KR20220009996A - 메소텔린 car 및 그의 용도 - Google Patents

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프라사드 에스. 아두수밀리
마이클 사델라인
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메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터
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Abstract

본 개시된 주제는 메소텔린을 표적화하는 키메라 항원 수용체(CAR); 및 우성 음성 형태의 프로그램화 죽음 1(PD-1 DN);을 포함하는 폴리펩티드 조성물을 제공한다. 또한, 이러한 폴리펩티드 조성물을 포함하는 면역반응성 세포 및 치료, 예컨대 고형 종양을 치료하기 위한 상기 폴리펩티드 조성물 및 면역반응성 세포의 용도가 제공된다.

Description

메소텔린 CAR 및 그의 용도
본 출원은 그 각각의 내용 전체가 인용에 의해 포함되고, 각각 우선권이 주장되는 2019년 5월 16일자로 출원된 미국 가출원 제62/848,983호, 및 2020년 2월 13일자로 출원된 미국 가출원 제62/975,966호에 대한 우선권을 주장한다.
서열목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출되고, 그 전체가 인용에 의해 포함되는 서열목록을 포함한다. 2020년 5월 13일자로 생성된 ASCII 사본은 그 명칭이 0727341041SL_ST25.TXT이고, 크기가 144,318 바이트이다.
1. 서론
본 개시된 주제는 암 및 병원체를 향한 면역 반응을 향상시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이것은 인간 메소텔린(mesothelin)을 특이적으로 표적화하는 키메라 항원 수용체(CAR), 및 이러한 CAR을 포함하는 면역반응성 세포에 관한 것이다. 본 개시된 메소텔린-표적화 CAR은 항-종양 활성을 포함하는 향상된 면역-활성화 특성을 갖지만, CAR-유도 독성 및 면역원성(immunogenicity)을 최소화하는 특징을 갖는다.
2. 본 발명의 배경기술
세포-기반 면역치료법은 암의 치료에 대한 치유적 잠재력을 갖는 치료법이다. T 세포 및 다른 면역 세포는 선택된 항원에 특이적이고 키메라 항원 수용체(CAR)로 명명된, 항원에 대한 인공 또는 합성 수용체를 코딩하는 유전자 물질의 도입을 통해 종양 항원을 표적화하기 위해 변형될 수 있다. CAR을 이용한 표적화 T 세포 치료법은 일부 혈액학적 악성물의 치료에 있어서 최근 임상적 성공을 보여주었다. 그러나, CAR-발현 T 세포 치료법을 고형 종양으로 옮기는 것은 임상적 유익을 달성하기 위해 극복해야만 하는 몇 가지 난관을 제기한다. 악성 세포는 면역 인식 및 제거로부터 그 자신을 보호하기 위하여 면역억제성 미세환경을 생성하도록 적응한다. 상기 종양 미세환경은 표적화 T 세포 치료법과 같이 면역 반응의 자극을 수반하는 치료 방법에 대한 도전과제를 제기한다. 고형 종양은 또한 효율적인 T 세포 수송(trafficking)을 지연시키고, 작용성(agonistic)의 공-자극성 리간드의 발현이 없고, 및/또는 T 세포 기능의 음성 조절자를 발현하는 해부학적 구획(compartment) 내로 제한될 수 있다. 따라서, 고형 종양의 성공적인 제거는 효과적인 종양 침입 및 종양-유도 면역억제의 극복을 필요로 한다. 또한, 고형 종양은 최적의 면역 표적(강력한 T 세포에 의한 종양 근절을 가능하게 하고 비-종양 조직에 대해 최소이거나 용인가능한 독성을 갖는 항원)을 선별하기 위한 도전과제를 제기한다.
따라서, 최소의 독성 및 면역원성으로 강력한 종양 근절을 유도할 수 있는 암, 특히 고형 종양을 치료하기 위해 CAR을 디자인하기 위한 신규한 치료 전략에 대한 필요성이 있다.
3. 본 발명의 요약
본 개시된 주제는 (a) 메소텔린(예컨대, 인간 메소텔린)을 특이적으로 표적화하는 키메라 항원 수용체(CAR); 및 (b) 우성 음성 형태의 프로그램화 죽음 1(PD-1 DN)을 포함하는 폴리펩티드 조성물; 이러한 폴리펩티드 조성물을 포함하는 면역반응성 세포, 및 예컨대 암을 치료하기 위한 상기 폴리펩티드 조성물 및 면역반응성 세포의 용도;를 제공한다.
본 개시된 주제는 폴리펩티드 조성물을 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 폴리펩티드 조성물은 ⅰ) 키메라 항원 수용체(CAR) 및 ⅱ) 우성 음성 형태의 프로그램화 죽음 1(PD-1 DN)을 포함하며, 여기서 상기 CAR은 (a) 세포외 항원-결합 도메인 및 (b) ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서 각각의 ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체는 2개의 기능 상실(loss-of-function) 돌연변이를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 서열번호 76에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 77에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 78에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 79에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 80에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 81에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 (a) 리간드 결합 영역을 포함하는 프로그램화 죽음 1(PD-1)의 세포외 도메인의 적어도 일부, 및 (b) 제1 막통과 도메인을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN의 제1 막통과 도메인은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD4 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN의 제1 막통과 도메인은 CD8 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN의 제1 막통과 도메인에 포함되는 CD8 폴리펩티드는 서열번호 86의 아미노산 137 내지 207을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 세포내 도메인이 없다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 서열번호 48의 아미노산 21 내지 165 및 서열번호 86의 아미노산 137 내지 207을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 약 1 nM 내지 약 25 nM의 EC50 값으로 인간 메소텔린에 특이적으로 결합한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 약 20 nM의 EC50 값으로 인간 메소텔린에 특이적으로 결합한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 단일-사슬 가변 단편(scFv), 선택적으로 가교결합되는 Fab, 또는 F(ab)2를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 인간 scFv를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 약 1,000개 이상의 메소텔린 결합 부위/세포의 메소텔린 발현 레벨로 인간 메소텔린을 인식한다.
소정 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 82에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 상동성 내지 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 82에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 83에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 상동성 내지 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 83에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 82에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 상동성 내지 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 83에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 상동성 내지 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 82에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 83에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 사이에 링커(linker)를 포함한다.
소정 구현예에서, 리더(leader)는 세포외 항원-결합 도메인의 N-말단에 공유적으로 연결된다. 소정 구현예에서, 상기 리더는 CD8 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CD8 폴리펩티드는 서열번호 71에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1의 세포외 도메인의 적어도 일부는 서열번호 48의 아미노산 21 내지 165를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 변형된 CD3ζ 폴리펩티드 내의 각각의 기능 상실 돌연변이는 티로신 아미노산 잔기에 있다. 소정 구현예에서, 상기 ITAM2 변이체는 서열번호 29에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 ITAM3 변이체는 서열번호 33에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형 ITAM1을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 자연형 ITAM1은 서열번호 23에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 35에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
소정 구현예에서, 상기 CAR은 서열번호 56에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
소정 구현예에서, 상기 CAR은 제2 막통과 도메인을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 제2 막통과 도메인은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD4 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 제2 막통과 도메인은 CD28 폴리펩티드를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 공-자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 CD28 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, DAP-10 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 폴리펩티드, NKGD2 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 CD28 폴리펩티드를 포함한다.
