KR100469612B1 - 흰씀바귀로부터 추출된 세스퀴테르펜 락톤계 화합물 및이를 함유하는 심혈관 질환 및 암 치료용 조성물 - Google Patents

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KR100469612B1 KR10-2003-0007237A KR20030007237A KR100469612B1 KR 100469612 B1 KR100469612 B1 KR 100469612B1 KR 20030007237 A KR20030007237 A KR 20030007237A KR 100469612 B1 KR100469612 B1 KR 100469612B1
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Abstract

본 발명은 흰씀바귀(lxeris dentataformaalbiflora)로부터 분리한 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(Acyl-CoA: Cholesterol Acyltransferase: ACAT) 및 파네실 단백질 트랜스퍼라제(Farnesyl Protein Transferase: FPT)의 활성을 저해하는 하기 화학식 1의 세스퀴테르펜 락톤계(sesquiterpene lactone) 화합물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 하기 화학식 1의 세스퀴테르펜 락톤계 화합물은 동맥경화, 고혈압, 협심증, 고지혈증, 심근경색 또는 심부전 등의 심혈관 질환 및 췌장암, 방광암, 폐암 및 피부암 등의 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
<화학식 1>

Description

흰씀바귀로부터 추출된 세스퀴테르펜 락톤계 화합물 및 이를 함유하는 심혈관 질환 및 암 치료용 조성물 {Sesquiterpene lactone compound extracted from Ixeris dentata forma albiflora and composition for treating cardiovascular disease and cancer containing the same}
본 발명은 세스퀴테르펜 락톤계 화합물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 흰씀바귀로부터 추출된 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(Acyl-CoA: Cholesterol Acyltransferase: ACAT) 및 파네실 단백질 트랜스퍼라제(Farnesyl Protein Transferase: FPT) 저해 활성을 갖는 세스퀴테르펜 락톤계 화합물 및 심혈관 질환 및 암의 예방 및 치료제로서의 이의 용도에 관한 것이다.
<화학식 1>
심혈관 질환(cardiovascular disease)은 미국 및 유럽에서 사망의 주된 원인으로 알려져 있으며, 한국인에서도 빈번하게 발생되고 있는 질병 중 하나이다. 심혈관 질환의 원인이 되는 인자로는 유전성 소인, 성별, 흡연, 생활 방식 및 연령 등을 들 수 있다. 특히, 저밀도 지단백질 콜레스테롤(Low Density Lipoprotein cholesterol; 이하 'LDL-콜레스테롤'이라 함) 및 총 콜레스테롤의 증가에 의한 고콜레스테롤 혈증(hypercholesterolemia)은 심혈관 질환 발생의 주된 원인이 된다. 따라서, 혈중 LDL-콜레스테롤 및 총 콜레스테롤 수치를 저하시킨다면 동맥경화 및 심근경색과 같은 심혈관 질환의 발생을 감소시킬 수 있다.
혈중 LDL-콜레스테롤 및 총 콜레스테롤 수치를 저하시키는 데 사용되는 콜레스테롤 저하제로 니코틴산(nicotinic acid), 콜레스티라민(cholestyramine), 클로피브레이트(clofibrate; CPIB), 네오마이신(neomycin), 식물 스테롤(plant sterols), 트리파라놀(triparanol; MER-29), D-티록신(D-thyroxine) 및에스트로겐(estrogen) 등과 같은 약물들이 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 약물들은 많은 문제점들이 보고되어지고 있다. 즉, 피부혈관확장, 발진, 위장관 이상, 요산혈증, 고혈당증, 간기능 이상과 같은 부작용을 유발하거나, 과량의 투여에 따른 불쾌감을 유발한다고 알려져 있어 사용이 제한되고 있는 실정이다. 최근에는 로바스타틴(lovastatin)류와 같은 HMG-CoA 환원효소(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase)의 활성을 억제하는 저해제가 개발되어 콜레스테롤 저하제로 사용되고 있다(Hunninghake,Curr. Opin. Lipidol., 3:22-28, 1992; Brownet al.,N. Engl. J. Med., 323:1289-1298, 1990). 그러나, 로바스타틴류와 같은 HMG-CoA 환원효소 활성 저해제들은 강력한 저해효과가 있음에도 불구하고, 근병증(myopathy), 횡문근분해(rhabdomyolysis), 자살충동(suicidal tendency)의 증가, 노이로제(신경증, neurosis) 등과 같은 부작용을 유발한다고 알려져 있다(Corpieret al.,JAMA, 260:239-241, 1988; Pierceet al.,JAMA, 264:71-75, 1990; Reaven and Witztum,Ann. Intern. Med., 109:597-598, 1988; Duits and Bos,Lancet, 341:114, 1993; Engelberg,Lancet, 339:727-729,1992). 따라서, 부작용이 없으면서도 기존 치료제의 문제점을 보완할 수 있는 새로운 형태의 심혈관 질환 치료제에 대한 요구가 증가되고 있다.
