KR101093778B1 - 치매의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

개상사화 (Lycoris aurea) 추출물, 및/또는 이의 분획물, 및/또는 상기 추출물 또는 분획물로부터 분리된 화합물 라이코리시딘 및 라이코리시디놀의 치매의 예방 및/또는 치료 용도가 제공된다.

개상사화, Lycoris aurea, 치매, 알츠하이머 병, 베타-아밀로이드, 베타-세크리테아제, 라이코리시딘 (lycoricidine), 라이코리시디놀 (lycoricidinol)

Description

치매의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for the treatment or protection of dementia}

본 발명은 개상사화 (Lycoris aurea) 추출물, 및/또는 이의 분획물, 및/또는 상기 추출물 또는 분획물로부터 분리된 화합물 라이코리시딘 및 라이코리시디놀의 치매의 예방 및/또는 치료 용도에 관한 것이다.

세계가 점차 노령화 사회로 접어들면서 뇌졸중, 파킨슨씨병, 알츠하이머 병등 각종 뇌질환에 시달리는 사람이 급증하고 있으며, 그 비용도 천문학적으로 소요되고 있다. 알츠하이머는 뇌신경의 일시적 혹은 지속적인 손상으로 발생한 것으로 정신기능의 전반적인 장애가 나타나는 것을 특징으로 하는 진행성 및 퇴행성 질환이다. 아직까지 발병원인이 정확하게 밝혀지지는 않았지만 노화와 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다. 노화과정에서 베타-아밀로이드라는 단백질이 뇌에 축적되어 엉키게 되는 플라그를 만들고 이로 인해 알츠하이머병이 발병하는 것으로 알려져 있다(Breimer LH, et al. Nature, 326: 749-750, 1987). 과거에는 아세틸콜 린 에스테라제라는 효소를 주요 약물작용점으로 하여 치매 질환 치료를 위한 연구가 수행되었으나, 현재 이 효소의 활성 억제는 알츠하이머병으로 인한 치매 환자에게 나타나는 아세틸콜린이라는 신경전달물질 저하현상을 억제하여 정상적인 생활이 가능하도록 유도하는 역할만을 할 뿐 병을 일으키는 근본 원인을 제거하는 것은 아닌 것으로 알려졌다. 현재까지 해외에서 개발된 알츠하이머병 치료제로서 FDA의 승인을 얻은 것은 아세틸콜린에스테라제 억제제(AChEIs:Acetyl cholinesterase inhibitors)와 N-메틸(N-methyl) D-아스파테이트(D-aspartate) 수용체 길항제(NMDARA) 계통 화합물이며, 현재 미국 등 선진국의 다국적 제약회사들을 중심으로 현재 15개 정도의 치료제가 임상시험 중이다. 그러나 이러한 치료제는 알츠하이머의 근본적인 치료제가 되지 못하므로 알츠하이머 질환 생성의 주된 원인으로 추정되는 베타-아밀로이드의 생성량을 감소시키기 위해서 베타 또는 감마-세크리테아제 저해제 및 베타-아밀로이드 응집 저해제의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명의 일례는 개상사화의 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매의 예방 및/또는 치료용 조성물 및 건강 기능성 식품을 제공한다.

본 발명이 또 다른 예는 라이코리시딘, 라이코리시디놀 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 치매의 예방 및/또는 치료용 조성물 및 건강 기능성 식품을 제공한다.

본 발명의 또 다른 예는 치매의 예방 및/또는 치료 효과가 우수한 개상사화 추출물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명자들은 개상사화 추출물, 및/또는 이의 분획물, 및/또는 상기 추출물 또는 분획물로부터 분리된 화합물인 라이코리시디놀 및 라이코리시딘이 시험관 실험 모델에서 베타-아밀로이드 생성을 억제시킴으로써, 치매, 특히 알츠하이머 질환의 예방 및/또는 치료 효과를 가짐을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

베타-아밀로이드(Aβ)는 아밀로이드 전구체 (APP)가 막단백질 가수분해 효소인 베타-세크리테아제 (BACE1), 감마-세크리테아제의 연속적인 작용으로 만들어진다. 베타-세크리테아제의 작용으로 먼저 sAPPβ가 만들어지고, 이것은 감마-세크리테아제의 작용으로 베타-아밀로이드로 만들어진다. 베타-아밀로이드는 40개와 42개의 아미노산으로 이루어진 Aβ40와 Aβ42를 포함한다. Aβ40이 그 대부분을 차지하지만, 상대적으로 적게 만들어지는 Aβ42가 플라그를 쉽게 만들기 때문에 가장 중요한 병인 물질로 지목되고 있다. APP는 베타-세크리테아제의 작용을 받지 않고 다른 경로로 가수분해가 이루어지기도 하는데, 이 경우에는 먼저 알파-세크리테아제에 의해 sAPPα가 만들어지고, 이것이 감마-세크리테아제의 연속적인 작용으로 해가 되지 않는 p3라는 물질이 만들어지기 때문에 베타-아밀로이드는 만들어지지 않는다. 따라서 BACE1 (beta-site amyloid precursor protein (APP)-cleaving enzyme)을 유전적으로 제거한 쥐를 만들면, 베타-아밀로이드 침착이 만들어지지 않으며, 알츠하이머병의 모델 쥐에서 발현되는 인지장애 등이 억제된다고 보고되어 있다 (Laird et al. J. Neuroscience 25: 11693-11709, 2005; Ohno et al. Neuron 41: 27-33, 2004). 이와 같은 결과들은 베타-세크리테아제는 베타-아밀로이드 형성에 중요한 효소이며, 이에 대한 저해제가 치매, 특히 알츠하이머병의 치료제로 적용될 수 있을 가능성을 보여준다. 또한 알파-세크리테아제의 활성 변화 물질도 알츠하이머 치료제의 중요한 타겟이 될 수 있을 것으로 생각되고 있다. 이와 함께 베타-아밀로이드를 만드는 최종 효소는 감마-세크리테아제이기 때문에 이에 대한 효과적인 저해제도 치료제로서 적용 가능할 것으로 기대되고 있다.

