WO2012164969A1

WO2012164969A1 - 置換フェナントレン化合物を有効成分とするがんを予防および／または治療するための医薬組成物

Info

Publication number: WO2012164969A1
Application number: PCT/JP2012/051949
Authority: WO
Inventors: 直史向田; 弘行石橋; 剛史谷口
Original assignee: 国立大学法人金沢大学
Priority date: 2011-05-30
Filing date: 2012-01-30
Publication date: 2012-12-06
Also published as: JP2014156403A

Abstract

【課題】公知のがん細胞増殖抑制効果を有する置換フェナントレン化合物と比較して、優れたがん細胞増殖抑制効果を有する置換フェナントレン化合物を含む医薬組成物を提供することである。【解決手段】下記式（I)の置換フェナントレン化合物が、公知のがん細胞増殖抑制効果を有する置換フェナントレン化合物と比較して、優れたがん細胞増殖抑制効果、さらには副作用を有さないことを見出したことを基にして、本発明を完成するに至った。

Description

置換フェナントレン化合物を有効成分とするがんを予防および／または治療するための医薬組成物

　本発明は、置換フェナントレン化合物を有効成分とするがんを予防および／または治療するための医薬組成物に関する。
　なお、本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本国特許出願の特願2011-121088からの優先権を請求する。

　発がん機構の分子機構の解明の進展に伴い、発がん機構に密接に関与している分子、なかでもシグナル伝達分子を標的とした、いわゆる分子標的薬剤の開発が近年盛んに行われている。分子標的薬剤の標的となりうるシグナル伝達分子は、正常細胞では発現がほとんど認められないのに対して、がん細胞では発現が亢進しており、かつ、がん細胞の増殖過程に必須の役割を果たしている。現在までに開発されている分子標的薬剤は、このような条件を満たしている増殖因子レセプターそのものあるいはその下流に位置するチロシン・キナーゼを標的としている。

　本発明者らのグループは、マウス肝がん発症モデルでの遺伝子発現パターンを解析し、正常の肝臓組織では発現が認められないセリン／スレオニン・キナーゼ活性を保有する原がん遺伝子であるPim-3の発現が、マウスの肝臓での前がん病変以降の段階で亢進していて、ヒト肝がん病変でも同様のPim-3の発現亢進が認められることを明らかにした（非特許文献１)。さらに、ヒト肝がん細胞株でのPim-3の発現をRNAiにて抑制すると、アポトーシスの亢進を伴う細胞周期進行が遅延することから、Pim-3が肝がん細胞株での細胞増殖過程に関与している可能性を想定するに至った。この際、それまで決定されていなかったヒトPim-3 cDNAの全塩基配列も決定された。

　肝臓と同様に内胚葉由来の臓器であるヒト膵臓・大腸・胃においても正常ではPim-3蛋白が検出されないにも関わらず、大腸がん・胃がん・肝がんの約50％の症例で、膵がんの全症例で、Pim-3蛋白の発現が亢進しており、これらのがん細胞株においても、Pim-3の発現を抑制すると、アポトーシスの亢進を伴って細胞周期進行が遅延することも見出された（非特許文献２、３）。以上の結果は、Pim-3が内胚葉由来臓器がん、なかでも膵がんの発がん過程にも関与していて、これらのがんに対する治療における標的分子であることを示唆している。Pim-3が好アポトーシス分子であるBadの第112番目のセリン残基を選択的にリン酸化して、不活化することによってアポトーシスを抑制していることも明らかとなった（非特許文献２、３）。

　PimファミリーとしてはPim-1・Pim-2の存在が報告されており、両者ともにBadの第112番目のセリン残基をリン酸化することが報告されている。さらにPim-1は活性中心を含めてPim-3と高い相同性を示すことも、cDNAの全塩基配列の解析から明らかになっている。

　本発明者らは、置換フェナントレン化合物のPim-1、Pim-2およびPim-3活性への影響を酵素免疫学的方法にて検討したところ、これらの活性を有意に阻害することを見出し、さらに該化合物ががん細胞株のvitroでの増殖も抑制することを見出した（特許文献１）。

　しかしながら、上記記載の置換フェナントレン化合物は、in vivoでのがん細胞増殖抑制効果を示していないという問題があった。

特開2011-16754

Int. J. Cancer 114: 209-218, 2005 Cancer Res. 66: 6741-6747, 2006 Cancer Sci. 98 : 321-328, 2007

　本発明は、上記した問題点を解決することを解決すべき課題とした。より詳しくは、本発明は、公知のがん細胞増殖抑制効果を有する置換フェナントレン化合物と比較して、優れたがん細胞増殖抑制効果を有する置換フェナントレン化合物を含む医薬組成物を提供することである。

　本発明者らは、「候補置換フェナントレン化合物が、公知のがん細胞増殖抑制効果を有する置換フェナントレン化合物と比較して、優れたがん細胞増殖抑制効果、さらには副作用を有さないこと」を見出したことを基にして、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明は以下の通りである。
「１．以下の式（I）の置換フェナントレン化合物、またはその塩、溶媒和物、若しくは生理学的に機能性の誘導体を有効成分として含む、がんを予防および／または治療するための医薬組成物。

　２．前記がんは、膵臓がん、胃がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、骨髄がん、副腎がん、皮膚がん、メラノーマ、肺がん、小腸がん、前立腺がん、精巣がん、子宮がん、乳がんまたは卵巣がんである、前項１に記載の医薬組成物。
　３．前記がんは膵臓がんである、前項２に記載の医薬組成物。」

　本発明では、公知の置換フェナントレン化合物を含む医薬組成物と比較して、優れたがん細胞増殖抑制効果、さらには副作用を有さない置換フェナントレン化合物を含む医薬組成物を提供することができた。

