KR102044232B1 - 갈색거저리 성충으로부터 BACE-1 또는 AChE에 대한 저해활성을 갖는 화합물을 분리하는 방법 - Google Patents

갈색거저리 성충으로부터 BACE-1 또는 AChE에 대한 저해활성을 갖는 화합물을 분리하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 갈색거저리 성충으로부터 BACE-1 또는 AChE에 대한 저해활성을 갖는 화합물을 분리하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 알츠하이머의 예방, 개선 또는 치료에 이용 가능한 BACE-1 또는 AChE에 대한 저해활성을 갖는 화합물을 분리하는 방법에 관한 것이다.
갈색거저리 에탄올 추출물로부터 분리한 본 발명의 화합물은 알츠하이머병 및 치매 등 퇴행성 뇌질환의 원인이 되는 아밀로이드 베타의 생성 및 축적을 유발하는 효소 BACE-1에 대한 저해활성이 우수하고, 기억 및 학습에 중요한 역할을 하는 아세틸콜린을 분해하는 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase)에 대한 저해활성도 우수하여, 본 발명의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 퇴행성 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학적 조성물 및 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

갈색거저리 성충으로부터 BACE-1 또는 AChE에 대한 저해활성을 갖는 화합물을 분리하는 방법 {Isolating Method for Compounds having BACE-1 or AChE Inhibiting Ability from Adults of Tenebrio molitor}
본 발명은 갈색거저리 성충으로부터 BACE-1 또는 AChE에 대한 저해활성을 갖는 화합물을 분리하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 알츠하이머의 예방, 개선 또는 치료에 이용 가능한 BACE-1 또는 AChE에 대한 저해활성을 갖는 화합물을 분리하는 방법에 관한 것이다.
알츠하이머병(Alzhimer's disease)은 치매를 일으키는 가장 일반적인 퇴행성 뇌질환으로, 진행형 신경 퇴행성 질환 증상으로 뉴런 손실 및 인지 장애가 있다. 알츠하이머병은 세포외 베타아밀로이드(β-amyloid: Aβ) 플라크(plaque) 및 세포 내 신경섬유 엉킴의 신경 병리학적 특징을 나타낸다.
베타아밀로이드를 생성하는 아밀로이드 전구체 단백질 (amyloid precusor protein: APP)의 내부 단백질 분해 절단은 베타세크레타제(β-secretase) 및 감마세크레타제(γ-secretase)의 두 가지 프로테아제의 연속적인 작용을 포함하고 있는데, 베타세크레타제는 큰 수용성 세포 외 단편(soluble APPβ)을 유리시키는 APP의 β 절단에 의해 베타아밀로이드 생산의 첫 단계를 중재한다. APP(APP-CTF, C99)의 C 말단 단편(carboxyl terminal fragment: CTF)은 몇 가지 위치에서 감마세크레타제에 의해 절단되어 병원성 종 Aβ42 및 Aβ40이 생성되는 것으로 알려져 있다.
또한, 이러한 베타아밀로이드는 BACE-1(beta-site APP-cleaving enzyme 1, beta-secretase-1) 및 프리시닐린/감마세크레타제(presenilin/γ-secretase)에 의해 매개되는, APP의 연속 분열에 의해 생성되며, 베타아밀로이드의 생성 및 응집은 신경퇴화, 신경섬유의 엉킴 현상, 염증 및 뉴런의 손실을 일으키는 복잡한 병리학적 유발을 촉발시키는 중요한 역할을 한다.
또한, 최근 연구 결과에 의하면 BACE-1 녹아웃 생쥐가 명백한 부작용 없이 베타아밀로이드 생산의 완전한 부재를 나타내고 있다는 내용이 보고되면서, BACE-1의 억제는 알츠하이머병의 치료를 위한 새로운 치료제 개발을 위한 타겟이 되고 있다.
나아가, 알츠하이머병의 특징적인 병변으로, 뇌 조직 중에 베타아밀로이드가 포함된 아밀로이드 플라크 및 신경섬유 엉킴의 형성과 함께 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine)의 양이 감소됨으로써 기억력 및 인지기능의 감퇴증상이 나타나는 것으로 보고되고 있다. 현대 의학의 관점은 대부분 뇌 콜린성 신경세포의 광범위한 변성 및 소실을 인지기능 감퇴의 가장 주요한 원인으로 간주하고 있으며, 이를 극복하기 위한 방편으로 손상되지 않고 남아있는 콜린성 신경계의 활성을 증가시켜 손상된 인지기능을 부분적으로 회복시키는 연구가 주종을 이루고 있다.
이에, 알츠하이머병과 같은 퇴행성 뇌질환의 치료제로서, 아세틸콜린 생성촉진제, 아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase, AChE) 저해제, 무스카린성 아세틸콜린 수용체(muscarine acetylcholine receptor)에 대한 효능제(agonist) 등 여러 가지 기전에 따라 아세틸콜린성 신경세포의 기능을 강화시켜줄 수 있는 약물들이 개발되고 있다.
특히 현재 퇴행성 뇌질환은 고령층 인구의 폭발적인 증가세로 환자수가 지속적으로 급증하고 있고 건강을 더욱 중요시 여기는 사회풍조에 의해 퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 및 치료하기 위한 더욱 효과적인 제제(건강기능성 식품 소재 포함)의 개발 수요가 어느 때보다 높은 시점이다.
그러나 아직까지 체내 부작용을 초래하지 않으면서 퇴행성 뇌질환을 효과적으로 치료할 수 있는 신약이 개발되지 못하고 있는 실정이다.
한편, 곤충은 전 세계적으로 인간의 질병을 예방 또는 치료하기 위한 의약품 및 식품으로 이용되고 있는데, 곤충에는 단백질과 필수아미노산, 철 및 비타민 등이 풍부하고 지방이 적은 우수한 영양소의 공급원으로서 역할이 가능하고, 단위면적당 생산량이 높으며 친환경적인 장점이 있다. 따라서 곤충은 차후 식량위기에 대처할 수 있는 단백질 공급원으로서의 개발이 기대되고 있는 분야이다.
갈색거저리(Tenebrio molitor)는 딱정벌레목(Coleoptera) 거저리과(Tenebrionidae)에 속하는 곤충으로 중국, 캄보디아, 태국 및 멕시코에서는 식용으로 널리 사용되고 있으나 국내에서는 대부분 반려동물의 사료로 이용하고 있다. 하지만 현재 천연물 유래 기능성 식품, 의약품 및 화장품에 대한 관심이 고조되고 있어, 천연물 신약으로 개발 가능한 다양한 물질이 함유되어 있을 것으로 사료되는 곤충에 대한 수요가 증가하고 있다. 또한, 식품 미래학자들은 20년 후의 식량으로 곤충을 꼽고 있으며, 곤충을 미래의 식의약용으로 이용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
현재 갈색거저리는 식품의약품안전처로부터 식품원료로써 한시적 인정을 받은 상태이며, 한시적 인정은 일정기간동안 문제가 없으면 일반식품 원료로 등록할 수 있는 단계로써 과학적인 안전성 입증을 거쳐 한시적 식품원료로 인정된 곤충은 갈색거저리가 처음이다.
그러나 갈색거저리에 대한 연구는 최근에서야 연구가 활발히 진행되고 있을 뿐, 아직까지 갈색거저리가 갖는 다양한 생리활성에 대한 연구가 미비한 실정이다. 그나마 유충에 대한 연구가 주종을 이루고 있으며, 성충에 대한 연구는 이루어지지 않고 있다.
이에 본 발명자들은 천연 유래의 강력하면서도 체내 안정한 퇴행성 뇌질환에 대한 새로운 치료제를 발굴하기 위해 연구하던 중, 갈색거저리 성충의 추출물로부터 BACE-1 및 AChE의 억제 활성이 우수한 화합물들을 분리 동정하고 이들 화합물의 퇴행성 뇌질환 치료제로서의 사용 가능성을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-0453574호 대한민국 등록특허 제10-1639864호
따라서 본 발명의 목적은 갈색거저리 성충의 에탄올(ethanol) 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 갈색거저리 에탄올 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 갈색거저리 에탄올 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
[화합물 1]
Figure 112019054782347-pat00001
[화합물 2]
Figure 112019054782347-pat00002
[화합물 3]
Figure 112019054782347-pat00003
[화합물 4]
Figure 112019054782347-pat00004
[화합물 5]
Figure 112019054782347-pat00005
[화합물 6]
Figure 112019054782347-pat00006
[화합물 7]
Figure 112019054782347-pat00007
[화합물 8]
Figure 112019054782347-pat00008
[화합물 9]
Figure 112019054782347-pat00009
[화합물 10]
Figure 112019054782347-pat00010
[화합물 11]
Figure 112019054782347-pat00011
[화합물 12]
Figure 112019054782347-pat00012
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 4는 갈색거저리 에탄올 추출물에 헥산(hexane)을 첨가하여 수득한 헥산 가용 분획물로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물 5, 화합물 6 또는 화합물 7은 갈색거저리 에탄올 추출물에 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 수득한 클로로포름 가용 분획물로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물 8 또는 화합물 9는 갈색거저리 에탄올 추출물에 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 가용 분획물로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물 10, 화합물 11 또는 화합물 12는 갈색거저리 에탄올 추출물에 부탄올(butanol)을 첨가하여 수득한 부탄올 가용 분획물로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병, 픽크병, 크로이츠펠트-야콥병, 헌팅턴병 및 치매로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 마쇄된 갈색거저리를 유기용매로 추출하여 갈색거저리 추출물을 얻는 단계; (b) 상기 갈색거저리 추출물을 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획시키는 단계; 및 (c) 분획된 헥산 분획물에서 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 4; 클로로포름 분획물에서 화합물 5, 화합물 6 또는 화합물 7; 에틸아세테이트 분획물에서 화합물 8 또는 화합물 9; 부탄올 분획물에서 화합물 10, 화합물 11 또는 화합물 12를 분리하는 단계를 포함하는 갈색거저리로부터 화합물 1 내지 12로 표시되는 BACE-1 또는 AChE에 대한 억제 활성을 갖는 화합물을 분리하는 방법을 제공한다.