본 개시된 주제는 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 조성물을 포함하는 면역반응성 세포를 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN 및/또는 CAR은 재조합적으로 발현된다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN 및/또는 CAR은 벡터로부터 발현된다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 이로부터 림프성 세포가 분화될 수 있는 다능성 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 다능성 줄기 세포는 배아 줄기 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포이다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 T 세포이다. 소정 구현예에서, 상기 T 세포는 세포독성 T 림프구(CTL), 조절성 T 세포, 및 자연 살해 T(NKT) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 자가성(autologous)이다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 동종성(allogenic)이다.
본 개시된 주제는 본 명세서에 개시된 면역반응성 세포를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 약학적 조성물이다. 소정 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 약 104 내지 106의 면역반응성 세포를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 적어도 약 105의 면역반응성 세포를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 약 105의 면역반응성 세포를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 대상체에서 신생물을 예방 및/또는 치료하고, 재발된 신생물을 갖는 대상체를 치료하고, 대상체에서 종양 부하(burden)를 감소시키고, 신생물을 갖는 대상체의 생존을 증가시키거나 늘리고, 대상체에서 염증성 질환을 예방 및/또는 치료하고, 및/또는 기관 이식의 수용자인 대상체에서 이식 거부를 예방하기 위한 것이다.
또한, 본 개시된 주제는 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 조성물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 조성물을 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 123에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 124에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 개시된 주제는 본 개시된 핵산 조성물을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 소정 구현예에서, 상기 레트로바이러스 벡터는 γ-레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다.
본 개시된 주제는 본 명세서에 개시된 면역반응성 세포를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 방법은 본 개시된 폴리펩티드 조성물, 본 개시된 핵산 조성물, 또는 본 개시된 벡터를 면역반응성 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
본 개시된 주제는 본 개시된 폴리펩티드 조성물, 본 개시된 핵산 조성물, 본 개시된 벡터, 본 개시된 면역반응성 세포, 또는 본 개시된 약학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 키트는 신생물을 치료 및/또는 예방하기 위한 기록된 설명서를 추가로 포함한다.
아울러, 본 개시된 주제는 전술한 면역반응성 세포를 이용하는 다양한 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 개시된 주제는 대상체에서 종양 부하를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 본 명세서에 개시된 유효량의 면역반응성 세포 또는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 방법은 대상체에서 종양 세포의 수를 감소시키고, 종양의 크기를 감소시키고, 및/또는 종양을 근절한다.
본 개시된 주제는 또한 신생물을 갖는 대상체의 생존을 증가시키거나 늘리는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 유효량의 본 개시된 면역반응성 세포 또는 본 개시된 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 종양 또는 신생물은 고형 종양이다. 소정 구현예에서, 상기 고형 종양은 중피종, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 결장암, 흉막 종양, 교모세포종, 식도암, 위의 암, 활막 육종, 흉선 암종, 자궁내막 암종, 위암, 담관암종, 자궁경부암, 침샘암, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시된 주제는 재발된 신생물을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 유효량의 면역반응성 세포 또는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 대상체는 상기 면역반응성 세포 또는 조성물의 투여 이전에 면역치료법을 받았다.
부가적으로, 본 개시된 주제는 대상체에서 암 세포 또는 병원체에 대한 반응으로 면역-활성화 사이토카인 생산을 증가시키는 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 유효량의 면역반응성 세포 또는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 면역-활성화 사이토카인은 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-3, IL-6, IL-11, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, 인터페론 조절 인자 7(IRF7), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시된 주제에 따라, 전술한 다양한 방법은 적어도 하나의 면역조절제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 적어도 하나의 면역조절제는 면역자극제, 체크포인트(checkpoint) 면역 차단제, 방사선 치료법 제제, 화학치료법 제제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 면역자극제는 IL-12, 작용성 공-자극성 단일클론 항체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 면역자극제는 IL-12이다. 일부 구현예에서, 상기 작용성 공-자극성 단일클론 항체는 항-4-1BB 항체, 항-OX40 항체, 항-ICOS 항체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 작용성 공-자극성 단일클론 항체는 항-4-1BB 항체이다. 소정 구현예에서, 상기 체크포인트 면역 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-LAG3 항체, 항-B7-H3 항체, 항-TIM3 항체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 체크포인트 면역 차단제는 항-PD-L1 항체 또는 항-PD-1 항체이다. 소정 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다.
소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 흉막으로 또는 흉막내로 대상체에게 투여된다.
본 개시된 주제는 대상체에서 염증성 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 방법은 본 개시된 면역반응성 세포 또는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 면역억제성 세포이다. 소정 구현예에서, 상기 면역억제성 세포는 조절성 T 세포이다. 소정 구현예에서, 상기 염증성 질환은 췌장염이다. 소정 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다. 소정 구현예에서, 상기 대상체는 기관 이식의 수용자이다. 소정 구현예에서, 상기 대상체는 췌장 이식의 수용자이다.
본 개시된 주제는 기관 이식의 수용자인 대상체에서 이식 거부를 방지하는 방법을 추가로 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 방법은 본 개시된 면역반응성 세포 또는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 면역억제성 세포이다. 소정 구현예에서, 상기 면역억제성 세포는 조절성 T 세포이다. 소정 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다. 소정 구현예에서, 상기 대상체는 췌장 이식의 수용자이다.
4. 도면의 간단한 설명
예로서 제공되지만 기술된 특정 구현예로 본 개시된 주제를 한정하기 위한 의도가 아닌 다음의 상세한 설명은 부속하는 도면과 함께 이해될 수 있다.
도 1은 본 개시된 주제의 소정 구현예에 따른 폴리펩티드 조성물을 도시한다. 상기 폴리펩티드 조성물은 항-메소텔린(MSLN) scFv, CD28 막통과 도메인, CD28 세포질 신호전달 도메인, (예컨대, ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체를 포함하는) CD3zeta 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 포함한다. 상기 CAR은 절단가능한 P2A 펩티드를 통해 PD1DNR(및 PD1 신호전달 도메인)에 융합된다. SP: 신호전달 펩티드; scFv: 단일-사슬 가변 단편; TM: 막통과 도메인; cyt: 세포기질 도메인; DNR: 우성 음성 수용체; LTR: 긴 말단 반복.
도 2는 실시예 2에 개시된 다양한 구조체를 도시한다.