한편, 암(Cancer) 역시 미국, 유럽뿐만 아니라, 한국에서 빈번하게 발생하고 있는 질환으로서 현재 약 50여 종류의 항암제가 사용되고 있다. 그러나, 이러한 항암제는 분열이나 증식이 빠른 세포에는 모두 작용하므로 정상적으로 세포분열이 왕성한 세포(골수세포, 위장관 상피세포, 모낭)에도 피해를 입혀 정도의 차이는 있으나 골수억제, 위장장애, 탈모 등의 부작용이 거의 모든 환자에서 발생한다고 알려져 있다. 따라서, 역시 부작용이 없으면서도 기존 치료제의 문제점을 보완할 수 있는 새로운 형태의 항암제에 대한 개발이 요구되고 있다.
세스퀴테르페노이드(sesquiterpenoid)는 테르페노이드(terpenoid) 화합물의 일종으로서, 다양한 식물에 광범위하게 분포되어 있으며 100종 이상의 기본 골격이 밝혀져 있는 화합물이다. 이들 세스퀴테르페노이드 화합물 중에서 특히, 락톤 구조를 갖고 있는 세스퀴테르펜 락톤(sesquiterpene lactone)계 화합물은 다양한 생리작용이 보고된 식물 천연 화합물군의 하나이다. 이 화합물군의 생리활성으로는 항종양활성, 세포독성, 항균작용 및 살충작용 등이 알려져 있으며, 위장세포의 보호작용이나 진통작용 등과 같은 약리활성도 보고된 바 있다.
국화과 식물에는 대부분 이러한 세스퀴테르펜 락톤계 화합물이 함유되어 있다고 알려져 있는데, 목향에서 세스퀴테르펜 락톤계 화합물 중 하나인 코스투놀리드(costunolide)가 분리된 바 있으며(Kanget al.,Kor. J. Pharmacogn., 30:137-144, 1999), 특히, 구절초와 산국 등에서 분리된 헤미스텝신 A/S(hemistepsin A/S), 안제로일쿠맘브린 B(angeloylcumambrin B), 쿠맘브린 A/B(cumambrin A/B), 트리그로일쿠맘브린 B(trigloylcumambrin B), 툴피놀리드(tullphinolide), 코스투놀리드(costunolide), 헨델린(hendelin) 등의 세스퀴테르펜 락톤계 화합물은 ACAT 활성과 FPT 활성을 동시에 억제하는 기능을 갖는다고 보고되어 있다(Yanget al.,Kor. J. Pharmacogn., 29(3):243-247, 1998; Janget al.,Kor. J. Pharmacogn.,30(1):74-78, 1999; Janget al.,Kor. J. Pharmacogn., 30(1):70-73, 1999; Khalilet al.,Planta Medica., 57:190, 1991).
씀바귀(Ixeris dentataNAKAI)는 국화과에 속하는 다년생초로서 헥세놀을 포함한 80여 종류의 휘발성 풍미 정유성분을 포함하고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 씀바귀는 식용적인 면에서 손색이 없을 뿐만 아니라 특유하고 다양한 풍미 때문에 우리나라 식생활에서 중요한 비중을 차지하고 있다. 또한, 민간에서는 예로부터 강장보호, 식욕부진, 위염, 진정, 진통, 축농증, 해열 등에 사용되어져 왔고, 최근에는 사람의 골육암 세포를 억제시키는 항암 효과와 콜레스테롤을 저하시키는 효능이 크다고 알려져 있다. 또한, 항산화, 항스트레스, 항박테리아, 면역증강, 장기능 회복 및 체중조절에 대한 효과가 있음도 보고되어 있다(대한민국 특허출원 제 2001-3744호).
