ_C29.2)有相关，可证实该化合物中存在一个3-甲基-3-羟基丁基片段。花椒多酚-3的不饱和度为6，扣除1个羰基、1个苯环后，还剩1个不饱和度。结合高分辨质谱数据给出的分子式，可推测该3-甲基-3-羟基丁基片段的羟基与苯环上的羟基脱水缩合形成六元环的稳定结构。

在HMBC谱中还可以观察到H-1″′(δ_H2.65)与C-2′(δ_C160.8),C-3′(δ_C113.8),C-4′(δ_C158.8)有相关，可证实该片段连接在C-3′位。

综合以上数据，证实了苯环上的取代基团的结构，从而推断出该化合物结构。结合1D和2D NMR谱信息，对花椒多酚-3进行了全归属(表3)。

表3花椒多酚-3 1D and 2D NMR数据(CDCl₃,δin ppm)

综合以上的结构解析，鉴定化合物的结构如式III所示，命名为花椒多酚-3。

花椒多酚-4的结构鉴定：

请参阅图22-图28。花椒多酚-4为淡黄色油状物，HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z337.2007[M+H]⁺(C₁₉H₂₉O₅,理论计算值:337.2010)确定分子式为C₁₉H₂₈O₅，不饱和度为6。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)谱中共显示27个质子信号，δ_H13.66(1H,s)提示该化合物中有1个苯环上的羟基氢信号。此外，该化合物还含有4组亚甲基质子信号[δ_H2.63(2H,overlapped),2.62(2H,overlapped),1.78(2H,m),1.67(2H,m)]；6个甲基质子信号[δ_H3.74(3H,s),2.67(3H,s),1.35(6H,s),1.28(6H,s)]，其中2个是连氧甲基氢信号[δ_H3.74(3H,s),2.67(3H,s)]。

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)谱中共出现19个碳信号，结合DEPT-135谱可知其分别为9个季碳、4个亚甲基和6个甲基。低场区可见δ_C203.4的1个酮羰基信号；根据δ_C 161.9,159.2,158.7,115.6,108.1,105.5可推测为苯环的碳信号。

将花椒多酚-4的NMR数据与花椒多酚-3对比，发现碳的化学位移非常相似。除了都有2,4-二羟基苯乙酮的骨架之外，二者也都存在2个3-甲基-3-羟基丁基片段[δ_H2.63(2H,overlapped),1.78(2H,m),1.35(6H,s)],[δ_H2.62(2H,overlapped),1.67(2H,m),1.28(6H,s)]。但是与化合物花椒多酚-3比，花椒多酚-4苯环上碳的化学位移都发生了较大的变化。因此推测该化合物可能为花椒多酚-3上苯环C-3′与C-5′连接的侧链取代基团的连接位置发生改变的产物。

在HMBC谱中，可以观察到H-1″(δ_H2.62)与C-4′(δ_C159.2),C-5′(δ_C115.6),C-6′(δ_C158.7)有相关，可证实该化合物中成环的3-甲基-3-羟基丁基片段连接在C-5′位。还可以观察到H-1″′(δ_H2.63)与C-2′(δ_C161.9),C-3′(δ_C108.1)有相关，可证实未成环的3-甲基-3-羟基丁基片段连接在C-3′位。

综合以上数据，证实了苯环上的取代基团的结构，从而推断出该化合物结构。结合1D和2D NMR谱信息，对花椒多酚-4进行了全归属(表4)。

表4花椒多酚-4 1D and 2D NMR数据(CDCl₃,δin ppm)

/>

综合以上的结构解析，鉴定化合物的结构如式IV所示，命名为花椒多酚-4。

实施例3本发明花椒多酚化合物及其组合物的保护活性(细胞试验)

NHDF细胞接种于96孔板，密度为5×10³细胞/孔，培养24h。加入2,4-二硝基氯苯(5μM)处理细胞12h，然后，收集细胞，冷PBS清洗2遍，加入新的培养基并加入终浓度为5μg/mL的花椒多酚组合物(花椒多酚-1，花椒多酚-2与花椒多酚-3、花椒多酚-4质量比为1:1:1:1)或花椒多酚-1，花椒多酚-2、花椒多酚-3、花椒多酚-4，共培育24h后，分离细胞及上清液备用。