도 3a 내지 도 3d는 프로듀서(producer) 세포주 RD114에서의 바이러스 생산을 도시한다. RD114 세포를 상이한 희석의 H29 바이러스 상등액(비희석, 1:2, 및 1:4)으로 형질도입하였고, 항-Fab 항체를 이용한 유세포분석에 의해 CAR 발현에 대해 염색하였다. RD114 엠프티(empty)는 음성 대조군으로 기능하였다. 도 3a는 (음성 대조군으로서) RD114 엠프티를 보여준다. 도 3b는 비희석을 보여주고; 도 3c는 상등액 1:2 희석을 보여주고; 도 3d는 상등액 1:4 희석을 보여준다.
도 4a 내지 도 4e는 M28z1XX-P2A-PD1DNR을 이용한 인간 T 세포의 형질도입을 도시한다 - 공여자 H116-2. PHA-활성화 T 세포를 상이한 농도의 RD114 바이러스 상등액으로 형질도입하였고(도 4a는 1:2를 보여주고, 도 4b는 1:5를 보여주고, 도 4c는 1:7을 보여주고, 도 4d는 1:15를 보여주고, 도 4e는 비-형질도입("UT")을 보여줌), 유세포분석을 이용하여 항-Fab 염색에 의한 CAR 발현 및 항-PD1 염색에 의한 PD1DNR에 대해 염색하였다.
도 5a 내지 도 5e는 M28z1XX-P2A-PD1DNR을 이용한 인간 T 세포의 형질도입을 도시한다 - 공여자 H18. PHA-활성화 T 세포를 상이한 농도의 RD114 바이러스 상등액으로 형질도입하였고(도 5a는 1:2를 보여주고, 도 5b는 1:5를 보여주고, 도 5c는 1:10을 보여주고, 도 5d는 1:15를 보여주고, 도 5e는 비-형질도입("UT")을 보여줌), 유세포분석을 이용하여 항-Fab 염색에 의한 CAR 발현 및 항-PD1 염색에 의한 PD1DNR에 대해 염색하였다.
도 6a 내지 도 6f는 M28z1XX-P2A-PD1DNR을 이용한 인간 T 세포의 형질도입을 도시한다 - 공여자 H19. PHA-활성화 T 세포를 상이한 농도의 RD114 바이러스 상등액으로 형질도입하였고(도 6a는 1:2를 보여주고, 도 6b는 1:5를 보여주고, 도 6c는 1:7을 보여주고; 도 6d는 1:10을 보여주고, 도 6e는 1:15를 보여주고, 도 6f는 비-형질도입("UT")을 보여줌), 유세포분석을 이용하여 항-Fab 염색에 의한 CAR 발현 및 항-PD1 염색에 의한 PD1DNR에 대해 염색하였다.
도 7a 내지 도 7c는 벡터 사본 수(VCN)와 중앙 형광 강도(MFI)의 상관관계를 도시한다. PHA-활성화 T 세포를 상이한 농도의 RD114 바이러스 상등액으로 형질도입하였고, 항-Fab 염색 및 유세포분석법에 의해 CAR 발현에 대해 염색하였다. 형질도입된 T 세포의 게놈 DNA를 단리하였고, 벡터 사본 수를 qPCR을 이용하여 VCN/㎍ DNA로서 결정하였다. CAR-양성 세포의 MFI는 3명의 상이한 공여자에 대하여 VCN/㎍ DNA로 연관되었다. 도 7a는 공여자 H19를 보여주고; 도 7b는 공여자 H18을 보여주고, 도 7c 공여자 H116-2를 보여준다.
도 8은 3명의 상이한 공여자 유래의 형질도입된 T 세포에 대한 세포독성을 도시한다. MSLN 높음(high) 표적 세포(MGM)를 임피던스(impedance)-기반 분석법을 이용하여 상이한 E:T 비에서 상이한 공여자 유래의 M28z1xx-PD1DNR CAR T 세포와 함께 공-배양하였다. M28z1xx-PD1DNR CAR T-세포는 E:T 비 1:1에서 MGM 세포의 세포용해를 매개하였다. M28z1xx-PD1DNR CAR T 세포는 MSLN 높음 표적 세포를 살상하였다.
도 9는 임피던스-기반 세포독성 측정(eCTL)의 예를 도시한다.
도 10은 eCTL을 이용한 다양한 구조체의 비교 분석의 파라미터(parameter)를 도시한다.
도 11a 내지 도 11e는 표적 세포주의 MSLN 및 PD-L1 발현을 도시한다. 중피종(MGM(도 11a에 나타냄), MGM-PDL1(도 11b에 나타냄) 및 MSTOG(도 11c에 나타냄)) 및 폐암(A549GM(도 11d에 나타냄) 및 A549G(도 11e에 나타냄)) 세포주를 유세포분석에 의한 MSLN 및 PD-L1 발현에 대해 평가하였다. MGM, MGM-PDL1 및 A549GM는 MSLN을 과발현하였다; MGM-PDL1 세포는 부가적으로 PD-L1을 과발현하였다.
도 12a 내지 도 12e는 형질도입된 T 세포의 CAR 및 PD1 발현을 도시한다. M28z(도 12a에 나타냄), M28z1xx(도 12b에 나타냄), M28z-PD1DNR(도 12c에 나타냄) 및 M28z1xx-PD1DNR(도 12d에 나타냄)로 형질도입된 인간 T 세포를 유세포분석을 이용하여 항-myc 염색에 의한 CAR 발현 및 항-PD1 염색에 의한 PD1/PD1DNR 발현에 대해 분석하였다. 도 12e는 비-형질도입("UT")된 T 세포를 보여준다.
도 13a 내지 도 13c는 MSLN 높음 종양 세포(MGM)에 대해 1XX 도메인 및 PD1DNR를 보유하는 CAR T 세포의 항-종양 효능의 비교 분석을 도시한다. MSLN 높음 표적 세포(MGM)를 표시된 E:T 비에서 M28z, M28z1xx, M28z-PD1DNR, M28z1XX-PD1DNR 또는 비-형질도입된 T 세포와 함께 공-배양하였다. 항-종양 효능을 임피던스-기반 분석법을 이용하여 평가하였다. 도 13a는 약 3:1의 E:T 비를 보여준다. 도 13b는 약 1:1의 E:T 비를 보여준다. 도 13c는 약 0.33:1의 E:T 비를 보여준다.
도 14는 MSLN 높음 종양 세포(MGM)에 대해 1xx 도메인 및 PD1DNR을 보유하는 CAR T 세포의 세포독성의 비교 분석을 도시한다. 크롬-51로 표지된 MSLN 높음 표적 세포(MGM)를 표시된 E:T 비에서 18시간 동안 M28z, M28z1xx, M28z-PD1DNR, M28z1xx-PD1DNR 또는 비-형질도입된 T 세포와 함께 공-배양하였다. 세포독성을 크롬-51 CTL에 의해 결정하였다.
