CN101837075A - 用于预防或治疗痴呆症的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及忽地笑(Lycoris aurea)提取物、及/或其有机溶剂萃取物、及/或从所述提取物或有机溶剂萃取物中分离得到的石蒜西定和石蒜西定醇在制备用于预防或治疗痴呆症的组合物中的用途。

Description

用于预防或治疗痴呆症的组合物

技术领域：

本发明涉及用于预防或治疗痴呆症的组合物，特别涉及将忽地笑(Lycoris aurea)提取物作为活性成分使用的用于预防或治疗痴呆症的组合物，以及忽地笑(Lycoris aurea)提取物、及/或其有机溶剂萃取物、及/或从所述提取物或有机溶剂萃取物中分离得到的石蒜西定和石蒜西定醇在制备用于预防或治疗痴呆症的组合物中的用途。

背景技术：

随着世界逐渐进入老龄化社会，中风、帕金森疾病、阿尔茨海默疾病等各种脑部疾病的发病率急剧增加，其治疗费用也非常昂贵。阿尔茨海默病是一种因脑神经暂时或持续损伤导致精神功能整体上发生障碍的进行性神经退行性疾病。迄今为止，阿尔茨海默病的病因尚未得到充分阐明，但其与大脑老化现象密切相关的事实已有报道：在大脑老化过程中，β-淀粉样蛋白在脑部堆积形成斑块(plaque)，可引发阿尔茨海默疾病(Breimer LH，et al.Nature，326：749-750，1987)。过去，主要以乙酰胆碱酯酶(Acetylcholin esterase)作为药物靶点，开展了一系列针对痴呆症治疗方面的研究。然而，研究表明，乙酰胆碱酯酶抑制剂仅能减少阿尔茨海默病痴呆患者脑内乙酰胆碱的分解，提高乙酰胆碱的浓度，改善患者的症状，但并不能解决引发疾病的根本原因。目前，经FDA认证在海外开发的阿尔茨海默病治疗剂主要有，乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEIs：Acetyl cholinesterase inhibitors)和N-甲基D-天冬氨酸盐(N-methyl D-aspartate)受体拮抗剂(NMDARA)等系列化合物。此外，还有约15种由美国等发达国家的跨国制药公司研制开发的阿尔茨海默病治疗剂也正在进行临床试验。以上治疗剂均不能从根本上治疗阿尔茨海默病，因此急需开发β-分泌酶或者γ-分泌酶的抑制剂和抑制β-淀粉样蛋白凝聚的抑制剂，从而减少被推定为引发阿尔茨海默疾病主要原因的β-淀粉样蛋白的生成量。

技术内容：

本发明的一实施例提供一种以忽地笑提取物为活性成分的用于预防及/或治疗痴呆症的组合物和健康功效食品。

本发明的另一实施例提供一种以由石蒜西定、石蒜西定醇以及它们在药学上允许的盐组成的一组化合物中的1种或1种以上化合物作为活性成分、用于预防及/或治疗痴呆症的组合物及健康功效食品。

本发明的另一实施例提供一种预防及/或治疗痴呆症效果显著的忽地笑提取物的制备方法。

本发明的发明人经研究发现，忽地笑提取物、及/或其有机溶剂物、及/或从所述提取物或有机溶剂萃取物中分离得到的化合物石蒜西定醇和石蒜西定，在试验管的实验模型中，能够抑制β-淀粉样蛋白生成，从而对痴呆症特别是阿尔茨海默病具有预防及/或治疗作用。β-淀粉样蛋白(Aβ)是淀粉样前体(APP)在膜蛋白质水解酶——β-分泌酶(BACE1)、γ-分泌酶的持续作用下生成的。首先，淀粉样前体(APP)在β-分泌酶的作用下生成sAPPβ，而sAPPβ则在γ-分泌酶的作用下成为β-淀粉样蛋白。β-淀粉样蛋白由不同长度的肽组成，主要包含Aβ40和Aβ42两种组分，其中Aβ40占有较大比例。然而鉴于Aβ42较容易形成斑块，Aβ42被认为是阿尔茨海默病发病机制中最重要的病因物质。当然，APP也可以不受β-分泌酶的影响，而通过其他途径进行水解。首先，APP通过α-分泌酶首先生成sAPPα，而sAPPα则在γ-分泌酶的持续作用下生成无害的p3物质，因此不生成β-淀粉样蛋白。因此，有报告显示，若制作遗传上被去除BACE1(beta-site amyloid precursor protein(APP)-cleaving enzyme)的鼠，就不会产生β-淀粉样蛋白的沉积，并能抑制患有阿尔茨海默病的模型鼠身上表征的认知障碍等现象(Laird et al.J.Neuroscience 25：11693-11709，2005；Ohno et al.Neuron 41：27-33，2004)。以上实验研究表明，β-分泌酶是β-淀粉样蛋白形成过程中的重要酶，且β-分泌酶抑制剂能有效减少β-淀粉样蛋白生成，可作为痴呆症特别是阿尔茨海默病的治疗剂使用。α-分泌酶激动剂也可以成为阿尔茨海默治疗剂的重要目标物质。同时，由于生成β-淀粉样蛋白的最终酶是γ-分泌酶，所以其抑制剂也有望作为治疗剂使用。