개상사화(Lycoris aurea)는 수선화과 식물인 개상사화의 전초이다. 개상사화는 한국(제주·전남·충남)·일본·타이완·중국 등지에 분포하며, 알칼로이드(alkaloid)와 플라보노이드(flavonoid) 성분들을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 개상사화 추출물의 항암효과는 알려져 있지만 (Nerome, K. et al. WO2008078362A1), 베타-아밀로이드 생성 억제 또는 치매 (예컨대, 알츠하이머병) 예방 및 치료와 관련된 효과는 현재까지 보고된 바 없다.

본 발명에서 베타-아밀로이드 생성 억제에 있어서의 유효 성분으로 분리된 라이코리시딘 및 라이코리시디놀은 나르시서스 속 식물(Narcissus), 라이코리스 속 식물 (Lycoris), 판크라티움 속 식물 (Pancratium), 수선 속 식물 (Haemanthus)에 존재하는 것으로 보고되어 있다. 라이코리시딘 및 라이코리시디놀은 항바이러스 효과 (Gabrielsen, B. et al. J. Nat. Prod. 55: 1569, 1992)와 항암효과 (Mondon, A. et al. Chem. Ber. 108: 445, 1975)를 갖는 것으로 알려져 있으나, 베타-아밀로이드 생성 억제 또는 치매 (알츠하이머) 예방 및 치료와 관련된 효과는 현재까지 보고된 바 없다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

우선 본 발명의 일례는 개상사화 (Lycoris aurea) 추출물의 베타-아밀로이드 생성 억제, 또는 치매의 예방 및/또는 개선 및/또는 경감 및/또는 치료에 있어서의 용도를 제공한다.

따라서, 본 발명의 일례는 개상사화 (Lycoris aurea) 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매의 예방 및/또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 예는 베타-아밀로이드 생성 억제제 및/또는 치매의 예방 및/또는 치료용 조성물의 제조에 사용되는 개상사화 (Lycoris aurea) 추출물의 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 예는 개상사화 (Lycoris aurea) 추출물을 베타-아밀로이드 생성 억제를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 베타-아밀로이드 생성 억제 방법, 또는 개상사화 (Lycoris aurea) 추출물을 치매의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 치매의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다. 상기 환자는 포유 동물일 수 있고, 바람직하게는 인간일 수 있다.

상기 치매는 알츠하이머 질환과 혈관성 치매를 포함하며, 특히 바람직한 구체예에서, 치매는 알츠하이머 질환이다.

베타-아밀로이드 생성 저해에 효과가 있는 유효 성분의 함량을 높이기 위하여, 상기 개상사화 추출물은 개상사화를 물, 및 C1 내지 C4의 저급 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매, 바람직하게는 50 내지 95 v/v%의 메탄올, 에탄올, 또는 이소프로판올로 추출하여 얻어진 것일 수 있다.

베타-아밀로이드 생성 저해에 효과가 있는 유효 성분의 함량을 높이기 위하여, 상기 개상사화 추출물은 개상사화를 물, 및 C1 내지 C4의 저급 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매, 바람직하게는 50 내지 95 v/v%의 메탄올, 에탄올, 또는 이소프로판올로 추출한 후, 헥산, 염화메틸렌, 초산에틸 및 부탄올로 차례로 분획하여 얻어진 용매 분획물 중의 초산에틸 분획물, 부탄올 분획물 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

보다 바람직한 구체예에 있어서, 개상사화 추출물은 상기 얻어진 초산에틸 분획물과 부탄올 분획물의 혼합물에 대하여 아세토니트릴과 물의 혼합액을 용리액으로 사용하는 역상 크로마토그래피를 수행하여 얻어진 소분획물로서, 하기하는 바와 같은 유효성분 라이코리시딘 및/또는 라이코리시디놀을 고함량으로 함유하여 베타-아밀로이드 생성 저해 효과가 우수한 것일 수 있다. 이 때, 상기 용리액으로 사용되는 아세토니트릴과 물의 혼합액 중의 아세토니트릴 함량은 10 내지 50 v/v%인 것이 좋고, 특히, 31 내지 33 v/v%인 경우에는 라이코리시딘의 함량이 높은 소분획물이 얻어지고, 42 내지 44 v/v%인 경우에는 라이코리시디놀의 함량이 높은 소분획물이 얻어진다. 상기 31 내지 33 v/v%인 경우의 소분획물 내의 라이코리시딘의 함량은 약 90 w/w% 이상, 예컨대, 90 내지 99.9 w/w%, 바람직하게는 95 내지 99.9 w/w%이다. 상기와 같은 라이코리시딘 함량은 최초의 물 및 C1-C4 저급 알코올 혼합물로 추출한 조추출물 중량을 기준으로 약 0.04 내지 0.1 w/w% 정도에 해당하는 값이다. 또한, 상기 42 내지 44 v/v%인 경우의 소분획물 내의 라이코리시디놀의 함량은 약 90 w/w% 이상, 예컨대, 90 내지 99.9 w/w%, 바람직하게는 95 내지 99.9 w/w%이다. 상기와 같은 라이코리시딘 함량은 최초의 물 및 C1-C4 저급 알코올 혼합물로 추출한 조추출물 중량을 기준으로 약 0.02 내지 0.05 w/w% 정도에 해당하는 값이다.

또 다른 예에 있어서, 본 발명자들은 상기 개상사화 추출물 및/또는 분획물 및/또는 소분획물의 유효성분을 분석한 결과, 하기 화학식 1로 표시되는 라이코리시딘과 하기의 화학식 2로 표시되는 라이코리시디놀이 베타-아밀로이드 생성 억제, 및/또는 알파- 또는 베타-세크리테아제 활성 억제에 효과적인 것으로 확인되었다.

<화학식 1>

<화학식 2>

따라서, 본 발명의 또 다른 예는 화학식 1로 표시되는 라이코리시딘, 화학식 2로 표시되는 라이코리시디놀, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 조성물과 관련된 것이다.

상기 치매는 알츠하이머 질환과 혈관성 치매를 포함하며, 특히 바람직한 구체예에서, 치매는 알츠하이머 질환이다.

