CN116041208A - 枸杞根多酚衍生物组合物、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有抗炎、止痒功效的枸杞根提取物、枸杞根多酚衍生物及其制备方法，本发明还涉及枸杞根提取物和枸杞根多酚衍生物的组合物在抗炎、止痒方面的应用。本发明公开的枸杞根提取物主要由多酚衍生物组成，该枸杞根提取物在抗炎、止痒方面效果优秀，枸杞根提取物中的多酚衍生物表现出优秀的协同作用，在抗炎、止痒方面具有重要的应用价值。本发明公开的枸杞根提取物及其制剂可广泛作为具有抗炎、止痒类化妆品或药品的原料。
Description
技术领域
本发明涉及一种枸杞根提取物、枸杞根多酚衍生物组合物、及其制备方法以及它们在抗炎、止痒化妆品或药品中的应用。
背景技术
特应性皮炎(Atopic dermat it i s，AD)，也称特应性湿疹(Atop ic eczema)，是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，具有反复发作、病程迁延，患者往往有剧烈瘙痒的特点。在不同的年龄段，患者还常常合并过敏性鼻炎、哮喘等其他特应性疾病，故被认为是一种系统性疾病，需要按慢性病进行长期的病程管理。我国AD患病率的增加晚于西方发达国家和日本、韩国，但进10年来增长迅速。2014年，采用临床医生诊断标准，我国12个城市1-7岁儿童AD患病率达到12.94％，1-12个月婴儿AD患病率达到30.48％。
特应性皮炎的治疗目标是缓解或消除临床症状，消除诱发和/或加重因素、减少和预防复发、提高患者生命质量。AD的临床治疗分为基础治疗、外用药物治疗、瘙痒对症治疗、过敏原特异性免疫治疗、中医中药治疗等。其中，外用药物治疗主要提及了外用糖皮质激素和钙调神经磷酸酶抑制剂的使用，虽可暂时缓解相关症状，但却无法改变广大病患群体带病生存的现实，同时也存在病症易反复、个体效果差异大、长期疗效不稳定等一系列局限和副作用。
中医药在治疗AD方面具有较大的优势和较远的历史，其在缓解AD瘙痒和皮损、减少复发、延长缓解期、改善患者生活质量等方面拥有西医无法相比的优越性。临床报道部分中药提取物，如复方甘草酸苷片剂、雷公藤片、雷公藤多甙等，可用于急性发作期控制症状。
地骨皮(CortexLycii)取自枸杞(Lycium chinenseMill.)的干燥根皮，是我国应用历史悠久的一类传统中药材。地骨皮富含生物碱类、有机酸及其酯类、苷类、甾醇类、蒽醌类、香豆素类、黄酮类、枸杞素、胺类等化学成分，具有美容护肤、免疫调节、抗炎舒缓等功效。其中，免疫调节、抗炎舒缓功效尤为突出，但枸杞根中所含活性物质的抗炎、舒缓、止痒活性却鲜有研究及报道。
中国专利201911229462.X公开了一种提取地骨皮中多酚的方法及其地骨皮多酚提取物，该方法包括：将地骨皮烘干至水分含量为不超过0.6％，粉碎后过60目筛，得地骨皮粉末，密封避光保存；将硫酸铵、乙醇溶液和地骨皮粉末混合，形成混合溶液体系，超声提取后，提取液抽滤，静置分层后，取上相，即得地骨皮多酚提取物。然而，该专利既没有确定地骨皮多酚的结构，也没有确定出此类多酚在化妆品和药品方面的用途。
因此，有必要基于活性追踪方法对枸杞根的抗炎、止痒类活性成分进行分离、提取，获得抗炎、止痒类活性更佳枸杞根多酚衍生物及其组合物，以开发具有重要应用价值的抗皮肤瘙痒、抗炎、舒缓类的化妆品或者药物。
发明内容
本发明的发明目的之一是提供利用活性(分析)追踪法制备的枸杞根提取物、枸杞根多酚衍生物及其制备方法；本发明的另一发明目的是提供枸杞根提取物及枸杞根多酚衍生物组合物在制备抗炎、止痒类化妆品或药品中的应用。
一方面，为了实现上述的发明目的，本发明提供了由枸杞根通过活性追踪法制备的、下述结构式中式I至式V所示的枸杞根多酚衍生物之一：
另一方面，为了实现上述的发明目的，本发明还提供了一种制备枸杞根提取物以及上述枸杞根多酚衍生物的方法，其中，枸杞根多酚衍生物是在枸杞根提取物的基础上制得的。本发明中，枸杞根提取物是采用包括如下步骤的方法制备的：
(1)将新鲜枸杞根粉碎；
(2)粉碎后的枸杞根用乙醇-水进行渗漉(渗漏)提取；
(3)合并减压浓缩步骤(2)所得的提取液，得到浸膏；
(4)将步骤(3)得到的浸膏溶于乙醇中，并与硅胶混合搅拌均匀，得到混合物；
(5)将步骤(4)所得的混合物于旋转蒸发仪中在35-45℃的温度下旋蒸，除去乙醇，得到浸膏-硅胶吸附混合物；
(6)将步骤(5)所得的浸膏-硅胶吸附混合物通过硅胶柱层析分离，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，得到若干馏分；