（１）T26による細胞増殖アッセイの結果（実施例７）、（２）各ヒト膵癌細胞株でのIC50値（実施例７）。各置換フェナントレン化合物のIC50値（実施例７）。（１）T26添加によるヒト膵臓癌細胞系であるMiapaca-2の細胞周期の割合（実施例８）、（２）T26添加によるヒト膵臓癌細胞系であるPCI66の細胞周期の割合（実施例８）。 T26添加によるヒト膵臓癌細胞系の各タンパク質の発現量（実施例８）。（１）（２）T26添加によるヒト膵臓癌細胞系のアポトーシス細胞の割合（実施例８）。 T26投与スケジュール（実施例９）。（１）T26投与による体重変化（実施例９）、（２）T26投与による腫瘍量の変化（実施例９）。（１）ＰＣＮＡ-３-陽性細胞数の測定結果、（２）切断カスパーゼ-３-陽性細胞数の測定結果、（３）ＣＤ３１陽性（postive）血管野範囲の測定結果（実施例９）。血液パラメーター及び生化学的パラメーターの測定結果（実施例９）。各生化学的パラメーターの測定結果（実施例９）。

　本発明は、以下の式（I）で表される置換フェナントレン化合物（3-ヒドロキシ-2,6-ジメトキシフェナントレン-9-カルボン酸メチル、「T26」と称する場合がある）、またはその塩、溶媒和物、若しくは生理学的に機能性の誘導体を有効成分として含む、がんを予防および／または治療するための医薬組成物に関する。

（置換フェナントレン化合物の合成方法）
　置換フェナントレン化合物は、公知の方法で製造可能である。例えば、Pande, H.; Bhakuni, D, S. J. C. S. Perkin I 1976, 2197、ならびにBremmer, M. L.; Khatri. N. A.: Weinreb, S. M. J. Org. Chem. 1983, 48, 3661に記載される方法、特開2011-16754（特許文献１）で開示されている置換フェナントレン化合物（No.5、T19、T19-1,2）の合成方法により合成することができる。各置換フェナントレン化合物の構造式は、以下の通りである。

｛式（I）の化合物の合成方法｝
　本発明の式（I）で表される置換フェナントレン化合物である3-ヒドロキシ-2,6-ジメトキシフェナントレン-9-カルボン酸メチルは、公知の方法で製造可能である。例えば、Cui, M.; Wang, Q. Eur. J. Org. Chem. 2009, 5445-5451、並びにGoksu, S.; Kazaz, C.; Sutbeyaz, Y.; Secen, H. Helv. Chim. Acta 2003, 86, 3310-331を参照することができる。

（本発明の置換フェナントレン化合物の特性）
　本発明の式（I）で表される置換フェナントレン化合物は、下記実施例７により、公知の置換フェナントレン化合物と比較して、優れたがん細胞増殖抑制効果を示す（参照：図２）。
　さらに、本発明の式（I）で表される置換フェナントレン化合物は、下記実施例９により、副作用を有さないことを確認している（参照：図７～１０）。
　加えて、本発明の式（I）で表される置換フェナントレン化合物は、下記実施例８により、がん細胞のG2/Mアレストの誘導及び／又はアポトーシスの誘導によりがん細胞増殖抑制効果を示すことを確認している（参照：図３）。

（本発明の置換フェナントレン化合物の形態）
　本発明の置換フェナントレン化合物は、１以上の形態で結晶化する（これは多型として知られる）ことがあり、かかる多型形態は本発明の範囲内にある。多型は一般に、温度、圧力またはその両方の変化に応じて生じる。多型は、当技術分野で既知の物理的特性、例えばX線回折パターン、溶解性、および融点により識別することができる。
　さらに、本発明の置換フェナントレン化合物は、１以上のキラル中心を有する、または多数の立体異性体として存在することができる。本発明の範囲は、異性体（例えば、立体異性体、位置異性体、幾何異性体又は光学異性体）の混合物ならびに精製された異性体を包含する。

（本発明の置換フェナントレン化合物の塩）
　本発明の置換フェナントレン化合物の塩は、通常、製薬上許容される塩である。「製薬上許容される塩」とは、本発明の化合物の無毒性の塩をさす。本発明の化合物の塩には、酸付加塩が含まれる。代表的な塩としては、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、炭酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、ホウ酸塩、エデト酸カルシウム塩、カンシル酸塩、クラブラン酸塩、クエン酸塩、エジシル酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、マレイン酸一カリウム塩、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩/二リン酸塩、カリウム塩、サリチル酸塩、ナトリウム塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、トシル酸塩、三ヨウ化エチル塩、トリメチルアンモニウム塩、および吉草酸塩が挙げられる。

（溶媒和物）
　本明細書において「溶媒和物」とは、溶質（本発明の置換フェナントレン化合物、またはその塩もしくは生理学的に機能性の誘導体）および溶媒により形成される錯体をさす。溶媒の例としては、限定するものではないが、水、メタノール、エタノール、および酢酸が挙げられる。

（生理学的に機能性の誘導体）
　本明細書において「生理学的に機能性の誘導体」とは、哺乳動物への投与時に、本発明の置換フェナントレン化合物またはその活性な代謝産物を（直接または間接的に）提供することのできる本発明の置換フェナントレン化合物のあらゆる製薬上許容される誘導体を言う。かかる誘導体、例えばエステルおよびアミド類は、過度の実験を要することなく当業者には自明である（Burger's Medicinal Chemistry And Drug Discovery, 第5版, Vol 1: Principles and Practice）。

