KR101755097B1

KR101755097B1 - 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR101755097B1
Application number: KR1020150071454A
Authority: KR
Inventors: 박소영; 이재은
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2015-05-22
Publication date: 2017-07-07
Also published as: KR20160137807A

Abstract

본 발명은 아사론 또는 그 유사체(유도체)의 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생 용도에 관한 관한 것이다. 본 발명의 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물은 베타-아밀로이드 응집체의 형성을 억제할 뿐만 아니라 이미 형성된 베타-아밀로이드 응집체를 분해시키는 효과가 있으므로 알츠하이머성 치매의 예방뿐만 아니라 이미 뇌조직에 베타-아밀로이드 응집체가 형성되어 뇌조직이 손상된 환자를 치료할 수 있는 현저한 효과를 발휘한다.

Description

알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Composition for Regeneration of Damaged Brain by Alzheimer's Disease}

본 발명은 아사론 또는 그 유사체(유도체)의 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

치매(dementia)는 정상적인 노화와는 구분해야 할 병적인 현상이며 그 원인에 따라 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease), 혈관성 치매(vascular dementia), 기타 알콜 중독, 외상, 파킨슨병의 후유증으로 오는 치매로 구별된다.

이중, 알츠하이머성 치매의 발병 기전은 명확히 알려져 있지 않으나, 신경독성단백질인 베타-아밀로이드(β-amyloid protein)의 독성이 가장 중요한 원인으로 제시되고 있다. 이 물질은 아밀로이드 전구단백질(APP: amyloid precursor protein)의 잘못된 대사로 인해 생성되는 것으로 알려져 있고, APP의 정상 대사물은 신경세포보호작용이 있는 것으로 보고되고 있다. 최근 유전공학적 방법을 이용한 연구 결과에서는 베타아밀로이드(β-amyloid)등의 독성 단백질이 세포와 혈관에 쌓여 신경세포에 독성을 미침으로써 결과적으로 뇌기능에 장애가 초래된다는 사실이 밝혀졌다

현재까지 치매 치료를 위한 약물 치료는 아세틸콜린 전구체를 투여하거나 아세틸콜린의 분해를 저해하는 약물을 투여하여 뇌의 아세틸콜린 농도를 높여 주는 치료 방법이 사용되어 왔다. 대표적인 약물로는 타크린 (tacrine), 도네페질 (donepezil), 리바스티그민 (rivastigmine), 갈란타민 (galantamine) 등이 있다.

다만, 기존의 치매 치료제는 주로 아세틸콜린에스터라제 억제 효과만을 가지고 있을 뿐, 베타-아밀로이드의 형성 억제 또는 이미 형성된 베타-아밀로이드 응집체의 분해 기능은 없었다.

따라서, 치매의 근원적 치료가 불가능할 뿐만 아니라, 이미 베타-아밀로이드 응집체가 형성된 치매 환자에게는 아무런 효과를 발휘할 수 없었다.

본 발명의 발명자들은 소엽의 알츠하이머성 질환 치료에 대해 연구하던 중 해당 생약에 존재하는 성분 중 알츠하이머성 치매 치료를 위하여 뇌조직의 파괴를 막을 뿐 아니라 문제가 되는 베타-아밀로이드의 분해 기능을 가진 약효 성분의 용도를 발견하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2013-0051142호 대한민국 공개특허 제10-2006-0013016호

본 발명은 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 해결하고자 하는 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 아사론 유도체, 이의 이성체 또는 그 염을 포함하는 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

i) 소엽을 50 %(v/v) 내지 99 %(v/v) 메탄올로 추출하는 단계,

ii) 위 단계에서 얻어진 추출물을 30 %(v/v) 내지 99 %(v/v) 헥산으로 분획하는 단계;

iii) 위 단계에서 얻어진 헥산층을 실리카젤 컬럼크로마토그래피법으로 분리하여 아사론 유도체를 얻는 단계; 및

iv) 위 단계에서 얻어진 아사론 유도체를 환자에게 투여 가능하도록 제형화하는 단계

를 포함하는 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물은 베타-아밀로이드 응집체의 형성을 억제할 뿐만 아니라 이미 형성된 베타-아밀로이드 응집체를 분해하는 효과가 있으므로 알츠하이머성 치매의 예방뿐만 아니라 이미 뇌조직에 베타-아밀로이드 응집체가 형성되어 뇌조직이 손상된 환자를 치료할 수 있는 현저한 효과를 발휘한다.