상기 화학식 1로 표시되는 라이코리시딘은 분자식이 C₁₄H₁₃NO₆이고 분자량은 291인 미황색의 반고형성 물질이다. 또한 화학식 2로 표시되는 라이코리시디놀은 분자식이 C₁₄H₁₃NO₇이고 분자량은 307인 미황색의 반고형성 물질이다. 상기 라이코리시딘 및 라이코리시디놀은 시험관내에서 매우 우수한 베타-아밀로이드 생성 억제 작용을 나타내어, 치매, 특히 알츠하이머 질환의 예방 및 치료제로서 사용될 수 있다. 또한 상기 라이코리시딘 및 라이코리시디놀은 단독요법으로 베타-아밀로이드 생성 억제제로서 임상에서 뿐만 아니라 동물모델 및 시험관 모델에서 양성대조군으로 활용될 수 있다.

베타-아미로이드 생성 저해, 및/또는 치매, 특히 알츠하이머 질환의 예방 및/또는 치료에 있어서, 상기 개상사화화 추출물, 이로부터 제조되는 분획물 (또는 소분획물), 라이코리시딘 및 라이코리시디놀은 생약 성분이거나 생약으로부터 추출된 성분이므로, 기존의 치매 (예컨대, 알츠하이머 질환) 치료제들로 인한 부작용을 최소화하거나 피해 갈 수 있는 이점이 있으며, 상기 성분들 중 1종 이상을 단독으로 투여하는 단독요법으로 적용되거나, 기존의 약물인 Tacrine, Donepezil, Rivastigmine 등과 복합 투여하는 복합요법 등으로 적용 가능하다.

본 발명의 또 다른 예는 상기 치매 예방 및/또는 치료용 조성물을 포함하는 치매 예방 및/또는 개선용 건강 기능성 식품에 관한 것이다. 상기 치매는 알츠하이머 질환과 혈관성 치매를 포함하며, 특히 바람직한 구체예에서, 치매는 알츠하이머 질환이다.

건강 기능성 식품은 치매의 예방 및/또는 개선을 위한 각종 식품 및/또는 음료를 모두 포함하며, 예컨대, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조 식품, 식품 첨가제 등일 수 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태일 수 있다. 건강 기능성 식품 내의 치매의 예방 및/또는 치료용 조성물의 함량은 최종 제품의 목적, 용도, 대상, 형태 등을 고려하여 적절하게 조절될 수 있으 며, 예컨대, 고형물 함량 기준으로, 개상사화화 추출물, 이로부터 제조되는 분획물 (또는 소분획물), 라이코리시딘 및/또는 라이코리시디놀을 0.00001 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 예는 베타-아밀로이드 저해 활성이 우수한 개상사화(Lycoris aurea) 추출물 (분획물 및/또는 소분획물 포함)을 제조하기 위한 제조 방법에 관한 것이다. 상기 제조 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:

개상사화를 물, 및 C1 내지 C4의 저급 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하는 단계 (단계 1);

상기 단계 1에서 제조된 추출물에 헥산, 염화메틸렌, 초산에틸, 및 부탄올을 차례로 가하여 각 용매 분획물을 얻는 단계 (단계 2); 및

상기 단계 2에서 얻어진 분획물 중 초산에틸 분획물 및 부탄올 분획물을 아세토니트릴/물의 혼합액을 용리액으로 사용하여 역상 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 소분획을 얻는 단계.

이 때, 상기 얻어진 소분획은 라이코리시딘 및 라이코리시디놀을 주성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

단계 1은 개상사화를 물, 및 C1 내지 C4의 저급 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하는 단계이다. 바람직한 구체예에서, 상기 추출 용매는 50 내지 95 v/v%의 메탄올, 에탄올, 또는 이소프로판올일 수 있다. 상기 개상사화는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있으며, 전초를 사용하거나 구근을 사용할 수 있으나, 사용 부위가 제한되는 것은 아니며, 깨끗이 세척하고 음지에서 건조하여 사용할 수 있다. 상기 추출 방법은 특별한 제한은 없고, 통상적으로 사용되는 모든 방법으로 가능하며, 예컨대, 가열 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 가압추출법, 환류추출법, 초임계 추출법, 또는 전기적 추출법 등을 사용할 수 있다. 한 구체예에서, 건조된 개상사화의 전초를 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 물 또는 C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 50 내지 95 v/v%의 메탄올, 에탄올, 또는 이소프로판올을 넣고 용액을 끓이며 환류 추출한 후, 일정시간 방치한 다음 잔사를 여과하여 제거한 후 알코올 추출물을 얻을 수 있다. 이때 알코올 용매의 부피는 분쇄한 시료 부피의 1 내지 5배인 것이 바람직하다. 추출 시간은 1 내지 12시간인 것이 바람직하며, 3시간인 것이 가장 바람직하다. 이후에 농축 또는 동결건조 등의 통상적 과정을 추가적으로 거칠 수 있다.

단계 2는 통상적으로 알려진 방법을 이용하여 상기 단계 1에서 추출된 추출물을 물로 현탁한 후 헥산, 염화메틸렌, 초산에틸 및 부탄올로 차례로 분획하여 용매 분획물을 얻는 단계이다. 예컨대, 상기 얻어진 추출물에 추출물 질량 기준으로 약 5 내지 100 부피배, 바람직하게는 10 내지 60 부피배의 물을 가하여 현탁시킨 후, 헥산을 가하여 헥산 분획물을 분리하고, 잔사에 염화메틸렌을 처리하여 염화메틸렌 분획물을 분리하고, 여기서 남은 잔사에 초산에틸을 처리하여 초산에틸 분획물을 분리하고, 여기서 남은 잔사에 부탄올을 처리하여 분탄올 분획물을 얻을 수 있다. 이 때 헥산, 염화메틸렌, 초산에틸 및 부탄올의 사용량은 추출물 질량 기준으로 약 5 내지 100 부피배, 바람직하게는 10 내지 60 부피배로 할 수 있으며, 상 기 현탁에 사용된 물의 양과 동일하게 할 수 있다. 이 중에서 초산에틸 분획물과 부탄올 분획물이 베타-아밀로이드 억제 효과가 보다 우수하여, 다음 단계에 초산에틸 분획물과 부탄올 분획물의 혼합물이 사용되는 것이 좋다.