（がんを予防および／または治療）
　本発明の置換フェナントレン化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能性の誘導体は、がんの予防および／または治療において有効である。本発明の置換フェナントレン化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能性の誘導体の有効量をそれを必要とする患者に投与することにより、がんを予防および／または治療することができる。

（有効量）
　本明細書において「有効量」とは、例えば研究者または臨床医の望む、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する化合物の量を意味する。本発明の置換フェナントレン化合物の有効量は、例えば、患者の年齢、体重、重症度、製剤の性質、および投与経路に依存する。哺乳動物、特にヒトの治療のための式（I）の化合物の有効量は、通常、0.1～100 mg/kg/日、例えば0.1～10 mg/kg/日の範囲である。

（本発明の医薬組成物が対象とするがん）
　本発明において、がんには、膵臓がん、胃がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、骨髄がん、副腎がん、皮膚がん、メラノーマ、肺がん、小腸がん、前立腺がん、精巣がん、子宮がん、乳がんまたは卵巣がんが包含される。
　本発明のがんを予防および／または治療するための医薬組成物は、特に膵臓がんの予防および／または治療に有効である。本発明の置換フェナントレン化合物は、Pim-1、Pim-2およびPim-3のすべての活性を阻害する作用を有することから、本発明のがんを予防および／または治療するための医薬組成物は、Pim-1、Pim-2および／またはPim-3の発現亢進が認められるがんにおいて特に有効である。本発明の置換フェナントレン化合物は、Pim-1、Pim-2およびPim-3の活性阻害剤としても使用できる。

（本発明の医薬組成物における予防）
　本発明において疾患の予防には、疾患の発症を抑えることおよび遅延させることが含まれ、疾患になる前の予防だけではなく、治療後の疾患の再発に対する予防も含まれる。本発明において疾患の治療には、疾患を治癒すること、症状を改善することおよび症状の進行を抑えることが包含される。

（本発明の医薬組成物の投与対象）
　本発明の医薬組成物の投与対象は、好ましくは、哺乳動物である。本明細書において哺乳動物は、温血脊椎動物をさし、例えば、ヒトおよびサルなどの霊長類、マウス、ラットおよびウサギなどの齧歯類、イヌおよびネコなどの愛玩動物、ならびにウシ、ウマおよびブタなどの家畜が挙げられる。本発明の医薬組成物は、霊長類、特にヒトへの投与に好適である。

（担体）
　本発明の医薬組成物は、式（I）で表される化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能性の誘導体と、１以上の製薬上許容される担体を含む。製薬上許容される担体とは、一般的に、本発明の有効成分とは反応しない、不活性の、無毒の、固体または液体の、増量剤、希釈剤またはカプセル化材料等をいい、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、植物性油などの溶媒または分散媒体などが挙げられる。

（本発明の医薬組成物の形態）
　本発明の医薬組成物は、経口により、非経口により、例えば、皮膚に、皮下に、粘膜に、静脈内に、動脈内に、筋肉内に、腹腔内に、膣内に、肺に、脳内に、眼に、および鼻腔内に投与される。経口投与製剤としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、チュアブル剤、ペレット剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤および吸入剤などが挙げられる。非経口投与製剤としては、坐剤、保持型浣腸剤、点滴剤、点眼剤、点鼻剤、ペッサリー剤、注射剤、口腔洗浄剤ならびに軟膏、クリーム剤、ゲル剤、制御放出パッチ剤および貼付剤などの皮膚外用剤などが挙げられる。本発明の医薬組成物は、徐放性皮下インプラントの形態で、または標的送達系（例えば、モノクローナル抗体、ベクター送達、イオン注入、ポリマーマトリックス、リポソームおよびミクロスフェア）の形態で、非経口で投与してもよい。

（添加剤）
　本発明の医薬組成物はさらに医薬分野において慣用の添加剤を含んでいてもよい。そのような添加剤には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤などがあり、必要に応じて使用できる。長時間作用できるように徐放化するためには、既知の遅延剤等でコーティングすることもできる。賦形剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、軽質無水ケイ酸、ゼラチン、結晶セルロース、ソルビトール、タルク、デキストリン、デンプン、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム等が使用できる。結合剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、エタノール、エチルセルロース、カゼインナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、精製水、ゼラチン、デンプン、トラガント、乳糖、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類等が挙げられる。抗酸化剤としては、トコフェロール、没食子酸エステル、ジブチルヒドロキシトルエン（BHT）、ブチルヒドロキシアニソール（BHA）、アスコルビン酸等が挙げられる。必要に応じてその他の添加剤や薬剤、例えば制酸剤（炭酸水素ナトリウム、炭酸マグネシウム、沈降炭酸カルシウム、合成ヒドロタルサイト等）、胃粘膜保護剤（合成ケイ酸アルミニウム、スクラルファート、銅クロロフィリンナトリウム等）を加えてもよい。

　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。なお、以下の全ての動物実験は、金沢大学動物実験規定に従って実施した。

｛3-ヒドロキシ-2,6-ジメトキシフェナントレン-9-カルボン酸メチル（T26）の合成｝
　本発明の式（I）で表される置換フェナントレン化合物である3-ヒドロキシ-2,6-ジメトキシフェナントレン-9-カルボン酸メチル（T26）（化合物５）の合成方法以下の通りである。