본 발명은 소엽에서 분리, 동정된 단일 물질의 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생에 관한 최초의 용도를 제시한다.

도 1은 본 발명에 따른 아사론 유도체를 얻기 위한 추출 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 아사론 유도체를 얻기 위하여 헥산 분획물을 분리하는 과정을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 아사론 유도체 중 화합물 1(=compound 1)의 ¹H-NMR을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 아사론 유도체 중 화합물 1의 ¹³C-NMR을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 아사론 유도체 중 화합물 1의 구조를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 아사론 유도체 중 화합물 2(=compound 2)의 ¹H-NMR을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 아사론 유도체 중 화합물 2의 ¹³C-NMR을 나타낸 도이다.
도 8는 본 발명에 따른 아사론 유도체 중 화합물 2의 구조를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 아사론 유도체 중 화합물 3(=compound 3)의 ¹H-NMR을 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에 따른 아사론 유도체 중 화합물 3의 ¹³C-NMR을 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명에 따른 아사론 유도체 중 화합물 3의 구조를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명에 따른 아사론 유도체 중 화합물 4(=compound 4)의 ¹H-NMR을 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명에 따른 아사론 유도체 중 화합물 4의 ¹³C-NMR을 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명에 따른 아사론 유도체 중 화합물 4의 구조를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명에 따른 아사론 유도체 중 화합물 5(=compound 5)의 ¹H-NMR을 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명에 따른 아사론 유도체 중 화합물 5의 ¹³C-NMR을 나타낸 도이다.
도 17은 본 발명에 따른 아사론 유도체 중 화합물 5의 구조를 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명에 따른 아사론 유도체의 농도 구배에 따른 베타-아밀로이드 응집 억제 효과를 측정한 도이다.
도 19는 본 발명에 따른 아사론 유도체의 베타-아밀로이드 응집 분해 효과를 나타낸 도이다.
도 20은 본 발명에 따른 아사론 유도체가 세포 독성을 나타내지 않음을 확인한 도이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명은 아사론 유도체, 이의 이성체 또는 그 염을 포함하는 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 정의되는 아사론 유도체는 벤젠 고리의 2번, 4번, 5번 위치가 메톡시기로 치환되고, 위 벤젠 고리의 1번 위치에 치환기를 갖는 화합물 또는 임의적으로 벤젠 고리의 2번, 3번 위치가 메톡시기로 치환되고, 5번 위치에 치환기를 갖는 화합물 의미한다. 본 명세서에서 지칭하는 아사론 유도체에는 α- 및 β- 아사론(α-asarone 및 β-asarone)이 포함된다.

본 발명의 아사론 유도체는 2,3-디메톡시-5-[(1E)-1-프로펜-1-일]-페놀(화합물 1, compound 1), β-아사론(화합물 2, compound 2), 2,4,5-트리메톡시-벤젠아세트알데하이드(화합물 3, compound 3), 아사론알데하이드 (화합물 4, compound 4), α-아사론(화합물 5, compound 5)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하고, 2,3-디메톡시-5-[(1E)-1-프로펜-1-일]-페놀 및 2,4,5-트리메톡시-벤젠아세트알데하이드가 특히 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서 2,3-디메톡시-5-[(1E)-1-프로펜-1-일]-페놀과 2,4,5-트리메톡시-벤젠아세트알데하이드는 베타-아밀로이드의 응집억제력과 응집 해체력이 우수할 뿐만 아니라 다른 아사론 유도체에 비해서도 낮은 세포 독성을 보였다(도 18 내지 20 참조).