단계 3은 아세토니트릴과 물의 혼합용액을 용리액으로 사용하여 역상 액체크로마토그래피를 사용하여 수행될 수 있는데, 이 때, 아세토니트릴의 함량을 증가시키면서 진행될 수 있다. 하기의 시험예에서 확인되는 바와 같이, 세포독성이 적고 베타-아밀로이드 생성 억제 효과가 우수한 분획물을 얻기 위하여, 아세토니트릴 함량을 증가시키면서, 예컨대, 60분 동안 농도구배를 10:90 (아세토니트릴 부피:물 부피)에서 50:50 (아세토니트릴 부피:물 부피)로 변화시키면서, 즉 아세토니트릴 농도를 10-50 v/v%로 증가시키면서 진행하는 것이 바람직하다. 또한 사익 용리액으로 사용되는 아세토니트릴과 물의 혼합용액은 0.001 내지 0.004, 바람직하게는 약 0.002 v/v%의 트리플루오르아세트산을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서는, 이와 같이 얻어진 소분획물 중 10v/v%에서 30v/v% ('CN1-M-E-fr1'로 명명), 31v/v%에서 33v/v% ('CN1-M-E-fr2'로 명명), 42v/v%에서 44v/v% ('CN1-M-E-fr3'로 명명), 45v/v%에서 50v/v% ('CN1-M-E-fr4'로 명명) 아세토니트릴/물을 용리액으로 사용할 때 용출된 용액을 감압건조하여 4개의 소분획물을 조제하였다. 상기 분획 중 CN1-M-E-fr2 소분획물은 라이코리시딘을 주성분으로, 약 90 w/w% 이상, 예컨대, 90 내지 99.9 w/w%, 바람직하게는 95 내지 99.9 w/w%의 양으로 포함하고, CN1-M-E-fr3 소분획물은 라이코리시디놀을 주성분으로, 약 90 w/w% 이상, 예컨대, 90 내지 99.9 w/w%, 바람직하게는 95 내지 99.9 w/w%의 양으로 포함하는 것으로 나 타났다.

본 발명의 또 다른 예에 있어서, 상기 제조 방법은 단계 3에서 조제된 라이코리시딘을 주성분으로 하는 CN1-M-E-fr2 소분획물 및 라이코리시디놀을 주성분으로 하는 CN1-M-E-fr3 소분획물을 각각 역상 컬럼 크로마토그래피를 재수행하여 화학식 1로 표시되는 라이코리시딘 및 화학식 2로 표시되는 라이코리시디놀을 정제하는 단계 (단계 4)를 추가로 포함할 수 있다. 이때 라이코리시딘의 정제를 위하여, 상기 소분획물, 바람직하게는 라이코리시딘을 주성분으로 하는 CN1-M-E-fr2 소분획물에 대하여, 0.05 내지 0.2 v/v%, 바람직하게는 0.1 v/v%의 트리플루오르아세트산을 포함하는 아세토니트릴 및 물의 혼합용액을 용리액으로 사용하여, 40분 동안 10v/v% 아세토니트릴/물로부터 20v/v% 아세토니트릴까지 아세토니트릴의 조성을 높이는 농도구배로 역상 컬럼 크로마토그래피를 수행하여, 화학식 1로 표시되는 라이코리시딘을 정제할 수 있다. 또한 라이코리시디놀의 정제를 위하여, 상기 소분획물, 바람직하게는 라이코리시디놀을 주성분으로 하는 CN1-M-E-fr3 소분획물에 대하여, 아세토니트릴 및 물의 혼합용액을 용리액으로 사용하여, 20분 동안 10v/v% 아세토니트릴/물로부터 20v/v% 아세토니트릴까지 아세토니트릴의 조성을 높이는 농도구배로 화학식 2로 표시되는 라이코리시디놀을 정제할 수 있다.

본 발명의 개상사화 추출물, 분획물, 라이코리시딘 및 라이코리시디놀은 단독요법으로 적용하거나, 혹은 Tacrine, Donepezil, Rivastigmine 등과 같은 기존의 치매 (예컨대, 알츠하이머 질환) 치료제와 복합요법으로 적용하거나, 혹은 생약 혼합 조성물로서 적용하여, 치매, 특히 알츠하이머 질환의 예방 및/또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 아래의 실시예에 의하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나 아래의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 개상사화 알코올 추출물의 조제

중국 호북성 무한 등지에서 채집한 개상사화를 본 실시예에 사용하였다. 음지에서 건조시킨 개상사화의 구근 200 g을 세절한 후, 추출 용기에 넣고 95 v/v% 에탄올을 시료 부피의 2 부피배로 가한 후, 3시간 동안 환류 추출하고 상온으로 식힌 후 여과하였다. 상기 추출액을 용매가 완전히 증발할 때까지 40℃에서 감압 하에 농축하여, 50 g의 알코올 추출물(CN1-M)을 수득하였다.

<실시예 2> 개상사화 용매 분획물 및 초산에틸 분획의 소분획물 조제

상기 실시예 1에서 조제된 개상사화 알코올 추출물 25 g을 물 1L에 현탁시킨 후, 헥산, 염화메틸렌, 초산에틸, 부탄올을 1L씩 각각 2회씩 차례로 가하여 용매 분획함으로써 (각 용매는 특급을 사용), 분획물을 각각 1.3 g (헥산 분획물), 94 mg (염화메틸렌 분획), 90 mg (초산에틸 분획) 및 1.2 g (부탄올 분획)의 양으로 얻었으며, 남은 물 분획물은 22 g이었다.