｛(E)-3-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-(4-methoxyphenyl)acrylic acid：(E)-3-(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)-2-(4-メトキシフェニル)アクリル酸（化合物3)｝
　バニリン (化合物1) （30.5 g, 200 mmol）、4-メトキシフェニル酢酸 (化合物2) （33.4 g, 201 mmol）、トリエチルアミン（70 mL, 502 mmol）および無水酢酸（110 mL, 1163 mmol）の混合物を24 時間加熱還流した。反応溶液を室温まで冷却後、水（100 mL）をゆっくり加えた。
　次いで、20%水酸化ナトリウム水溶液（500 mL）を加えた後、全ての固体が溶解するまで加熱還流を行った。反応溶液を室温まで冷却後、ジエチルエーテルで二回洗浄し、水層に濃塩酸を加えてpH 1にした。生じた沈殿を酢酸エチルから再結晶を行い、(E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-(4-methoxy- phenyl)acrylic acid (3)（40.9 g, 68%）を白色固体として得た。

｛(E)-Methyl 3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-(4-methoxyphenyl)acrylate： (3-(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)-2-(4-メトキシフェニル)アクリル酸 (E)-メチル（化合物4)｝
　(E)-3-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-(4-methoxyphenyl)acrylic acid (化合物3)（24.0 g, 80.0 mmol）のメタノール溶液（650 mL）に濃硫酸（20 mL）を加え、14時間加熱還流した。メタノールを減圧下で留去して得られた固体をジクロロメタンに溶解させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ―（石油エーテル―酢酸エチル, 2:1）で精製し、(E)-methyl 3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-(4- methoxyphenyl)acrylate (化合物4)（24.5 g, 97%）を白色固体として得た。

｛Methyl 3-hydroxy-2,6-dimethoxyphenanthrene-9-carboxylate：3-ヒドロキシ-2,6-ジメトキシフェナントレン-9-カルボン酸メチル (化合物5) (T-26)｝
　(E)-Methyl 3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-(4-methoxyphenyl)acrylate（20.0 g, 63.7 mmol）のジクロロメタン溶液（1300 mL）に無水塩化鉄（36.9 g, 22.3 mmol）を0 °Cで加えた後、同じ温度で2時間撹拌した。反応溶液を水で三回洗浄した後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン）で精製し、3-ヒドロキシ-2,6-ジメトキシフェナントレン-9-カルボン酸メチル(化合物5) (T-26)（16.1 g, 81%）を白色固体として得た。なお、NMRデータにより目的の化合物が合成できていることを確認した。

｛6,7-ジメトキシナフタレン-2-カルボン酸（化合物９）及び6,7-ジヒドロキシナフタレン-2-カルボン酸 (10)の合成｝
　6,7-ジメトキシナフタレン-2-カルボン酸（化合物９）（T-26）及び6,7-ジヒドロキシナフタレン-2-カルボン酸 (10) (T-27)の合成方法以下の通りである。

｛2,3-Dimethoxynaphthalene: 2,3-ジメトキシナフタレン(化合物7)｝
　2,3-Dihydroxynaphtalene (化合物6)（2.00 g, 12.5 mmL）のアセトン溶液（30 mL）に炭酸カリウム（3.80 g, 27.5 mmol）を加え、次いで硫酸ジメチル（3.46 g, 27.5 mmol）をゆっくり滴下し、22時間還流した。反応液を室温まで冷却した後にろ過し、減圧下で溶媒を留去した。残渣に水を加え、ジクロロメタンで三回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下で濃縮した。得られた固体に対してヘキサン―酢酸エチル混合溶媒から再結晶を行い、2,3-dimethoxy- naphthalene (化合物7)（1.45 g, 62%）を白色固体として得た。

{2-Acetyl-6,7-dimethoxynaphthalene：2-アセチル-6,7-ジメトキシナフタレン(化合物8)}
　2,3-Dimethoxynaphthalene (化合物7)（1.45 g, 7.72 mmol）のジクロロエタン溶液（23 mL）に塩化アセチル（727 mg, 9.26 mmol）を0 °Cで加えた後、塩化アルミニウム（2.78g, 20.8 mmol）を少しずつ加え、同じ温度で7.5時間撹拌した。反応液に10%塩酸を加え、ジクロロメタンで三回抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン―酢酸エチル，4;1）で精製し、1-acetyl-6,7-dimethoxynaphthalene（472 mg, 27%）と2-acetyl-6,7-dimethoxynaphthalene (化合物8)（831 mg, 47%）をそれぞれ無色結晶として得た。

｛6,7-Dimethoxynaphthalene-2-carboxylic acid ：6,7-ジメトキシナフタレン-2-カルボン酸(化合物9) (T-20) ｝
　水酸化ナトリウム（408 mg, 10.2 mmol）の水溶液（1.5 mL）に臭素（506 mg, 3.16 mmol）を0 °C でゆっくり加えた後、2-acetyl-6,7-dimethoxynaphthalene (化合物8) （235 mg, 1.21 mmol）のテトラヒドロフラン溶液（2 mL）を加え、室温で 8時間撹拌した。水層を有機層と分離し、水層に氷と亜硫酸ナトリウム（200 mg）を加えた後、15% 塩酸を加えてpHを3以下にした。生じた沈殿をろ取して、水で洗浄して6,7-dimethoxynaphthalene-2-carboxylic acid（化合物9）（119 mg, 51%）を白色固体として得た。なお、NMRデータにより目的の化合物が合成できていることを確認した。

｛6,7-Dihydroxynaphthalene-2-carboxylic acid：6,7-ジヒドロキシナフタレン-2-カルボン酸(化合物10) (T-27)｝
　6,7-dimethoxynaphthalene-2-carboxylic acid（化合物9）（100 mg, 0.431 mmol）のジクロロメタン溶液（7 mL）に三臭化ホウ素を－78 °Cで加えた後、室温で2時間撹拌した。反応液に水（30 mg, 1.72 mmol）を加えて撹拌した後、減圧下で溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン―メタノール, 10:1）で精製し、6,7-dihydroxynaphthalene-2-carboxylic acid (化合物10) (61 mg, 68%)を白色固体として得た。なお、NMRデータにより目的の化合物が合成できていることを確認した。