본 발명의 약제학적 조성물 중의 약효 물질은 2,3-디메톡시-5-[(1E)-1-프로펜-1-일]-페놀, β-아사론, 2,4,5-트리메톡시-벤젠아세트알데하이드, 아사론알데하이드, α-아사론 이의 이성체 또는 그 염을 단독으로 포함하더라도 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생의 효과를 발휘할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 약제학적 조성물 중의 약효 물질은 2,3-디메톡시-5-[(1E)-1-프로펜-1-일]-페놀 이의 이성체 또는 그 염만을 포함하더라도 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생의 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 구체적으로, 본 발명의 약제학적 조성물 중의 약효 물질은 β-아사론 이의 이성체 또는 그 염 만을 포함하더라도 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생의 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 구체적으로, 본 발명의 약제학적 조성물 중의 약효 물질은 2,4,5-트리메톡시-벤젠아세트알데하이드 이의 이성체 또는 그 염 만을 포함하더라도 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생의 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 구체적으로, 본 발명의 약제학적 조성물 중의 약효 물질은 아사론알데하이드 이의 이성체 또는 그 염만을 포함하더라도 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생의 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 구체적으로, 본 발명의 약제학적 조성물 중의 약효 물질은 α-아사론 이의 이성체 또는 그 염만을 포함하더라도 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생의 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 아사론 유도체의 염은 무기산, 유기산, 무기 염기 또는 유기 염기와의 생리학적으로 허용되는 염일 수 있다.

상기 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산 및 인산이 예시될 수 있고, 유기산은 구연산 (citric acid), 초산, 젖산, 주석산 (tartariac acid), 말레인산, 푸마르산 (fumaric acid), 포름산, 프로피온산 (propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등이 예시될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용하는 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease)란 알츠하이머 질환으로 야기되는 치매, 즉, 베타-아밀로이드가 뇌조직에 침착되어 발병하는 치매를 의미하며, 베타-아밀로이드의 침착으로 야기된 치매라면 본원 발명의 권리범위에 포함된다.

본 발명에 따른 아사론 유도체를 포함하는 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물은 인간을 포함한 동물에 적용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 아사론 유도체는 화학적 합성법에 의해 제조되거나 소엽(Perilla frutescens)에서 추출하여 수득할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 아사론 유도체를 소엽으로부터 분리하였다.

소엽(蘇葉; Perilla Leaf)은 꿀풀과에 속하는 1년생 초본 식물로서 차조기(Perilla frutescens var. acuta KUDO.)의 잎이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 아사론 유도체를 추출법에 의해서 수득하는 경우 그 추출법은 냉침추출법, 온침추출법, 열 추출법, 초음파 추출법 등일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 아사론 유도체의 분리는 메탄올 및 헥산을 순차적인 용매로 적용하여 달성할 수 있다.

상기 분리에 이용되는 메탄올은 바람직하게는 50 %(v/v) 내지 99 %(v/v)의 희석수가 바람직하다.

구체적으로, 소엽의 메탄올 추출물은 추출 후, 소엽 찌꺼기를 제거하고, 필터 페이퍼로 여과한 후 여액을 진공회전농축기 또는 진공건조기를 사용하여 농축한 후, 실온에서 보관할 수 있다.

상기 소엽의 메탄올 추출물은 헥산을 이용하여 동시 또는 순차적으로 분획과정을 더 실시한다.

상기 헥산은 바람직하게는 30 %(v/v) 내지 99 %(v/v) 수용액인 것이 좋다.

상기 분획과정을 수행하여 수득한 분획 추출물은 진공회전농축기 또는 진공건조기를 사용하여 농축한 후, 실온에서 보관할 수 있다.

상기 헥산으로 분획하여 얻어진 헥산층은 실리카젤 컬럼크로마토그래피법을 통해 분리할 수 있다.

상기 컬럼크로마토그래피법에 사용되는 용매는 제한되지 않으나, 바람직하게는 n-헥산, 에틸아세테이트(EtOAc), 메탄올을 예로 들 수 있다.

