JP5723010B2 - 認知症の予防または治療用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、鐘馗水仙（Ｌｙｃｏｒｉｓ ａｕｒｅａ）抽出物、および／またはその分画物、および／または前記抽出物または分画物から分離された化合物リコリシジンおよびリコリシジノールの認知症の予防および／または治療用途に関する。

世界が漸次に老齢化社会に進入することに伴い、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病など各種脳疾患に苦しむ人が急増しており、その費用も天文学的な額がかかっている。アルツハイマーは、脳神経の一時的あるいは持続的な損傷により発生したもので、精神機能の全般的な障害が現れることを特徴とする進行性および退行性疾患である。まだ発病原因が正確に明らかになっていないが、老化と密接な関係があると知られている。老化過程でベータアミロイドという蛋白質が脳に蓄積されて絡まるようになるプラークを作り、これによってアルツハイマー病が発病すると知られている（Ｂｒｅｉｍｅｒ ＬＨ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ３２６：７４９−７５０， １９８７）。過去はアセチルコリンエステラーゼという酵素を主要薬品作用点にして認知症疾患治療のための研究が行われたが、現在、この酵素の活性抑制は、アルツハイマー病による認知症患者に現れるアセチルコリンという神経伝達物質の低下現象を抑制して正常的な生活が可能であるように誘導する役割に止まり、質病を起こす根本原因を除去するのではないと知られていた。

現在まで開発されたアルツハイマー病治療剤としてＦＤＡの承認を得たものは、アセチルコリンエステラーゼ抑制剤（ＡＣｈＥＩｓ：Ａｃｅｔｙｌ ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）とＮ−メチル（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ）Ｄ−アスパラギン酸（Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）収容体拮抗剤（ＮＭＤＡＲＡ）系統化合物であり、現在、多国籍製薬会社らを中心に１５個程度の治療剤が臨床試験中である。しかしながら、このような治療剤は、アルツハイマーの根本的な治療剤にはならないため、アルツハイマー疾患生成の主な原因と推定されるベータアミロイドの生成量を減少させるためにベータまたはガンマセクレターゼ阻害剤およびベータアミロイド凝集阻害剤の開発が要求される実情である。

ＷＯ２００８０７８３６２Ａ１

Ｂｒｅｉｍｅｒ ＬＨ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ３２６：７４９−７５０， １９８７ Ｌａｉｒｄ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２５：１１６９３−１１７０９，２００５ Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｎ ４１：２７−３３，２００４ Ｇａｂｒｉｅｌｓｅｎ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｄ． ５５：１５６９，１９９２ Ｍｏｎｄｏｎ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｂｅｒ． １０８：４４５，１９７５ Ｇｅｏｒｇｅ Ｒ． Ｔｅｔｔｉｔ ａｎｄ Ｊｏｙ Ａ． Ｂｅｌｌ， Ｊ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｄ ６９：７−１３，２００６ Ｓｈａｎｍｕｇｈａｍ Ｅｌａｎｇｏ ａｎｄ Ｙｕ−Ｈｓｉｎ Ｙａｎ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ ６７：６９５４−６９５９，２００２

本発明の一例は、鐘馗水仙の抽出物を有効性分として含有するベータアミロイド生成抑制用組成物を提供する。

他の例は、鐘馗水仙の抽出物を有効性分として含有する認知症の予防および／または治療用組成物および健康機能性食品を提供する。

他の例は、リコリシジン、リコリシジノールおよびこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選択された１種以上を有効性分として含有するベータアミロイド生成抑制用組成物を提供する。

他の例は、リコリシジン、リコリシジノールおよびこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選択された１種以上を有効性分として含有する認知症の予防および／または治療用組成物および健康機能性食品を提供する。

さらに他の例は、鐘馗水仙の抽出物のベータアミロイド生成抑制のための用途、またはベータアミロイド生成抑制剤製造のための用途を提供する。

さらに他の例は、鐘馗水仙の抽出物の認知症の予防および／または治療のための用途、または認知症の予防剤および／または治療剤製造のための用途を提供する。

さらに他の例は、リコリシジン、リコリシジノールおよびこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選択された１種以上のベータアミロイド生成抑制のための用途、またはベータアミロイド生成抑制剤製造のための用途を提供する。

さらに他の例は、リコリシジン、リコリシジノールおよびこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選択された１種以上の認知症の予防および／または治療のための用途、または認知症の予防剤および／または治療剤製造のための用途を提供する。

さらに他の例は、ベータアミロイド生成抑制を必要とする患者を確認する段階、および鐘馗水仙の抽出物を前記患者に投与する段階を含むベータアミロイド生成抑制方法を提供する。

さらに他の例は、認知症の予防および／または治療を必要とする患者を確認する段階、および鐘馗水仙の抽出物を前記患者に投与する段階を含む認知症の予防および／または治療方法を提供する。

さらに他の例は、ベータアミロイド生成抑制を必要とする患者を確認する段階、およびリコリシジン、リコリシジノールおよびこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選択された１種以上を前記患者に投与する段階を含むベータアミロイド生成抑制方法を提供する。

さらに他の例は、認知症の予防および／または治療を必要とする患者を確認する段階、およびリコリシジン、リコリシジノールおよびこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選択された１種以上を前記患者に投与する段階を含む認知症の予防および／または治療方法を提供する。

さらに他の例は、ベータアミロイド生成抑制、および／または認知症の予防および／または治療効果に優れた鐘馗水仙抽出物の製造方法を提供する。

本発明者らは、鐘馗水仙抽出物、および／またはその分画物、および／または前記抽出物または分画物から分離された化合物であるリコリシジノールおよびリコリシジンが試験管実験モデルでベータアミロイドの生成を抑制させることによって、認知症、特にアルツハイマー疾患の予防および／または治療効果を有することを確認して本発明を完成した。