(7)构建2,4-二硝基氯苯(DNCB)诱导的正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)的损伤模型，评价步骤(6)所得各馏分的活性；
(8)将步骤(7)中具有最佳保护活性的馏分进一步用凝胶柱分离，并采用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，得到若干馏分；
(9)基于DNCB诱导的NHDF细胞损伤模型，评价步骤(8)所得各馏分的保护活性；
其中，步骤(9)中具有最佳保护活性的馏分即为本发明的枸杞根提取物。
进一步地，本发明在制备出上述枸杞根提取物的基础上，制备出上述的枸杞根多酚衍生物，其方法包括：
A、提供上述的枸杞根提取物；
B、将步骤A中的枸杞根提取物用制备型HPLC分离纯化，得式I所示的枸杞根多酚衍生物-1、式II所示的枸杞根多酚衍生物-2、式III所示的枸杞根多酚衍生物-3、式IV所示的枸杞根多酚衍生物-4、以及式V所示的枸杞根多酚衍生物-5。
本发明中，枸杞根多酚衍生物、枸杞根提取物是基于2,4-二硝基氯苯(DNCB)诱导的正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)损伤模型，采用活性评价追踪方法提取、分离得到的。
本发明中，所提及的活性泛指能够提高皮肤成纤维细胞抗炎、抗氧化等方面的活性。
更具体地，本发明的枸杞根提取物是基于DNCB诱导的NHDF细胞炎症模型及活性追踪方法分离得到的枸杞根活性组分，其制备过程包括：
新鲜枸杞根粉碎，乙醇-水浸渍提取，提取液浓缩得浸膏；
基于DNCB诱导的NHDF细胞炎症模型，评价不同浓度乙醇-枸杞根提取物的保护活性；
将具有最佳保护活性的枸杞根提取物浸膏用乙醇溶解，并与硅胶混合；混合物于旋转蒸发仪中在35-45℃的温度下旋蒸，除去乙醇，得到浸膏-硅胶吸附混合物；
浸膏-硅胶吸附混合物通过硅胶柱层析分离，石油醚-乙酸乙酯混合溶剂洗脱，得到Fr.1-15；
基于DNCB诱导的NHDF细胞炎症模型，评价Fr.1-15的保护活性；
将具有最佳保护活性的Fr.11采用凝胶柱分离，采用氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，得到Fr.11-1-Fr.11-15；
基于DNCB诱导的NHDF细胞炎症模型，评价Fr.11-1-Fr.11-15的保护活性；
其中，具有最佳保护活性的馏分Fr.11-5组分即确定为本发明的枸杞根提取物。
进一步地，将具有最佳保护活性的Fr.11-5中含量最多的化合物采用制备型HPLC(甲醇-水)分离纯化，得到化合物经鉴定为式I所示的枸杞根多酚衍生物-1、式II所示的枸杞根多酚衍生物-2、式III所示的枸杞根多酚衍生物-3、式IV所示的枸杞根多酚衍生物-4、以及式V所示的枸杞根多酚衍生物-5。
在上述步骤(2)中，用于渗漏提取枸杞根所用的乙醇-水可以为含15％-75％乙醇的乙醇-水(乙醇：水-V:V)，优选为含乙醇20％-60％的乙醇-水(乙醇：水-V:V)，更优选为含25％-35％乙醇的乙醇-水(乙醇：水-V:V)。例如，渗漏提取枸杞根所用的乙醇-水为含30％乙醇的乙醇-水(乙醇：水-V:V)。
在上述步骤(4)中，用于溶解浸膏的乙醇优选为纯乙醇，用于与浸膏乙醇溶液混合的硅胶优选为80-100目的硅胶。
在上述步骤(5)中，旋蒸的温度优选为38-42℃，例如40℃。
在上述步骤(6)中，浸膏-硅胶吸附混合物经硅胶柱色谱分离，选用硅胶可为200-300目或300-400目，优选为200-300目的硅胶。
在上述步骤(8)中，具有最佳保护活性的馏分(Fr.11)采用凝胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇(100∶10→10∶100)梯度洗脱，优选用氯仿-甲醇(100∶50→50∶100)梯度洗脱。
在上述步骤B中，将具有最佳保护活性的馏分(Fr.11-5)经制备型HPLC(甲醇-水)分离纯化得式I至式V所示的化合物。
本发明中，枸杞根提取物、枸杞根多酚衍生物可从枸杞根中基于活性追踪方法分离得到，为枸杞根提取物以及枸杞根多酚衍生物的制备提供了一种新的途径。
再一方面，为了实现上述的发明目的，本发明还提供了一种用于抗炎、止痒的枸杞根多酚衍生物的组合物，该组合物包括如式I至式V所示的枸杞根多酚衍生物中的至少一种。
优选地，在本发明的枸杞根多酚衍生物的组合物中，其包括式I至式V所示的枸杞根多酚衍生物，且式I至式V所示的各枸杞根多酚衍生物的质量比为1:(1-100):(1-100):(1-100):(1-100)。从评价实验的结果来看，枸杞根提取物中的枸杞根多酚衍生物之间存在协同效应，能够更好的发挥提高NHDF细胞的抗炎活性。