상기 실리카젤 컬럼크로마토그래피법은 용매의 농도구배법(gradient method) 또는 등용매분리법(isocratic method)을 적용할 수 있으며, 당업자는 그 용매의 극성등 물리 화학적 성질에 따라 적절히 적용할 수 있다.

본 발명에 따른 아사론 유도체는 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌조직 재생에 탁월한 용도를 제공한다.

본 발명의 한 실시예에서 아사론 유도체의 베타-아밀로이드 응집 억제능을 측정한 결과, 농도 의존적으로 베타-아밀로이드 응집을 억제하는 것을 알 수 있었다(도 18 참조).

따라서 본 발명의 아사론 유도체, 이의 이성체 또는 그 염을 포함하는 약제학적 조성물은 알츠하이머성 치매가 더 악화되는 것을 막을 수 있고, 그 질병이 발생하는 것을 예방할 수 있다.

또한, 본 발명의 한 실시예에서 아사론 유도체의 베타-아밀로이드 응집체 해체능을 측정한 결과, 효과적으로 이미 생성된 베타-아밀로이드를 분해하는 것을 알 수 있었다(도 19 참조). 특히 2,3-dimethoxy-5-(1E)-1-propen-1-yl-phenol (화합물 1)과, 2,4,5-trimethoxy-benzeneacetaldehyde (화합물 3)의 활성이 가장 뛰어났다. 따라서, 본 발명의 아사론 유도체, 이의 이성체 또는 그 염을 포함하는 약제학적 조성물은 알츠하이머성 치매가 이미 발병하여 뇌 조직이 손상된 환자에 대하여도 그 치료 효과를 기대할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여량은 투여 방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 1일 유효 성분을 기준으로 하였을 때 0.1 mg/kg(체중) 내지 500 mg/kg(체중), 바람직하게는 0.1 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 더 바람직하게는 0.1 mg/kg(체중) 내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있고, 상기 투여는 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 불활성 담체, 희석제, 또는 이들 둘 다를 포함하여 제형화 될 수 있다.

상기 불활성 담체 또는 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 옥수수전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 시트르산, 타르타르산, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, pH 조절제, 영양제, 비타민, 전해질, 알긴산 및 그의 염, 펙트산 및 그의 염, 보호성 콜로라이드, 글리세린, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 위에 예시된 담체, 희석제를 포함한 첨가제를 포함하여 경구 또는 비경구 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여를 위한 제제에는 정제, 캡슐제, 환제, 산제, 과립제, 현탁화제 및 시럽제 등이 포함된다. 비경구투여를 위한 형태는 크림제, 로션제, 연고제, 액제, 겔제, 카타플라스마제, 패취제, 에어로솔제, 유동엑스제, 엘릭서, 침제, 향낭, 주사제 등의 형태일 수 있다.

이 경우, 상기 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물 내 아사론 유도체의 함량은 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 0.1 중량% 내지 99 중량% 또는 1 중량% 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 조성물의 사용태양 및 사용방법에 따라 상기 화합물의 함량은 바람직한 함량으로 적절히 조절하여 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물은 상기 유효 성분 이외에 공지의 치매 치료 효과가 있는 것으로 당업계에 알려진 물질, 일 예로 타크린 (tacrine), 도네페질 (donepezil), 리바스티그민 (rivastigmine), 갈란타민 (galantamine)등의 물질을 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 소엽 추출물 및 분획 추출물의 제조

1. 소엽의 메탄올 추출물의 제조

불순물이 제거된 소엽 5kg에 95% 메탄올(SAM MO585)을 가하여 24시간 상온에 침지시킨 후 여과지(ADVANTEC 5A 150mm)로 여과한 여액을 진공회전농축기 (EYELA)를 사용하여 농축하였고, 이 과정을 3번 반복하여 308 g의 추출물을 얻었다.

