KR20210113203A - 대추나무 및 과라나에 있는 생물활성 식물화학물질 - Google Patents

대추나무 및 과라나에 있는 생물활성 식물화학물질 Download PDF

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KR20210113203A
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Abstract

선택된 단리된 4-하이드록시메틸-프롤린, 또는 이의 약제학적 허용성 염 또는 유도체를 포함하는 조성물이 기술된다. 또한, 신규 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린이 이의 제조 방법, 이를 함유하는 조성물, 이의 약제 및 의약으로서의 용도가 기술된다. 또한, 상기 생약 샘플에서 하나 이상의 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 존재 또는 부재를 검출하거나 또는 그 양을 측정함으로써 상기 생약의 품질을 모니터링하는 단계를 포함하는 생약을 제조하는 방법도 기술된다.

Description

대추나무 및 과라나에 있는 생물활성 식물화학물질
본 발명은 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린을 포함하는 조성물 및 에너지 이용 질환의 치료, 혈당 제어, 염증, 박테리아 감염, 피부 장애, 시알리다제 활성의 생체내 저해, 대사 증후군(예를 들어, 이와 관련된 임의의 질환 또는 장애, 예를 들어, 중추 비만, 상승된 트라이글리세라이드의 수치 및 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 인슐린 저항성을 포함한 당뇨병)의 치료를 포함하는, 상기 조성물의 의약 용도, 다양한 식물 공급원으로부터 상기 조성물을 단리 및 정제하는 방법에 관한 것이며, 이에 기초한 다양한 생성물, 화합물, 조성물, 의약 용도 및 방법도 함께 한다.
본 발명은 또한 대추나무속(지자이푸스: Zizyphus) 및 과라나(Guarana) 생약(herbal medicine), 보충제 및 추출물의 품질을 모니터링하는 방법, 대추나무속 및 과라나 추출물을 기반으로 하는 생약을 제조하는 방법, 뿐만 아니라 이러한 방법에 의해 수득할 수 있는 약초 식품(herbal food) 첨가물, 식품 및 음료에 관한 것이다.
지자이푸스 종 ( Zizyphus spp.)
대추나무속(Zizyphus)은 갈매나무과, 람나시에(Rhamnaceae)에 속하는 가시 관목 및 소고목 속이며, 많은 종을 갖고 있다. 이들은 전 세계적으로 열대 및 아열대 지역에 분포한다. 열매는 질감 및 풍미가 시기를 연상시키는, 종종 매우 달고 단맛이 있는 황갈색, 적색 또는 흑색의 식용 핵과이다. 잘 알려진 종으로는 Z. 주주바(Z. jujuba), Z. 스피나-크리스티(Z. spina-christi), Z. 로투스(Z. lotus), Z. 모리티아나(Z. mauritiana) 및 Z. 조아제이로(Z. joazeiro)를 포함한다.
지자이푸스 주주바(Zizyphus jujuba)는 중국 대추로도 알려져 있고 전통 중국 의약에 사용되는 대추 열매를 갖는다. 이것은 심장에 영양을 공급하고 정신을 진정시키는 것으로 여겨지고 있고, 과민성, 불면증 및 심계항진을 치료하는데 사용된다. 지자이푸스 종의 다른 전통적인 용도는 소화 장애, 간 통증, 비뇨기 장애, 당뇨병, 피부 감염 및 발열과 같은 질환의 치료를 포함한다. 이것은 습진 치료제로서 사용된다(Khiljee at al., 2011, Journal of Pakistan Association of Dermatologists 21, 112).
지자이푸스 스피나-크리스티(Zizyphus spina-christi)는 사막 지역에서 자라며 중동 전역에 풍부한 야생 나무이다. 이것의 잎은 사막 동물을 위한 풍부한 단백질 공급원이며 작은 갈색 열매는 지역 주민들이 먹는다. 이 식물의 모든 부분은 전통적으로 지역 주민들이 건강을 유지하는데 도움을 주기 위해 사용된다. 항균, 항진균, 항산화 및 항염증 특성은 이 식물에 기인하였고, 잎 추출물은 상처 및 피부 질환의 치료에 사용된다. 말린 잎의 침출액은 스킨 클렌저와 헤어 트리트먼트로 사용된다. 이의 뿌리 껍질은 또한 통증 치료제로 민간 의학에서 사용된다.
이 식물의 화학적 성분에 대한 연구는 잘 기록되어 있다(Abdel-Zaher, A. et al., 2005, J. Ethnopharmacol. 101,129). 다수의 펩타이드 및 사이클로펩타이드 알칼로이드, 플라보노이드, 트리테르페노이드 사포닌 글리코사이드 및 베툴린산은 이 속의 다양한 종에서 다양한 양으로 식별되었다(Han, B., et al., 1990, Phytochemistry 29, 3315; Solati, J. & Soleimani, N., 2010, Acta Diabetol., 47, 219).
최근 지자이푸스 주주바의 수 추출물의 조성, 항산화 활성 및 간보호 효과가 평가되었다(Liu, N. et al., 2017, RSC Adv. 7, 6511). Z. 주주바 열매에 대한 보다 자세한 분석은 문헌[Villanueva, J.R. & Villanueva, L.R.(2017, Phytotherapy Research, 31, 347)]에 의해 수행되었다.
문헌은 당뇨병 치료를 위한 Z. 스피나-크리스티(Z. spina-christi)의 사용에 관한 많은 과학적 연구를 함유한다(예를 들어, Nesseem, D., et al., 2009, Pharmazie 64, 104). 이 식물의 추출물은 항고혈당 활성을 보유하는 것으로 보고되어 있다(예를 들어, 문헌[Abdel-Zaher, A. et al., 2005, J. Ethnopharmacol. 101,129]). 알록산 당뇨병 랫트의 치료에 사용된 Z. 스피나-크리스티 및 Z. 주주바 뿌리의 메탄올 추출물은 고혈당증, 고지혈증 및 지질 과산화물의 감소에 의해 당뇨병 랫트에게 유익한 효과가 있다고 주장되었다(Hussein, H., et al., 2006, International Journal of Pharmacology 2, 563). Hussein 등은 이 활성이 본 발명의 화합물의 특성이 아닌 강력한 항산화 활성의 결과로 본다.
Tanira, M. 등(1988, International Journal of Pharmacology 2, 563)은 마우스에서 Z. 스피나-크리스티 잎의 에탄올 추출물을 시험하였고, 항염증 및 중등도의 해열 활성을 보여주었다. Motamedi, H. 등(2009, Asian Journal of Plant Sciences 8, 187)은 Z. 스피나-크리스티의 에탄올계 및 메탄올계 잎 추출물을 새로운 항미생물 화합물의 잠재적 공급원으로서 보고하지만, 지금은 대부분 식물의 일반적인 지방산(헥사데칸산)이 강력한 항미생물 활성을 함유한다는 것이 분명하다. Motamedi 등은 잠재적인 활성 성분으로서 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린을 식별하지 않거나, 이 열매의 용도를 암시하지 않는다.
Borgi, W. 등(2007, Fitoterapia 78, 16)은 Z. 로투스(Z. lotus) 뿌리 껍질의 수성 및 메탄올 추출물이 염증 과정의 급성기에서 상당한 항염증 효과를 보였지만 항산화 효과와 관련이 있음을 보고했다. '미용제품 및 건선을 위한 Z. 스피나-크리스티 추출물'이라는 명칭의 미국 특허 5,849,302 및 EP 0815 842 A2는 Z. 스피나-크리스티 잎의 10% 수성 추출물을 사용한 잎 추출물을 기술하며, 이것이 모든 대상체에 대해 발적의 17.5% 감소와 함께 건강한 지원자의 UV-조사된 피부에 대해 항염증 활성을 보여주었다.
그러나, 본 명세서에 기술된 어떠한 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린(또는 임의의 유사한 화합물)도 대추나무속으로부터 보고된 적은 없으며, 이 화합물들이 임의의 생물활성 연구에 연루된 것으로 시사된 적도 없다. 오히려, 이와 관련하여 관심은 구조적으로 관련이 없는 트라이터펜, 항산화제 및 펩타이드에 집중되었다.
과라나
다른 그룹에 의해 보고되지 않은 지자이푸스 종에 존재하는 생물활성 식물화학물질로서 본 명세서에 기술된 4-하이드록시메틸-N-메틸-L-프롤린은 놀랍게도 현재 파울리니아 쿠파나[Paullinia cupana, 지자이푸스와 근연성이 없는 사핀다시애(Sapindaceae) 과]인 과라나 열매에서 발견되었다.
파울리니아 쿠파나는 아마존 유역에서 자생하는 것으로, 특히 브라질에서 흔하다. 과라나는 이의 열매의 종자가 가장 잘 알려져 있으며, 이는 대략 커피콩 크기이며, 높은 카페인 함량으로 가장 유명한 식이 보충제로서 사용된다(그 종자는 커피 종자에서 발견되는 카페인 농도의 약 2배를 함유한다: 커피 종자에서 1% 내지 2%인 것에 비해 과라나 종자에는 약 2% 내지 4.5% 수준의 카페인이 존재한다 - Bempong, D.K. et al., 1993, Int. J. Pharmacog. 31, 175).
음료로서 과라나의 사용에 대한 최초의 보고는 예수회가 아마존 탐험 중에 선교사인 주앙 필리페 베텐도르프(Joao Felipe Bettendorf)가 사테르-마위(Satere-Mawe) 인디언이 이뇨 특성과 두통, 발열 및 경련에 대해 치료 효과가 있는 기호 음료를 마신다는 것을 발견한 1669년에 나타났다. 과라나는 현재 가당 또는 탄산 청량 음료 및 에너지 샷, 허브 차 성분으로서 또는 캡슐에 담겨 사용된다. 대추나무속은 카페인을 함유하지 않는다.
각성제, 강장제 및 최음제로서 과라나의 치료적 특성은 토착지 사용에 대한 최초의 보고 이후에 전세계적으로 알려졌다. 종자는 과라나의 각성 특성이 기인하는 카페인(1,3,7-트라이메틸잔틴)의 함량으로 인해 이 식물의 상업적으로 유용한 부분이다(Kofink, M., et al., 2007, European Food Research and Technology 225, 569; Campos, M.P.D. et al., 2011, Journal of Alternative and Complementary Medicine 17, 505).
향정신성 효과 외에도, 대사 장애에 대한 과라나의 사용은 카테킨도 풍부한 녹차와 유사한 기능적 특성을 갖는 것으로 보이기 때문에 널리 연구되었다. 연구에 따르면 과라나는 지질 대사에 긍정적인 영향을 미치고 기초 에너지 및 체중 감소를 증가시키며 비만 치료에 유용할 수 있는 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Opala, T., et al., 2006, European Journal of Medical Research 11, 343]).
그러나, 다른 연구에서는 과라나를 함유한 포뮬러가 체중에 어떠한 영향도 미치지 않는 것으로 나타났고(Sale, C., et al., 2006, Int. J. Obes. (Lond.), 30, 764), 이것은 시험관내 또는 생체내에서 특정 활성을 갖는 것으로 나타난 화합물(예컨대, 본 발명자들에 의해 최초로 밝혀진 4-하이드록시메틸-N-메틸-L-프롤린)을 계량한 품질-관리된 추출물의 생산에 대한 필요성을 강조한다.
본 명세서에 기재된 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린(및 임의의 유사한 화합물)은 과라나에서 보고된 적이 없으며 이들 화합물이 생리활성 식물화학물질인 것으로 시사된 적도 없다. 오히려 이와 관련하여 관심은 메틸잔틴, 카테킨, 메틸벤젠, 환형 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 올레산, 파울린산 및 메톡시페닐 프로펜을 포함한 구조적 관련이 없는 화학물질에 집중되었다(Avato, P., et al., 2003, Lipids 38, 773-780).
약초 식품 첨가물 및 치료제
현재, 식품 제조업체, 의료 회사 및 의료 전문가로부터 약초 생성물이 가치가 있고 기성 제형 및 치료를 보완할 수 있다는 커지는 인정과 약초 치료제 및 보충제의 사용에 대해 큰 관심을 받고 있다. 약초 식품 첨가물 및 보충제는 현재 널리 사용되고 있다.
그러나, 식물 재료는 복잡한 특성과 고유의 불균일성으로 인해 약초 식품 첨가물의 품질 관리가 어렵다. 약초 및 식물성 식품 첨가물에 사용되는 재료는 일반적으로 전체 식물 또는 그 일부 또는 추출물이다. 식물 재료는 다양한 화학 성분을 함유하므로, 이 재료는 복잡한 혼합물이다. 이것은 재료의 품질을 표준화하고 관리하기가 매우 어렵게 한다. 더욱이, 많은 약초 식품 첨가물은 2종 이상의 식물 기반 성분의 혼합물이어서, 혼합물의 혼합물이므로 더 높은 수준의 복잡성을 도입한다. 더욱이, 사용된 레시피 및 제조 방법은 종종 균일하지 않으며 미공개된 것일 수 있다. 이러한 요인으로 인해, 서로 다른 공급원에서 얻어 표면상 동일한 주어진 제품의 두 샘플이 실제로 동일한 성분의 혼합물을 함유하는 지를 확인하는 것은 매우 어렵다. 이러한 재료의 품질을 관리하는데 어려움을 초래하는 이 문제는 약초 전문가들 사이에서도 특정 약초 추출물의 사용을 제한했다.
다른 문제는 약초 식품 첨가물의 관행에 사용되는 식물이 지역적으로 자주 구할 수 없기 때문에 최종 사용자로부터 멀리 떨어진 공급원에서 얻어야 할 필요가 있다는 사실에서 발생한다. 그러나, 원거리 위치에서 그러한 식물의 공급은, 특히 그러한 많은 식물에 정체성 및 품질 기준을 포함하는 상세한 논문이 존재하지 않기 때문에 불규칙하고 부정확할 수 있다. 약용 식물에서 발견되는 성분들의 복잡한 혼합물은 식물 공급원, 식물이 자란 위치, 근처에서 자란 다른 식물이나 미생물의 종류, 식물이 수확된 시기, 재료가 저장 및 가공된 조건, 및 사용된 추출 절차를 비롯한 많은 요인에 따라 종류 및 농도가 크게 다르다.
따라서, 약초 제품을 프로파일링하고 활성과 관련이 있을 수 있는 약용 식물 재료에 대한 표준 사양을 수립하여, 약초 식품 첨가물의 생산에 품질 관리를 가능하게 하고, 이상적으로는 활성이 있는 것으로 알려지거나 또는 가능성이 있는 성분을 이상적으로 정량할 수 있는 민감한 공정이 필요하다.
본 발명자는 이제 특정 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 식물 분포가 다양한 질환의 치료에 사용되는 대추나무속 및 과라나 식물과 상관성이 있음을 발견했다. 이 발견은 상업적 및 의학적으로 매우 중요하며, 처음으로 새로운 계열의 치료적 활성 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 합성 및/또는 분리, 표준 사양을 충족하는 개선된 생약의 생산 및 그에 기초한 다양한 치료학적 치료를 가능하게 한다.
본 발명은 특정 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 식물 분포가 다양한 질환의 치료에 사용되는 약용 식물과 상관성이 있다는 놀라운 발견을 적어도 부분적으로 기반으로 한다. 따라서, 처음으로 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린 계열이 확립된 생약에 중요한 생리활성 요소로서 식별되었다.
따라서, 본 발명에 따라 다음으로부터 선택되는 단리된 4-하이드록시메틸-프롤린 또는 이의 약제학적 허용성 염 또는 유도체를 포함하는 조성물이 제공된다:
Figure pct00001
Figure pct00002
여기서, R은 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, C1-6 알케닐 또는 C1-6 알키닐을 나타낸다.
바람직한 실시형태에서, 4-하이드록시메틸-프롤린은 하기 식의 화합물 또는 이의 약제학적 허용성 염 또는 유도체로부터 선택된다:
Figure pct00003
Figure pct00004
본 발명의 다른 실시형태는 본 명세서에 첨부되는 청구범위에서 정의된다.
본 명세서에 기재된 특정 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린은 신규한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명자들은 또한 이들 신규 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린을 생성물 자체로서, 이의 제조 방법, 이를 함유하는 조성물, 뿐만 아니라 약제 및 의약으로서의 용도와 함께 제공한다. 본 명세서에 기술된 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 일부가 알려진 정도로, 이들이 생물활성으로 인식된 적은 없으며, 이에 따라 약제 그 자체로서 청구된다.
본 발명의 약초 품질 모니터링 양상
본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 생약(herbal medicine) 샘플에서 하나 이상의 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 존재 또는 부재를 검출하거나 그 양을 측정함으로써 상기 생약의 품질을 모니터링하는 단계를 포함하는 생약의 제조 방법이 제공된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 생약의 품질을 모니터링하는 방법을 제공한다: (a) 생약의 샘플을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 생약 샘플에서 하나 이상의 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 존재 또는 부재를 검출하거나 그 양을 측정하는 단계.
이러한 맥락에서, 품질이라는 용어는 의도된 용도에 생약의 전반적인 적합성을 정의하는 데 사용되며, 예를 들어, 특정 공급원, 조건, 순도 및 바람직하지 않은 보충제 및/또는 오염물에 의한 허용되거나 허용되지 않는 오염 정도의 사용을 나타내는 상기 생약 샘플(적절한 농도에서) 중 하나 이상의 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 존재 또는 부재를 포함할 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 보충 식품 또는 음료의 생산 방법을 제공한다:
(a) 지자이푸스 종(Zizyphus spp.) 및/또는 파울리니아 쿠파나(Paullinia cupana)의 식물 부분을 제공하는 단계;
(b) 상기 식물 부분의 품질을 본 발명의 방법에 따라 모니터링하는 단계; 및
(c) 상기 식물 부분(또는 이의 하나 이상의 분획)을 식품 또는 음료에 첨가하여 상기 보충 식품 또는 음료를 생산하는 단계.
본 발명의 이러한 양상은 임의의 보충 식품 또는 음료의 생산에 광범위한 활용성이 있고 냉장 식품 및 음료, 뜨거운 식품 및 음료, 가당 식품 및 음료, 탄산 음료, 알코올성 음료 및 무알코올 음료를 포함한 임의의 식품 또는 음료가 사용될 수 있다.
본 발명의 공정 및 방법은 바람직하게는 상기 약초(herbal) 식품 첨가물 샘플에서 하나 이상의 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 존재 또는 부재를 검출하거나 그 양을 측정하는 단계를 더 포함한다.
하나 이상의 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 존재가 본 발명에 따라 검출되는 실시형태에서, 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 4-하이드록시메틸-프롤린이 검정, 검출 또는 모니터링되는 공정이 바람직하다:
Figure pct00005
Figure pct00006
여기서, R은 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, C1-6 알케닐 또는 C1-6 알키닐을 나타낸다.
하나 이상의 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 존재가 본 발명에 따라 검출되는 다른 실시형태에서, 특히 바람직한 것은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 4-하이드록시메틸-프롤린이 검정, 검출 또는 모니터링되는 공정이다:
Figure pct00007
Figure pct00008
본 발명은 또한 본 발명의 방법 및 공정에 의해 얻을 수 있는 생약을 고려한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 기타 참고문헌은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 통합되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되고 그 내용이 전부 인용된 것처럼 모든 목적을 위해 그들 전체가 참조로 포함된다.
정의
본 명세서에서 사용되는 경우, 그리고 특별히 달리 명시되지 않는 한, 다음 용어는 이 용어가 본 기술분야에서 향유할 수 있는 임의의 더 넓은(또는 더 좁은) 의미 외에도 다음과 같은 의미를 갖는 것으로 의도된다:
문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서에서 단수의 사용은 복수를 포함하는 것으로 판독되어야 하고 그 반대도 마찬가지여야 한다. 실체(entity)와 관련하여 사용된 용어 "일(a)" 또는 "일(an)"은 해당 실체의 하나 이상을 지칭하는 것으로 판독되어야 한다. 이와 같이, 용어 "일"(또는 "일"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 호환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "포함한다(comprise)" 또는 이의 변형어, 예컨대 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"은 임의의 언급된 완전체(예를 들어, 특징, 요소, 특성, 속성, 방법/공정 단계 또는 제한) 또는 완전체의 그룹(예를 들어, 특징들, 요소들, 특성들, 속성들, 방법/공정 단계들 또는 제한들)의 포함을 나타내는 것으로 판독되어야 하지만, 임의의 다른 완전체 또는 완전체 그룹을 배제하는 것은 아니다. 따라서, 본 명세서에 사용된 용어 "포함하는"은 포괄적이거나 개방적이며 또 다른 언급되지 않은 완전체 또는 방법/공정 단계를 배제하지 않는다.
"본질적으로 이루어지는"이라는 문구는 특정된 완전체(들) 및/또는 단계뿐만 아니라 청구된 발명의 특성 또는 기능에 중대한 영향을 미치지 않는 것을 필요로 하는 것으로 본 명세서에 사용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "이루어지는"은 언급된 완전체(예를 들어, 특징, 요소, 특성, 성질, 방법/공정 단계 또는 제한)의 존재 또는 완전체의 그룹(예를 들어, 특징들, 요소들, 특성들, 성질들, 방법/공정 단계들 또는 제한들)의 존재를 단독으로 나타내기 위해 사용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "질환"은 생리학적 기능을 손상시키고 특정 증상과 연관이 있는 임의의 비정상적인 상태를 정의하는 데 사용된다. 이 용어는 병인의 본성(nature)(또는 실제로 이 질환의 병인학적 기초가 확립되어 있는지 여부)에 관계없이 생리학적 기능이 손상된 임의의 장애, 병, 이상, 병리, 아픔, 상태 또는 증후군을 포함하기 위해 광범위하게 사용된다. 따라서, 감염, 외상, 부상, 수술, 방사선 절제, 중독 또는 영양 결핍으로 인한 상태를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 질환의 증상을 치유, 개선 또는 감소시키거나 그 원인(들)(예를 들어, 병리학적 혼합 상태)을 제거(또는 그 영향을 감소)시키는 개입(예를 들어, 대상체에 대한 제제의 투여)을 지칭한다. 이 경우, 이 용어는 "치료법"이라는 용어와 동의어로 사용된다.
추가로, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 질환의 발병 또는 진행을 예방 또는 지연시키거나 치료된 집단 내에서 그의 발병률을 감소(또는 근절)시키는 개입(예를 들어, 대상체에 대한 제제의 투여)을 지칭한다. 이 경우, 치료라는 용어는 "예방"이라는 용어와 동의어로 사용된다.