갈색거저리 에탄올 추출물로부터 분리한 본 발명의 화합물은 알츠하이머병 및 치매 등 퇴행성 뇌질환의 원인이 되는 베타아밀로이드의 생성 및 축적을 유발하는 BACE-1에 대한 저해활성이 우수하고, 기억 및 학습에 중요한 역할을 하는 아세틸콜린을 분해하는 AChE에 대한 저해활성도 우수하여, 본 발명의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 퇴행성 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학적 조성물 및 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에서 갈색거저리 에탄올 추출물로부터 순차적으로 각 용매별 분획물을 수득하는 공정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 갈색거저리 에탄올 추출물로부터 수득한 헥산 가용성 분획물로부터 본 발명에 따른 화합물 1, 2, 3 및 4의 분리 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 3은 고속액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography: HPLC)를 통해 본 발명의 화합물 1, 3 및 4에 대한 각각의 용출 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서 갈색거저리 에탄올 추출물로부터 수득한 클로로포름 가용성 분획물로부터 본 발명에 따른 화합물 5, 6 및 7의 분리 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 5는 HPLC를 통해 본 발명의 화합물 5, 6 및 7에 대한 각각의 용출 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에서 갈색거저리 에탄올 추출물로부터 수득한 에틸아세테이트 가용성 분획물로부터 본 발명에 따른 화합물 8 및 9의 분리 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 7은 HPLC를 통해 본 발명의 화합물 8 및 9에 대한 각각의 용출 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에서 갈색거저리 에탄올 추출물로부터 수득한 부탄올 가용성 분획물로부터 본 발명에 따른 화합물 10, 11 및 12의 분리 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 9는 HPLC를 통해 본 발명의 화합물 10, 11 및 12가 용출된 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 1에 대한 전자이온화 질량분석(electron ionization-mass spectrometry: EI-MS) 스펙트럼(a), 1H 핵자기공명(nuclear magnetic resonance: NMR) 스펙트럼(b), 13C NMR 스펙트럼(c) 및 DEPT (distortionless enhancement by polarization transfer) 스펙트럼(d)을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 2에 대한 EI-MS 스펙트럼(a), 1H NMR 스펙트럼(b), 13C NMR 스펙트럼(c) 및 DEPT 스펙트럼(d)을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 3에 대한 EI-MS 스펙트럼(a), 1H NMR 스펙트럼(b), 13C NMR 스펙트럼(c) 및 DEPT 스펙트럼(d)을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 4에 대한 EI-MS 스펙트럼(a), 1H NMR 스펙트럼(b), 13C NMR 스펙트럼(c) 및 DEPT 스펙트럼(d)을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 5에 대한 EI-MS 스펙트럼(a), 1H NMR 스펙트럼(b), 13C NMR 스펙트럼(c) 및 DEPT 스펙트럼(d)을 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 6에 대한 EI-MS 스펙트럼(a), 1H NMR 스펙트럼(b), 13C NMR 스펙트럼(c) 및 DEPT 스펙트럼(d)을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 7에 대한 EI-MS 스펙트럼(a), 1H NMR 스펙트럼(b), 13C NMR 스펙트럼(c) 및 DEPT 스펙트럼(d)을 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 8에 대한 EI-MS 스펙트럼(a), 1H NMR 스펙트럼(b), 13C NMR 스펙트럼(c) 및 DEPT 스펙트럼(d)을 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 9에 대한 EI-MS 스펙트럼(a), 1H NMR 스펙트럼(b), 13C NMR 스펙트럼(c) 및 DEPT 스펙트럼(d)을 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 10에 대한 EI-MS 스펙트럼(a), 1H NMR 스펙트럼(b), 13C NMR 스펙트럼(c) 및 DEPT 스펙트럼(d)을 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 11에 대한 EI-MS 스펙트럼(a), 1H NMR 스펙트럼(b), 13C NMR 스펙트럼(c) 및 DEPT 스펙트럼(d)을 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 12에 대한 EI-MS 스펙트럼(a), 1H NMR 스펙트럼(b), 13C NMR 스펙트럼(c) 및 DEPT 스펙트럼(d)을 나타낸 것이다.
본 발명자들은 퇴행성 뇌질환을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 치료제를 천연소재로부터 발굴하기 위해 연구하던 중, 갈색거저리 성충의 에탄올 추출물로부터 BACE-1 및 AChE에 대한 저해활성이 우수한 화합물들을 분리 및 동정하였다.
따라서 본 발명은 갈색거저리 에탄올 추출물로부터 분리된 하기 화합물 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 구체적으로 이에 제한되지는 않으나, 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병, 픽크병, 크로이츠펠트-야콥병, 헌팅턴병 및 치매로 이루어진 군에서 선택되는 질환에 대한 예방 또는 치료활성을 갖는다.
구체적으로 본 발명의 조성물에 함유된 유효성분인 상기 화합물은 하기에 기재된 구조식을 갖는 화합물 1 내지 12 중 어느 하나 일 수 있다.
[화합물 1]
Figure 112019054782347-pat00013
[화합물 2]
Figure 112019054782347-pat00014
[화합물 3]
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[화합물 4]
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[화합물 5]
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[화합물 6]
Figure 112019054782347-pat00018
[화합물 7]
Figure 112019054782347-pat00019
[화합물 8]
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[화합물 9]
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[화합물 10]
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[화합물 11]
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[화합물 12]
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본 발명에 따른 상기 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본 발명에 따른 상기 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.
바람직하게 본 발명에 따른 상기 화합물은 갈색거저리 에탄올 추출물로부터 분리할 수 있는데, 상기 갈색거저리 에탄올 추출물에 적절한 유기용매 또는 물을 이용하여 수득한 분획물로부터 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 상기 유기용매로는 이에 제한되지는 않으나, 메탄올(methanol), 에탄올, 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산, 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.
바람직하게 상기 본 발명의 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 4는 갈색거저리 에탄올 추출물에 헥산을 첨가하여 수득한 헥산 가용 분획물로부터 분리할 수 있고, 상기 본 발명의 화합물 5, 화합물 6 또는 화합물 7은 갈색거저리 에탄올 추출물에 클로로포름을 첨가하여 수득한 클로로포름 가용 분획물로부터 분리할 수 있으며, 상기 본 발명의 화합물 8 또는 화합물 9는 갈색거저리 에탄올 추출물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 가용 분획물로부터 분리할 수 있고, 상기 본 발명의 화합물 10, 화합물 11 또는 화합물 12는 갈색거저리 에탄올 추출물에 부탄올을 첨가하여 수득한 부탄올 가용 분획물로부터 분리할 수 있다.
또한, 상기 분획물로부터 본 발명의 화합물의 분리 및 정제는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼크로마토그라피(column chromatography), 중압액체크로마토그래피(medium-pressure liquid chromatography: MPLC), 박막크로마토그래피(thin layer chromatography: TLC), HPLC 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.
상기 중압액체크로마토그래피 수행 시 이동상은 클로로포름 및 메탄올을 이용하는 것이 바람직하며, 클로로포름:메탄올의 비율이 100:0에서 순차적으로 0:100이 되도록 하는 것이 더욱 바람직하다.
갈색거저리 에탄올 추출물로부터 본 발명에 따른 상기 화합물 1 내지 12의 분리 과정은 하기 실시예에 상세히 기재되어 있다.
한편, 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 정제한 상기 화합물 1 내지 12의 화합물들이 퇴행성 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료 활성이 있는지 확인하기 위해, 먼저 BACE-1 저해활성 분석을 수행하였다.
그 결과, 본 발명에서 분리한 12개의 화합물 모두가 퇴행성 뇌질환의 원인 물질로 작용하는 베타아밀로이드의 생성 및 축적에 영향을 주는 BACE-1을 효과적으로 저해하는 활성이 있음을 확인하였다.
나아가 본 발명의 다른 일실시예에서는 뇌 인지기능 및 기억력 능 뇌 기능에 작용하는 아세틸콜린에 대하여 아세틸콜린을 분해하여 뇌 질환 또는 뇌 기능 이상을 유발할 수 있는 AChE에 대한 저해활성 여부를 분석하였는데, 분석 결과 본 발명에서 분리한 12개 화합물 모두가 AChE에 대한 우수한 저해활성이 있음을 확인하였다.
앞서 종래기술에서도 언급한 바와 같이, BACE (beta-site APP-cleaving enzyme)은 베타아밀로이드의 생성에 가장 중요한 역할을 하고 있는 효소로서, BACE-1과 BACE-2의 두 종류가 알려져 있다. 이 중 BACE-1은 베타세크레타제의 대부분의 활성(약 90%)을 가지고 있어 베타아밀로이드 생성과정에 있어 BACE-2에 비하여 훨씬 더 중요한 역할을 담당하고 있다고 알려져 있다.
또한, AChE는 체내 부교감 신경의 활성을 매개하는 신경전달물질들(neurotransmitters)중의 하나인 아세틸콜린을 콜린과 아세테이트로 가수분해하는 효소로서, 소포체 막에서 형성되어 세포막으로 이동하여 그 기능을 수행한다. 이 효소는 콜린 신경과 그 주위, 특히 근신경 접합부(neuromuscular junction)에 가장 많이 분포되어 있고, 혈장, 간 및 다른 조직에서도 발견되는 중요한 효소이다.