忽地笑(Lycoris aurea)为石蒜科植物中忽地笑的全草。忽地笑分布于韩国(济州岛、全罗南道、忠淸南道)、日本、台湾、中国等地，并且包含生物碱(alkaloid)和类黄酮(flavonoid)成分。忽地笑提取物的抗癌效果已有报道(Nerome，K.et al.WO2008078362A1)，然而尚无报告显示忽地笑提取物具有抑制β-淀粉样蛋白生成或者预防及治疗痴呆症特别是阿尔茨海默病的作用。

在本发明中分离得到的、具有抑制β-淀粉样蛋白生成活性的石蒜西定和石蒜西定醇还存在于多种水仙属植物(Narcissus)、石蒜属植物(Lycoris)、全能花属植物(Pancratium)、网球花属植物(Haemanthus)中。有关石蒜西定和石蒜西定醇的药理活性的研究已做过报道，如其抗病毒效果(Gabrielsen，B.etal.J.Nat.Prod.55：1569，1992)、抗癌效果(Mondon，A.etal.Chem.Ber.108：445，1975)等。然而尚无报告显示，石蒜西定及石蒜西定醇具有抑制β-淀粉样蛋白生成或者预防及治疗痴呆症特别是阿尔茨海默病的作用。

下面，对本发明进行详细说明。

首先，本发明的一实施例提供忽地笑(Lycoris aurea)提取物在制备用于抑制β-淀粉样蛋白生成、或预防及/或改善及/或减轻及/或治疗痴呆症的组合物中的用途。

因此，本发明的一实施例涉及一种将忽地笑(Lycoris aurea)提取物作为活性成分并用于预防及/或治疗痴呆症的组合物。本发明的又一实施例涉及忽地笑(Lycoris aurea)提取物在制备β-淀粉样蛋白生成抑制剂及/或用于预防及/或治疗痴呆症的组合物中的新用途。本发明的另一实施例涉及忽地笑(Lycoris aurea)提取物在制备抑制β-淀粉样蛋白生成的组合物中的用途。该组合物可提供给需要抑制β-淀粉样蛋白生成的患者、或需要预防及/或治疗痴呆症的患者服用，从而预防及/或治疗痴呆症。所述患者可以是哺乳动物，最好是人类。

所述痴呆症包括阿尔茨海默疾病和血管性痴呆症，在较佳实施例中所提到的痴呆症尤其是指阿尔茨海默病。

为了提高对β-淀粉样蛋白生成起抑制作用的活性成分的含量，所述忽地笑提取物可以是用水或/和含1至4个碳原子的低级醇中的1种或1种以上的醇作溶剂对忽地笑进行提取而得到的物质，最好是用体积百分比为50-95％的甲醇、乙醇或异丙醇溶液。

为了提高对β-淀粉样蛋白生成起抑制作用的活性成分的含量，所述忽地笑提取物可以是用水或/和含1至4个碳原子的低级醇中的1种或1种以上的醇作溶剂，最好是用50-95体积％的甲醇、乙醇或异丙醇溶液对忽地笑进行提取之后，依次分别采用己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯以及丁醇对忽地笑提取物进行萃取而获得的有机溶剂萃取物中的乙酸乙酯萃取物、丁醇萃取物或它们的混合物。