용어 "대상체"(문맥이 허용하는 경우 "개체", "동물", "환자" 또는 "포유류"를 포함하는 것으로 판독되어야 함)는 치료가 지시된 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 정의한다. 포유류 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물 및 애완 동물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
본 명세서에 사용된 용어 "에너지 이용 질환"은 비정상적인 에너지 이용으로 인해 발생하는 임의의 질환 또는 장애를 포함한다. 따라서, 이 용어는 항상성 장애 및 질환, 대사 질환, 당 대사의 기능장애 및 식욕 장애를 포함한다. 따라서, 이 용어는 인슐린 저항성, 다양한 형태의 당뇨병, 대사 증후군, 비만, 소모성 증후군(예를 들어, 암 관련 악액질), 근병증, 위장 질환, 성장 지연, 고콜레스테롤혈증, 죽상경화증 및 노화 관련 대사 기능장애를 포함한다. 이 용어는 또한 대사 증후군, 비만 및/또는 당뇨병과 관련된 상태, 예를 들어, 고혈당증, 포도당 불내성, 고인슐린혈증, 포도당뇨증, 대사성 산증, 백내장, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 신병증, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 사구체경화증, 당뇨병성 심근병증, 인슐린 저항성, 포도당 대사 장애, 관절염, 고혈압, 고지혈증, 골다공증, 골감소증, 골 손실, 부서지기 쉬운 뼈 증후군, 급성 관상동맥 증후군, 불임, 단장 증후군, 만성 피로, 섭식장애 및 장 운동성 기능장애를 포함한다.
용어 "대사 증후군"은 다음 증상 중 3개 이상의 존재를 특징으로 하는 상태를 정의하기 위해 본 명세서에 사용된다: 중심 비만(남성의 경우 40인치 초과, 여성의 경우 35인치 초과의 허리 둘레); 높은 트라이글리세라이드 수치(150 ㎎/㎗ 이상); 낮은 HDL 수치(남성의 경우 40 ㎎/㎗ 미만, 여성의 경우 50 ㎎/㎗ 미만) 및 높은 혈압(130/85 mmHg 이상).
따라서, 이 용어는 세계보건기구의 대사 증후군의 정의에 따라 정의된 상태를 포함한다: (a) 6.1 m㏖/ℓ 초과의 공복 혈당; (b) 140/90 mmHg 초과의 혈압; 및 (c) 다음 중 하나 이상: (i) 1.7 m㏖/ℓ 초과의 혈장 트라이글리세라이드; (ii) 0.9 및 1.0 m㏖/ℓ 미만(각각 남성 및 여성에 대해)의 HDL; (iii) 30 ㎏/㎡ 초과의 체질량 지수.
대사 증후군의 치료에 대한 본 명세서에서의 언급은 특히 비만(예를 들어, 중심 비만)을 포함하는 대사 증후군, 및 상승된 혈청 트라이글리세라이드 및 당뇨병(1형 및 2형 당뇨병 및 인슐린 저항성 포함)과 관련된 임의의 또는 모든 장애의 치료를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
1형 또는 2형 당뇨병의 치료에 대한 본 명세서에서의 언급은 1형 및 2형 당뇨병 자체뿐만 아니라 당뇨병전증(초기 당뇨병) 및 인슐린 저항성의 치료를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
용어 "당뇨병전증" 또는 "초기 당뇨병"은 당뇨병이 없는 상태에서 상승된 포도당 또는 글리코실화된 헤모글로빈의 수치가 존재하는 상태를 정의한다.
본 명세서에 사용된, 화합물 또는 조성물의 유효량은 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 합리적인 유익/유해 비율에 비례하여 대상체에게 투여될 수 있는 양이나, 대상체의 상태에 대한 영구적 또는 일시적인 개선으로 나타나는 치료 또는 예방과 같은 원하는 효과를 제공하기에 충분한 양을 정의한다. 이 양은 개인의 연령과 일반적인 상태, 투여 방식 및 기타 요인에 따라 대상체마다 다를 것이다. 따라서, 정확한 유효량을 지정하는 것은 가능하지 않지만, 본 기술분야의 기술자는 일상적인 실험 및 배경 일반 지식을 사용하여 임의의 개별 사례에 적절한 "유효"량을 결정할 수 있을 것이다. 이러한 상황에서 치료적 결과는 증상의 근절 또는 완화, 통증 또는 불편 감소, 생존 연장, 이동성 개선 및 기타 임상 개선의 지표를 포함한다. 치료적 결과가 완전한 치유일 필요는 없다.
본 명세서에 사용된 용어 "약제학적 키트"는 투약 수단(예를 들어, 측정 장치) 및/또는 전달 수단(예를 들어, 흡입기 또는 주사기)과 함께 약제학적 조성물의 하나 이상의 단위 용량의 어레이를 정의하며, 이는 선택적으로 모두 공통 외부 포장 내에 함유되어 있다. 2개 이상의 화합물/제제의 조합을 포함하는 약제학적 키트에서, 개별 화합물/제제는 단일 또는 비-단일 제형일 수 있다. 단위 용량(들)은 블리스터 팩에 함유될 수 있다. 약제학적 키트는 선택적으로 사용 설명서를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "약제학적 팩(pack)"은 약제학적 조성물의 하나 이상의 단위 용량의 어레이를 정의하며, 이는 선택적으로 공통 외부 포장 내에 함유되어 있다. 2개 이상의 화합물/제제의 조합을 포함하는 약제학적 팩에서, 개별 화합물/제제는 단일 또는 비-단일 제형일 수 있다. 단위 용량(들)은 블리스터 팩에 함유될 수 있다. 약제학적 팩은 선택적으로 사용 설명서를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "환자 팩"은 전체 치료 과정 동안 약제학적 조성물을 함유하는, 환자에게 처방된 패키지를 정의한다. 환자 팩은 일반적으로 하나 이상의 블리스터 팩(들)을 함유한다. 환자 팩은 보통 환자의 처방약에서 유실되는, 환자 팩 안에 담긴 패키지 삽입물에 환자가 항상 접촉한다는 점에서, 약사가 대량 공급원으로부터 약제의 환자 공급분을 나누는 전통적인 처방약보다 장점이 있다. 패키지 삽입물의 내포는 의사 지시에 의한 환자의 규정 준수를 개선하는 것으로 나타났다.
본 발명의 화합물에 적용되는 약제학적 허용성 유도체란 용어는 본 발명의 모 화합물의 화학적 유도체화에 의해 수득되는(또는 수득 가능한) 화합물을 정의한다. 따라서, 약제학적 허용성 유도체는 과도한 독성, 자극 또는 알레르기 반응없이(즉, 합리적인 유익/유해 비율에 비례하여) 인간 조직에 투여하거나 접촉하여 사용하기에 적합하다. 바람직한 유도체는 모 화합물의 알킬화, 에스테르화 또는 아 실화에 의해 수득된(또는 수득 가능한) 유도체이다. 따라서, 본 발명의 화합물의 약제학적 허용성 유도체는 N-옥사이드 및 이의 에스테르를 포함한다.
본 발명의 약제학적 허용성 유도체는 본 명세서에 기재된 생물학적 활성의 일부 또는 전부를 보유할 수 있다. 몇몇 경우에, 생물학적 활성은 유도체화에 의해 증가한다. 유도체는 전구약물로서 작용할 수 있고, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 생물학적 활성은 생체내 프로세싱 후에만 발생할 수 있다. 특히 바람직한 전구약물은 하나 이상의 유리 하이드록실에서 에스테르화되고 생체내 가수분해에 의해 활성화되는 에스테르 유도체이다. 유도체화는 또한 화합물의 다른 생물학적 활성, 예를 들어, 생체이용률 및/또는 글리코시다제 저해 프로파일을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 유도체화는 CNS 침투를 증가시킬 수 있다(예를 들어, 혈액 뇌 장벽의 침투).
약제학적 허용성 염이라는 용어는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 유익/유해 비율에 비례하는, 유리 염기의 임의의 비독성 유기 또는 무기 산 부가 염을 정의한다. 적합한 약제학적 허용성 염은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 예는 무기산(예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산), 유기 카복실산(예를 들어, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 젖산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 구연산, 아스코르브산, 말레산, 하이드록시말레산, 다이하이드록시말레산, 벤조산, 페닐아세트산, 4-아미노벤조산, 4-하이드록시벤조산, 안트라닐산, 신남산, 살리실산, 2-페녹시벤조산, 2-아세톡시벤조산 및 만델산) 및 유기 설폰산(예를 들어, 메탄설폰산 및 p-톨루엔설폰산)과의 염이다.
이들 염 및 유리 염기 화합물은 수화된 형태 또는 실질적으로 무수 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 화합물의 모든 다형체 형태를 포함하는, 결정질 형태가 또한 고려되며, 일반적으로 화합물의 산 부가 염은 물 및 다양한 친수성 유기 용매에 용해되고 이들의 유리 염기 형태와 비교하여 더 높은 융점과 증가된 용해도를 입증하는 결정질 물질이다.
본 명세서에서 용어 "알킬"은 직쇄 또는 분지형 포화 탄화수소 사슬을 정의한다. 용어 "C1-C6 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 포화 탄화수소 사슬을 지칭한다. 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, t-부틸, n-헥실을 포함한다. 본 발명의 알킬 기는 하나 이상의 할로겐 원자에 의해 선택적으로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "알케닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 정의한다. 용어 "C1-C6 알케닐"은 1개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 불포화 탄화수소 사슬을 지칭한다. 예로는 에테닐, 2-프로페닐 및 3-헥세닐을 포함한다. 본 발명의 알케닐 기는 하나 이상의 할로겐 원자에 의해 선택적으로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "알키닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 정의한다. 용어 "C1-C6 알키닐"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 불포화 탄화수소 사슬을 지칭한다. 예로는 에티닐, 2-프로피닐 및 3-헥시닐을 포함한다. 본 발명의 알키닐 기는 하나 이상의 할로겐 원자에 의해 선택적으로 치환될 수 있다.
식물화학물질(phytochemical)이라는 용어는 본 명세서에서 광범위한 의미로, 거대분자 및 소분자를 포함하는 식물의 임의의 화학적 구성성분을 포함하기 위해 사용된다. 중요한 예로는 알칼로이드(예를 들어, 이미노 당 및 이미노 당 산, 예를 들어, 구조적 부류 피롤리딘, 피페리딘, 피롤리지딘, 인돌리지딘, 트로판 및 노르트로판으로부터 선택됨), 탄수화물 유사체, 페놀계 화합물, 테르페노이드, 효소 저해제, 배당체, 뉴클레오타이드, 아미노산, 지질 및 당을 포함한다.
본 발명의 화합물에 적용되는 경우, 용어 단리된(isolated)은 화합물이 자연에서 발생하는 것과는 다른 물리적 환경에 존재함(또는 합성 화합물의 경우에는 어느 정도로 정제됨)을 나타내기 위해 본 명세서에 사용된다. 예를 들어, 단리된 화합물은 그것이 자연적으로 발생하는 복잡한 세포 환경과 관련하여(또는 출발 생성물, 중간체, 완충액, 용매, 반응물 및/또는 이것이 합성된 공동산물의 일부 또는 전부에 대해) 실질적으로 단리(예를 들어, 정제)될 수 있다. 따라서, 단리된 화합물은 본 명세서에 기재된 임의의 식물 공급원의 농축 분획 또는 추출물의 형태를 취할 수 있다.
단리된 물질(예를 들어, 합성, 비-자연 발생의 화합물)이 정제될 때, 순도의 절대 수준은 중요하지 않으며, 본 기술분야의 기술자는 물질이 투입되어야 하는 용도에 따라 순도의 적절한 수준을 쉽게 결정할 수 있다. 합성 물질의 경우, 순도 수준은 85 내지 99% w/w 범위일 수 있고, 99% w/w를 초과할 수 있다. 그러나, 특히 그 물질이 천연 공급원으로부터 단리된 경우, 바람직한 순도 수준은 적어도 0.1% w/w, 0.2% w/w, 0.3% w/w, 0.4% w/w, 0.5% w/w, 0.6% w/w, 0.7% w/w, 0.8% w/w, 0.9% w/w, 1.0% w/w, 1.1% w/w, 1.2% w/w, 1.3% w/w, 1.4% w/w, 1.5% w/w, 1.6% w/w, 1.7% w/w, 1.8% w/w, 1.9% w/w 또는 2.0% w/w이다. 특히 바람직한 순도 수준은 적어도 0.5 내지 2.0% w/w, 예를 들어, 적어도 0.8 내지 1.5% w/w, 예를 들어, 적어도 약 1.0% w/w의 순도 수준이다. 물질이 천연 공급원으로부터 단리되는 경우에, 필요하다면, 이온 교환 크로마토그래피와 같은 적절한 농축 기술을 사용하여 5 내지 10% w/w의 수준은 쉽게 얻을 수 있다.
일부 상황에서, 단리된 화합물은, 예를 들어, 다른 성분들을 함유할 수 있는, 조성물(예를 들어, 정도의 차이는 있어도 많은 다른 물질을 함유한 조 추출물) 또는 완충액 시스템의 일부를 형성한다. 다른 상황에서, 단리된 화합물은, 예를 들어, 분광광도계, NMR 또는 크로마토그래피(예를 들어, 트라이메틸실릴 유도체의 GC-MS)에 의해 결정되는 것처럼, 본질적인 균질성으로 정제될 수 있다.
생약(herbal medicine)이라는 용어는 적어도 하나의 활성 요소(예를 들어, 화합물)가 화학적으로 합성되지 않고 식물의 식물화학적 구성성분인 약제학적 조성물을 정의하기 위해 본 명세서에 사용된다. 대부분의 경우, 이 비합성 활성 요소는 단리되지 않으며(본 명세서에 정의된 바와 같이), 공급원 식물에서 결합되어 있는 다른 식물화학물질과 함께 존재한다. 그러나, 몇몇 경우에 식물 유래의 생물활성 요소(bioactive principle)(들)는 농축된 분획에 존재하거나 또는 단리될 수 있다(때로는 높은 정제도를 수반함). 그러나, 많은 경우에, 생약은 정도의 차이는 있어도 식물의 조추출물, 침액(infusion) 또는 분획, 또는 심지어 미가공된 전체 식물(또는 이의 일부)를 포함하며, 단 이러한 경우에 식물(또는 식물 일부)은 보통 적어도 건조 및/또는 분쇄된다. 생약은 식품 보충제, 음료의 형태이거나, 또는 생약 키트 또는 팩으로서 단일 용량으로 제공될 수 있다.
용어 약초 식품(herbal food)은 적어도 하나의 성분이 화학적으로 합성된 것이 아니라, 오히려 식물의 식물화학적 구성성분인 조성물을 정의하기 위해 본 명세서에 사용된다. 대부분의 경우, 이러한 비합성 성분은 정제되는 것이 아니라, 공급원 식물에서 결합되어 있는 다른 식물화학물질과 함께 존재한다. 그러나, 몇몇 경우에 식물 유래 성분(들)은 농축된 분획에 존재하거나 단리될 수 있다(때로는 고순도로). 그러나, 많은 경우에, 약초 식품 첨가물은 정도의 차이는 있어도 식물의 조추출물, 침액 또는 분획, 또는 심지어 미가공된 전체 식물(또는 이의 일부)을 포함하지만, 이러한 경우 식물(또는 식물 일부)은 보통 적어도 건조 및/또는 분쇄된다. 따라서, 이 용어는 식품 및 음료와 함께 사용하기 위한 첨가물 및 보충제 형태의 약초 식품을 포함한다.
용어 생물활성 요소(bioactive principle)는 이것이 포함된 약초 약제의 약제학적 효능에 필요하거나 충분한 식물화학물질을 정의하기 위해 본 명세서에 사용된다. 본 발명의 경우, 생물활성 요소(들)는 본 발명의 하나 이상의 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린을 포함한다.
기능식품(nutraceutical)이라는 용어는 생리학적 이점을 제공하거나 질환으로부터 보호하는 식품 생성물(또는 이의 단리물)을 정의하기 위해 본 명세서에 사용된다. 본 발명의 바람직한 기능식품은 혈당 조절 활성을 가지며 에너지 이용 질환의 치료에 적용성이 있다. 본 발명의 다른 기능식품은 항염증성이다.
표준 사양(standard specification)이라는 용어는 생약, 미용제품 또는 기능식품의 허용되는 품질과 상관성이 있는 특성 또는 식물화학적 프로파일을 정의하기 위해 사용된다. 이러한 맥락에서, 품질(quality)이라는 용어는 의도된 용도에 생성물의 전반적인 적합성(fitness)을 정의하는데 사용되며, 본 발명의 하나 이상의 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 존재를 적절한 농도로 포함한다.
식물화학적 프로파일(phytochemical profile)이라는 용어는 상이한 식물화학적 구성성분과 관련된 일련의 특성을 정의하기 위해 본 명세서에 사용된다.
가장 넓은 양상에서, 본 발명은 본 발명의 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 모든 광학 이성질체, 라세미 형태 및 부분입체이성질체를 고려한다. 따라서, 본 발명의 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린에 대한 언급은 부분입체이성질체의 혼합물로서, 개별 부분입체이성질체로서, 거울상이성질체의 혼합물로서, 뿐만 아니라 개별 거울상이성질체의 형태로서의 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린을 포함한다.
화학적 합성
본 명세서에 기재된 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린은 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 헤테로방향족 고리 시스템을 제조하는 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 특히, 합성 방법은 문헌[Comprehensive Heterocyclic Chemistry, Vol. 1(Eds.: AR Katritzky, CW Rees), Pergamon Press, Oxford, 1984 및 Comprehensive Heterocyclic Chemistry II: A Review of the Literature 1982-1995 The Structure, Reactions, Synthesis, and Uses of Heterocyclic Compounds, Alan R. Katritzky(Editor), Charles W. Rees(Editor), E.F.V. Scriven(Editor), Pergamon Pr, June 1996]에 논의되어 있다. 관심 화합물의 합성에 도움이 되는 기타 일반 자료로는 문헌[March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Wiley-Interscience; 5th edition(January 15, 2001)]을 포함한다.
식물 공급원으로부터의 추출/검출
본 명세서에 기재된 본 발명의 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린은 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 화합물은 (a) 지자이푸스(Zizyphus) 속의 식물; 및 (b) 파울리니아(Paullinia) 속의 식물로부터 선택되는 식물 공급원으로부터 추출 및/또는 정제될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 식물 공급원은 Z. 주주바(Z. jujuba), Z. 스피나-크리스티(Z. spina-christi), Z. 로투스(Z. lotus), Z. 모리티아나(Z. mauritiana), Z. 조아제이로(Z. joazeiro) 및 P. 쿠파나(P. cupana)로부터 선택되는 식물 종으로부터 선택된다.
상기 언급된 식물 공급원으로부터의 식물 재료는 본 발명에 따라 사용하기 위한 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 단리 및 정제를 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다. 본 발명의 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린은 수용성이고 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 농축될 수 있다. 또한, 농축을 위해 크기 배제 방법을 사용할 수도 있다. 따라서, 본 기술분야의 기술자는 표준 기술을 사용하여 본 발명의 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린을 쉽게 정제 및 단리할 수 있음을 이해할 것이다.
식물 공급원의 임의의 적절한 부분이 사용될 수 있으며, 바람직한 실시형태에서 공급원은 열매, 종자 및 잎으로부터 선택되는 식물 부분을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어질 수 있다. 뿌리, 줄기 및 나무껍질과 같은 다른 부분도 사용될 수 있다.
추출 및/또는 정제에 적합한 공정은 다음 단계를 포함하는 공정을 포함한다:
(a) 재료, 예를 들어, 식물 공급원으로부터의 열매, 열매 부분, 열매 추출물, 열매즙, 종자, 나무껍질, 뿌리 및/또는 잎으로부터 선택되는 식물 부분을 제공하는 단계;
(b) 상기 재료의 제1 샘플을 극성 용매로 추출하여 극성 추출물 및 비극성 잔류물을 생산하는 단계;
(c) 단계 (b)의 극성 추출물을 이온교환 크로마토그래피로 처리하여 이온성 화합물이 농축된 추출물 및 비이온성 잔류물을 생산하는 단계;
(d) 단계 (c)의 농축된 추출물을 크로마토그래피로 분별하여 이온성 화합물이 농축되고 하나 이상의 본 발명의 화합물을 포함하는 하나 이상의 극성 분획을 산출하는 단계.
약초 품질 관리 양상
샘플
본 발명의 방법에 사용되는 약초 샘플은 건조된 식물 재료 또는 식품 및 음료에 첨가되는 형태의 약초 식품 첨가물의 분취량일 수 있다. 대안적으로, 샘플은 특성화 전에 임의의 매우 다양한 방식으로 전처리될 수 있다. 전처리는 물리적 또는 화학적 전처리, 예를 들어, 분말화, 분쇄, 동결, 증발, 여과, 압축, 분무 건조, 압출, 초임계 용매 추출 및 팅크제(tincture) 생산을 수반할 수 있다.
바람직하게는, 식품 첨가물 샘플은 특성화 전에 분별한다. 용매 추출(들)을 포함하는 임의의 적합한 분별 방법이 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 샘플은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분별되어 극성 화합물이 농축된 추출물 및 비극성 잔류물을 생산한다. 이러한 실시형태에서, 특성화는 바람직하게는 기체-액체 크로마토그래피(GC), 예를 들어, GC-MS를 포함한다. GC가 사용되는 경우, 농축된 추출물은 크로마토그래피 전에 유도체화된다.
약초 식품 첨가물이 전체 식물(또는 그 일부)의 형태로 투여되거나 판매되는 경우, 식물 재료는 사용 전에 건조될 수 있다. 동결 건조, 분무 건조 또는 공기 건조를 포함한 임의의 편리한 건조 형식이 사용될 수 있다.
4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 검출
식품 첨가물 샘플에 대한 임의의 적합한 특성화 형식이 사용될 수 있으며, 그 예로는 샘플 중의 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 존재 또는 부재를 검출하거나 또는 그 양을 측정하는데 충분한 기능적 및/또는 물리적 및/또는 화학적 특성화를 제한없이 포함한다.
샘플이 물리적으로 특성화되는 경우, 그 특성화는 (a) 식물화학물질 성분(들)의 정량; 및/또는 (b) 구성성분의 순도의 측정; 및/또는 (c) 분자량(또는 복수의 상이한 식물화학물질 구성성분을 포함하는 분획인 경우 분자량 분포 또는 이의 다양한 통계학적 함수)의 결정; 및/또는 (d) (예를 들어, 핵자기공명에 의한) 분자식(들)의 결정; 및/또는 (e) 스펙트럼 분석으로부터 선택될 수 있다.
스펙트럼 분석이 특히 바람직하며, 다음 스펙트럼 중 임의의 스펙트럼 또는 모든 스펙트럼을 생산할 수 있다:
(a) 질량 스펙트럼[예를 들어, 질량 대 전하(m/z) 값 대 존재비(abundance)], 및/또는
(b) 크로마토그래피 데이터(예를 들어, 스펙트럼, 컬럼 체류 시간, 용출 프로파일 등), 및/또는
(c) 포토다이오드 어레이(PDA) 스펙트럼(예를 들어, UV 및 가시광 범위 모두), 및/또는
(d) 전기화학적 검출 또는 증발 광 산란 검출
(e) 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼(예를 들어, 1H 및/또는 13C NMR을 통해 수득한 스펙트럼 데이터 세트).