ベータアミロイド（Ａβ）は、アミロイド前駆体（ＡＰＰ）が膜蛋白質加水分解酵素であるベータセクレターゼ（ＢＡＣＥ１）、ガンマセクレターゼの連続的な作用により作られる。ベータセクレターゼの作用により先にｓＡＰＰβが作られ、これはガンマセクレターゼの作用によりベータアミロイドに作られる。ベータアミロイドは、４０個と４２個のアミノ酸からなるＡβ４０とＡβ４２を含む。Ａβ４０がその大部分を占めるが、相対的に少量作られるＡβ４２がプラークを容易に作るため、最も重要な病因物質として指摘されている。ＡＰＰは、ベータセクレターゼの作用を受けずに他の経路で加水分解が行われたりもするが、この場合には、先にアルファセクレターゼによりｓＡＰＰαが作られ、これがガンマセクレターゼの連続的な作用により害にならないｐ３という物質が作られるため、ベータアミロイドは作られない。したがって、ＢＡＣＥ１（ｂｅｔａ−ｓｉｔｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＰＰ）−ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）を遺伝的に除去したネズミを作れば、ベータアミロイド沈着が作られず、アルツハイマー病のモデルネズミで発現する認知障害などが抑制されると報告されている（Ｌａｉｒｄ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２５：１１６９３−１１７０９，２００５；Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｎ ４１：２７−３３，２００４）。このような結果らは、ベータセクレターゼは、ベータアミロイドの形成に重要な酵素であり、これに対する阻害剤が認知症、特にアルツハイマー病の治療剤として適用される可能性を示す。また、アルファセクレターゼの活性変化物質もアルツハイマー治療剤の重要なターゲットになり得ると考えられている。これと共に、ベータアミロイドを作る最終酵素は、ガンマセクレターゼであるため、これに対する効果的な阻害剤も治療剤として適用可能であると期待されている。

鐘馗水仙（Ｌｙｃｏｒｉｓ ａｕｒｅａ）は、スイセン科植物である鐘馗水仙の全草である。鐘馗水仙は、韓国（済州道・全羅南道・忠清南道）・日本・台湾・中国などの地に分布し、アルカロイド（ａｌｋａｌｏｉｄ）とフラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ）成分を含有していると知られている。鐘馗水仙抽出物の坑癌効果は知られているが（Ｎｅｒｏｍｅ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． ＷＯ２００８０７８３６２Ａ１）、ベータアミロイド生成抑制または認知症（例えば、アルツハイマー病）の予防および治療と関連した効果は現在まで報告されたことがない。

本発明において、ベータアミロイド生成抑制における有効成分として分離されたリコリシジンおよびリコリシジノールは、スイセン属植物（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）、リコリス属植物（Ｌｙｃｏｒｉｓ）、パンクラティウム属植物（Ｐａｎｃｒａｔｉｕｍ）、ハエマンサス属植物（Ｈａｅｍａｎｔｈｕｓ）に存在すると報告されている。リコリシジンおよびリコリシジノールは、抗ウイルス効果（Ｇａｂｒｉｅｌｓｅｎ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｄ． ５５：１５６９，１９９２）と坑癌効果（Ｍｏｎｄｏｎ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｂｅｒ． １０８：４４５，１９７５）を持つと知られているが、ベータアミロイド生成抑制または認知症（アルツハイマー）予防および治療と関連した効果は現在まで報告されたことがない。

以下、本発明をより詳しく説明する。

まず、本発明の一例は、鐘馗水仙（Ｌｙｃｏｒｉｓ ａｕｒｅａ）抽出物のベータアミロイド生成抑制、または認知症の予防および／または改善および／または軽減および／または治療における用途を提供する。

したがって、本発明の一例は、鐘馗水仙（Ｌｙｃｏｒｉｓ ａｕｒｅａ）抽出物を有効性分として含有するベータアミロイド生成抑制剤、および／または認知症の予防および／または治療用組成物に関するものである。本発明のさらに他の例は、ベータアミロイド生成抑制剤および／または認知症の予防および／または治療用組成物の製造のための鐘馗水仙（Ｌｙｃｏｒｉｓ ａｕｒｅａ）抽出物の新規な用途に関するものである。本発明のさらに他の例は、鐘馗水仙（Ｌｙｃｏｒｉｓ ａｕｒｅａ）抽出物をベータアミロイド生成抑制を必要とする患者に投与することを特徴とするベータアミロイド生成抑制方法、または鐘馗水仙（Ｌｙｃｏｒｉｓ ａｕｒｅａ）抽出物を認知症の予防および／または治療を必要とする患者に投与することを特徴とする認知症の予防および／または治療方法に関するものである。前記方法は、投与段階以前にベータアミロイド生成抑制を必要とする患者または認知症の予防および／または治療を必要とする患者を確認する段階をさらに含むことができる。前記患者は、哺乳動物であってもよく、好ましくは人間であってもよい。

前記認知症は、アルツハイマー疾患と血管性認知症を含み、特に好ましい具体的な例において、認知症はアルツハイマー疾患である。

ベータアミロイド生成阻害に効果がある有効成分の含量を高めるために、前記鐘馗水仙抽出物は、鐘馗水仙を水、およびＣ１〜Ｃ４の低級アルコールからなる群より選択された１種以上の溶媒、好ましくは、５０〜９５ｖ／ｖ％のメタノール、エタノール、またはイソプロパノールで抽出して得られたものであってもよい。