在更为优选的实施例中，忽地笑提取物是对所述获得的乙酸乙酯萃取物和丁醇萃取物的混合物，以乙腈和水混合溶液作为洗脱剂，进行反相柱色谱分离而获得的细分馏物。由于所述细分馏物中活性成分石蒜西定及/或石蒜西定醇的含量高，其抑制β-淀粉样蛋白生成的效果更加显著。该实施例所述反相柱色谱分离采用梯度洗脱，洗脱液中的乙腈体积百分比浓度在60分钟内，从10％增加到50％。当洗脱剂中的乙腈体积百分比浓度为31-33％时，获得的细分馏物主要含有石蒜西定，该化合物在细分馏物中的质量百分比含量大约在90％以上，例如90-99.9％，最好是95-99.9％。以最初的水及含1至4个碳原子的低级醇的混合溶剂萃取的粗提物重量为基准，上述石蒜西定的质量百分比含量约为0.04-0.1％。当洗脱剂中的乙腈体积百分比浓度为42-44％时，获得的细分馏物主要含有石蒜西定醇，该化合物在细分馏物中的质量百分比含量大约在90％以上，例如90-99.9％，最好是95-99.9％。以最初的水及含1至4个碳原子的低级醇的混合溶剂萃取的粗提物重量为基准，所述石蒜西定醇的质量百分比含量约为0.02-0.05％。

在本发明的另一实施例中，本发明的发明人对所述忽地笑提取物及/或有机溶剂萃取物及/或细分馏物中的活性成分进行了研究。实验结果显示，由以下化学结构式(I)表示的石蒜西定和由以下化学结构式(II)表示的石蒜西定醇能显著抑制β-淀粉样蛋白的生成。

因此，本发明的另一实施例涉及用于预防或治疗痴呆症的组合物，所述组合物包含作为活性成分使用的由化学结构式(I)表示的石蒜西定和由化学结构式(II)表示的石蒜西定醇、以及它们在药学上允许的盐组成的一组化合物中的1种或1种以上的化合物。

所述痴呆症包括阿尔茨海默疾病和血管性痴呆症，在本发明的较佳实施例中提及的痴呆症尤其是指阿尔茨海默病。

石蒜西定，化学结构见化学结构式I，米黄色的半固态物质，分子式为C₁₄H₁₃NO₆、分子量为291。石蒜西定醇，化学结构见化学结构式II，米黄色的半固态物质，分子式为C₁₄H₁₃NO₇、分子量为307。所述石蒜西定和石蒜西定醇在实验中表现出非常显著的抑制β-淀粉样蛋白生成的作用，可作为对痴呆症，特别是阿尔茨海默病的预防及治疗剂使用，也可以在动物模型和试管模型中作为抑制β-淀粉样蛋白生成的阳性对照样品使用。

在抑制β-淀粉样蛋白生成、及/或对痴呆症特别是阿尔茨海默疾病的预防及/或治疗方面，由于所述忽地笑提取物、或从所述提取物中分离得到的有机溶剂萃取物(或者细分馏物)、石蒜西定和石蒜西定醇均为从植物药中提取的化学成分，因此可使现有的痴呆症(例如阿尔茨海默病)治疗剂引发的副作用达到最小化。该组合物中1种或1种以上组分既可单独给药，也可以与现有的Tacrine、Donepezil、Rivastigmine等药物配合使用用于预防及/或改善痴呆症。

本发明的另一实施例涉及包含上述组合物中1种或1种以上组分的用于预防及/或改善痴呆症的健康功效食品。所述痴呆症包括阿尔茨海默疾病和血管性痴呆症，特别在较佳实施例中所提及的痴呆症是指阿尔茨海默疾病。

健康功效食品包括用于预防及/或改善痴呆症的各种食品及/或饮料，例如，各种食品、饮料、口香糖、茶、维生素、多种营养片、健康功效辅助食品以及食品添加剂，该食品包括粉末、颗粒、片剂、胶囊或者饮料等多种形态。健康功效食品内预防及/或治疗痴呆症的组合物的含量可根据最终成品的目的、用途、对象、形状等进行适当地调整。例如，以固态物质的质量为基准，可以将忽地笑提取物、从所述提取物中分离得到的有机溶剂萃取物(或者细分馏物)、石蒜西定及/或石蒜西定醇质量百分比含量调制为0.00001-50％，最好是0.0001-10％，但并不限于此。

本发明的再一实施例涉及一种具有显著抑制β-淀粉样蛋白生成活性的忽地笑(Lycoris aurea)提取物(包含有机溶剂萃取物及/或细分馏物)的制备方法。所述制备方法如下：

用水或/和含1至4个碳原子的低级醇中的1种或1种以上的醇作溶剂对忽地笑(Lycoris aurea)进行提取，得到忽地笑提取物(步骤1)；

对所述步骤1中获得的提取物依次分别采用己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯及丁醇进行萃取，获得己烷萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物和丁醇萃取物(步骤2)；