｛2,3,6-トリメトキシフェナントレン-9-カルボン酸（T19）の合成｝
　2,3,6-トリメトキシフェナントレン-9-カルボン酸（T19）（化合物16）の合成方法以下の通りである。

(E)-3-(2-ブロモ-4,5-ジメトキシフェニル)-2-(4-メトキシフェニル)アクリル酸(化合物13)の合成
　4-メトキシフェニル酢酸 (8.38 g, 50.5 mmol) のテトラヒドロフラン（50 ml）溶液にカリウムtert-ブトキシド (5.76 g, 51.4 mmol) を加え、混合物を室温で3 時間撹拌し化合物11を調製した。溶媒 (テトラヒドロフラン) を留去し、2-ブロモ-4,5-ジメトキシベンズアルデヒド (化合物12) と酢酸無水物 (60 ml) を加え、混合物を 105 ℃で15 時間加熱した。熱水 (120 ml) を加え、混合物を室温で一晩撹拌し、結晶をろ取した。ろ液をクロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、乾燥したのち溶媒を留去した。残さと結晶を合わせ、エタノール／ヘキサンから再結晶すると化合物13 (12.92 g, 70%) が得られた。

メチル(E)-3-(2-ブロモ-4,5-ジメトキシフェニル)-2-(4-メトキシフェニル)アクリレート (化合物14)の合成
　化合物 13 (12.22 g, 31.0 mmol) のアセトニトリル (95 ml) 溶液に1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]-7-ウンデセン (7.5 ml, 50.2 mmol) とヨードメタン (9.5 ml, 153.0 mmol)を室温で加え、混合物を室温で 3時間撹拌した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液で薄め、エチルエーテルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥後、溶媒を留去した。残さをヘキサン／酢酸エチルで再結晶すると化合物 14 (12.33 g, 97%) が得られた。

メチル2,3,6-トリメトキシフェナントレン-9-カルボキシレート (化合物15)の合成
　化合物 14 (5.96 g, 14.6 mmol) の還流トルエン (110 ml) 溶液に、水素化トリブチルスズ (6.0 ml, 22.3 mmol) と1,1'-アゾビス(シクロヘキサン-1-カルボニトリル) (2.16 g, 8.84 mmol) のトルエン (70 ml) 溶液を1時間かけて滴下した。混合物を更に3時間加熱還流したのち、溶媒を留去し、残さを10%のフッ化カリウムを含むシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製すると化合物15 (3.53 g, 74%)が得られた。

2,3,6-トリメトキシフェナントレン-9-カルボン酸 (化合物16) (T19)の合成
　化合物 15 (275 mg, 0.675 mmol) をメタノール (4.4 ml) とテトラヒドロフラン (11 ml) に溶解し、10%水酸化ナトリウム水溶液 (2.2 ml) を加え、60 ℃ で１時間撹拌した。放冷後、反応液に 10% 塩酸を加え酸性とし、塩化メチレンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、乾燥し、溶媒を留去した。残渣をヘキサン／酢酸エチルから再結晶すると化合物16 (252 mg. 96%) が得られた。なお、NMRデータにより目的の化合物が合成できていることを確認した。

｛2,3,6-トリメトキシフェナントレン-10-カルボン酸（T19-1）の合成｝
　2,3,6-トリメトキシフェナントレン-10-カルボン酸（T19-1）（化合物22）の合成方法は以下の通りである。

(E)-2-(2-ブロモ-4,5-ジメトキシフェニル)-3-(4-メトキシフェニル)アクリル酸(化合物19)の合成
　p-アニスアルデヒド (19.9 ml, 0.164 mol) (化合物17) と 2-ブロモ-4,5-ジメトキシフェニル酢酸 (化合物18) (45.05 g, 0.164 mol) を無水酢酸 (82 ml) とトリエチルアミン (30 ml) の混液に室温で加え、混合物を 110 ℃ で 9 時間加熱した。水 (100 ml) を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をクロロホルムで抽出し、有機層を乾燥させ、溶媒を留去した。残さを 10% 水酸化ナトリウム水溶液に溶かし、エチルエーテルで抽出した。水層を 10% 塩酸で酸性にし、クロロホルムで抽出した。有機層を乾燥させ、溶媒を留去すると化合物 19 (37.01 g, 57%) が得られた。

メチル(E)-2-(2-ブロモ-4,5-ジメトキシフェニル)-3-(4-メトキシフェニル)アクリレート (化合物20)の合成
　化合物 19 (37.01 g, 0.094 mol) のアセトニトリル (130 ml) 溶液に1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]-7-ウンデセン (28.1 ml, 0.189 mol) とヨードメタン (39.3 ml, 0.631 mol) を室温で加え、混合物を室温で 3時間撹拌した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液で薄め、酢酸エチルで抽出した。有機層を乾燥したのち、溶媒を留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン／酢酸エチル, 3:1→2:1) を通したのち、溶媒を留去し、ヘキサン／酢酸エチルで再結晶すると化合物 20 (28.37 g, 75%)が得られた。

メチル2,3,6-トリメトキシフェナントレン-10-カルボキシレート (化合物21)の合成
　化合物 20 (8.00 g, 19.65 mmol) と1,1'-アゾビス(シクロヘキサン-1-カルボニトリル) (4.80 g, 19.64 mmol) の還流クロロベンゼン (110 ml) 溶液に、水素化トリブチルスズ (7.9 ml, 29.4 mmol) と1,1'-アゾビス(シクロヘキサン-1-カルボニトリル) (4.80 g, 19.64 mmol) のクロロベンゼン(70 ml) 溶液を2時間かけて滴下した。混合物を更に1時間加熱還流したのち、溶媒を留去し、残さを10%のフッ化カリウムを含むシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン／酢酸エチル, 1:1) で精製すると化合物21 (3.55 g, 56%)が得られた。