ベータアミロイド生成阻害に効果がある有効成分の含量を高めるために、前記鐘馗水仙抽出物は、鐘馗水仙を水、およびＣ１〜Ｃ４の低級アルコールからなる群より選択された１種以上の溶媒、好ましくは、５０〜９５ｖ／ｖ％のメタノール、エタノール、またはイソプロパノールで抽出した後、ヘキサン、塩化メチレン、酢酸エチルおよびブタノールで順次に分画して得られた溶媒分画物のうちの酢酸エチル分画物、ブタノール分画物またはこれらの混合物であってもよい。

より好ましい具体的な例において、鐘馗水仙抽出物は、前記得られた酢酸エチル分画物とブタノール分画物の混合物に対してアセトニトリルと水の混合液を溶離液として使用する逆相クロマトグラフィーを行って得られた小分画物であって、下記のような有効成分リコリシジンおよび／またはリコリシジノールを高含量で含有して、ベータアミロイド生成阻害の効果が優秀なものであり得る。この時、前記溶離液として使用されるアセトニトリルと水の混合液中のアセトニトリル含量は、１０〜５０ｖ／ｖ％であることがよく、特に、３１〜３３ｖ／ｖ％である場合には、リコリシジンの含量の高い小分画物が得られ、４２〜４４ｖ／ｖ％である場合には、リコリシジノールの含量が高い小分画物が得られる。前記３１〜３３ｖ／ｖ％である場合の小分画物中のリコリシジンの含量は、約８０ｗ／ｗ％以上、例えば、８０〜９９．９ｗ／ｗ％、好ましくは９０〜９９．９ｗ／ｗ％である。このようなリコリシジン含量は、最初の水およびＣ１−Ｃ４低級アルコール混合物で抽出した粗抽出物重量を基準に約０．０４〜０．１ｗ／ｗ％程度に該当する値である。また、前記４２〜４４ｖ／ｖ％である場合の小分画物中のリコリシジノールの含量は、約８０ｗ／ｗ％以上、例えば、８０〜９９．９ｗ／ｗ％、好ましくは９０〜９９．９ｗ／ｗ％である。このようなリコリシジン含量は、最初の水およびＣ１−Ｃ４低級アルコール混合物で抽出した粗抽出物重量を基準に約０．０２〜０．０５ｗ／ｗ％程度に該当する値である。

さらに他の例において、本発明者らは、前記鐘馗水仙抽出物および／または分画物および／または小分画物の有効成分を分析した結果、下記の化学式１で表されるリコリシジンと下記の化学式２で表されるリコリシジノールがベータアミロイド生成抑制、および／またはアルファまたはベータセクレターゼ活性抑制に効果的であることが確認された。

したがって、本発明のさらに他の例は、化学式１で表されるリコリシジン、化学式２で表されるリコリシジノール、およびこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選択された１種以上を有効性分として含有するベータアミロイド生成抑制剤、および／または認知症の予防または治療用組成物に関するものである。本発明のさらに他の例は、ベータアミロイド生成抑制剤および／または認知症の予防および／または治療用組成物の製造のための化学式１で表されるリコリシジン、化学式２で表されるリコリシジノール、およびこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選択された１種以上の新規な用途に関するものである。本発明のさらに他の例は、化学式１で表されるリコリシジン、化学式２で表されるリコリシジノール、およびこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選択された１種以上をベータアミロイド生成抑制を必要とする患者に投与することを特徴とするベータアミロイド生成抑制方法、または化学式１で表されるリコリシジン、化学式２で表されるリコリシジノール、およびこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選択された１種以上を認知症の予防および／または治療を必要とする患者に投与することを特徴とする認知症の予防および／または治療方法に関するものである。前記方法は、投与段階以前にベータアミロイド生成抑制を必要とする患者または認知症の予防および／または治療を必要とする患者を確認する段階をさらに含むことができる。前記患者は、哺乳動物であってもよく、好ましくは人間であってもよい。

前記認知症は、アルツハイマー疾患と血管性認知症を含み、特に好ましい具体的な例において、認知症は、アルツハイマー疾患である。

前記化学式１で表されるリコリシジンは、分子式がＣ_１４Ｈ_１３ＮＯ_６であり、分子量は２９１である微黄色の半固形成物質である。また、化学式２で表されるリコリシジノールは、分子式がＣ_１４Ｈ_１３ＮＯ_７であり、分子量は３０７である微黄色の半固形成物質である。前記リコリシジンおよびリコリシジノールは、試験管内で非常に優れたベータアミロイド生成抑制作用を現わして、認知症、特にアルツハイマー疾患の予防および治療に有用に使用され得る。また、前記リコリシジンおよびリコリシジノールは、単独療法でベータアミロイド生成抑制剤として臨床でのみならず、動物モデルおよび試験管モデルで陽性対照群として活用され得る。

ベータアミロイド生成阻害、および／または認知症、特にアルツハイマー疾患の予防および／または治療において、前記鐘馗水仙抽出物、これから製造される分画物（または小分画物）、リコリシジンおよびリコリシジノールは、生薬成分または生薬から抽出された成分であるため、既存の認知症（例えば、アルツハイマー疾患）治療剤による副作用を最少化したり避けられる利点があり、前記成分のうちの１種以上を単独で投与する単独療法で適用されたり、既存の薬品であるＴａｃｒｉｎｅ、Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ、Ｒｉｖａｓｔｉｇｍｉｎｅなどと複合投与する複合療法などで適用可能である。

本発明のさらに他の例は、前記認知症予防および／または治療用組成物を含む認知症予防および／または改善用健康機能性食品に関するものである。前記認知症は、アルツハイマー疾患と血管性認知症を含み、特に好ましい具体的な例において、認知症はアルツハイマー疾患である。