이후, 초산에틸 분획 및 부탄올 분획을 합한 분획물 1.29 g에 대하여 0.02%의 트리플루오르아세트산을 함유한 아세토니트릴 및 물의 혼합용액을 용리액으로 사용하여 10% 아세토니트릴/물을 5분간 유지한 후 아세토니트릴:물의 비율을 60분 동안 10:90 부피비에서 50:50 부피비로 변화시키면서 C18 역상 크로마토그래피를 수행하여 머무름시간 8분에서 36분(아세토니트릴 함량: 10v/v%에서 30v/v%)까지의 CN1-M-E-fr1, 36분에서 40분(아세토니트릴 함량: 31v/v%에서 33v/v%)까지의 CN1-M-E-fr2, 53분에서 56분(아세토니트릴 함량: 42v/v%에서 44v/v%)까지의 CN1-M-E-fr3 및 56분에서 60분(아세토니트릴 함량: 45v/v%에서 50v/v%)까지의 CN1-M-E-fr4의 4종의 소분획물을 수득하였다. 4종의 분획 모두 상기 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 라이코리시딘 또는 라이코리시디놀을 함유하고 있었으나, 이 중 CN1-M-E-fr2 소분획물이 상기 라이코리시딘을 주성분으로 약 90 w/w% 이상 함유하고 있었고 CN1-M-E-fr3 소분획물이 상기 라이코리시디놀을 주성분 으로 약 90 w/w% 이상 함유하고 있었다.

<실시예 3> 라이코리시딘의 정제 및 구조 동정

본 발명자들은 <실시예 2>로부터 조제된 라이코리시딘을 주성분으로 함유하는 소분획물을 (CN1-M-E-fr2) 감압 농축한 후, 상기 농축물에 대하여 0.1v/v%의 트리플루오르아세트산을 함유한 아세토니트릴 및 물의 혼합용액을 용리액으로 사용하 여 10v/v% 아세토니트릴/물로부터 20v/v% 아세토니트릴/물까지 40분 동안 아세토니트릴의 조성을 높이는 농도구배로 C18 역상 컬럼을 사용한 고속유체크로마토그래피 분리법을 통하여 개상사화 추출물 25 g으로부터 화학식 1로 표시되는 라이코리시딘 5 mg을 수득하였다.

하기한 바와 같이 NMR 분석 및 질량 분석을 실시하여, 화학식 1로 표시되는 라이코리시딘의 구조를 동정하였다.

분자량 및 분자식은 Agilent 1100 고속유체크로마토그래피-질량 분광계(HPLC-ESI-MS)를 이용한 MS 측정을 통하여 291으로 결정하였으며, 핵자기공명기(Varian 500 ㎒ NMR)를 이용한 ¹H NMR 스펙트럼(spectrum) 분석을 통하여 그 구조를 상기 화학식 2와 같이 동정하였다 (George R. Tettit and Joy A. Bell, J. Nat. Prod 69: 7-13, 2006). 분석 결과는 다음과 같다.

미황색 반고형성 물질 분자식 C₁₄H₁₃NO₆; ESI-MS : m/z 292 [M+H]^{+ 1}H NMR (500 MHz, CD₃OD) : δ 3.92 (1H, m, H-3), 3.94 (1H, m, H-4), 4.26 (1H, ddd, J = 4.5, 2.0, 1.5 Hz, H-2), 4.40 (1H, ddt, J = 9.5, 2.5, 1.0 Hz, H-4a), 6.06 and 6.08 (each 1H, d, J = 1.0 Hz, -OCH₂O-), 6.18 (1H, m, H-1), 7.17 (1H, s, H-10), 7.40 (1H, s, H-7).

<실시예 4> 라이코리시디놀의 정제 및 구조 동정

상기 실시예 2로부터 조제된 라이코리시디놀을 주성분으로 함유하는 소분획물을 (CN1-M-E-fr3) 감압 농축한 후, 상기 농축물에 대하여 아세토니트릴 및 물의 혼합용액을 용리액으로 사용하여 10v/v% 아세토니트릴/물로부터 20v/v% 아세토니트릴/물까지 20분 동안 아세토니트릴의 조성을 높이는 농도구배로 C18 역상 컬럼을 사용한 고속유체크로마토그래피 분리법을 통하여 개상사화 추출물 25 g으로부터 화학식 2로 표시되는 라이코리시디놀 10 mg을 수득하였다.

하기한 바와 같이 NMR 분석 및 질량 분석을 실시하여, 화학식 2로 표시되는 라이코리시디놀의 구조를 동정하였다.

분자량 및 분자식은 Agilent 1100 고속유체크로마토그래피-질량 분광계(HPLC-ESI-MS)를 이용한 MS 측정을 통하여 307으로 결정하였으며, 핵자기공명기(Varian 500 ㎒ NMR)를 이용한 ¹H-NMR 스펙트럼(spectrum) 분석을 통하여 그 구조를 상기 화학식 2와 같이 동정하였다 (Shanmugham Elango and Yu-Hsin Yan, J. Org. Chem 67: 6954-6959, 2002). 분석 결과는 다음과 같다.

미황색 반고형성 물질; 분자식 C₁₄H₁₃NO₇; ESI-MS : m/z 308 [M+H]⁺; ¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) : δ 3.91 (1H, m, H-3), 3.92 (1H, m, H-4), 4.24 (1H, m, H-2), 4.36 (1H, m, H-4a), 6.03 and 6.05 (each 1H, d, J = 1.0 Hz, -OCH₂O-), 6.18 (1H, m, H-1), 6.75 (1H, s, H-10).

<시험예 1> 개상사화 추출물의 베타-아밀로이드 생성 억제 작용 평가

개상사화 추출물의 베타-아밀로이드 생성억제 작용을 시험관내에서 평가하기 위하여, Human APP가 형질감염되어 있는 HeLa 세포주를 사용하였다. 이 세포주는 Tae-Wan Kim 교수 (Department of Pathology, Columbia University Medical Center, New York, NY10032, USA)로부터 제공받아 사용하였다. 세포가 분비하는 감마-세크리테아제 활성의 결과물인 주요 베타-아밀로이드, Aβ40, Aβ42의 정량은 Human Beta Amyloid [1-40] (Aβ40), Human Beta Amyloid [1-42] (Aβ42) Colorimetric ELISA Kit (#KHB3482 and #KHB3442; BioSource International, Inc., USA)를 각각 사용하였다.

