KR101862750B1 - 허니부쉬 추출물의 분획물 및 이로부터 유래한 화합물을 함유하는 피부 개선용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 허니부쉬(honeybush) 추출물의 용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 또는 피부 주름 개선을 위한 피부 개선용 조성물에 관한 것으로, 상기 분획물 또는 분획물 유래 화합물이 자외선 조사에 의해 증가된 피부 손상으로부터 발생된 피부 주름에 대한 개선 효과가 우수하므로, 피부 개선용 약학, 화장료, 건강기능식품 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

허니부쉬 추출물의 분획물 및 이로부터 유래한 화합물을 함유하는 피부 개선용 조성물{Composition for skin conditions improvement comprising fractions of honeybush extracts and compounds derived from the same}
본 발명은 허니부쉬(honeybush) 추출물의 분획물 및 이로부터 유래한 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 또는 피부 주름 개선을 위한 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.
피부의 노화는 나이가 들어감에 따라 자연적으로 발생하는 내인성(intrinsic) 자연노화와 자외선 노출에 의한 외인성 광노화 두가지 과정을 통해 일어난다. 자연노화와 광노화 모두 주름이 생성되고 피부 면역세포인 랑거한스 세포(Langerhans' cell)와 진피세포 성분이 줄어드는 등 많은 공통점이 있으나, 광노화의 경우에는 피부 두께가 두꺼워지고 탄력섬유가 증가하는 반면, 자연노화에서는 피부가 얇아지는 다른 특징이 있기도 하다. 최근 들어 자외선 등 노출과 관련한 광노화 예방/치료에 관심이 많아지고 있으며, 이는 연령과 직접적인 관계를 가지고 있는 자연노화와는 다르게 젊은 층부터 노년층에 이르기까지 전세대에 걸친 관심분야이기도 하다.
내인성 자연노화의 주원인은 우리 몸의 신진대사과정에서 만들어진 반응성 활성 산소 라디칼에 의하여 우리 몸의 구성 성분에 생기는 손상이 누적되기 때문이다. 반면, 외인성 광노화는 자외선에 의해 생기는 피부 손상의 결과로서, 대표적인 증상 중 하나가 주름(wrinkle)이라고 할 수 있는데, 현대사회와 같이 각종 대기오염의 결과 발생하는 오존층 파괴 때문에 과다한 자외선 노출이 항시적으로 우려가 되고 있는 것이 현실이다. 이렇게 자외선 노출이 지속되면 산화적 스트레스(oxidative stress)가 발생하며 이는 곧 체내의 라디칼(radical)이 증가되고, 진피의 결합조직인 콜라겐(collagen), 엘라스틴 (elastin), 히아루론산(hyaluronic aicd) 등을 파괴하여 피부의 일정 부위 침하현상(주름)을 일으킬 수 있는 것으로 설명된다. 또한 이러한 기작들은 세포막의 지질부분을 산화시켜 세포의 파괴 현상을 일으켜 피부염, 여드름 또는 피부암 등의 질병을 유발할 수 있다.
한편, 현재 피부주름에 사용되고 있는 가장 우수한 화장품은 레티노이드 제품으로, 효과가 뛰어난 장점이 있지만 제품에 처방될 경우 변색, 변취 현상이 발생하고, 소량 사용시에도 피부 자극이 유발되는 부작용이 있으며, 경시적인 변화에 의한 역가 감소와 이에 따른 효과 감소 등이 큰 문제점으로 인식되고 있어 대체할 수 있는 안전한 제품개발이 시급하다. 즉, 레티노이드와 같은 화학적 합성물질은 기능적인 측면에서는 효과적이나 화학변화(산패)에 의해 피부 자극을 유발할 수도 있기 때문에, 이러한 피부 자극 없이 피부내 활성산소를 제거하여 피부 노화를 예방하기 위하여, 최근에는 부작용이 적으면서 안정성이 우수한 천연 식물성 원료를 이용한 기능성 화장품 또는 건강기능식품의 개발이 활발하다.
허니부쉬(Cyclopia intermedia, honeybush)는 멜리안투스과(-科 Melianthaceae)에 속하는 상록관목으로, 남아프리카의 케이프지역(Cape region)의 서동쪽 해안의 산등성의 좁은 지역에서만 자라는 식물로, 루이보스와 같이 차로 많이 이용되고 있는 허브이다. '허니부쉬'라는 이름은 그 꽃에서 꿀 향기가 난다 해서 붙여진 이름으로 먹는 방법이나 효능은 루이보스와 비슷하지만 맛은 그보다 훨씬 더 달콤한 맛이 나는 식물이다. 허니부쉬는 탄닌이 적고 카페인이 전혀 없으며, 다양한 무기질(예: 철분,포타시움, 칼슘, 동, 아연, 마그네슘 등)이 함유되어 있다.
허니부쉬의 효능으로는 오래전부터 감기, 불면증, 배탈을 치료할 때 이용되어 왔으며, 그밖에 항당뇨 효과가 보고된 바 있다. 또한, 허니부쉬의 물 추출물 또는 이의 발효액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물에 대한 특허(한국등록특허 10-1295368)가 공개되어 있으나, 추출물을 특정 용매로 더욱 분획한 분획물 또는 이로부터 유래한 화합물에 대한 효과는 알려진 바 없다.
즉, 허니부쉬의 물 추출물 또는 이의 발효액의 개시만으로는, 이들 중 어떠한 분획물이 피부 개선 효과가 뛰어난지를 용이하게 유추할 수 없고, 이러한 효과를 입증하기 위해서는 반드시 구체적인 실험 데이터가 구비되어야 한다.
이에, 본 발명자들은, 부작용 없이 피부 주름 개선 효과가 뛰어난 천연 약물을 개발하기 위해 예의 연구한 결과, 허니부쉬 추출물의 분획물 및 이로부터 유래한 화합물이 자외선 보호 효과 및 광노화 유발인자(MMP-1 및 MMP-9) 억제효과가 우수함을 발견하고, 자외선 등에 의한, 피부 노화를 방지하거나 피부 주름을 개선할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은, 허니부쉬 추출물의 분획물 및 이로부터 유래한 화합물을 유효성분으로 함유하는, 피부 개선용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 허니부쉬 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는, 피부 개선용 조성물을 제공한다.
상기 추출물은 물, C1 내지 C6의 저급알코올, 또는 이들의 혼합용매로 추출할 수 있다.