이와 같이 다양한 기능을 갖고 있는 씀바귀에는 화학성분으로 다량의 비타민 A, 다당류인 이눌린, 알코올류, 에스테르류, 알데히드류, 케톤류, 하이드로카본류, 엑시드류, 페놀류 및 플라보노이드류 등과 구아이안계의 세스퀴테르펜 락톤계 화합물 배당체 성분이 함유되어 있다고 보고되어 있다(Kimet al.,J. Korean Agric. Chem. Soc., 31(4):394-399, 1988; Chunget al.,Arch. Pharm. Res., 17(5):327, 1994). 노란색 꽃이 피는 것을 씀바귀, 흰색 꽃이 피는 것을 흰씀바귀(Ixeris dentataformaalbiflora)라고 하는데, 아직까지 흰씀바귀에 대한 화학 분석적 연구나 생리활성 및 임상 효과에 대해서는 연구가 미흡한 편이다.
이에 본 발명자들은 오랜 동안 사용되어 안정성이 확보된 천연 생약재로부터 혈중 콜레스테롤 농도를 저하시키고 항암 활성을 갖는 물질을 발견하기 위해 연구 하던 중, 한국에서 자생하는 흰씀바귀(lxeris dentataformaalbiflora)로부터 세스퀴테르펜 락톤계의 신규한 화합물을 분리하여 이의 이화학적 특성을 규명하고 상기 화합물이 ACAT 및 FPT 저해 활성을 갖고 있어 심혈관 질환 및 암의 예방 및 치료제로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 ACAT 및 FPT 저해제로서 우수한 효과를 나타내는 신규한 세스퀴테르펜 락톤계 화합물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 화합물을 유효 성분으로 포함하는 심혈관 질환 및 암의 예방 및 치료제로 사용될 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
도 1은 흰씀바귀 근경으로부터 추출된 아세틸화된 본 발명의 세스퀴테르펜 락톤계 화합물에 대한 핵자기공명(NMR) 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 것이고,
도 2는 흰씀바귀 근경으로부터 추출된 아세틸화된 본 발명의 세스퀴테르펜 락톤계 화합물에 대한 적외선(IR) 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 3β-O-(6'-p-하이드록시페닐아세틸-β-D-글루코피라노실)-8β-하이드록시구아이안-4(15),10(14),11(13)-트리엔-6,12-올라이드(3β-O-(6'-p-hydroxyphenylacetyl-β-D-glucopyranosyl)-8β-hydroxyguaian-4(15),10(14),11(13)-triene-6,12-olide)를 제공한다.
<화학식 1>
상기 본 발명의 화합물은 흰씀바귀를 알콜 용매로 추출하고, 추출액을 농축하고, 농축액을 분배 추출하고 정제하여 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효 성분으로 포함하는 심혈관 질환 암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
상기 심혈관 질환은 동맥경화, 고혈압, 협심증, 고지혈증, 심근경색 및 심부전 등을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효 성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
상기 암은 췌장암, 방광암, 폐암 및 피부암 등을 포함한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물, 3β-O-(6'-p-하이드록시페닐아세틸-β-D-글루코피라노실)-8β-하이드록시구아이안-4(15),10(14),11(13)-트리엔-6,12-올라이드(3β-O-(6'-p-hydroxyphenylacetyl-β-D-glucopyranosyl)-8β-hydroxyguaian-4(15),10(14),11(13)-triene-6,12-olide)는 본 분야에서 통상적으로 사용되는 공지의 방법에 의해 흰씀바귀로부터 추출될 수 있으며, 바람직하게는 하기 방법에 의해 흰씀바귀 뿌리로부터 추출될 수 있다. 먼저 흰씀바귀 뿌리를 저급알코올 용매, 바람직하게는 메탄올로 추출하여 추출물을 얻고, 상기 추출물을 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물을 이용하여 분배 추출하고 농축하여 에틸아세테이트 분획, n-부탄올 분획 및 물 분획을 수득한 후에, 상기 분획 중에서 n-부탄올 분획에 대해서 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)를 반복 실시하여 본 발명의 화합물을 수득할 수 있다. 이 때 전개용매로는 당업계에 공지된 다양한 유기용매가 사용될 수 있으나, 바람직하게는 n-헥산과 에틸아세테이트의 혼합용액, 클로로포름과 메탄올의 혼합용매가 사용될 수 있다.