更优选地，在本发明的枸杞根多酚衍生物组合物中，式I至式V的枸杞根多酚衍生物的质量比为1:(1-50):(1-50):(1-50):(1-50)。例如，在本发明的枸杞根多酚衍生物的组合物中，式I至式V所示的枸杞根多酚衍生物化合物的质量比大致为1:4.5:13.5:8:3，但此处并非是严格执行的比例，可以上下有一定的波动。
又一方面，为了实现上述的发明目的，本发明还提供了上述枸杞根提取物以及枸杞根多酚衍生物的组合物在制备抗炎、止痒类化妆品或药品中的应用。
在本发明的应用中，该应用可通过提高NHDF细胞活力、抑制NHDF细胞内ROS含量、抑制NHDF细胞炎性细胞因子分泌、抑制NHDF细胞NLRP3炎症小体激活、和/或抑制NHDF细胞NF-κB信号通路激活而实现。
在本发明的应用中，用于抗炎、舒缓类的化妆品或药品可为外用制剂，其形式可为喷剂、慕斯、膏剂、乳剂、或液体制剂等。
在本发明的应用中，抗炎所涉及的炎症是指皮肤炎症，包括皮肤干燥症、皮炎、荨麻疹、湿疹、和浅部真菌感染等。
在本发明的应用中，抗炎、止痒的药品可以为复方制剂，其包括辅料以及上述的枸杞根提取物和/或枸杞根多酚衍生物的组合物。
在本发明的应用中，枸杞根提取物和/或枸杞根多酚衍生物的组合物可以作为化妆品或护肤品的添加剂，加入至化妆品或护肤品中，作为抗炎、止痒的有效成分。
本发明的枸杞根提取物或枸杞根多酚衍生物的组合物能够抑制DCNB诱导的NHDF细胞炎性因子过量表达，抑制DCNB诱导的NHDF细胞氧化损伤，发挥抗炎保护活性。
本发明的枸杞根提取物或枸杞根多酚衍生物的组合物能够抑制皮肤瘙痒模型小鼠的皮肤瘙痒，减少小鼠搔扒次数；抑制皮肤瘙痒模型小鼠炎性因子过度表达，最终发挥抗炎、止痒活性。
相对于现有技术，本发明具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明的枸杞根提取物的抗炎、止痒活性强于普通市售枸杞根提取物；
(2)本发明的枸杞根提取物能显著减少皮肤瘙痒模型小鼠炎性细胞因子过度表达，发挥抗炎止痒活性；
(3)本发明的枸杞根提取物能显著减少皮肤瘙痒模型小鼠搔抓次数，减轻皮肤损伤。
下面结合具体实施方式和附图对本发明技术方案进行清楚、完整描述。本领域技术人员可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅是本发明一部分的实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明的精神，本领域的普通技术人员可以在不作出创造性劳动的前提下进行相应的替换、变换、改变或改进，但这些替换、变换、改变或改进，仍属于本发明的保护范围。
附图说明
图1是枸杞根多酚衍生物-1的1H-NMR谱图；
图2是枸杞根多酚衍生物-1的13C-NMR谱图；
图3是枸杞根多酚衍生物-1的HR-ESI-MS谱图；
图4是枸杞根多酚衍生物-2的1H-NMR谱图；
图5是枸杞根多酚衍生物-2的13C-NMR谱图；
图6是枸杞根多酚衍生物-2的HR-ESI-MS谱图；
图7是枸杞根多酚衍生物-3的1H-NMR谱图；
图8是枸杞根多酚衍生物-3的13C-NMR谱图；
图9是枸杞根多酚衍生物-3的HR-ESI-MS谱图；
图10是枸杞根多酚衍生物-4的1H-NMR谱图；
图11是枸杞根多酚衍生物-4的13C-NMR谱图；
图12是枸杞根多酚衍生物-4的HR-ESI-MS谱图；
图13是枸杞根多酚衍生物-5的1H-NMR谱图；
图14是枸杞根多酚衍生物-5的13C-NMR谱图；
图15是枸杞根多酚衍生物-5的HR-ESI-MS谱图；
图16是枸杞根提取物增强NHDF细胞活力、抑制ROS过量产生的示意图；
图17是枸杞根提取物调控NHDF细胞炎性细胞因子分泌示意图；
图18是枸杞根提取物抑制DCNB诱导的NHDF细胞NLRP3炎症小体、NF-κB信号通路激活激活的示意图；
图19是枸杞根提取物调控DCNB诱导的小鼠炎性因子分泌的示意图。
具体实施方式
实施例1枸杞根提取物的制备
新鲜枸杞根1kg粉碎并用30％乙醇(10L)的渗漏提取24h，合并减压浓缩提取液，得浸膏164g。
将浸膏(50g)溶解于100mL乙醇中，溶解物与100g 80-100目硅胶混合搅拌均匀，混合物于旋转蒸发仪40℃旋蒸，除去乙醇，得浸膏-硅胶吸附混合物。将浸膏-硅胶吸附混合物通过硅胶柱(200-300目)层析分离，采用石油醚-乙酸乙酯(100:30→30:100)混合溶剂梯度洗脱，得到Fr.1-15。
基于DNCB诱导的NHDF细胞炎症模型，评价Fr.1-15的保护活性。