健康機能性食品は、認知症の予防および／または改善のための各種食品および／または飲み物を全て含み、例えば、各種食品類、飲み物、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康機能性補助食品、食品添加剤などであってもよく、粉末、顆粒、錠剤、カプセルまたは飲み物の形態であってもよい。健康機能性食品中の認知症の予防および／または治療用組成物の含量は、最終製品の目的、用途、対象、形態などを考慮して適切に調節することができ、例えば、固形物含量基準に、鐘馗水仙抽出物、これから製造される分画物（または小分画物）、リコリシジンおよび／またはリコリシジノールを０．００００１〜５０重量％、好ましくは０．０００１〜１０重量％であってもよいが、これに限定されない。

本発明のさらに他の例は、ベータアミロイド阻害活性に優れた鐘馗水仙（Ｌｙｃｏｒｉｓ ａｕｒｅａ）抽出物（分画物および／または小分画物を含む）を製造するための製造方法に関するものである。前記製造方法は、次の段階を含むことができる：
鐘馗水仙を水、およびＣ１〜Ｃ４の低級アルコールからなる群より選択された１種以上の溶媒で抽出する段階（段階１）；
前記段階１で製造された抽出物にヘキサン、塩化メチレン、酢酸エチル、およびブタノールを順次に加えて各溶媒分画物を得る段階（段階２）；および
前記段階２で得られた分画物のうち、酢酸エチル分画物およびブタノール分画物をアセトニトリル／水の混合液を溶離液として使用して逆相コラムクロマトグラフィーを行って小分画を得る段階。

この時、前記得られた小分画は、リコリシジンおよびリコリシジノールを主成分として含有することを特徴とする。

段階１は、鐘馗水仙を水、およびＣ１〜Ｃ４の低級アルコールからなる群より選択された１種以上の溶媒で抽出する段階である。好ましい具体的な例において、前記抽出溶媒は、５０〜９５ｖ／ｖ％のメタノール、エタノール、またはイソプロパノールであってもよい。前記鐘馗水仙は、栽培したものまたは市販されるものなどを制限なしに使用することができ、全草を使用したり球根を使用することができるが、使用部位が制限されるわけではなく、きれいに洗浄して陰地で乾燥して使用することができる。前記抽出方法は、特別な制限はなく、通常使用されるすべての方法が可能であり、例えば、加熱抽出法、超音波抽出法、ろ過法、加圧抽出法、還流抽出法、超臨界抽出法、または電気的抽出法などを使用することができる。一つの具体的な例において、乾燥された鐘馗水仙の全草を適当な大きさに粉砕して抽出容器に入れて水またはＣ１〜Ｃ４の低級アルコールまたはこれらの混合溶媒、好ましくは５０〜９５ｖ／ｖ％のメタノール、エタノール、またはイソプロパノールを入れて溶液を沸かしながら還流抽出した後、一定の時間を放置した後に残留物をろ過して除去した後にアルコール抽出物を得ることができる。この時、アルコール溶媒の体積は、粉砕した試料体積の１〜５倍であることが好ましい。抽出時間は、１〜１２時間であることが好ましく、３時間であることが最も好ましい。以降、濃縮または凍結乾燥などの通常的過程をさらに経ることができる。

段階２は、通常知られた方法を用いて前記段階１で抽出された抽出物を水で懸濁した後、ヘキサン、塩化メチレン、酢酸エチルおよびブタノールで順次に分画して溶媒分画物を得る段階である。例えば、前記得られた抽出物に抽出物質量基準に約５〜１００倍体積、好ましくは１０〜６０倍体積の水を加えて懸濁させた後、ヘキサンを加えてヘキサン分画物を分離し、残留物に塩化メチレンを処理して塩化メチレン分画物を分離し、ここで残った残留物に酢酸エチルを処理して酢酸エチル分画物を分離し、ここで残った残留物にブタノールを処理してブタノール分画物を得ることができる。この時、ヘキサン、塩化メチレン、酢酸エチルおよびブタノールの使用量は、抽出物質量基準に約５〜１００倍体積、好ましくは１０〜６０倍体積にすることができ、前記懸濁に使用された水の量と同一にすることができる。このうち、酢酸エチル分画物とブタノール分画物がベータアミロイド抑制効果により優れていて、次の段階に酢酸エチル分画物とブタノール分画物の混合物を使用することがよい。

段階３は、アセトニトリルと水の混合溶液を溶離液として使用し、逆相液体クロマトグラフィーを使用して行われ得るが、この時、アセトニトリルの含量を増加させながら行われ得る。下記の試験例で確認されるように、細胞毒性が少なく、ベータアミロイド生成抑制効果に優れた分画物を得るために、アセトニトリル含量を増加させるながら、例えば、６０分間にわたって濃度勾配を１０：９０（アセトニトリルの体積：水の体積）から５０：５０（アセトニトリルの体積：水の体積）に変化させながら、つまり、アセトニトリル濃度を１０−５０ｖ／ｖ％に増加させながら行うことが好ましい。また、前記溶離液として使用されるアセトニトリルと水の混合溶液は、０．００１〜０．００４、好ましくは約０．００２ｖ／ｖ％のトリフルオロ酢酸を含むものであってもよい。本発明の一つの具体的な例では、このように得られた小分画物中、１０ｖ／ｖ％から３０ｖ／ｖ％（「ＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ１」と命名）、３１ｖ／ｖ％から３３ｖ／ｖ％（「ＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ２」と命名）、４２ｖ／ｖ％から４４ｖ／ｖ％（「ＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ３」と命名）、４５ｖ／ｖ％から５０ｖ／ｖ％（「ＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ４」と命名）アセトニトリル／水を溶離液として使用する時、溶出された溶液を減圧乾燥して４個の小分画物を調製した。前記分画のうちのＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ２小分画物は、リコリシジンを主成分として、約８０ｗ／ｗ％以上、例えば、８０〜９９．９ｗ／ｗ％、好ましくは９０〜９９．９ｗ／ｗ％の量で含み、ＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ３小分画物は、リコリシジノールを主成分として、約８０ｗ／ｗ％以上、例えば、８０〜９９．９ｗ／ｗ％、好ましくは９０〜９９．９ｗ／ｗ％の量で含むことと示された。

