JP5144540B2 - 血小板産生促進因子及びその利用 - Google Patents
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Description
<1> 植物、動物、及び微生物の少なくともいずれかの抽出物乃至その処理物であって、下記一般式(1)で示される化合物を、精製を行なっていない前記植物、動物、及び微生物の少なくともいずれかの抽出物における濃度よりも高濃度で含み、血小板形成促進活性を有することを特徴とする抽出物乃至その処理物である。
<2> 一般式(1)で示される化合物が、少なくとも、下記一般式(2)で示される化合物及び下記一般式(3)で示される化合物のいずれかである前記<1>に記載の抽出物乃至その処理物である。
<3> 一般式(1)で示される化合物が、少なくとも、下記化学式(1)から(4)で示される化合物のいずれかである前記<1>から<2>のいずれかに記載の抽出物乃至その処理物である。
<5> 精製されたものである前記<1>から<4>のいずれかに記載の抽出物乃至その処理物である。
<6> 巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成の促進作用を有する組成物であって、前記<1>から<5>のいずれかに記載の抽出物乃至その処理物を含むことを特徴とする組成物である。
<7> 巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成の促進作用を有する組成物であって、一般式(1)で示される化合物を含むことを特徴とする組成物である。
<8> 巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成の促進作用を有する組成物であって、下記一般式(4)で示される化合物を含むことを特徴とする組成物である。
<9> X、R5、及びYが、それぞれ下記である、前記<8>に記載の組成物である。
(XはO又はNR6であり、R5は1から2個のOHで置換されたC2からC3のアルキル基であり、YはOH又はC1からC2のアルコキシ基又はF、Cl又はBrである。)
<10> 食品、栄養補助食品、食品添加物又は医薬品である、前記<6>から<9>のいずれかに記載の組成物である。
<11> 一般式(4)で示される化合物(ただし、X=Oの場合、R5はOH又は1−グリセリル基ではない)である。
<12> X、R5、及びYが、それぞれ下記である、前記<11>に記載の化合物である。
(XはO又はNR6であり、R5は1から2個のOHで置換されたC2からC3のアルキル基であり、YはOH又はC1からC2のアルコキシ基又はF、Cl又はBrである。)
<13> 下記化学式(5)から(11)のいずれかで示されることを特徴とする化合物である。
<15> 前記<1>から<5>のいずれかに記載の抽出物乃至その処理物、或いは一般式(1)で示される化合物を巨核球系細胞に接触させることを特徴とする、巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成を促進させる方法である。
<16> 一般式(1)で示される化合物の巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成の促進作用を指標として行うことを特徴とする、被検試料の巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成の促進作用を評価する方法である。
本発明は、下記一般式(1)で示される化合物を含む、植物、動物、及び微生物の少なくともいずれかの抽出物乃至その処理物を提供する。
前記一般式(1)において、Xは酸素、イオウ、スルホニル基、又は置換基を有していてもよいイミノ基を示し、該置換基はアシル基、置換されていてもよいアミノ基、又は置換スルホニル基である。破線は二重結合の存在を示し、シスでもトランスでもよい。また環状構造の一部でもよい。n及びmはそれぞれメチレンの数で1〜18の整数を示す。R1及びR2はそれぞれ酸素又はH2を示す。R3は水素、それぞれ置換基を有していてもよい低級アルキル基、アリール基、アラルキル基、又は薬学的に許容され得る塩を形成する陽イオンを示す。
前記抽出物は、精製を行なっていない前記植物、動物、及び微生物の少なくともいずれかの抽出物における濃度よりも、上記一般式(1)で示される化合物を高濃度で含むことを特徴とする。ここで「精製を行なっていない前記植物、動物、及び微生物の少なくともいずれかの抽出物」とは、植物、動物、又は微生物から、通常の抽出操作(例えば、植物、動物、又は微生物を粉砕又は破砕して、水、エタノール、メタノール、アセトン又はこれらの混合物と、室温又は冷却或いは加熱下で接触させ、ろ過後、ろ液の溶媒を溜去する方法)で有効成分を抽出した段階のものであって、精製操作により有効成分が濃縮されていないものを意味する。
前記動物、植物、微生物の種類としては、前記一般式(1)で示される化合物を得ることが可能なものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピーナッツ(ラッカセイ;Arachis hypogaea)などが挙げられる。また、前記動物、植物、微生物としては、その全体を使用してもよいし、一部を使用してもよく、例えば、前記ピーナッツを用いる場合には、その種皮を特に好適に使用することができる。また、前記動物、植物、微生物は、新鮮なもの又は処理を加えたもののいずれであってもよいが、中でも、乾燥させたもの又は焙煎させたものが望ましい。また、前記動物、植物、微生物は、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