상기 형질감염 HeLa 세포가 배양된 세포 배양액 (DMEM 배양액 #11995; GIBCO)에 하기의 표 1에 표시된 바와 같은 일정 농도의 개상사화의 알코올 추출물 (CN1-M, 실시예 1 참조)을 첨가한 후 8시간동안 37℃에서 배양하였고, 배양액에 분비된 베타-아밀로이드의 양을 측정하여, 표 1 및 도 1에 나타내었다. 음성대조군으로서 상기 개상사화추 알코올 추출물을 첨가하지 않은 미처리 형질감염 HeLa 세포 배양액을 사용하였다.

[표 1] 개상사화 알코올 추출물 (CN1-M)의 농도별 베타 아밀로이드 생성 억제 효능

	100 μg/ml	25 μg/ml	5 μg/ml
음성대조군 대비 Aβ42 생성 억제율 (%)	87.8	77.5	31.9
음성대조군 대비 Aβ40 생성 억제율 (%)	73.4	46.6	15.5

표 1 및 도 1에서 보이는 바와 같이, 개상사화의 알코올 추출물은 농도 의존 적으로 베타-아밀로이드 Aβ42 및 Aβ40의 생성 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.

<시험예 2> 개상사화 추출물 CN1-M의 분획물에 의한 베타-아밀로이드 생성 억제작용 평가

상기 실시예 2로부터 조제된 CN1-M의 용매 분획물인 헥산 분획물 (CN1-MH), 염화메틸렌 분획물 (CN1-MM), 초산에틸 분획물 (CN1-ME) 및 부탄올 분획물 (CN1-MB)을 일정한 농도 (25 μg/ml)로 사용하여 상기 시험예 1과 동일한 방법으로 베타 아밀로이드 억제 활성을 확인한 결과를 표 2와 도 2에 나타내었다. 음성대조군으로서 상기 용매 분획물을 첨가하지 않은 미처리 형질감염 HeLa 세포 배양액을 사용하였다.

[표 2] 개상사화 추출물의 용매 분획물 (25 μg/ml)의 베타-아밀로이드 생성 억제 효능

	헥산 분획물 (CN1-MH)	염화메틸렌 분획물 (CN1-MM)	초산에틸 분획물 (CN1-ME)	부탄올 분획물 (CN1-MB)
음성대조군 대비 Aβ42 생성 억제율 (%)	45.3	94.4	97.0	95.7

표 2 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 용매 분획물 중 초산에틸 (CN1-ME) 및 부탄올 분획 (CN1-MB)의 Aβ42 생성 억제 효과가 우수한 것으로 나타났다.

<시험예 3> 초산에틸 분획(CN1-ME) 및 부탄올 분획(CN1-MB)의 혼합 분획물(CN1-M-E)로부터 조제된 4종의 소분획물에 의한 베타-아밀로이드 생성 억제 작용 평가

상기 실시예 2에서 제조된 초산에틸 분획 및 부탄올 분획을 합한 분획물(CN1-M-E)로부터 조제된 4종의 소분획물, CN1-M-E-fr1, E-fr2, E-fr3, 및 E-fr4에 의한 Aβ42 생성 억제활성 실험을 상기 시험예 1과 같은 방법으로 수행하여 그 결과를 표 3 및 도 3에 나타내었다.

[표 3] 개상사화 CN1-M의 초산에틸 및 부탄올 분획을 합한 분획물(CN1-M-E)로부터 제조된 4종의 소분획물 (25 μg/ml)에 의한 베타-아밀로이드 생성 억제 효능

	fr1	fr2	fr3	fr4
음성대조군 대비 Aβ42 생성 억제율 (%)	96.6	98.1	97.9	96.0

표 3 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 4개의 소분획물 모두 96% 이상의 현저한 베타-아밀로이드 생성 억제 활성을 나타내었다.

<시험예 4> 라이코리시딘 및 라이코리시디놀에 의한 베타-아밀로이드 생성 억제 작용 평가

실시예 3 및 실시예 4에서 수득된 화합물 라이코리시딘 (CN1-M-E2) 및 라이코리시디놀 (CN1-M-E3)에 의한 Aβ42 및 Aβ40 생성 억제활성 실험을 상기 시험예 1와 같은 방법으로 수행한 결과를 표 4 및 도 4에 나타내었다.

[표 4] 라이코리시딘 및 라이코리시디놀의 베타-아밀로이드 생성 억제 효능

	라이코리시딘 (CN1-M-E2)				라이코리시디놀 (CN1-M-E3)
농도 (μg/ml)	0.01	0.1	1	10	0.01	0.1	1	10
음성대조군 대비 Aβ42 생성 억제율 (%)	16.0	81.3	97.5	100	44.0	97.0	100	100
음성대조군 대비 Aβ40 생성 억제율 (%)	3.3	67.0	92.8	97.2	25.0	90.4	97.8	98.4

표 4 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 라이코리시딘과 라이코리시디놀은 모두 농도의존적으로 현저한 베타-아밀로이드 생성 억제 활성을 나타내었다.

<시험예 5> 라이코리시딘 및 라이코리시디놀에 의한 알파-세크리테아제 활성 평가

상기 실시예 4 및 표 4 및 도 4에서 입증된 바와 같이, 라이코리시딘 및 라이코리시디놀에 의해 Aβ42 및 Aβ40 생성이 억제되었으며, 이에 의하여 감마-세크리테아제의 산물이 감소되었음을 알 수 있다. Aβ42 및 Aβ40의 생성 감소의 원인으로서 고려 가능한 첫번째 가능성은 알파-세크리테아제의 활성 증가이다. 또한 Aβ42 및 Aβ40의 생성은 베타- 및 감마-세크리테아제의 연속적인 효소작용으로 이루어지기 때문에 상기 화합물에 의한 베타- 및 감마-세크리테아제 활성 저해 효과 때문일 가능성도 있다.