本発明のさらに他の例において、前記製造方法は、段階３で調製されたリコリシジンを主成分とするＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ２小分画物およびリコリシジノールを主成分とするＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ３小分画物をそれぞれ逆相コラムクロマトグラフィーを再遂行して化学式１で表されるリコリシジンおよび化学式２で表されるリコリシジノールを精製する段階（段階４）をさらに含むことができる。この時、リコリシジンの精製のために、前記小分画物、好ましくはリコリシジンを主成分とするＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ２小分画物に対して、０．０５〜０．２ｖ／ｖ％、好ましくは０．１ｖ／ｖ％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルおよび水の混合溶液を溶離液として使用し、４０分間にわたって１０ｖ／ｖ％アセトニトリル／水から２０ｖ／ｖ％アセトニトリルまでアセトニトリルの組成を高める濃度勾配で逆相コラムクロマトグラフィーを行って、化学式１で表されるリコリシジンを精製することができる。また、リコリシジノールの精製のために、前記小分画物、好ましくはリコリシジノールを主成分とするＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ３小分画物に対して、アセトニトリルおよび水の混合溶液を溶離液として使用し、２０分間にわたって１０ｖ／ｖ％アセトニトリル／水から２０ｖ／ｖ％アセトニトリルまでアセトニトリルの組成を高める濃度勾配で化学式２で表されるリコリシジノールを精製することができる。

本発明の鐘馗水仙抽出物、分画物、リコリシジンおよびリコリシジノールは、単独療法で適用したり、あるいはＴａｃｒｉｎｅ、Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ、Ｒｉｖａｓｔｉｇｍｉｎｅなどのような既存の認知症（例えば、アルツハイマー疾患）治療剤と複合療法で適用したり、あるいは生薬混合組成物として適用して、認知症、特にアルツハイマー疾患の予防および／または治療に有用に利用され得る。

鐘馗水仙アルコール抽出物（ＣＮ１−Ｍ）の濃度によるＡβ４２およびＡβ４０の生成抑制効果を示した図面である。 鐘馗水仙アルコール抽出物から製造された４種の溶媒分画物（ＣＮ１−ＭＨ、ＣＮ１−ＭＭ、ＣＮ１−ＭＥ、ＣＮ１−ＭＢ）の２５μｇ／ｍｌ濃度でＡβ４２生成抑制効果を示した図面である。 鐘馗水仙アルコール抽出物の酢酸エチル分画（ＣＮ１−ＭＥ）とブタノール分画（ＣＮ１−ＭＢ）を合わせた分画物（ＣＮ１−Ｍ−Ｅ）から製造された４種の小分画物（ＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ１、ＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ２、ＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ３、ＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ４）の２５μｇ／ｍｌ濃度でＡβ４２生成抑制効果を示した図面である。 化合物リコリシジン（ＣＮ１−Ｍ−Ｅ２）およびリコリシジノールの（ＣＮ１−Ｍ−Ｅ３）の濃度別Ａβ４２生成抑制効果を示した図面である。 化合物リコリシジン（ＣＮ１−Ｍ−Ｅ２）およびリコリシジノール（ＣＮ１−Ｍ−Ｅ３）によるベータセクレターゼ活性の結果物であるｓＡＰＰαの生成減少効果を示した図面である。 リコリシジンとリコリシジノールのｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ生成減少効果を示した図面である。 リコリシジンとリコリシジノール処理した場合のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔの結果におけるｓＡＰＰα、およびｓＡＰＰβのｂａｎｄのｄｅｎｓｉｔｙを示した図面である。 リコリシジン（ＣＮ１−Ｍ−Ｅ２）およびリコリシジノール（ＣＮ１−Ｍ−Ｅ３）の濃度による細胞死作用を示した図面である。

以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。しかしながら、これら実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるわけではない。

＜実施例１＞
鐘馗水仙アルコール抽出物の調製
中国湖北省武漢などの地で採集した鐘馗水仙を本実施例に使用した。陰地で乾燥させた鐘馗水仙の球根２００ｇを細切した後、抽出容器に入れて９５ｖ／ｖ％エタノールを試料体積の２倍体積を加えた後、３時間にわたって還流抽出し常温で冷ました後、ろ過した。前記抽出液を溶媒が完全に蒸発するまで４０℃で減圧下に濃縮して、５０ｇのアルコール抽出物（ＣＮ１−Ｍ）を収得した。

＜実施例２＞
鐘馗水仙溶媒分画物および酢酸エチル分画の小分画物の調製
前記実施例１で調製された鐘馗水仙アルコール抽出物２５ｇを水１Ｌに懸濁させた後、ヘキサン、塩化メチレン、酢酸エチル、ブタノールを１Ｌずつそれぞれ２回ずつ順次に加えて溶媒分画することによって（各溶媒は特級を使用）、分画物をそれぞれ１．３ｇ（ヘキサン分画物）、９４ｍｇ（塩化メチレン分画）、９０ｍｇ（酢酸エチル分画）および１．２ｇ（ブタノール分画）の量で得、残った水分画物は２２ｇであった。