前記抽出物乃至その処理物は、例えば、前記動物、植物、及び微生物の少なくともいずれかを、水、エタノール、又は含水エタノール、或いは有機溶剤で抽出、濃縮して得られる抽出物、及び、ここで得られる抽出物をアクリル系、スチレン系、メタクリル系、又は芳香族系合成吸着剤に吸着させ、10〜95%濃度までの含水エタノールで溶出されてくる画分を濃縮して得られる抽出物、及び、その抽出物を乾燥して得られる抽出物等でありうる。また、前記抽出物乃至その処理物は、前記のようにして得られた各抽出物等に、任意の処理を加えて得られる処理物等でありうる。また、前記抽出物乃至その処理物は、前記動物、植物、及び微生物の少なくともいずれかの抽出物に、合成された前記化合物(前記一般式(1)で示される化合物)が添加されたものであってもよい。また、より具体的には、前記抽出物乃至その処理物は、後述する実施例に示す方法等により製造することができる。
前記抽出物乃至その処理物は、精製を行なっていない植物、動物、及び微生物の抽出物における濃度よりも、上記一般式(1)で示される化合物を高濃度で含むことを特徴とし、このため優れた巨核球胞体突起形成/血小板形成促進作用を有しうる。前記抽出物乃至その処理物においては、少なくとも前記化学式(1)から(4)で示される化合物のいずれかの濃度が、通常、0.001質量%以上(例えば、0.002質量%以上、0.005質量%以上)であり、より好ましくは0.01質量%以上(例えば、0.02質量%以上、0.05質量%以上)であり、更に好ましくは0.1質量%以上(例えば、0.2質量%以上、0.5質量%以上、1質量%以上)である。また、前記抽出物乃至その処理物における前記化学式(1)から(4)の化合物の合計であれば、通常、0.004質量%以上(例えば、0.01質量%以上、0.015質量%以上、0.03質量%以上)であり、より好ましくは0.04質量%以上(例えば、0.05質量%以上、0.1質量%以上、0.3質量%以上)であり、更に好ましくは0.4質量%以上である。
前記抽出物乃至その処理物中の前記化合物の含量は、例えば高性能液体クロマトグラフィーで分析し、分光光学的に275nm〜285nmの範囲で測定することができる。
本発明は更に、前記した本発明の抽出物乃至その処理物を含み、巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成(巨核球胞体突起形成/血小板形成)の促進作用を有する組成物を提供する。また、本発明は更に、他の態様において、上記一般式(1)で示される化合物を含み、巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成の促進作用を有する組成物を提供する。
本発明の組成物における、上記一般式(1)で示される化合物としては、下記一般式(4)で示される化合物であることが好ましい。
R5で示される好ましいアルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、s−ブチル、t−ブチル、シクロブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、2−ヒドロキシエチル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロパンー2−イル、2,3−ジヒドロキシプロピル、2,4−ジヒドロキシブチル、2,5−ジヒドロキシペンチル、2,6−ジヒドロキシヘキシル、又はペンタエリスリトリルが挙げられる。
特に好ましい具体的な化合物としては、上記化学式(1)から(4)の化合物及び下記化学式(5)から(11)に記載の化合物であり、巨核球系細胞における胞体突起形成/血小板形成促進作用の高さの点で、化学式(6)の化合物が最も好ましい。
本発明は、一般式(4)で示される化合物の中に含まれる新規化合物を提供する。本発明の新規化合物は、より詳しくは、上記一般式(4)で示される化合物において、「X=Oの場合において、R5がOH又は1−グリセリル基である化合物」を除く化合物である。本発明の新規化合物の好ましい具体例としては、上記化学式(5)から(11)で示される化合物が挙げられ、これらは、巨核球系細胞における胞体突起形成/血小板形成促進作用に優れる点で、有利である。化学式(6)で示される化合物は、当該作用が高い点で、最も好ましい。
前記組成物は、例えば、食品、栄養補助食品、食品添加物、又は医薬品でありうる。
例えば、前記組成物が医薬品組成物である場合は、種々の剤形とすることができる。前記医薬品組成物をヒトに投与するときの投与方法は特に限定されるものではないが、経口投与が好ましい。例えば、経口投与のためには、前記医薬品組成物の剤形を錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤等とすることができるが、これらに限定されない。また、前記医薬品組成物には薬剤的に許容できる種々の担体を加えることができる。例えば、前記担体としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、コーティング剤、ビタミンC、抗酸化剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
前記組成物は、食品、栄養補助食品、又は食品添加物の形態とすることもできる。前記食品、栄養補助食品、食品添加物の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、後述する実施例で得られるようなピーナッツ種皮抽出物や前記一般式(1)で示される化合物を各種原材料に適宜配合することにより、麺類、パン、キャンディー、ゼリー、クッキー、スープ、クリーム、バター、健康飲料、錠果、カプセル状等の形態とすることができる。