2. 소엽의 분획 추출물의 제조

상기 농축된 소엽 메탄올 추출물을 메탄올90ml와 물 900ml로 완전히 현탁시켜 Separatory Funnel (labdia 5000ml)에 옮겨 넣은 후, 용매의 극성 차이를 이용하여 n-헥산과 물의 순서로 분획한 후, 각각을 감압 농축하여 분획 추출물을 얻었다. n-헥산 53.6 g, 헥산 침전물 57.9 g, chloroform 5.6 g, EtOAc 16.9 g, 그리고 물 층 119 g 을 얻었다.

실시예 2. 화합물 1 내지 5의 분리 정제

상기 분획한 헥산층 추출물(53.6 g)을 더 분획하기 위해 실리카젤 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 추출물에 실리카 200 g을 흡착시켜서 건조시키고 따로 컬럼에 실리카 350 g을 100% n-헥산 1 L 에 녹여 슬러리 상태가 되도록 하면서 충진시켰다.. 그 후에 건조된 헥산층 추출물을 부어주고 n-헥산 : EtOAc = 20 : 1, 10 : 1, 5 : 1, 1 : 1 의 용매조건으로 각각 2 L 씩 흘려주었다. 총 7개의 fraction 이 나왔으며 그 중 3번 fraction (6 g) 의 2 g을 medium pressure liquid chromatography (MPLC, Biotage) 로 50 % MeOH isocratic 을 수행하여 5개의 fraction 을 얻었다. 그 중 5번 fraction 은 순수한 단일 물질인 α-asarone (200 mg) 이었다 (화합물 5). 3번 fraction 은 5번 fraction 과 같은 조건으로 MPLC 를 진행하였고, TLC (Thin layer chromathgraphy, Merck) 를 이용해 6개의 fraction 으로 나누었으며 그 중 4번 fraction 은 단일 물질로 화합물 1 (22.7 mg) 을 얻었다. 2번 fraction 은 prep HPLC (20 -100 % ACN) 을 통해 화합물 3 (0.9 mg) 과 화합물 4 (6.6 mg) 을 얻었으며, 6번 fraction 에서 prep HPLC (40 % ACN, isocratic) 을 통해 β-asarone (1.0 mg) 을 얻었다 (화합물 2).

실시예 3. 화합물 1의 구조 동정

화합물 1은 ¹H NMR에서는 2개의 아로마틱 프로톤인 δ 6.50 (1H, d, J = 0.7 Hz), δ 6.50 (1H, d, J = 0.7 Hz) 과 2개의 올레피닉 프로톤인 δ 6.27 (1H, dd, J = 1.4, 15.4 Hz), δ 6.14 (1H, dq, J = 7.0, 15.8 Hz)을 확인하였고, 2개의 메톡실 프로톤 인 δ 3.83 (3H, s), δ 3.78 (3H, s) 과 메틸 프로톤 δ 1.85 (3H, dd, J = 1.4, 6.7 Hz)을 나타내었다. ¹³C NMR 에서는 4개의 4가 탄소인 δ 153.3, δ 149.5, δ 134.9, δ 134.9 와 4개의 sp2 메틴(methine) 탄소 인 δ 127.4, δ 126.6, δ 107.6, δ 104.8을 확인하였다. 2개의 아로마틱 메톡실 탄소 인 δ 60.6, δ 56.8 과 1개의 메틸 탄소 인 δ 17.2 도 확인하였다. NMR 결과를 참고문헌과 비교한 결과 화합물 1은 2,3-디메톡시-5-[(1E)-1-프로펜-1-일]-페놀로 확인되었다. 화합물 1 은 자소엽에서 처음으로 분리된 물질이다.