도 15a-15c는 MSLN 음성 종양 세포(MSTOG)에 대해 1xx 도메인 및 PD1DNR을 보유하는 CAR T 세포의 항-종양 효능의 비교 분석을 도시한다. MSLN 음성 표적 세포(MSTOG)를 표시된 E:T 비에서 M28z, M28z1xx, M28z-PD1DNR, M28z1xx-PD1DNR 또는 비-형질도입된 T 세포와 함께 공-배양하였다. 항-종양 효능을 임피던스-기반 분석법을 이용하여 평가하였다. 도 15a는 약 3:1의 E:T 비를 보여준다. 도 15b는 약 1:1의 E:T 비를 보여준다. 도 15c는 약 0.33:1의 E:T 비를 보여준다.
도 16은 MSLN 음성 종양 세포(MSTOG)에 대해 1XX 도메인 및 PD1DNR을 보유하는 CAR T 세포의 세포독성의 비교 분석을 도시한다. 크롬-51로 표지된 MSLN 음성 표적 세포(MSTOG)를 표시된 E:T 비에서 18시간 동안 M28z, M28z1XX, M28z-PD1DNR, M28z1XX-PD1DNR 또는 비-형질도입된 T 세포와 함께 공-배양하였다. 세포독성을 크롬-51 CTL에 의해 결정하였다.
도 17a 내지 도 17c는 PDL1을 과발현하는 MSLN 높음 종양 세포에 대해 1XX 도메인 및 PD1DNR을 보유하는 CAR T 세포의 항-종양 효능의 비교 분석을 도시한다. PDL1을 과발현하는 MSLN 높음 표적 세포(MGM-PDL1)를 표시된 E:T 비에서 M28z, M28z1XX, M28z-PD1DNR, M28z1XX-PD1DNR 또는 비-형질도입된 T 세포와 함께 공-배양하였다. 항-종양 효능을 임피던스-기반 분석법을 이용하여 평가하였다. 도 17a는 약 3:1의 E:T 비를 보여준다. 도 17b는 약 1:1의 E:T 비를 보여준다. 도 17c는 약 0.33:1의 E:T 비를 보여준다.
도 18a 내지 도 18c는 MSLN 높음 종양 세포(A549GM)에 대해 1xx 도메인 및 PD1DNR를 보유하는 CAR T 세포의 항-종양 효능의 비교 분석을 도시한다. MSLN 높음 표적 세포(A549GM)를 표시된 E:T 비에서 M28z, M28z1xx, M28z-PD1DNR, M28z1xx-PD1DNR 또는 비-형질도입된 T 세포와 함께 공-배양하였다. 항-종양 효능을 임피던스-기반 분석법을 이용하여 평가하였다. 도 18a는 약 10:1의 E:T 비를 보여준다. 도 18b는 약 5:1의 E:T 비를 보여준다. 도 18c는 약 2:1의 E:T 비를 보여준다.
도 19a-19c는 1xx 도메인 및 PD1DNR: MSLN 낮음 종양 세포(A549G)를 보유하는 CAR T 세포의 항-종양 효능의 비교 분석을 도시한다. MSLN 낮음 표적 세포(A549G)를 표시된 E:T 비에서 M28z, M28z1xx, M28z-PD1DNR, M28z1xx-PD1DNR 또는 비-형질도입된 T 세포와 함께 공-배양하였다. 항-종양 효능을 임피던스-기반 분석법을 이용하여 평가하였다. 도 19a는 약 10:1의 E:T 비를 보여준다. 도 19b는 약 5:1의 E:T 비를 보여준다. 도 19c는 약 2:1의 E:T 비를 보여준다.
도 20a 내지 도 20d는 다양한 처리의 생체내 연구 결과를 도시한다. 도 20a는 CAR T 세포 - M28z, M28z와 PD1 항체, 및 M28z와 PD1DNR의 비교 생체내 효능을 보여준다. 도 20b는 M28z 및 M28z1XX+PD1DNR CAR T 세포의 비교 생체내 효능을 보여준다. 도 20c는 종양 재도전(rechallenge) 이후에 전신 항-종양 면역력(immunity)을 보여주는 종양 부하 이미지를 보여준다. 도 20d는 CAR T 세포의 침입을 보여주는 동소성(orthotopic) MPM 종양의 생체외(ex vivo) 면역형광 염색을 보여준다.
도 21은 M28z1XXPD1DNR CAR의 구조 및 성분을 도시한다. M28z와 대조적으로, M28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 단일 기능 ITAM를 갖는 돌연변이 CD3ζ 신호전달 도메인을 보유하고, CD8 막통과 및 힌지(hinge) 도메인으로 이루어지는 PD1DNR을 공-발현하며, 내인성(endogenous) PD1에 존재하는 세포내 PD1 신호전달 도메인이 없다.
도 22는 CAR T 세포 벡터의 구조를 도시한다.
도 23은 종양 세포주에 대한 메소텔린(MSLN), PD-L1, 및 GFP의 발현을 도시한다. MGM, MGM-PDL1, 및 MSTOG 종양 세포를 유세포분석에 의해 메소텔린(왼쪽 패널), PD-L1(가운데 패널), 및 GFP(오른쪽 패널)의 발현에 대해 분석하였다. 측면 산란 영역(Y-축)에 대해 플롯팅된 상대적 발현 강도를 도시하는 밀도 플롯을 보여준다.
도 24a 내지 도 24d는 동소성 MPM 마우스 모델을 도시한다. 도 24a는 심장, 폐, 및 종격(mediastinal) 구조를 감싸는 종양 및 흉벽을 침입하는 종양(아래 패널)과 함께 MPM의 마우스 모델(오른쪽 위 패널)에서 재생산되는 인간 MPM(왼쪽 위 패널)의 육안 외형(gross appearance)을 보여준다. 도 24b는 종양의 대규모 혈관분포(vascularity)가 CD34 면역형광에 의해 입증됨을 보여준다. 도 24c는 BLI에 의해 추적된 종양 부하 진행이 해당 시점에서 MRI에 의한 종양 부피 측정과 연관됨을 보여준다. 도 24d는 일련의 BLI 및 MRI에 의해 추적된 종양 부하 진행을 보여준다.
도 25a 내지 도 25c는 면역조직화학 분석에 의한 인간 조직에서의 메소텔린의 발현을 도시한다. 도 25a는 MPM 대 정상 흉막 및 심막에서 메소텔린의 발현을 보여준다. 도 25b는 폐 선암종 대 정상 폐 조직에서 메소텔린의 발현을 보여준다. 도 25c는 3중-음성 유방암 대 정상 유방 조직에서 메소텔린의 발현을 보여준다.