合并所述步骤2中获得的乙酸乙酯萃取物和丁醇萃取物之后，采用反相柱色谱、以乙腈和水的混合溶液作为洗脱剂对其进行分离，制得细分馏物。

此时，所述获得的细分馏物主要含有石蒜西定和石蒜西定醇。

步骤1为采用水或/和含1至4个碳原子的低级醇中的1种或1种以上的醇作溶剂对忽地笑进行提取的过程。在较佳实施例中，所述萃取溶剂可以是体积百分比为50-95％的甲醇、乙醇或异丙醇水溶液。所述忽地笑可以是栽培或市场上销售的产品，对此并不做任何限制。忽地笑的使用部位没有限制，可使用全草或鳞茎。该药材用水清洗干净，在阴凉处干燥后即可使用。所述提取方法没有特别的限制，常用的提取方法均可使用，如冷浸法、渗漏法、热回流提取法、超声波提取方法、超临界萃取方法或电萃取方法等。在一具体的实施例中，将干燥过的忽地笑的全草粉碎成适当的大小后装入提取容器中，之后添加水或/和含1至4个碳原子的低级醇中的1种或1种以上的醇作溶剂，最好是体积百分比为50-95％的甲醇、乙醇或异丙醇水溶液，接着对溶液进行加热回流提取，然后将其搁置一段时间再进行过滤。将药材残渣去除后，过滤液经减压浓缩可获得忽地笑提取物。在该提取方法中，醇溶剂的体积最好是经粉碎试样体积的1-5倍。萃取时间在1-12小时比较恰当，最好为3小时。然后，可以进一步进行浓缩或冷冻干燥等的一般过程。

步骤2是对所述步骤1提取的忽地笑提取物用水进行悬浮之后，依次分别采用己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯及丁醇进行萃取，获得四种有机溶剂萃取物的过程。例如，向所述步骤1中获得的忽地笑提取物中加入约5-100倍忽地笑提取物重量的水，最好是10-60倍，充分搅拌使之成为悬浮液。然后依次分别采用己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯及丁醇进行萃取，获得己烷萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物和丁醇萃取物。此时，己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯及丁醇的使用量是萃取物重量的约5-100倍体积，最好是10-60倍体积，可以与所述悬浮方法中的水的用量相等。其中，乙酸乙酯萃取物和丁醇萃取物均能显著抑制β-淀粉样蛋白的生成，因此在以下制备步骤中采用乙酸乙酯萃取物和丁醇萃取物的混合物。

步骤3对所述获得的乙酸乙酯萃取物和丁醇萃取物的混合物，以乙腈和水混合溶液作为洗脱剂，进行反相柱色谱分离而获得的细分馏物。为了获得活性成分，该色谱分离方法最好采用梯度洗脱，即在60分钟内，将洗脱剂中的乙腈体积百分比浓度从10％增加到50％，该洗脱液可含有体积百分比为0.001-0.004％的三氟乙酸，其最佳浓度为0.002％。

本发明的一个具体实施例中，采用上述方法，制得四种细分馏物，依次为CN1-M-E-fr1、CN1-M-E-fr2、CN1-M-E-fr3、CN1-M-E-fr4，它们对应的色谱分离条件分别为：洗脱剂中在乙腈的体积百分比浓度为10-30％、31-33％、42-44％、45-50％。CN1-M-E-fr2细分馏物含有石蒜西定，其中石蒜西定的质量百分比含量大于90％，最佳为95-99.9％；CN1-M-E-fr3细分馏物含有石蒜西定醇，其中石蒜西定醇的质量百分比含量大于90％，最佳为95-99.9％。

本发明的又一实施例中，所述制备方法可进一步包括步骤4。在所述步骤4中，分别对步骤3中获得的CN1-M-E-fr2细分馏物和CN1-M-E-fr3细分馏物再次进行反相柱色谱分离，从而精制由化学结构式I表示的石蒜西定和由化学结构式II表示的石蒜西定醇。此时，精制石蒜西定的色谱分离条件为，在40分钟内，将洗脱剂中的乙腈体积百分比浓度从10％增加到20％进行梯度洗脱，该洗脱液还含有体积百分比为0.05-0.2％的三氟乙酸，其最佳浓度为0.1％。精制石蒜西定醇的色谱分离条件为，在20分钟内，将洗脱剂中的乙腈体积百分比浓度从10％增加到20％进行梯度洗脱。

本发明的忽地笑提取物、有机溶剂萃取物、石蒜西定和石蒜西定醇可以在单独使用，或与他可林(Tacrine)、多奈哌齐(Donepezil)、酒石酸卡巴拉汀(Rivastigmine)等现有的痴呆症(例如，阿尔茨海默疾病)治疗剂配合使用，或可以作为生药混合组合物使用，用于预防及/或治疗痴呆症、特别是阿尔茨海默疾病。