실시예 4. 화합물 2의 구조 동정

화합물 2는 흰색의 가루로 분리되었다. ¹H NMR에서는 2개의 아로마틱 프로톤 인 δ 6.68 (1H, s), δ 6.88 (1H, s) 과 2개의 올레피닉 프로톤 인 δ 6.44 (1H, dq, J = 2.1, 11.6 Hz), δ 5.71 (1H, dq, J = 7.0, 11.9 Hz)을 확인하였고, 3개의 메톡실 프로톤 인 δ 3.81 (3H, s), δ 3.88 (3H, s), δ 3.80 (3H, s) 과 메틸 프로톤 δ 1.83 (3H, dd, J = 2.1, 7.0 Hz)을 나타내었다. ¹³C NMR 에서는 4개의 4가 탄소 인 δ 152.0, δ 149.0, δ 142.3, δ 118.2 와 4개의 sp2 메틴 탄소 인 δ 124.7, δ 124.6, δ 114.9, δ 97.9을 확인하였다. 3개의 아로마틱 메톡실 탄소 인 δ 56.2, δ 55.4, δ 55.3 과 1개의 메틸 탄소 인 δ 13.5를 확인하였다. NMR 결과를 참고문헌과 비교한 결과 화합물 2는 β-아사론 으로 확인, 동정하였다.

실시예 5. 화합물 3의 구조 동정

화합물 3은 연한 노란색의 가루로 분리되었다. ¹H NMR에서는 2개의 아로마틱 프로톤 인 δ 7.08 (1H, s), δ 6.66 (1H, s) 과 2개의 올레피닉 프로톤 인 δ 6.85 (1H, dt, J = 1.4, 16.1 Hz), δ 6.25 (1H, dt, J = 6.3, 16.1 Hz)을 확인하였고, 3개의 메톡실 프로톤 인 δ 3.88 (3H, s), δ 3.84 (3H, s), δ 3.82 (3H, s) 과 메틸렌 프로톤 δ 4.22 (2H, dd, J = 1.4, 6.3 Hz)을 나타내었다. ¹³C NMR 에서는 4개의 4가 탄소 인 δ 153.1, δ 150.3, δ 144.1, δ 117.7 와 4개의 sp2 메틴 탄소인 δ 128.6, δ 125.8, δ 110.7, δ 97.4을 확인하였다. 3개의 아로마틱 메톡실 탄소 인 δ 56.0, δ 55.6, δ 55.2 과 1개의 메틸렌 탄소 인 δ 62.9를 확인하였다. HMBC, HMQC, COSY를 통해 프로톤 과 proton, 탄소 과 탄소 의 관계와 NMR 결과를 참고문헌과 비교한 결과 화합물 3은, 2,4,5-트리메톡시-벤젠아세트알데하이드로 확인, 동정하였다. 화합물 3은 천연에서는 처음으로 분리된 물질이다.

실시예 6. 화합물 4의 구조 동정

화합물 4는 흰색의 가루로 분리되었다. ¹H NMR에서는 2개의 아로마틱 프로톤 인 δ 7.28 (1H, s), δ 6.73 (1H, s) 과 1개의 올레피닉 프로톤 인 δ 10.2 (1H, s)을 확인하였고, 3개의 메톡실 프로톤 인 δ 3.97 (3H, s), δ 3.96 (3H, s), δ 3.82 (3H, s) 을 나타내었다. ¹³C NMR 에서는 4개의 4가 탄소 인 δ 159.4, δ 156.8, δ 143.6, δ 116.7 와 3개의 sp2 메틴인 δ 188.4, δ 109.0, δ 96.3 그리고 3개의 아로마틱 메톡실 탄소 인 δ 55.5, δ 55.4, δ 55.4 를 확인하였다. NMR 결과를 참고문헌과 비교한 결과 아사론알데하이드로 확인, 동정하였다.

실시예 7. 화합물 5의 구조 동정

화합물 5 는 흰색의 가루로 분리되었다. ¹H NMR에서는 2개의 아로마틱 프로톤 인 δ 7.01 (1H, s), δ 6.62 (1H, s) 과 2개의 올레피닉 프로톤 인 δ 6.62 (1H, dq, J = 2.1, 14.0 Hz), δ 6.11 (1H, dq, J = 6.3, 15.4 Hz)을 확인하였고, 3개의 메톡실 프로톤 인 δ 3.85 (3H, s), δ 3.81 (3H, s), δ 3.80 (3H, s) 과 메틸 프로톤 δ 1.86 (3H, dd, J = 2.1, 6.7 Hz)을 나타내었다. ¹³C NMR 에서는 4개의 4가 탄소 인 δ 151.1, δ 149.0, δ 143.2, δ 119.0 와 4개의 sp2 메틴인 δ 125.0, δ 123.1, δ 110.5, δ 98.1에서 확인하였다. 3개의 아로마틱 메톡실 탄소 인 δ 56.0, δ 55.6, δ 55.2 과 1개의 메틸 탄소 인 δ 17.5를 확인하였다. Compound 5는 화합물 2와 J value 에서만 차이를 보이는 기하 이성질체 관계임을 알 수 있었고, NMR 결과를 참고문헌과 비교한 결과 α-아사론으로 확인, 동정하였다.