도 26은 M28z1XXPD1DNR 발현이 상이한 희석의 바이러스 상등액을 이용하여 적정될 수 있음을 도시한다. 인간 T 세포를 M28z1XXPD1DNR(왼쪽 패널) 또는 mycM28z1XXPD1DNR(가운데 패널)에 대해 암호화하는 상이한 희석의 바이러스 상등액으로 형질도입하였다. 살아있는 CD3-양성 세포의 CAR(Y-축) 및 PD1(X-축)의 발현을 유세포분석에 의해 평가하였다. 3명의 상이한 공여자를 대표하여 1명의 공여자로부터의 결과가 도시된다.
도 27은 MFI에 의해 측정된 CAR 발현이 VCN과 연관성이 있음을 도시한다. 3명의 상이한 공여자로부터 유래된 인간 T 세포를 M28z1XXPD1DNR 또는 mycM28z1XXPD1DNR에 대해 암호화하는 상이한 희석의 레트로바이러스 상등액으로 형질도입하였다. (유세포분석에 의해 결정된) CAR-양성 T 세포의 MFI를 (qPCR에 의해 결정된) VCN에 대해 플롯팅하였다. R2 값은 선형 회귀 분석으로부터 유래되었다(흑색 선).
도 28a 내지 도 28d는 mycM28z1XXPD1DNR 및 mycM28z CAR T 세포에서 PD1 및 PD1DNR의 발현을 도시한다. 도 28a는 mycM28z 및 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 CAR 표면 발현 백분율을 보여준다. 도 28b는 PD1 표면 발현에 대해 양성인 CD3-양성 세포의 백분율을 보여준다. 도 28c는 CD3-양성 세포의 PD1 표면 발현의 MFI를 보여준다. 도 28d는 비-형질도입된 T 세포의 경우와 비교하여 배수 변화로 나타낸 PD1 세포외 및 PD1 세포내 도메인의 상대적 mRNA 발현을 보여준다.
도 29는 myc-태그를 갖거나 갖지 않는 M28z1XXPD1DNR-발현 T 세포가 시험관내에서 동일한 항-종양 효능을 나타냄을 도시한다. 3명의 상이한 공여자로부터 유래된 인간 T 세포를 M28z1XXPD1DNR(적색) 또는 mycM28z1XXPD1DNR(녹색)로 형질도입하였고(형질도입 범위, 37%-63%), MGM 세포(녹색; 화살표는 T-세포 첨가 시간을 나타냄)와 함께 공-배양하였다. 양쪽 구조체의 항-종양 효능을 임피던스-기반 세포독성 분석법을 이용하여 표시된 E:T 비에서 비교하였다.
도 30은 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포가 항원-특이적, HLA-비의존적 종양 용해를 매개함을 보여준다. mycM28z1XXPD1DNR(청색) 또는 mycM28z(적색)으로 형질도입된 인간 T 세포를 표시된 E:T 비에서 MGM, MGM-PDL1, 또는 MSTOG 종양 세포와 함께 공-배양하였다. CAR T 세포의 세포독성을 18시간의 공-배양 후에 51Cr-방출 분석법에 의해 평가하였다. 비-형질도입된 T 세포(오렌지색)는 대조군으로 기능하였다.
도 31은 메소텔린-발현 종양 세포를 이용한 자극시에 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 축적을 도시한다. mycM28z1XXPD1DNR(청색) 또는 mycM28z(적색)으로 형질도입된 인간 T 세포를 1:1의 E:T 비에서 48시간 동안 MGM 또는 MGM-PDL1 표적 세포에 반복적으로 노출하였다. CAR T 세포의 축적을 각각의 항원 자극 후에 절대적 CAR T-세포 카운트에 의해 정량하였다.
도 32는 초기 항원 자극시에 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포가 mycM28z CAR T 세포에 대해 유사한 세포독성을 나타냄을 보여준다. mycM28z1XXPD1DNR(청색) 또는 mycM28z(적색)으로 형질도입된 인간 T 세포를 표시된 E:T 비에서 51Cr-표지된 MGM 또는 MGM-PDL1 표적 세포와 함께 공-배양하였다. 세포독성을 51Cr-방출 분석법을 이용하여 18시간 후에 평가하였다. 비-형질도입된 T 세포(오렌지색)는 대조군으로 기능하였다.
도 33은 반복된 항원 자극시에 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포가 항-종양 효능을 유지함을 보여준다. mycM28z1XXPD1DNR(청색) 또는 mycM28z(적색)으로 형질도입된 인간 T 세포를 3:1의 E:T 비에서 4회 자극하고, 이어서 1:1의 E:T 비에서 2회 추가 자극한 후 48시간 동안 MGM(왼쪽 패널) 또는 MGM-PDL1(오른쪽 패널) 표적 세포에 반복적으로 노출하였다. CAR T 세포의 세포독성을 표시된 E:T 비에서 18시간 동안 공-배양한 후에 4번째 및 7번째 항원 자극시에 51Cr-방출 분석법에 의해 평가하였다.
도 34는 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포가 항원 자극시에 이펙터(effector) 사이토카인을 분비함을 보여준다. mycM28z1XXPD1DNR(청색) 또는 mycM28z(적색)으로 형질도입된 인간 T 세포를 1:1의 E:T 비에서 48시간 동안 MGM(위쪽 열) 또는 MGM-PDL1(아래쪽 열) 표적 세포에 반복적으로 노출하였다. 세포-부재 상등액을 1번째, 3번째, 및 6번째 항원 노출 24시간 후에 수집하였고, 이펙터 사이토카인 분비를 루미넥스(Luminex) 분석법에 의해 평가하였다.
도 35는 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포에 대한 3×104의 단일 저용량의 흉막내 투여가 생체내 항-종양 효능을 입증함을 도시한다. 동소성 MGM 종양을 보유하는 암컷 NSG 마우스를 단일 흉막내 용량의 P28z CAR T 세포(n=6, 적색 막대) 또는 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포(n=10, 청색 막대)로 처리하였다. 종양 부하를 BLI에 의해 측정하였다. 표시된 시점은 CAR T-세포 투여 후 15일을 나타내며, 이때 P28z CAR T 세포-처리 마우스는 빈사되기 시작하였다. 언페어드(unpaired) 스튜던트 t 테스트(양측(2-tailed))를 이용해 통계적 유의성을 결정하였다. ***p<0.001.
도 36a 내지 도 36d는 흉막내로 투여된 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포가 생체내 항-종양 효능을 나타내고 생존을 증가시킴을 도시한다. 도 36a는 단일 용량의 mycM28z(1×105) 또는 mycM28z1XXPD1DNR(1×105 또는 5×104) CAR T 세포(n=7-8)로 처리된 MGM-PDL1 종양-보유 암컷 NSG 마우스의 일련의 종양 BLI를 보여준다. 복부 위치에서 처리군 당 4마리 마우스가 나타나 있다. 도 36b는 각각의 처리된 마우스의 종양 부하를 나타내는 해당 일련의 종양 BLI(등쪽 및 복부의 평균)를 보여준다. 도 36c는 처리 후의 해당 마우스 중량을 보여준다. 도 36d는 mycM28z 및 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 생체내 효능을 비교하는 카플란(Kaplan)-마이어(Meier) 생존 분석을 보여준다. 생존 곡선을 log-순위 테스트를 이용해 분석하였다. *p<0.05, **p<0.01.