본 발명에 따라 사용될 때, 스펙트럼 분석은, 예를 들어, GC-MS 및/또는 HPLC-PDA-MS를 사용하여 샘플의 분별 및/또는 유도체화와 커플링될 수 있다.
특히 바람직한 것은 샘플에서 4-하이드록시메틸-N-메틸-프롤린의 존재 또는 부재를 검출하거나 또는 그 양을 측정하기 위해 GC-MS를 사용하는 것이다.
샘플이 화학적으로 특성화되는 경우, 그 특성화는 식물화학적 구성성분(들)의 화학 반응성, 식물화학적 구성성분(들)의 용해도, 식물화학적 구성성분(들)의 안정성 및 융점, 또는 이들의 임의 조합의 측정으로부터 선택될 수 있다.
샘플이 기능적으로 특성화되는 경우, 특성화는, 예를 들어, 생체내 또는 시험관내 검정, 효소 저해 검정(예를 들어, 시알리다제 저해), 수용체 결합 검정, 세포 검정(예를 들어, 세포 복제, 세포-병원체, 세포-세포 상호작용 및 세포 분비 검정), 면역검정, 항미생물 활성(예를 들어, 박테리아 및 바이러스 세포 결합 및/또는 복제) 검정, 독성 검정(예를 들어, LD50 검정) 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 생물학적 검정을 포함할 수 있다.
용매 추출
본 발명의 공정에 사용하기에 적합한 극성 용매는 제한없이 유기 알코올과 같은 유기 용매를 포함한다. 바람직한 것은 에탄올 및 메탄올, 뿐만 아니라 에탄올/물 또는 메탄올/물 혼합물이다. 바람직하게는, 극성 용매는 51 내지 80% 에탄올/물, 31 내지 50% 에탄올/물, 및 최대 30% 에탄올/물로부터 선택된다. 특히 바람직한 것은 약 50% 에탄올/물인 극성 용매이다. 본 발명의 공정에서 원치 않는 성분을 제거하는데 사용하기에 적합한 비극성 용매는 제한없이 헥산 및 다이클로로메탄(DCM) 또는 클로로포름과 같은 유기 용매를 포함한다. 특히 바람직한 것은 다이클로로메탄이다. 추출(들)이 수행되는 조건(시간, 온도, 진탕 정도 등)은 경험적으로 쉽게 결정할 수 있으며, 샘플의 본성, 임의의 전처리 본성 및 선택된 용매 시스템에 따라 달라진다.
크로마토그래피 분별
크로마토그래피 분별은 기체-액체 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 기체-액체 크로마토그래피는 가열된 컬럼 내부의 불활성 지지체에 코팅된 박층의 비휘발성 액체와 압력 하의 불활성 기체 간에 샘플을 분할하여 휘발성 물질의 복잡한 혼합물을 이의 구성성분으로 분리하는 공정이다. 혼합물에서 특정 화합물을 잘 분리하기 위해서는 정확한 특성을 가진 컬럼을 사용하는 것이 중요하다. 고체 지지체의 본성, 액상의 유형 및 양, 패킹 방법, 전체 길이 및 컬럼 온도는 중요한 요인이다.
본 기술분야의 기술자는 일상적인 시행 착오와 흔한 일반 지식을 사용하여 특히 연구중인 추출물 및 추출에 사용된 용매의 본성 및 이러한 용매들에서 예상되는 화학물질의 유형을 포함하여 상황에 따라 적절한 컬럼 특성을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 많은 상황에서 특히 바람직하고 유용한 것은 비극성 액체상으로 코팅된 모세관 컬럼(25m×0.22㎜ id×0.25㎛ BPX5 고정상, SGE Ltd.의 제품, 또는 그 등가물)이다.
많은 화합물은 이들의 높은 극성, 낮은 휘발성 또는 열 불안정성으로 인해 기체 크로마토그래프에 직접 주입하는 것이 적합하지 않다. 고도로 하이드록시화된 화합물은 분자간 수소 결합으로 인해 기화하기가 어렵다. 그러나, 하이드록실 수소를 다른 화학 기로 대체하면 GC 분석에 충분하게 휘발성으로 만들 수 있다. 하이드록실기를 유도체화하는 가장 인기있는 2가지 수단은 아세틸화 및 실릴화이며, 여기서 아세틸화물[CH3CO-O-R] 또는 실릴 에테르, 예를 들어, 트라이메틸실릴(TMS) 에테르[(CH3)3Si-O-R]가 형성된다. 따라서, 농축된 추출물이 분석적 규모로 크로마토그래피에 의해 분별되는 실시형태에서, 농축된 추출물의 식물화학적 구성성분은, 예를 들어, 아실화 또는 실릴화에 의해, 바람직하게 유도체화된다. 특히 바람직한 것은 트라이메틸 실릴(TMS) 유도체화이다.
크로마토그래피 분별은 또한 이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피는 이온 종을 부분적으로 정제하여 이들을 농축시키고 오염 물질을 제거한다. 본 기술분야의 기술자는 일상적인 시행 착오와 흔한 일반 지식을 사용하여 적합한 컬럼 패킹 재료 및 이동상(들)을 쉽게 식별할 수 있을 것이며, 이것은 특히 분별될 양, 연구중인 추출물, 및 추출에 사용된 용매의 본성에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 방법에 특히 바람직한 것은 유리 산 또는 수소(H+) 형태 또는 암모늄(NH4 +) 염 형태로 사용될 수 있는 강산성 양이온 교환 수지이다. 이러한 형태는 용액으로부터 양이온을 흡착시키고 동등한 수의 반대 이온을 용액으로 다시 방출한다(사용된 형태에 따라 H+ 또는 NH4 + 이온). 또한, 하이드록사이드 형태(OH-)로 사용되는 경우, 강염기성 음이온 교환 수지도 바람직하다.
분획 특성화
취한 특성화 형식은 연구중인 생약의 본성과 사용된 특성화 기술에 따라 달라진다. 일반적으로 다음 접근방식 중 임의의 방식 또는 모든 방식이 사용될 수 있다:
(a) 기능적 특성화
기능적 특성화는 생물학적 검정을 포함할 수 있다. 생물학적 검정은 생체내 또는 시험관내에서 수행될 수 있으며, 효소 저해 검정(예를 들어, 시알리다제 저해)을 포함할 수 있다. 다른 생물학적 검정으로는 수용체 결합 검정, 세포 검정(세포 복제, 세포 병원체 및 세포-세포 상호작용 및 세포 분비 검정을 포함함), 면역검정, 항미생물 활성(예를 들어, 박테리아 및 바이러스 세포 결합 및/또는 복제) 검정 및 독성 검정(예를 들어, LD50 검정)을 포함한다.
기능적 특성화는 또한 생물학적 활성에 대한 하나 이상의 지표의 식별을 허용하는 특성화의 형태에 의해 간접적으로 수행될 수 있다.
(b) 물리적 특성화
이것은 공정 중 임의의 주어진 분획에, 또는 임의의 다른 단계에서 존재하는 식물화학적 성분(들)의 정량화, 구성성분의 순도 측정, 분자량 측정(또는 복수의 상이한 식물화학적 구성성분을 포함하는 분획들의 경우, 분자량 분포 또는 이의 다양한 통계학적 함수), 분자식(들)의 결정(예를 들어, 핵자기공명에 의해), 및 다양한 스펙트럼 분석의 형태를 취할 수 있다.
특히 유용한 스펙트럼 특성은 다음과 같다:
Figure pct00009
질량 스펙트럼(예를 들어, 질량 대 전하(m/z) 값 대 존재비), 및/또는
Figure pct00010
크로마토그래피 데이터(예를 들어, 스펙트럼, 컬럼 체류 시간, 용출 프로파일 등), 및/또는
Figure pct00011
포토다이오드 어레이(PDA) 스펙트럼(예를 들어, UV 및 가시광 범위 모두), 및/또는
Figure pct00012
전기화학적 검출(ED) 또는 증발 광 산란(ELSD) 검출; 및/또는
Figure pct00013
핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼(예를 들어, 1H 및/또는 13C NMR을 통해 수득한 스펙트럼 데이터 세트 포함).
스펙트럼 특성화는 분별 단계와 커플링될 수 있다. 예를 들어, GC-MS 및/또는 HPLC-PDA-MS-ED-ELSD를 사용하여(본 명세서에 기술된 바와 같이) 분별을 질량 스펙트럼, UV-가시광 스펙트럼, 전기화학적 반응 또는 분획 질량 데이터 및 크로마토그래피적 스펙트럼 데이터의 획득과 커플링시킬 수 있다.
전술한 특성들 중 임의의 특성 또는 모든 특성은 임의의 주어진 샘플(또는 이의 임의의 분획 또는 식물화학적 구성성분)에 대한 "화학적 핑거프린트"를 정의하는데 사용될 수 있다.
(c) 화학적 특성화
이것은 특히 식물화학적 구성성분(들)의 화학적 반응성, 이들의 용해도, 안정성 및 융점의 측정 형식을 취할 수 있다.
본 발명의 화합물의 의학적 용도
신생물형성
본 발명의 화합물은 시알리다제 저해제이므로, 시알리다제 활성 및/또는 시알산에 의해 매개되는 질환 및 장애의 치료 또는 예방에 적용된다.
시알리다제는 박테리아 및 바이러스 감염 및 신생물형성을 포함한 다양한 병리학적 과정에 관여하며, 이로 인해 이들 효소는 매력적인 치료 표적이 된다. 시알리다제 Neu1 및 Neu3의 발현은 당뇨병에서 변경되는 것으로 나타난다(예를 들어, 문헌[Natori, Y., et al, 2013, Biol. Pharm., Bull., 36, 1027]에 논의된 Neu1 활성). 시알리다제는 또한 죽종형성(Sukhorukov, V.N., et al., 2017, Curr. Pharm. Des., 23, 4696) 및 골관절염(Katoh, S., et al., 1999, J Immunol., 162, 5058)에 연루되기도 한다.
따라서, 본 발명의 화합물은 아래에 더 상세히 설명되는 바와 같이 신생물형성/증식성 장애의 치료 또는 예방에 적용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "신생물형성(neoplasia)"은 엄밀한 의미로, 신생물 세포의 비정상적인 증식을 수반하는 질환을 정의하기 위해 사용된다. 이 용어는 양성, 전암성 및 악성 신생물형성(상기 정의된 바와 같음)을 포함하며, 용어 "증식성 장애"와 동의어로 사용된다.
신생물형성은 정상적인 생리적 제어로부터 자유로운 후천적 유전자 또는 후성적 변화를 갖는 신생물 세포(즉, 세포가 "형질전환됨")에서 부적절하게 높은 수준의 세포 분열 및/또는 낮은 수준의 아폽토시스 또는 노쇠로부터 발생한다. 신생물형성은 전형적으로 신생물(neoplasm), 즉 그 성장이 정상 조직의 성장을 초과하고 조화되지 않으며 변화를 유발한 자극이 중단 된 후에도 동일한 과도한 방식으로 지속되는 것으로 알려진 구조를 생성한다. 대부분의 신생물은 큰 조직 덩어리(고형 종양)를 형성하지만, 일부 신생물은 그러한 별개의 조직 덩어리를 형성하지 않는다. 이들로는 자궁경부 상피내 신생물형성, 항문 상피내 신생물형성 및 백혈병을 포함한다.
신생물형성은 양성, 잠재적 악성 또는 악성일 수 있다. 양성 신생물형성은 침습적이지 않고 악성 신생물로 변형 또는 진행되지 않는 자궁 섬유종 및 멜라닌세포 모반(피부 점)을 포함한다. 잠재적 악성(전암성) 신생물은 침습적이지는 않지만 시간이 지나면 악성 신생물로 변하는 상피내암(carcinoma in situ)을 포함한다.
악성 신생물형성은 주변 조직에 침습하여 파괴하는 신생물(종양)을 일으키고 전이를 형성하여 결국 숙주를 사멸시킬 수 있다. 용어 "악성 신생물형성" 및 "암"은 본 명세서에서 동의어로 사용된다.
용어 "증식 장애(proliferative disorder)" 및 "신생물형성"은 생체내 세포의 병리학적 성장을 수반하는 질환의 부류를 정의하기 위해 동의어로서 본 명세서에 사용될 수 있다.
따라서, 증식 장애는 암, 암 전이, 평활근 세포 증식, 전신 경화증, 간경변, 성인 호흡 곤란 증후군, 특발성 심근병증, 홍반성 루푸스, 망막병증(예를 들어, 당뇨병성 망막증), 심장 과형성, 양성 전립선 과형성, 난소 낭종, 폐 섬유증, 자궁내막증, 섬유종증, 과오종, 림프관종증, 유육종증 및 데스모이드 종양을 포함한다. 평활근 세포 증식을 수반하는 신생물형성은 혈관구조 내 세포의 과증식(예를 들어, 내막 평활근 세포 과형성, 재협착 및 혈관 폐쇄, 특히 혈관성형술과 같은 생물학적 또는 기계적으로 매개된 혈관 손상 후 협착을 포함함)을 포함한다. 더욱이, 내막 평활근 세포 과형성은 혈관구조 외의 다른 평활근에서의 과형성(예를 들어, 신장 간질성 섬유증 환자의 담관, 기관지 기도 및 신장의 폐색)을 포함할 수 있다. 비암성 증식 장애는 또한 건선 및 이의 다양한 임상 형태와 같은 피부 내 세포의 과증식, 라이터 증후군, 모공성 홍색 비강진(pityriasis rubra pilaris) 및 각질화 장애의 과증식 변이(광선 각화증, 노인 각화증 및 경피증 포함)를 포함한다.
용어 "신생물형성"은 엄밀한 의미로 생체내 세포의 비정상적인 성장 및/또는 분화를 수반하는 질환을 정의하기 위해 본 명세서에 사용되며, 이에 따라 과형성, 화생 및 이형성을 포함한다.
과형성(hyperplasia)은 기관 또는 조직 내의 정상(형질전환되지 않은) 세포가 비정상적인 정도로 증식하는 상태를 정의한다. 따라서, 이것은 기관의 총체적 확대, 양성 종양의 형성을 초래할 수 있거나, 또는 현미경으로만 볼 수 있다. 과형성은 특정 자극에 대한 생리학적 반응이며 과형성 세포는 여전히 정상적인 조절 제어 메커니즘의 영향을 받는다(세포가 정상적인 생리적 제어에 반응하지 않는 비정상적인 방식으로 증식하는 신생물 성장과 달리). 그 예로는 선천성 부신 과형성, 자궁내막 과형성, 양성 전립선 과형성(전립선 비대), 유방 과형성(유관 과형성 포함), 국소 상피 과형성[헤크(Heck) 병], 피지 과형성 및 간 과형성을 포함한다.
화생(metaplasia)은 성숙한 분화 유형의 세포가 다른 성숙한 분화 유형의 세포로 대체되는 상태를 정의한다. 예를 들어, 침샘관의 원주 상피 세포의 편평상피화생(돌이 있는 경우), 방광의 전이성 상피의 편평상피 화생(역시 돌이 있거나 감염과 관련이 있는 경우), 위산 역류가 있는 환자의 식도(Barrett's esophagus)에서의 샘 화생, 및 결합 조직의 골 화생을 포함한다.
이형성(dysplasia)은 조직 내 세포의 비정상적인 성숙을 특징으로 하는 상태를 정의한다. 이것은 일반적으로 미성숙 세포의 확장 및 이에 상응하는 성숙 세포의 수 및 위치의 감소로 이루어진다. 예를 들어, 자궁경부의 상피 이형성은 점막 표면에 제한되는 미성숙 세포의 증가된 집단을 특징으로 한다. 골수이형성 증후군 또는 조혈 세포의 이형성은 골수에 있는 미성숙 세포의 수 증가 및 혈액에 있은 성숙한 기능성 세포의 감소를 나타낸다. 다른 예로는 신경섬유종증이 있다.
과형성, 화생 및 이형성은 일반적으로 가역적 상태이며, 자극(예를 들어, 발작 또는 손상)의 결과이다. 이에 반해, 신생물형성은 일반적으로 비가역적이며 세포 변형과 관련이 있다.
본 발명의 화합물은 증식성 장애, 양성, 전암성 및 악성 신생물형성, 과형성, 화생 및 이형성을 포함하는 임의의 신생물형성의 치료에 일반적으로 적용된다.
따라서, 본 발명은 암, 암 전이, 평활근 세포 증식, 전신 경화증, 간경화, 성인 호흡 곤란 증후군, 특발성 심근병증, 홍반성 루푸스, 망막병증(예를 들어, 당뇨병성 망막병증), 심장 과형성, 양성 전립선 과형성, 난소 낭종, 폐 섬유증, 자궁내막증, 섬유종증, 과오종, 림프관종증, 유육종증 및 데스모이드 종양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 증식 장애의 치료에 적용성이 있다. 평활근 세포 증식을 수반하는 신생물형성은 혈관구조 내 세포의 과증식(예를 들어, 내막 평활근 세포 과형성, 재협착 및 혈관 폐쇄, 특히 혈관성형술과 같은 생물학적 또는 기계적으로 매개된 혈관 손상 후 협착을 포함함)을 포함한다. 더욱이, 내막 평활근 세포 과형성은 혈관구조 외에 다른 평활근에서의 과형성(예를 들어, 신장 간질성 섬유증 환자의 담관, 기관지 기도 및 신장의 폐색)을 포함할 수 있다. 비암성 증식 장애는 또한 건선 및 이의 다양한 임상 형태와 같은 피부내 세포의 과증식, 라이터 증후군, 모공성 홍색 비강진 및 각질화 장애의 과증식 변이(광선 각화증, 노인 각화증 및 경피증 포함)를 포함한다.
특히 바람직한 것은 악성 신생물(암)의 치료이다. 본 발명은 다음과 같은 주요 그룹에서 선택되는 것을 포함하여 임의의 암 치료에 적용된다: (a) 암종; (b) 모세포종; (c) 백혈병; (d) 림프종; (e) 골수종; (f) 육종 및 (g) 혼합형 암.
암종은 상피 기원의 악성 신생물 또는 신체 내부 또는 외부 내벽(lining)의 암을 지칭한다. 상피 조직의 악성종양인 암종은 모든 암 사례의 80 내지 90%를 차지한다. 상피 조직은 몸 전체에서 발견된다. 이것은 피부뿐만 아니라 위장관과 같은 기관 및 내부 통로의 덮는 층(covering) 및 내벽에도 존재한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따라 치료되는 암종은 다음의 암종으로부터 선택된다: 침샘; 결장; 직장; 부속체; 폐; 흉선; 유방; 자궁경부; 방광 및 눈.
본 발명은 간모세포종(예를 들어, 신모세포종, 비상피성 신장 종양, 횡문근 신장 종양, 신장 육종 및 신장의 pPNET), 수모세포종, 췌장모세포종, 폐모세포종, 흉막폐모세포종, 신경모세포종(일반적으로 말초 신경 세포 종양뿐만 아니라 신경절신경모세포종 및 망막모세포종 포함)을 포함하는 모든 모세포종의 치료에 적용된다.
본 발명은 림프성 백혈병(예를 들어, 전구세포 백혈병, 성숙 B 세포 백혈병, 성숙 T 세포 백혈병 및 NK 세포 백혈병); 급성 골수성 백혈병; 만성 골수증식성 질환; 골수이형성 증후군 및 기타 골수증식성 질환을 포함하는 모든 백혈병, 골수증식성 질환 및 골수이형성 질환의 치료에 적용된다. 따라서, 본 발명은 림프성, 림프구성 또는 림프모구성 백혈병(림프성 및 림프구성 혈액 세포 계열의 악성종양) 및 진성 적혈구 증가증 또는 적혈병(다양한 혈액 세포 생성물의 악성종양이나, 적혈구가 우세함)을 포함하는 다양한 백혈병의 치료에 적용된다.
림프종은 체액을 정화하고 감염과 싸우는 백혈구 또는 림프구를 생성하는 혈관, 결절 및 기관(특히 비장, 편도선 및 흉선)의 망구조인 림프계의 샘 또는 결절에서 발생한다. 때때로 "액체 암"이라고 불리는 백혈병과 달리 림프종은 "고형암"이다. 림프종은 또한 위, 유방 또는 뇌와 같은 특정 기관에서 발생할 수도 있다. 이러한 림프종은 림프절외 림프종이라고 지칭된다. 림프종은 호지킨 림프종과 비호 지킨 림프종의 2가지 범주로 세분된다. 호지킨 림프종에서 리드-스턴버그(Reed-Sternberg) 세포의 존재는 호지킨 림프종을 비호지킨 림프종으로부터 진단적으로 구별한다. 본 발명은 다음을 포함하는 모든 이러한 림프종 및 망상내피 신생물의 치료에 적용된다: (a) 호지킨 림프종; (b) 비호지킨 림프종(예를 들어, 전구 세포 림프종, 성숙 B 세포 림프종, 성숙 T 세포 림프종 및 NK 세포 림프종; (c) 버킷 림프종 및 (d) 외투 세포 림프종을 포함한 기타 림프세망 신생물.
따라서, 본 발명은 예를 들어, 림프계의 샘 또는 결절(비장, 편도선 및 흉선 포함)의 종양 및 위, 유방 및 뇌의 림프절외 림프종을 포함하는 광범위한 림프종의 치료에 적용된다.
골수종은 골수의 형질 세포에서 기원하는 암이다. 따라서, 본 발명은 조혈 종양 및 혈액 악성종양, 예를 들어, 림프계 계통의 것[예를 들어, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종(예컨대, 미만성 거대 B 세포 림프종), T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(호지킨 림프종을 비호지킨 림프종으로부터 구별하는 호지킨 림프종 중 리드-스턴버그 세포의 존재), 모세포 림프종 및 버킷 림프종] 뿐만 아니라 골수 계통의 조혈 종양[예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수성 백혈병 및 이마티닙(Imatinib) 민감성 및 불응성 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 보르테조밉(Brotezomib) 민감성 및 불응성 다발성 골수종, 골수증식성 질환 또는 전골수성 백혈병 및 갑상선 소포암]의 치료에 적용된다.