상기 분획물은 허니부쉬 추출물의 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 또는 물 분획물일 수 있다.
상기 분획물은 허니부쉬 추출물을 흡착제인 Diaion HP-20 레진으로 흡착시킨 후의 용출물일 수 있다.
상기 용출물은 물, C1 내지 C6의 저급알코올, 또는 이들의 혼합용매로 용출할 수 있다.
상기 분획물의 용량은 10㎍/㎖ 내지 200㎍/㎖일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 헤스페리딘, 5,7-디하이드록시크로몬, 4-하이드록시벤잘데하이드, 4-하이드록시아세토페논, 헤스페레틴 및 프로토카테큐익산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 조성물을 제공한다.
상기 화합물은 허니부쉬 추출물의 분획물로부터 분리될 수 있다.
상기 화합물의 용량은 10㎍/㎖ 내지 200㎍/㎖일 수 있다.
상기 조성물은 피부 노화 방지 또는 피부 주름 개선용일 수 있다.
상기 조성물은 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 및 MMP-9(matrix metalloproteinase-9) 억제를 통한 피부 노화 방지 또는 피부 주름 개선용일 수 있다.
상기 조성물은 약학적 조성물, 화장료 조성물 또는 건강기능식품 조성물일 수 있다.
상기 조성물은 분말, 산제, 과립제, 음료, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 경피제, 좌제 또는 주사용액으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 허니부쉬 추출물의 특정 분획물은, 자외선 조사에 의해 증가된 피부 주름을 감소시키고, 콜라겐 조직의 파괴 반응을 억제하여 피부 주름 개선효과가 우수한 바, 피부 노화 방지 또는 피부 주름 개선을 위한 피부 개선용 조성물에 유용하게 사용될 수 있으므로, 기존의 천연 피부개선제를 뛰어넘는 새로운 치료제 및 치료법을 제공할 수 있다.
도 1은 (a) 디클로로메탄 분획물 및 (b) Diaion HP-20 물분획물의 HPLC 패턴분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 화합물 1 내지 화합물 6에 대한 세포독성 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 허니부쉬 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 허니부쉬는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용될 수 있으며, 잎, 종자, 열매, 뿌리 또는 지상부(aerial part)를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명에 있어서, 허니부쉬 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 알코올로는 C1 내지 C6의 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하고, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 허니부쉬 추출방법으로는 진탕 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하고, 환류 냉각 추출을 이용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 구체적으로는, 상기 추출 용매를 허니부쉬 분량에 2 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 추출온도는 상온(25℃) 내지 100 ℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며, 추출시간은 1 내지 3시간인 것이 바람직하고, 아울러, 추출 회수는 1 내지 3회인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명에 있어서, 허니부쉬 추출물의 유기용매 분획물은 추출액의 농축액에 추가적으로 유기용매를 가하여 분획물을 제조하는 방법으로 기존에 알려진 유기용매를 이용한 추출방법을 사용하여 제조할 수 있다. 상기 유기용매는 물, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 수포화부탄올, 70~100% 에탄올, 헥산 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하고, 특히 물, 디클로로메탄, 에틸아세테이트인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명에 있어서, 허니부쉬 추출물의 유기용매 분획물은 허니부쉬 추출물을 다공성 흡착제로 흡착시킨 후의 용출물을 이용할 수 있다. 이때 다공성 흡착제에 제한은 없으나 이온교환수지(ion exchange resin)로서 Diaion HP-20 수지(레진)인 것이 바람직하다. Diaion HP 20은 스티렌(Styrene)과 디비닐벤젠(Divinyl benzene, DVB)의 공중합체의 High Porous Type 합성흡착제로서, 다수의 세공(細孔)이 분포하며 비표면적(Surface Area)이 높아 흡착 능력이 우수하고, 세공이 비교적 크기 때문에 큰 분자의 흡착에 적합하며(MW 1,500 이상) 흡착물질의 용출(elution)이 용이하다. 흡착된 물질의 용출은 산, 알칼리, 극성 용매 등이 사용될 수 있으며, 특히 물, C1 내지 C6의 저급알코올, 또는 이들의 혼합용매로 용출하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 허니부쉬 추출물의 분획물은 헤스페리딘, 5,7-디하이드록시크로몬, 4-하이드록시벤잘데하이드, 4-하이드록시아세토페논, 헤스페레틴 및 프로토카테큐익산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 을 포함할 수 있으며, 구체적으로, 상기 허니부쉬 추출물의 분획물 100 중량부에 대하여, 헤스페리딘 0.001 내지 10.0 중량부, 5,7-디하이드록시크로몬 0.01 내지 5.0 중량부, 4-하이드록시벤잘데하이드 0.005 내지 2.0 중량부, 4-하이드록시아세토페논 0.01 내지 4.0 중량부, 헤스페리틴 0.005 내지 5.0 중량부 또는 프로토카테큐익산 0.0005 내지 5.0 중량부를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 허니부쉬 추출물의 분획물의 용량은 10㎍/㎖ 내지 200㎍/㎖인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 헤스페리딘, 5,7-디하이드록시크로몬, 4-하이드록시벤잘데하이드, 4-하이드록시아세토페논, 헤스페레틴 및 프로토카테큐익산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 화합물은 허니부쉬 추출물의 분획물로부터 분리된 것일 수 있다.
헤스페리딘(Hesperidin) 및 헤스페리틴(Hesperitin)은, 감귤류 과일에 많이 존재하는 플라보노이드계 색소 중의 플라바논(flavanone) 배당체로서, 지질과산화물 형성을 억제하며 노화지연 등의 항산화 효과, 항염증 효과, 모세혈관 보호 및 항암작용, 콜레스테롤을 낮추는 작용을 한다고 알려져 있다.
5,7-디하이드록시크로몬(5,7-dihydroxychromone)은, 땅콩 껍질에 많이 존재하는 화합물로서 항진균 효과가 있고, 혈당을 낮춰주는 효과가 있다고 알려져 있다. 또한 뇌세포를 보호하는 효과가 알려져 있다.
4-하이드록시벤잘데하이드(4-hydroxybenzaldehyde)는, 천마에 많이 존재하는 페놀릭 화합물로서 항염증, 항혈관신생합성 효과가 있고, 통증억제 작용이 있다고 알려져 있다.