상기 방법으로 분리한 본 발명의 세스퀴테르펜 락톤계 화합물의 구조는 공지의 방법에 의해 분석될 수 있다. 구체적으로 수소 핵자기공명 스펙트럼, 탄소 핵자기 공명 스펙트럼, DEPT 스펙트럼 및 2D-핵자기 공명 스펙트럼(COSY, HMQC 및 HMBC 스펙트럼) 등을 이용하여 분석할 수 있다. 본 발명 화합물을 상기의 방법으로 분석한 결과, 본 발명 화합물은 3β-O-(6'-p-하이드록시페닐아세틸-β-D-글루코피라노실)-8β-하이드록시구아이안-4(15),10(14),11(13)-트리엔-6,12-올라이드(3β-O-(6'-p-hydroxyphenylacetyl-β-D-glucopyranosyl)-8β-hydroxyguaian-4(15),10(14),11(13)-triene-6,12-olide)의 화학식을 갖는 신규한 화합물로 판명되었다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 흰씀바귀로부터 추출된 세스퀴테르펜 락톤계 화합물이 심혈관 질환 치료제로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 ACAT 활성 저해 측정 방법을 이용하였다. ACAT 효소활성 측정은 본 분야의 당업자에게 공지인 방법으로 수행할 수 있다. ACAT는 작용기전이 확실하고 부작용이 없는 새로운 심혈관 질환 치료제를 개발하기 위한 목표 효소(target enzyme) 중 하나이다. ACAT는 1) 콜레스테롤을 콜레스테롤 에스테르(cholesterol ester: CE) 형태로 변화시켜 소장내로 콜레스테롤의 흡수를 촉진시키며, 2) 간에서 초저밀도 지단백질(very low-density lipoprotein: VLDL)을 형성함으로써 혈중 콜레스테롤 농도와 직접 관련되어 있으며 동맥 경화증을 일으키는 결정적 요인인 저밀도 지단백질(low-density lipoprotein: LDL)을 형성하는데 관여하고, 3) 혈관내벽 상처의 주변 세포에 CE가 축적되는데도 관여한다고 알려져 있다. 또한, 필요 이상의 CE가 존재할 경우 혈관벽 등에 축적되거나 혈중의 점도를 증가시켜서 각종 심혈관 질환을 일으킨다고도 알려져 있다. 따라서, ACAT의 활성을 저해할 경우, 혈중 CE의 양을 저하시켜서 혈액의 점도를 낮출 수 있고, 간에서의 VLDL 형성을 저해함으로써 LDL의 합성을 감소시킬 수 있으며, 장에서 흡수되는 콜레스테롤의 양 또한 줄일 수 있어 결과적으로 동맥경화, 고혈압, 협심증, 고지혈증, 심근경색 및 심부전 등의 심혈관 질환을 치료할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 흰씀바귀로부터 추출된 세스퀴테르펜 락톤계 화합물이 암 치료제로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 FPT 활성 저해 측정 방법을 이용하였다. FPT 효소활성 측정은 본 분야의 당업자에게 공지인 방법으로 수행할 수 있다. FPT는 효과적인 암 치료제의 개발에 유용한 목표 효소로 평가되고 있다. FPT는 세포의 증식과 분화를 조절하는 신호전달 과정에 관여하는 효소 중의 하나로서, 파네실 파이로포스페이트(farnesyl pyrophosphate)의 파네실기(farnesyl group)를 라스 단백질(ras protein)에 전달하는 역할을 한다(Pomplianoet al.,Biochem., 31:3800-3807, 1992). 라스 단백질은 성장 조절 인자를 통한 신호 전달 과정에서 가장 중요한 역할을 하는 단백질로서 라스 원형 암유전자(ras proto-oncogene)에 의해 발현되는데, 이 라스 유전자는 악성 종양과 관련이 있다고 알려져 있기 때문에(Lowyet al.,Ann. Rev. Biochem., 62:851-891, 1993), 이 FPT 효소를 저해할 수 있다면 암을 효과적으로 치료할 수 있을 것이다. 따라서, FPT 효소를 저해하는 활성을 갖고 있는 본 발명의 화합물은 암의 예방 및 치료에 이용될 수 있으며, 구체적으로는 라스 단백질과 관련되어 있다고 알려진 췌장암, 방광암, 폐암 또는 피부암과 같이 라스 단백질과 관련되어 있다고 알려진 암의 예방 및 치료에 이용될 수 있다(Bos, J. L.,Cancer Res., 49:4682, 1989).