본 발명은 모든 육종의 치료에 적용된다. 육종은 뼈, 힘줄, 연골, 근육 및 지방과 같은 지지 및 결합 조직에서 기원하는 암을 지칭한다. 일반적으로 젊은 성인에서 발생하는 가장 흔한 육종은 종종 뼈에서 고통스러운 덩어리로서 발생한다. 육종 종양은 일반적으로 이들이 성장하는 조직과 유사하다. 본 발명에 따른 치료를위한 예시적인 육종은 골육종(또는 골형성 육종); 연골육종; 평활근육종(평활근); 횡문근육종(골격근); 중피육종 또는 중피종(체강의 막 내벽); 섬유육종(섬유 조직); 혈관육종 또는 혈관내피종(혈관); 지방육종; 신경교종; 성상세포종; 점액육종(원시 배아 결합 조직) 및 중간엽 또는 혼합 중배엽 종양(혼합 결합 조직 유형)을 포함한다. 섬유육종은 말초 신경초 종양 및 기타 섬유성 신생물, 예를 들어, 섬유모세포 및 근섬유모세포 종양, 신경초 종양 및 기타 섬유종 신생물을 포함한다. 카포시 육종도 포함된다. 또한, 연조직 육종, 예를 들어, 연조직의 유잉(Ewing) 종양 및 아스킨(Askin) 종양, 연조직의 pPNET, 신장외 횡문근 종양; 섬유조직구성 종양; 활액 육종; 연조직 및 폐포 연부 육종의 골성 및 연골종성 신생물을 포함한다. 골육종(악성 골종양)은 다음을 포함한다: 골의 악성 섬유 신생물; 악성 척삭종 및 치원성 악성 종양도 포함된다. 신경교종은 희소돌기교종, 혼합 및 상세 불명의 신경교종 및 신경상피 신경교 종양을 포함한다.
본 발명은 예를 들어, 선편평상피 암종, 혼합 중배엽 종양, 암육종 및 기형암종을 포함하는 혼합형 암의 치료에 적용된다. 따라서, 본 발명은 다음을 포함하는 다양한 CNS, PNS 및 다수의 두개내 및 척추내 신생물의 치료에 적용된다: 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종, 슈반세포종, 뇌실막세포종 및 맥락막총 종양(예를 들어, 뇌실막세포종 및 맥락막총 종양); 두개내 및 척추내 배아 종양(예를 들어, 수모세포종, 원시 신경외배엽 종양(PNET), 수질상피종, 비정형 기형/횡문근 종양 및 기타 두개내 및 척추내 신생물[예를 들어, 뇌하수체 선종 및 암종, 안장 부위 종양(두개인두종), 뉴런 및 혼합 뉴런-아교 종양, 수막종 및 일반적으로 두개 내 및 척추내 신생물].
따라서, 본 발명은 두개내 및 척추내 생식 세포 종양; 두개내 및 척추내 종자세포종; 두개내 및 척추내 기형종; 두개내 및 척추내 배아 암종; 두개내 및 척추내 난황낭 종양; 두개내 및 척추내 융모암종 및 혼합 형태의 두개내 및 척추내 종양의 치료에 특별히 적용성이 있다.
본 발명은 또한 다양한 생식 세포 종양, 영양막 종양 및 생식선 신 생물의 치료에 적용성이 있다. 따라서, 본 발명은 예를 들어, 다음을 포함하는 악성 두개외 및 생식선외 생식 세포 종양의 치료에 적용성이 있다: 두개외 및 생식선외 부위의 악성 생식종, 두개외 및 생식선외 부위의 악성 기형종, 두개외 및 생식선외 부위의 배아 암종, 두개외 및 생식선외 부위의 난황낭 종양; 두개외 및 생식선외 부위의 융모암종 및 일반적으로 두개외 및 생식선외 부위의 악성 혼합 생식 세포 종양. 본 발명은 또한 예를 들어, 악성 생식선 생식선종, 정액종, 악성 생식선 기형종, 생식선 배아 암종, 생식선 난황낭 종양, 생식선 융모암, 혼합 형태의 악성 생식선 종양 및 악성 생식선 생식선모세포종을 포함하는 악성 생식선 생식 세포 종양의 치료에 적용성이 있다.
감염성 질환
본 발명의 화합물은 시알리다제 저해제이므로, 시알리다제 활성 및/또는 시알산에 의해 매개되는 질환 및 장애의 치료 또는 예방에 적용성이 있다. 이러한 질환 및 장애는 감염성 질환(박테리아 및 바이러스 감염 포함)을 포함한다.
본 발명의 화합물은 임의의 감염제에 대해 항감염(예를 들어, 병리정지 또는 병리살균) 활성을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 광범위한 상이한 감염인자를 표적으로 삼을 수 있다(즉, 대항 활성을 가질 수 있다). 따라서, 본 발명은 바이러스, 박테리아, 진균, 원생 동물, 프리온 또는 후생동물 인자가 연루된 감염성 질환을 포함하는 임의의 감염 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방에 광범위한 적용성이 있다.
따라서, 본 발명은 바이러스 감염의 치료 또는 예방; 박테리아 감염의 치료 또는 예방; 원생동물 감염의 치료 또는 예방; 진균 감염의 치료 또는 예방; 프리온 감염의 치료 또는 예방; 및/또는 후생동물(예를 들어, 연충) 감염 또는 전염의 치료 또는 예방에 광범위한 적용성이 있다. 본 발명의 화합물은 또한 만성, 휴면 또는 잠복성 바이러스, 박테리아, 원생 동물, 진균, 프리온 또는 후생 동물(예를 들어, 연충) 감염 또는 전염의 치료 또는 예방에 적용성이 있다.
· 바이러스 표적은 다음 바이러스(또는 바이러스 부류)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 레트로비리대(Retroviridae)(예를 들어, HIV-1을 포함한 인간 면역결핍 바이러스); 피코나비리대(Picornaviridae)[예를 들어, 폴리오 바이러스, A형 간염 바이러스; 엔테로바이러스, 인간 콕사키(Coxsackie) 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스]; 칼시비리대(Calciviridae)(예를 들어, 위장염을 유발하는 균주); 토가비리대(Togaviridae)(예를 들어, 말 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스); 플라비비리대(Flaviridae)(예를 들어, 뎅기 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열병 바이러스); 코로노비리대(Coronoviridae)(예를 들어, 코로나바이러스); 랍도비라대(Rhabdoviradae)(예를 들어, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스); 필로비리대(Filoviridae)(예를 들어, 에볼라바이러스); 파라믹소비리대(Paramyxoviridae)(예를 들어, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스); 오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae)(예를 들어, 인플루엔자 바이러스); 번가비리대(Bungaviridae)[예를 들어, 한탄(Hantaan) 바이러스, 번가 바이러스, 플레보바이러스(phleboviruse) 및 나이로(Nairo) 바이러스]; 아레나 비리대(Arena viridae)(출혈열 바이러스); 레오비리대(Reoviridae)(예를 들어, 레오바이러스, 오르비바이러스, 및 로타바이러스); 비르나비리대(Birnaviridae); 헤파드나비리대(Hepadnaviridae)(B형 간염 바이러스); 파르보비리대(Parvoviridae)(파르보바이러스); 파포바비리대(Papovaviridae)(유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노비리대(Adenoviridae)(대부분의 아데노바이러스); 헤르페스비리대(Herpesviridae)[단순 포진 바이러스(HSV) 1 및 2, 수포성 대상포진 바이러스, 거대세포바이러스(CMV), 헤르페스 바이러스]; 폭스비리대(Poxviridae)(바리올라 바이러스, 백시니아 바이러스, 수두 바이러스), 및 이리도비리대(Iridoviridae)(예를 들어, 아프리카 돼지 열 바이러스); 및 미분류된 바이러스(예를 들어, 해면상 뇌병증의 병인 인자, 델타 간염 인자(B형 간염 바이러스의 결함 위성으로 간주됨), HCV 바이러스(비A, 비B형 간염 유발); 노르워크(Norwalk) 및 관련 바이러스 및 아스트로바이러스]. 전술한 것 중에서 특히 바람직한 것은 HIV, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 광견병 바이러스, 폴리오바이러스, 인플루엔자 바이러스, 수막염 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 풍진, 백일해, 뇌염 바이러스, 유두종 바이러스, 황열 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파르보바이러스, 치쿤군야(chikungunya) 바이러스, 출혈열 바이러스 및 헤르페스 바이러스, 특히 수두, 거대세포바이러스 및 엡스타인-바 바이러스이다.
· 박테리아 표적으로는 그람 음성균과 그람 양성균을 모두 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 화합물에 의해 표적화될 수 있는 박테리아의 예는 다음을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 보렐리아 부르크도르페리(Borelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 마이코박테리움 종(예를 들어, M. 튜베르큘로시스, M. 레프레, M. 아비움, M. 인트라셀루라레, M. 칸사이 및 M. 고도내), 스타필로코커스 아우레우스(Stapylococcus aureus), 나이세리아 고노로에아(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(그룹 A 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 아가락티에(Streptococcus agalactiae)(그룹 B 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 비리단스(Streptococcus viridans), 스트렙토코커스 페칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코커스 속의 임의의 혐기성 종, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 캄필로박터(Campylobacter) 종, 엔테로코커스(Enterococcus) 종, 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 코리네박테리움(Corynebacterium) 종[C. 디프테리애(C. diphtheriae) 포함], 에리시펠로트릭스 루시오패시애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 크렙시엘라(Klebsiella) 종(K. 뉴모니애 포함), 파스퇴렐라 멀토시다(Pasturella multocida), 박테로이데스(Bacteroides) 종, 푸소박테리움 뉴클레아텀(Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실러스 모닐리조미스(Streptobacillus monilijormis), 트레포네마 팔리디움(Treponema pallidium), 트레포네마 퍼테뉴(Treponema pertenue), 렙토스피라(Leptospira) 종, 리켓치아(Rickettsia) 종, 및 악티노마이세스(Actinomyces) 종[A. 이스라엘리(A. israelii) 포함]. 생체내에서 생물막을 형성하는 박테리아는 본 발명의 화합물의 특정 표적이며, 이들은 탄네렐라 포시티아(Tannerella forsythia), 탄네렐라 덴티콜라(Tannerella denticola), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 및 가드너렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)를 포함한다.
· 진균 표적은 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스 토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 및 칸디다 알비 칸스(Candida albicans)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
· 원생동물 표적은 플라스모듐(Plasmodium) 종[플라스모듐 팔시파럼(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 말라리에(Plasmodium malariae), 플라스모듐 오발(Plasmodium ovale) 및 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax) 포함], 톡소플라스마(Toxoplasma) 종[T. 곤디(T. gondii) 및 T. 크루지(T. cruzii) 포함], 리슈마니아(Leishmania) 종, 크립토스포리디움(Cryptosporidium) 종[C. 파범(C. parvum) 포함], 사이클로스포라(Cyclospora) 종[C. 카예타넨시스(C. cayetanensis) 포함], 엔타모에바(Entamoeba)[E. 히스톨리티카(E. histolytica) 포함] 및 지아디아(Giardia) 종[G. 람블리아(G. lamblia) 포함]을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
· 후생동물 표적은 기생충 또는 병원체, 예컨대 연충[예를 들어, 시스토소마(Schistosoma) 종을 포함한다.
생체내 박테리아 성장의 저해
본 발명의 화합물의 시알리다제 저해 특성은 또한 생체내 공생 및/또는 병원성 박테리아 성장의 저해, 특히 포유동물(예를 들어, 인간) 숙주에서 박테리아 생물막의 저해 또는 제거를 포함하는 숙주-박테리아 세포 상호작용의 파괴에 적용성이 있다.
따라서, 본 화합물은 박테리아 생물막(예를 들어, 치은하 플라크 생물막 및 점막 생물막)의 존재에 의해 매개되거나 이를 특징으로 하는 질환 및 장애의 치료 또는 예방에 적용성이 있다.
이러한 질환으로는 치주 질환, 박테리아성 질염 및 감염 원인이 탄네렐라 포시티아(Tannerella forsythia), 탄네렐라 덴티콜라(Tannerella denticola), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 및 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)(이 후자의 종은 박테리아성 질염 및 조산과 관련이 있음)인 질환을 포함한다.
죽종형성(Atherogenesis)
본 발명의 화합물은 시알리다제 저해제이므로, 시알리다제가 과정에 연루되어 있는 죽종형성(Sukhorukov, V.N., et al., 2017, Curr. Pharm. Des., 23, 4696) 및 골관절염(Katoh, S., et al., 1999, J Immunol., 162, 5058)의 치료 또는 예방에 적용성이 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 죽상경화증의 치료 및 예방에 적용성이 있다.
공생 박테리아 성장의 조절
본 발명의 화합물의 시알리다제 저해 특성은 또한 숙주에서 미생물총(및 특히 공생 박테리아)의 조성의 조절, 예를 들어, 포유류(예를 들어, 인간) 숙주에서 공생 박테리아의 조성의 조절에 적용성이 있다, 특히 바람직한 것은 장내 미생물총의 조절이다.
염증
본 발명의 화합물은 골관절염에서 TNF-α 유도 염증 과정에 연루된 것으로 생각되는 시알리다제를 저해한다(Gee, K. et al., 2003, J Biol Chem. 278, 37275). 또한, 본 발명의 화합물은 TNF-α 활성을 저해하거나 억제할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 화합물은 염증이 생리학적 기능의 손상 및/또는 증상 및/또는 통증에 역할을 하는 임의의 장애에 적용성이 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은, 예를 들어, 급성, 만성, 국소 또는 전신 염증을 감소 또는 제거하기 위한 항염증제로서 사용될 수 있다.
염증은 미생물, 외상, 화학물질, 열, 추위, 일광 화상 또는 기타 유해한 사건으로 인해 조직이 손상될 때 발생한다. 내인성 화학물질(예를 들어, 브래디키닌, 히스타민 및 세로토닌)은 상해 또는 발작 시 방출되며, 이러한 화학물질은 조직 대 식세포 및 기타 백혈구를 활성화하고 유인한다. 이 과정 동안, TNF-α와 같은 화학 매개체가 방출되어 염증을 일으킨다.
염증성 장애는 염증이 지속되거나 만성인 질환이다. 이러한 상황에서 장기간의 염증은 조직 파괴를 일으키고 광범위한 손상 및 환부 조직 및/또는 기관의 궁극적인 기능상실을 초래하는 것이다.
따라서, 본 발명의 화합물은 비-국소화된 염증성 장애, 예를 들어, 하나보다 많은 기관에 영향을 미치는 장애의 치료에 적용성이 있다. 이러한 장애는 면역 기능장애로 인해 발생하는 장애를 포함한다(이에 따라 자가면역 성분이 있을 수 있음). 이러한 상태는 전신 홍반성 루푸스(SLE), 경피증 및 과민증을 포함한다.
본 발명의 화합물은 또한 피부 염증 및 만성 전립선염, 사구체신염, 염증성 장 질환, 골반 염증 질환, 재관류 손상, 류마티스 관절염, 이식 거부, 혈관염, 천식, 여드름, 골관절염, 구강 점막, 위장 염증, 안구, 비강 및 귀 염증 및 기타 스테로이드 반응성 염증 장애를 포함하는 국소 염증 장애의 치료에 적용성이 있다.
특히, 본 발명의 화합물은 피부 염증성 질환의 치료에 적용성이 있다. 그 예로는, 광선 각화증, 여드름(심상성 여드름, 면포, 주사성 여드름, 및 결절낭 여드름 포함), 알레르기성 접촉 피부염, 혈관부종, 수포성 유사천포창, 피부 약물 반응, 다형성 홍반, 낭창성 홍반증, 광피부염, 건선성 관절염, 경피증 및 두드러기, 건선, 피부염(예를 들어, 아토피성 피부염), 경피증, 스테로이드-반응성 피부 염증 장애(예를 들어, 요독 가려움증), 및 햇빛, 방사선, 화학요법 및 환경 자극제에 대한 노출과 관련된 피부 상태를 포함한다.
본 발명의 화합물은 또한 염증성 자가면역 질환의 치료에 적용성이 있다. 이러한 질환은 특이적 조직 또는 기관(예컨대, 류마티스 관절염 및 강직 척추염에서와 같은 근골격 조직), 위장관(예를 들어, 크론병 및 궤양성 대장염에서와 같은 것), CNS(예를 들어, 알츠하이머 병, 다발성 경화증, 운동 뉴런 질환, 파킨슨병 및 만성 피로 증후군에서와 같은 것), 췌장 베타 세포(예를 들어, 인슐린 의존성 진성 당뇨병), 부신(예를 들어, 애디슨 병), 신장[예를 들어, 굿파스처(Goodpasture) 증후군, IgA 신병증 및 간질성 신염], 외분비선(예를 들어, 쇼그렌 증후군 및 자가면역 췌장염) 및 피부(예르르 들어, 건선 및 아토피 피부염)를 수반할 수 있다.
본 발명에 따라 치료할 수 있는 다른 염증성 질환은 골관절염, 치주 질환, 당뇨병성 신병증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 죽상동맥경화증, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증성 질환, 자궁내막증, 만성 간염 및 결핵과 같은 상태를 포함한다.
에너지 이용 질환
본 발명의 화합물은 혈당 조절 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명은 다양한 에너지 이용 질환의 치료에 적용된다. 이러한 질환으로는 광범위한 질환 및 장애를 포함하며, 예를 들어, 항상성 장애, 대사 질환, 당 대사 기능장애 및 식욕 장애를 포함한다.
따라서, 에너지 이용 질환의 예로는 인슐린 저항성, 다양한 형태의 당뇨병(1형 및 2형 당뇨병 포함), 대사 증후군, 비만, 소모성 증후군(예를 들어, 암 관련 악액질), 근병증, 위장 질환, 성장 지연, 고콜레스테롤혈증, 죽상경화증 및 노화 관련 대사 기능장애를 포함한다.
에너지 이용 질환으로는, 또한, 예를 들어, 고혈당증, 포도당 불내성, 고인슐린혈증, 포도당뇨, 대사성 산증, 백내장, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 신병증, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 사구체경화증, 당뇨병성 심근병증, 인슐린 저항성, 포도당 대사 장애, 관절염, 고혈압, 고지혈증, 골다공증, 골감소증, 골 손실, 부서지기 쉬운 뼈 증후군, 급성 관상동맥 증후군, 불임, 단장 증후군, 만성 피로, 섭식 장애 및 장 운동 기능 장애를 포함하는, 대사 증후군, 비만 및/또는 당뇨병과 관련이 있는 상태를 포함한다.
인슐린 저항성, 대사 증후군 및 당뇨병
건강한 개체에서, 혈당 수치는 인슐린(췌장 β 세포에 의해 생성됨)과 글루카곤(췌장 α 세포에 의해 생성됨)이라는 두 췌장 호르몬에 의해 좁은 범위 내에서 유지된다. 췌장 β 세포는 혈당 수치의 증가를 감지하고 인슐린을 분비하여 반응한다. 인슐린은 신체 조직의 포도당 흡수를 촉진하여 혈당 농도를 생리학적 범위로 회복시킨다. 글루카곤은 주로 간에서 포도당 생산을 자극하여, 공복 상태에서 혈당 수치를 증가시켜 상호작용한다.
인슐린 저항성은 골격근, 지방세포 및 간세포에서 인슐린의 작용이 감소하여 정상적인 양의 인슐린이 이러한 조직의 세포에서 정상적인 인슐린 반응을 생성하는 데 부적절해지는 것을 특징으로 한다. 지방세포에서, 인슐린 저항성은 저장된 트라이글리세라이드의 가수분해를 일으켜 혈장 내의 유리 지방산을 증가시킨다. 근육에서 인슐린 저항성은 포도당 흡수를 감소시키는 반면, 간세포에서는 포도당 저장을 감소시킨다. 후자의 경우 모두 혈당 농도가 상승한다.
인슐린 저항성으로 인한 높은 혈장 인슐린 및 포도당 수치는 종종 대사 증후군 및 2형 당뇨병으로 진행한다.
대사 증후군은 심혈관 질환 및 당뇨병의 위험을 증가시키는 이상 및 장애의 집합체이다. 발병률은 많은 선진국에서 매우 높다: 일부 연구에 따르면 미국 인구의 최대 25%의 유병률을 나타낸다. 이 장애는 (대사) 증후군 X, 인슐린 저항성 증후군, Reaven 증후군 및 CHAOS라고도 알려져 있다. 대사 증후군은 다음 증상 중 3가지 이상의 존재로 진단할 수 있다: 중심 비만(남성의 경우 40 인치 초과, 여성의 경우 35 인치 초과의 허리 둘레); 높은 트라이글리세라이드 수치(150 ㎎/㎗ 이상); 낮은 HDL 수치(남성의 경우 40 ㎎/㎗ 미만, 여성의 경우 50 ㎎/㎗ 미만) 및 고혈압 (130/85 mmHg 이상). 관련 질환 및 징후는 다음과 같다: 지방간(종종 비알코올성 지방간 질환으로 진행됨), 다낭성 난소 증후군, 혈색소침착증(철분 과부하) 및 흑색극세포증(검은 피부 패치).
대사 증후군의 1차 치료는 생활 습관의 변화(칼로리 제한 및 신체 활동)이다. 그러나, 약물 치료가 자주 필요하다. 일반적으로, 대사 증후군을 포함하는 개체의 질환은 별도로 치료된다(예를 들어, 이뇨제 및 고혈압에 대한 ACE 저해제). 콜레스테롤 약물은 LDL 콜레스테롤과 트라이글리세라이드 수치가 높은 경우, 이들 수치를 낮추고, HDL 수치가 낮은 경우, HDL 수치를 높이는데 사용될 수 있다. 인슐린 저항성을 감소시키는 약물의 사용(예를 들어, 메트포르민 및 티아졸리딘디온은 논란의 여지가 있음). 심혈관 운동은 31% 미만의 사례에서 치료적이며, 일반적으로 공복 혈당 또는 인슐린 저항성을 감소시키지 않는다.
따라서, 대사 증후군에 대한 신규 및/또는 대체 치료, 특히 비만 및/또는 트라이글리세라이드 상승 수치에 대한 효과적인 치료가 필요하다.
2형 당뇨병은 지속적으로 상승된 혈당 수치를 특징으로 하는 만성 질환(고혈당증)이다. 인슐린 저항성은 췌장 β 세포로부터 인슐린 분비 장애와 함께 이 질병의 특징이다. 2형 당뇨병에 대한 인슐린 저항성의 진행은 췌장 β-세포가 정상적인 혈당 수치(정상혈당)를 유지하기 위해 적절한 인슐린을 생산할 수 없게 된 경우, 식사 후 고혈당증의 발생에 의해 표시된다.