将具有最佳保护活性的Fr.11采用凝胶柱分离，采用氯仿-甲醇(100∶50→50∶100)梯度洗脱，得到Fr.11-1-Fr.11-15。
基于DNCB诱导的NHDF细胞炎症模型，评价Fr.11-1-Fr.11-15的保护活性。
具有最佳保护活性的Fr.11-5组分，为本发明的枸杞根提取物。
实施例2枸杞根多酚衍生物分离、鉴定
将具有最佳保护活性的Fr.11-5组分经制备型HPLC分离获得：
制备型HPLC的具体条件为：RP-HPLC(安捷伦1200HPLC)在Zorbax，SB C-18柱(9.4×250mm，5μm)上分离。洗脱溶剂系统由水-三氟乙酸(溶剂A；100:0.1，v/v)和乙腈-三氟乙酸(溶剂B；100:0.1，v/v)组成。使用30％至75％溶剂B的梯度洗脱，以5.0mL/min的流速35min，检测波长设置为300nm；收集11.96min处的色谱峰对应的洗脱液浓缩干燥后得式I所示结构的枸杞根多酚衍生物-1；收集12.16min处的色谱峰对应的洗脱液浓缩干燥后得式II所示结构的枸杞根多酚衍生物-2；收集12.54min处的色谱峰对应的洗脱液浓缩干燥后得式III所示结构的枸杞根多酚衍生物-3；收集12.68min处的色谱峰对应的洗脱液浓缩干燥后得式IV所示结构的枸杞根多酚衍生物-4；收集12.77min处的色谱峰对应的洗脱液浓缩干燥后得式V所示结构的枸杞根多酚衍生物-5；其中：
式I所示结构的枸杞根多酚衍生物-1的结构解析如下：
请参阅图1-图3。化合物淡黄色油状，HR-ESI-MS m/z 338.0992[M+Na]+(calcdfor C18H21NO4Na,338.1379)，结合该化合物的碳、氢核磁数据谱图，确定该化合物的分子式为C18H21NO4，不饱和度为9，相对分子质量为315。
观察1H NMR(300MHz,MeOH-d4)谱中的特征信号，化合物中存在10组氢信号。存在一组特征ABX自旋体系芳香质子信号[δH6.66(1H,s,H-5),6.76(1H,d,J＝4.8Hz,H-8),6.61(1H,d,J＝1.8Hz,H-9)]，说明该化合物含有一个1,3,4-三取代苯环；AA'BB'自旋体系特征芳香质子信号一组[δH 6.68(2H,d,J＝1.8Hz,H-5',7'),6.92(2H,d,J＝8.4Hz,H-4',8')]，说明结构中含有一个1,4-二取代苯环。四个亚甲基质子信号分别为[δH 2.79(2H,t,J＝7.5Hz,H-3),2.59(2H,t,J＝7.5Hz,H-2'),2.39(2H,d,J＝6.6,15Hz,H-2),3.31(2H,d,J＝8.4,10Hz,H-1')]、甲氧基质子信号一个[δH 3.82(3H,s,6-OCH3)]。结合13C NMR和DEPT谱，化合物含有16个碳信号，其中[δC 174.8(C-1)]为羰基碳信号，一组对称1,4-二取代苯基芳香碳信号分别为[δC 130.7(C-4',8'),116.1(C-5',7']，一组芳香碳信号[δC 133.7(C-4),145.9(C-6),148.9(C-7)]为1,3,4-三取代苯基上的信号，甲氧基碳信号1个[δC56.3(6-OCH3)]、亚甲基碳信号4个[δC 32.6(C-3),35.7(C-2'),39.4(C-2),42.3(C-1')]。其碳氢核磁数据如表1所示。
表1枸杞根多酚衍生物-11HNMR及13CNMR数据
综上分析，化合物结构鉴定为式I所示化合物本发明中命名为枸杞根多酚衍生物-1。
式II所示结构的枸杞根多酚衍生物-2的结构解析如下：
请参阅图4-图6。化合物为黄色油状，HR-ESI-MS m/z 302.1285[M+H]+(calcd forC17H20NO4,302.1393)，确定该化合物的分子式为C17H20NO4，不饱和度为9，相对分子质量为301。1H NMR(600MHz,MeOH-d4)谱，化合物中存在9组氢信号，存在一组ABX自旋体系特征芳香质子信号[δH 6.63(1H,s,H-2),6.67(1H,d,J＝8.4Hz,H-5),6.51(1H,d,J＝8.4Hz,H-6)]，说明结构中含有一个1,3,4-三取代苯环；一组AA'BB'自旋体系特征芳香质子信号[δH6.95(2H,d,J＝8.4Hz,H-2',6'),6.69(2H,d,J＝9Hz,H-3',5')]，说明化合物结构中存在一个1,4-二取代苯环。在高场区，发现亚甲基四个信号[δH 2.73(2H,t,J＝7.8Hz,H-7),2.37(2H,t,J＝7.8Hz,H-8),2.61(2H,d,J＝7.8,15Hz,H-7'),3.28(2H,d,J＝7.8Hz,H-8')]。结合13C NMR和DEPT谱，发现该化合物含有15个碳信号，其中[δC 175.4(C-9)]羰基碳信号、一组对称1,4-二取代苯基芳香碳信号[δC 130.7(C-2',6'),116.2(C-3',5']、一组1,3,4-三取代苯基芳香碳信号[δC 116.5(C-2),116.3(C-5),120.6(C-6)]、亚甲基碳信号4个分别为[δC 32.5(C-7),39.4(C-8),35.7(C-7'),42.3(C-8')]。其碳氢核磁数据如表2所示。