실험예 1. 아사론 유도체의 베타-아밀로이드 응집 억제 효과

상기 실시예 2에서 분리한 아사론 유도체(화합물 1 내지 5)에 대하여 Thioflavin T 형광 실험법을 이용하여 Aβ의 응집 억제 효과를 측정하였다. 우선, Aβ(1-42)를 DMSO에 1 mM의 농도로 녹인 후 50 μl의 증류수로 희석하였다. 이렇게 준비된 20 μM Aβ(1-42)에 100, 20, 및 4 μg/ml 의 농도로 아사론 유도체를 처리한 뒤 37℃에서 24시간 배양시켰다. Thioflavin T를 100 mM 글라이신 버퍼(pH 8.5)에 300 μM 농도로 녹여 준비한 다음, 사용 전 50배로 희석하여 6 μM Th T를 만든 후 배양이 끝난 시료 50 μl에 최종 농도가 3 μM가 되도록 50 μl의 6 μM Th T를 처리하여 상온에서 30분 방치한 뒤 Multi mode microplate reader(Biotek Instruments, Winooski, USA)를 이용하여 excitation 442 nm와 emission 485 nm에서 형광 값을 측정하였다.

그 결과 아사론 유도체들(화합물 1 내지 5)은 모두 농도 의존적으로 베타-아밀로이드의 응집을 억제한다는 것을 알 수 있었다(도 18 참조).

실험예 2. 아사론 유도체의 베타-아밀로이드 응집 분해 효과

상기 실시예 2에서 분리한 아사론 유도체에 대하여 Thioflavin T 형광 실험법을 이용하여 Aβ의 응집 분해 효과를 측정하였다. 우선, Aβ(1-42)를 DMSO에 1 mM의 농도로 녹인 후 50 μl의 증류수로 희석하였다. 이렇게 준비된 20 μM Aβ(1-42)를 37℃에서 24시간 배양시킨 뒤 상기 실시예 2에서 얻은 아사론 유도체들(화합물 1 내지 5)을 100, 20, 4 μg/ml 의 농도로 처리한 뒤 37℃에서 24시간 추가 배양시켰다. Thioflavin T를 100 mM glycine buffer(pH 8.5)에 300 μM 농도로 녹여 준비한 다음, 사용 전 50배로 희석하여 6 μM Th T를 만든 후 배양이 끝난 시료 50 μl에 최종 농도가 3 μM이 되도록 50 μl의 6 μM Th T를 처리하여 상온에서 30분 방치한 뒤 Multi mode microplate reader(Biotek Instruments, Winooski, USA)를 이용하여 excitation 442 nm와 emission 485 nm에서 형광 값을 측정하였다.

그 결과 아사론 유도체들(화합물 1 내지 5)은 모두 농도 의존적으로 응집된 베타-아밀로이드의 양을 감소시킨 것을 알 수 있었다. 즉, 상기 아사론 유도체들의 베타-아밀로이드 응집 분해 효과를 확인하였다(도 19 참조).