현재 2형 당뇨병 치료에 사용되는 가장 중요한 약물은 메트포르민[글루코파지(Glucophage), 다이아벡스(Diabex), 다이아폴민(Diaformin), 포타멧(Fortamet), 리오메트(Riomet), 글루메차(Glumetza), 시도파지(Cidophage) 등]이다. 메트포르민은 바이구아나이드 부류의 경구용 항고혈당제이다. 다른 바이구아나이드로는 펜포르민 및 부포르민(현재는 철회됨)을 포함한다. 메트포르민은 주로 글리코겐 저장물로부터 혈당의 간 방출을 감소시킴으로써 작용하지만 포도당 흡수를 증가시키는 데에도 약간의 영향을 미친다. 다른 널리 사용되는 약물 부류로는 설포닐우레아(sulfonylurea) 그룹의 약물[글리벤클라마이드(glibenclamide) 및 글리클라자이드(gliclazide) 포함]을 포함한다. 이 약물은 췌장에 의한 포도당 자극 인슐린 분비를 증가시킨다. 더 새로운 약물 부류로는 티아졸리딘디온(예를 들어, 로시글리타존, 피오글리타존 및 트로글리타존)을 포함하며, 이는 세포핵 내의 수용체 분자 그룹인 PPAR(퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체)에 결합하여 작용한다. 다른 부류로는 α-글루코시다제 저해제(아카보스), 메글리티나이드(인슐린 방출을 자극하고 나테글리니드, 레파글리니드 및 이들의 유사체를 포함함), 펩타이드 유사체 (예를 들어, 인슐린 분비촉진제로 작용하는 인크레틴 모방체), 글루카곤 유사 펩타이드 유사체(예를 들어, 엑세나타이드), 다이펩타이딜 펩티다제-4(DPP-4) 저해제[인크레틴 수치를 증가시킴(예를 들어, 시타글립틴)] 및 아밀린 작용제 유사체[위 공복을 늦추고 글루카곤을 억제함(예를 들어, 프람린타이드)]를 포함한다.
그러나, 다른 형태의 2형 당뇨병에 대한 기존의 치료법은 β 세포의 주요 내재적 인자의 기능을 향상시키는 것으로 보이지 않으며, 기존의 모든 치료법은 이 질병의 진행을 저해하지 못하고, 시간이 경과해도 포도당 수치를 정상화하지 못하고 그리고/또는 후속 합병증을 예방하지 못한다. 기존 치료법은 또한 바람직하지 않은 부작용과 관련이 있다. 예를 들어, 인슐린 분비촉진제 및 인슐린 주사는 저혈당증 및 체중 증가를 유발할 수 있다. 환자는 또한 시간 경과에 따라 인슐린 분비촉진제에 반응하지 않게 될 수 있다. 메트포르민 및 α-글루코시다제 저해제는 종종 위장 문제를 일으키고 PPAR 작용제는 체중 증가와 부종을 증가시키는 경향이 있다. 엑세나타이드(Exenatide)는 또한 메스꺼움과 구토를 유발하는 것으로 보고되어 있다.
글리코실화는 단백질의 특성을 조절하는 데 중요한 역할을 하며 많은 질환과 관련이 있다. 문헌[Itoh, N. et al., 2007(Am J Physiol Endocrinol Metab 293: E1069-E1077)]은 2형 당뇨병에 걸린 인간 대상체의 혈청 N-글리칸 프로파일을 보고했으며, 이등분성 N-아세틸글루코사민과 함께 α1,6-푸코스를 갖는 이중안테나성 N-글리칸의 양이 증가한 것을 발견했다. 문헌[Copeland, R.J. et al., 2008(Am J Physiol Endocrinol Metab 295: E17-E28)]은 당뇨병에서 O-연결된 N-아세틸글루코사민의 중요성을 검토했고 GlcN아실화와 인슐린 저항성의 발생 사이에 강한 양(positive)의 상관관계가 있다는 결론을 내렸다. O-연결된-β-N-아세틸글루코사민(O-GlcNAc)은 인산화와 유사하게, 세린 및/또는 트레오닌 하이드록실 기에서 순환 시작 및 정지가 이루어지는 동적 해독후 변형이다. O-GlcNAc의 순환은 O-GlcNAc 전이효소와 O-GlcNAcase의 공동 작용에 의해 조절된다. GlcN아실화는 2형 당뇨병의 주요 특징인 포도당 독성 및 만성 고혈당 유발 인슐린 저항성의 원인에 관여한다. 헥소사미니다제(hexosaminidase) 활성은 당뇨병 환자의 혈청에서 상승하는 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Agardh, C.D. et al., 1982, Acta Med Scand. 212: 39-41]).
1형 당뇨병(또는 인슐린 의존성 당뇨병)은 췌장에 있는 랑게르한스 섬의 인슐린 생산 베타 세포가 손실되어 인슐린 결핍을 초래하는 것을 특징으로 한다. 이 베타 세포 손실의 주요 원인은 T 세포 매개의 자가면역 공격이다. 북미와 유럽에서 진성 당뇨병 사례의 최대 10%를 차지하는 1형 당뇨병에 대해 취할 수 있는 예방 조치는 알려져 있지 않다. 영향을 받은 대부분의 사람들은 그렇지 않으면 건강하고, 발병 시 건강한 체중이다. 인슐린에 대한 민감도 및 반응성은 특히 초기 단계에서 일반적으로 정상이다.
1형 당뇨병의 주된 치료는 특히 초기 단계부터 인슐린 대체와 함께 혈액 검사 모니터를 사용한 혈당 수치의 주의 깊은 모니터링이다. 인슐린이 없으면 케톤증과 당뇨병성 케톤산증이 발생할 수 있으며 혼수상태 또는 사망에 이르게 될 것이다. 일반적인 피하 주사외에도, 펌프로 인슐린을 전달하는 것이 가능하고, 이는 사전설정된 수준으로 하루 24 시간 인슐린을 지속적으로 주입할 수 있으며, 식사 시간에 필요한 만큼 인슐린 용량(볼루스)을 계획할 수 있도록 한다. 흡입형 인슐린인 Exubera는 최근 FDA의 승인을 받았다.
1형 당뇨병의 치료는 무기한 계속되어야 한다. 치료가 정상적인 활동을 해치지 않지만, 검사 및 약물치료에 있어 지대한 관심, 적절한 주의 및 규율을 준수해야 한다.
따라서, 신규 및/또는 대체 항당뇨병 약물 치료, 특히 β-세포 기능을 회복시킬 수 있는 치료가 필요하다. 특히, 기존 약물 치료법보다 부작용이 적으면서 2형 및 1형 당뇨병 및 관련 상태를 모두 치료할 수 있는 효과적인 약물에 대한 현실적이고 실질적인 미충족된 임상 요구가 있다.
본 발명은 임의의 에너지 이용 질환의 치료에 광범위한 적용성이 있다. 따라서, 본 발명에 따라 치료될 수 있는 질환은 예를 들어, 항상성 장애, 대사 질환, 당 대사 기능장애 및 식욕 장애를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 인슐린 저항성, 다양한 형태의 당뇨병, 대사 증후군, 비만, 소모성 증후군(예를 들어, 암 관련 악액질), 근병증, 위장 질환, 성장 지연, 고콜레스테롤혈증, 죽상경화증 및 연령-관련 대사 기능장애의 치료에 적용성이 있다.
본 발명은 또한 예를 들어, 고혈당증, 포도당 불내성, 고인슐린혈증, 포도당뇨, 대사성 산증, 백내장, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 신병증, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 사구체경화증, 당뇨병성 심근병증, 인슐린 저항성, 포도당 대사 장애, 관절염, 고혈압, 고지혈증, 골다공증, 골감소증, 골 손실, 부서지기 쉬운 뼈 증후군, 급성 관상동맥 증후군, 불임, 단장 증후군, 만성 피로, 섭식 장애, 장 운동 기능장애 및 당 대사 기능장애를 포함하는 대사 증후군, 비만 및/또는 당뇨병과 관련된 상태의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 식욕을 억제하는데 사용될 수 있다. 어떠한 이론에도 얽매이길 원치 않지만, 이것은 특히 혈당 수준의 유지, 피곤함/피로 및 단 것을 먹고 싶은 욕구를 유발하는 라지 딥스(large dips)를 제거함으로써(즉, '개선된 에너지 균형'을 촉진함으로써) 달성될 수 있다.
특히 바람직한 것은 인슐린 저항성, 대사 증후군, 비만 및 당뇨병(특히 2형 당뇨병)의 치료이다.
본 발명은 인슐린 저항성의 치료에 적용성이 있다. 인슐린 저항성은 골격근, 지방세포 및 간세포에서 인슐린의 작용이 감소하여 정상적인 양의 인슐린이 이러한 조직들의 세포에서 정상적인 인슐린 반응을 생성하는 데 부적절해지는 것을 특징으로 한다. 지방세포에서 인슐린 저항성은 저장된 트라이글리세라이드의 가수분해를 일으켜 혈장 내의 유리 지방산을 증가시킨다. 근육에서 인슐린 저항성은 포도당 흡수를 감소시키는 반면, 간세포에서는 포도당 저장을 감소시킨다. 후자의 경우 모두 혈당 농도의 상승이 초래된다. 인슐린 저항성으로 인한 높은 혈장 인슐린 및 포도당 수치는 종종 대사 증후군 및 2형 당뇨병으로 진행된다.
본 발명은 대사 증후군(본 명세서에 정의된 바와 같은 것)의 치료에 적용성이 있다. 이 장애는 (대사) 증후군 X, 인슐린 저항성 증후군, Reaven 증후군 및 CHAOS로도 알려져 있다.
본 발명은, 예를 들어, 지방간(종종 비알코올성 지방간 질환으로 진행됨), 다낭성 난소 증후군, 혈색소침착증(철분 과부하) 및 흑색극세포증(검은 피부 패치)을 포함하는 대사 증후군과 관련된 질병의 치료에 적용성이 있다.
본 발명은 1형 및 2형 당뇨병을 포함하는 당뇨병의 치료에 적용성이 있다. 2형 당뇨병은 상승된 혈당 수치(고혈당증)를 특징으로 하는 만성 질환이다. 인슐린 저항성과 함께 췌장 β 세포의 인슐린 분비 장애가 이 질병의 특징이다. 2형 당뇨병에 대한 인슐린 저항성의 진행은 췌장 β-세포가 정상적인 혈당 수치를 유지(정상혈당)하기 위해 적절한 인슐린을 생산할 수 없게 되는 경우 식사 후 고혈당증의 발생으로 표시된다.
1형 당뇨병
본 발명은 1형 당뇨병(또는 인슐린 의존성 당뇨병)의 치료에 적용성이 있다. 1형 당뇨병은 췌장에 있는 랑게르한스 섬의 인슐린 생산 베타 세포가 손실되어 인슐린 결핍을 초래하는 것을 특징으로 한다. 이 베타 세포 손실의 주요 원인은 T 세포 매개의 자가면역 공격이다. 북미와 유럽에서 진성 당뇨병 사례의 최대 10%를 차지하는 1형 당뇨병에 대해 취할 수 있는 예방 조치는 알려진 것이 없다. 영향을 받은 대부분의 사람들은 달리 건강하고 발병시 건강한 체중이다. 인슐린에 대한 민감도와 반응성은 특히 초기 단계에서, 일반적으로 정상이다.
이하에 설명된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 항당뇨병유발성 바이러스 활성을 가질 수 있다. 당뇨병유발성 바이러스는 1형 당뇨병의 병인이며, 따라서 항당뇨병성 바이러스 활성을 갖는 화합물은 1형 당뇨병의 치료 또는 예방, 및 또한 (a) 바이러스 유발성 1형 당뇨병의 치료; (b) 바이러스성 당뇨병유발의 지연 또는 예방; (c) 1형 당뇨병의 치료; (d) 바이러스에 의한 ß-세포 용해의 치료 또는 예방 (예를 들어, 비면역 세포용해 또는 면역 매개 세포용해에 의해); (e) 바이러스 매개 내인성 인터페론 생산의 예방, 감소 또는 제거; (f) β-세포를 표적으로 하는 자가반응성 T 세포의 바이러스 매개 방관자 활성화의 예방, 감소 또는 제거; (g) β-세포를 표적으로 하는 자가반응성 T 세포의 바이러스 활성화 및/또는 확장의 예방, 감소 또는 제거; 및/또는 (h) β-세포를 면역 매개 세포용해에 노출시키는 조절 T 세포의 바이러스 매개 손실의 예방 또는 감소에 사용하기에 특히 바람직하다.
이러한 적용성들은 섬(islet) 자가항체를 갖는 대상체의 치료에 특별한 유용성이 있는데, 그 이유는 그러한 환자들이 1형 당뇨병으로 진행될 위험이 높고 전술 한 당뇨병유발성 바이러스에 감염될 수 있기 때문이다.
본 발명은 또한 미토콘드리아 질환, 특히 전술한 에너지 이용 질환과 관련된 후천성 미토콘드리아 기능장애의 치료 및 관리에 적용성이 있다.
약용량
본 발명의 화합물은 국소적으로 또는 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 직장, 질 및 국소(구강 및 설하 포함) 투여를 포함하는 경구 또는 비경구 경로에 의해 투여될 수 있다.
투여되는 양은 사용된 특정 투여량 단위, 치료 기간, 치료된 환자의 연령 및 성별, 치료된 장애의 본성 및 정도, 및 선택된 특정 화합물에 따라 크게 달라질 수 있다.
일반적으로, 투여되는 화합물의 유효량은 일반적으로 1일 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 500 ㎎/㎏ 범위일 것이다. 단위 투여량은 0.05 내지 500㎎의 화합물을 함유할 수 있고, 1일 1회 이상 복용될 수 있다. 화합물은 이하에 기재된 바와 같이 경구, 비경구 또는 국소의 통상적인 투여량 단위 형태를 사용하여 약제학적 담체와 함께 투여될 수 있다.
바람직한 투여 경로는 경구 투여이다. 일반적으로 적절한 용량은 수혜자의 1일 체중 kg당 0.01 내지 500㎎ 범위, 바람직하게는 1일 체중 kg당 0.1 내지 50㎎ 범위, 가장 바람직하게는 1일 체중 kg당 1 내지 5㎎ 범위일 것이다.
바람직한 용량은 매일 투여를 위한 단일 용량으로서 제공되는 것이 바람직하다. 그러나, 하루 동안 적절한 간격으로 2, 3, 4, 5 또는 6회 이상의 부분용량(sub-dose)의 투여도 사용될 수 있다. 이러한 부분용량은, 예를 들어, 단위 투여량 형태당 0.001 내지 100㎎, 바람직하게는 0.01 내지 10㎎, 가장 바람직하게는 0.5 내지 1.0㎎의 활성 성분을 함유하는 단위 투여량 형태로 투여될 수 있다.
제형
본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 임의의 형태를 취할 수 있다. 이것은 합성이거나 또는 천연 공급원{예를 들어, 람나시애(Rhamnaceae) 및 사핀다시애(Sapindaceae) 과의 식물[예를 들어, 지자이푸스(Zizyphus) 또는 파울리니아(Paullinia) 속의 식물, 예를 들어, 지자이푸스 주주바 또는 파울리니아 쿠파나 종의 식물]로부터 선택되는 식물 공급원을 포함하는, 본 명세서에서 식별된 임의의 식물 공급원 유래}으로부터 단리될 수 있다. 전술한 식물의 열매, 열매의 부분, 열매 추출물 및 열매즙이 식물 공급원으로서 특히 바람직하다.
천연 공급원에서 단리된 경우, 화합물은 정제될 수 있다. 그러나, 본 발명의 조성물은 앞서 정의된 바와 같이 생약의 형태를 취할 수 있다. 이러한 생약은 바람직하게는 사용 전에 표준 사양을 충족하는지 여부를 결정하기 위해 분석된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 생약은 건조된 식물 재료일 수 있다. 대안적으로, 생약은 가공된 식물 재료일 수 있고, 가공은, 예를 들어, 분말화, 분쇄, 동결, 증발, 여과, 압착, 분무 건조, 압출, 초임계 용매 추출 및 팅크제 생산과 같은 물리적 또는 화학적 전처리를 수반한다. 생약이 식물 전체(또는 그 일부)의 형태로 투여 또는 판매되는 경우, 식물 재료는 사용 전에 건조될 수 있다. 동결 건조, 분무 건조 또는 공기 건조를 포함한 임의의 편리한 형태의 건조를 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 극성 용매[예를 들어, 에탄올/물 혼합물, 예를 들어, ≥50% v/v(예를 들어, 최대 약 70% v/v) 에탄올/물 혼합물]에서 추출에 의해 단백질 및 다당류와 같은 고 분자량 성분으로부터 분리될 수 있다. 다른 적절한 기술로는 다양한 막 기술이 포함된다. 이들로는 미세여과, 한외여과 및 나노여과가 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 전기 투석을 사용하여 하전된 화합물을 농축할 수도있다. 이러한 방법은 특정 크기 미만의 분자만이 통과하도록 하는 소공 크기의 막을 이용하거나 또는 분자 상의 전하에 의존하여 막을 통과하도록 허용하거나 허용하지 않는다. 음이온 및 양이온 교환 수지를 사용하여 화합물을 농축할 수도 있다.
천연 공급원으로부터 단리되는 경우, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 정제될 수 있다. 화합물이 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화되는 실시형태에서, 예를 들어, 불활성 희석제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제를 포함하는 임의의 적합한 부형제가 사용될 수 있다. 적합한 불활성 희석제는 탄산 나트륨 및 칼슘, 인산 나트륨 및 칼슘, 락토스를 포함하는 한편, 옥수수 전분 및 알긴산은 적합한 붕해제이다. 결합제는 전분 및 젤라틴을 포함 할 수 있는 한편, 윤활제는 존재하는 경우 일반적으로 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 또는 활석일 것이다.
약제학적 조성물은 임의의 적합한 형태를 취할 수 있으며, 예를 들어, 정제, 엘릭시르, 캡슐, 용액, 현탁액, 분말, 과립 및 에어로졸을 포함한다.
약제학적 조성물은 부품 키트의 형태를 취할 수 있으며, 이 키트는 사용 설명서 및/또는 단위 투여 형태의 복수의 상이한 성분과 함께 본 발명의 조성물을 포함할 수 있다.
경구용 정제는 불활성 희석제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제와 같은 약제학적 허용성 부형제와 혼합된, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물을 포함할 수 있다. 적합한 불활성 희석제는 탄산 나트륨 및 칼슘, 인산 나트륨 및 칼슘, 락토스를 포함하며, 옥수수 전분 및 알긴산은 적합한 붕해제이다. 결합제는 전분 및 젤라틴을 포함할 수 있는 한편, 윤활제는 존재하는 경우 일반적으로 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석일 것이다. 원하는 경우, 정제는 위장관에서의 흡수를 지연시키기 위해 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 다이스테아레이트와 같은 물질로 코팅될 수 있다. 경구용 캡슐은 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물이 고체 희석제와 혼합된 경질 젤라틴 캡슐 및 활성 성분이 물 또는 땅콩 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 같은 오일과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐을 포함한다.
직장 투여용 제형은 예를 들어, 코코아 버터 또는 살리실레이트를 포함하는 적절한 기제(base)와 좌약으로서 제공될 수 있다. 질 투여에 적합한 제형은 활성 성분 외에도, 적절한 것으로 공지된 담체를 함유하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제형으로서 제공될 수 있다.
근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 사용을 위해, 본 발명의 화합물은 일반적으로 적절한 pH 및 등장성으로 완충된 멸균 수용액 또는 현탁액으로 제공될 것이다. 적합한 수성 비히클은 링거액 및 등장성 염화나트륨을 포함한다. 본 발명에 따른 수성 현탁액은 셀룰로스 유도체, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 및 트라가칸트 검과 같은 현탁화제, 및 레시틴과 같은 습윤제를 포함할 수 있다. 수성 현탁액에 적합한 보존제는 에틸 및 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트를 포함한다.
본 발명의 화합물은 또한 리포솜 제형으로 제공될 수 있다.
경구 투여를 위해 화합물 또는 화합물들은 캡슐, 알약, 정제, 트로키, 로젠 지, 용융물, 분말, 과립, 용액, 현탁액, 분산액 또는 에멀션(여기서, 용액, 현탁액 분산액 또는 에멀션은 수성 또는 비수성일 수 있음)과 같은 고체 또는 액체 제제로 제형화될 수 있다. 고체 단위 투여 형태는, 예를 들어, 계면활성제, 윤활제, 및 불활성 충전제, 예컨대, 락토스, 수크로스, 인산 칼슘 및 옥수수 전분을 함유하는 일상적인 경질 또는 연질 껍질의 젤라틴 유형일 수 있는 캡슐일 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제, 투여 후 정제의 붕괴(break-up) 및 용해를 돕기 위한 붕해제, 예컨대 감자 전분, 알긴산, 옥수수 전분, 및 구아 검, 정제 과립의 유동을 개선시키고 정제 다이(die) 및 펀치(punch)의 표면에 정제 물질의 접착을 방지하기 위한 윤활제, 예를 들어, 탈크, 스테아르산, 또는 마그네슘, 칼슘, 또는 아연 스테아레이트, 염료, 착색제, 및 정제의 심미적 품질을 향상시키고 환자에게 더욱 허용성으로 만들기 위한 향미제와 함께, 락토스, 수크로스 및 옥수수 전분과 같은 통상적인 정제 기제에 의해 정제화될 수 있다.
경구 액체 투여 형태에 사용하기에 적합한 부형제는 약제학적 허용성 계면 활성제, 현탁화제 또는 유화제의 첨가와 함께 또는 첨가없이 물 및 알코올, 예를 들어, 에탄올, 벤질 알코올 및 폴리에틸렌 알코올과 같은 희석제를 포함한다.
본 발명의 화합물은 또한 비경구, 즉 피하, 정맥내, 근육내 또는 복강내 투여될 수 있다.
이러한 실시형태에서, 화합물은 약제학적 담체(살균 액체 또는 액체 혼합물일 수 있음)와 함께 생리학적으로 허용되는 희석제에 주사가능한 용량으로서 제공된다. 적합한 액체는 물, 식염수, 수성 덱스트로스 및 관련 당 용액, 알코올(예컨대, 에탄올, 아이소프로판올 또는 헥사데실 알코올), 글리콜(예컨대, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜), 글리세롤 케탈(예컨대, 2,2-다이메틸-1,3-다이옥솔란-4-메탄올), 에테르[예컨대, 폴리(에틸렌-글리콜) 400], 오일, 지방산, 지방산 에스테르 또는 글리세라이드, 또는 아세틸화된 지방산 글리세라이드를, 약제학적 허용성 계면활성제(예컨대, 비누 또는 세제), 현탁화제[예컨대, 펙틴, 카호머(carhomer), 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 또는 카복시메틸셀룰로스], 또는 유화제 및 기타 약제학적 보조제의 첨가 또는 첨가 없이 포함한다. 본 발명의 비경구 제형에 사용될 수 있는 적합한 오일은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어, 땅콩 오일, 대두유, 참깨유, 면실유, 옥수수 오일, 올리브 오일, 바셀린, 및 미네랄 오일이다. 적합한 지방산은 올레산, 스테아르산 및 아이소스테아르산을 포함한다. 적합한 지방산 에스테르는, 예를 들어, 에틸 올레이트 및 아이소프로필 미리스테이트이다.