前記した本発明の抽出物乃至その処理物、或いは前記一般式(1)で示される化合物(例えば、前記化学式(1)から(11)で示される化合物)は、その巨核球系細胞の胞体突起形成又は血小板形成の促進作用を利用して、上記した利用例(食品、栄養補助食品、食品添加物、医薬品等)以外にも種々の応用が可能である。例えば、血小板再生医療等の目的のために、in vitro或いはex vivoで培養された巨核球系細胞の胞体突起形成又は血小板形成を促進させるために利用することができる。また、前記一般式(1)で示される化合物(例えば、化学式(1)から(11)で示される化合物)を対照として、各種試料における、in vitroやin vivo(例えば、ヒトや、マウス、ラットなどの非ヒト動物)での巨核球系細胞の胞体突起形成又は血小板形成の促進作用を評価することも可能である。
従って、本発明は、上記抽出物乃至その処理物、或いは前記一般式(1)で示される化合物を、巨核球系細胞に接触させることを特徴とする、巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成を促進させる方法、並びに、一般式(1)で示される化合物の巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成の促進作用を指標として行うことを特徴とする、被検試料の巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成の促進作用を評価する方法、をも提供するものである。
このようにして選定した活性物質の候補化合物につき分離精製を試みたが、ある精製段階になると、この活性物質の候補化合物は非常に不安定な性状を示した。このため通常の方法によりこの活性物質の候補化合物を同定することは困難であると考えられた。そこで、次に、この活性物質の候補化合物のLCMS及びLCMS/MSを精査して、共通して現れるピークの、MSスペクトラム及びMS/MSスペクトラムの解析を行った。この解析結果から、この活性物質の候補化合物に共通して構成されると考えられる部分構造を示すマススペクトルのピークを特定することができたため、そのピークを、元のピーナッツ種皮エキスから見出した。このピークをもとに、この活性物質の候補化合物を下記の各方法で単離・精製し、その構造を決定した。
250kgのピーナッツ種皮に含水エタノール3500Lを加え、ろ過し、抽出液を得た。抽出液を60℃にて減圧濃縮し、約1/30容量まで濃縮後、噴霧乾燥を行い、固形物としてピーナッツ種皮エキス40kgを得た。
ピーナッツ種皮エキス400gを30%エタノール500mLに溶解して、酢酸エチル900mLを加えた。続いて水100mLとn−ヘキサン300mLを加えて室温で30分間攪拌し、1次抽出を行った。上層の有機層を取り出した後、酢酸エチル200mLとn−ヘキサン200mLを加えて2次抽出を行った。
1次抽出液と2次抽出液を合わせて200gのシリカゲルを用いてクロマトグラフィーを行った。最終的に酢酸エチル/n−ヘキサン1:1の混合溶液で溶出を行い、溶出物から溶媒を瑠去し固形物として8.83gを得た。
更にこの固形物を200gのシリカゲルを用いてクロマトグラフィーにより精製し、酢酸エチル/n−ヘキサン(1:2)溶出部として274.9mgを得た。
更に酢酸エチル/n−へキサン(1:1)の混合溶液の溶出部1.0gを、数回に分けてHPLCリサイクルシステムを用いて精製した。使用したカラムはYMC−Pack C18 20 i.d.x150mmを用いて、検出波長275nm、移動層として0.001%トリフルオロ酢酸を含む70%アセトニトリル、流速15mL/minで各ピークが完全に分離されるまでリサイクルを行った。
その結果、化合物3[(9Z,11E)−13−oxo−octadecadienoic acid]の白色粉末41.0mg及び化合物4[(10E,12Z)−9−oxo−octadecadienoic acid]の白色粉末69.0mgを得た。
1H−NMR(CDCl3,400MHz)、σ:0.91(t,J=6.9,3H),1.33(m,10H),1.43(m,2H),1.63(m,2H),2.3(dt,J=6.58,7.52Hz,2H),2.35(t,J=7.46Hz,2H),2.55(t,J=7.35Hz,2H),5.91(dt,J=7.8,10.7Hz,1H),6.10(q,J=10.93,11.20Hz,1H),6.17(d,J=15.1Hz,1H),7.50(ddd,J=0.5,11.60,15.11Hz,1H),13C−NMR(CDCl3,100MHz),σ:14.22,22.70,24.48,24.81,28.56,29.08,29.26,29.26,29.28,31.60,34.14,41.20,127.11,129.53,137.36,142.98,179.72,201.35,EI−MS(positive mode)m/z(%):67(33),81(79),95(92),151(100),166(97),223(64),276(8),294(27)、ESI−MS(positive mode):m/z=295.3[M+H]+、UV(0.1%HCOOH含有60%アセトニトリル):278.7nm。