일반적으로 아세틸콜린은 신경 세포의 축색 말단 막에서 시냅틱 크레프트(synaptic cleft)라고 불리는 틈으로 분비되어 시냅스후 뉴런 세포막의 수용체에 결합함으로써 활동 전위를 전달시키는 물질이며, 이 물질은 작용 부위에서 신경의 흥분을 전달한 후, 효소 AChE에 의해 콜린과 아세테이트로 분해된 후 세포내로 흡수되어 재사용되는 것으로 알려져 있다.
그런데, 많은 신체적 또는 정신적 질환들의 경우, 아세틸콜린의 합성 및 분해 기작과 관련하여 비정상적으로 아세틸콜린의 농도 감소되어 있는 것으로 알려져 있고, 아세틸콜린 관련 질환으로서 대표적인, 노인성 치매인 알츠하이머병의 경우, 환자의 뇌에는 전뇌 기저에 있는 마이네르트핵(basal nucleus of Meynert) 신경 세포가 대부분 사멸하여 신경 세포가 지배하는 시냅스와 대뇌 피질과의 연결이 퇴화되어 있고, 이들 신경 세포의 사멸로 인해 기억에 중요한 역할을 하는 신경전달물질인 아세틸콜린의 생산량이 현저하게 감소되어 있는 것으로 보고되어 있다.
따라서 AChE와 같은 아세틸콜린 분해제에 대한 저해를 유도하여 알츠하이머병을 포함하는 아세틸콜린 관련 퇴행성 뇌질환을 치료하고자 하는 연구가 시도되고 있다.
따라서, BACE-1 또는 AChE의 활성을 저해하는 물질들은 알츠하이머병을 포함하여 파킨슨병, 루게릭병, 픽크병, 크로이츠펠트-야콥병, 헌팅턴병 및 치매와 같은 퇴행성 뇌질환의 치료제 또는 개선제로 사용될 수 있다.
그러므로 본 발명의 화합물 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 파킨슨병, 루게릭병, 픽크병, 크로이츠펠트-야콥병, 헌팅턴병 또는 치매와 같은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분인 본 발명의 화합물 이외에도 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1~30중량%로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 치료제와 조합하여 치료 유효량으로 투여될 수 있다(제약 조합물). 예를 들어, 본 발명의 화합물을 화학요법제와 조합하여 사용하는 경우 상승작용 효과가 발생할 수 있다. 본 발명의 화합물을 다른 요법과 함께 투여하는 경우, 공동-투여된 화합물의 투여량은 물론 사용된 공동-약물의 유형, 사용된 구체적인 약물, 치료할 병태 등에 따라 달라질 것이다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 상기 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약제학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 화합물을 1일 1회 내지 수회 투여 시, 0.001 ㎎/kg~1,000 ㎎/kg의 용량으로 투여할 수 있으나, 특별히 그 범위를 한정하는 것은 아니다.
나아가 본 발명에 따른 상기 화합물 1 내지 12의 화합물은 갈색거저리 성충, 즉 곤충 유래의 화합물로서 체내에 부작용 및 독성을 유발시키지 않아 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있으므로, 본 발명의 화합물 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물로도 사용할 수 있다.
그러므로 본 발명의 식품 조성물은 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병, 픽크병, 크로이츠펠트-야콥병, 헌팅턴병 및 치매로 이루어진 군에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
본원에서 상기 "식품"이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본원발명에 따른 식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품 (예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 "기능성 식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬 조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 식품 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본원발명의 식품 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100 mL를 기준으로 0.001 g 내지 2 g, 바람직하게는 0.01 g 내지 0.1 g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<준비예>
분석용 장비
1H 및 13C NMR 스펙트럼은 내부 표준으로서 테트라메틸실란(tetramethylsilane)을 사용하여 각각 600 및 150 MHz에서 AVANCE 600 분광계 (Bruker, Rheinspettem, Germany)상의 CDCl3로 기록하였고, 화학적 이동은 δ (ppm)로 기록하였다. Bruker 소프트웨어를 사용하여 DEPT 스펙트럼을 획득하였고, 자외선(ultraviolet: UV) 스펙트럼은 Kontron UVICON 933/934 분광광도계(Milan, Italy)를 이용하여 아세토니트릴 또는 메탄올에서의 측정값을 얻었고, Jeol JMS-DX 303 spectrometer (Tokyo, Japan)에서 질량스펙트럼을 얻었다. 컬럼크로마토그래피는 실리카겔(silica gel) 60 (0.063~0.2 mm) (Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하였다. 머크사의 사전 코팅된 실리카겔 플레이트(Kieselgel 60 F254)를 분석용 TLC로 사용하였다. Isolera One 중압체크로마토그래프(medium-pressure liquid chromatograph)(Biotage, Uppsala, Sweden) 및 Agilent 1200 시리즈 고속액체 크로마토그래프 (high performance liquid chromatograph) (캘리포니아주 산타클라라 소재 Agilent 사)를 사용하여 Merck 제조 TLC 플레이트 (두께 2mm) USA)를 사용하여 활성 화합물을 분리하였다.
시약
EGCG (epigallocatechin gallate)와 Inhibitor IV는 각각 Sigma-Aldrich와 Merck에서 구입하여 사용하였고, 재조합 인간 BACE-1 및 형광성 펩티드 기질 Mca-SEVNLDAEFRK (Dnp) RR-NH2는 R&D 시스템(미네소타주 미네아폴리스 소재)에서 구입하여 사용하였다. 전기뱀장어(Electrophorus electricus)(VI-S 형, 동결 건조 분말, 1000 units/mg 단백질)에서 추출한 AChE는 Sigma-Aldrich사로부터 구입하여 사용하였다. 또한, 본 실험에서 사용한 모든 화합물들과 시약은 분석등급용의 것을 사용하였고 시중에서 판매되는 것을 구입하여 사용하였다.
곤충재료
건조시킨 갈색거저리 성충은 한국유용곤충연구소로부터 공급받은 것을 사용하였고, 바우처 표본(TM-AW-01)은 서울대학교 농업생명과학대학 농생명과학연구소에 보관하였다.
FRET 기반의 효소활성 분석
BACE-1 저해활성에 대한 분석은 Lv 등(Planta Med. 74, 540~545, 2008), Wang 등(BMC Complement. Altern. Med. 14, 88, 2014)에서 기술하고 있는 방법으로 수행하였는데, 0.5 μg/μL 재조합 인간 BACE-1 1 μL, 2.5 μg/μL 형광성 펩타이드 기질 0.75 L, 50 mM 아세트산나트륨 (PH 4.5) 47.25 μL 및 2% DMSO에 용해된 본 발명의 하기 실시예에서 분리한 화합물(1~1000 μg/mL)을 혼합하여 1시간 동안 25℃의 온도로 암실에서 예비 항온 처리한 다음, 16.6 μL의 2.5 M 아세트산나트륨(sodium acetate)을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 천연 BACE-1 억제제인 EGCG 및 억제제 IV는 표준 시료로 사용하였다. SpectraMAX Gemini XS 플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 320 nm 여기 및 405 nm 방출 파장으로 실온에서 형광 강도를 측정하였다. 저해율은 하기 수식을 사용하여 계산하였다.
저해 % = 100 - [(Fs-Fs0) / (Fc-Fc0)] × 100
여기서, Fs 및 Fs0는 120분 및 0분에서의 시료 형광 값을 나타낸 것이고, Fc 및 Fc0는 각각 120분 및 0분에서 대조군의 형광 값을 나타낸 것이다.
50% 저해활성(50% inhibitory concentration: IC50) 값은 GraphPad Prism 6.0 software (GraphPad Prism Software, La Jolla, CA, USA)를 이용하여 산출하였으며, 처리 당 IC50 값이 겹치지 않을 경우, 유의차가 있는 것으로 간주하였다. 실험은 3반복으로 실시하였다.
In vitro 상에서 아세틸콜린에스테라제 저해활성 분석
96-웰 마이크로플레이트에서의 AChE 활성검정은 전기뱀장어 AChE (0.1 U/mL) 20 μL, 0.1 M 인산 완충액 (PH 8.0) 140 μL, 1% DMSO에 첨가된 1% 에탄올에 용해된 농도별 시험 시료 10 μL, 0.1 M 인산 완충액 (PH 7.0)에 용해되어 있는 1 mM 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) 10 μL의 및 5 mM 아세틸콜린 요오드화물(acetylcholine iodide) 10 μL로 이루어진 반응 혼합물을 30분 동안 37℃에서 반응시키고, 이후 VersaMax microplate 리더기를 이용하여 412 nm에서 흡광도를 측정하였다.
50% 저해활성(50% inhibitory concentration: IC50) 값은 상기 GraphPad Prism 6.0 software를 이용하여 산출하였으며, 처리 당 IC50 값이 겹치지 않을 경우, 유의차가 있는 것으로 간주하였다. 실험은 3반복으로 실시하였다.
<실시예 1>
갈색거저리 성충 추출물의 제조
갈색거저리 성충의 건조물(16.9 kg)을 분쇄하고 실온에서 에탄올(3 × 5 L)로 2 일 동안 추출하고 여과하였다. 이후 여과액을 40℃에서 회전증발에 의해 농축 건조시켜 약 2.444 kg의 어두운 황색의 붉은 타르를 수득하였다. 이후 수득한 추출물(20 g)은 순차적으로 헥산(11.93 g), 클로로포름(0.25 g), 에틸아세테이트(0.21 g), 부탄올(1.83 g) 및 물 분획물(5.78 g)로 분획화하여 각 용매별 분획을 수득하였다(도 1 참조). 이러한 분획 과정은 40회 반복 수행하였고, 유기용매 가용부는 40℃에서 진공 농축하였으며, 수용부는 50℃로 농축하였다. 또한 상기 과정으로 수득한 각 분획물 중에서 0.5~1 mg/mL은 fluorescence resonance energy transfer (FRET) 기반의 효소분석을 수행하여, 각 분획물의 활성여부를 분석하였다.