적합한 비누는 지방 알칼리 금속, 암모늄, 및 트리에탄올아민 염을 포함하고, 적합한 세제는 양이온성 세제, 예를 들어, 다이메틸 다이알킬 암모늄 할라이드, 알킬 피리디늄 할라이드, 및 알킬아민 아세테이트; 음이온성 세제, 예를 들어, 알킬, 아릴 및 올레핀 설포네이트, 알킬, 올레핀, 에테르, 및 모노글리세라이드 설페이트, 및 설포숙시네이트; 비이온성 세제, 예를 들어, 지방 아민 산화물, 지방산 알칸올아미드, 및 폴리옥시에틸렌폴리프로필렌 공중합체; 및 양쪽성 세제, 예를 들어, 알킬-베타-아미노프로피오네이트, 및 2-알킬이미다졸린 4차 암모늄 염, 및 혼합물을 포함한다.
본 발명의 비경구 조성물은 전형적으로 용액에 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물을 약 0.5 내지 약 25 중량% 함유할 것이다.
보존제 및 완충액도 사용될 수 있다. 주사 부위의 자극을 최소화하거나 제거하기 위해, 이러한 조성물은 친수성-친지성 균형(HLB)이 약 12 내지 약 17인 비이 온성 계면활성제를 함유할 수 있다. 이러한 제형에서 계면활성제의 양은 약 5 내지 약 15 중량% 범위이다. 계면활성제는 상기 HLB를 갖는 단일 성분일 수 있거나, 또는 원하는 HLB를 갖는 2 이상의 성분의 혼합물일 수 있다. 비경구 제형에 사용되는 계면활성제의 예시는 폴리에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르의 부류, 예를 들어, 소르비탄 모노올레이트 및 프로필렌 글리콜과 프로필렌 옥사이드의 축합에 의해 형성된, 소수성 염기에 의한 에틸렌 옥사이드의 고 분자량 첨가생성물이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 화합물들은 또한 국소 투여될 수 있고, 국소 투여되는 경우 담체는 적합하게 용액, 연고 또는 겔 기제를 포함할 수 있다. 기제(base)는, 예를 들어, 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 바셀린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀랍, 미네랄 오일, 물 및 알코올과 같은 희석제, 및 유화제 및 안정제. 국소 제형은 약 0.1 내지 약 10% w/v(단위 부피당 중량)의 화합물 농도를 함유할 수 있다.
보조적으로 사용되는 경우, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 화합물들은 하나 이상의 다른 약물(들)과 함께 사용하기 위해 제형화될 수 있다. 따라서, 보조적 사용은 다른 약물(들)과 화합성이도록(또는 상승작용하도록) 설계된 특정 단위 투여량에 반영되거나, 또는 그 화합물 또는 화합물들이 하나 이상의 효소와 혼합되는 제형에 반영될 수 있다. 보조적 사용은 또한 본 발명의 화합물이 효소와 함께 공동포장되는(예를 들어, 단위 용량 어레이의 일부로서) 본 발명의 약제학적 키트의 조성물에 반영될 수 있다. 보조적 사용은 또한 그 화합물 또는 화합물들 및/또는 효소의 공동 투여에 관한 정보 및/또는 설명서에 반영될 수 있다.
미용 제형
본 발명의 미용 조성물은, 예를 들어, 보습 조성물, 클렌징 조성물, 또는 피부에 유익을 제공할 수 있는 임의의 조성물로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 미용 조성물은 미용적으로 허용되는 부형제 또는 담체, 예를 들어, 이하에 기재된 것들로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 미용 조성물은 클렌징 조성물이다. 적합한 클렌징 조성물은 실온에서 고체 또는 반고체이다. 유용한 클렌징 조성물의 예는 글리세린 비누, 합성 세제 및 이들의 혼합물을 포함하는 지방산 비누를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 고체 클렌징 조성물은 1990년대 Soap Technology에 광범위하게 교시되어 있고, 그 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 클렌징 조성물은 유동성인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시형태에서, 클렌징 조성물은 글리세린 비누를 포함한다. 본 발명에 유용한 글리세린 비누의 예는 미국 특허 제4,405,492호 및 제4,879,063호에 개시된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 각 문헌의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
적합한 지방산 비누의 예는 약 10 내지 22개(카복실 탄소 포함)의 탄화수소 사슬 길이로부터 유래된 비누를 포함하고, 포화되거나 불포화될 수 있다. 비누는 예를 들어, 나트륨 염, 칼륨 염, 암모늄염, 트리에탄올암모늄 염 및 이들의 혼합물일 수 있다.
적합한 합성 세제는 원하는 목적을 위해 본 기술분야에 공지된 것들을 포함한다. 개인용 클렌징에 유용한 세제의 예로는 순수한 사슬 길이 변이체일 수 있는 이세티오네이트, 사르코시네이트, 및 글리세릴 에테르 설포네이트, 또는 코코넛 오일과 같은 시판 오일에서 유래된 것을 포함한다. 다른 적합한 세제는 음이온성 아실 사르코시네이트, 메틸 아실 타우레이트, N-아실 글루타메이트, 알킬 설포숙시네이트, 알킬 포스페이트 에스테르, 에톡시화된 알킬 포스페이트 에스테르, 트리데세스 설페이트, 단백질 축합물, 에톡시화된 알킬 설페이트와 알킬 아민 옥사이드의 혼합물, 베타인, 설타인 및 이의 혼합물을 포함한다. 1 내지 12개의 에톡시 기를 갖는 알킬 에테르 설페이트, 특히 암모늄 및 소듐 라우릴 에테르 설페이트가 포함된다.
미용 조성물은 보습 조성물일 수 있다.
본 발명의 미용 조성물의 다른 선택적 성분은 향수, 방향제, 보존제, 착색제, 염료, 점결방지제 및 개인 위생 성분, 예를 들어, 비제한적으로 피부 및 모발 관리 성분을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 유용한 적합한 개인 위생 성분의 예는 안전하고 유효한 양의 하기 성분을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 습윤제, 자외선 차단제, 피부 진정제, 항자극제, 항염증제, 연화제, 컨디셔닝제, 보습제, 탈취제, 발한제, 인공 태닝제, 항미생물제, 여드름 방지제, 주름 방지제, 피부 위축 방지제, 피부 탄력 제, 가려움 방지제, 항진균제, 국소 마취제, 피부 톤 이브닝 제제, 활성 천연 성분, 원치 않는 털의 출현을 최소화하거나 재성장을 지연시키는 제제, 피부 질감 개질제 및 추가 클렌징 제제.
일 실시형태에서, 화합물은 예를 들어, 건성 피부의 치료 및 연화제 적용예에 사용되는 것과 같은 유중수(w/o) 에멀션을 사용하여 물 또는 알코올성 수추출물로부터 사용될 수 있다
연화제는 피부 표면이나 각질층에 남아 있는 능력에 의해 윤활제로서 작용하고, 박리를 줄이고 피부 외관을 개선시키는 기능을 한다. 전형적인 연화제는 지방 에스테르, 지방 알코올, 미네랄 오일, 폴리에테르 실록산 공중합체 등을 포함한다. 적합한 연화제의 예는 폴리프로필렌 글리콜("PPG")-15 스테아릴 에테르, PPG-10 세틸 에테르, 스테아레스-10, 올레스-8, PPG-4 라우릴 에테르, 비타민 E 아세테이트, PEG-7 글리세릴 코코에이트, 라놀린 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 비타민 E 아세테이트, PEG-7 글리세릴 코코에이트 및 이들의 조합이 바람직하다.
적합한 습윤제의 예는 다가 알코올을 포함한다. 적합한 다가 알코올은 글리세롤(글리세린으로도 알려짐), 폴리알킬렌 글리콜, 알킬렌 폴리올 및 이들의 유도체, 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 다이프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 유도체, 소르비톨, 하이드록시프로필 소르비톨, 헥실렌 글리콜, 1,3-다이부틸렌 글리콜, 1,2,6-헥산트리올, 에톡실화된 글리세롤, 프로폭실화된 글리세롤 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
적합한 피부 진정제는 판테놀, 비사보롤, 알란토인, 알로에 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
적합한 컨디셔닝제는 다이메티콘 프로필 PG-베타인, 다이메티콘 코폴리올, 폴리쿼터늄-10, 구아, 구아 유도체 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 항여드름 활성 성분은 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 살리실산, 황, 젖산, 글리콜산, 피루브산, 요소, 레조시놀, N-아세틸시스테인, 레틴산, 벤조일 퍼옥사이드, 옥토피록스, 트리클로산, 아젤라산, 페녹시에탄올, 페녹시프로판올, 플라보노이드, 이들의 유도체, 및 이들의 조합. 살리실산 및 과산화 벤조일 arE가 바람직하다.
실시예
본 발명은 이제 특정 실시예를 참조하여 설명될 것이다. 이들은 단지 예시적이고 설명의 목적일 뿐이며, 어떤 방식으로든 청구된 독점권의 범위 또는 설명된 발명에 제한하려는 의도는 없다. 이들 실시예는 본 발명을 실시하기 위해 현재 고려되는 최상의 모드를 구성한다.
실시예 1: 화합물 1 내지 3의 단리 및 식별
3개의 4-하이드록시메틸-N-메틸-L-프롤린 화합물(1-3)은 모두 Z. 주주바의 열매, 과라나 종자 및 Z. 스피나-크리스티의 잎에서 관찰되었고, 단리하여 구조를 밝혀냈다.
과라나 종자는 주로 화합물 1(약 0.1% w/w)을 더 적은 양의 2 및 3과 함께 함유했다. 지자이프스 종은 전형적으로 화합물 1과 3의 비율이 각각 약 2:1이었다(약 0.1% w/w). 화합물 1과 2는 Z. 주주바 열매에서 분리되었고, 3은 Z. 스피나-크리스티에서 분리되었다.
이 화합물들 중 어떤 화합물도 다른 공급원에서는 분리되지 않았다.
지자이푸스 추출물 제조
건조 Z. 스피나-크리스티 잎(BEZ01)의 샘플(200g)을 4 리터의 50% 수성 에탄올로 밤새 추출하였다. 여과된 추출물을 양이온 교환 컬럼(H+ 형태의 Amberlite IR120) 아래로 통과시키고 잔류 분획을 암모니아로 용출시켰다. 이어서 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피(OH- 형태의 Amberlite CG400)를 수행하고 결합된 분획을 아세트산으로 용출시키고 CG400 아세테이트-형 컬럼에 적용하였다.
분획 분석을 통해 화합물 1(HS0810/146/36 - 50 ㎎) 및 3(HS0810/146/41 - 44㎎)을 식별할 수 있었다. 동일한 방법을 사용하여 화합물 1(JH0806/42/4) 및 2(LJ746/18/7)를 Z. 주주바 열매에서 분리하였고 1은 과라나(JH0420/8/20)에서도 분리되었다.
과라나 추출물(Blue Sky Botanics 배취 150701A)은 이하에 기술되는 GC 조건 하에서 9.9분의 체류 시간에 트라이메틸실릴 유도체(주 이온 194 amu)의 GCMS에 의한 카페인과 일치하는 주요 화합물을 갖고, 또한 신규 N-메틸화된 피페콜산(N-메틸-4R,5S-다이하이드록시-2S-피페콜산)(JH0806/90/5; 체류 시간 8.4분)을 갖는다는 점에서 지자이푸스 종의 추출물과 상이했다.
추출물 및 순수 화합물의 GC 분석
모든 샘플은 유도체화 전에 동결 건조했다. 피리딘 중 헥사메틸다이실라잔(HMDS) 및 트라이메틸클로로실란(TMCS)의 혼합물(Pierce 'Tri-Sil' 실릴화 시약, HMDS:TMCS:피리딘 2:1:10 비율)을 사용하여 트라이메틸실릴(TMS) 유도체를 제조했다. 샘플을 60℃에서 15분 동안 가열한 다음, 실온에서 최소 60분 동안 방치했다. 불용성 반응 생성물은 원심분리에 의해 침전되었고, 상청액은 주사기를 사용하여 새로운 바이알로 옮겼다.
고 극성 용융-실리카 컬럼(Varian 'Factor Four' VF-5ms 컬럼, 25m x 0.25mm 내경, 0.25mm 상 두께)을 가진 Perkin Elmer Autosystem XL 기체 크로마토그래프를 사용하여 GC-MS로 분석을 수행했다. 운반 기체(헬륨) 유속은 1ml/분이었다. 트라이메틸실릴-(TMS) 유도체는 160℃에서 5분 동안 시작한 뒤, 10℃/min의 속도로 300℃까지 직선 증가시키는 온도 프로그램을 사용하여 분리하였다. 온도는 추가 10분 동안 300℃에서 유지시켰다; 총 분석 시간은 29분이었다. 컬럼 용출액의 전자 충격 질량 분광분석은 4중극자 이온 필터 시스템을 갖고 분석 동안 250℃에서 지속적으로 실행되는 Perkin Elmer TurboMass Gold 질량 분석계를 사용하여 수행하였다. 검출기 질량 범위는 100 내지 650 amu로 설정되었다. 이송 라인(GC에서 MS로)의 온도는 250℃로 유지되었다. 샘플을 스플릿 벤트(스플릿 비율 50:1)를 통해 컬럼에 주입하여 비활성화된 석영 울로 채워진 용융 실리카 좁은 구멍 주입 라이너를 통과시켰고; 주입구 온도는 200℃로 유지시켰다. 주입량은 1㎕였다. 시스템 제어, 데이터 수집 및 질량 스펙트럼 분석은 Perkin Elmer TurboMass 소프트웨어(TurboMass v. 4.4)를 사용하여 수행했다.
화합물 1 내지 3은 다음과 같은 조건 하에 GCMS에 의해 상이한 체류 시간을 갖는 상기와 같이 제조된 트라이메틸실릴 유도체로서 고유한 질량 스펙트럼을 제공한다:
화합물 1, 고유 이온 186(100%), 260(10%) 및 288(10%) amu(체류 시간 4.8분).
화합물 2, 고유 이온 170(10%) 및 186(100% amu (체류 시간 5.6분).
화합물 3, 고유 이온 170(10%), 274(100%), 288(15%) 및 376(10%) amu(체류 시간 7분).
구조 결정
이온 교환에 의해 정제된 화합물은 중수소 산화물을 용매로 사용하는 Bruker Avance 500MHz 기기에서 분석하였다. NMR 설명은 아래에 기재된다.
화합물 1의 구조적 설명
Figure pct00014
1H NMR(500MHz, D2O) δ/ppm 3.89(1H, t, J=9.14Hz, 2), 3.48-3.58(2H, m, 5), 3.46-3.50(1H, m, 6), 3.29(1H, dd, J=12.0, 8.8Hz, 5), 2.87(3H, s, 7), 2.65-2.77(1H, m, 4), 2.60(1H, dt, J=13.6, 8.4Hz, 3), 1.71-1.82(1H, m, 3)
13C NMR(126MHz, D2O) δ/ppm 173.6(8), 71.2(2), 62.8(6), 58.2(5), 41.4(7), 38.6(4), 32.2(3)
개별 탄소 원자에 대한 양성자 부착은 펜던트 및 HMQC 스펙트럼에서 할당되었다. COSY 상관관계는 2에서 3 내지 4까지, 4에서 5 및 6까지의 연계성을 보여준다. δ 3.89 ppm(2)에서 CH, δ 2.87 ppm(7)에서 메틸 및 δ 3.29 ppm 및 δ 3.52 ppm(5)에서 메틸렌의 수소 화학적 이동은 모두 질소에 부착되어 있어 N-메틸-피롤리딘 고리 구조를 형성한다는 것을 나타낸다.
δ 3.50 ppm(6)에서 메틸렌의 수소 화학적 이동은 메틸렌이 하이드록실에 부착되어 있는 것을 나타내어, 4에 부착된 하이드록실메틸을 형성한다. 2 및 3에서부터 δ 173.6 ppm에서 4차까지의 HMBC 상관관계는 2에 부착되는 산을 나타낸다.
δ 3.89 ppm(2)과 δ 2.70 ppm(4)에서 양성자 사이의 NOESY 상관관계는 이들이 고리의 동일 면에 있어 S,S 구성을 제공한다는 것을 나타낸다. 이러한 해석을 기반으로 하여, 구조는 N-메틸-4S-(하이드록시메틸)-2S-피롤리딘카복실산(화합물 1)인 것으로 추정된다.
양성자의 화학적 이동은 치환기 효과의 기준 표에서 예상되는 것과 잘 일치하며 탄소 이동은 예측된 값(ACD CNMR 예측인자)과 거의 일치한다. 설명된 구조는 이전에 보고된 적이 없는 것이다.
화합물 2의 구조적 설명
Figure pct00015
1H NMR(500MHz, D2O) δ/ppm 3.39-3.53(2H, m, 6), 2.96-3.05(1H, m, 2), 2.91(1H, d, J=10.7Hz, 5), 2.42-2.57(1H, m, 5), 2.29-2.42(1H, m, 4), 2.22-2.29(1H, m, 3), 2.22(3H, s, 7), 1.46(1H, dt, J=8.8, 4.7Hz, 3).
13C NMR(126MHz, D2O) δ/ppm 173.6(8), 68.6(2), 64.5(6), 57.8(5), 41.4(7), 38.6(4), 33.2(3)
개별 탄소 원자에 대한 양성자 부착은 펜던트 및 HMQC 스펙트럼에서 할당되었다. COSY 상관관계는 2에서 3 내지 4까지의 연계성, 및 4에서 5 및 6까지의 상관관계를 보여준다. δ 3.01 ppm(2)에서 CH, δ 2.22 ppm(7)에서 메틸 및 δ 2.91 ppm 및 δ 2.51 ppm(5)에서 메틸렌의 수소 화학적 이동은 모두 질소에 부착되는 것을 나타내며, 따라서 N-메틸-피롤리딘 고리 구조를 형성한다. δ 3.47 ppm(6)에서 메틸렌의 수소 화학적 이동은 이것이 하이드록실에 부착되는 것을 나타내며, 따라서 4에 부착된 하이드록실메틸을 형성한다. 7부터 2 및 5까지의 HMBC 상관관계는 N-메틸피롤리딘 고리 구조를 확인시켜준다. 2 및 3부터 δ173.6ppm에서 4차까지의 HMBC 상관관계는 산이 2에 부착되는 것을 나타낸다. δ 3.01 ppm(2)과 δ 2.34 ppm(4)에 있는 양성자 사이에 NOESY 상관 관계는 없으며, 이는 이들이 고리의 반대 면에 있어, S, R 구성을 제공한다는 것을 나타낸다. 이러한 해석을 바탕으로 할 때, 구조는 N-메틸-4R-(하이드록시메틸)-2S-피롤리딘카복실산(화합물 2)인 것으로 추정된다.
양성자의 화학적 이동은 치환기 효과의 기준 표에서 예상되는 것과 잘 일치하며, 탄소 이동은 예측된 값(ACD CNMR 예측인자)과 거의 일치한다.
설명된 구조는 이전에 보고된 적이 없다.
화합물 3의 구조적 설명
Figure pct00016
1H NMR(500MHz, D2O) δ/ppm 4.21(1H, dd, J=11.3, 7.3Hz, 2), 3.81(1H, d, J=12.9Hz, 5), 3.58(2H, s, 6), 3.14(1H, d, J=12.9Hz, 5), 2.99(3H, s, 7), 2.41(1H, dd, J=13.9, 7.3Hz, 3), 2.13(1H, dd, J=13.9, 11.3Hz, 3)
13C NMR(126MHz, D2O) δ/ppm 172.8(8), 79.9(4), 70.6(2), 64.9(6), 63.3(5), 43.1(7), 39.4(3)
개별 탄소 원자에 대한 양성자 부착은 펜던트 및 HMQC 스펙트럼에서 할당되었습니다. COSY 상관 관계는 2에서 3까지의 연계성을 보여준다. δ 4.21ppm(2)에서 CH, δ 2.99 ppm(7)에서 메틸, δ 3.14 ppm 및 δ 3.81 ppm(5)에서 메틸렌은 모두 질소에 부착되어 N-메틸 고리 구조를 형성한다는 것을 나타낸다. δ 2.99pm(7)에서 메틸로부터 2 및 5까지의 HMBC 상관관계는 이 배열을 확인시켜준다. δ 3.58ppm에서의 단일선은 탄소와 수소 화학 이동으로부터 하이드록시메틸을 암시하는 2개의 양성자로서 통합된다. 이것은 HMBC 상관관계를 3, 4, 5에 제공한다. 이것이 단일선이라는 사실은 이것이 4차, 따라서 4에 부착되어 있음을 의미한다. 4의 탄소 화학적 이동은 여기에 부착된 하이드록실 단위가 있음을 의미한다.
이러한 해석을 기반으로 하여, 구조는 N-메틸-4-하이드록시-4-(하이드록시메틸)-2-피롤리딘카복실산인 것으로 추정된다. 2와 6 사이에 NOESY 상관관계가 있으며, 이는 하이드록시메틸이 양성자와 고리의 동일 면에 있음을 의미하므로, 구조는 N-메틸-4-하이드록시-4S-(하이드록시메틸)-2S-피롤리딘카복실산(화합물 3)인 것으로 추정된다.
양성자의 화학적 이동은 치환기 효과의 기준 표에서 예상되는 것과 잘 일치하며, 탄소 이동은 예측된 값(ACD CNMR 예측인자)과 거의 일치한다. 설명된 구조는 이전에 보고된 적이 없다.
Z. 스피나-크리스티 추출물의 양성자 NMR 스펙트럼(NMR 파일 K101613)과 화합물 1 및 화합물 3에 대한 양성자 스펙트럼과의 비교는 이것이 아미노산과 함께 주요 N-메틸프롤린 성분으로서 두 화합물의 혼합물을 함유한다는 것을 확인시켜주었다.
실시예 2: 화합물 1 및 3과 Z. 스피나-크리스티 추출물을 사용한 마우스에서의 이당류 부하 시험
서론
정제된 화합물 1 및 3을 마우스의 혈당 조절 활성에 대해 두 화합물을 모두 포함하는 Z. 스피나-크리스티 추출물과 함께 연구하였다.
방법
이 연구의 동물 실험 프로토콜은 도야마 대학의 동물 실험 위원회(S-2010 UH-2)의 승인을 받았다. 밤새 금식 후 수컷 ddy 마우스(29-33g)를 급성 이당류 부하 시험에 사용했다. 말토스(2.5 g/㎏ 체중) 또는 수크로스(2.5 g/㎏ 체중) 및 시험 샘플을 0.9% NaCl 용액에 용해시키고 위관을 통해 마우스에게 투여했다. 대조군에게는 식염수만을 부하했다.