4-하이드록시아세토페논(4-hydroxyacetophenone)은, 피세올 (piceol)이라고도 하며 Picea ebies라는 식물, 즉 노르웨이 가문비나무(Norway spruces)에서 분리된 화합물로서 약효나 기전 등에 대해 보고된 바가 아직 없다.
프로토카테규익산(Protocatechuic acid)은, 녹차나 히비스커스 등에 많이 존재하는 페놀성 화합물로서 항산화 및 항염활성이 보고되어 있으며 간독성에 대한 보호효과와 세포증식 촉진, 세포사멸을 막는 작용이 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 화합물의 용량은 10㎍/㎖ 내지 200㎍/㎖인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는, MTS assay를 통하여 본 발명의 분획물 및 이로부터 유래한 화합물이 자외선에 의한 피부사멸을 억제하는지 그 효과를 확인하였다. MTS assay는 MTT 분석법과 마찬가지로 세포생존률(독성)을 평가하는 데 널리 알려진 방법으로서, 살아있는 미토콘드리아의 탈수소효소(dehydrogenase)에 의해 노란색의 MTS 테트라졸륨(MTS tetrazolium)이 갈색빛을 띄는 보라색의 포마잔(formazan)으로 전환될 때의 흡광도를 측정하는 방법이다.
따라서, 세포생존률이 높을수록 주름 개선 등의 효과가 우수하다는 것을 의미하며, 실제 본원 실험예 1에서는 본 발명의 허니부쉬 용매 분획물이 단순한 추출물에 비하여 상기 세포생존률이 월등히 높다는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명에서는, MMP-1 및 MMP-9 assay를 통하여 본 발명의 분획물이 자외선에 의한 광노화(피부 주름)를 개선하는지 그 효과를 확인하였다. 아연-의존성 엔도프로테아제(endoprotease)계의 하나인 기저막 단백질 분해 효소(matrix metalloproteinase:MMP)는 광범위한 기질을 공유하고, 진피의 세포외기질 단백질 분해의 주된 효소이다. 특히, 자외선은 여러 종류의 MMP를 유도하는데, 이러한 여러 종류의 MMP로는 Type I, III 콜라겐을 분해시키는 MMP-1, 콜라겐 조각들을 분해시키는 MMP-9 등이 있다. 자외선 등에 의해서 자극된 세포, 즉 각질 세포, 진피의 섬유아세포 등에서 과다하게 MMP가 분비되어 세포외기질 단백질의 분해를 유발함으로써 피부 노화를 유발하고 임상적으로는 주름을 만들게 되는 것이다.
따라서, MMP-1 및 MMP-9 억제활성이 높을수록 주름 개선 등의 효과가 우수하다는 것을 의미하며, 실제 본원 실험예 2 및 3에서는 본 발명의 허니부쉬 용매 분획물이 단순한 추출물에 비하여 상기 억제활성이 월등히 높다는 것을 확인하였다.
본 발명의 약학 조성물은 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용가능한 담체 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 및 에탄올 등을 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 에센스, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 폼(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 허니부쉬 추출물의 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으나, 카라멜, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다. 또한 본 발명에서 "약제학적 유효량"은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 투여방법에는 제한이 없다. 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 비교예 ] 허니부쉬 추출물의 제조
비교예 1. 허니부쉬 물 추출물
허니부쉬 1kg을 정선하여 환류냉각 추출장치에 넣은 후 5～10배량의 정제수를 넣고 80～100℃에서 1～4시간 동안 환류냉각 추출법으로 2회 추출하여 추출액을 얻었다. 이를 여과하고 여액을 70℃ 이하에서 감압농축기(EYELA N-1000, EYELA Ltd.,JAPAN)로 감압농축하여 조추출물을 얻었다(수득률 21%).
비교예 2. 허니부쉬 70% 에탄올 추출물
허니부쉬 1kg을 정선하여 환류냉각 추출장치에 넣은 후 5～10배량의 70% 에탄올을 넣고 70～90℃에서 1～4시간 동안 환류냉각 추출법으로 2회 추출하여 추출액을 얻었다. 이를 여과하고 여액을 70℃ 이하에서 감압농축기(EYELA N-1000, EYELA Ltd.,JAPAN)로 감압농축하여 조추출물을 얻었다(수득률 22%).
비교예 3. 허니부쉬 100% 에탄올 추출물
허니부쉬 1kg을 정선하여 환류냉각 추출장치에 넣은 후 5～10배량의 100% 에탄올을 넣고 60～90℃에서 1～4시간 동안 환류냉각 추출법으로 2회 추출하여 추출액을 얻었다. 이를 여과하고 여액을 60℃ 이하에서 감압농축기(EYELA N-1000, EYELA Ltd.,JAPAN)로 감압농축하여 조추출물을 얻었다(수득률 12%).
[ 실시예 1-15] 허니부쉬 추출물의 용매분획물 제조
실시예 1. 물 추출물의 헥산 분획물의 제조
상기 비교예 1의 물 추출물 20g을 증류수 800mL에 현탁시키고 동량의 n-헥산을 이용하여 3회 용매분획을 실시하였고, 여기서 얻은 분획물을 40℃ 이하에서 감압농축하여 헥산분획물을 얻었다(수득률 3.5%).
실시예 2. 디클로로메탄 분획물
상기 실시예 1의 헥산 분획물을 얻은 후 남은 수층에 800mL의 디클로로메탄을 이용하여 3회 용매분획을 실시하였고, 여기서 얻은 분획물을 40℃ 이하에서 감압농축하여 디클로로메탄 분획물을 얻었다(수득률 1.7%).
실시예 3. 에틸아세테이트 분획물
상기 실시예 2의 디클로로메탄 분획물을 제조한 후 남은 수층에 800mL의 에틸아세테이트를 이용하여 3회 용매분획을 실시하였고, 여기서 얻은 분획물을 50℃ 이하에서 감압농축하여 에틸아세테이트 분획물을 얻었다(수득률 2.9%).
실시예 4. 수포화 부탄올 분획물
상기 실시예 3의 에틸아세테이트 분획물을 제조한 후 남은 수층에 800mL의 수포화부탄올을 이용하여 3회 용매분획을 실시하였고, 여기서 얻은 분획물을 70℃ 이하에서 감압농축하여 수포화 부탄올 분획물을 얻었다(수득율 13.5%).
실시예 5. 물 분획물
상기 실시예 4의 수포화 부탄올 분획물를 제조한 후 남은 수층을 70℃ 이하에서 감압농축하여 물 분획물을 얻었다(수득율 68.8%).