<실시예 2>
갈색거저리 성충 추출물로부터 BACE-1 저해활성을 갖는 화합물의 분리
<2-1> 헥산 분획물로부터 BACE-1 저해활성을 갖는 화합물의 분리
상기 실시예 1에서 수득한 헥산 분획물(즉, 헥산 가용분획물(10 g))을 5.5 × 70 cm 실리카겔 (600 g) 컬럼을 이용하여 클로로포름과 메탄올의 용매 농도구배[(100:0 (2.5 L), 99:1 (2 L), 98:2 (2 L), 95:5 (2 L), 90:10 (2 L), 70:30 (2 L), 50:50 (1 L), 40:60 (2 L), 0:100 (0.9 L) 부피비]로 87개의 분획물(각각 약 180 mL)을 수득하였다(도 2 참조). 이후 각 컬럼분획을 클로로포름과 메탄올(95:5 부피비)의 혼합용매를 이동상으로 하여 실리카겔 플레이트 상에서 TLC로 모니터링 하였다. TLC 플레이트 상에서 유사한 Rf 값을 갖는 분획을 수집하였고, 이후 플레이트에 2% 황산을 분무하고 시료를 가열하여 스팟(spot)을 검출하였다. 이러한 과정을 통해 활성 분획 1~7 (H1), 14~21 (H3) 및 22~31 (H4)을 수득하였다. 이후 분획 H1을 254 및 365 nm의 UV 검출기와 22 mL의 컬럼 부피를 갖는 SNAP 컬럼 카트리지 (25 g 실리카 겔)로 MPLC에 의해 분리시킨 후, 클로로포름 및 메탄올 용매의 농도구배 [100:0 (300 mL), 99:1 (440 mL), 98:2 (210 mL), 95:5 (690 mL), 0:100 (200 mL) 부피비]를 이용하여 유속 20 mL/min으로 92개의 분획물(각 분획물의 부피는 약 20 mL)을 수득하였다. 각 수득한 컬럼 분획물은 상기 기술된 방법과 같이 실리카겔 플레이트 상에서 TLC로 모니터링 하였으며, 활성 분획물인 37~58 (H13) 분획을 수득하였다.
분획물 H3은 254 및 365 nm에서 검출할 수 있는 UV 검출기 및 132 mL의 부피를 갖는 컬럼 카트리지(실리카겔 100 g)를 갖는 중압액체크로마토그래프에 의해 분리되었으며, 이때 상기 분획은 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매를 농도구배로 하고[100:0 (900 mL), 99:1 (1454 mL), 98:2 (737 mL), 95:5 (1293 mL), 90:10 (1324 mL), 85:15 (712 mL), 80:20 (510 mL), 70:30 (470 mL), 0:100 (340 mL) 부피비], 25 mL/min의 유속으로 43개의 분획물(각 분획물 부피는 180 mL)을 용출시켜 수득하였다. 이후 각 컬럼 분획물은 실리카겔 플레이트 상에서 상기 기술된 방법에 따라 TLC 상에서 모니터링 하여 활성 분획물인 17~25 (H32) 분획을 수집하였고, 이를 메탄올 상에서 재결정화하여 고형 분획물인 H32S 및 액상 분획물인 H32L 분획물을 각각 수득하였다. 이후 H32S 분획물은 메탄올을 이용하여 -20℃에서 재결정화를 수행하여 본 발명에 따른 화합물 2를 분리 및 정제하였다.
또한, H4 분획물은 254 nm 및 365 nm에서 검출할 수 있는 UV 검출기 및 132 mL의 부피를 갖는 컬럼 카트리지(실리카겔 100 g)가 장착된 중압액체크로마토그래프에 의해 분리되었으며, 이때 상기 분획은 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매를 농도구배로 하여 [100:0 (1500 mL), 99:1 (1215 mL), 98:2 (841 mL), 97:3 (1765 mL), 95:5 (983 mL), 90:10 (1760 mL), 85:15 (813 mL), 80:20 (995 mL), 70:30 (1100 mL), 60:40 (700 mL), 0:100 (928 mL)부피비] 40 mL/min의 유속으로 70개의 분획물(각 분획물 부피는 180 mL)을 용출시켜 수득하였다. 이후 각 컬럼 분획물은 실리카겔 플레이트 상에서 상기 기술된 방법에 따라 TLC 상에서 모니터링 하였으며, 활성분획 9~23 (H42)들을 수집하였다. HPLC를 수행하여 H13, H32L 및 H42의 활성분획물로 순차적으로 분리시켰고, 이때 컬럼은 안지름 7.8 mm × 300 mm μBondapak C18 (Waters, Milford, MA, USA)을 사용하였고, 이동상 용매로 메탄올과 물의 혼합용매(85:15, 90:10 및 90:10(부피비))를 사용하여 1 mL/min의 유속으로 HPLC를 수행하였다. 이후 크로마토그래픽 분리는 UV 검출기로 242 nm, 250 nm 및 233 nm에서 각각 분석하였고, 최종적으로 H13 분획물로부터 본 발명의 활성화합물 1 (6.81 mg)을 분리하였고, H32L 분획물로부터 본 발명의 활성화합물 3 (7.02 mg)을 분리하였으며, H42 분획물로부터의 본 발명의 활성화합물 4 (9.45 mg)를 분리하였고(도 2 참조), 이들 활성화합물들의 용출 크로마토그램을 도 3에 나타내었다(용출시간 : 15.61분 (화합물 1), 17.63분 (화합물 3) 및 26.45분 (화합물 4).
<2-2> 클로로포름 분획물로부터 BACE-1 저해활성을 갖는 화합물의 분리
상기 실시예 1에서 수득한 클로로포름 분획물(즉, 클로로포름 가용분획물(10.13 g))을 254 nm 및 365 nm에서 검출할 수 있는 UV 검출기 및 210 mL의 부피를 갖는 SNAP 컬럼 카트리지(실리카겔 340 g)가 장착된 중압액체크로마토그래프를 이용하여 분리하였으며, 이때 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 용출용매로 하여 농도구배를 수행하였고[[100:0 (0.7 L), 99:1 (1.8 L), 98:2 (2 L), 90:10 (1.8 L), 70:30 (3.3 L), 50:50 (1.1 L), 40:60 (1.7 L), 0:100 (0.9 L) 부피비], 50 mL/min의 유속으로 74개의 분획물(각 분획물의 부피 : 180 mL)을 수득하였다(도 4 참조). 이후 상기 수득한 분획물들은 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매(95:5 부피비)를 이동상 용매로 하여 실리카겔 플레이트 상에서 TLC 분석으로 모니터링 하였다. 이러한 과정으로 활성 분획 26~40 (C3) 및 41~57 (C4)을 수득하였다. C3 분획은 UV 검출기 및 132 mL 부피를 갖는 컬럼 카트리지(실리카겔 100 g)가 장착된 중압액체크로마토그래프를 이용하여 분리하였으며, 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 용출용매로 하여 농도구배로[클로로포름:메탄올 [100:0 (0.7 L), 98:2 (1.3 L), 96:4 (0.6 L), 95:5 (0.4 L), 90:10 (1.7L), 80:20 (1.5 L), 40:60 (1.4 L), 0:100 (0.9 L) 부피비] 40 mL/min의 유속에 의해 47개의 분획물(각 분획물의 부피 : 180 mL)을 수득하였다. 각 분획물들은 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매를 이동상으로 하여(9:1 부피비) 실리카겔 플레이트 상에서 TLC 분석을 수행하였다. 활성 분획물인 7~11 (C32) 분획물을 수집하고 다시 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매를 이동상으로 하여(9:1 부피비) TLC 분석을 통해 활성 분획물인 C322 및 C324 분획물을 수득하였다. 이후 C322 및 C324 분획물은 메탄올 및 물의 혼합용매를 이동상으로 하고(95:5 부피비) 1 mL/min의 유속으로 HPLC를 수행하여, 243 nm 및 210 nm에서 검출할 수 있는 UV 검출기로 모니터링 한 결과, 최종적으로 C322 분획물로부터 본 발명의 화합물 5 (17.31 mg) 및 C324 분획물로부터 본 발명의 화합물 6 (5.93 mg)을 각각 분리하였고, 이들 용출시간은 각각 12.11분 (화합물 5) 및 20.81분 (화합물 6)이었다(도 5 참조).