도 37은 흉막내로 처리된 마우스의 원발성 종양에서 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 검출을 도시한다. 마우스 유래의 흉막 MGM 종양을 5×105의 비-형질도입된 T 세포(왼쪽), mycM28z CAR T 세포(가운데), 또는 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포(오른쪽)로 처리하였다. 흉막내 T-세포 주사 3일 후에 종양 조직을 수집하였고, 고정하였으며, 면역형광에 의해 종양 메소텔린(녹색), 인간 CD45-양성 세포(적색), 및 DAPI(세포 핵, 청색)에 대해 생체외에서 염색하였다.
도 38a 및 도 38b는 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포가 생체내에서 반복된 종양 도전 시에 종양 재확립에 저항함을 보여준다. 도 38a는 종양 재도전 실험을 예시하는 계획(scheme)을 보여준다: mycM28z 또는 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 흉막내 투여(단일 용량의 1×105 CAR T 세포) 68일 후 및 MGM-PDL1 종양 세포(8×105의 접종 용량)의 흉막 근절 후, 마우스를 증가하는 용량(2×106 내지 11×106)의 MGM 종양 세포로 4-8일마다 10회 복강내 재도전하였다. 도 38b는 단일 흉막내 용량의 mycM28z(2마리 마우스, 적색 선) 또는 mycM28z1XXPD1DNR(3마리 마우스, 흑색 선) CAR T 세포 및 처리 68일에 시작하는 종양 재도전 이후에 종양 부하를 나타내는 일련의 BLI를 보여준다. 흑색 화살표는 증가하는 용량으로 복강내 종양 재도전한 시점을 나타낸다.
도 39a 내지 도 39c는 임상 시험을 위한 벡터 스톡(stock)을 이용하여 제조된 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포가 생체내 항-종양 효능 및 연장된 생존을 갖고 있음을 도시한다. 도 39a는 임상 시험을 위한 바이러스 상등액을 이용하여 CTCEF에 의해 제조된 6×104(n=8) 또는 2×105(n=10) M28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 MGM 종양-보유 암컷 NSG 마우스의 일련의 종양 BLI를 보여준다. 도 39b는 처리 이후의 해당 마우스 중량을 보여준다. 도 39c는 카플란-마이어 생존 분석을 보여준다.
도 40은 수컷 마우스에 대한 잠정 희생시의 평균 체중을 도시한다. 제1 군(비-종양 대조군), 제3 군(대조군 비히클(vehicle)), 및 제5 군(테스트 물품)이 나타나 있다.
도 41은 암컷 마우스에 대한 잠정 희생시의 평균 체중을 도시한다. 제2 군(비-종양 대조군), 제4 군(대조군), 및 제6 군(테스트 물품)이 나타나 있다.
도 42는 수컷 마우스에 대한 최종 희생시의 평균 체중을 도시한다. 제7 군(비-종양 대조군), 제9 군(대조군 비히클), 및 제11 군(테스트 물품)이 나타나 있다.
도 43은 암컷 마우스에 대한 최종 희생시의 평균 체중을 도시한다. 제8 군(비-종양 대조군), 제10 군(대조군 비히클), 및 제12 군(테스트 물품)이 나타나 있다.
도 44는 CAR T 세포-처리 및 비히클-처리 마우스의 종양에서 인간 T 세포를 확인한 것을 도시한다. CAR T 세포-처리 및 비히클-처리 마우스로부터 유래된 흉막내 종양 조직 세포를 DAPI, 항-인간 CD45 APC/CY7, 및 항-인간 CD3 PE/CY7 항체로 염색하여 유세포분석에 의해 살아있는 인간 T 세포를 검출하였다. DAPI-음성 (살아있는) 단일 세포의 인간 CD3 발현(X-축) 및 인간 CD45 발현(Y-축)의 밀도 플롯이 나타나 있다. 게이트(gate)는 인간 T 세포를 나타내는 인간 CD45 및 인간 CD3에 대해 양성으로 염색된 세포를 나타낸다.
도 45는 CAR T 세포-처리 및 비히클-처리 마우스의 비장에서 인간 T 세포를 확인한 것을 도시한다. CAR T 세포-처리 및 비히클-처리 마우스로부터 유래된 비장 조직 세포를 DAPI, 항-인간 CD45 APC/CY7, 및 항-인간 CD3 PE/CY7 항체로 염색하여 유세포분석에 의해 살아있는 인간 T 세포를 검출하였다. DAPI-음성 (살아있는) 단일 세포의 인간 CD3 발현(X-축) 및 인간 CD45 발현(Y-축)의 밀도 플롯이 나타나 있다. 게이트는 인간 T 세포를 나타내는 인간 CD45 및 인간 CD3에 대해 양성으로 염색된 세포를 나타낸다.
도 46은 수컷 마우스의 BLI를 도시한다.
도 47은 암컷 마우스의 BLI를 도시한다.
5. 본 발명의 상세한 설명
본 개시된 주제는 메소텔린 및 우성 음성 형태의 프로그램화 죽음 1(PD-1 DN)을 표적화하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 폴리펩티드 조성물, 및 상기 폴리펩티드 조성물을 포함하는 면역반응성 세포(예컨대, T 세포 또는 NK 세포)를 제공한다. 본 개시된 주제는 또한 면역 세포 고갈의 감소가 요망되는 경우에 항원을 표적화하기 위해 면역반응성 세포의 면역 반응을 유도 및/또는 향상시키고, 및/또는 신생물 또는 다른 질환/질병을 치료 및/또는 예방하기 위하여 이러한 폴리펩티드 조성물을 이용하는 방법을 제공한다.
예컨대, 암에서 T 세포가 지속적으로 항원에 노출되면 고갈이라 명명되는 변경된 T-세포 분화 상태를 유도하여, CAR T 세포가 기능장애가 되게 한다(Youngblood et al., Int Immunol. 2010;22(10):797-803; Wherry et al., Nat Rev Immunol. 2015;15(8):486-499). 이전의 연구는 CAR 활성화 잠재력이 CD3ζ 세포질 도메인에 존재하는 3가지 ITAM(1-2-3)과 연관이 있음을 보여주었다(Acuto et al., Nat Rev Immunol. 2003;3(12):939-951; Love et al., Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010;2(6):a002485). 최근의 연구는 상기 CAR 활성화 잠재력이 ITAM을 돌연변이시킴으로써 교정되고, 이로 인해 그 기능성(functionality)을 감소시킬 수 있음을 입증하였다. 중요하게는, CD3ζ 도메인의 제2- 및 제3-위치 ITAM에서 점 돌연변이(1-X-X; 본 명세서에서 "1XX"로 나타냄)를 도입함으로써, CAR T 세포의 운명이 높은 항원 노출의 존재시에 고갈 상태로부터 균형잡힌 이펙터 및 메모리(memory) 상태로 변화된 것으로 나타났다(Feucht et al., Nat Med. 2019;25(1):82-88).