以降、酢酸エチル分画およびブタノール分画を合わせた分画物１．２９ｇに対して０．０２％のトリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルおよび水の混合溶液を溶離液として使用して１０％アセトニトリル／水を５分間維持した後、アセトニトリル：水の比率を６０分間にわたって１０：９０体積比から５０：５０体積比に変化させながらＣ１８逆相クロマトグラフィーを行って滞留時間８分から３６分（アセトニトリル含量：１０ｖ／ｖ％から３０ｖ／ｖ％）までのＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ１、３６分から４０分（アセトニトリル含量：３１ｖ／ｖ％から３３ｖ／ｖ％）までのＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ２、５３分から５６分（アセトニトリル含量：４２ｖ／ｖ％から４４ｖ／ｖ％）までのＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ３および５６分から６０分（アセトニトリル含量：４５ｖ／ｖ％から５０ｖ／ｖ％）までのＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ４の４種の小分画物を収得した。４種の分画ともに前記化学式１および化学式２で表されるリコリシジンまたはリコリシジノールを含有していたが、このうち、ＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ２小分画物が前記リコリシジンを主成分として約８０ｗ／ｗ％以上含有しており、ＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ３小分画物が前記リコリシジノールを主成分として約８０ｗ／ｗ％以上含有していた。

＜実施例３＞
リコリシジンの精製および構造の同定
本発明者らは、＜実施例２＞から調製されたリコリシジンを主成分として含有する小分画物を（ＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ２）減圧濃縮した後、前記濃縮物に対して０．１ｖ／ｖ％のトリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルおよび水の混合溶液を溶離液として使用して１０ｖ／ｖ％アセトニトリル／水から２０ｖ／ｖ％アセトニトリル／水まで４０分間アセトニトリルの組成を高める濃度勾配でＣ１８逆相コラムを用いた高速流体クロマトグラフィー分離法を通じて鐘馗水仙抽出物２５ｇから化学式１で表されるリコリシジン５ｍｇを収得した。

下記の通り、ＮＭＲ分析および質量分析を施して、化学式１で表されるリコリシジンの構造を同定した。

分子量および分子式は、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００高速流体クロマトグラフィー−質量分光計（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）を利用したＭＳ測定を通じて２９１と決定し、核磁気共鳴器（Ｖａｒｉａｎ ５００ ＭＨｚ ＮＭＲ）を利用した^１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ｓｐｅｃｔｒｕｍ）分析を通じてその構造を前記化学式２のように同定した（Ｇｅｏｒｇｅ Ｒ． Ｔｅｔｔｉｔ ａｎｄ Ｊｏｙ Ａ． Ｂｅｌｌ， Ｊ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｄ ６９：７−１３，２００６）。分析結果は次の通りである。

微黄色半固形成物質；分子式Ｃ_１４Ｈ_１３ＮＯ_６；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２９２［Ｍ＋Ｈ］^＋；^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）：δ３．９２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、３．９４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、４．２６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ=４．５，２．０，１．５Ｈｚ，Ｈ−２）、４．４０（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ=９．５，２．５，１．０Ｈｚ，Ｈ−４ａ）、６．０６ ａｎｄ ６．０８（ｅａｃｈ １Ｈ，ｄ，Ｊ=１．０Ｈｚ，−ＯＣＨ_２Ｏ−）、６．１８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１）、７．１７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１０）、７．４０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７）。

＜実施例４＞
リコリシジノールの精製および構造の同定
前記実施例２から調製されたリコリシジノールを主成分として含有する小分画物を（ＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ３）減圧濃縮した後、前記濃縮物に対してアセトニトリルおよび水の混合溶液を溶離液として使用して１０ｖ／ｖ％アセトニトリル／水から２０ｖ／ｖ％アセトニトリル／水まで２０分間にわたってアセトニトリルの組成を高める濃度勾配でＣ１８逆相コラムを用いた高速流体クロマトグラフィー分離法を通じて鐘馗水仙抽出物２５ｇから化学式２で表されるリコリシジノール１０ｍｇを収得した。

下記の通り、ＮＭＲ分析および質量分析を施して、化学式２で表されるリコリシジノールの構造を同定した。

分子量および分子式は、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００高速流体クロマトグラフィー−質量分光計（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）を利用したＭＳ測定を通じて３０７と決定し、核磁気共鳴器（Ｖａｒｉａｎ ５００ ＭＨｚ ＮＭＲ）を利用した^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ｓｐｅｃｔｒｕｍ）分析を通じてその構造を前記化学式２のように同定した（Ｓｈａｎｍｕｇｈａｍ Ｅｌａｎｇｏ ａｎｄ Ｙｕ−Ｈｓｉｎ Ｙａｎ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ ６７：６９５４−６９５９，２００２）。分析結果は次の通りである。

微黄色半固形成物質；分子式Ｃ_１４Ｈ_１３ＮＯ_７；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３０８［Ｍ＋Ｈ］^＋；^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）：δ３．９１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、３．９２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、４．２４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２）、４．３６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４ａ）、６．０３ ａｎｄ ６．０５（ｅａｃｈ １Ｈ，ｄ，Ｊ=１．０Ｈｚ，−ＯＣＨ_２Ｏ−）、６．１８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１）、６．７５（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１０）。

＜試験例１＞
鐘馗水仙抽出物のベータアミロイド生成抑制作用の評価
鐘馗水仙抽出物のベータアミロイド生成抑制作用を試験管内で評価するために、Ｈｕｍａｎ ＡＰＰが形質感染されているＨｅＬａ細胞株を使用した。この細胞株は、Ｔａｅ−Ｗａｎ Ｋｉｍ教授（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ１００３２， ＵＳＡ）から提供されて使用した。細胞が分泌するガンマセクレターゼ活性の結果物である主要ベータアミロイド、Ａβ４０、Ａβ４２の定量は、Ｈｕｍａｎ Ｂｅｔａ Ａｍｙｌｏｉｄ［１−４０］（Ａβ４０）、Ｈｕｍａｎ Ｂｅｔａ Ａｍｙｌｏｉｄ［１−４２］（Ａβ４２）Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（♯ＫＨＢ３４８２ ａｎｄ ♯ＫＨＢ３４４２；Ｂｉｏ Ｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）をそれぞれ使用した。