表2枸杞根多酚衍生物-21HNMR及13CNMR数据
综上分析，化合物结构鉴定为式II所示化合物本发明中命名为枸杞根多酚衍生物-2。
式III所示结构的枸杞根多酚衍生物-3的结构解析如下：
请参阅图7-图9。化合物为棕色固体，HR-ESI-MS m/z 314.1380[M+H]+(calcd forC18H20NO4,314.1393)，确定该化合物的分子式为C18H20NO4，不饱和度为10，相对分子质量为313。
观察1H NMR(300MHz,MeOH-d4)谱中的特征信号，化合物中共存在10组氢信号。存在反式双键质子信号2个[δH 5.81(1H,d,J＝12.6Hz,H-2'),6.61(1H,d,J＝12.6Hz,H-3')]；含有一组ABX自旋体系特征芳香质子信号[δH 7.36(1H,d,J＝2.1Hz,H-4),6.74(1H,d,J＝5.1Hz,H-7),6.93(1H,d,J＝8.1Hz,H-8)],结构中存在一个1,3,4-三取代苯环；一组AA'BB'自旋体系特征质子信号[δH 6.99(2H,d,J＝6.3Hz,H-5',9'),6.69(2H,d,J＝6.6Hz,H-6',8')]，说明化合物中含有一个1,4-二取代苯环。在高场区，发现亚甲基2个信号[δH2.69(2H,t,J＝8.1,15Hz,H-2),3.35(2H,br.s,H-1)]、甲氧基信号一个[δH 3.83(3H,s,7'-OCH3)]。
结合13C NMR和DEPT谱，发现该化合物含有16个碳信号，其中[δC 170.3(C-1')]为羰基碳信号、双键碳信号两个[δC 114.1(C-2'),138.2(C-3')]、一组对称1,4-二取代苯基芳香碳信号[δC 130.7(C-5',9'),116.2(C-6',8')]、一组1,3,4-三取代苯基芳香碳信号[δC 115.9(C-4),142.0(C-7),124.8(C-8)]、亚甲基碳信号2个[δC 42.3(C-1),35.2(C-2)]、甲氧基碳信号一个[δC 56.4(7'-OCH3)]。其NMR数据如表3所示。
表3枸杞根多酚衍生物-31HNMR及13CNMR数据
综上分析，化合物结构鉴定为式III所示化合物本发明中命名为枸杞根多酚衍生物-3。
式IV所示结构的枸杞根多酚衍生物-4的结构解析如下：
请参阅图10-图12。化合物为白色粉状，HR-ESI-MS m/z 318.1351[M+H]+(calcdfor C17H20NO5,318.1342)，确定该化合物的分子式为C17H19NO5，不饱和度为9，相对分子质量为317。根据1H NMR(600MHz,MeOH-d4)谱中所提供的特征信号，化合物中存在10组氢信号。化合物存在两组特征ABX自旋体系芳香质子信号[δH 6.63(1H,s,H-2),6.67(1H,d,J＝9.6Hz,H-5),6.50(1H,d,J＝7.8Hz,H-6)]和[δH 6.62(1H,s,H-2'),6.66(1H,d,J＝7.8Hz,H-5'),6.46(1H,d,J＝8.4Hz,H-6')]，说明结构中存在两个1,3,4-三取代苯环。在高场区，发现亚甲基信号4个[δH 2.73(2H,t,J＝7.8Hz,H-7),2.56(2H,t,J＝7.8Hz,H-7'),2.37(2H,t,J＝6.6Hz,H-8),3.28(2H,t,J＝3.6Hz,H-8')]。结合13C NMR和DEPT谱，化合物含有15个碳信号，其中[δC 175.4(C-9)]为羰基碳信号、两组1,3,4-三取代苯基芳香碳信号[δC116.3(C-2),116.8(C-5),121.1(C-6)]及[δC 116.3(C-2'),116.5(C-5'),120.6(C-6')]、亚甲基碳信号4个分别为[δC 32.5(C-7),36.0(C-7'),39.5(C-8),42.3(C-8')]。其碳氢核磁数据如表4所示。
表4枸杞根多酚衍生物-41HNMR及13CNMR数据
综上分析，化合物结构鉴定为式IV所示化合物本发明中命名为枸杞根多酚衍生物-4。
式V所示结构的枸杞根多酚衍生物-5的结构解析如下：