실시예 6. 70% 에탄올 추출물의 헥산 분획물의 제조
상기 비교예 2의 70% 에탄올 추출물 20g을 증류수 800mL에 현탁시키고 동량의 n-헥산을 이용하여 3회 용매분획을 실시하였고, 여기서 얻은 분획물을 40℃ 이하에서 감압농축하여 헥산 분획물을 얻었다(수득률 4.3%).
실시예 7. 디클로로메탄 분획물
상기 실시예 6의 헥산 분획물을 제조한 후 남은 수층에 800mL의 디클로로메탄을 이용하여 3회 용매분획을 실시하였고, 여기서 얻은 분획물을 40℃ 이하에서 감압농축하여 디클로로메탄 분획물을 얻었다(수득률 3.5%).
디클로로메탄 분획물의 HPLC 패턴분석 결과는 도 1(a)와 같다.
구체적으로, 디클로로메탄 분획물 27.14g 을 이용하여 헥산:에틸아세테이트 = 3:1 초기조건으로 용리되는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 진행하였고, 7개의 분획을 얻었다. 분획 4번(2.35g)을 메탄올:디클로로메탄 = 1:1로 용리한 뒤, 원심분리(3000rpm, 3min)하여 상등액을 취해 감압농축하였다. 상등액 부분을 메탄올:디클로로메탄 = 1:1조건으로 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 진행하였고, 총 7개의 분획을 얻었다. 이중 분획 5번을 메탄올로 필터링하여 용리되는 부분만을 취해 아세토나이트릴:0.1% TFA물 = 10:90-20:80 조건으로 prep-HPLC(Eurospher 100-10 C18, 250×20mm, 10ml/min)를 하여 화합물 1(8.6mg, 0.032%), 화합물 2(21.21mg, 0.078%), 화합물 3(29.13mg, 0.11%)을 얻었다. 이중 분획 6번은 아세토나이트릴:0.1% TFA물 = 23:77 조건으로 prep-HPLC(Eurospher 100-10 C18, 250×20mm, 10ml/min)를 하여 화합물 4(11.41mg, 0.04%)을 얻었다.
디클로메탄 분획물로부터 분리된 화합물은 NMR(Bruker model digital AVANCCE Ⅲ, 400MHz)와 UPLC-UV-MS(Waters, ESI, negative mode)를 이용하여 구조 동정하였다.
화합물1의 분광학적 데이터를 하기에 나타내었다 : 1H-NMR(MeOH, 400MHz) : δ 6.95-6.88 (2H, m), 7.81-7.74 (2H, m), 9.77 (1H, s); 13C-NMR(MeOH, 100MHz) : δ 192.83, 165.18, 133.44, 130.30, 116.85, m/z 121[M+H]-. 위의 분광학적 결과를 토대로 비교했을 때, 화합물 1은 하기 화학식 1로 표시되는 4-하이드록시벤잘데하이드(4-Hydroxybenzaldehyde)임을 확인할 수 있었다(Scholars Research Library Der Pharmacia Lettre (2012), 4 (6):1817-1820):
[화학식 1]
Figure 112017089968192-pat00001
.
화합물 2의 분광학적 데이터를 하기에 나타내었다. 1H NMR(MeOD, 400MHz) : δ 2.51 (1H, s), 6.87-6.80 (2H, m), 7.93-7.83 (2H, m); 13C NMR(MeOD, 400MHz) : δ 199.49, 163.91, 132.12, 130.14, 116.19, 26.27, m/z 135[M+H]-. 위의 분광학적 결과를 토대로 비교했을 때, 화합물 2는 하기 화학식 2로 표시되는 4-하이드록시아세토페논(4-Hydroxyacetophenone)임을 확인할 수 있었다(Natural Product Sciences (2010) 16(4) : 203-206):
[화학식 2]
Figure 112017089968192-pat00002
.
화합물3의 분광학적 데이터를 하기에 나타내었다. 1H NMR(DMSO-d6, 400MHz) : δ 1.88 (1H, dd, J=17.1, 3.0Hz), 2.24 (1H, dd, J=17.1, 12.7Hz), 3.04 (3H, s), 4.48 (1H, dd, J=12.7, 2.9Hz), 5.08 (2H, dd, J=8.3, 2.1Hz), 6.08 (2H, dd, J=10.9, 2.5Hz), 6.13 (1H, t, J=2.9Hz); 13C NMR(MeOD, 100MHz) : δ 188.11, 158.84, 155.94, 155.25, 139.82, 138.23, 123.59, 109.51, 105.01, 103.00, 93.86, 87.57, 86.69, 70.77, 46.89, 34.55. 이 화합물의 경우 표준품(Hesperetin, Sigma-Aldrich)을 구매하여 HPLC와 비교했을 때 같은 Rt값을 나타내었으며, UV스펙트럼 또한 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 분광학적 분석자료와 선행 논문을 비교해봤을 때, 하기 화학식 3으로 표시되는 헤스페레틴(hesperetin)임을 확인 할 수 있었다(Journal of the Science of Food and Agriculture (2015)):
[화학식 3]
Figure 112017089968192-pat00003
.
화합물 4의 분광학적 데이터를 하기에 나타내었다. 1H NMR(DMSO-d6, 400MHz) : δ 6.20 (1H, s), 6.25 (1H, d, J=5.7Hz), 6.37 (1H, d, J=1.2Hz); 13C NMR(DMSO-d6, 100MHz) : δ 181.33, 164.44, 161.62, 157.83, 157.54, 110.51, 104.91, 99.04, 94.01 m/z 177[M+H]-. 위의 분광학적 결과를 토대로 비교했을 때, 화합물 4는 하기 화학식 4로 표시되는 5,7-디하이드록시크로몬(5,7-dihydroxychromone)임을 확인할 수 있었다(Phytochemistry (1994) Vol 36, No. 4, pp. 1043-1045):
[화학식 4]
Figure 112017089968192-pat00004
.
화합물 1 내지 4에 대한 세포독성을 평가해본 결과, 200ug/ml 농도까지 세포독성이 확인되지 않았다(참조 :도 2).
실시예 8. 에틸아세테이트 분획물
상기 실시예 7의 디클로로메탄 분획물을 제조한 후 남은 수층에 800mL의 에틸아세테이트를 이용하여 3회 용매분획을 실시하였고, 여기서 얻은 분획물을 50℃ 이하에서 감압농축하여 에틸아세테이트 분획물을 얻었다(수득률 4.9%).