본 발명에 따른 세스퀴테르펜 락톤계 화합물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 적절한 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 심혈관 질환 및 암의 치료용 조성물로 제조될 수 있다.
적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토스, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 분말, 새세이(sachet), 엘릭서(elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통하여 투여될 수 있다. 사람의 경우 활성 화합물의 통상적인 1일 투여량은 체중 1㎏당 1 내지 1,000㎎, 바람직하게는 10 내지 100㎎의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
흰씀바귀는 옛부터 오랫동안 식용 및 약용으로 사용되어 왔고 흰씀바귀에 대한 부작용이 보고된 적은 없다. 따라서, 흰씀바귀로부터 추출분리한 본 발명의 화합물 및 그를 포함하는 약학적 조성물도 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없을 것임을 쉽게 예상할 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
흰씀바귀 근경으로부터 본 발명의 세스퀴테르펜 락톤계 화합물의 분리, 정제
본 발명에서 사용한 흰씀바귀(Ixeris dentateformaalbiflora)는 2002년 10월 경기도 양평군 강하면에서 구입하여 사용하였다. 흰씀바귀 생체 60㎏을 지하부(뿌리 45%)와 지상부(잎, 55%)로 나누고, 지하부를 약 2㎝ 정도의 크기로 잘랐다. 흰씀바귀 뿌리 27㎏을 80% 메탄올 수용액 360ℓ에 48시간 담가서 실온에서 추출하였다. 상기 추출물을 여과하고 남은 것은 동일한 방법으로 2회 더 추출하였다. 얻어진 여과액을 모두 합쳐 감압농축하여 메탄올 추출물을 얻었다.
상기 메탄올 추출물을 에틸아세테이트 2ℓ와 물 2ℓ의 혼합액으로 분배 추출하였고, 다시 물 층을 n-부탄올 2ℓ와 물 2ℓ로 분배 추출하였다. 각 층을 감압농축하여 에틸아세테이트 분획 17g, n-부탄올 분획 80g 및 물 분획 251g을 얻었다.
상기 3개의 분획 중 n-부탄올 분획 80g에 대하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(실리카겔은 머크사(Merck)에서 생산한 silica gel 60(63~200㎛)을 사용함)를 실시하여 분취하였다. 이 때, 전개용매로는 클로로포름, 메탄올 및 물의 혼합 용매를 사용하였고, 클로로포름:메탄올:물의 비율은 9:3:1, 7:3:1 및 65:35:10이었다. 상기 분취액을 박층 크로마토그래피(TLC)(머크사(Merck)에서 생산한 silica gel 60 F254를 사용함)로 확인하여 유사한 것끼리 모아 10개의 중분획으로 나누었다.
상기 10개의 중분획 중 네 번째 분획(3.9g)에 대하여 n-헥산:클로로포름:메탄올(2 : 3 : 1)의 용매를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 5개의 소분획으로 나누었다.
상기 5개의 소분획 중에서 다섯 번째 분획에 대하여 피리딘 3㎖와 무수초산(acetic anhydride) 3㎖를 빙냉하에서 적가한 뒤 실온에서 하루동안 교반시켜 아세틸화 반응(acetylation)을 실시하였다. 아세틸화 반응은 본 발명 화합물의 분리를 용이하게 하기 위하여 실시한 것이다. 상기 아세틸화된 분획을 에틸아세테이트와 물로 분배 추출한 후, 유기층을 5% HCl, 포화 NaHCO3및 NaCl을 가하여 세척하고 MgSO4로 탈수한 뒤 여과, 감압농축하였다. 이것을 다시 n-헥산:에틸아세테이트(1:1)의 용매를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 아세틸화된 본 발명의 화합물을 51.9㎎ 수득하였다.
<실시예 2>
흰씀바귀로부터 분리, 정제한 본 발명 화합물의 분석
상기 실시예 1에서 수득된 화합물은 흰색 분말이고, Fisher-Johns meltingpoint apparatus(Fisher scientific, USA)를 사용하여 측정한 융점은 224~225℃이었다. 본 발명의 화합물은 [α]D값이 -1.2°이고 TLC 상에서 전개시켰을 때 UV 흡수가 없었다. 또한, 10% H2SO4로 분무 건조하고 가열하였을 경우, 보라색으로 발색되었다.