또한, 다른 활성 분획물인 C4는 분획물은 254 nm 및 365 nm에서 검출할 수 있는 UV 검출기 및 132 mL의 부피를 갖는 컬럼 카트리지(실리카겔 100 g)가 장착된 중압 액체크로마토그래프를 이용하여 분리하였는데, 이때 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 용출용매로 하여 농도구배를 수행하였고[[100:0 (100 mL), 99:1 (350 mL), 98:2 (440 mL), 90:10 (470 mL), 0:100 (200 mL) 부피비], 30 mL/min의 유속으로 78개의 분획물(각 분획물의 부피 : 20 mL)을 수득하였다. 이후 상기 수득한 분획물들은 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매(9:1 부피비)를 이동상 용매로 하여 실리카겔 플레이트 상에서 TLC 분석을 수행하였다. 활성 분획물 8~23 (C43)은 수집하고 UV 검출기 및 22 mL의 부피 컬럼 카트리지(실리카겔 25 g)가 장착된 중압액체크로마토그래프를 이용하여 분리하였는데, 이때 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 용출용매로 하여 농도구배를 수행하였고[[100:0 (100 mL), 98:2 (220 mL), 90:10 (310 mL), 80:20 (300 mL), 60:40 (210 mL), 0:100 (200 mL) 부피비], 20 mL/min의 유속으로 67개의 분획물(각 분획물의 부피 : 20 mL)을 수득하였다. 이후 상기 수득한 분획물들은 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매(95:5 부피비)를 이동상 용매로 하여 실리카겔 플레이트 상에서 TLC 분석으로 모니터링 하였다. 활성분획물 10~32 (C432)을 수집하여 클로로포름과 메탄올의 혼합용매(8:2 부피비)로 TLC 분석을 수행하여 C4322의 분획물을 수득하였으며, 상기 분획물은 추가로 HPLC를 수행하였는데, 즉, 메탄올 및 물의 혼합용매(80:20 부피비)를 이동상으로 하여 1 mL/min의 유속으로 분리하면서 230 nm에서 UV 검출기로 분석하여, 최종적으로 본 발명의 활성 화합물 7 (17.9 mg)을 분리하였고, 상기 화합물의 용출시간은 11.17분이었다.
상기와 같이 클로로포름 분획물로부터 본 발명의 화합물 5, 6 및 7을 분리 및 정제하는 과정은 도 4에 나타내었고, 분리된 상기 화합물들의 용출시간에 따른 크로마토그램은 도 5에 나타내었다.
<2-3> 에틸아세테이트 분획물로부터 BACE-1 저해활성을 갖는 화합물의 분리
상기 실시예 1에서 수득한 에틸아세테이트 분획물(5.19 g)을 254 nm 및 365 nm에서 검출할 수 있는 UV 검출기 및 510 mL의 부피를 갖는 컬럼 카트리지(실리카겔 340 g)가 장착된 중압액체크로마토그래프를 이용하여 분리하였으며, 이때 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 용출용매로 하여 농도구배를 수행하였고[100:0 (800 mL), 99:1 (924 mL), 97:3 (1211 mL), 95:5 (762 mL), 90:10 (2139 mL), 80:20 (673 mL), 70:30 (1752 mL), 60:40 (910 mL), 0:100 (1089 mL) 부피비], 50 mL/min의 유속으로 57개의 분획물(각 분획물의 부피 : 180 mL)을 수득하였다(도 6 참조). 이후 상기 분획물들은 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매(95:5 부피비)를 이동상 용매로 하여 실리카겔 플레이트 상에서 TLC 분석으로 모니터링 하였다. 이러한 과정으로 활성 분획 13~25 (E3), 44~57 (E6)를 수득하였다. 상기 E3 분획물은 254 nm 및 365 nm에서 검출할 수 있는 UV 검출기 및 132 mL의 부피를 갖는 컬럼 카트리지(실리카겔 100 g)가 장착된 중압액체크로마토그래프를 이용하여 분리하였으며, 이때 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 용출용매로 하여 농도구배를 수행하였고[100:0 (1.1 L), 99:1 (1.3 L), 98:2 (2.1 L), 95:5 (1 L), 9:1 (0.8L), 8:2 (1 L), 7:3 (0.7 L), 5:5 (1.4 L), 4:6 (0.63 L), 0:100 (1.13 L) 부피비], 30 mL/min의 유속으로 62개의 분획물(각 분획물의 부피 : 180 mL)을 수득하였다. 상기 분획물들은 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매(95:5 부피비)를 이동상 용매로 하여 실리카겔 플레이트 상에서 TLC 분석으로 모니터링 하여 활성 분획물인 8~13 (E32)을 수득하였다.
이후 분획물 E32는 254 및 365 nm에서 검출할 수 있는 UV 검출기 및 22 mL의 부피를 갖는 컬럼 카트리지(실리카겔 25 g)가 장착된 중압액체크로마토그래프를 이용하여 분리하였으며, 이때 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 용출용매로 하여 농도구배로[100:0 (170 mL), 98:2 (340 mL), 95:5 (310 mL), 0:100 (200 mL) 부피비], 20 mL/min의 유속으로 51개의 분획물(각 분획물의 부피 : 20 mL)을 수득하였다. 상기 분획물들은 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매(95:5 부피비)를 이동상 용매로 하여 실리카겔 플레이트 상에서 TLC로 모니터링 하여 활성 분획물인 13~31 (E322)을 수득하였고, E322 분획물은 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매(95:5 부피비)를 이동상 용매로 하는 TLC 분석을 통해 활성분획물인 E3223을 수득하였다.
나아가 활성 분획물인 E6는 254 nm 및 365 nm에서 검출할 수 있는 UV 검출기 및 132 mL의 부피를 갖는 컬럼 카트리지(실리카겔 100 g)가 장착된 중압액체크로마토그래프를 이용하여 분리하였으며, 이때 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 용출용매로 하여 농도구배로[100:0 (600 mL), 99:1 (750 mL), 97:3 (1123 mL), 9:1 (1469 mL), 8:2 (1138 mL), 7:3 (783 mL), 0:100 (437 mL) 부피비], 30 mL/min의 유속으로 35개의 분획물(각 분획물의 부피 : 180 mL)을 수득하였다. 각 분획물들은 TLC 분석 및 모니터링을 통해 활성 분획물 4~21 (E62)를 얻었으며 이들 분획을 수집하여 에틸아세테이트 상에서 재결정화시켜 고형 분획물인 E62S 및 액상 분획물인 E62L을 수득하였다. 고형 분획물인 E62S 및 E3223 분획물은 이후 메탄올 및 물의 혼합용매(8:2 부피비)를 이동상으로 하고 1 mL/min의 유속으로 HPLC 분석을 각각 수행하여, E3223 분획물로부터 본 발명의 화합물 8 (5.23 mg)를 수득하였고, E62S 분획물로부터 본 발명의 화합물 9 (15.72 mg)를 수득하였다. 이때 상기 화합물 8의 용출시간 및 화합물 9의 용출시간은 각각 11.45분 및 11.83분이었다(도 7 참조).
<2-4> 부탄올 분획물로부터 BACE-1 저해활성을 갖는 화합물의 분리
상기 실시예 1에서 수득한 부탄올 분획물(5.72 g)을 254 nm 및 365 nm에서 검출할 수 있는 UV 검출기 및 123 mL의 부피를 갖는 SNAP 컬럼 카트리지(실리카겔 100 g)가 장착된 중압액체크로마토그래프를 이용하여 분리하였으며, 이때 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 용출용매로 하여 농도구배를 수행하였고[100:0 (200 mL), 99:1 (410 mL), 97:3 (250 mL), 95:5 (370 mL), 90:10 (520 mL), 80:20 (440 mL), 70:30 (300 mL), 40:60 (370 mL), 0:100 (400 mL) 부피비], 30mL/min의 유속으로 163개의 분획물(각 분획물의 부피 : 20mL)을 수득하였다(도 8 참조). 이후 상기 분획물들은 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매(9:1 부피비)를 이동상 용매로 하여 실리카겔 플레이트 상에서 TLC 분석으로 모니터링 하였다. 이러한 과정으로 활성 분획 1~17 (B1), 37~51 (B3) 및 51~81 (B4)를 수득하였고, 상기 B1 분획을 254 nm 및 365 nm에서 검출할 수 있는 UV 검출기 및 132 mL의 부피를 갖는 SNAP 컬럼 카트리지(실리카겔 100 g)가 장착된 중압액체크로마토그래프를 이용하여 분리하였으며, 이때 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 용출용매로 하여 농도구배를 수행하였고[100:0 (150 mL), 98:2 (410 mL), 95:5 (200 mL), 90:10 (480 mL), 80:20 (320 mL), 0:100 (300 mL) 부피비], 30 mL/min의 유속으로 93개의 분획물(각 분획물 부피 : 20 mL)을 수득하였으며, 이 중에서 12~21 (B12)분획물을 수집하여 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매(9:1 부피비)로 TLC 분석을 수행하여 B122 분획물을 수득하였다.
또한, 분획물 B3은 수집 후 클로로포름을 이용하여 재결정화시킨 후, 고형 분획물인 B3S 및 액상 분획물인 B3L 분획물을 수득하였다. B3L 분획물은 254 nm 및 365 nm에서 검출할 수 있는 UV 검출기 및 132 mL의 부피를 갖는 SNAP 컬럼 카트리지(실리카겔 100 g)가 장착된 중압액체크로마토그래프를 이용하여 분리하였으며, 이때 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 용출용매로 하여 농도구배를 수행하였고[100:0 (190 mL), 99:1 (300 mL), 98:2 (260 mL), 95:5 (410 mL), 9:1 (550 mL), 7:3 (340 mL), 6:4 (120 mL), 5:5 (300 mL), 4:6 (230 mL), 0:100 (300) 부피비], 30 mL/min의 유속으로 150개의 분획물(각 분획물 부피 : 20 mL)을 수득하였다. 분획물들은 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매(95:5 부피비)를 이동상 용매로 하여 실리카겔 플레이트 상에서 TLC 분석으로 모니터링 하여 활성 분획물인 B3L31을 수득하였다.