실시예 9. 수포화 부탄올 분획물
상기 실시예 8의 에틸아세테이트 분획물을 제조한 후 남은 수층에 800mL의 수포화부탄올을 이용하여 3회 용매분획을 실시하였고, 여기서 얻은 분획물을 70℃ 이하에서 감압농축하여 수포화 부탄올 분획물을 얻었다(수득율 12.4%).
실시예 10. 물 분획물
상기 실시예 9의 수포화 부탄올 분획물을 제조한 후 남은 수층을 70℃ 이하에서 감압농축하여 물 분획물을 얻었다(수득율 58.7%).
실시예 11. 100% 에탄올 추출물의 헥산 분획물의 제조
상기 비교예 3의 100% 에탄올 추출물 20g을 증류수 800mL에 현탁시키고 동량의 n-헥산을 이용하여 3회 용매분획을 실시하였고, 여기서 얻은 분획물을 40℃ 이하에서 감압농축하여 헥산 분획물을 얻었다(수득률 10.4%).
실시예 12. 디클로로메탄 분획물
상기 실시예 11의 헥산 분획물을 제조한 후 남은 수층에 800mL의 디클로로메탄을 이용하여 3회 용매분획을 실시하였고, 여기서 얻은 분획물을 40℃ 이하에서 감압농축하여 디클로로메탄 분획물을 얻었다(수득률 9.9%).
실시예 13. 에틸아세테이트 분획물
상기 실시예 12의 디클로로메탄 분획물을 제조한 후 남은 수층에 800mL의 에틸아세테이트를 이용하여 3회 용매분획을 실시하였고, 여기서 얻은 분획물을 50℃ 이하에서 감압농축하여 에틸아세테이트 분획물을 얻었다(수득률 8.6%).
실시예 14. 수포화 부탄올 분획물
상기 실시예 13의 에틸아세테이트 분획물을 제조한 후 남은 수층에 800mL의 수포화 부탄올을 이용하여 3회 용매분획을 실시하였고, 여기서 얻은 분획물을 70℃ 이하에서 감압농축하여 수포화 부탄올 분획물을 얻었다(수득율 25.9%).
실시예 15. 물 분획물
상기 실시예 14의 수포화 부탄올 분획물을 제조한 후 남은 수층을 70℃ 이하에서 감압농축하여 물 분획물을 얻었다(수득율 48.7%).
[ 실시예 16-30] 허니부쉬 추출물의 Diaion HP-20 분획물 제조
실시예 16. 물 추출물의 Diaion HP-20 물 분획물 제조
상기 비교예 1의 물 추출물 21g을 5～20배량의 증류수에 현탁시킨 후, 다공성 흡착제인 Diaion HP-20 resin을 이용하여 분획물을 제조하였다.
구체적으로, Diaion HP-20 resin 400～600mL에 대하여 그 부피의 3배량의 메탄올로 활성화시켜, 직경 7cm, 높이 60cm의 컬럼내에 충진한 후 레진이 완전하게 침전할 때까지 메탄올로 흘려주었다. 그 후에 증류수의 양을 순차적으로 늘려 최종 증류수로 치환되도록 한 후, 비교예 1의 물 추출물 현탁액을 로딩하였다.
이후, 로딩된 컬럼을 레진 부피의 5～10배량의 증류수를 이용하여 용출(elution)시키고, 이 용출액을 70℃ 이하에서 감압농축하여 물 분획물을 얻었다(수득률 51.7%).
Diaion HP-20 물분획물의 HPLC 패턴분석 결과는 도 1(b)와 같다.
구체적으로, Diaion HP-20 물분획물으로부터 화합물을 분리 정제하였다.
Diaion HP-20 물분획물 약 14g을 물 300ml에 녹인 후 노르말부탄올 240ml을 혼합하여 3회 분획하여 부탄올 층만을 따로 취한 후 감압농축하였다. 이 중 730mg를 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 이용하여 클로로포름 : 메탄올 : 물 조건으로 10 : 3 : 1에서 순차별로 5 : 4 : 1까지 용리시켜 총 7개의 소분획을 얻었다. 이 중 소분획 3번 108mg을 Sephadex LH20 컬럼크로마토그래피를 이용하여 메탄올 용매 조건으로 실시하였다. 그 결과, 화합물 5(50mg, 0.36%)를 최종 분리하였으며 이 화합물의 분광학적 데이터를 하기에 나타내었다. 1H NMR(CD3OD, 600MHz) : δ 6.79 (1H, d, J=8.2Hz), 7.43 (1H, dd, J=8.2Hz, J=1.4Hz), 7.44 (1H, d, J=8.2Hz); 13C NMR(CD3OD, 150MHz) : δ 170.63, 151.55, 146.08, 124.06, 123.34, 117.84, 115.88; m/z 153[M-H]-, MS/MS m/z 109 [M-H-CO2]-. 위의 분광학적 결과를 토대로 비교했을 때, 화합물 5는 화학식 5로 표시되는 프로토카테큐익산(protocatechuic acid)임을 확인할 수 있었다(Chromatographia (2007) Vol 65 (1/2), pp. 1-7):
[화학식 5]
Figure 112017089968192-pat00005
.
이중 화학식 6로 표시되는 헤스페리딘(Hesperidin)은 상용화된 표준품이 있기 때문에 별도로 정제하지 않고 표준품을 사용하였다:
[화학식 6]
Figure 112017089968192-pat00006
.
화합물 5 및 화합물 6에 대한 세포독성을 평가해본 결과 200ug/ml 농도까지 세포 독성이 확인되지 않았다(참조 :도 2).
실시예 17. 20% 메탄올 분획물
실시예 16의 용출을 완료한 후 20% 메탄올을 이용하여 다시 용출을 시킨 후 70℃ 이하에서 감압농축하여 20% 메탄올 분획물을 얻었다(수득률 9.2%).
실시예 18. 40% 메탄올 분획물
실시예 17의 용출을 완료한 후 40% 메탄올을 이용하여 다시 용출을 시킨 후 70℃ 이하에서 감압농축하여 40% 메탄올 분획물을 얻었다(수득률 23.4%)
실시예 19. 70% 메탄올 분획물
실시예 18의 용출을 완료한 후 70% 메탄올을 이용하여 다시 용출을 시킨 후 70℃ 이하에서 감압농축하여 70% 메탄올 분획물을 얻었다(수득률 13.2%).