附图说明：

图1a、图1b是忽地笑醇提取物(CN1-M)在不同浓度下抑制Aβ42及Aβ40生成的效果图。

图2是由忽地笑醇提取物制备的四种溶剂萃取物(CN1-MH、CN1-MM、CN1-ME、CN1-MB)分别在25μg/ml浓度下抑制Aβ42生成的效果图。

图3是从合并乙酸乙酯萃取物(CN1-ME)和丁醇萃取物(CN1-MB)而成的混合物(CN1-M-E)中制备得到的四种细分馏物(CN1-M-E-fr1、CN1-M-E-fr2、CN1-M-E-fr3、CN1-M-E-fr4)分别在25μg/ml浓度下抑制Aβ42生成的效果图。

图4a、图4b是化合物石蒜西定(CN1-M-E2)及石蒜西定醇(CN1-M-E3)在不同浓度下抑制Aβ42生成的效果图。

图5是化合物石蒜西定(CN1-M-E2)及石蒜西定醇(CN1-M-E3)减少sAPPα生成的效果图。

图6是化合物石蒜西定(CN1-M-E2)及石蒜西定醇(CN1-M-E3)减少sAPPα及sAPPβ生成的效果图。

图7a、图7b是根据蛋白质印迹(Western blot)结果绘制的、经过石蒜西定(CN1-M-E2)及石蒜西定醇(CN1-M-E3)处理的sAPPα及sAPPβ的条带密度图。

图8a、图8b是石蒜西定(CN1-M-E2)及石蒜西定醇(CN1-M-E3)在不同浓度下表现的细胞毒性效果图。

具体实施方式：

下面，结合实施例和附图进一步详细说明本发明。但以下实施例仅为本发明的示例，本发明的保护范围并不局限于此。

<实施例1>忽地笑醇提取物的制备

在本实施例中，忽地笑药材采自中国湖北省。取200g在阴凉处干燥的忽地笑鳞茎，将其切细，放入提取容器中，加入试样体积二倍的体积百分比浓度为95％乙醇，热回流提取3小时后，在室温下冷却，过滤。过滤液在40℃和减压环境下浓缩至溶剂完全蒸发，制得50g醇提取物(CN1-M)。

<实施例2>忽地笑溶剂萃取物的制备及乙酸乙酯与丁醇混合萃取物之细分馏物的制备

将所述实施例1制得的忽地笑醇提取物25g置入1L水中，充分搅拌使之混悬，之后依次分别加入己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丁醇四种溶剂进行萃取，每种溶剂分别连续萃取两次，每次加入1L。萃取液经减压浓缩至溶剂完全蒸发后，分别获得己烷萃取物1.3g、二氯甲烷萃取物94mg、乙酸乙酯萃取物90mg及丁醇萃取物1.2g，剩余的水溶液浓缩干燥后重量为22g。

以含有0.02％三氟乙酸的乙腈和水的混合溶液作为洗脱剂，采用C18反相柱色谱分馏法，对乙酸乙酯与丁醇萃取物的混合物1.29g进行分离，从而制得四种细分馏物。具体柱色谱分离方法为：将洗脱剂中乙腈的体积百分比浓度维持在10％5分钟后，在60分钟内将乙腈的体积百分比浓度由10％梯度增加至50％；在停留时间段第8分钟到第36分钟内(乙腈的体积百分比浓度从10％增加至30％)获得CN1-M-E-fr1，第36分钟到第40分钟内(乙腈的体积百分比浓度从31％增加至33％)获得CN1-M-E-fr2，第53分钟到第56分钟内(乙腈的体积百分比浓度从42％增加至44％)获得CN1-M-E-fr3，第56分钟到第60分钟内(乙腈的体积百分比浓度从45％增加至50％)获得CN1-M-E-fr4。四种分馏物均含有石蒜西定或石蒜西定醇，其中CN1-M-E-fr2细分馏物的主要成分为石蒜西定，质量百分比含量大于90％；CN1-M-E-fr3细分馏物的主要成分为石蒜西定醇，质量百分比含量大于90％。

<实施例3>石蒜西定的精制及结构鉴定

本发明的发明人对实施例2所制得的细分馏物CN1-M-E-fr2再次进行C18反相柱色谱分离，得到精制品5mg。

该精制方法的色谱分离条件为，在40分钟内，将洗脱剂中的乙腈体积百分比浓度从10％增加到20％进行梯度洗脱，该洗脱液含有体积百分比为0.1％的三氟乙酸。

经核磁共振(Varian 500MHz NMR)的¹H NMR光谱分析及高效液相色谱-质量分光计(Agilent1100HPLC-ESI-MS)的质谱分析，鉴定该精制品为石蒜西定(George R.Tettit and Joy A.Bell，J.Nat.Prod 69：7-13，2006)，化学结构见化学结构式I。分析结果如下：