请参阅图13-图15。化合物为黄色油状HR-ES I-MS m/z 366.1329[M+Na]+(calcdfor C19H21NO5Na,366.1318)，确定该化合物的分子式为C19H21NO5，不饱和度为10，相对分子质量为343。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)谱中的特征信号，发现化合物11中共存在8组氢信号。在低场区，可观察到该化合物存在反式双键质子信号2个[δH 6.53(1H,d,J＝15.6Hz,H-2),7.28(1H,d,J＝13.5Hz,H-3)]；其中的一组特征芳香质子信号[δH 6.84(2H,s,H-5)]说明结构中存在一个1,3,4,5-四取代苯环；一组AA'BB'自旋体系特征芳香质子信号[δH 7.01(2H,d,J＝8.7Hz,H-2',6'),6.68(2H,d,J＝8.7Hz,H-3',5')]，说明化合物中含有一个1,4-二取代苯环。在高场区，发现亚甲基信号2个[δH 2.64(2H,t,J＝7.5Hz,H-β),3.28(2H,m,H-α)]、甲氧基信号两个[δH 3.78(6H,s,6,8-OCH3)]。13C NMR和DEPT谱，发现该化合物含有12个碳信号，其中[δC 165.5(C-1)]是羰基碳信号、一组芳香碳信号[δC125.3(C-4),148.1(C-6),129.5(C-7),148.1(C-8)]为1,3,4,5-四取代苯基、一组芳香碳信号[δC 129.4(C-2',6'),115.1(C-3',5']为1,4-二取代苯基、双键碳信号2个[δC 119.4(C-2),139.2(C-3)]、亚甲基碳信号2个[δC 41.5(C-α),34.4(C-β)]、甲氧基信号两个[δC 56.0(6,8-OCH3)]。其碳氢核磁数据如表5所示。
表5枸杞根多酚衍生物-51HNMR及13CNMR数据
综上分析，化合物结构鉴定为式V所示化合物本发明中命名为枸杞根多酚衍生物-5。
效果实验例1枸杞根提取物抗炎活性评价
5×103NHDF细胞/孔接种于96孔板，培养过夜。加入DCNB溶液，使其终浓度为10μM，继续培养12h后，收集细胞，冷PBS清洗2遍。加入含有枸杞根多酚衍生物-1、枸杞根多酚衍生物-2、枸杞根多酚衍生物-3、枸杞根多酚衍生物-4、枸杞根多酚衍生物-5、枸杞根提取物或市售枸杞根提取物的新培养基，使其终浓度为1.0mg/mL，继续培养12h。收集细胞，CCK 8试剂盒检测细胞活性。
②、5×103NHDF细胞/孔接种于96孔板，培养过夜。加入DCNB溶液，使其终浓度为10μM，继续培养12h后，收集细胞，冷PBS清洗2遍。加入含有枸杞根多酚衍生物-4或枸杞根提取物或市售枸杞根提取物的新培养基，使其终浓度为1.0mg/mL，继续培养12h。收集细胞及上清液，ELISA试剂盒检测细胞炎性因子的分泌变化、细胞内ROS含量变化及westernblotting检测相关蛋白变化。
实验结果(图16A)显示，相比于空白对照组(细胞活力，100％)，DCNB组NHDF细胞活力降低23.5％，而枸杞根提取物、枸杞根多酚衍生物-1、枸杞根多酚衍生物-2、枸杞根多酚衍生物-3、枸杞根多酚衍生物-4、枸杞根多酚衍生物-5组细胞活力均高于DCNB组；说明枸杞根多酚衍生物-1、枸杞根多酚衍生物-2、枸杞根多酚衍生物-3、枸杞根多酚衍生物-4、枸杞根多酚衍生物-5及其枸杞根提取物对DCNB诱导的细胞损伤有修复作用，对NHDF细胞有一定的保护活性。进一步分析实验结果发现，同等浓度条件下枸杞根提取物的保护活性强于枸杞根多酚衍生物，强于市售枸杞根提取物的保护活性。
细胞内活性氧化物是诱导细胞氧化应激、细胞氧化损伤的重要因素。我们以保护活性最佳的枸杞根多酚衍生物-4为代表化合物，继续研究枸杞根多酚衍生物及枸杞根提取物发挥保护活性的潜在分子机制。实验结果如图16B显示：DCNB组NHDF细胞内ROS含量增加341％(p<0.01)，说明DCNB暴露诱导NHDF细胞内ROS过量产生，诱发细胞氧化损伤，使NHDF细胞活力降低。而相比于DNCB组，枸杞根多酚衍生物-4、枸杞根提取物及市售枸杞根提取物组NHDF细胞内ROS含量均降低。相比于DCNB组，枸杞根多酚衍生物-4、枸杞根提取物、市售枸杞根提取物组NHDF细胞内ROS含量分别减少39.9％(p<0.05)，61.7％(p<0.01)，16.8％(p<0.05)。
炎性细胞因子是机体免疫的重要组成部分，其中，促炎性细胞因子能加重炎症反应，主要包括IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-13、TNF-α等；而抗炎性细胞因子能够抑制炎症反应，主要包括IL-4、IL-10等。