상기 화합물들의 Aβ 생성 억제효과가 어느 세크리테아제에 대한 작용 때문인지를 확인하기 위하여, 알파-세크리테아제의 활성 assay kit를 사용하였다 (#CBA042; Calbiochem, USA). 알파-시크리테아제는 HeLa cell (실험예 1 참조)에서 얻은 total membrane protein을 사용하였다. 얻어진 라이코리시딘 및 라이코리시디놀에 의한 알파-세크리테아제 활성 변화를 표 5 및 도 5에 나타내었다.

[표 5] 라이코리시딘 및 라이코리시디놀에 의한 알파-시크리테아제의 활성 변화 (100%: 변화 없음)

	라이코리시딘 (CN1-M-E2)		라이코리시디놀 (CN1-M-E3)
음성대조군 대비 알파-시크리테아제 활성 변화율(%)	0.01 μg/ml	0.1 μg/ml	0.01 μg/ml	0.1 μg/ml
	106	110	94	100

표 5 및 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 라이코리시딘 및 라이코리시디놀은 0.01, 0.1 μg/ml 농도에서 알파-시크리테아제의 활성을 변화시키지 않았다. 시험예 4에서, 상기 농도는 이들 화합물들이 Aβ42 및 Aβ40 생성을 효과적으로 억제하였던 농도였다 (표 4, 및 도 4 참조). 따라서, 라이코리시딘 및 라이코리시디놀이 Aβ42 및 Aβ40 생성을 억제하는 것은 알파-세크리테아제의 활성을 변화시키기 때문이 아님을 알 수 있었다.

<시험예 6> 개상사화 추출물로부터 조제된 화합물 라이코리시딘 및 라이코리시디놀에 의한 알파-, 또는 베타- 세크리테아제 산물 생성 억제 작용 평가

알파-세크리테아제의 활성작용의 산물인 sAPPα의 생성과 베타-세크리테아제의 활성작용의 산물인 sAPPβ의 생성에 대한 상기 화합물들의 효과를 sAPPα, sAPPβ에 대한 Western blot 방법으로 확인하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, Aβ42 및 Aβ40의 생성 효과를 나타내는 0.1 μg/ml 농도에서 라이코리시딘과 라이코리시디놀은 sAPPα, 및 sAPPβ 분비에 영향을 주지 않았다. 도 6의 Western blot의 결과에서 sAPPα, sAPPβ의 band의 density를 측정하여 표 6과 도 7에 나타내었다.

[표 6] 라이코리시딘, 및 라이코리시디놀에 의한 sAPPα, sAPPβ 생성 변화

	라이코리시딘 (CN1-M-E2)	라이코리시디놀 (CN1-M-E3)
음성대조군 대비 sAPPα감소율(%)	12	1.0
음성대조군 대비 sAPPβ감소율(%)	17	7.5

표 6 및 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 라이코리시딘, 및 라이코리시디놀에 의한 sAPPα, sAPPβ 생성 변화는 현저한 수준이 아니었다. 따라서 라이코리시딘과 라이코리시디놀에 의한 Aβ42 및 Aβ40의 생성 감소 효과는 알파-, 및 베타-세크리테아제의 활성 변화가 이유가 아님을 알 수 있었다.

이러한 결과를 종합하였을 때 라이코리시딘과 라이코리시디놀에 의한 Aβ42 및 Aβ40의 생성 억제는 이들 화합물이 감마-세크리테아제의 활성 저해제로 작용하여 나타난 것임을 알 수 있었다.

<시험예 7> 화합물 라이코리시딘 및 라이코리시디놀에 의한 세포사 작용 평가

상기 화합물 라이코리시딘 및 라이코리시디놀에 의해 발생되는 세포사 (cell death) 작용을 평가하기 위하여, MTT Cell Proliferation assay 방법을 사용하였다 (ATCC catalog #30-1010K, Manassas, USA). 세포에 상기 화합물들을 다양한 농도로 각각 8시간 동안 처리한 후에 살아있는 세포 (viable cell)를 정량하여 그 결과를 표 7 및 도 8에 나타내었다.

[표 7] 라이코리시딘, 라이코리시디놀에 의한 세포사

	라이코리시딘 (CN1-M-E2)				라이코리시디놀 (CN1-M-E3)
농 도 (μg/ml)	0.01	0.1	1	10	0.01	0.1	1	10
음성대조군 대비 세포사율 (%)	4.9	11.3	19	21.1	10.3	11.6	16.5	19.3

표 7 및 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 실험에서 사용한 가장 높은 농도인 10 μg/ml의 라이코리시딘 또는 라이코리시디놀을 처리한 경우에도 약 20% 이내의 세포만이 세포사한 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터 상기 화합물들에 의해 나타난 베타-아밀로이드 생성 감소 효과가 단순하게 세포사에 의해 발생되는 현상이 아님을 알 수 있으며, 상기 화합물은 세포 독성이 없음을 알 수 있다.

도 1은 개상사화 알코올 추출물(CN1-M)의 농도에 따른 Aβ42 및 Aβ40의 생성 억제효과를 나타낸 도면이고,

도 2는 개상사화 알코올 추출물로부터 제조된 4종의 용매분획물 (CN1-MH, CN1-MM, CN1-ME, CN1-MB)의 25 μg/ml 농도에서 Aβ42 생성 억제효과를 나타낸 도면이고,

도 3은 개상사화 알코올 추출물의 초산에틸분획(CN1-ME)과 부탄올 분획(CN1-MB)을 합한 분획물 (CN1-M-E) 로부터 제조된 4종의 소분획물(CN1-M-E-fr1, CN1-M-E-fr2, CN1-M-E-fr3, CN1-M-E-fr4)의 25 μg/ml 농도에서 Aβ42 생성 억제효과를 나타낸 도면이고,

도 4는 화합물 라이코리시딘 (CN1-M-E2) 및 라이코리시디놀의 (CN1-M-E3) 농도별 Aβ42 생성 억제효과를 나타낸 도면이고,

도 5는 화합물 라이코리시딘 (CN1-M-E2) 및 라이코리시디놀에 (CN1-M-E3) 의한 베타-세크리테아제 활성의 결과물인 sAPPα의 생성 감소 효과를 나타낸 도면이고,

도 6은 라이코리시딘과 라이코리시디놀의 sAPPα 및 sAPPβ 생성 감소 효과를 나타낸 도면이고,

도 7은 라이코리시딘과 라이코리시디놀 처리한 경우의 Western blot의 결과에서의 sAPPα, 및 sAPPβ의 band의 density를 보여주는 도면이고,

도 8은 라이코리시딘 (CN1-M-E2) 및 라이코리시디놀의 (CN1-M-E3) 농도에 따른 세포사 작용을 나타낸 도면이다.