포도당 측정을 위한 혈액 샘플은 이당류 로딩 후 0, 15, 30, 60 및 120분에 꼬리 정맥에서 수득했다. 혈당 수치는 휴대용 키트인 Antsence IITM(Sankyo Co. Ltd. 일본 도쿄)로 측정했다. 지자이프스 추출물 HS0810/142/41 뿐만 아니라 정제된 화합물을 이러한 방식으로 시험했다.
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
결론
지자이푸스 혼합물은 화합물 1과 같이 말토스로 이당류 공격 후 혈당 수준의 저하 효과를 나타냈다. 화합물 3은 30분째에 더 빠르게 강하하지만 수크로스 공격 후 초기 혈당이 명백히 증가하지만, 2시간 경에 다른 그룹보다 더 높은 출발점 아래로 떨어지는 더욱 복잡한 효과를 보였고, 이것은 혈당이 더 낮게 떨어진 DMDP 및 대조군보다 아마도 더 양호한 조절을 나타낸다.
실시예 3: 화합물 1 및 3에 의한 글루코시다제 저해 부족
서론
글루코시다제 저해가 혈당에 미치는 영향을 설명할 수 있는지를 결정하기 위해 이당류 부하 마우스 연구에 사용된 화합물 1 및 3 및 지자이푸스 추출물에 대해 글리코시다제 검정을 수행했다. 글리코시다제 패널을 사용하여 발견된 임의의 활성이 효소에 대해 단지 비특이적 결합이 아닌 선택적 저해였는지를 확인했다.
효소 검정
글리코시다제 검정은 문헌[Watson et al.(Phytochemistry 1997, 46, 255)]에 기재된 바와 같이, p-나이트로페닐-기질(기질로서 메틸움벨리페릴-N-아세틸뉴라민산을 사용한 시알리다제는 제외)을 사용하여 수행했다. 검정은 마이크로타이터 플레이트에서 수행했다. 효소를 위한 최적 pH인 0.1M 시트르산/0.2M 인산수소이나트륨(McIlvaine) 완충액에서 효소를 검정했다. 모든 검정은 20℃에서 수행했다. 모든 효소 및 기질은 Sigma Aldrich Chemicals Limited에서 구입했다. 항온처리 혼합물은 효소 용액 10㎕, 이미노당 용액 10㎕ 및 효소에 대한 최적 pH의 McIlvaine 완충액에 구성된 적절한 5mM p-나이트로페닐 기질 50㎕로 구성되었다. 반응의 대수기동안 0.4M 글리신(pH 10.4)으로 반응을 중단시켰다. 흡광도는 405nm에서 판독하였다. 물은 블랭크에서 알칼로이드 대신 대체되었다. 반응은 3반복으로 수행했다.
효소 저해제 용액 - 화합물을 1 ㎎ ㎖-1 농도의 증류수에 용해시킨 다음, 기질을 검정 부피에 1 ㎎ ㎖-1 희석한 후 0.14 ㎎ ㎖-1 농도로 스크리닝했다.
시알리다제 검정은 1mM 저해제(또는 저해제 없이 물) 및 2.5nM 시알리다제[T. 포시티아(T. forsythia)의 NanH 포함]를 사용하여 20mM 인산나트륨 완충액 중 0.1mM 메틸움벨리페릴-N-아세틸뉴라민산, pH 7.2의 존재하에 항온처리하였다. 반응은 30초 및 60초에 pH 10.5 60mM 탄산나트륨 완충액의 첨가를 통해 중지시켰다. 형광성 MU의 방출은 여기 350㎚, 450㎚에서 형광 방출을 측정하여 정량하였다. 시알리다제 활성 백분율은 저해제가 없는 반응의 형광과 비교하여 30초와 60초 사이의 형광 변화로 표현되었다. 반응은 3반복으로 수행하였다.
결과
결과는 저해%로 표시된다. 지자이푸스 추출물 또는 지자이푸스와 과라나로부터의 화합물 1 및 3에서는 글루코시다제 저해가 전혀 관찰되지 않았다. 글루코시다제 저해제인 DMDP 및 DNJ[1-데옥시노지리마이신(deoxynojirimycin)]는 다양한 글루코시다제에 대해 예상되는 강력한 저해를 보여주었다. 다른 글리코시다제 중에서, 단리된 화합물에 의해 관찰된 유일한 저해는 화합물 1에 의한 박테리아 T. 포시티아로부터의 시알리다제에 의한 것으로 시험되었다(화합물 3 및 지자이푸스 추출물은 이 검정에서 이용하지 않았다).
Figure pct00021
ND=결정되지 않음.
볼드체의 숫자는 0.4mM 시험 농도에서 강력한 저해를 나타낸다.
음수 값은 아마도 안정화 또는 개선된 폴딩에 의해 증가된 효소 활성을 나타낸다.
DMDP 및 DNJ는 가장 흔하게 발생하는 식물 이미노당이며 둘 다 알파-글루코시다제의 강력한 저해제이다(Watson, A. A., Fleet, G. W. J., Asano, N., Molyneux, R. J.; Nash, R. J. Phytochemistry 2001, 56, 265-295). 뽕나무(Mulberry)에서 처음 분리된 DNJ(1-데옥시노지리마이신)는 중국 전통 의학에서 당뇨병에 사용된다.
실시예 4: 화합물 1에 의한 TNF-α의 감소
서론
인간 혈액에서 TNF-α 생산의 측정은 TNF-α 수준에 대한 전신 투여된 임의의 제제의 작용을 예측하며, 즉, 생체외 또는 시험관내 혈액에서의 효과가 생체내 효과를 정확하게 모방한다. 이것은 윤리적 문제 또는 더 중요한 안전 고려 사항을 위해 인간의 생체내에서 직접 연구를 수행하기 어려운 경우 특히 유용하다. 전혈액 항온처리는 인간에서 시험관내 전염증 매개인자의 자극을 입증하는 데 유용한 것으로 나타났다(Finch-Arietta, M.B. & Cochran, F.R., 1991, Agents and Actions 34, 49). 이 접근법은 또한 전신 투여된 임의의 제제의 생체이용률을 모니터링하는 데 유용하다(Song, H.J. et al., 2005, European Journal of Clinical Nutrition 59, 508).
염증을 억제하는 데에는 여러 접근법이 있으며, 현재 치료적으로 가장 일상적으로 사용되는 2가지는 a) 스테로이드(글루코코르티코이드 유사체) 및 b) 에타너셉트(가용성 TNF-α 수용체 융합 단백질) 및 인플릭시맙(TNF-α에 대한 단클론 항체)과 같은 TNF-α의 작용을 중화시키는 제제이다. 이 두 접근법은 모두 염증성 사이토카인을 표적으로 하고, 스테로이드에 의한 생산 억제 및 에타너셉트와 인플릭시맙에 의한 TNF-α 작용을 방지한다. 이것은 또한 염증 반응을 억제하는데 있어서 TNF-α 표적화의 중요성을 입증한다(Feldmann, M. & Maini, R.N., 2001, Annual Review of Immunology 19, 163). 이와 유사하게, 글루코코르티코이드 유사체는 또한 사이토카인과 덱사메타손의 생성을 억제하고, 구체적으로 인간 단핵구로부터 TNF-α의 LPS-자극 생산을 감소시킬 수 있다(Waage, A. & Bakke, O., 1988, Immunology 63: 299).
이 연구의 목적은 전 인간 혈액 중 TNF-α 수준을 조절하는 능력과 관련하여 화합물 1의 항염증 활성을 평가하는 것이었다.
재료
혈액 및 백혈구연층(buffy coat) 분획은 영국 글래스고에 소재하는 스코틀랜드 국립 수혈 서비스(SNBTS)에서 공급받았다. Ficoll Histopaque(1.077g/l), 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)(Salmonella abortus equi 유래)는 Sigma-Aldrich Co. Ltd.(영국)에서 구입했다. PGE는 Cayman Chemical Co.(미시간 앤아버) 제품이다. TNF-α ELISA 검정을 위한 인간 TNF-α 항체 쌍은 Invitrogen/Life Sciences Europe에서 구입했다. 모든 약물은 영국 Gibco BRL의 RPMI 1640 배지에 용해했다.
방법
전혈액 항온처리 실험에서, 헌혈 후 추가 처리없이 혈액을 사용했다. 혈액은 모두 HIV, B형 및 C형 간염, CMV 및 말라리아와 같은 기생충 질환에 대해 음성으로 시험된(국립 수혈 서비스에 의해 시험됨) 것을 확인하여 정의된 대로 정상적인 건강한 기증자로부터의 혈액이 스코틀랜드 국립 수혈 서비스에 의해 친절하게 공급되었다. 혈액은 또한 우리 실험실에서 혈액을 받은 시기에 항상 <50 pg/㎖인 TNF-α의 기저 수준을 측정하여 급성 염증성 질환이 없는 것으로 확인했다.
세포 자극 및 TNF-α 측정
전체 혈액의 분취량(800㎕)을 결과에 표시된 바와 같은, RPMI 1640에 용해된 화합물과 함께 적절한 사전항온처리 기간 동안 항온처리한 후, LPS를 첨가하고 공기 중 CO2가 5%인 가습(100%) 대기하에 37℃에서 추가 20시간 동안 항온처리를 지속했다. 항온처리 기간이 끝나면 혈장 또는 배양 배지로 이루어진 상청액을 실온에서 10,000g에서 30초 동안 원심분리하여 수집하고 인간 TNF-α ELISA 시스템(BioSource Europe S.A., 벨기에, Invitrogen에서 제공)을 사용하여, 이전에 설명된 제조업체의 설명서(Brown et al., 2013)에 따라 측정하였다.
결과 및 결론
화합물 1은 인간 혈액에서 농도 의존적으로 LPS-자극된 TNF-α의 생산을 감소시키는 평균값 경향을 보여주었다.
도 1은 인간 혈액에서 LPS-자극 TNF-α 생산에 대한 화합물 1(μM)의 효과를 보여준다. 전혈액은 다양한 농도의 화합물과 함께 LPS(10 ㎍/㎖)의 부재(열린 기호) 또는 존재(채워진 원) 하에 24시간 동안 항온처리하였다. 37℃(5% CO2, 100% 습도)에서 항온처리한 후, 원심분리를 통해 혈액에서 혈장을 수집하고 혈장 샘플의 TNF-α 수준을 ELISA로 측정했다. 값은 n=3의 평균±s.d를 나타낸다.
여기에 사용된 낮은 μM 농도에서는 중요하지 않지만, 지자이푸스 식물 추출물의 농도는 생산 방법에 따라 높을 수 있고, 이것과 다른 4-하이드록시메틸-N-메틸-L-프롤린(화합물 1, 2 및 3)은 그 식물에 대해 주장된 항염증 활성을 설명하는데 도움이 될 수 있다.
실시예 5: 시알리다제 및 치주 병원체의 성장에 대한 4-하이드록시메틸-N-메틸-L-프롤린의 효과
치주 질환은 전세계적으로 약 7억 명의 환자가 있으며 영국 인구의 약 10 내지 20%에 영향을 미치는 심각한 건강 부담이다. 치아 손실의 원인인 것 외에도 최근 연구에 따르면 치주 질환의 증가된 발병률은 다양한 중요한 전신 질환, 예컨대 심혈관 질환, 당뇨병 및 류마티스 관절염과 관련이 있음이 밝혀졌다. 나이와 함께 증가된 발병률을 나타낸다.
질병 진행의 일부로서, 치주 박테리아가 치은하 플라크 생물막을 형성하는 능력 및 구강 상피 세포와의 상호작용을 통해 선천성 면역을 자극하는 능력은 병인의 핵심으로 간주된다. 치주 병원균인 탄네렐라 포시티아(Tannerella forsythia), T. 덴티콜라(T. denticola) 및 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)의 병원균 시알리다제는 이 과정에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 시알리다제 저해는 치주염에 대한 가능한 치료 또는 예방을 나타낸다. 관련 효소는 인플루엔자 바이러스의 주요 독성 인자로서 존재한다(즉, H1N1에서 N은 TamiFlu의 표적인 뉴라미니다제를 나타냄).
본 연구의 목적은 치주 박테리아 및 이의 정제된 시알리다제의 시알리다제 활성을 저해하는 4-하이드록시메틸-N-메틸-L-프롤린의 능력 및 또한 그 화합물을 함유하는 추출물(예를 들어, 지자이푸스 열매)의 효과를 조사하는 것이었다. 또한, 구강내 병원균 생존 및 증식에 중요한 것으로 간주되고 있으므로, 생물막 형성 및 숙주-박테리아 결합의 시험관내 모델에 대한 예비 연구를 수행하여 화합물 및 추출물이 치주 병원체의 독성에 미치는 영향을 평가했다.
이러한 검정의 효과는 또한 보다 일반적으로 시알리다제 활성이 연루된 다른 질환 상태의 예방 또는 치료에 대한 가능한 연관성에 의해, 인간 미생물군집에 대한 화합물 및 추출물의 영향을 나타낼 수도 있다.
시알리다제 활성 검정
이 검정에서는 형광 기질인 메틸움벨리페릴-N-아세틸뉴라민산(MUNANA)을 사용하였고, 이는 시알리다제의 작용을 통해 절단되어 N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac) 및 메틸움벨리페론(MU)을 방출하고, 후자는 350㎚에서 여기 시에 450㎚에서 최대 형광을 나타낸다. MU 방출은 시알리다제 활성을 정량화하는 데 사용될 수 있다.
전체 박테리아 또는 정제된 시알리다제가 화합물 1(실시예 3) 또는 1%의 N-메틸-프롤린을 함유하는 지자이푸스 열매 50% 수성 에탄올 추출물의 존재 또는 부재 하에 MUNANA에 노출되었다.
1mM 저해제(또는 저해제 없이 물) 및 2.5nM 시알리다제(T. 포시티아의 NanH 포함)를 0.1mM MUNANA, pH 7.2 20mM 인산나트륨 완충액의 존재하에 항온처리하였다. 반응은 pH 10.5 60mM 탄산나트륨 완충액의 첨가를 통해 30초 및 60초에 정지시켰다. 형광성 MU의 방출은 350㎚ 여기, 450㎚에서 형광 방출을 측정하여 정량했다. 시알리다제 활성의 백분율은 30초와 60초 사이의 형광 변화를 저해제가 없는 반응의 변화와 비교하여 나타냈다. 반응은 3반복으로 수행했다.
다양한 화합물과 시판되는 시알리다제(뉴라미니다제) 저해제인 자나미비르(Zanamivir)(독감 치료제로서 약제학적 제제 "RelenzaTM"로 판매됨)를 사용하여 N1Neu 저해의 초기 스크리닝을 수행했다.
Neu1 활성에 대한 화합물 및 식물 추출물의 초기 스크리닝
시알리다제 검정을 수행하였고, 반응은 0.1mM MUNANA, pH 7.4 50mM Tris, 5mM CaCl2, 200mM NaCl, 식물 추출물 또는 표시된 농도의 대조용 시알리다제 저해제 자나미비르를 함유하거나, 추정되는 저해제가 없었다. N1Neu는 반응물에 0.025㎍/㎖로 존재했다. 이 반응물 50㎕를 100㎕의 100mM 탄산나트륨 완충액(pH 10.5)을 사용하여 5분 및 10분째에 퀀칭시켰다. 10분 시점은 시알리다제 활성을 평가하는 데 사용하였다. 표시된 데이터는 각 조건이 3반복으로 반복되는 한 실험의 평균을 나타낸다. 퀀칭된 반응에 존재하는 MU는 TECAN M200 Infinite 마이크로플레이트 리더를 사용하여 여기 340㎚ 방출 430㎚에서 정량했고, 저해제가 없는 조건에 상대적인 시알리다제 활성(MU 형광)의 백분율로서 표현하였다.
숙주 세포 결합
생물막을 형성하고 점막 표면에 존재하는 것 외에도, 박테리아는 숙주 세포와 결합(부착 및 침입)할 수 있다. 이것은 항미생물 요법, 면역계 또는 생물막의 기계적 제거에 직면하여 지속성, 및 숙주 세포 내의 영양소에 대한 접근을 포함하여, 박테리아에 대한 몇 가지 이점을 갖고 있다. 숙주 세포와 박테리아의 결합은 또한 면역 조절에 영향을 미치며, 즉, 증가된 세포 침입은 염증의 상향조절을 야기할 수 있고 치주 질환에 기여할 수 있다. 시알리다제(및 기타 생성물)는 숙주 세포와 P. 진지발리스 및 T. 포시티아 결합 동안 중요하다.
P. 진지발리스 및 T. 포시티아에 의한 숙주 세포의 부착 및 침입 저해를 시험하기 위해 항생제 보호 검정을 사용하였다. 여기에는 두 세트의 숙주 세포 단층을 성장시킨 다음, 1:100 숙주 세포:박테리아 비율(감염 다중도)의 박테리아로 감염시키는 것을 수반했다. 1.5 시간 동안 항온처리한 후, 한 세트는 용해시키고 박테리아를 한천에 플레이팅하여 생존 박테리아의 수를 수득했고; 이것은 결합된 총 박테리아 수를 제공한다. 감염된 단층의 두 번째 세트는, 임의의 외부(부착된) 박테리아를 죽이고 침입된(내재화된) 박테리아만을 남기는 항생제인 메트로니다졸을 이용하여 1시간 동안 항온처리하였고, 그 다음 세포를 용해시키고, 전술한 바와 같이 한천 위에 플레이팅하고, 결합된 총 수로부터 침입된 박테리아의 수를 빼서 부착된(외부) 박테리아를 수득했다.
생물막 검정
치주 병원체는 구강에서 생물막(플라크의 일부로서)으로 존재하며, 정상적인 구강 위생 방법과 치주염 치료는 모두 생물막을 파괴하는 것이다. 따라서, 임의의 잠재적인 치료제 또는 예방제는 또한 단일 또는 혼합 종 생물막으로서 시험관내에서 모델링될 수 있는 치주 병원체 생물막을 파괴할 수 있어야 한다. 식물 추출물과 화합물의 효과는 직접 항미생물성인 것이 아니라, 숙주 당단백질에 대한 부착을 방지하거나 당단백질로부터 영양소 획득을 방지하는 작용을 할 수 있으므로, 다양한 서로 다른 접근법을 사용했다. 이들은 P. 진지발리스 및 T. 포시티아는 영양소 풍부 배지(트립신 소이 브로스-TSB)에서 혈청(소 태아 혈청-FBS) 코팅된 표면에서 배양하고, P.진지발리스는 탄소 및 질소원으로서 혈청(10% v/v FBS)만을 함유하는 영양소 결핍 배지에서 배양하는 것을 수반했다. 시알리다제 저해제로서 명백한 활성을 감안하여, 지자이푸스의 추출물을 생물막 형성 방지 능력에 대해 시험하였다.
생물막 형성을 정량하기 위해 2가지 접근법인, 처리량은 높지만 감도가 낮은 크리스탈 바이올렛 염색 및 크리스탈 바이올렛 염색보다 감도는 높지만 처리량은 낮은 직접 박테리아 계수를 사용했다. 크리스탈 바이올렛 염색은 또한 정성적 관찰을 위해 생물막을 이미지화하는 데 사용할 수 있다.
P. 진지발리스 및 T. 포시티아는 1500 ㎍/㎖ 지자이푸스 추출물의 존재 또는 부재하에 FBS로 사전코팅된 마이크로타이터 플레이트에서 각각 2일 및 5일 동안 보충된 TSB에서 배양하였다. 이 실험 세트의 경우, 박테리아 계수는 생물막 형성의 정량을 가능하게 하는 반면, 크리스탈 바이올렛 염색은 생물막의 가시화를 허용했다. 이러한 조건에서, P. 진지발리스 생물막 형성은 크게 저해되지 않았다. T. 포시티아 생물막 형성은 저해제가 없는 대조군에서 2.2×107 박테리아/㎖로부터 1.0×107로 모든 조건에서 적어도 2배 감소했다.
생물막 저해 검정 - 풍부 배지에서 P. 진지발리스 + F. 뉴클레아텀(25586) 혼합 종 생물막
혈청 코팅된 표면에서 TSB에서 배양된 T. 포시티아 및 P. 진지발리스에 대한 지자이푸스 추출물의 효과
P. 진지발리스 또는 T. 포시티아를 FBS로 사전코팅된(100% FBS 50㎕ 첨가 및 4℃에서 밤새 항온처리된 다음, PBS로 한 번 세척하여 미결합된 혈청을 제거함) 96웰 폴리리신 코팅된 조직 배양판의 웰에 있는, 0.1% w/v 효모 추출물, 5 ㎍/㎖ 헤민(hemin), 1 ㎍/㎖ 메나디온(menadione) 및 50 ㎍/㎖ 젠타마이신을 함유하는 TSB에 0.05의 OD600으로 접종했다. 두 종은 37℃에서 T. 포시티아는 5일 동안, P. 진지발리스는 48시간 동안 혐기적으로 항온처리했다. 상청액을 제거하고, 웰은 PBS로 2회 세척했다. 생물막은 희석 전에 PBS에 강력하게 재현탁시켰고(적절한 경우), 헬버(helber) 챔버 및 위상차 현미경을 400x 배율로 사용하여 계수했다.
이미지화를 위한 웰은 크리스탈 바이올렛에 의해 염색했다; 상청액을 제거하고 웰을 0.1% (w/v) 크리스탈 바이올렛과 함께 실온에서 15분 동안 항온처리했다. 염색을 제거하고 PBS를 사용하여 웰을 3회 세척했다. 생물막은 도립 현미경 및 이미지화 소프트웨어를 사용하여 400× 배율로 이미지화했다. 이미지 캡처 매개변수(광 강도 및 노출 시간)는 각 이미지에 대해 일정했다. 제시된 데이터는 각 조건이 실험마다 3번 반복된 3회 실험의 평균을 나타낸다.
생물막 형성에 대한 지자이푸스 추출물의 상이한 효과에 대한 가능한 설명은이러한 두 유기체의 영양소 요구사항의 차이이다. T. 포시티아는 P. 진지발리스보다 더 까다로운 성장 요구사항을 가지고 있다. 예를 들어, T. 포시티아는 일반적으로 생물막 형성 동안 시알산으로 치환될 수 있고(이 실험에서 이 공급원은 FBS에 의해 제공됨), 이것이 시알리다제 저해에 의해 파괴될 수 있을지라도 N-아세틸뉴라민산(NAM)의 외인성 공급원을 필요로 하는 반면, P. 진지발리스는 특히 시알리다제 저해의 존재 하에도, 보충된 TSB 배양 배지로부터 영양소 요구사항을 수득할 수 있을 것이다. 따라서, 탄소 및 질소 공급원으로서 혈청(FBS)만을 함유하는 합성 배지도 생물막 형성에 대한 지자이푸스 추출물의 효과를 평가하는 데 사용되었다.