实验结果如图17A、C、D、F、G、H显示，DNCB组炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-13、IL-18、TNF-α分泌显著增加，而抗炎性细胞因子IL-4、IL-10(图17B、E)分泌显著减少。我们推测，DCNB诱发NHDF细胞炎症反应，导致NHDF细胞受到严重的炎性损伤，进而导致NHDF细胞活力降低。而枸杞根提取物显著抑制了DNCB诱导的NHDF细胞炎性因子IL-1β、IL-6、IL-13、IL-18、TNF-α过度分泌，同时也使DNCB诱导的NHDF细胞抗炎性细胞因子IL-10分泌抑制有效缓解。枸杞根提取物对DNCB诱导的NHDF细胞炎性因子分泌紊乱的调控活性在同等浓度条件下优于枸杞根多酚衍生物-4及市售枸杞根提取物。我们推测，枸杞根提取物中的枸杞根多酚衍生物存在协同效应，能够更好的发挥提高NHDF细胞的抗炎活性。
固有免疫作为对外来病原体的清除及引导机体产生有效的适应性免疫应答具有至关重要的作用。固有免疫通过模式识别受体来识别病原体的保守结构，进而激活下游信号通路引起炎症反应。如NOD样受体(NLR)：一类细胞内感应分子。NOD样受体在激活后形成巨大的蛋白复合体即“炎症小体”。
实验结果如图18A、B、C显示，DCNB暴露组NHDF细胞NLRP3、ASC-1及Caspase-1蛋白表达显著增加。Western blot实验结果说明，DCNB暴露激活了NHDF细胞NLRP3炎症小体，而NLRP3炎症小体的激活会进一步诱发炎性细胞因子分泌并加重DCNB组NHDF细胞的炎性损伤。经过枸杞根提取物治疗，DCNB诱发的NHDF细胞NLRP3、ASC-1及caspase-1蛋白表达增加被显著抑制，NLRP3炎症小体激活被抑制。我们认为，枸杞根提取物发挥抗炎，保护NHDF细胞活性可能是通过抑制DCNB诱导的NHDF细胞NLRP3炎症小体激活实现的。
NF-κB是一种细胞核转录因子，能够调控靶基因免疫相关受体、细胞因子(如IL-1、IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α等)、炎症因子(IL-8、MIP-1α、MCP1)及黏附分子(ICAM、VCAM和E-selectin)等，在调控免疫细胞激活、细胞凋亡及炎症反应方面发挥重要作用。
实验结果如图18D、E、F显示，DCNB使NHDF细胞p65，NF-κB蛋白显著增加；同时，DCNB组NHDF细胞IκBα蛋白含量显著减少。实验结果说明，DCNB暴露使NHDF细胞NF-κB信号通路激活。而枸杞根提取物治疗后，DCNB诱导的NHDF细胞p65，NF-κB蛋白高表达被显著抑制，而IκBα蛋白降解也被显著抑制。我们推测，枸杞根提取物发挥抗炎活性，抑制DCNB诱导的NHDF细胞NF-κB信号通路激活也是潜在的分子机制之一。本部分实验结果同样显示出枸杞根提取物对DCNB诱导的NHDF细胞NF-κB信号通路激活抑制活性强于枸杞根多酚衍生物-4，强于市售枸杞根提取物。进一步验证，枸杞根多酚衍生物可通过协同作用发挥其保护活性。
效果实验例2枸杞根提取物抗炎、止痒活性评价
昆明种小鼠，SPF级，雄性，体重(21±2)g，恒温环境饲养，温度(20±2)℃，湿度50％，饲养环境为光照节律12h:12h，自由进食进水，适应性喂养1周。将小鼠随机分为5组，每组8只，分别为正常组、皮肤瘙痒模型组、枸杞根提取物组、枸杞根多酚衍生物-4组、市售枸杞根提取物组。实验开始后，除正常组外，剃毛后，用200μL 2％DNCB溶液在1×1cm贴片上涂抹小鼠背部皮肤1周，并用200μL 0.2％DNCB溶液每周2次再次激发。
第21天开始，各用药组小鼠按1mg/cm2涂抹给药，于每日傍晚给药1次，连续14天(正常组、皮肤瘙痒模型组每日给予同等剂量蒸馏水)。实验过程中，小鼠颈背部剃毛，保持颈背部无毛。于第28天涂药30min后，记录小鼠搔抓表现；摘眼球取血，3000r/min离心10min，取血清，ELISA法检测血清IL-1β、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α及IL-18含量。
表6枸杞根提取物对小鼠皮肤瘙痒潜伏时间及皮肤瘙痒次数影响
与空白组比较##p＜0.01；与DCNB组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