상기 아세틸화된 본 발명의 화합물을 완전히 건조하여 CDCl3에 녹인 후, 5mm 튜브에 넣어 핵자기 공명 분광기(Nuclear Magnetic Resonance spectrometer, Varian Inova AS 400, Varian, USA)를 이용하여 NMR 분석을 수행하였다.1H-NMR(400MHz, CDCl3), DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) 및13C-NMR(100MHz, CDCl3) 결과는 하기 표 1a와 1b 및 도 1에 나타내었다.
또한, 상기 아세틸화된 본 발명의 화합물을 클로로포름에 녹여 건조한 후, 적외선 분광기(Infrared Spectrometer, Perkin model 599B, Perkin-Elmer, Massachusetts, USA)를 사용하여 적외선(IR) 흡광도를 분석하였다. IR 흡광도에선 3447(-OH), 1750(C=O), 1222, 1037 cm-1(KBr)의 피크가 보였다(도 2 참조).
또한, 상기 아세틸화된 본 발명 화합물의 2D-NMR 스펙트럼을 상기 핵자기 공명 분광기를 이용하여 추가적으로 조사하였다.
gCOSY(correlated spectroscopy)(400Hz, CDCl3) 스펙트럼의 조사 결과, 2번 메틸렌 양성자(methylene proton)와 3번 산소화 메틴이, 6번 산소화 메틴 양성자와 7번 메틴 양성자가, 8번 산소화 메틴과 9번 메틸렌 양성자가 각각상관관계(correlation)를 보임으로써 3번, 6번 및 9번의 하이드록실기의 위치를 확인할 수가 있었다.
gHMQC(heteronuclear multiple quantum correlation) 스펙트럼의 조사 결과, 13번, 14번 및 15번의 엑소메틸렌(exomethylene)의 탄소가 각각 두 개의 자신의 양성자와 상관관계가 있음을 확인하였고, 3번, 6번 및 8번의 산소화 메틴 탄소가 자신의 양성자와 상관관계가 있음을 확인할 수가 있었다.
gHMBC(heteronuclear multiple bonding correlation) 스펙트럼의 조사 결과, 3번 산소화 메틴 탄소는 아노머성(anomeric) 1번 양성자와 상관관계가 있음을 확인하였다. 또한 8번 산소화 메틴 탄소와 엑소메틸렌 14번 양성자가 상관관계를 보임으로써 3번과 8번에 하이드록실기가 치환되어 있음을 확인할 수 있었다. 9번 메틸렌 양성자, 10번 및 14번 엑소메틸렌, 및 8번 산소화 메틴 탄소가 상관관계가 있음을 확인하였다. 그리고, 당 6번 메틴 양성자와 α-카보닐기의 연결을 결정할 수 있는 피크도 확인하였다.
상기와 같이 1D-NMR, IR 및 2D-NMR(COSY, gHMQC 및 gHMBC) 스펙트럼 결과들을 종합하여 살펴본 결과 본 발명의 화합물은 구아이아놀리드(guaianolide) 골격의 세스퀴테르펜 락톤계 화합물임을 확인할 수 있었다. 따라서 8번 탄소 및 3번 탄소에 하이드록실가 각각 치환되어 있으며, 3번 하이드록실기에 D-글루코피라노실(D-glucopyranosyl) 한 분자가 결합하고 있고, 글루코스 6번 탄소에p-하이드록시페닐아세틸(p-hydroxypenylacetyl)이 결합하고 있는 문헌에 보고되어 있지 않는 새로운 화합물로 규명되었다.