고형 종양 미세환경에서 CAR T 세포가 마주치는 다른 장애물은 항원-매개성 T-세포 활성화시에 발현되는 억제성 수용체인 PD1을 통해 매개되는 그 세포용해 활성의 억제이다. 또한, 종양 세포는 T-세포-분비 전구아폽토시스(proapoptotic) 사이토카인의 노출 이후 PD-L1과 같은 공-억제성 리간드의 발현을 증대시킨다(McGray et al., Mol Ther. 2014;22(1):206-218; Spranger et al., Sci Transl Med. 2013;5(200):200ra116; Moon et al., Clin Cancer Res. 2014;20(16):4262-4273). 상기 장애물을 극복하기 위하여, 본 발명자 그룹은 메소텔린-표적화 CAR T 세포를 PD1 차단 항체와 조합하여고갈된 CAR T 세포를 구제하고, 본 발명자들의 동소성 마우스 모델에서 CAR T 세포의 항-종양 효능을 회복시켰다(Cherkassky et al., J Clin Invest. 2016;126(8):3130-3144; Grosser et al., Cancer Cell. 2019;36(5):471-482). PD1 체크포인트 차단제의 반복적인 투여와 이와 연관된 임상적 부작용을 피하기 위하여, 본 발명자 그룹은 세포-내재적 PD1 체크포인트 차단 전략(PD1DNR이 2세대 CAR와 함께 T 세포 내로 동시-형질도입됨)을 사용하면 궁극적으로 형질도입된 세포가 고형 종양 미세환경에서 종양 PD-L1-매개성 억제에 저항성이 되게 함을 입증하였다(Cherkassky et al., J Clin Invest. 2016;126(8):3130-3144; Grosser et al., Cancer Cell. 2019;36(5):471-482).
따라서, 향상된 치료 프로필, 기능의 지속성, 및 종양-매개성 억제에 대한 저항성을 갖는 CAR T 세포를 개발하기 위하여, 본 발명자들은 1XX 및 PD1DNR 성분을 2세대 CAR 벡터 디자인 내에 포함시켰고, 이는 상기 세포가 매우 면역억제성인 고형 종양의 미세환경에서 효율적으로 수행하게 하였다.
제한하기 위함이 아니라 명확하게 개시하기 위한 목적으로, 상세한 설명은 다음의 서브섹션으로 나누어진다:
5.1. 정의;
5.2. 폴리펩티드 조성물;
5.2.1. PD-1 DN;
5.2.2. 메소텔린-표적화 CAR; 및
5.2.3. 예시적인 폴리펩티드 조성물;
5.3. 면역반응성 세포;
5.4. 핵산 조성물 및 벡터;
5.5. 폴리펩티드 및 유사체;
5.6. 약학적 조성물 및 투여;
5.7. 제형;
5.8. 치료 방법; 및
5.9. 키트
5.1. 정의
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 기술분야의 기술자에 의해 보통 이해되는 의미를 갖는다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "약" 또는 "대략"은 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 때의 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내임을 의미하며, 이는 부분적으로 그 값이 어떻게 측정되는지 또는 결정되는지, 즉 측정 시스템의 한계에 의존할 것이다. 예를 들면, "약"은 본 기술분야에서의 실행에 따라 표준 편차 3 이내 또는 그 초과를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 20%까지, 예컨대 10%까지, 5%까지, 또는 1%까지의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정에 대하여, 상기 용어는 수치의 10배 크기 이내, 예컨대 5배 이내, 또는 2배 이내를 의미할 수 있다.
"면역반응성 세포"는 면역 반응에서 기능을 하는 세포 또는 그의 전구체(progenitor), 또는 후손(progeny)을 의미한다.
"면역반응성 세포를 활성화시킨다"는 세포에서 단백질 발현에서의 신호 전달을 도입 또는 변화시켜서 면역 반응의 개시를 야기하는 것을 의미한다. 예를 들면, 리간드 결합 및 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITAM)에 대한 반응으로 CD3 사슬이 클러스터될 때, 신호 전달 캐스케이드(cascade)가 생성된다. 소정 구현예에서, 키메라 항원 수용체(CAR) 항원에 결합할 때, 결합된 수용체(예컨대, CD4 또는 CD8, CD3γ/δ/ε/ζ, 등) 근처의 많은 분자의 클러스터화를 포함하는 면역학적 시냅스의 형성이 일어난다. 상기 막 결합 신호전달 분자의 클러스터화는 상기 CD3 사슬 내에 함유되는 ITAM 모티프가 이산화되게 한다. 상기 인산화는 다시 T 세포 활성화 경로를 개시하고, 궁극적으로 전사 인자, 예컨대 NF-κB 및 AP-1을 활성화시킨다. 상기 전사 인자는 T 세포 매개성 면역 반응을 개시하기 위하여 T 세포의 글로벌 유전자 발현을 유도하여 마스터 조절성 T 세포 단백질의 증식 및 발현을 위한 IL-2 생산을 증가시킨다.