2,3,6-トリメトキシフェナントレン-10-カルボン酸 (化合物22)の合成
　化合物 21 (76 mg, 0.232 mmol)をメタノール (1.2 ml) とテトラヒドロフラン (3.0 ml) に溶解し、10%水酸化ナトリウム水溶液 (0.6 ml) を加え、60 ℃ で１時間撹拌した。放冷後、反応液に 10% 塩酸を加え酸性とし、塩化メチレンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、乾燥し、溶媒を留去した。残渣をヘキサン／酢酸エチルから再結晶すると化合物22(60.0 mg. 83%) が得られた。なお、NMRデータにより目的の化合物が合成できていることを確認した。

｛2,3,8-トリメトキシフェナントレン-10-カルボン酸（T19-2）の合成｝
　2,3,8-トリメトキシフェナントレン-10-カルボン酸（T19-2）（化合物27）の合成方法以下の通りである。

(E)-2-(2-ブロモ-4,5-ジメトキシフェニル)-3-(2-メトキシフェニル)アクリル酸 (化合物24)の合成
　o-アニスアルデヒド (0.725 ml, 6.00 mmol) (化合物23)と 2-ブロモ-4,5-ジメトキシフェニル酢酸 (化合物18) (1.65 g, 6.00 mmol) を無水酢酸 (6.0 m) とトリエチルアミン (3.0 ml) の混液に室温で加え、混合物を 110 ℃ で 4 時間加熱した。水 (20 ml) を加え、混合物を50 ℃で1時間撹拌した。反応混合物を塩化メチレンで抽出し、有機層を乾燥させ、溶媒を留去した。残さを 10% 水酸化ナトリウム水溶液に溶かし、エチルエーテルで抽出した。水層を 10% 塩酸で酸性にし、塩化メチレンで抽出した。有機層を乾燥させ、溶媒を留去した。残さをヘキサン／酢酸エチルで再結晶すると化合物 24 (997 mg, 42%) が得られた。

メチル(E)-2-(2-ブロモ-4,5-ジメトキシフェニル)-3-(2-メトキシフェニル)アクリレート (化合物25)の合成
　化合物 24 (997 mg, 2.54 mmol) のアセトニトリル (7.0 ml) 溶液に1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]-7-ウンデセン（0.570 ml, 3.81 mmol）とヨードメタン (0.791 ml, 12.7 mmol) を室温で加え、混合物を室温で 1時間撹拌した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、エチルエーテルで抽出した。有機層を乾燥したのち、溶媒を留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン／酢酸エチル, 3:1) を通したのち、溶媒を留去し、ヘキサン／酢酸エチルで再結晶すると化合物 25 (737 mg, 72%)が得られた。

メチル2,3,8-トリメトキシフェナントレン-10-カルボキシレート (化合物26)の合成
　化合物 25 (737 mg, 1.81 mmol) と1,1'-アゾビス(シクロヘキサン-1-カルボニトリル) (442 mg, 1.81 mmol) の還流クロロベンゼン (10 ml) 溶液に、水素化トリブチルスズ (0.732 ml, 2.72 mmol) と1,1'-アゾビス(シクロヘキサン-1-カルボニトリル) (442 mg, 1.81 mmol) のクロロベンゼン(5.0 ml) 溶液を3時間かけて滴下した。溶媒を留去し、残さを10%のフッ化カリウムを含むシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン／酢酸エチル) に通し、ヘキサン／酢酸エチルで再結晶すると化合物26 (230 mg, 39 %)が得られた。

2,3,8-トリメトキシフェナントレン-10-カルボン酸 (化合物27)の合成
　化合物 26 （180 mg, 0.552 mmol）をメタノール（2.8 ml）とテトラヒドロフラン（7.0 ml）に溶解し、10%水酸化ナトリウム水溶液（1.4 ml）を加え、60 ℃ で１時間撹拌した。放冷後、反応液に 10% 塩酸を加え酸性とし、塩化メチレンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、乾燥し、溶媒を留去した。残渣をヘキサン／酢酸エチルから再結晶する化合物27（130 mg, 76%）が得られた。なお、NMRデータにより目的の化合物が合成できていることを確認した。

（材料及び方法）
　以下の細胞、抗体、並びに統計分析手法を使用して実施例を行った。詳細は、以下の通りである。

（細胞系および抗体）
　ヒト膵臓癌細胞系であるＰＣＩ３５、ＰＣＩ５５、ＰＣＩ６６、ＰＡＮＣ-１及びMiapaca-2をＲＰＭＩ１６４０培地（Sigma Aldrich，ミズーリ州セントルイス）で培養した。Ｌ３．６ｐｌ細胞は、最小必須培地（Invitrogen Japan、日本国東京都）で維持した。全ての培地には、１０％ウシ胎仔血清（Biowest）、５０U／mlのペニシリンおよび５０U／mlのストレプトマイシン（Sigma Aldrich）を補充した。
　ウェスタンブロッティング分析には以下の抗体を使用した。
　マウス抗ヒトＢａｄおよびウサギ抗サイクリンＢ１抗体（Santa Cruz Biotechnology、カリフォルニア州サンタクルーズ）、ウサギ抗phospho-Ser¹¹²-Bad、抗カスパーゼ３、抗切断カスパーゼ３、抗Cdc25c、抗phospho-Ser²¹⁶-Cdc25c、抗切断カスパーゼ-９（Asp330）、抗phospho-Aurora A-Thr²⁸⁸／Aurora B-Thr²³²／Aurora C-Thr¹⁹⁸、抗Aurora B／AIM1（Cell Signaling Technology、マサチューセッツ州ビバリー）、抗Bcl-X_L（Medical and Biological Laboratories、日本国名古屋市）、抗β-アクチン抗体（Sigma-Aldrich）、マウス抗phospho-Ser¹⁰-Histone H3（Cell Signaling Technology）及びマウス抗チトクロムＣ（BD Biosciences、カリフォルニア州サンホゼ）抗体。