前記形質感染ＨｅＬａ細胞が培養された細胞培養液（ＤＭＥＭ培養液♯１１９９５；ＧＩＢＣＯ）に下記の表１に示されたような一定の濃度の鐘馗水仙のアルコール抽出物（ＣＮ１−Ｍ、実施例１参照）を添加した後、３７℃で８時間にわたって培養し、培養液に分泌されたベータアミロイドの量を測定して、表１および図１に示した。陰性対照群として前記鐘馗水仙アルコール抽出物を添加していない未処理形質感染ＨｅＬａ細胞培養液を使用した。

表１および図１に示したように、鐘馗水仙のアルコール抽出物は、濃度依存的にベータアミロイドＡβ４２およびＡβ４０の生成抑制効果を示すことを確認した。

＜試験例２＞
鐘馗水仙抽出物ＣＮ１−Ｍの分画物によるベータアミロイド生成抑制作用の評価
前記実施例２から調製されたＣＮ１−Ｍの溶媒分画物であるヘキサン分画物（ＣＮ１−ＭＨ）、塩化メチレン分画物（ＣＮ１−ＭＭ）、酢酸エチル分画物（ＣＮ１−ＭＥ）およびブタノール分画物（ＣＮ１−ＭＢ）を一定の濃度（２５μｇ／ｍｌ）に使用して前記試験例１と同様な方法でベータアミロイド抑制活性を確認した結果を表２と図２に示した。陰性対照群として前記溶媒分画物を添加していない未処理形質感染ＨｅＬａ細胞培養液を使用した。

表２および図２に示したように、溶媒分画物のうち、酢酸エチル（ＣＮ１−ＭＥ）およびブタノール分画（ＣＮ１−ＭＢ）のＡβ４２生成抑制効果に優れていることが示された。

＜試験例３＞
酢酸エチル分画（ＣＮ１−ＭＥ）およびブタノール分画（ＣＮ１−ＭＢ）の混合分画物（ＣＮ１−Ｍ−Ｅ）から調製された４種の小分画物によるベータアミロイド生成抑制作用の評価
前記実施例２で製造された酢酸エチル分画およびブタノール分画を合わせた分画物（ＣＮ１−Ｍ−Ｅ）から調製された４種の小分画物、ＣＮ１−Ｍ−Ｅ−ｆｒ１、Ｅ−ｆｒ２、Ｅ−ｆｒ３、およびＥ−ｆｒ４によるＡβ４２生成抑制活性実験を前記試験例１のような方法で行って、その結果を表３および図３に示した。

表３および図３に示したように、４個の小分画物ともに９６％以上の顕著なベータアミロイド生成抑制活性を示した。

＜試験例４＞
リコリシジンおよびリコリシジノールによるベータアミロイド生成抑制作用の評価
実施例３および実施例４で得られた化合物リコリシジン（ＣＮ１−Ｍ−Ｅ２）およびリコリシジノール（ＣＮ１−Ｍ−Ｅ３）によるＡβ４２およびＡβ４０生成抑制活性実験を前記試験例１のような方法で行った結果を表４および図４に示した。

表４および図４に示したように、リコリシジンとリコリシジノールはともに濃度依存的に顕著なベータアミロイド生成抑制活性を示した。

＜試験例５＞
リコリシジンおよびリコリシジノールによるアルファセクレターゼ活性の評価
前記実施例４並びに表４および図４で立証された通り、リコリシジンおよびリコリシジノールによりＡβ４２およびＡβ４０の生成が抑制され、これによってガンマセクレターゼの産物が減少したことが分かる。Ａβ４２およびＡβ４０の生成減少の原因として考慮できる第一の可能性は、アルファセクレターゼの活性増加である。また、Ａβ４２およびＡβ４０の生成は、ベータおよびガンマセクレターゼの連続的な酵素作用によりなされることから、前記化合物によるベータおよびガンマセクレターゼ活性阻害効果のためである可能性もある。

前記化合物のＡβ生成抑制効果がどのセクレターゼに対する作用のためであるのかを確認するために、アルファセクレターゼの活性ａｓｓａｙ ｋｉｔを使用した（♯ＣＢＡ０４２；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， ＵＳＡ）。アルファセクレターゼは、ＨｅＬａ ｃｅｌｌ（実験例１参照）から得たｔｏｔａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎを使用した。得られたリコリシジンおよびリコリシジノールによるアルファセクレターゼ活性変化を表５および図５に示した。

表５および図５から分かるように、リコリシジンおよびリコリシジノールは、０．０１、０．１μｇ／ｍｌ濃度でアルファセクレターゼの活性を変化させなかった。試験例４で、前記濃度はこれら化合物がＡβ４２およびＡβ４０生成を効果的に抑制した濃度であった（表４および図４参照）。したがって、リコリシジンおよびリコリシジノールがＡβ４２およびＡβ４０生成を抑制するのは、アルファセクレターゼの活性を変化させるためではないことが分かった。

＜試験例６＞
鐘馗水仙抽出物から調製された化合物リコリシジンおよびリコリシジノールによるアルファまたはベータセクレターゼ産物生成抑制作用の評価
アルファセクレターゼの活性作用の産物であるｓＡＰＰαの生成とベータセクレターゼの活性作用の産物であるｓＡＰＰβの生成に対する前記化合物の効果をｓＡＰＰα、ｓＡＰＰβに対するＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法で確認し、その結果を図６に示した。図６から分かるように、Ａβ４２およびＡβ４０の生成効果を示す０．１μｇ／ｍｌ濃度でリコリシジンとリコリシジノールは、ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ分泌に影響を与えなかった。図６のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔの結果で、ｓＡＰＰα、ｓＡＰＰβのｂａｎｄのｄｅｎｓｉｔｙを測定して表６と図７に示した。