1H−NMR(CDCl3,400MHz)、σ:0.91(t,J=6.9,3H),1.33(m,10H),1.43(m,2H),1.63(m,2H),2.3(dt,J=6.58,7.52Hz,2H),2.35(t,J=7.46Hz,2H),2.55(t,J=7.35Hz,2H),5.91(dt,J=7.8,10.7Hz,1H),6.10(q,J=10.93,11.20Hz,1H),6.17(d,J=15.1Hz,1H),7.50(ddd,J=0.5,11.60,15.11Hz,1H),13C−NMR(CDCl3,100MHz),σ:14.22,22.70,24.48,24.81,28.56,29.08,29.26,29.26,29.28,31.60,34.14,41.20,127.11,129.53,137.36,142.98,179.72,201.35,EI−MS(positive mode)m/z(%):67(33),81(79),95(92),151(100),166(97),223(64),276(8),294(27)、ESI−MS(positive mode):m/z=295.3[M+H]+、UV(0.1%HCOOH含有60%アセトニトリル):278.7nm。
実施例1で得られたピーナッツ種皮エキス1.0gを、25%エタノール100mLに溶解し、合成吸着樹脂XAD−7(ローム・アンド・ハース社製)20mLに通液させ、有効成分を吸着させた後、水20mLを流し糖質などの水溶性物質を除去した。その後、85%エタノール40mLで脱離し有効成分を含む画分を集め、60℃にて減圧濃縮し、約1/10容量まで濃縮後、凍結乾燥を行い、ピーナッツ種皮抽出物を固形物として0.56g得た。
9.34kgのピーナッツ種皮に含水エタノール184Lを加え、室温で2時間攪拌後ろ過し、抽出液を得た。抽出液を60℃にて16Lまで減圧濃縮後、水18L及び85%エタノール46Lを加えて25%エタノール濃度にし、XAD7樹脂32Lに通液した。XAD7樹脂は85%エタノール64Lを通液して吸着物を溶離させた。溶離液は60℃にて減圧濃縮を行い、約4Lまで濃縮した。濃縮液を噴霧乾燥し、固形物としてピーナッツ種皮エキス950gを得た。
ピーナッツ種皮(100g)に水(2L)を加え室温で10時間攪拌した後、水をろ過し、残渣に75%エタノール(1.6L)を加え室温で10時間攪拌し、ろ過してろ液を得た。ろ過残渣に50%エタノール(1.6L)を加え室温で10時間攪拌し、ろ過した。ろ液を合わせて減圧下で濃縮乾固し、乾燥エキス5.6gを得た。このエキス(100.6mg)を50%エタノール(15mL)に溶解し、合成吸着樹脂XAD−7(ローム・アンド・ハース社製)(20mL)に吸着し、水(20mL)で洗い、その後85%エタノール(40mL)で溶出し、減圧下で濃縮乾燥し、濃縮エキス(42mg)を得た。表1に、得られた濃縮エキス中の化合物1の含量を示し、また、実施例1で得たエキスと、実施例2−3で得られたエキスの血小板様粒子形成の促進作用を比較し示した。
文献(D.Martiniら,Biocatalysis,11(1994)47−63)に記述されている方法に従って、linoleic acid 1.02gをホウ酸緩衝液(pH 11)30mLに加えて純酸素気流下、温度を5℃に保ちながらSoy−bean lipoxygenase(Sigma−Aldrich社製)140mgを加えて激しく撹拌する。3時間反応後、氷水で冷やしながら30mLのエタノールと水20mLを加える。この溶液に1.4gのNaBH4を撹拌しながら序々に加える。2時間反応後、反応溶液に酢酸エチル10mLを加える。氷水で冷やし、撹拌しながら注意深く2N−HCl水溶液を序々に加えて反応溶液をpH3とする。反応溶液を分液ロートに移し、酢酸エチルを用いて2回抽出する。酢酸エチル層はNa2SO4を用いて乾燥、ろ過する。ろ液にPh3P 230mgを加えて0℃で一晩放置する。40℃にて減圧濃縮し、約1/10容量まで濃縮後に100gのシリカゲルを用いてクロマトグラフィーを行う。最終的にn−ヘキサン/酢酸エチル(2:1)の混合溶液で溶出された(9Z,11E)−13−hydroxy−octadecadienoic acid 721mgを得た。続いて(9Z,11E)−13−hydroxy−octadecadienoic acid 99.0mgをジクロロメタン1mLに溶解、氷冷下Dess−Martin periodinane(Sigma−Aldrich社製)206mgを加えて10分間撹拌する。この反応溶液にn−ヘキサン/酢酸エチル(2:1)混合溶液2mLを加えてシリカゲル60gを用いてクロマトグラフィーを行い、化合物3[(9Z,11E)−13−oxo−octadecadienoic acid]白色粉末85.4mgを得た。
1H−NMR(CDCl3,400MHz)σ:0.9(t,J=7.1,3H),1.33(m,10H),1.42(m,2H),1.63(m,2H),2.3(dt,J=6.58,7.69Hz,2H),2.35(t,J=7.4Hz,2H),2.55(t,J=7.4Hz,2H),5.9(dt,J=7.82,10.69Hz,1H),6.12(q,J=10.93,11.20Hz,1H),6.18(d,J=15.32Hz,1H),7.49(ddd,J=0.7,11.51,15.31Hz,1H).13C−NMR(CDCl3,100MHz)σ:14.15,22.70,23.96,24.82,28.48,29.04,29.12,29.12,29.38,31.71,34.11,41.41,127.20,129.55,137.25,142.74,179.49,201.56.EI−MSm/z(%):67(49),81(100),95(71),151(78),177(24),223(43),238(21),276(10),294(29)。