실시예 20. 100% 메탄올 분획물
실시예 19의 용출을 완료한 후 100% 메탄올을 이용하여 다시 용출을 시킨 후 70℃ 이하에서 감압농축하여 100% 메탄올 분획물을 얻었다(수득률 1.1%)
실시예 21. 70% 에탄올 추출물의 Diaion HP-20 물 분획물 제조
상기 비교예 2의 70% 에탄올 추출물 19g을 5～20배량의 증류수에 현탁시킨 후, 다공성 흡착제인 Diaion HP-20 resin을 이용하여 분획물을 제조하였다.
구체적으로, Diaion HP-20 resin 400～600mL에 대하여 그 부피의 3배량의 메탄올로 활성화시켜, 직경 7cm, 높이 60cm의 컬럼내에 충진한 후 레진이 완전하게 침전할 때까지 메탄올로 흘려주었다. 그 후에 증류수의 양을 순차적으로 늘려 최종 증류수로 치환되도록 한 후, 비교예 2의 70% 에탄올 추출물 현탁액을 로딩하였다.
이후, 로딩된 컬럼을 레진 부피의 5～10배량의 증류수를 이용하여 용출(elution)시키고, 이 용출액을 70℃ 이하에서 감압농축하여 물 분획물을 얻었다(수득률 41.5%)
실시예 22. 20% 메탄올 분획물
실시예 21의 용출을 완료한 후 20% 메탄올을 이용하여 다시 용출을 시킨 후 70℃ 이하에서 감압농축하여 20% 메탄올 분획물을 얻었다(수득률 7.8%).
실시예 23. 40% 메탄올 분획물
실시예 22의 용출을 완료한 후 40% 메탄올을 이용하여 다시 용출을 시킨 후 70℃ 이하에서 감압농축하여 40% 메탄올 분획물을 얻었다(수득률 18.9%).
실시예 24. 70% 메탄올 분획물
실시예 23의 용출을 완료한 후 70% 메탄올을 이용하여 다시 용출을 시킨 후 70℃ 이하에서 감압농축하여 70% 메탄올 분획물을 얻었다(수득률 16.5%).
실시예 25. 100% 메탄올 분획물
실시예 24의 용출을 완료한 후 100% 메탄올을 이용하여 다시 용출을 시킨 후 70℃ 이하에서 감압농축하여 물 분획물을 얻었다(수득률 4.2%).
실시예 26. 100% 에탄올 추출물의 Diaion HP-20 물 분획물 제조
상기 비교예 3의 100% 에탄올 추출물 11g을 5～20배량의 증류수에 현탁시킨 후, 다공성 흡착제인 Diaion HP-20 resin을 이용하여 분획물을 제조하였다.
구체적으로, Diaion HP-20 resin 400～600mL에 대하여 그 부피의 3배량의 메탄올로 활성화시켜, 직경 7cm, 높이 60cm의 컬럼내에 충진한 후 레진이 완전하게 침전할 때까지 메탄올로 흘려주었다. 그 후에 증류수의 양을 순차적으로 늘려 최종 증류수로 치환되도록 한 후, 비교예 2의 70% 에탄올 추출물 현탁액을 로딩하였다.
이후, 로딩된 컬럼을 레진 부피의 5～10배량의 증류수를 이용하여 용출(elution)시키고, 이 용출액을 70℃ 이하에서 감압농축하여 물 분획물을 얻었다(수득률 11.5%).
실시예 27. 20% 메탄올 분획물
실시예 26의 용출을 완료한 후 20% 메탄올을 이용하여 다시 용출을 시킨 후 70℃ 이하에서 감압농축하여 20% 메탄올 분획물을 얻었다(수득률 7.2%).
실시예 28. 40% 메탄올 분획물
실시예 27의 용출을 완료한 후 40% 메탄올을 이용하여 다시 용출을 시킨 후 70℃ 이하에서 감압농축하여 40% 메탄올 분획물을 얻었다(수득률 13.9%).
실시예 29. 70% 메탄올 분획물
실시예 28의 용출을 완료한 후 70% 메탄올을 이용하여 다시 용출을 시킨 후 70℃ 이하에서 감압농축하여 70% 메탄올 분획물을 얻었다(수득률 10.3%).
실시예 30. 100% 메탄올 분획물
실시예 29의 용출을 완료한 후 100% 메탄올을 이용하여 다시 용출을 시킨 후 70℃ 이하에서 감압농축하여 메탄올 분획물을 얻었다(수득률 7.4%).
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[ 실험예 ]
실험예 1: UV-B를 처리한 세포에서의 허니부쉬 분획물의 보호효과
허니부쉬 추출물의 용매 분획물이 UV-B를 처리한 세포의 사멸을 억제하는지 확인하기 위하여, 공지의 MTS assay 방법으로 세포 생존율을 평가하였다.
우선, 각질형성세포인 HaCaT(human keratinocyte) 세포주를 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지로 37℃에서, 5% CO2 배양기에서 배양하였고, 배양된 세포는 96웰 플레이트에 5×104 cells/ well의 세포수로 분주하였다.
96웰 플레이트에 세포를 분주한 후, 세포가 완전히 붙어 세포의 모양을 갖추도록 24시간 배양 후에, 비교예 1-3의 추출물 및 실시예 1-30의 분획물을 10, 25, 50, 100 ug/ml 농도로 처리하고 다시 24시간 배양하였다.
이후, 세포를 serum free 배지로 교체한 후 UV-B를 20mJ/cm2 로 30분 처리하고 MTS((주) Promega) 시약을 넣은 배지로 바꾸고, 490nm (SpectraMax, Molecular Devices)에서 흡광도를 측정한 후, UV-B를 처리하지 않은 대조군(control)에 대한 상대적인 세포 생존률을 계산하여 그 결과를 하기 표 1 및 2에 나타내었다.
또한, UV-B를 조사하지 않은 세포주에 실시예 1에서 실시예 30의 허니부쉬 분획물을 10, 50, 100, 200 ug/ml 농도로 처리했을 때 세포독성이 발생하지 않았다.