表６および図７で確認できるように、リコリシジンおよびリコリシジノールによるｓＡＰＰα、ｓＡＰＰβの生成変化は顕著な水準ではなかった。したがって、リコリシジンとリコリシジノールによるＡβ４２およびＡβ４０の生成減少効果は、アルファおよびベータセクレターゼの活性変化が理由ではないことが分かった。

このような結果を総合すると、リコリシジンとリコリシジノールによるＡβ４２およびＡβ４０の生成抑制は、これら化合物がガンマセクレターゼの活性阻害剤として作用して現れたものであることが分かった。

＜試験例７＞
化合物リコリシジンおよびリコリシジノールによる細胞死作用の評価
前記化合物リコリシジンおよびリコリシジノールにより発生される細胞死（ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）作用を評価するために、ＭＴＴ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ方法を利用した（ＡＴＣＣ ｃａｔａｌｏｇ ♯３０−１０１０Ｋ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＵＳＡ）。細胞に前記化合物を多様な濃度にそれぞれ８時間にわたって処理した後に生きている細胞（ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ）を定量して、その結果を表７および図８に示した。

表７および図８で確認できるように、本実験で使用した最も高濃度である１０μｇ／ｍｌのリコリシジンまたはリコリシジノールを処理した場合にも、約２０％以内の細胞のみが細胞死したことが分かる。このような結果から、前記化合物により現れたベータアミロイド生成減少効果が単に細胞死により発生される現象ではないことが分かり、前記化合物は細胞毒性がないことが分かる。

Claims (12)

1. 鐘馗水仙（Ｌｙｃｏｒｉｓ ａｕｒｅａ）抽出物を有効性分として含有する認知症の予防または治療用組成物であって、前記鐘馗水仙抽出物は、下記の化学式１で表されるリコリシジン、または下記の化学式２で表されるリコリシジノールを含んでいる、認知症の予防または治療用組成物。
   
2. 鐘馗水仙抽出物を有効性分として含有するベータアミロイド抑制用組成物であって、前記鐘馗水仙抽出物は、下記の化学式１で表されるリコリシジン、または下記の化学式２で表されるリコリシジノールを含んでいる、ベータアミロイド抑制用組成物。
   
3. 前記鐘馗水仙抽出物は、鐘馗水仙を水、およびＣ１〜Ｃ４の低級アルコールからなる群より選択された１種以上の溶媒で抽出して得られたものである、請求項１にまたは２に記載の組成物。
4. 前記鐘馗水仙抽出物は、鐘馗水仙を水、およびＣ１〜Ｃ４の低級アルコールからなる群より選択された１種以上の溶媒で抽出した後、ヘキサン、塩化メチレン、酢酸エチルおよびブタノールで順次に分画して得られた溶媒分画物のうちの酢酸エチル分画物、ブタノール分画物またはこれらの混合物である、請求項１にまたは２に記載の組成物。
5. 前記鐘馗水仙抽出物は、鐘馗水仙を水、およびＣ１〜Ｃ４の低級アルコールからなる群より選択された１種以上の溶媒で抽出した後、ヘキサン、塩化メチレン、酢酸エチルおよびブタノールで順次に分画して得られた溶媒分画物のうちの酢酸エチル分画物とブタノール分画物の混合物に対して、アセトニトリルと水の混合液を溶離液として使用する逆相コラムクロマトグラフィーを行って得られた小分画物である、請求項１または２に記載の組成物。
6. 前記逆相コラムクロマトグラフィーは、６０分基準にアセトニトリルと水の混合液中のアセトニトリルの含量を１０ｖ／ｖ％から５０ｖ／ｖ％に増加させながら行う、請求項５に記載の組成物。
7. 前記アセトニトリルと水の混合液中のアセトニトリルの含量は、３１〜３３ｖ／ｖ％であり、得られた小分画物は、下記の化学式１で表されるリコリシジンを８０〜９９．９ｗ／ｗ％の量で含有することを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
   
8. 前記アセトニトリルと水の混合液中のアセトニトリルの含量は、４２〜４４ｖ／ｖ％であり、得られた小分画物は、下記の化学式２で表されるリコリシジノールを８０〜９９．９ｗ／ｗ％の量で含有することを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
   
9. 鐘馗水仙を水、およびＣ１〜Ｃ４の低級アルコールからなる群より選択された１種以上の溶媒で抽出する段階；
   前記得られた抽出物にヘキサン、塩化メチレン、酢酸エチルおよびブタノールを順次に加えて溶媒分画物を得る段階；および
   前記得られた溶媒分画物のうち、酢酸エチル分画物とブタノール分画物を混合した後、アセトニトリルと水の混合液を溶離液として使用する逆相コラムクロマトグラフィーを行って、小分画物を得る段階
   を含む、
   下記の化学式１で表されるリコリシジン、または下記の化学式２で表されるリコリシジノールを含んでおりかつベータアミロイド生成抑制効果を有する鐘馗水仙抽出物の、製造方法。
   
10. 前記逆相クロマトグラフィーは、６０分基準にアセトニトリルと水の混合液中のアセトニトリルの含量を１０ｖ／ｖ％から５０ｖ／ｖ％に増加させながら行う、請求項９に記載の製造方法。
11. アセトニトリルと水の混合液中のアセトニトリルの含量が３１〜３３ｖ／ｖ％である時の溶出液から小分画物を得る段階をさらに含み、
    前記得られた小分画物は、下記の化学式１で表されるリコリシジンを８０〜９９．９ｗ／ｗ％の量で含有するものである、請求項１０に記載の製造方法。
    
12. 前記アセトニトリルと水の混合液中のアセトニトリルの含量が４２〜４４ｖ／ｖ％である時の溶出液から小分画物を得る段階をさらに含み、
    前記得られた小分画物は、下記の化学式２で表されるリコリシジノールを８０〜９９．９ｗ／ｗ％の量で含有するものである、請求項１０に記載の製造方法。