（統計分析）
　得られた全データを計算し、別段の指示が無い限り平均±ＳＤとして表した。差異は、一元配置分散分析を使用し、続いてTukey-Kramer試験を使用し、統計学的に分析した。ｐ＜０．０５は、統計上有意と考えた。

（細胞増殖アッセイ）
　3-ヒドロキシ-2,6-ジメトキシフェナントレン-9-カルボン酸メチル(T26)が、他の置換フェナントレン化合物と比較して、優れた癌細胞株の成長阻害効果を示すかを確認した。詳細は、以下の通りである。

　96穴細胞培養用マイクロテストプレート（Becton Dickinson）に各穴細胞数3,000のヒト膵癌細胞株（PCI55, MiaPaCa-2, PANC-1）を培地量100 μLで分注した。16～18時間培養後培地を除き、被検化合物を含む培地［0.1％ DMSO, T19,T19-1,T19-2,T26,T20,T21,T27及びT28（各化合物の濃度は、5,10,15,20,25μM)］を100 μL/穴で加えた。0、24、48、72、96時間培養を続け、経過後、被検化合物含有培地を除き、10％ WST-1（Roche）培地を100 μL/穴で加えた。さらに1時間培養後、マイクロプレートリーダー（モデル550、バイオ・ラッド）にて波長450nmの吸光度を測定した。なお培地としては、RPMI-1640培地（SIGMA）を用い、10% 仔牛血清（Invitrogen）、50 U/mL ペニシリンG（SIGMA）、50 μg/mL ストレプトマイシン（SIGMA）を加えた上で使用した。細胞株は、37℃、二酸化炭素濃度5%の炭酸ガス細胞培養装置（ESPEC）内で培養した。
　なお、IC50値は、ロジスティック回帰分析を使用して計算した。

（細胞増殖アッセイの結果）
　図１より、T26は濃度依存的にヒト膵癌細胞株（PCI55, MiaPaCa-2, PANC-1）の増殖を阻害した。
　図２より、T26は、他の置換フェナントレン化合物であるT19,T19-1,T19-2,T20,T21,T27及びT28と比較して、優れた癌細胞株の阻害効果を示した。

｛3-ヒドロキシ-2,6-ジメトキシフェナントレン-9-カルボン酸メチル（T26）の抗がん作用の確認｝
　T26は、どのような機構によりがん細胞の増殖を阻害していることを確認するために、細胞周期分析、細胞アポトーシス分析及びウェスタンブロッティング分析を行った。詳細は、以下の通りである。

（細胞周期分析）
　６cmプレートに細胞懸濁液（５×１０^５／５ml）を加え、３７℃で１８時間インキュベートした。次いで、所定の濃度の薬剤で細胞を処理し、さらに所定の時間間隔でインキュベートした。浮揚細胞と接着細胞を回収し、４℃の７０％エタノールで固定した。固定した細胞を５０μg／mlのヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Molecular Probes）および５μg／mlのRNase Aと共に３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、Cell Quest分析ソフトウェアを使用し、ＤＮＡ含有量をFACS Canto IIシステム（BD Biosciences）で分析した。

（細胞アポトーシス分析）
　薬剤で処理後、所定の時間間隔で、細胞を回収し、ヒトAnnexin V-FITCアポトーシスキット（Bender MedSsytems GmbH、オーストリア国ウィーン）とプロピジウムヨウ素（ＰＩ：propidium iodine）で染色した。各定量については、FACS Canto IIシステム（BD Biosciences）により少なくとも２０，０００個の染色細胞を分析した。

（ウェスタンブロッティング分析）
　１００mMの培養プレートに１．５×１０^６個のMiapaca-2またはＰＣＩ６６細胞を分注し、１８時間インキュベートした。薬剤を終濃度２０μMでプレートに加えた。所定の時間間隔で、完全プロテイナーゼ阻害薬混合物（Roche Diagnostics AG、スイス国Rotkreutz）を含むCellLytic^TM細胞溶解試薬（Sigma-Aldrich）５０μlに、浮揚細胞と接着細胞を懸濁し、超音波処理を使用し破砕した。遠心分離後、得られた上清（４０～６０μg）を免疫ブロットにかけた。抗β-アクチン抗体を使用し、等量のタンパク質が分析に使用されたことを確認した。LAS-4000 mini CDDカメラ（GE Healthcare Biosciences）を使用しシグナルを検出した。