아세틸화된 본 발명 화합물의1H-NMR(400 MHz, CDCl3) 및13C-NMR(100 MHz, CDCl3) 데이터
탄소 번호 δ H δ C
1 2.91(1H, br. dd,J=16.6, 8.4Hz) 45.06
2a 2.29(1H, m) 37.43
2b 2.31(1H, m)
3 4.51(1H, dd,J=7.2, 5.8Hz) 80.79
4 148.20
5 2.72(1H, dd, t,J=9.2, 9.2Hz) 50.84
6 4.43(1H, dd,J=10.4, 9.2Hz) 78.04
7 3.07(1H, dd,J=8.6, 6.0Hz) 48.11
8 5.48(1H, Overlapping) 67.82
9a 2.58(1H, dd,J=14.2, 5.8Hz) 40.55
9b 2.40(1H, dd,J=14.2, 5.6Hz)
10 141.52
11 134.33
12 170.47
13a 6.15(1H, d,J=3.4Hz) 121.96
13b 5.38(1H, d,J=3.4Hz)
14a 5.12(3H, br. s) 118.11
14b 4.81(1H, br. s)
15a 5.46(1H, br. s) 113.77
아세틸화된 본 발명 화합물의1H-NMR(400 MHz, CDCl3) 및13C-NMR(100 MHz, CDCl3) 데이터
탄소번호 δ H δ C
15b 5.26(1H, br. s)
1´ 4.74(1H, d,J=8.2Hz) 99.80
2´ 5.12(1H, dd,J=7.6, 9.0Hz) 71.25
3´ 5.23(1H,J=9.6Hz) 72.77
4´ 5.07(1H, dd,J=9.8, 7.6Hz) 68.47
5´ 3.73(1H, m) 71.62
6a´ 4.27(1H, dd,J=12.1, 5.2Hz) 62.00
6b´ 4.21(1H, dd,J=12.1, 3.0Hz)
1″ 130.80
2″, 6″ 7.23(2H, d,J=6.4Hz) 130.10
3″, 5″ 7.04(2H, d,J=6.4Hz) 121.63
4″ 149.72
α 169.94
β 3.56(2H, s) 40.55
아세틸 2.01(3H, s), 2.03(3H, s), 2.04(3H, s)2.06(3H, s), 2.09(3H, s) 170.32, 169.22169.14, 168.97168.82, 21.0720.70, 20.6420.59×2
<실시예 3>
본 발명 화합물의 ACAT 효소 저해 활성 측정
상기 실시예 1에서 흰씀바귀로부터 분리, 정제한 본 발명의 세스퀴테르펜 락톤계 화합물이 심혈관 질환 치료에 이용될 수 있는지를 확인하기 위하여 본 발명 화합물의 ACAT 효소 저해 활성을 측정하였다. 이하 활성 실험에서는 아세틸기를 제거한 화학식 1의 화합물을 사용하였다.
ACAT 효소활성 측정은 [1-14C] 올레오일-CoA(oleoyl-CoA)를 기질로 사용하는타바스 등(Tabaset al)의 방법(Tabaset al., J. Biol. Chem.,261:3147-3154, 1986)을 응용하여 수행하였다. 화합물 시료액 10㎕, 쥐의 간조직의 마이크로좀 효소(microsomal enzyme) 4㎕, 어세이 버퍼(0.5 M KH2PO4, 10 mM DTT. pH 7.4) 20㎕, 40㎎/㎖ BSA(essentially fatty acid free) 15㎕, 20㎎/㎖ 콜레스테롤 2㎕, 증류수 41㎕가 혼합된 반응용액을 37℃에서 20분 동안 예비 반응시키고, 이 반응 용액에 [1-14C] 올레오일-CoA(oleoyl-CoA) (0.05 μCi, 최종농도 10μM) 8㎕를 첨가하여 다시 37℃에서 25분간 본 반응시켰다. 이후, 이소프로판올-헵탄(4:1, v/v) 1㎖을 가하여 반응을 정지시켰다. 헵탄 0.6㎖과 5배로 희석한 어세이 버퍼 0.4㎖을 첨가한 후 원심분리 하였다. 효소 활성의 측정은 원심분리하여 얻은 상층액 100㎕에 신틸레이션 칵테일(scintillation cocktail) 3㎖을 첨가한 후, 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선활성을 측정하였다.
ACAT 저해도는 방사능으로 표지한 기질과 효소의 혼합액에 검색 시료를 넣어 반응 생성물의 양을 방사능 측정 장치를 사용하여 측정한 후, 하기 식으로 저해도를 계산하였으며 그 결과 본 발명 화합물의 ACAT 효소 저해도는 66.3%로 높았다. 따라서, 본 발명의 화합물은 심혈관 질환의 예방 및 치료제로서 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
% 저해도 = 100 × [1-CPM(T)-CPM(C2) / CPM(C1)-CPM(B)]
(CPM : count per minute)
상기 식에서,
CPM(T) : 시료와 효소를 넣었을 때의 CPM
CPM(C1) : 시료는 넣지 않고, 효소는 넣었을 때의 CPM
CPM(C2) : 시료는 넣고, 효소는 넣지 않았을 때의 CPM
CPM(B) : 시료와 효소를 넣지 않았을 때의 CPM
<실시예 4>
본 발명 화합물의 FPT 효소 저해 활성 측정
상기 실시예 1에서 흰씀바귀로부터 분리, 정제한 본 발명의 세스퀴테르펜 락톤계 화합물이 암 치료에 이용될 수 있는지를 확인하기 위하여 본 발명 화합물의 FPT 효소 저해 활성을 측정하였다.