ESI−MS(positive mode,カラム:YMC−Pack Pro C18,4.6 i.d.x150mm,移動層0.1%HCOOH含有60%アセトニトリル,1mL/min):保持時間12min,m/z=295.3[M+H]+.ESI−MS/MS(negative mode)m/z(%):293(26),249(5),195(10),179(3),139(10),113(100).UVλmax(0.1%HCOOH含有60%アセトニトリル):279.7nm。
(D.Martiniら,Biocatalysis,11(1994)47−63(Syn)、G.Iacazioら,Chem.Phys.Lipids,138(2003)115−121(Syn,NMR,UV)、及び、C.Dufourら,Chem.Phys.Lipids,138(2005)60−68(NMR,MS,UV)参照)
文献(G.Iacazioら,Chem.Phys.Lipids,138(2003)115−121)に記述されている方法に従って、linoleic acid17.2gを大気下、室温で激しく撹拌した。9日間反応後、300mlのエタノールを加えた。氷水で冷やしながら、この溶液に3.3gのNaBH4を撹拌しながら序々に加えた。20分反応後、反応溶液に蒸留水300mlを加えた。氷水で冷やし、撹拌しながら注意深く2N−HCl水溶液を序々に加えて反応溶液をpH3とした。反応溶液を分液ロートに移し、酢酸エチルを用いて2回抽出した。酢酸エチル層はNa2SO4を用いて乾燥、ろ過した。ろ液にトリフェニルフォスフィン(Ph3P)400mgを加えて4℃で一晩放置した。40℃にて減圧濃縮し、約20gまで濃縮後に400gのシリカゲルを用いてクロマトグラフィーを行った。最終的にヘキサン/酢酸エチル(4:1)で溶出された9−及び13−Hydroxy−octadecadienoic acidの4種混合物2.17gを得た。続いてこの4種混合物をジクロロメタン50mlに溶解、氷冷下Dess−Martin periodinane(Sigma−Aldrich社製)4.68gを加えて1時間撹拌した。この反応溶液にヘキサン200mlを加えて、シリカゲル140gを用いてクロマトグラフィーを行い、9−及び13−Oxo−Octadecadienoic acidの4種混合物1.89gを得た。
更にこの4種混合物を数回に分けて、HPLCリサイクルシステムを用いて精製した。使用したカラムはYMC−Pack C18 20x150mmを用いて、検出波長275nm、移動相として0.001%トリフルオロ酢酸を含む70%アセトニトリル、流速15ml/minで、各ピークが完全に分離されるまでリサイクルを行った。
その結果、化合物4[(10E,12Z)−9−oxo−octadecadienoic acid]の白色粉末22mgを得た。
1H−NMR(CDCl3,400MHz)、σ:0.9(t,J=6.9,3H),1.33(m,10H),1.43(m,2H),1.63(m,2H),2.3(dt,J=6.58,7.52Hz,2H),2.35(t,J=7.46Hz,2H),2.55(t,J=7.35Hz,2H),5.9(dt,J=7.8,10.7Hz,1H),6.10(q,J=10.93,11.20Hz,1H),6.19(d,J=15.1Hz,1H),7.50(ddd,J=0.5,11.60,15.11Hz,1H),13C−NMR(CDCl3,100MHz),σ:14.23,22.71,24.48,24.82,28.56,29.09,29.26,29.26,29.29,31.60,34.11,41.21,127.11,129.54,137.34,142.97,179.48,201.31,EI−MS(positive mode)m/z(%):67(34),81(84),95(64),151(86.7),166(100),223(46),276(12),294(41)、ESI−MS(positive mode):m/z=295.3[M+H]+、UV(0.1%HCOOH含有60%アセトニトリル):278.7nm。
実施例1で行ったシリカゲルを用いたクロマトグラフィーの後、更に80%エタノールにて撹拌抽出した。この操作を数回繰り返した抽出液を集め、溶媒を留去し、固形物として197gを得た。
この固形物100gをYMC−ODS 600gを用いてクロマトグラフィーにより精製し、80%エタノール溶出部として14.37gを得た。
更にこの溶出部について、数回のシリカゲルを用いたクロマトグラフィーを行い、溶出液として酢酸エチル、或いは、酢酸エチル/ヘキサン(2:1)の混合液で精製を行い、油性物質として179mgを得た。
この油性物質を、数回に分けてHPLCリサイクルシステムを用いて精製した。使用したカラムはYMC−Pack C18 20x250mmを用いて、検出波長275nm、移動層として50%アセトニトリル、流速10ml/minで、各ピークが完全に分離されるまでリサイクルを行った。
その結果、化合物1[1−[(9Z,11E)−13−Oxo−octadecadienoyl]−glycerol]8.3mg及び化合物2[1−[(10E,12Z)−9−oxo−octadecadienoyl]−glycerol]13.9mgを得た。
得られた化合物1[1−[(9Z,11E)−13−oxo−octadecadienoyl]−glycerol]及び化合物2[1−[(10E,12Z)−9−oxo−octadecadienoyl]−glycerol]の各種スペクトルデータは以下の通りである。