本实验部分，花椒多酚组合物组标记为HJDFZ；空白组标记为CON，2,4-二硝基氯苯组标记为DCNB；花椒多酚-1组标记为HJDF-1；花椒多酚-2组标记为HJDF-2；花椒多酚-3组标记为HJDF-3；花椒多酚-4组标记为HJDF-4。

实验结果(图29)显示，相比于空白对照组(细胞活力设为100％)，DCNB暴露使NHDF细胞活力显著降低(21.7％)，而花椒多酚组及花椒多酚组合物组细胞活力高于DCNB组；其中花椒多酚组合物组细胞活力提高最为显著，高于同浓度的花椒多酚化合物组；相比于DCNB组，花椒多酚组合物组细胞活力提高16.2％。

机体发生氧化应激时，ROS是诱导细胞氧化损伤、凋亡的毒性因子。本实验结果(图30)显示，相比于空白对照组(细胞内ROS含量设为1)，2,4-二硝基氯苯暴露使NHDF细胞内ROS含量显著增加(355％)，而花椒多酚组及花椒多酚组合物组细胞内ROS低于DCNB组；其中花椒多酚组合物组细胞内ROS含量减少最显著，相比于DCNB组，花椒多酚组合物组细胞内ROS含量减少41.1％。

在免疫系统中，细胞因子白介素在免疫调节和炎症应答中起重要作用。根据细胞因子对炎症反应的不同影响，细胞因子分为前炎性细胞因子和抗炎性细胞因子两类。前炎性细胞因子主要包括IL-1、IL-5、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α等，是机体正常防御系统的重要组成部分，具有促进炎症反应活性。抗炎性细胞因子主要包括和受体拮抗剂IL-4、IL-10、IL-13等，具有抑制炎症反应活性。

本实验ELISA实验结果显示(图31)，2,4-二硝基氯苯暴露使NHDF细胞炎性细胞因子(IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α、IL-4及IL-10)分泌显著增加，说明DCNB暴露后诱导了NHDF细胞炎症反应。而花椒多酚及花椒多酚组合物处理后，细胞炎性因子过度分泌被抑制。其中花椒多酚组合物对DNCB诱导的炎性因子分泌抑制作用最为显著，且高于花椒多酚化合物单独使用。我们推测，花椒多酚可能是通过发挥协同作用进而发挥抑制炎性因子含量升高的。

NF-κB则信号通路是介导炎症反应关键的转录因子，激活的NF-κB信号通路会进一步上调炎性因子的转录翻译，促进炎症。因此抑制NF-κB信号通路激活是减轻炎症的有效途径之一。

Western blotting实验结果显示(图32)，DCNB暴露显著诱导了NHDF细胞NF-κB信号通路中p65及IκBα蛋白的磷酸化，说明DCNB暴露后诱导了NHDF细胞NF-κB信号通路的激活。而花椒多酚及花椒多酚组合物处理后，NHDF细胞NF-κB信号通路中p65及IκBα蛋白的磷酸化被抑制，说明DCNB暴露后诱导的NHDF细胞NF-κB信号通路的激活被抑制。我们推测，椒多酚及花椒多酚组合物对DNCB诱导的NHDF细胞NF-κB信号通路具有抑制作用，且椒多酚及花椒多酚组合物对DNCB诱导的NHDF细胞炎性因子过度分泌可能是通过抑制NF-κB信号通路激活实现的。

实施例4本发明花椒多酚及其组合物的生物活性(动物试验)

Balb/c小鼠，SPF级，雄性，体重(20±2)g，恒温环境饲养，温度(20±2)℃，湿度50％，饲养环境为光照节律12h:12h，自由进食进水，适应性喂养1周。将小鼠随机分为4组，每组8只，分别为正常组；皮肤瘙痒模型组；花椒多酚(花椒多酚-1)组；花椒多酚组合物组。实验开始后，除正常组外，剃须后，用200μL 2％DNCB溶液在1×1cm贴片上涂抹小鼠背部皮肤1周，并用200μL 0.2％DNCB溶液每周2次再次激发。