其中，分析表6的实验结果，与空白对照组相比，模型组小鼠皮肤瘙痒的潜伏时间显著缩短，且皮肤瘙痒的次数明显增多。而枸杞根提取物治疗后，小鼠皮肤瘙痒潜伏时间有效延长(p<0.01)，同时，小鼠皮肤瘙痒的次数明显减少(p<0.01)；同时，枸杞根提取物组小鼠皮肤瘙痒的潜伏时间延长最显著；小鼠皮肤瘙痒次数减少也最显著，效果优于同等剂量条件下的枸杞根多酚衍生物-4及市售枸杞根提取物。
枸杞根提取物对皮肤瘙痒小鼠炎性因子的影响结果(图19)显示，与空白组相比，瘙痒模型组小鼠IL-1β、IL-6、IL-13、TNF-α及IL-18分泌显著增加而IL-10分泌被显著减少。说明，DCNB暴露诱发小鼠严重的炎症反应进而使小鼠受到炎性损伤。而枸杞根提取物治疗后，与模型组比，枸杞根提取物组IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-18含量显著减少，IL-10含量增加。进一步的分析实验数据显示，枸杞根提取物对DCNB暴露诱发的IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-18过量分泌的抑制活性，对DCNB暴露诱发的IL-10表达分泌抑制活性，高于同等浓度条件下的枸杞根多酚衍生物-4及市售枸杞根提取物。本部分数据再次验证，枸杞根多酚衍生物可通过协同作用发挥抗炎活性。
Claims (10)
1.由枸杞根通过活性追踪法制备的、下述结构式中式I至式V所示的枸杞根多酚衍生物之一：
2.一种枸杞根提取物，该枸杞根提取物是采用包括如下步骤的方法制备的：
(1)将新鲜枸杞根粉碎；
(2)粉碎后的枸杞根用乙醇-水进行渗漉提取；
(3)合并减压浓缩步骤(2)所得的提取液，得到浸膏；
(4)将步骤(3)得到的浸膏溶于乙醇中，并与硅胶混合搅拌均匀，得到混合物；
(5)将步骤(4)所得的混合物于旋转蒸发仪中在35-45℃的温度下旋蒸，除去乙醇，得到浸膏-硅胶吸附混合物；
(6)将步骤(5)所得的浸膏-硅胶吸附混合物通过硅胶柱层析分离，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，得到若干馏分；
(7)构建2,4-二硝基氯苯(DNCB)诱导的正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)的损伤模型，评价步骤(6)所得各馏分的活性；
(8)将步骤(7)中具有最佳保护活性的馏分进一步用凝胶柱分离，并采用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，得到若干馏分；
(9)基于DNCB诱导的NHDF细胞损伤模型，评价步骤(8)所得各馏分的保护活性；
其中，步骤(9)中具有最佳保护活性的馏分即为枸杞根提取物。
3.一种制备如权利要求1中所述枸杞根多酚衍生物的方法，该方法包括：
A、提供如权利要求2所述的枸杞根提取物；
B、将步骤A中的枸杞根提取物用制备型HPLC分离纯化得式I所示的枸杞根多酚衍生物-1、式II所示的枸杞根多酚衍生物-2、式III所示的枸杞根多酚衍生物-3、式IV所示的枸杞根多酚衍生物-4以及式V所示的枸杞根多酚衍生物-5。
4.如权利要求2或3所述的制备方法，其中，步骤(2)中所采用的乙醇-水为15％-75％的乙醇，优选为20％-60％的乙醇，更优选为25％-35％的乙醇。
5.一种用于抗炎、止痒的枸杞根多酚衍生物的组合物，该枸杞根多酚衍生物的组合物包括如权利要求1中所述的式I至式V所示的枸杞根多酚衍生物中的至少一种。
6.如权利要求5所述的组合物，其中，该组合物包括式I至式V所示的枸杞根多酚衍生物，且式I至式V所示的各枸杞根多酚衍生物的质量比控制为1:(1-100):(1-100):(1-100):(1-100)，优选控制为1:(1-50):(1-50):(1-50):(1-50)，最优选为1:4.5:13.5:8:3。
7.权利要求2中所述的枸杞根提取物或权利要求5-6之一中所述的枸杞根多酚衍生物的组合物在制备抗炎、止痒类化妆品或药品中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其中，所述的应用是通过提高NHDF细胞活力、抑制NHDF细胞内ROS含量、抑制NHDF细胞炎性细胞因子分泌、抑制NHDF细胞NLRP3炎症小体激活、和/或抑制NHDF细胞NF-κB信号通路激活而实现的。
9.如权利要求7所述的应用，其中，所述的抗炎、舒缓类化妆品或药品为外用制剂，其形式为喷剂、慕斯、膏剂、乳剂、或液体制剂。
10.如权利要求7所述的应用，其中，抗炎所涉及的炎症是皮肤炎症，包括皮肤干燥症、皮炎、荨麻疹、湿疹、和浅部真菌感染。
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