米黄色半固态物质；分子式C₁₄H₁₃NO₆；ESI-MS：m/z 292[M+H]⁺¹HNMR(500MHz，CD₃OD)：δ3.92(1H，m，H-3)，3.94(1H，m，H-4)，4.26(1H，ddd，J＝4.5，2.0，1.5Hz，H-2)，4.40(1H，ddt，J＝9.5，2.5，1.0Hz，H-4a)，6.06和6.08(每1H，d，J＝1.0Hz，-OCH₂O-)，6.18(1H，m，H-1)，7.17(1H，s，H-10)，7.40(1H，s，H-7)。

<实施例4>石蒜西定醇的精制及结构鉴定

本发明的发明人对实施例2所制得的细分馏物CN1-M-E-fr3再次进行C18反相柱色谱分离，得到精制品10mg。

该精制方法的色谱分离条件为，在20分钟内，将洗脱剂中的乙腈体积百分比浓度从10％增加到20％进行梯度洗脱。

经核磁共振(Varian 500MHz NMR)的¹H NMR光谱分析及高效液相色谱-质量分光计(Agilent1100HPLC-ESI-MS)的质谱分析，鉴定该精制品为石蒜西定醇(Shanmugham Elango and Yu-Hsin Yan，J.Org.Chem 67：6954-6959，2002)，化学结构见化学结构式II。分析结果如下：

米黄色半固态物质；分子式C₁₄H₁₃NO₇；ESI-MS：m/z 308[M+H]⁺；¹H NMR(500MHz，CD₃OD)：δ3.91(1H，m，H-3)，3.92(1H，m，H-4)，4.24(1H，m，H-2)，4.36(1H，m，H-4a)，6.03和6.05(每1H，d，J＝1.0Hz，-OCH₂O-)，6.18(1H，m，H-1)，6.75(1H，s，H-10)。

<试验例1>忽地笑提取物对β-淀粉样蛋白生成的抑制效果评价

为了评价忽地笑提取物对β-淀粉样蛋白生成的抑制效果，本发明采用了经过人淀粉样前体(Human APP)基因转染(transfection)的海拉(HeLa)细胞株。所述细胞株由Tae-Wan Kim教授(Department of Pathology，Columbia University Medical Center，New York，NY10032，USA)提供。本实验分别采用人β-淀粉样蛋白1-40(Human Beta Amyloid[1-40])(Aβ40)、人β-淀粉样蛋白1-42(Human Beta Amyloid[1-42])(Aβ42)比色-酶联免疫吸附测定试剂盒(Colorimetric ELISA Kit)(#KHB3482和#KHB3442；BioSource International，Inc.，USA)对细胞分泌的Aβ40和Aβ42(β-淀粉样蛋白的主要成分)进行定量检测。

实验方法如下：首先，将经过基因转染的海拉细胞置于细胞培养基(DMEM培养基#11995；GIBCO)中，并在该培养基中分别添加表1所示浓度的忽地笑醇提取物(CN1-M，参见实施例1)，阴性对照组未添加所述忽地笑醇提取物，其他实验步骤同正常组。在37℃温度下培养8小时后，检测各培养基中的β-淀粉样蛋白量，实验结果见表1和图1a、图1b。

[表1]在不同浓度下，忽地笑醇提取物(CN1-M)对β-淀粉样蛋白生成的抑制效果

表1及图1a、图1b实验结果显示，忽地笑醇提取物能够剂量依赖性地抑制β-淀粉样蛋白Aβ42及Aβ40的生成。

<试验例2>忽地笑提取物CN1-M的有机溶剂萃取物对β-淀粉样蛋白生成的抑制效果评价

将所述实施例2所制得的溶剂萃取物——己烷萃取物(CN1-MH)、二氯甲烷萃取物(CN1-MM)、乙酸乙酯萃取物(CN1-ME)及丁醇萃取物(CN1-MB)配制成25μg/ml的受试液，采用试验例1中相同的方法分别测定四种溶剂萃取物(CN1-MH，CN1-MM，CN1-ME，CN1-MB)对β-淀粉样蛋白生成的抑制效果，实验结果见表2和图2。