1H−NMR(CDCl3,400MHz)、σ:0.9(t,J=6.9,3H),1.33(m,10H),1.43(m,2H),1.62(m,4H),2.32(m,4H),2.45(t,J=7.4Hz,2H),3.61(dd,J=5.9,11.4Hz,1H),3.70(dd,3.9,11.4Hz,1H),3.94(m,1H),4.15(dd,6.0,12.7Hz,1H),4.21(dd,4.6,12.7Hz,1H),5.91(m,1H),6.13(d,J=11.1Hz,1H),6.16(d,J=15.3Hz,1H),7.49(dd,J=12.0,15.3Hz,1H),13C−NMR(CDCl3,100MHz),σ:14.21,22.70,24.35,25.02,28.57,28.98,29.14,29.19,29.23,31.60,34.33,41.16,53.60,65.40,70.48,127.10,129.53,137.44,143.01,174.43,201.43,EI−MS(positive mode)m/z(%):67(51),81(91),95(90),151(100),166(92),223(13),276(76),277(95),297(22),334(41),350(38),368(18)、ESI−MS(positive mode):m/z=369.3[M+H]+、UV(0.1%HCOOH含有60%アセトニトリル):280.7nm。
1H−NMR(CDCl3,400MHz)、σ:0.9(t,J=6.9,3H),1.33(m,10H),1.43(m,2H),1.62(m,4H),2.32(m,4H),2.45(t,J=7.4Hz,2H),3.61(dd,J=5.9,11.4Hz,1H),3.70(dd,3.9,11.4Hz,1H),3.94(m,1H),4.15(dd,6.0,12.7Hz,1H),4.21(dd,4.6,12.7Hz,1H),5.91(m,1H),6.13(d,J=11.1Hz,1H),6.16(d,J=15.3Hz,1H),7.49(dd,J=12.0,15.3Hz,1H),13C−NMR(CDCl3,100MHz),σ:14.21,22.70,24.35,25.02,28.57,28.98,29.14,29.19,29.23,31.60,34.33,41.16,53.60,65.40,70.48,127.10,129.53,137.44,143.01,174.43,201.43,EI−MS(positive mode)m/z(%):67(51),81(91),95(90),151(100),166(92),223(13),276(76),277(95),297(22),334(41),350(38),368(18)、ESI−MS(positive mode):m/z=369.3[M+H]+、UV(0.1%HCOOH含有60%アセトニトリル):280.7nm。
実施例3で得た(9Z,11E)−13−Oxo−octadecadienoic acid(化合物3)45.2mg(0.153mmole)にglycerol 6.2g(67mmole)、リパーゼG 50(Amano Enzyme Inc.Aichi Japan)4.3mg、水50μlを加えて室温、2日間攪拌した。反応液をアセトンで3回抽出、アセトンを濃縮し、酢酸エチルを加えてシリカゲルカラムに吸着、酢酸エチルを用いて流出した。酢酸エチル溶液を濃縮し、つづいてシリカゲルに吸着し、溶出溶媒はヘキサン:酢酸エチル1:2でクロマトを行い、1−O−[(9Z,11E)−13−oxo−octadecadienoyl]glycerol(化合物1)を17mg(0.046mmole)、収率30%で得た。最終的にはYMC−Pack ODS カラム(20mmx250mm)を用いてリサイクルHPLCクロマト、溶出溶媒 50% アセトニトリル−水を用いて行い、化合物1の純品10mgを得た。
実施例3で得た(9Z,11E)−13−Oxo−octadecadienoic acid(化合物3)200mg(0.680mmole)のアセトニトリル 700μlの溶液に氷冷下、Et3N 300mg、Me3N−HCl 31.2mg(0.328mmole)を加えて10分間撹拌する。反応液を−10〜−15℃に冷却してMe−SO2Cl 156.0mg(1.36mmole)のアセトニトリル 700μl溶液を加えて30分間撹拌する。続いてglycerol 63mg(0.68mmole)、DMAP 83mg(0.68mmole)を加えて反応液を−10〜−15℃に保って1時間撹拌する。
反応終了後反応液に水を加えてエーテルで抽出する。水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥、溶媒を留去した。続いて酢酸エチル/ヘキサン(1:1)を加えてシリカゲルカラムに吸着、酢酸エチル/ヘキサン(1:1)を用いて流出、溶媒を留去すると粗1−O−[(9Z,11E)−13−oxo−octadecadienoyl]glycerol(化合物1)を180mg(0.118mmole)、収率72%で得た。さらに精製するためにはYMC−Pack ODS カラム(20mmx250mm)を用いてリサイクルHPLCクロマト、溶出溶媒 50% アセトニトリル−水を用いて行い、化合物1の純品75mgを得た。