실험예 3. 아사론 유도체의 독성 확인

아사론 유도체들이 신경세포의 사멸을 유발하는지 알아보기 위해 MTT assay를 시행 하였다. 96well에 PC12세포를 6x10⁴개로 plating 하고 아사론 유도체(화합물 1 내지 5)을 각각 100, 20 및 4 μg/ml의 농도로 섞어 준 뒤 24시간 배양 시킨 후 세포에 처리하였다. 세포에 아사론 유도체를 처리하고 24시간 지난 후 5 mg/ml 농도의 MTT 용액을 넣고 3시간 추가 배양하였다. 세포를 용해시키기 위해 배지를 제거하고 DMSO 100 ?L 를 넣은 후에 상온에서 30분 방치 후 Emax precision microplate reader (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 α-아사론 (compound 5)의 경우 100 ug/mL 의 농도에서는 세포 독성이 나타났으나 낮은 농도에서는 독성이 나타나지 않았으며 다른 아사론 유도체는 실험한 모든 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다(도 20 참조).

Claims

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아사론 유도체 또는 그 염을 포함하는 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물에 있어서,
상기 아사론 유도체는 2,3-디메톡시-5-[(1E)-1-프로펜-1-일]-페놀, 2,4,5-트리메톡시-벤젠아세트알데하이드 및 아사론알데하이드로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물.
청구항 2에 있어서,
상기 아사론 유도체는 2,3-디메톡시-5-[(1E)-1-프로펜-1-일]-페놀인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 약제학적 조성물 중의 약효 물질은 2,3-디메톡시-5-[(1E)-1-프로펜-1-일]-페놀 만을 함유하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물.
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청구항 2에 있어서,
상기 아사론 유도체는, 2,4,5-트리메톡시-벤젠아세트알데하이드인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물.
청구항 7에 있어서,
상기 약제학적 조성물 중의 약효 물질은 2,4,5-트리메톡시-벤젠아세트알데하이드 만을 함유하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물.
청구항 2에 있어서,
상기 아사론 유도체는 아사론알데하이드 인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물.
청구항 9에 있어서,
상기 약제학적 조성물 중의 약효 물질은 아사론알데하이드 만을 함유하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물.
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청구항 2에 있어서,
상기 염은 무기산, 유기산, 무기 염기 또는 유기 염기와의 생리학적으로 허용되는 염인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물.
청구항 2에 있어서,
상기 아사론 유도체가 소엽(Perilla frutescens)에서 분리된 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물.
청구항 14에 있어서,
상기 아사론 유도체의 분리는 소엽을 메탄올 및 헥산을 순차적인 용매로 적용하여 달성되는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물.
청구항 15에 있어서,
상기 아사론 유도체는 헥산으로 분획하여 얻어진 헥산층을 실리카젤 컬럼크로마토그래피법을 통해 분리한 아사론 유도체인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물.
청구항 16에 있어서,
상기 실리카젤 컬럼크로마토그래피법은 용매의 농도구배법(gradient method) 또는 등용매분리법(isocratic method)을 통해 분리하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물.
청구항 2에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 불활성 담체, 희석제, 또는 이들 둘 다를 포함하는, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물.
청구항 2에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구형 제제로 제형화된 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물.
청구항 19에 있어서,
상기 경구형 제제는 정제, 캡슐제, 환제, 산제, 과립제, 현탁화제 또는 시럽제이고,
상기 비경구형 제제는 크림제, 로션제, 연고제, 액제, 겔제, 카타플라스마제, 패취제, 에어로솔제, 유동엑스제, 엘릭서, 침제, 향낭 또는 주사제인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물.
청구항 2에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 타크린 (tacrine), 도네페질 (donepezil), 리바스티그민 (rivastigmine), 갈란타민 (galantamine)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 약효 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물.
i) 소엽을 50 %(v/v) 내지 99 %(v/v) 메탄올로 추출하는 단계,
ii) 위 단계에서 얻어진 추출물을 30 %(v/v) 내지 99 %(v/v) 헥산으로 분획하는 단계;
iii) 위 단계에서 얻어진 헥산층을 실리카젤 컬럼크로마토그래피법으로 분리하여 제2항의 아사론 유도체를 얻는 단계; 및
iv) 위 단계에서 얻어진 아사론 유도체를 환자에게 투여 가능하도록 제형화하는 단계
를 포함하는 제2항에 따른 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌 조직 재생용 약제학적 조성물의 제조방법.