[表2]忽地笑提取物的溶剂萃取物(25μg/ml)对β-淀粉样蛋白生成的抑制效果

表2及图2实验结果显示，乙酸乙酯(CN1-ME)及丁醇分馏物(CN1-MB)对Aβ42的生成具有显著的抑制效果。

<试验例3>由乙酸乙酯萃取物(CN1-ME)和丁醇萃取物(CN1-MB)组成的混合萃取物(CN1-M-E)所制得的四种细分馏物对β-淀粉样蛋白生成的抑制效果评价

将所述实施例2所制得的的四种细分馏物——CN1-M-E-fr1、CN1-M-E-fr2、CN1-M-E-fr3及CN1-M-E-fr4配制成25μg/ml的受试液，采用试验例1中相同的方法分别测定四种细分馏物(CN1-M-E-fr1、CN1-M-E-fr2、CN1-M-E-fr3及CN1-M-E-fr4)对Aβ42生成的抑制效果，实验结果见表3及图3。

[表3]乙酸乙酯萃取物(CN1-ME)和丁醇萃取物(CN1-MB)组成的混合萃取物(CN1-M-E)所制得的四种细分馏物(25μg/ml)对β-淀粉样蛋白生成的抑制效果

表3及图3实验结果显示，四种细分馏物对β-淀粉样蛋白的生成均表现出显著的抑制效果，抑制率达到96％。

<试验例4>石蒜西定及石蒜西定醇对β-淀粉样蛋白生成的抑制效果评价

将所述实施例3及实施例4所制得的的化合物石蒜西定(CN1-M-E2)及石蒜西定醇(CN1-M-E3)配制成系列浓度的受试液，采用试验例1中相同的方法分别测定其对Aβ42及Aβ40的抑制效果，实验结果见表4及图4a、图4b。

[表4]石蒜西定(CN1-M-E2)及石蒜西定醇(CN1-M-E3)对β-淀粉样蛋白生成的抑制效果

表4及图4a、图4b实验结果显示，石蒜西定和石蒜西定醇均对β-淀粉样蛋白的生成均表现出显著的抑制效果，该抑制效果还呈现剂量依赖性。

<试验例5>石蒜西定及石蒜西定醇对α-分泌酶活性的影响评价

如所述试验例4、表4及图4a、图4b所示，石蒜西定及石蒜西定醇能够显著抑制Aβ42及Aβ40的生成。抑制Aβ42及Aβ40的生成的原因有多种，如α-分泌酶的活性增加、β-分泌酶活性抑制及γ-分泌酶的活性抑制效果等。

为了明确石蒜西定及石蒜西定醇抑制Aβ生成的作用靶点，本实验使用α-分泌酶的活性检测试剂盒(assay kit)(#CBA042；Calbiochem，USA)进行检测，评价石蒜西定及石蒜西定醇对α-分泌酶的影响。实验中使用了由海拉细胞(参见试验例1)获得的细胞膜总蛋白(total membrane protein)。实验结果见表5及图5。

[表5]石蒜西定及石蒜西定醇所引起的α-分泌酶的活性变化(100％：表示未引起变化)

如表5及图5所示，石蒜西定及石蒜西定醇在0.01μg/ml、0.1μg/ml浓度下对α-分泌酶的活性未引起变化。试验例4中，所述浓度是这些化合物有效抑制Aβ42及Aβ40生成时的浓度(参见表4及图4)。因此可以确认，石蒜西定及石蒜西定醇之所以能够抑制Aβ42及Aβ40的生成，并不是因为其改变了α-分泌酶的活性。

<试验例6>石蒜西定及石蒜西定醇对α-分泌酶及β-分泌酶产物生成的抑制效果评价

为了评价石蒜西定及石蒜西定醇对α-分泌酶活性作用产物sAPPα及β-分泌酶活性作用产物sAPPβ生成的影响，本实验通过蛋白质印迹法(Western blot)对sAPPα和sAPPβ进行确认，实验结果见图6。从图6可知，石蒜西定及石蒜西定醇在0.1μg/ml浓度下能够显著抑制Aβ42及Aβ40的生成(见试验例4)，但并没有影响sAPPα及sAPPβ的分泌。检测本实验蛋白质印迹中sAPPα、sAPPβ的条带密度(density)，进行数理统计，试验结果见表6和图7a、图7b。

[表6]石蒜西定及石蒜西定醇对sAPPα、sAPPβ生成的影响

表6及图7a、图7b实验结果显示，石蒜西定及石蒜西定醇对sAPPα、sAPPβ生成的影响并不显著。由此推测，石蒜西定及石蒜西定醇对Aβ42及Aβ40生成的抑制作用并不是通过改变α-分泌酶及β-分泌酶的活性而产生的。