Claims (14)

1. 개상사화 (Lycoris aurea)를 물과 C1 내지 C4의 저급 알코올의 혼합물로 추출하여 얻어진 추출물을 유효성분으로 함유하고,

   상기 추출물은 다음의 화학식 1의 라이코리시딘 및 다음의 화학식 2의 라이코리시디놀 중 하나 이상을 함유하는 것인,

   는 치매의 예방 또는 치료용 조성물:

   <화학식 1>

   

   <화학식 2>

   
2. 제1항에 있어서,

   상기 개상사화 추출물은 개상사화 (Lycoris aurea)를 50 내지 95 v/v%의 메탄올, 50 내지 95 v/v% 에탄올, 또는 50 내지 95 v/v% 이소프로판올로 추출하여 얻어진 것인, 치매의 예방 또는 치료용 조성물.
3. 개상사화 (Lycoris aurea)를 물과 C1 내지 C4의 저급 알코올의 혼합물로 추출한 후, 헥산, 염화메틸렌, 초산에틸 및 부탄올로 차례로 분획하여 얻어진 용매 분획물 중의 초산에틸 분획물, 부탄올 분획물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하고,

   상기 초산에틸 분획물, 부탄올 분획물 또는 이들의 혼합물은 다음의 화학식 1의 라이코리시딘 및 다음의 화학식 2의 라이코리시디놀 중 하나 이상을 함유하는 것인,

   치매의 예방 또는 치료용 조성물:

   <화학식 1>

   

   <화학식 2>

   
4. 개상사화 (Lycoris aurea)를 물과 C1 내지 C4의 저급 알코올의 혼합물로 추출한 후, 헥산, 염화메틸렌, 초산에틸 및 부탄올로 차례로 분획하여 얻어진 용매 분획물 중의 초산에틸 분획물과 부탄올 분획물의 혼합물에 대하여 아세토니트릴과 물의 혼합액을 용리액으로 사용하는 역상 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 얻어진 소분획물을 유효성분으로 함유하고,

   상기 소분획물은 다음의 화학식 1의 라이코리시딘 및 다음의 화학식 2의 라이코리시디놀 중 하나 이상을 함유하는 것인,

   치매의 예방 또는 치료용 조성물:

   <화학식 1>

   

   <화학식 2>

   
5. 제4항에 있어서,

   상기 역상 컬럼 크로마토그래피는 60분 기준으로 아세토니트릴과 물의 혼합액 중의 아세토니트릴의 함량을 10 v/v%에서 50 v/v%로 증가시키면서 수행하는 것인, 치매의 예방 또는 치료용 조성물.
6. 제5항에 있어서,

   아세토니트릴과 물의 혼합액 중의 아세토니트릴의 함량이 31 내지 33 v/v%이고, 얻어진 소분획물은 하기의 화학식 1로 표시되는 라이코리시딘을 90 내지 99.9 w/w%의 양으로 함유하는 것을 특징으로 하는, 치매의 예방 또는 치료용 조성물.

   <화학식 1>

   
7. 제5항에 있어서,

   아세토니트릴과 물의 혼합액 중의 아세토니트릴의 함량은 42 내지 44 v/v%이고, 얻어진 소분획물은 하기의 화학식 2로 표시되는 라이코리시디놀을 90 내지 99.9 w/w%의 양으로 함유하는 것을 특징으로 하는, 치매의 예방 또는 치료용 조성물.

   <화학식 2>

   
8. 하기의 화학식 1로 표시되는 라이코리시딘, 하기의 화학식 2로 표시되는 라이코리시디놀, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 치매의 예방 또는 치료용 조성물.

   <화학식 1>

   

   <화학식 2>

   
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 치매는 알츠하이머 질환인, 치매의 예방 또는 치료용 조성물.
10. 삭제
11. 개상사화(Lycoris aurea)을 물과 C1 내지 C4의 저급 알코올의 혼합물로 추출하는 단계;

    상기 얻어진 추출물에 헥산, 염화메틸렌, 초산에틸 및 부탄올을 차례로 가하여 용매 분획물을 얻는 단계; 및

    상기 얻어진 용매 분획물 중, 초산에틸 분획물과 부탄올 분획물을 혼합한 후, 아세토니트릴과 물의 혼합액을 용리액으로 사용하는 역상 컬럼 크로마토그래피를 수행하여, 소분획물을 얻는 단계

    를 포함하는, 제4항의 베타-아밀로이드 생성 억제 효과를 갖는 개상사화 추출물의 제조 방법.
12. 제 11항에 있어서,

    상기 역상 컬럼 크로마토그래는 60분 기준으로 아세토니트릴과 물의 혼합액 중의 아세토니트릴의 함량을 10 v/v%에서 50 v/v%로 증가시키면서 수행하는 것인, 제조 방법.
13. 제12항에 있어서,

    아세토니트릴과 물의 혼합액 중의 아세토니트릴의 함량이 31 내지 33 v/v%일 때의 용출액으로부터 소분획물을 얻는 단계를 추가로 포함하고,

    상기 얻어진 소분획물은 하기의 화학식 1로 표시되는 라이코리시딘을 90 내지 99.9 w/w%의 양으로 함유하는 것인,

    제조 방법.

    <화학식 1>

    
14. 제12항에 있어서,

    상기 아세토니트릴과 물의 혼합액 중의 아세토니트릴의 함량이 42 내지 44 v/v%일 때의 용출액으로부터 소분획물을 얻는 단계를 추가로 포함하고,

    상기 얻어진 소분획물은 하기의 화학식 2로 표시되는 라이코리시디놀을 90 내지 99.9 w/w%의 양으로 함유하는 것인,

    제조 방법.

    <화학식 2>

    

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