자외선 처리한 피부세포에서의 허니부쉬 용매 분획물의 보호효과(단위: 세포생존율 %)
10 ug/ml 25 ug/ml 50 ug/ml 100 ug/ml
비교예 1 26 30 52 59
비교예 2 40 43 34 45
비교예 3 38 41 39 35
실시예 1 32 40 51 53
실시예 2 22 32 32 60
실시예 3 40 44 57 86
실시예 4 37 35 38 57
실시예 5 29 33 31 44
실시예 6 32 35 41 39
실시예 7 60 61 72 88
실시예 8 49 54 56 77
실시예 9 41 41 56 63
실시예 10 32 33 39 39
실시예 11 43 46 38 49
실시예 12 69 72 78 65
실시예 13 77 77 75 80
실시예 14 56 56 60 65
실시예 15 42 42 52 47
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 극성별 용매 분획물의 경우, 70% 에탄올 추출물(비교예 2)과 비교시, 디클로로메탄 분획물인 실시예 7에서 10～100ug/ml의 저농도 및 고농도 모두 우수한 세포보호효과를 나타내었다.
또한, 100% 에탄올 추출물(비교예 3)과 비교시 에틸아세테이트 분획물인 실시예 13에서도 10～100ug/ml의 저농도 및 고농도 모두 우수한 세포보호효과를 나타내었다.
자외선 처리한 피부세포에서의 허니부쉬 Diaion HP-20 분획물의 보호효과(단위: 세포생존율 %)
10 ug/ml 25 ug/ml 50 ug/ml 100 ug/ml
비교예 1 26 30 52 59
비교예 2 40 43 34 45
비교예 3 38 41 39 35
실시예 16 73 68 65 64
실시예 17 68 63 70 82
실시예 18 22 24 26 35
실시예 19 34 46 64 72
실시예 20 34 40 34 39
실시예 21 33 38 32 29
실시예 22 31 35 33 28
실시예 23 26 24 27 41
실시예 24 61 59 68 92
실시예 25 30 33 35 52
실시예 26 26 35 41 55
실시예 27 37 47 51 52
실시예 28 39 61 52 59
실시예 29 42 48 51 52
실시예 30 40 34 41 47
또한, Diaion HP-20 레진을 이용한 분획물의 경우, 비교예 1의 물 추출물과 비교시, 물 용출 분획물인 실시예 16과 20% 메탄올 용출 분획물인 실시예 17이 우수한 세포보호효과를 가짐을 확인하였다.
또한, 비교예 2의 70% 에탄올 추출물과 비교시, 70% 메탄올 용출 분획물인 실시예 24 역시 우수한 세포보호효과가 있음을 확인하였다.
실험예 2: UV-B를 처리한 세포에서의 허니부쉬 분획물의 MMP -1 억제활성
허니부쉬 추출물의 용매 분획물이 UV-B를 처리한 피부세포의 주름생성을 억제하는지 확인하기 위하여, 공지의 MMP-1 assay 방법으로 MMP-1 활성억제를 평가하였다.
우선, 각질형성세포인 HaCaT(human keratinocyte) 세포주를 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지로 37℃에서, 5% CO2 배양기에서 배양하였고, 배양된 세포는 96웰 플레이트에 5×104 cells/ well의 세포수로 분주하였다.
96웰 플레이트에 세포를 분주한 후, 세포가 완전히 붙어 세포의 모양을 갖추도록 24시간 배양 후에, 비교예 1-3의 추출물 및 실시예 1-30의 분획물을 10, 25, 50, 100 ug/ml 농도로 처리하고 다시 24시간 배양하였다.
이후, 세포를 serum free 배지로 교체한 후 UV-B를 20mJ/cm2 로 30분 처리하고 배지만 취하여, MMP-1 키트로 어세이를 진행하였다. 모든 반응이 끝난 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 MMP-1의 활성억제율을 계산하여 그 결과를 하기 표 3 및 4에 나타내었다.
자외선 처리한 피부세포에서의 허니부쉬 용매 분획물의 MMP-1 활성억제율(%)
10 ug/ml 25 ug/ml 50 ug/ml 100 ug/ml
비교예 1 60 44 56 67
비교예 2 54 57 68 42
비교예 3 54 23 43 26
실시예 1 35 32 45 49
실시예 2 30 39 77 105
실시예 3 76 66 73 80
실시예 4 58 63 86 103
실시예 5 107 119 95 126
실시예 6 5 14 -8 26
실시예 7 43 50 51 55
실시예 8 -76 -31 37 63
실시예 9 -68 -126 -105 -82
실시예 10 -42 16 39 100
실시예 11 -25 8 14 11
실시예 12 -96 12 4 35
실시예 13 -4 27 15 -42
실시예 14 4 -23 -19 19
실시예 15 41 78 119 81
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 물 추출물인 비교예 1보다 용매 분획물 중 물 분획물인 실시예 5에서 MMP-1의 발현을 강하게 억제한다는 것을 확인하였다. 또한 에탄올 추출물인 비교예 3과 비교시, 물 분획물인 실시예 15에서 강한 MMP-1 억제활성을 나타냄을 확인하였다.
자외선 처리한 피부세포에서의 허니부쉬 Diain HP-20 분획물의 MMP-1 활성억제율(%)
10 ug/ml 25 ug/ml 50 ug/ml 100 ug/ml
비교예 1 60 44 56 67
비교예 2 54 57 68 42
비교예 3 54 23 43 26
실시예 16 46 84 100 89
실시예 17 3 51 95 116
실시예 18 47 -15 51 76
실시예 19 91 89 105 95
실시예 20 55 71 11 -18
실시예 21 82 107 106 107
실시예 22 20 23 21 17
실시예 23 1 -6 39 13
실시예 24 46 86 120 126
실시예 25 66 74 104 116
실시예 26 16 28 51 52
실시예 27 41 43 59 54
실시예 28 15 -20 45 36
실시예 29 56 45 75 63
실시예 30 21 63 43 51
또한, Diaion HP-20 레진을 이용한 분획물의 경우, 비교예 1의 물 추출물과 비교시, 물 용출 분획물인 실시예 16, 20% 메탄올 용출 분획물인 실시예 17, 및 70% 메탄올 용출 분획물인 실시예 19에서 강한 MMP-1 억제활성이 있음을 확인하였다.
또한, 비교예 2의 70% 에탄올 추출물과 비교시, 물 용출 분획물인 실시예 21, 70% 메탄올 용출 분획물인 실시예 24, 및 100% 메탄올 용출 분획물인 실시예 25 역시 우수한 MMP-1 억제활성이 있음을 확인하였다.