또한, 분획물 B4는 254 nm 및 365 nm에서 검출할 수 있는 UV 검출기 및 132 mL의 부피를 갖는 SNAP 컬럼 카트리지(실리카겔 100 g)가 장착된 중압액체크로마토그래프를 이용하여 분리하였으며, 이때 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 용출용매로 하여 농도구배를 수행하였고[100:0 (80 mL), 9:1 (230 mL), 7:3 (690 mL), 5:5 (400 mL), 0:100 (200 mL) 부피비], 25 mL/min의 유속으로 80개의 분획물(각 분획물 부피 : 20 mL)을 수득하였다. 분획물들은 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매(95:5 부피비)를 이동상 용매로 하여 실리카겔 플레이트 상에서 TLC 분석으로 모니터링 하여 활성 분획물인 30~37 (B45)을 수득하였다. 이후 B45 분획물은 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매(9:1 부피비)를 이동상 용매로 하여 실리카겔 플레이트 상에서 TLC 분석으로 모니터링 하여 활성 분획물인 B451을 수득하였고, 이를 다시 260 nm 및 215 nm에서 검출할 수 있는 UV 검출기 및 메탄올과 물의 혼합용매(8:2 및 7:3 부피비)를 이동상 용매로 하고 1 mL/min의 유속으로 분리하여, B122 분획물로 부터 본 발명의 화합물 10 (4.12 mg)을, B3L31 분획물로 부터 본 발명의 화합물 11 (9.75 mg)을, 그리고 B451분획물로 부터 본 발명의 화합물 12 (8.29 mg)를 각각 분리하였다. 이들 화합물의 각 용출시간은 11.54분 (화합물 6), 12.30분 (화합물 11) 및 21.21분 (화합물 12)인 것으로 나타났다(도 9 참조).
<실시예 3>
갈색거저리 성충 추출물로부터 분리한 본 발명의 BACE-1 저해활성을 갖는 화합물들의 동정
상기 실시예 2를 통해 갈색거저리 성충의 추출물로부터 총 12개의 BACE-1 저해활성을 갖는 화합물을 동정하였는데, 상기 분리한 화합물의 동정은 EI-MS 및 NMR spectroscopy를 이용하여 수행하였다. 본 발명에서 분리한 각 화합물들의 동정 분석 결과는 다음과 같다.
<3-1> 화합물 1의 동정
상기 실시예 2에서 분리된 본 발명의 화합물 1은 갈색의 점성이 있는 액체 형태로 분리되었고, EI-MS, 1H NMR, 13C NMR 및 DEPT의 분광 분석 결과에 의해 팔미톨레산(palmitoleic acid)의 화합물임을 알 수 있었으며(도 10 참조), 13C NMR 분석결과, 이중결합, 메틸 및 카복시기를 포함하여 분자 내에 16 개의 탄소를 가지는 분자식 C16H30O2의 화합물임을 확인할 수 있었다.
화합물의 동정결과: viscous liquid; UV (MeOH): λmax nm = 242; EI-MS (70 eV), m/z (% relative intensity): 254 [M]+ (5), 236 (8), 219 (4), 207 (2), 194 (5), 152 (6), 138 (6), 123 (11), 111 (18), 97 (32), 83 (45), 69 (71), 60 (90), 55 (100), 41 (86), 29 (36). High resolution MS: C16H30O2 + observed: 255.23186, calculated: 255.23241.
본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 1의 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) 및 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) 분석 결과는 하기 표 1에 나타내었고, 그 구조식은 하기 화학식 1을 갖는 팔미톨레산(palmitoleic acid) ((9Z)-hexadec-9-enoic acid) 임을 알 수 있었다. 또한 EI-MS, 1H NMR, 13C NMR 및 DEPT의 분광분석 결과는 도 10에 나타내었다.
<화학식 1>
Figure 112019054782347-pat00025
Figure 112019054782347-pat00026
<3-2> 화합물 2의 동정
본 발명의 실시예 2에서 분리한 화합물 2를 상기 <3-1>과 동일한 방법으로 동정하였다.
본 발명의 화합물 2는 백색 고형의 스테아르산(stearic acid)임을 확인할 수 있었고, 13C NMR 분석 결과, 메틸 및 카복시기를 포함하여 분자 내에 18개의 탄소를 나타내어 분자식 C13H36O2의 화합물임을 확인할 수 있었다.
화합물의 동정결과: white flake crystals; UV (MeOH): λmax nm = 254; EI-MS (70 eV), m/z (% relative intensity): 284 [M]+ (80), 241 (10), 199 (32), 185 (9), 171 (8), 157 (9), 143 (25), 129 (11), 125 (8), 115 (7), 111 (43), 98 (12), 83 (24), 73 (64), 69 (59), 60 (43), 57 (12), 43 (24), 29 (64), 18 (59). High resolution MS: C18H37O2 + observed: 285.27881, calculated: 285.27936.
본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 2의 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) 및 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) 분석 결과는 하기 표 2에 나타내었고, 그 구조식은 하기 화학식 2를 갖는 스테아르산(stearic acid) (octadecanoic acid) 임을 알 수 있었다.
또한 EI-MS, 1H NMR, 13C NMR 및 DEPT의 분광분석 결과는 도 11에 나타내었다.
<화학식 2>
Figure 112019054782347-pat00027
Figure 112019054782347-pat00028
<3-3> 화합물 3의 동정
본 발명의 실시예 2에서 분리한 화합물 3을 상기 <3-1>과 동일한 방법으로 동정하였다.
본 발명의 화합물 3은 무색의 오일 형태의 리놀레산(linoleic acid)임을 확인할 수 있었고, 13C NMR 분석 결과, 이중결합, 메틸 및 카복시기를 포함하여 분자 내에 18개의 탄소를 나타내어 분자식 C18H32O2의 화합물임을 확인할 수 있었다.
화합물의 동정결과: colorless oil; UV (MeOH): λmax nm = 250; EI-MS (70 eV), m/z (% relative intensity): 280 [M]+ (38), 182 (2), 168 (1), 150 (2), 137 (7), 124 (6), 110 (10), 95 (15), 81 (20), 67 (39), 55 (77), 41 (97), 29 (100), 27 (51). High resolution MS: C18H33O2 + observed: 281.24751, calculated: 281.24806.
본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 3의 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) 및 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) 분석 결과는 하기 표 3에 나타내었고, 그 구조식은 하기 화학식 3을 갖는 리놀레산(linoleic acid) ((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoic acid) 임을 알 수 있었다.
또한 EI-MS, 1H NMR, 13C NMR 및 DEPT의 분광분석 결과는 도 12에 나타내었다.
<화학식 3>
Figure 112019054782347-pat00029
Figure 112019054782347-pat00030
<3-4> 화합물 4의 동정
본 발명의 실시예 2에서 분리한 화합물 4를 상기 <3-1>과 동일한 방법으로 동정하였다.
본 발명의 화합물 4는 황색 오일인 리놀렌산(linolenic acid) 임을 확인할 수 있었고, 13C NMR 분석결과, 이중결합, 메틸 및 카복시기를 포함하여 분자식 C18H30O2의 화합물임을 확인할 수 있었다.
화합물의 동정결과: yellow oil; UV (MeOH): λmax nm = 233; EI-MS (70 eV), m/z (% relative intensity): 278 [M]+ (6), 149 (4), 135 (6), 121 (9), 108 (26), 95 (36), 79 (78), 67 (73), 60 (12), 55 (60), 41 (100), 29 (35). High resolution MS: C18H31O2 + observed: 279.23186, calculated: 279.23241.
본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 4의 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) 및 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) 분석 결과는 하기 표 4에 나타내었고, 그 구조식은 하기 화학식 4를 갖는 리놀렌산(linolenic acid) ((9Z,12Z,15Z)-octadeca-9,12,15-trienoic acid) 임을 알 수 있었다.
또한 EI-MS, 1H NMR, 13C NMR 및 DEPT의 분광분석 결과는 도 13에 나타내었다.
<화학식 4>
Figure 112019054782347-pat00031
Figure 112019054782347-pat00032
<3-5> 화합물 5의 동정
본 발명의 실시예 2에서 분리한 화합물 5를 상기 <3-1>과 동일한 방법으로 동정하였다.
본 발명의 화합물 5는 노란색 고체물질인 카테킨(catechin)임을 확인할 수 있었고, 13C NMR 분석 결과, 이중결합, 수산화 라디칼을 포함하여 탄소수 15개를 갖는 분자식 C15H14O6의 화합물임을 확인할 수 있었다.
화합물의 동정결과: yellow solid; UV (MeOH): λmax nm = 245, 280; EI-MS (70 eV), m/z (% relative intensity): 290 [M]+ (25), 167 (5), 152 (43), 139 (100), 123 (44), 110 (4), 85 (3), 69 (10), 51 (8), 39 (6),19 (21). High resolution MS: C15H15O6 + observed: 291.08631, calculated: 291.08686.
본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 5의 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) 및 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) 분석 결과는 하기 표 5에 나타내었고, 그 구조식은 하기 화학식 5를 갖는 카테킨(catechin) ((2R,3S)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-2H-chromene-3,5,7-triol) 임을 알 수 있었다.
또한 EI-MS, 1H NMR, 13C NMR 및 DEPT의 분광분석 결과는 도 14에 나타내었다.
<화학식 5>
Figure 112019054782347-pat00033
Figure 112019054782347-pat00034
<3-6> 화합물 6의 동정
본 발명의 실시예 2에서 분리한 화합물 6을 상기 <3-1>과 동일한 방법으로 동정하였다.
본 발명의 화합물 6은 무색의 결정질 고체인 테레인(terrein)임을 확인할 수 있었고, 13C NMR 분석 결과, 이중결합, 수산화 라디칼, 메틸 및 카르보닐 그룹을 포함하여 탄소수 8개를 갖는 분자식 C8H10O3의 화합물임을 확인할 수 있었다.