생물막 저해 검정 - 합성 배지에서 P. 진지발리스
T. 포시티아는 P. 진지발리스보다 까다로우며, 합성 배지를 사용하여 단일 종 생물막으로서 배양하려는 노력은 실패했다. 따라서, 우리는 합성 배지에서 배양된 P. 진지발리스에 대해 지자이푸스 추출물만을 시험했다. P. 진지발리스는 FBS로 사전코팅된(100% FBS 50㎕ 첨가 및 4℃에서 밤새 항온처리된 다음, PBS로 한 번 세척하여 미결합된 혈청을 제거함) 96웰 폴리리신 코팅된 조직 배양판의 웰에 있는, 10% v/v FBS, 5 ㎍/㎖ 헤민, 및 50 ㎍/㎖ 젠타마이신이 추가로 보충된 합성 배지에 0.05의 OD600으로 접종했다. P. 진지발리스는 37℃에서 5일 동안 혐기적으로 항온처리했다.
상청액을 제거하고 웰을 0.1% (w/v) 크리스탈 바이올렛과 함께 실온에서 15 분 동안 항온처리했다. 염색을 제거하고 웰을 수류에 의해 세척했다. A) 크리스탈 바이올렛의 정량 - 크리스탈 바이올렛은 에탄올:아세톤(80:20)을 사용하여 생물막으로부터 새로운 96웰 마이크로타이터 플레이트 내로 추출했고, 590㎚에서 흡광도를 측정하여 정량했다.
결과
제시된 데이터는 2회 실험의 평균을 나타내고, 각 조건은 실험마다 10회 반복하였다.
N1 Neu 시알리다제 저해
지자이푸스는 N1Neu 활성을 100%에서 34%로 감소시킬 수 있었다(p=<0.05).
Figure pct00022
T. 포시티아 균질물의 시알리다제 활성
Figure pct00023
주: 1mM의 화합물 1은 T. 포시티아 유래 NanH을 50% 저해했다(실시예 3).
P. 진지발리스 균질물의 시알리다제 활성
Figure pct00024
숙주 세포 결합: T. 포시티아의 생존력 %를 나타내는 항생제 방어 검정
Figure pct00025
생물막 저해 검정 - 풍부 배지 중의 P. 진지발리스 + F. 뉴클레아텀
Figure pct00026
지자이푸스 1500㎍/㎖는 저해제가 없는 경우에 비해 생물막 형성의 감소를 보여주었다.
합성 배지에서 생물막 저해 검정
Figure pct00027
주: 풍부 배지에서는 P. 진지발리스 생물막에 대한 효과가 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 명백하지 않았다.
논의
화합물 1(실시예 3) 및 1% 4-하이드록시메틸-N-메틸-L-프롤린 1 내지 3을 갖는 지자이푸스 추출물은 탄네렐라 포시티아의 시알리다제를 저해했다. 지자이푸스 추출물은 직접 항미생물 효과가 있는 것으로 나타나지 않았지만, 높은 당 함량에도 불구하고 영양소 획득의 방지, 또는 혈청 코팅된 표면에 대한 부착 제한을 통해 생물막 형성을 저해할 수 있다. TSB에서 P. 진지발리스 생물막 형성은 식물 추출물에 의해 현저히 저해되지 않았지만, 합성 배지(혈청-FBS가 유일한 탄소 및 질소 공급원인 경우)에서 배양된 경우에는 저해되었다.
이것은 화합물 1 내지 3을 함유하는 추출물이 P. 진지발리스 단백질 이화작용을 제한할 수 있는 시알리다제 및 가능한 다른 효소의 저해를 통해 P. 진지발리스에 의한 영양소 획득을 방지하고 있음을 시사한다. 이것은 혈청으로부터 영양소 획득에 특히 유해할 것이며, 단백질 공급원[대두 밀(meal)]이 이미 효소 분해 처리된 TSB로부터의 영양소 획득에는 덜 유해할 것이다. 논쟁의 여지가 있지만, 합성 배지는 P. 진지발리스가 치은구액(GCF, 혈청과 조성이 유사)에 있는 숙주 당단백질, 및 혈액 및 타액에 있는 다른 당단백질의 이화작용을 통해 영양소를 획득하는, 생체내 상황을 더욱 잘 대표한다.
T. 포시티아는 P. 진지발리스보다 더 까다로우며, 합성 배지를 사용하여 단일 종 생물막으로서 배양하려는 노력은 지금까지 성공하지 못했다. 그러나, TSB 중 혈청 코팅 표면에서는 생물막을 형성할 수 있었다. 이 일련의 실험에서 지자이푸스 추출물은 T. 포시티아 생물막 형성을 저해하는 것으로 나타났다.
이러한 발견은 또한 본 발명의 화합물이 박테리아 질염 및 조산과 관련된 종인 가드너렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)를 포함하는 다른 박테리아 시알리다제의 저해를 기반으로 하여 다양한 치료요법적 치료에 적용성이 있을 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 6: 지자이푸스 주주바 열매 50% 수성 에탄올 추출물 마우스 연구
지자이푸스 주주바 열매 추출물은 50% 수성 에탄올에 제조하고 건조시켰다. 추출물의 기체 크로마토그래피 - 질량 분광법(GCMS)에 의한 분석은 높은 단당류 당 함량(>5%) 및 1%의 화합물 1 내지 3의 존재를 나타냈다. Z. 스피나-크리스티 추출물의 추출물에 대한 이전 연구는 말토스 및 수크로스 부하 시험에서 수컷 ddy 마우스를 대상으로 수행하였다(실시예 2).
이 연구에서 수컷 C57BL/6J 마우스를 포도당, 말토스 및 수크로스 부하 시험에 사용했다.
방법
동물 실험 프로토콜은 도야마 대학 동물 실험위원회의 승인을 받았다. 동물을 밤새 금식시켰다. 포도당(2.5 g/㎏ 체중) 또는 수크로스(2.5 g/㎏ 체중) 뿐만 아니라 추출물은 0.9% NaCl 용액에 용해시키고 위관을 통해 마우스에 투여하였다. 대조군에는 식염수만을 부하했다. 포도당 측정을 위한 혈액 샘플은 당 부하 후 0, 15, 30, 60 및 120분에 꼬리 정맥으로부터 수득했다. 혈당 수치는 휴대용 키트인 Antsence II™(Sankyo Co. Ltd, 일본 도쿄)로 측정했다. 시험은 아래와 같다.
· 포도당 부하 시험 1000 ㎎/㎏ 체중(도 2, 표 1)
· 포도당 부하 시험 500 ㎎/㎏ 체중(도 3, 표 2)
· 수크로스 부하 시험 1000 ㎎/㎏ 체중(도 4, 표 3)
· 말토스 부하 시험 500 ㎎/㎏ 체중(도 5, 표 4)
결과
도 2는 지자이푸스 추출물이 혈당 수치에 미치는 영향을 보여준다. 지자이푸스 추출물(각각 1000 ㎎/㎏ 체중) 추출물(백색 원)과 함께 2.5 g/㎏체중의 포도당을 경구 부하한 후 수컷 C57BL/6J 마우스의 혈당 농도. 대조군에는 식염수(흑색 원)가 부하되었다. 각 값은 평균±SEM(n=5)을 나타낸다.
도 3은 지자이푸스 추출물이 혈당 수치에 미치는 영향을 보여준다. 지자이푸스 추출물(각각 500 ㎎/㎏ 체중) 추출물(백색 원)과 함께 2.5 g/㎏체중의 포도당을 경구 부하한 후 수컷 C57BL/6J 마우스의 혈당 농도. 대조군에는 식염수(흑색 원)가 부하되었다. 각 값은 평균±SEM(n=5)을 나타낸다.
도 4는 지자이푸스 추출물이 혈당 수치에 미치는 영향을 보여준다. 지자이푸스 추출물(각각 1000 ㎎/㎏ 체중) 추출물(백색 원)과 함께 2.5 g/㎏체중의 수크로스를 경구 부하한 후 수컷 C57BL/6J 마우스의 혈당 농도. 대조군에는 식염수(흑색 원)가 부하되었다. 각 값은 평균±SEM(n=5)을 나타낸다.
도 5는 지자이푸스 추출물이 혈당 수치에 미치는 영향을 보여준다. 지자이푸스 추출물(각각 500 ㎎/㎏ 체중) 추출물(백색 원)과 함께 2.5 g/㎏체중의 말토스를 경구 부하한 후 수컷 C57BL/6J 마우스의 혈당 농도. 대조군에는 식염수(흑색 원)가 부하되었다. 각 값은 평균±SEM(n=5)을 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00028
[표 2]
Figure pct00029
[표 3]
Figure pct00030
[표 4]
Figure pct00031
결론
추가 단당류를 함유한 지자이푸스 주주바 열매 추출물은 포도당 및 수크로스 공격 시험 모두에서 혈당을 억제했다. 말토스 또는 수크로스 부하 조건에 대한 효과는 추출물이 유의적인 글루코시다제 저해를 나타내지 않았다는 점을 제외하고는 말타아제 또는 수크라아제 저해에 의해 생성된 것일 수 있다. 포도당 부하 시험 결과는 글루코시다제 저해와는 독립적인 상이한 메커니즘 및 아마도 인슐린 방출 또는 기타 메커니즘에 대한 영향을 시사한다.
등가물
전술한 설명은 본 발명의 현재 바람직한 실시형태를 상세히 설명한다. 이들 설명을 고려할 때, 본 기술분야의 기술자에게는 그의 실시에서 수많은 수정 및 변경이 발생하는 것이 예상된다. 이러한 수정 및 변경은 여기에 첨부된 청구범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (43)

  1. 다음으로부터 선택되는 단리된 4-하이드록시메틸-프롤린 또는 이의 약제학적 허용성 염 또는 유도체를 포함하는, 조성물:
    Figure pct00032

    식 중, R은 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, C1-6 알케닐 또는 C1-6 알키닐을 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 4-하이드록시메틸-프롤린이 하기 화합물 또는 이의 약제학적 허용성 염 또는 유도체로부터 선택되는, 조성물:
    Figure pct00033
    .
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단리된 4-하이드록시메틸-프롤린이 합성이거나, 또는 (a) 지자이푸스(Zizyphus) 속의 식물; 및 (b) 파울리니아(Paullinia) 속의 식물로부터 선택되는 식물 공급원으로부터 정제되는, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, (a) 상기 식물 공급원이 Z. 주주바(Z. jujuba), Z. 스피나-크리스티(Z. spina-christi), Z. 로투스(Z. lotus), Z. 모리티아나(Z. mauritiana) 및 Z. 조아제이로(Z. joazeiro)로부터 선택되는 식물 종에서 선택되고; 또는 (b) 상기 식물 공급원이 식물 종 파울리니아 쿠파나(Paullinia cupana)로부터 선택되는, 조성물.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 공급원이 열매, 열매 부분, 열매 추출물, 열매즙, 종자, 나무껍질, 뿌리 및/또는 잎을 포함하는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물 및 약제학적 허용성 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, (a) 약제학적 팩, 키트 또는 환자 팩 형태; 또는 (b) 단위 투여 형태인, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 에너지 이용 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 에너지 이용 질환이 (a) 항상성 장애; (b) 대사 질환; (c) 당 대사의 기능장애; (d) 식욕 장애; (e) 인슐린 저항성; (f) 당뇨병(예를 들어, 1형 또는 2형 당뇨병); (g) 당뇨병전증; (h) 대사 증후군; (i) 비만; (j) 소모성 증후군(예를 들어, 암 관련 악액질); (k) 근병증; (l) 위장 질환; (m) 성장 지연; (n) 고콜레스테롤혈증; (o) 죽상경화증; (p) 노화 관련 대사 기능장애; (q) 고혈당증; (r) 포도당 불내성; (s) 고인슐린혈증; (t) 포도당뇨; (u) 대사성 산증; (v) 백내장; (w) 당뇨병성 신경병증; (x) 당뇨병성 신병증; (y) 당뇨병성 망막증; (z) 황반 변성; (aa) 사구체경화증; (bb) 당뇨병성 심근병증; (cc) 손상된 포도당 대사; (dd) 관절염; (ee) 고혈압; (ff) 고지혈증; (gg) 골다공증; (hh) 골감소증; (ii) 골 손실; (jj) 부서지기 쉬운 뼈 증후군; (kk) 급성 관상동맥 증후군; (ll) 불임; (mm) 단장 증후군; (nn) 만성 피로; (oo) 섭식 장애; (pp) 장 운동성 기능장애; (qq) 당 대사 기능장애; (rr) 지방간; (ss) 다낭성 난소 증후군; (tt) 혈색소 침착증; 및 (uu) 흑색극세포증으로부터 선택되는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 염증성 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 염증성 장애가 (a) 비-국재성 염증성 장애[예를 들어, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 경피증 및 과민증]; (b) 만성 전립선염; (c) 사구체신염; (d) 염증성 장 질환; (e) 골반 염증성 질환; (f) 재관류 손상; (g) 류마티스 관절염; (h) 이식 거부; (i) 혈관염; (j) 천식; (k) 여드름; (l) 골관절염; (m) 구강, 점막 또는 위장 염증; (n) 안구 염증; (o) 비염; (p) 귀 염증; (q) 스테로이드 반응성 염증성 장애; (r) 피부 염증성 질환(예를 들어, 광선 각화증, 심상성 여드름, 여드름 면포, 주사성 여드름, 결절낭 여드름, 알레르기성 접촉 피부염, 혈관부종, 수포성 유사천포창, 피부 약물 반응, 다형성 홍반, 낭창성 홍반증, 광피부염, 건선성 관절염, 경피증 및 두드러기, 건선, 피부염, 아토피성 피부염, 경피증, 스테로이드-반응성 피부 염증 장애, 요독 가려움증, 및 방사선, 화학요법 및 환경 자극제에 대한 노출과 관련된 피부 상태); (s) 염증성 자가면역 질환[예를 들어, 강직성 척추염, 크론병, 궤양성 대장염, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 운동 뉴런 질환, 파킨슨병, 만성 피로 증후군, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 애디슨 병, 굿파스처(Goodpasture) 증후군, IgA 신병증, 간질성 신염, 쇼그렌 증후군 및 자가면역 췌장염]; (t) 골관절염; (u) 치주 질환; (v) 당뇨병성 신병증; (w) 만성 폐쇄성 폐 질환; (x) 죽상동맥경화증; (y) 이식편 대 숙주 질환; (z) 만성 골반 염증성 질환; (a') 자궁내막증; (b') 만성 간염; (c') 결핵 및 (d') 피부 염증, 예를 들어, 햇빛, 알레르기유발제, 자극제, 또는 화상에 대한 노출에 의해 유발된 염증으로부터 선택되는, 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 염증 장애가 자가면역 질환, 천식 또는 알레르기인, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 그레이브 병; 류마티스 관절염; 하시모토 갑상선염; 백반증; 당뇨병(예를 들어, I형 당뇨병 또는 II형 당뇨병); 악성 빈혈; 다발성 경화증; 사구체 신염; 전신성 루푸스 E(SLE, 루푸스); 쇼그렌 증후군; 경피증; 건선; 강직성 척추염; 중증 근무력증; 천포창; 다발근염; 피부염; 포도막염; 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군; 크론(Crohn) 병; 궤양성 대장염 및 염증성 장 질환(IBD)으로부터 선택되는, 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 염증성 질환이 이식편 대 숙주 질환; 유육종증; 파종성 혈관내 응고, 죽상경화증, 가와사키 병리를 포함하는 혈관 염증성 질환; 혈관염; 쇼그렌 증후군; 건선 관절염; 장병성 관절염; 반응성 관절염 및 염증성 장 질환과 관련된 관절염으로부터 선택되는, 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 상기 알레르기가 아토피 알레르기, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 아토피성 피부염, 과호산구증가증, 과민성 대장 증후군, 알레르기 유발성 편두통, 박테리아 알레르기, 기관지 알레르기(천식), 접촉 알레르기(피부염), 지연 알레르기, 꽃가루 알레르기(건초열), 약물 알레르기, 쏘임 알레르기, 물림 알레르기, 위장 알레르기; 음식 알레르기; 및 물리적 알레르기, 예를 들어, 저온 두드러기, 혈관부종, 콜린성 두드러기 및 감광성으로부터 선택되는, 조성물.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 신생물형성을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 신생물형성이 양성, 전암성 및 악성 신생물형성, 과형성, 화생 및 이형성으로부터 선택되는, 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 상기 신생물형성이 악성 신생물형성(암)인, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 악성 신생물형성이 (a) 암종; (b) 모세포종; (c) 백혈병; (d) 림프종; (e) 골수종; (f) 육종 및 (g) 혼합형 암으로부터 선택되는, 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 악성 신생물형성이 방광, 유방(예를 들어, 원발성 유방암, 결절 음성 유방암, 유방의 침습성 관 선암종 및 비-자궁내막유사 유방암), 결장(예를 들어, 결장 선암종 및 결장 선종과 같은 결장직장 암), 신장, 표피(예를 들어, 악성 흑색종), 간, 폐(예를 들어, 선암종, 부신피질, 비인두, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암종), 식도, 담낭, 난소, 췌장(예를 들어, 외분비 췌장 암종), 위, 자궁경부, 갑상선, 전립선, 위장계(예를 들어, 위장 기질 종양) 또는 피부(예를 들어, 편평 세포 암종)의 암종으로부터 선택되는 암종인, 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 상기 악성 신생물형성이 림프성 백혈병, 예를 들어, 전구 세포 백혈병, 성숙 B 세포 백혈병, 성숙 T 세포 백혈병 및 NK 세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 질환 및 골수형성이상 증후군으로부터 선택되는 백혈병인, 조성물.
  23. 제20항에 있어서, 상기 악성 신생물형성이 (a) 호지킨 림프종; (b) 비호지킨 림프종, 예를 들어, 전구 세포 림프종, 성숙 B 세포 림프종, 성숙 T 세포 림프종 및 NK 세포 림프종; (c) 버킷 림프종 및 (d) 림프세망 신생물, 예를 들어, 외투 세포 림프종으로부터 선택되는 림프종인, 조성물.
  24. 제20항에 있어서, 상기 악성 신생물형성이 골육종; 연골육종; 평활근육종; 횡문근육종; 중피종; 섬유육종; 혈관육종 또는 혈관내피종; 지방육종; 신경교종; 성상세포종; 점액육종 및 중간엽 및 혼합 중배엽 종양으로부터 선택되는 육종인, 조성물.
  25. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 또는 바이러스 감염을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 방법이 생체내 공생 및/또는 병원성 박테리아 성장을 저해하는 것을 포함하는, 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 상기 방법이 숙주-박테리아 세포 상호작용을 파괴하고, 및/또는 포유류(예를 들어, 인간) 숙주에서 박테리아 생물막 형성을 저해 또는 제거하는 것을 포함하는, 조성물.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 방법이 박테리아 생물막(예를 들어, 치 은하 플라크 생물막 및 점막 생물막)의 존재를 매개하거나 특징으로 하는 질환 및 장애의 치료 또는 예방을 포함하는, 조성물.
  29. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 치주 질환, 박테리아 질염 및/또는 탄네렐라 포시티아(Tannerella forsythia), 탄네렐라 덴티콜라(Tannerella denticola), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 또는 가드너렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)에 의한 감염으로 유발된 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  30. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 죽종형성, 예를 들어, 죽상동맥경화증을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  31. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 숙주에서 공생 박테리아 성장을 조절하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 방법이 포유류, 예를 들어, 인간, 숙주에서 공생 박테리아의 상기 조성물 조절을 포함하는, 조성물.
  33. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류, 예를 들어, 인간, 대상체에서 혈당을 조절하는 방법에 사용되는, 조성물.
  34. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 제9항 내지 제33항 중 어느 한 항에 정의된 방법.
  35. 질환 치료용 약제의 제조를 위한 또는 제9항 내지 제33항 중 어느 한 항에 정의된 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물의 용도.
  36. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물을 포함하고, 선택적으로 미용, 기능식품용 또는 약제학적 허용성 부형제 또는 담체를 더 포함하는 미용, 기능식품, 생약 또는 약제학적 조성물.
  37. 제1항 내지 제8항 또는 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물을 대상체에게, 예를 들어, 피부에 국소 적용함으로써 투여하는 것을 포함하는 피부의 부종 또는 홍반을 감소시키기 위한 미용 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 4-하이드록시메틸-프롤린이 적어도 0.5%, 1% w/w, 5% w/w, 10% w/w; 15% w/w; 20% w/w; 25% w/w; 30% w/w; 35% w/w; 40% w/w; 45% w/w; 50% w/w, 60% w/w, 70% w/w, 80% w/w, 90% w/w, 99% w/w(건조 중량 기준)의 수준으로 조성물에 존재하는 조성물, 사용하기 위한 조성물, 방법 또는 용도.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물의 제조 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계:
    (a) 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 식물 공급원으로부터 식물 재료를 제공하는 단계;
    (b) 상기 식물 재료로부터 제1항에 정의된 바와 같은 4-하이드록시메틸-프롤린을 추출하는 단계; 및 이어서
    (c) 상기 추출된 4-하이드록시메틸-프롤린을 약제학적 허용성 부형제와 함께 제형화하여 약제학적 조성물을 제조하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  40. 약제학적 조성물, 생약 또는 기능식품을 제조하는 방법으로서, 상기 약제학적 조성물, 생약 또는 기능식품의 샘플에서 제1항에 정의된 바와 같은 4-하이드록시메틸-프롤린의 존재 또는 부재를 검출하거나, 또는 그 양을 측정함으로써 상기 약제학적 조성물, 생약 또는 기능식품의 품질을 모니터링하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 약제학적 조성물, 생약 또는 기능식품의 품질을 모니터링하는 방법으로서,
    (a) 상기 약제학적 조성물, 생약 또는 기능식품의 샘플을 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 샘플에서 제1항에 정의된 바와 같은 4-하이드록시메틸-프롤린의 존재 또는 부재를 검출하거나, 또는 그 양을 측정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  42. 보충 식품 또는 음료를 제조하는 방법으로서, (a) 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 정의된 조성물을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 조성물을 식품 또는 음료에 첨가하여 보충 식품 또는 음료를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 제3항 또는 제4항에 정의된 바와 같은 식물의 육성 계통 및/또는 변종을 선택하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계:
    (a) 제3항 또는 제4항에 정의된 식물로부터 유래되는, 제5항에 정의된 식물 부분과 같은 재료를 제공하는 단계; 및
    (b) 단계 (a)의 재료에서 제1항 또는 제2항에 정의된 4-하이드록시메틸-프롤린의 존재 또는 부재를 결정하고 그리고/또는 그 양을 측정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
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