从以上结果可知，石蒜西定及石蒜西定醇对Aβ42及Aβ40生成的抑制效果是由于这些化合物作为其对γ-分泌酶活性的抑制剂来发挥作用而引起的。

<试验例7>石蒜西定及石蒜西定醇所引起的细胞凋亡效果评价

为了评价所述化合物石蒜西定及石蒜西定醇所引起的细胞凋亡(cell death)效果，本实验使用MTT细胞增殖检测法(MTT Cell Proliferation assay)(ATCC catalog#30-1010K，Manassas，USA)进行了检测。用不同浓度的所述化合物分别与细胞孵育8小时后，测量存活细胞(viable cell)，计算细胞死亡率。实验结果见表7及图8a、图8b。

表7及图8a、图8b实验结果显示，采在10μg/ml(本试验中最高浓度)的石蒜西定或石蒜西定醇进行处理，仅有约20％的细胞凋亡。由此可知，所述化合物显著抑制β-淀粉样蛋白生成的活性并不是单纯由细胞凋亡引起的，所述化合物对细胞没有明显的毒性。

[表7]石蒜西定及石蒜西定醇所引起的细胞死亡

Claims (14)

1.一种用于预防或治疗痴呆症的组合物，包含作为活性成分使用的忽地笑提取物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述忽地笑提取物是用水或/和含1至4个碳原子的低级醇中的1种或1种以上的醇作溶剂对忽地笑进行提取而得。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述忽地笑提取物是用水或/和含1至4个碳原子的低级醇中的1种或1种以上的醇作溶剂对忽地笑进行提取后，依次分别采用己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯以及丁醇对忽地笑提取物进行萃取而获得的有机溶剂萃取物中的乙酸乙酯萃取物、丁醇萃取物或它们的混合物。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述忽地笑提取物是用水或/和含1至4个碳原子的低级醇中的1种或1种以上的醇作溶剂对忽地笑进行提取后，再对经己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯以及丁醇萃取而获得的有机溶剂萃取物中的乙酸乙酯萃取物和丁醇萃取物的混合物进行反相柱色谱分离而获得的细分馏物，所述反相柱色谱分离采用乙腈和水的混合溶液作为洗脱剂。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于：所述反相柱色谱分离是在60分钟内，将所说的洗脱剂中的乙腈体积百分比浓度从10％增加到50％的条件下进行的。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于：当所说的洗脱剂中的乙腈体积百分比浓度为31-33％时，获得的细分馏物包含由以下化学结构式(I)表示、质量百分比浓度为90-99.9％的石蒜西定。

7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于：当所说的洗脱剂中的乙腈体积百分比浓度为42-44％时，获得的细分馏物包含由以下化学结构式(II)表示、质量百分比浓度为90-99.9％的石蒜西定醇。

8.一种用于预防或治疗痴呆症的组合物，其特征在于：所述组合物包含作为活性成分使用的由以下化学结构式(I)表示的石蒜西定、化学结构式(II)表示的石蒜西定醇、以及它们在药学上被允许的盐组成的一组化合物中的一种或一种以上的化合物。

9.根据权利要求1至8中任何一项所述的组合物，其特征在于：所述痴呆症为阿尔茨海默疾病。

10.一种用于预防或改善痴呆症的健康功效食品，包含如权利要求1至8中任何一项所述的组合物。

11.一种具有抑制β-淀粉样蛋白生成活性的忽地笑提取物的制备方法，包括以下步骤：

a.用水或/和含1至4个碳原子的低级醇中的1种或1种以上的醇作溶剂对忽地笑进行提取，得到忽地笑提取物；

b.对所获得的忽地笑提取物分别采用己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯及丁醇进行萃取，获得己烷萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物和丁醇萃取物；

c.合并所获得的有机溶剂萃取物中的乙酸乙酯萃取物和丁醇萃取物之后，以乙腈和水的混合溶液作为洗脱剂，采用反相柱色谱对其进行分离，制得细分馏物。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：所述反相柱色谱分离条件为，在60分钟内，所说的洗脱剂中的乙腈的体积百分比浓度从10％递增到50％。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，进一步包括：当所说的洗脱剂中乙腈的体积百分比浓度为31-33％时，从洗脱液中获取细分馏物的步骤，所述获得的细分馏物包含由化学结构式(I)表示、质量百分比浓度为90-99.9％的石蒜西定。

14.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，进一步包括：当所说的洗脱剂中乙腈的体积百分比浓度为42-44％时，从洗脱液中获取细分馏物的步骤，所述获得的细分馏物包含由化学结构式(II)表示、质量百分比浓度为90-99.9％的石蒜西定醇。

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