FPT 활성은 SPA 키트(Scintillation Proximity Assay Kit, Amersham Pharmacia Biotech사 제조)를 이용하여 측정하였다. FPT 활성도는 비오틴-KKKSKTKCVIM (FPT의 기질로서 Ki-Ras c-말단 서열)에 [3H]-파네실 파이로포스페이트(farnesyl pyrophosphate)로부터 [3H]-파네실기의 전이를 측정함에 의해 결정된다. 반응 용액(최종 부피 ; 100㎕)은 50mM HEPES(pH 7.5), 30mM MgCl2, 20mM KCl, 5mM DTT, 0.01% 트리톤(Triton) X-100, 150~250 nM [3H]-파네실 파이로포스페이트(60μM, 1Ci/㎕), 25~50ng의(약 2.5~5.0 nM)의 재조합 랫트 FPT 또는 10㎕의 부분 정제된 FPT, 10~200nM 비오틴-KKKSKTKCVIM을 포함하고 있으며, 시료로서 DMSO 1㎖당 본 발명의 화합물을 1~100㎎ 녹인 용액을 10㎕ 첨가하였다. 60분 동안 37℃에서 반응시킨 후 150㎕의 스톱/비드 시약(STOP/bead reagent)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 시료를 잘 혼합한 후, 실온에서 30분 동안 방치한 후 방사선측정기(1450 Microbeta counter, Wallac)를 이용하여, 비오틴-KKKSKTKCVIM에 전이된 [3H]-파네실의 양을 측정함으로써 FPT 활성을 측정하였다.
효소 억제 활성은 DMSO만 넣은 시료에서의 효소 활성도에 대한 %로 계산하였고, 그 결과 본 발명 화합물의 FPT 효소 저해도는 41.1% 였다. 따라서, 본 발명의 화합물은 암의 예방 및 치료제로서 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
<실시예 5>
본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 제제의 제조
하기 제제예는 본 발명의 제제를 예시하는 것일 뿐 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 표 2의 성분들을 이용하여 경질 젤라틴 캡슐을 제조하였다.
성분 함량(㎎/캡슐)
활성 성분(본 발명의 화합물) 50
비타민 C 50
담체 또는 부형제(전분, 락토스 등) 380
마그네슘 스테아레이트 20
총량 500 ㎎
상기 성분들을 완전히 혼합하여 총 500 ㎎의 양으로 경질 캡슐에 채웠다.
상기 조성물은 또한 비타민 C 외에 건강에 유익한 다른 성분들을 추가로 포함할 수 있으며, 이 조성물을 이용하여 일반적으로 널리 알려진 방법에 따라, 정제, 과립제, 분제, 마이크로캡슐제, 드링크제 등의 각종 경구용 제제 및 각종 주사제 등의 비경구용 제제를 제조할 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물은 흰씀바귀 뿌리에서 유래한 화합물로서 독성이 없고 우수한 ACAT 및 FPT 저해효과를 나타내므로 동맥경화, 고혈압, 협심증, 고지혈증, 심근경색 또는 심부전 등의 심혈관 질환 및 췌장암, 방광암, 폐암 및 피부암 등의 암의 예방 및 치료용으로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물.
    <화학식 1>
  2. 제 1항에 있어서, 흰씀바귀 근경을 알콜 용매로 추출 및 여과하고, 추출액을 농축, 분배 추출 및 정제하여 제조되는 화합물.
  3. 제 1항의 화합물을 유효 성분으로 함유하는 심혈관 질환 예방 및 치료용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 심혈관 질환이 동맥경화, 고혈압, 협심증, 고지혈증, 심근경색 또는 심부전인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1항의 화합물을 유효 성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 암이 췌장암, 방광암, 폐암 또는 피부암인 것을 특징으로 하는 조성물.
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