실험예 3: UV-B를 처리한 세포에서의 허니부쉬 분획물의 MMP -9 억제활성
상기 실험예 1의 세포보호효과와 실험예 2의 MMP-1 억제활성 결과를 토대로, 그 효과가 우수한 분획물(실시예 5, 7, 13, 15, 16, 17, 19, 21, 24, 25)을 선별하여 최종 MMP-9 억제활성을 측정함으로써, 광노화(주름개선) 효과를 확실히 증명하였다.
우선, 각질형성세포인 HaCaT(human keratinocyte) 세포주를 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지로 37℃에서, 5% CO2 배양기에서 배양하였고, 배양된 세포는 96웰 플레이트에 5×104 cells/ well의 세포수로 분주하였다.
96웰 플레이트에 세포를 분주한 후, 세포가 완전히 붙어 세포의 모양을 갖추도록 24시간 배양 후에, 실시예 5, 7, 13, 15, 16, 17, 19, 21, 24 및 25의 분획물을 10, 50, 100 ug/ml 농도로 처리하고 다시 24시간 배양하였다.
이후, 세포를 serum free 배지로 교체한 후 UV-B를 20mJ/cm2 로 30분 처리하고 배지만 취하여, MMP-9 키트로 어세이를 진행하였다. 모든 반응이 끝난 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 MMP-9의 활성억제율을 계산하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
자외선 처리한 피부세포에서의 허니부쉬 분획물의 MMP-9 활성억제율(%)
10 ug/ml 50 ug/ml 100 ug/ml
실시예 5 14 122 100
실시예 7 109 90 107
실시예 13 106 106 95
실시예 15 103 89 107
실시예 16 59 91 125
실시예 17 53 100 86
실시예 19 70 124 103
실시예 21 56 67 90
실시예 24 115 84 101
실시예 25 79 87 95
실험예 4: UV-B 처리한 세포에서의 허니부쉬 분획물 유래 화합물의 세포보호 효과
UV를 처리한 세포에서의 허니부쉬 분획물(실시예 7, 실시예 16) 유래 화합물의 세포보호효과를 표 6에 나타내었다.
자외선 처리한 피부세포에서의 허니부쉬 유래 화합물의 보호효과(단위: 세포생존율 %)
화합물 10 ug/ml 50 ug/ml 100 ug/ml 200 ug/ml
헤스페리딘 77 89 92 99
5,7-디하이드록시크로몬 25 28 29 28
4-하이드록시벤잘데하이드 29 28 32 45
4-하이드록시아세토페논 28 33 31 35
헤스페레틴 38 53 59 87
프로토카테큐익산 45 55 56 73
상기에 나타난 바와 같이, 실시예 16 유래의 화합물인 헤스페리딘은 저농도 (10 ug/ml)부터 우수한 세포보호효과를 나타내었다. 또한 프로토카테큐익산의 경우 고농도로 처리했을 때 세포보호효과가 있는 것으로 확인되었다.
실시예 7 유래의 화합물인 헤스페리틴의 경우도 고농도에서 세포보호효과가 있는 것으로 확인되었다.
실험예 5: UV-B 처리한 세포에서의 허니부쉬 분획물 유래 화합물의 MMP -1 억 제활성
UV를 처리한 세포에서의 허니부쉬 분획물 (실시예 7, 실시예 16) 유래 화합물의 MMP-1 억제효과를 표 7에 나타내었다.
자외선 처리한 피부세포에서의 허니부쉬 유래 화합물의 MMP-1 활성억제율(%)
화합물 10 ug/ml 50 ug/ml 100 ug/ml 200 ug/ml
헤스페리딘 59 83 88 99
5,7-디하이드록시크로몬 -9 -7 6 30
4-하이드록시벤잘데하이드 21 27 25 39
4-하이드록시아세토페논 86 94 109 114
헤스페레틴 106 107 114 113
프로토카테큐익산 93 98 98 105
상기에 나타난 바와 같이, 실시예 16 유래의 화합물인 헤스페리딘은 50 ug/ml 농도부터 강한 MMP-1 억제활성을 나타내었다. 또한 프로토카테큐익산의 경우 저농도인 10 ug/ml 부터 고농도까지 강한 억제활성이 있는 것으로 확인되었다.
실시예 7 유래의 화합물인 4-하이드록시아세토페논과 헤스페리틴의 경우, 저농도에서 고농도까지 MMP-1 억제활성이 있는 것으로 확인되었다.
실험예 6: UV-B 처리한 세포에서의 허니부쉬 분획물 유래 화합물의 MMP -9 억 제활성
UV를 처리한 세포에서의 허니부쉬 분획물(실시예 7, 실시예 16) 유래 화합물의 MMP-9 억제효과를 표 8에 나타내었다.
자외선 처리한 피부세포에서의 허니부쉬 유래 화합물의 MMP-9 활성억제율(%)
화합물 10 ug/ml 50 ug/ml 100 ug/ml 200 ug/ml
헤스페리딘 61 85 77 95
5,7-디하이드록시크로몬 93 103 104 105
4-하이드록시벤잘데하이드 80 99 103 111
4-하이드록시아세토페논 95 97 101 109
헤스페레틴 79 86 103 115
프로토카테큐익산 99 105 114 104
상기에 나타난 바와 같이, 실시예 16 유래의 화합물인 헤스페리딘은 50 ug/ml 농도부터 MMP-9에 대하여 80%를 상회하는 억제활성을 나타내었다. 이 외에도 프로토카테큐익산의 경우 저농도인 10 ug/ml 부터 고농도까지 강한 억제활성이 있는 것으로 확인되었다.
실시예 7 유래의 화합물인 5,7-디하이드록시크로몬, 4-하이드록시벤잘데하이드, 4-하이드록시아세토페논과 헤스페리틴의 경우, 저농도에서 고농도까지 MMP-9에 대한 강한 억제활성이 있는 것으로 확인되었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (7)

  1. 4-하이드록시벤잘데하이드를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 4-하이드록시벤잘데하이드는 허니부쉬 추출물의 분획물로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 4-하이드록시벤잘데하이드의 용량은 10㎍/㎖ 내지 200㎍/㎖인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 및 MMP-9(matrix metalloproteinase-9) 억제를 통한 피부 주름 개선용인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 분말, 산제, 과립제, 음료, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 경피제, 좌제 또는 주사용액으로 제형화된 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  6. 4-하이드록시벤잘데하이드를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
  7. 4-하이드록시벤잘데하이드를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 건강기능식품 조성물.
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