（T26の抗がん作用の確認結果）
　図３により、T26添加用量依存的に、ヒト膵臓癌細胞系であるMiapaca-2およびＰＣＩ６６中のＧ２／Ｍ期中にある細胞の比率が増加し、そして交換的にＧ０／Ｇ１期の細胞の比率が減少したことを確認した。
　図４により、時間経過と共に、Cdc25Cの減少とリン酸化Cdc25Cの増加という、Ｇ２／Ｍ期の細胞進行に関わる分子の量の変動をみた。
　加えて、処理から２４時間後には、リン酸化BadならびにBcl-XLを減少させたが、全カスパーゼ-３にほとんど影響を与えることなく、チトクロムＣおよび切断カスパーゼ-３を増加したことを確認した。
　図５により、T26処理から時間経過と共に、初期アポトーシス細胞（Annexin V陽性及びＰＩ陰性）と後期アポトーシス細胞（Annexin V陽性及びＰＩ陽性）の比率が増加したことを確認した。
　以上により、T26は、がん細胞のG2/Mアレストの誘導及び／又はアポトーシスの誘導によりがん細胞増殖抑制効果を示すことを確認した。
　より詳しくは、T26は、Ｂａｄのリン酸化を防止できること、Bcl-XLを減少できること、ならびにチトクロムＣ-およびカスパーゼ-３依存方式で最終的にアポトーシスを誘発できると考えられる。

｛3-ヒドロキシ-2,6-ジメトキシフェナントレン-9-カルボン酸メチル（T26）の抗がん作用の確認｝
　T26の生体内腫瘍増殖に及ぼす影響を確認するために、T26が投与された担ガンマウスの体重及び腫瘍量、各陽性細胞を測定した。さらに、T26投与による副作用の有無について確認するために、T26が投与された担癌マウスの血液パラメーター及び生化学的パラメーターを測定した。詳細は、以下の通りである。

（動物実験）
　ヒト膵臓癌細胞系であるＰＣＩ６６細胞を２×１０^７細胞／mlの濃度でハンク平衡塩類溶液に懸濁し、細胞懸濁液１００μlをBALB／c nU／nuマウス（ＳＬＣ、日本国静岡県）の背に皮下注射した。腫瘍の注射から１４日後、２０mg／kgの用量の薬剤またはビヒクルを５日間１日１度、続いて２日おきに腹腔内注射した。このサイクルを延べ３回繰り返した（参照：図６）。３、４日毎にノギスを使用し腫瘍サイズを測定しつつ、腫瘍量を以下のように計算した。
　腫瘍量（mM^３）＝（最大径）（mM）×（最小径）^２（mM）／２
　腫瘍の注射から３６日後、腫瘍を除去すると同時に採血した。そして、公知の装置により、生化学的パラメーターであるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性、クレアチニン（Ｃｒｅ）濃度、血液尿素窒素（ＢＵＮ）濃度、血糖値（ＧＬＵ）濃度及び電解質（Na, Cl, K）濃度、並びに血液パラメーターである血球数（RBC）、血小板数（Platelets）、白血球数（WBC）、好中球濃度（Neutrophil）、好酸球濃度（Eosinophils）、好塩基球濃度（Basophil）、リンパ球濃度（Lymphocytes）及び単球濃度（Monocytes）を測定した。
　さらに、別の一連の実験では、腫瘍の注射から３６日後に腫瘍組織を除去し、抗増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）抗体（BD Biosciences）、抗切断カスパーゼ３（Cell Signaling Technology）、または抗ＣＤ３１抗体（BD Biosciences）を使用して、ＰＣＮＡ-３-陽性細胞数、切断カスパーゼ-３-陽性細胞数、及びＣＤ３１陽性（postive）血管野を定量した。

（動物実験結果）
　図７（１）により、T26が投与された担ガンマウスは、体重減少及び食欲不振が存在しないことを確認した。
　図７（２）により、ビヒクル処理された（DMSOが投与された）担ガンマウスは、進行性腫瘍増殖を示したことを確認した。一方、T26が投与された担ガンマウスの腫瘍増殖は顕著に遅延したことを確認した。
　図８により、T26投与３６日目では、腫瘍中のＰＣＮＡ陽性増殖性細胞数は著しく減少したが、交換的に切断カスパーゼ３陽性アポトーシス細胞数が増加したことを確認した。また、ＣＤ３１陽性血管野は、ビヒクル処理と比較して著しく減少したことを確認した。
　図９及び図１０により、血液パラメーターの一つである白血球数に関し、T26が投与された担ガンマウスは、ビヒクル処理された担ガンマウスと比較して、低い値を示しているが有意差は認められない上に、T26が投与された担ガンマウスの血中の白血球数は、正常範囲内である。なお、白血球数以外の血液パラメーターでは、T26が投与された担ガンマウスは、ビヒクル処理された担ガンマウスと比較して有意な差異はなかった。
　同様に、生化学的パラメーターに関し、T26が投与された担ガンマウスは、ビヒクル処理された担ガンマウスと比較して有意な差異はなかった。
　以上により、T26は、副作用（特に、肝機能及び血球数）を誘発することなく、生体内腫瘍増殖を抑制することができた。

（総論）
　本発明の医薬組成物は、公知の置換フェナントレン化合物を含む医薬組成物と比較して、優れたがん細胞増殖抑制効果、さらには副作用を有さない。加えて、本発明の医薬組成物は、G2/Mアレストの誘導及び／又はアポトーシスの誘導によりがん細胞増殖抑制効果を示すという特有の効果を有する。

　本発明によれば、優れたがん細胞増殖抑制効果、さらには副作用を有さない置換フェナントレン化合物を含む医薬組成物を提供することができる。

Claims

以下の式（I）の置換フェナントレン化合物、またはその塩、溶媒和物、若しくは生理学的に機能性の誘導体を有効成分として含む、がんを予防および／または治療するための医薬組成物。
前記がんは、膵臓がん、胃がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、骨髄がん、副腎がん、皮膚がん、メラノーマ、肺がん、小腸がん、前立腺がん、精巣がん、子宮がん、乳がんまたは卵巣がんである、請求項１に記載の医薬組成物。
前記がんは膵臓がんである、請求項２に記載の医薬組成物。