第3周开始，各用药组小鼠按0.3mg/cm²涂抹给药，于每日傍晚给药1次，连续14d(正常组、皮肤瘙痒模型组每日给予同等剂量蒸馏水)。实验过程中，小鼠颈背部剪刀剃毛，保持颈背部无毛。于第28天涂药30min后，摄像机记录小鼠搔抓表现；摘眼球取血，3000r/min离心10min，取血清，酶联免疫吸附法检测血清IgE、IL-6、IL-1β及IL-13含量。

从表5数据中可以看出，与正常组比较，皮肤瘙痒模型组瘙痒潜伏时间显著缩短，瘙痒次数明显增多。而用药后各用药组瘙痒潜伏时间延长，瘙痒次数减少，其中花椒多酚组合物组瘙痒潜伏时间延长最长，瘙痒次数减少最显著。

表5花椒多酚及其组合物对小鼠瘙痒潜伏时间及瘙痒次数的影响

与皮肤瘙痒模型组比较^*p＜0.05,^**p＜0.01.

小鼠在皮炎发作后表现出血清中IgE水平升高，因此，我们测试花椒多酚组合物是否能够控制Th2介导的IgE血清水平及相关炎性因子含量变化。

从图33中可以看出，与正常组比较，皮肤瘙痒模型组IgE含量显著性升高。而花椒多酚、花椒多酚组合物用药后，与皮肤瘙痒模型组比较，IgE含量显著降低。其中，与花椒多酚组合物组IgE含量更低。我们推测，在相同浓度条件下，花椒多酚可能发挥协同作用，具有更优的抗炎活性。

从图33数据中可以看出，与正常组比较，皮肤瘙痒模型组炎性细胞因子IL-6、IL-1β及IL-13含量显著性升高，说明模型组小鼠受到严重的炎性损伤。而与皮肤瘙痒模型组比较，用药后各组炎性细胞因子IL-6、IL-1β及IL-13含量降低，说明花椒多酚及其组合物均具有抑制炎症的活性。此外，花椒多酚组合物抑制小鼠皮肤瘙痒模型小鼠炎性因子分泌活性高于花椒多酚。

Claims (6)

1.一种制备花椒多酚的方法，该方法包括如下的过程制备：

(1)将花椒粉碎；

(2)粉碎后的花椒用含乙醇25％-60％的乙醇-水进行渗漉提取；

(3)合并减压浓缩步骤(2)所得的提取液，得到浸膏；

(4)用水混悬步骤(3)所得的浸膏，得到混悬液；

(5)步骤(4)所得的混悬液用氯仿进行萃取，萃取液浓缩后得氯仿萃取物；

(6)将氯仿萃取物通过硅胶柱层析分离，采用氯仿-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，得到若干馏分；

(7)构建2,4-二硝基氯苯诱导的正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)的损伤模型，评价步骤(6)所得各馏分的保护活性；

(8)将步骤(7)中具有最佳保护活性的馏分采用制备型HPLC分离纯化得式I所示的花椒多酚-1、式II所示的花椒多酚-2、式III所示的花椒多酚-3、式IV所示的花椒多酚-4，

其中，步骤(7)中得到的具有最佳保护活性的馏分也称为花椒活性提取物。

2.如权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(2)中所采用的乙醇-水为30％-50％的乙醇。

3.式I至式IV所示的化合物或者包括式I至式IV所示化合物的组合物在制备止痒的化妆品或药品中的应用

4.如权利要求3所述的应用，其中，所述的止痒化妆品或药品为外用制剂，其形式为膏剂或液体制剂。

5.如权利要求3所述的应用，其中，所述的止痒化妆品或药品为外用制剂，其形式为慕斯、喷剂或乳剂。

6.如权利要求3所述的应用，其中，止痒所涉及的痒症是指由皮炎、湿疹、荨麻疹、或皮肤干燥症所引起的痒症。