화합물의 동정결과: colorless crystal; UV (MeOH): λmax nm = 230, 254; EI-MS (70 eV), m/z (% relative intensity): 154 [M]+ (19), 139 (100), 136 (11), 121 (39), 109 (26), 95 (23), 91 (5), 79 (36), 67 (16), 60 (5), 53 (11), 41 (25), 18 (12). High resolution MS: C8H11O3 + observed: 155.07027, calculated: 155.17310.
본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 6의 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) 및 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) 분석 결과는 하기 표 6에 나타내었고, 그 구조식은 하기 화학식 6을 갖는 테레인(terrein) (4,5-dihydroxy-3-((E)-prop-1-enyl) cyclopent-2-en-1-one) 임을 알 수 있었다.
또한 EI-MS, 1H NMR, 13C NMR 및 DEPT의 분광분석 결과는 도 15에 나타내었다.
<화학식 6>
Figure 112019054782347-pat00035
Figure 112019054782347-pat00036
<3-7> 화합물 7의 동정
본 발명의 실시예 2에서 분리한 화합물 7을 상기 <3-1>과 동일한 방법으로 동정하였다.
본 발명의 화합물 7은 무색의 오일 형태인 올레산(oleic acid) 임을 확인할 수 있었고, 13C NMR 분석 결과, 이중결합, 메틸 및 카복시기를 포함하여 분자 내에 18개의 탄소를 나타내어 분자식 C18H34O2의 화합물임을 확인할 수 있었다.
화합물의 동정결과: colorless oil; UV (MeOH): λmax nm = 243; EI-MS (70 eV), m/z (% relative intensity): 280 [M]+ (36), 182 (5), 168 (4), 150 (6), 137 (9), 124 (17), 110 (32), 95 (63), 81 (88), 67 (100), 55 (60), 41 (54), 29 (21). High resolution MS: C18H35O2 + observed: 283.26316, calculated: 283.26371.
본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 7의 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) 및 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) 분석 결과는 하기 표 7에 나타내었고, 그 구조식은 하기 화학식 7을 갖는 올레산(oleic acid) ((9Z)-octadec-9-enoic acid) 임을 알 수 있었다.
또한 EI-MS, 1H NMR, 13C NMR 및 DEPT의 분광분석 결과는 도 16에 나타내었다.
<화학식 7>
Figure 112019054782347-pat00037
Figure 112019054782347-pat00038
<3-8> 화합물 8의 동정
본 발명의 실시예 2에서 분리한 화합물 8을 상기 <3-1>과 동일한 방법으로 동정하였다.
본 발명의 화합물 8은 백색의 크리스탈의 칸타리딘(cantharidin)임을 확인할 수 있었고, 13C NMR 분석 결과, 메틸 및 카복시기를 포함하여 분자 내에 10개의 탄소를 나타내어 분자식 C10H12O4의 화합물임을 확인할 수 있었다.
화합물의 동정결과: white crystal; UV (MeOH): λmax nm = 230; EI-MS (70 eV), m/z (% relative intensity): 168 [M]+ (4), 163 (4), 128 (88), 125 (20), 109 (70), 100 (12), 96 (26), 91 (11), 81 (88), 70 (20), 67 (70), 53 (12), 39 (26), 27 (11). High resolution MS: C10H13O4 + observed: 197.08084, calculated: 197.08138.
본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 8의 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) 및 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) 분석 결과는 하기 표 8에 나타내었고, 그 구조식은 하기 화학식 8을 갖는 칸타리딘(cantharidin) (2,6-dimethyl-4,10-dioxatricyclo-[5.2.1.02,6]decane-3,5-dione) 임을 알 수 있었다.
또한 EI-MS, 1H NMR, 13C NMR 및 DEPT의 분광분석 결과는 도 17에 나타내었다.
<화학식 8>
Figure 112019054782347-pat00039
Figure 112019054782347-pat00040
<3-9> 화합물 9의 동정
본 발명의 실시예 2에서 분리한 화합물 9를 상기 <3-1>과 동일한 방법으로 동정하였다.
본 발명의 화합물 9는 백색의 니들 형태 크리스탈의 에르고스테롤(ergosterol)임을 확인할 수 있었고, 13C NMR 분석 결과, 이중결합, 메틸 및 히드록시기 라디칼을 포함하여 분자 내에 28개의 탄소를 나타내어 분자식 C28H44O5의 화합물임을 확인할 수 있었다.
화합물의 동정결과: white needle-shaped crystal; UV (MeOH): λmax nm = 284; EI-MS (70 eV), m/z (% relative intensity): 396 [M]+ (67), 378 (10), 363 (75), 337 (33), 309 (24), 271 (46), 253 (13), 245 (12), 237 (27), 227 (19), 217 (14), 211 (20), 197 (35), 185 (42), 175 (19), 171 (24), 157 (22), 143 (23), 131 (45), 125 (96), 119 (75), 107 (46), 95 (11), 81 (5), 69 (96), 55 (75), 43 (46), 29 (11), 18 (5). High resolution MS: C28H45O+ observed: 397.34649, calculated: 397.34704.
본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 9의 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) 및 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) 분석 결과는 하기 표 9에 나타내었고, 그 구조식은 하기 화학식 9를 갖는 에르고스테롤(ergosterol) ((3S,9S,10R,13R,14R,17R)-17-((2R,3E,5R)-5,6- dimethyl-3-hepten-2-yl)-10,13-dimethyl-2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17- dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol) 임을 알 수 있었다.
또한 EI-MS, 1H NMR, 13C NMR 및 DEPT의 분광분석 결과는 도 18에 나타내었다.
<화학식 9>
Figure 112019054782347-pat00041
Figure 112019054782347-pat00042
<3-10> 화합물 10의 동정
본 발명의 실시예 2에서 분리한 화합물 10을 상기 <3-1>과 동일한 방법으로 동정하였다.
본 발명의 화합물 10은 흰색분말의 프로토카테추산(protocatechuic acid)임을 확인할 수 있었고, 13C NMR 분석 결과, 이중결합, 수산화 라디칼 및 카복시기를 포함하여 분자 내에 7개의 탄소를 갖는 분자식 C7H6O4의 화합물임을 확인할 수 있었다.
화합물의 동정결과: white powder; UV (MeOH): λmax nm = 260; EI-MS (70 eV), m/z (% relative intensity): 154 [M]+ (100), 137 (95), 109 (25), 97 (4), 81 (13), 63 (12), 51 (10), 44 (6), 39 (4), 18 (6). High resolution MS: C7H7O4 + observed: 155.03389, calculated: 155.03443.
본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 10의 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) 및 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) 분석 결과는 하기 표 10에 나타내었고, 그 구조식은 하기 화학식 10의 프로토카테추산(protocatechuic acid) (3,4-dihydroxybenzoic acid) 임을 알 수 있었다.
또한 EI-MS, 1H NMR, 13C NMR 및 DEPT의 분광분석 결과는 도 19에 나타내었다.
<화학식 10>
Figure 112019054782347-pat00043
Figure 112019054782347-pat00044
<3-11> 화합물 11의 동정
본 발명의 실시예 2에서 분리한 화합물 11을 상기 <3-1>과 동일한 방법으로 동정하였다.
본 발명의 화합물 11은 백색 고체의 아데노신(adenosine)임을 확인할 수 있었고, 13C NMR 분석 결과, 이중결합, 메틸, 아미도겐 및 히드록시기 라디칼을 포함하여 분자 내에 7개의 탄소를 나타내어 분자식 C10H13N5O4의 화합물임을 확인할 수 있었다.
화합물의 동정결과: white solid; UV (MeOH): λmax nm = 260; EI-MS (70 eV), m/z (% relative intensity): 267 [M]+ (1), 223 (1), 164 (25), 135 (73), 108 (6), 98 (94), 81 (5), 66 (30), 54 (6), 43 (10), 39 (6), 28 (12), 18 (6), 15 (12). High resolution MS: C10H14N5O4 + observed: 268.10403, calculated: 268.10458.
본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 11의 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) 및 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) 분석 결과는 하기 표 11에 나타내었고, 그 구조식은 하기 화학식 11을 갖는 아데노신(adenosine) ((2R,3R,4S,5R)-2-(6-amino-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol) 임을 알 수 있었다.
또한 EI-MS, 1H NMR, 13C NMR 및 DEPT의 분광분석 결과는 도 20에 나타내었다.
<화학식 11>
Figure 112019054782347-pat00045
Figure 112019054782347-pat00046
<3-12> 화합물 12의 동정
본 발명의 실시예 2에서 분리한 화합물 12를 상기 <3-1>과 동일한 방법으로 동정하였다.
본 발명의 화합물 12는 베이지색 고체의 트립토폴(tryptophol)임을 확인할 수 있었고, 13C NMR 분석 결과, 이중결합, 아미도겐 및 히드록시기 라디칼을 포함하여 분자 내에 4개의 탄소를 나타내어 분자식 C10H11NO의 화합물임을 확인할 수 있었다.
화합물의 동정결과: beige solid; UV (MeOH): λmax nm = 215; EI-MS (70 eV), m/z (% relative intensity): 161 [M]+ (26), 130 (93), 103 (5), 77 (7), 51 (5), 18 (7). High resolution MS: C10H12NO+ observed: 162.09134, calculated: 162.09189.
본 발명에서 분리 및 동정한 화합물 12의 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) 및 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) 분석 결과는 하기 표 12에 나타내었고, 그 구조식은 하기 화학식 12을 갖는 트립토폴(tryptophol) (2-(1H-indol-3-yl)ethanol) 임을 알 수 있었다.
또한 EI-MS, 1H NMR, 13C NMR 및 DEPT의 분광분석 결과는 도 21에 나타내었다.