実施例3で得られた化合物3を出発原料として、(2S)−3−amino―1、2−dihydroxypropane、(2R)−3−amino―1、2−dihydroxypropane、1,2−dihydroxyethane、2−amino―1−hydroxyethane、2−amino―1,3−dihydroxypropane、bis−(2−hydroxyethyl)amineをそれぞれ実施例5−3と同様に反応させて化合物5〜化合物11を合成した。得られた化合物の収率及び血小板形成促進作用の指標であるplatelet−like particle(PLP)形成促進作用の最小有効量を表2に示す。PLP形成促進作用とは、すなわち以下のようにして評価した。1x105cells/mLに調製したMEG−01細胞に対して、滅菌ミリQ水/エタノール混液(1:1)にあらかじめ溶解した得られた化合物を培養液に添加後、10nM PMAで2から4日間分化誘導した。培養後細胞懸濁液をそれぞれ100μL分収し、Z1 Coulter Particle Counter(BEKMAN COALTER社製)を用いて対照群(PMA単独)及び得られた化合物処理群の血小板分画と巨核球分画をそれぞれカウントした。データは平均値±標準誤差(N=4−6)で表記し、統計解析は一元配置分散分析法並びに多重比較を行った。対照群と比較し有意にPLP形成を促進させた最小濃度を最小有効量とした。また得られた化合物の物理恒数を表3に示す。
恒常的にPLP形成を起こす特性を有する巨核球芽細胞株であるMEG−01細胞を継代培養し、実験に供した。Cell trackTM Orange(Molecular Probe社製)で細胞を指標(40μM/106cells)し、滅菌ミリQ水/エタノール混液(1:1)にあらかじめ溶解した実施例2で得たピーナッツ種皮抽出物(化合物1〜4を高濃度に含む)を培養液に添加後、10nM ホルボールミリステートアセテート(PMA:フナコシ社製)処理し4日間分化誘導した。得られたPLPの画像をCCDカメラよりコンピューターに取り込んだ後、画像処理し、ImageSXMソフトウエアでPLPを計測解析し解析を行った。得られたデータは平均値±標準誤差(例数:N=4−6)で表記した。統計解析は一元配置分散分析法並びに多重比較を行った。
1x105cells/mLに調製したMEG−01細胞に対して、滅菌ミリQ水/エタノール混液(1:1)にあらかじめ溶解した実施例2で得たピーナッツ種皮抽出物を培養液に添加後、10nM PMAで2から4日間分化誘導した。培養後細胞懸濁液をそれぞれ100μL分収し、Z1 Coulter Particle Counter(BEKMAN COALTER社製)を用いて対照群(PMA単独)及びピーナッツ種皮エキス抽出物処理群の血小板分画と巨核球分画をそれぞれカウントした。得られたデータは平均値±標準誤差(N=4−6)で表記し、統計解析は一元配置分散分析法並びに多重比較を行った。
巨核芽球株化細胞であるMEG−01細胞を継代培養し、実験に供した。Igarashiらの報告(Nature 367 568 1994)に準じ、チキンβグロビンエンハンサー領域のNFE2サイトのオリゴヌクレオチドの3重繰り返し配列を、TATA boxを有するpTAL−ルシフェラーゼ発現ベクターのNheI−BglIIサイトに挿入し、pMARE−ルシフェラーゼベクターを構築した。エレクトロポレーション法(amaxa社製)により内部標準としてphRT−TKベクターをpNFE2−ルシフェラーゼと共に遺伝子導入し、実施例2で得たピーナッツ種皮抽出物の共存下で培養後細胞を溶解し、発現したルシフェラーゼの蛍光活性をDual−luciferase Reporter Assay System(promega社製)を用い測定した。
Satoらの方法(Br.J.Haematol.121 315 2003)に準じ、CD34+細胞より巨核球並びに血小板への分化誘導を行った。すなわち、健常妊婦出産で得られた臍帯血より密度勾配遠心法により単核球分画し、CD34+cell selection system(Dynal社製)によりCD34+細胞を純化し、トロンボポイエチン(TPO)及びc−kit リガンド(KL)存在下で培養した。培養後、抗−CD41−FITC抗体並びにDAPI(又はPI、7−ADD)染色後、FACS(Caliber、LSR、Aria;日本ベクトンディッキンソン社製)により測定し、CELLQUEST或いはFACSDiVaソフトウエアを用いて解析を行った。なお臍帯血はインフォームドコンセントの得られた妊産婦より得た。
MEG−01細胞の培養液に、滅菌ミリQ水/エタノール混液(1:1)にあらかじめ溶解した化合物3[(9Z,11E)−13−oxo−octadecadienoic acid]を添加後、10nM PMAで2日間分化誘導した。培養後、細胞懸濁液をそれぞれ100mL分収し、Z1 Coulter Particle Counter(BEKMAN COALTER社製)を用いて対照群(PMA単独)及び化合物3[(9Z,11E)−13−oxo−octadecadienoic acid]処理群の血小板分画と巨核球分画をそれぞれカウントした。得られたデータはmean±SE (N=4)で表記し、統計解析は一元配置分散分析並びに多重比較を行った。
化合物3[(9Z,11E)−13−oxo−octadecadienoic acid]を指標として、実施例2で得たピーナッツ種皮抽出物、及び実施例1で得た酢酸/n−ヘキサン(1:2)で得た画分のPLP形成促進作用を比較した。実施例2で得られた抽出物及び施例1で得られた酢酸/n−ヘキサン(1:2)で得た画分の比活性は、それぞれ1μg/mLあたり化合物3〔(9Z,11E)−13−oxo−octadecadienoic acid〕、25ng Eq/mL及び11ng Eq/mLであり、化合物3〔(9Z,11E)−13−oxo−octadecadienoic acid〕を指標として血小板様粒子促進物質の活性比較が可能であることが示された。