<화학식 12>
Figure 112019054782347-pat00047
Figure 112019054782347-pat00048
<실시예 4>
갈색거저리 성충 추출물 및 이의 분획물에 대한 BACE-1 저해활성 분석
상기 <실시예 1> 및 <실시예 2>에서 갈색거저리 성충으로부터 추출한 각 용매 추출물 및 각 용매 추출물의 분획물들에 대한 BACE-1 저해활성 여부를 분석하였다. 갈색거저리 에탄올 추출물의 용매 분배로부터 얻어진 분획에 대해 FRET-기반의 효소 분석을 통해 BACE-1 저해활성을 분석하였고, 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.
Figure 112019054782347-pat00049
그 결과, 각 용매 추출 분획물 간에는 BACE-1 저해활성의 유의한 차이가 관찰되었는데, 24시간 동안의 IC50 값 분석 결과, 헥산 및 에틸아세테이트 가용성 분획물이 가장 강력한 BACE-1 저해활성을 나타내었고, 부탄올도 BACE-1 저해활성이 있는 것으로 나타났다.
또한, 헥산 분획, 클로로포름 분획, 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획으로 분획화된 각 세부 분획물들에 대한 BACE-1 저해활성 결과를 하기 표 14 내지 표 17에 각각 나타내었다.
Figure 112019054782347-pat00050
Figure 112019054782347-pat00051
Figure 112019054782347-pat00052
Figure 112019054782347-pat00053
<실시예 5>
갈색거저리 성충 추출물로부터 분리 및 동정한 본 발명의 화합물들에 대한 BACE-1 저해활성 분석
본 발명자들은 갈색거저리 성충의 추출물로부터 분리한 각 용매별 분획물로부터 BACE-1 저해활성을 가질 것으로 예상된 상기 12개의 화합물들에 대해 실제적으로 BACE-1 저해활성이 있는지를 분석하였고, 그 결과를 하기 표 18에 나타내었다.
Compound IC 50 , μM (95% CL a ) Slope ± SE χ 2b P-value
linolenic acid 28.41 (24.24~32.57) 2.1 ± 0.49 1.07 0.88
Ergosterol 32.80 (25.20~40.40) 1.4 ± 0.41 1.25 0.99
Linoleic acid 37.72 (32.00~43.44) 1.7 ± 0.30 1.11 0.92
Palmitoleic acid 41.84 (35.37~48.31) 1.4 ± 0.17 2.14 0.96
Tryptopol 46.16 (41.58~50.73) 1.3 ± 0.06 1.56 0.98
Oleic acid 50.19 (49.84~50.55) 1.7 ± 0.32 2.39 0.92
Protocatechuic acid 62.97 (60.95~64.99) 3.0 ± 0.00 1.01 0.98
Terrein 146.64 (139.91~153.47) 2.0 ± 0.40 1.81 0.90
Stearic acid 225.20 (203.20~247.10) 2.8 ± 0.16 2.21 0.96
Adenosine 350.82 (340.11~361.53) 2.3 ± 0.19 1.97 0.95
Catechin 431.27 (423.85~438.69) 2.6 ± 0.45 1.87 0.89
Cantharidin 676.65 (668.24~684.96) 1.6 ± 0.36 1.16 0.91
Epigallocatechin gallate 13.13 (10.91~15.35) 2.0 ± 0.33 1.68 0.99
BACE-1 inhibitor IV 1.12 (0.46~1.78) 1.9 ± 0.06 1.23 0.99
a CL denotes confidence limit.
b Pearson χ2, goodness-of-fit test.
또한 상기 분석에서 양성대조군으로 BACE-1 저해제로 알려져 있는 인간 BACE-1 inhibitor IV 및 EGCG을 사용하였다.
IC50 값에 기초하여 분석한 결과, 상기 표 18에 나타낸 바와 같이 본 발명의 화합물 12개 모두는 BACE-1 저해활성을 갖고 있는 것으로 나타났으며, 특히 linolenic acid (28.41 μM), ergosterol (32.80 μM), linoleic acid (37.72 μM), palmitoleic acid (41.84 μM) 및 tryptopol (46.16 μM)은 강력한 BACE-1 저해활성이 있는 것으로 나타났다. 또한, 이들 화합물들의 활성은 EGCG (IC50, 13.13 μM)와 큰 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다.
<실시예 6>
갈색거저리 성충 추출물로부터 분리 및 동정한 본 발명의 화합물들에 대한 아세틸콜린에스테라제 저해활성 분석
본 발명의 화합물들에 대한 알츠하이머병 치료제로서의 사용 가능성을 확인하기 위해, AChE를 저해하는 활성이 있는지를 분석하고, 그 결과를 표 19에 나타내었다. 이를 위해 본 발명에서 분리 및 동정한 화합물들과 AChE 저해제인 Tacrine 및 EGCG을 양성 대조군으로 하여 분석을 수행하고, 그 결과를 표 19에 나타내었다.
Compound IC50, μM (95% CLa) Slope ± SE χ2b P-value
Ergosterol 20.36 (18.84~21.89) 0.9 ± 0.13 1.56 0.85
Linoleic acid 55.42 (49.77~61.07) 1.0 ± 0.21 1.76 0.86
Protocatechuic acid 60.51 (56.60~64.41) 0.8 ± 0.11 1.48 0.87
Oleic acid 71.59 (59.30~83.88) 1.4 ± 0.49 2.29 0.89
linolenic acid 82.44 (72.26~92.62) 1.1 ± 0.29 1.93 0.91
Palmitoleic acid 84.52 (76.42~92.62) 1.0 ± 0.20 1.72 0.91
Tryptophol 95.77 (88.24~103.30) 0.9 ± 0.15 1.59 0.86
Terrein 191.42 (181.91~201.03) 0.8 ± 0.08 1.37 0.94
Stearic acid 301.55 (273.61~329.39) 1.0 ± 0.19 1.69 0.99
Adenosine 325.48 (290.87~360.09) 1.1 ± 0.23 1.80 0.99
Catechin 413.44 (400.91~425.97) 0.7 ± 0.04 1.23 0.97
Cantharidin 647.90 (620.70~675.10) 0.7 ± 0.06 1.31 0.97
Tacrine 0.81 (0.73~0.89) 1.0 ± 0.21 1.77 0.91
EGCG 8.14 (7.45~8.83) 0.9 ± 0.16 1.63 0.93
a CL denotes confidence limit.
b Pearson χ2, goodness-of-fit test.
IC50 값에 기초하여 분석한 결과, 상기 표 19에 나타낸 바와 같이 본 발명의 화합물 12개 모두는 AChE 저해활성을 갖고 있는 것으로 나타났으며, 특히 ergosterol (20.36 μM), linoleic acid (55.42 μM), protocatechuic acid (60.51 μM), oleic acid (71.59 μM) 및 linolenic acid (82.44 μM)은 강력한 AChE 저해활성이 있는 것으로 나타났다. 또한, 이들 화합물들의 활성은 EGCG (IC50, 8.14 μM)와 큰 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 통해, 본 발명에서 동정한 상기 12개의 화합물들이 우수한 BACE-1 및 AChE 저해활성이 있어, BACE-1 또는 AChE으로 인해 유발되는 알츠하이머병과 같은 뇌질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

  1. 다음 단계를 포함하는 갈색거저리 성충으로부터 화합물 8 및 11로 표시되는 BACE-1 (beta-secretase-1) 또는 AChE (acetylcholinesterase)에 대한 저해활성을 갖는 화합물을 분리하는 방법:
    (a) 마쇄된 갈색거저리 성충을 유기용매로 추출하여 갈색거저리 추출물을 얻는 단계;
    (b) 상기 갈색거저리 추출물을 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획시키는 단계; 및
    (c) 분획된 에틸아세테이트 분획물에서 화합물 8; 부탄올 분획물에서 화합물 화합물 11을 분리하는 단계.
    [화합물 8]
    Figure 112019093212854-pat00085


    [화합물 11]
    Figure 112019093212854-pat00086

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  8. 제1항에 있어서, 상기 화합물 8은 에틸아세테이트 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 중압액체크로마토그래피로 분획하고, BACE-1 (beta-secretase-1) 또는 AChE (acetylcholinesterase)에 대한 저해활성이 높은 분획물을 분리한 다음, 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 중압 액체크로마토그래피로 2회 분획하고, 박막크로마토그래피를 수행하여 BACE-1 또는 AChE에 대한 저해활성이 높은 분획물을 분리한 다음, 메탄올과 물을 혼합액(8:2 부피비)을 이동상으로 하여 고속액체크로마토그래피로 분리하는 것을 특징으로 하는 BACE-1 또는 AChE에 대한 저해활성을 갖는 화합물을 분리하는 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 상기 화합물 11은 부탄올 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 중압액체크로마토그래피로 분획하고, BACE-1 (beta-secretase-1) 또는 AChE (acetylcholinesterase)에 대한 저해활성이 높은 분획물을 분리한 다음, 분획물을 클로로포름으로 재결정화시키고, 분리된 액상을 대상으로 하여 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 중압액체크로마토그래피로 분획하고, 박막크로마토그래피를 수행하여 BACE-1 또는 AChE에 대한 저해활성이 높은 분획물을 분리한 다음, 메탄올과 물을 혼합액(8:2 부피비)을 이동상으로 하여 고속액체크로마토그래피로 분리하는 것을 특징으로 하는 BACE-1 또는 AChE에 대한 저해활성을 갖는 화합물을 분리하는 방법.
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김지영 저, ‘갈색거저리의 β-secretase (BACE1) 저해 효과’, 동아대학교 대학원 식품영양학과 석사학위 논문 (2013)* *

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