Cell trackTM Orange(Molecular Probe社製)で細胞を指標(40μM/106cells)し、滅菌ミリQ水/エタノール混液(1:1)にあらかじめ溶解した化合物1〔1−[(9Z,11E)−13−oxo−octadecadienoyl]−glycerol〕、化合物2〔1−[(10E,12Z)−9−oxo−octadecadienoyl]−glycerol〕及び化合物4[(10E,12Z)−9−Oxo−octadecadienoic acid]を培養液に添加後、10nM ホルボールミリステートアセテート(PMA:フナコシ社製)処理し2日間分化誘導した。得られたPLPの画像をCCDカメラよりコンピューターに取り込んだ後、画像処理し、ImageSXMソフトウエアでPLPを計測解析し解析を行った。得られたデータは平均値±標準誤差(例数:N=6)で表記した。統計解析は一元配置分散分析法並びに多重比較を行った。
実施例1で得たピーナッツ種皮抽出物をマウスに経口投与して血小板増加作用を調べた。
マウスはMF飼料(オリエンタル酵母)、飲水として水道水を、自由摂取させ、明暗サイクル9時点灯、21時消灯で、室温25℃±5で飼育した。14日間の予備飼育後、体重を測定し、体重が均一になるようにランダムに2群にわけた。
投与検体としてPEXTを0.5%CMCに懸濁して調整し、7−9週零のICR系雄性マウス(日本エスエルシー)を対照群(n=8)とPEXT投与群(n=7)にわけた。PEXT投与群にはPEXT150mg/10mL/kgを1日1回5日間連続経口投与した。対照群には0.5%CMC水溶液10mL/kgを1日1回5日間連続経口投与した。
エーテル麻酔下でUNOPETTEを使用してretro−orbitalより採血した。コールターカウンターCounter Z1(BECKMAN COULTER)を使用して、血小板数を測定した。ビュルケル・チュルク型血球計算盤C−Chip(iN CYTO)を使用して,白血球数を測定した。測定日毎にstudent’s t−testを行い、対照群と比較した。
体重は投与中及び休薬5日目まで対照群に比べ変化を示さなかった。
上記一般式(1)において、R1が芳香族環を有する下記誘導体は、次の方法により合成することができる。
実施例3で得られた化合物3又は化合物4又は上記芳香環誘導体を出発原料として、アルキルチオール化合物をそれぞれ実施例5−3と同様に反応させてXがSである化合物が合成できる。またXがSO、SO2の化合物はXがSである化合物をメタクロルパーベンゾイックアシッド、過酸化水素などの酸化剤と反応させることにより合成することが出来る。
Claims (14)
- ピーナッツ種皮の抽出物乃至その処理物であって、下記化学式(1)又は(2)で示される化合物を、精製を行なっていない前記ピーナッツ種皮の抽出物における濃度よりも高濃度で含み、血小板形成促進活性を有することを特徴とする抽出物乃至その処理物。
- 更に、下記化学式(3)又は(4)で示される化合物を含む請求項1に記載の抽出物乃至その処理物。
- 少なくとも化学式(1)から(4)で示される化合物のいずれかを0.001質量%以上の濃度で含むか、又は、化学式(1)から(4)で示される化合物の合計を0.004質量%以上の濃度で含む請求項1から2のいずれかに記載の抽出物乃至その処理物。
- 精製されたものである請求項1から3のいずれかに記載の抽出物乃至その処理物。
- 巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成の促進作用を有する組成物であって、請求項1から4のいずれかに記載の抽出物乃至その処理物を含むことを特徴とする組成物。
- 巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成の促進作用を有する組成物であって、下記一般式(4)で示される化合物を含むことを特徴とする組成物。
- X、R 5 、及びYが、それぞれ下記である、請求項6に記載の組成物。
(XはO又はNR 6 であり、R 5 は1から2個のOHで置換されたC2からC3のアルキル基であり、YはOH又はC1からC2のアルコキシ基又はF、Cl又はBrである。) - 食品、栄養補助食品、食品添加物又は医薬品である、請求項5から7のいずれかに記載の組成物。
- 患者の巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成を促進するための医薬である、請求項5から8のいずれかに記載の組成物。
- 下記一般式(4)で示されることを特徴とする化合物。
- X、R 5 、及びYが、それぞれ下記である、請求項10に記載の化合物。
(XはO又はNR 6 であり、R 5 は1から2個のOHで置換されたC2からC3のアルキル基であり、YはOH又はC1からC2のアルコキシ基又はF、Cl又はBrである。) - 一般式(4)が、下記化学式(5)から(11)のいずれかで示される請求項10から11のいずれかに記載の化合物。
- 請求項1から4のいずれかに記載の抽出物乃至その処理物、或いは請求項10から12のいずれかに記載の化合物をin vitroで巨核球系細胞に接触させることを特徴とする、巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成を促進させる方法。
- 非ヒト動物或いはin vitroで請求項10から12のいずれかに記載の化合物の巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成の促進作用を指標として行うことを特徴とする、被検試料の巨核球系細胞における胞体突起形成又は血小板形成の促進作用を評価する方法。
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