"면역반응성 세포를 자극시킨다"는 강력하고 지속되는 면역 반응을 야기하는 신호를 의미한다. 다양한 구현예에서, 이것은 면역반응성 세포(예컨대, T-세포)의 활성화 후에 일어나거나, CD28, CD137(4-lBB), OX40, CD40, 및 ICOS를 비제한적으로 포함하는 수용체를 통해 동시 매개된다. 다중 자극 신호를 수용하는 것은 강력하고 장기간의 T 세포 매개성 면역 반응을 늘이는데 중요할 수 있다. T 세포는 즉시 억제되고 항원에 반응하지 않을 수 있다. 상기 공-자극성 신호의 효과는 다양할 수 있지만, 일반적으로 완전하고 지속적인 근절을 위해 항원에 강력하게 반응하는 수명이 길고 증식성인 항-아폽토시스 T 세포를 생성하기 위하여 증가된 유전자 발현을 야기한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "항체"는 온전한 항체 분자뿐만 아니라 면역원-결합 능력을 보유하는 항체 분자의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 또한 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 시험관내 및 생체내에서 모두 정규 도입된다. 따라서, 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 분자뿐만 아니라 잘-알려진 활성 단편 F(ab')2 및 Fab를 의미한다. F(ab')2 및 온전한 항체의 Fc 단편이 없는 Fab 단편은 순환으로부터 보다 신속하게 제거되며, 온전한 항체의 비-특이적인 조직 결합을 더 적게 가질 수 있다(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). 본 명세서에서 사용될 때, 항체는 전체 자연형 항체, 이중특이적 항체; 키메라 항체; Fab, Fab', 단일 사슬 V 영역 단편(scFv), 융합 폴리펩티드, 및 비통상적 항체를 포함한다. 소정 구현예에서, 항체는 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변(CH) 영역을 포함한다. 상기 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 CL 영역을 포함한다. 상기 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. 상기 VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 명명된, 보다 보존된 영역과 함께 배치되는, 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명되는 고가변성 영역으로 추가 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 아미노-말단부터 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 상기 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포(예컨대, 이펙터 세포) 및 전통적 보체 시스템의 제1 성분(C1 q)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "CDR"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역인 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로 정의된다. 예컨대 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]을 참고한다. 일반적으로, 항체는 가변 영역에 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 또는 CDR 영역을 포함한다. CDR은 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합을 위한 대부분의 접촉 잔기를 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 CDR 영역은 카밧(Kabat) 시스템[Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]을 이용해 기술된다. 소정 구현예에서, 상기 CDR은 카밧 시스템을 통해 확인된다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "단일-사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 VH::VL 헤테로다이머를 형성하기 위해 공유결합된 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 상기 VH 및 VL은 직접 연결되거나, VH의 N-말단과 VL의 C-말단, 또는 VH의 C-말단과 VL의 N-말단을 결합시키는 펩티드-암호화 링커(예컨대, 10개, 15개, 20개, 25개 아미노산)에 의해 연결된다. 상기 링커는 보통 유연성(flexibility)을 위해 글리신이, 그리고 용해도를 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부하다. 본 명세서에서 사용될 때, "링커"는 2 이상의 폴리펩티드 또는 핵산을 공유적으로 부착시켜서 이들이 서로 연결되게 하는 작용기(예컨대, 화학물질 또는 폴리펩티드)를 의미할 것이다. 본 명세서에서 사용될 때, "펩티드 링커"는 2개의 단백질을 서로 커플링시키기 위해(예컨대, VH 및 VL 도메인을 커플링시키기 위해) 사용되는 하나 이상의 아미노산을 나타낸다. 소정 구현예에서, 상기 링커는 아래에 제공되는 서열번호 66에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
GGGGSGGGGSGGGGS [서열번호 66].
서열번호 66의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 50에 나타낸다:
GGAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGCAGTGGAGGTGGTGGGTCA [서열번호 50].
서열번호 66의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 51에 나타낸다.
GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCA [서열번호 51]
불변 영역의 제거와 링커의 도입에도 불구하고, scFv 단백질은 본래의 면역글로불린의 특이성을 유지한다. 단일 사슬 Fv 폴리펩티드 항체는 허스톤 등의 문헌(Huston, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)에 개시된 것과 같이 VH- 및 VL-암호화 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,091,513호, 제5,132,405호 및 제4,956,778호; 및 미국 특허 공개 제20050196754호 및 제20050196754호를 참조한다. 억제 활성을 갖는 길항성(antagonistic) scFv가 개시되어 있다(예컨대, [Zhao et al., Hyrbidoma (Larchmt) 2008 27(6):455-51]; [Peter et al., J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012 August 12]; [Shieh et al., J Imunol2009 183(4):2277-85]; [Giomarelli et al., Thromb Haemost 2007 97(6):955-63]; [Fife eta., J Clin Invst 2006 116(8):2252-61]; [Brocks et al., Immunotechnology 1997 3(3):173-84]; [Moosmayer et al., Ther Immunol 1995 2(10:31-40)] 참조). 자극 활성을 갖는 작용성 scFv가 개시되어 있다(예컨대, [Peter et al., J Bioi Chern 2003 25278(38):36740-7]; [Xie et al., Nat Biotech 1997 15(8):768-71]; [Ledbetter et al., Crit Rev Immunol 1997 17(5-6):427-55]; [Ho et al., BioChim Biophys Acta 2003 1638(3):257-66] 참조).
본 명세서에서 사용될 때, "F(ab)"는 항원에 결합하지만 1가(monovalent)이고, Fc 부분을 갖지 않는 항체 구조의 단편을 나타내며, 예를 들면, 효소 파파인에 의해 소화된 항체는 2개의 F(ab) 단편 및 1개의 Fc 단편(예컨대, 중쇄(H) 불변 영역; 항원에 결합하지 않는 Fc 영역)을 생성한다.
본 명세서에서 사용될 때, "F(ab')2"는 온전한 IgG 항체의 펩신 소화에 의해 생성된 항체 단편을 나타내며, 여기서 상기 단편은 2개의 항원 결합(ab')(2가) 영역을 가지며, 각각의 (ab') 영역은 항원 결합을 위하여 S-S 결합에 의해 연결된 H 사슬 및 경쇄(L)의 일부인 2개의 별도의 아미노산 사슬을 포함하고, 남아있는 H 사슬 부분은 서로 결합된다. "F(ab')2" 단편은 2개의 개별 Fab' 단편으로 분리될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "벡터"는 임의의 유전자 요소, 예컨대 플라스미드, 파지, 트린스포존, 코스미드, 염색체, 바이러스, 비리온, 등을 나타내며, 올바른 제어 요소와 연관될 때 복제를 할 수 있고 유전자 서열을 세포 내로 전달할 수 있다. 따라서, 상기 용어는 클로닝 및 발현 비히클 뿐만 아니라, 바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터를 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "발현 벡터"는 원하는 코딩 서열 및 특히 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 위해 필요한 적절한 핵산 서열을 함유하는 재조합 핵산 서열, 즉 재조합 DNA 분자를 나타낸다. 원핵생물에서의 발현을 위해 필요한 핵산 서열은 대개 프로모터, 오퍼레이터(선택적), 및 리보솜 결합 부위와, 종종 다른 서열을 함께 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 인핸서, 및 종료 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "친화도(affinity)"는 결합 세기의 측정을 의미한다. 친화도는 항체 조합 부위와 항원 결정기(determinant) 사이의 입체화학적 맞춤(fit)의 근접함, 이들 사이의 접촉 면적의 크기, 및/또는 대전된 기 및 소수성 기의 분포에 의존할 수 있다. 항원에 대한 항체의 친화도를 계산하는 방법은 본 기술분야에 알려져 있으며, 다양한 항원-결합 실험, 예컨대 기능적 분석법(예컨대, 유세포분석법)을 비제한적으로 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 면역반응성 세포를 활성화 또는 자극시킬 수 있는 세포내 신호전달 도메인에 융합된 세포외 항원-결합 도메인, 및 막통과 도메인을 포함하는 분자를 나타낸다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 scFv를 포함한다. 상기 scFv는 항체의 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 융합으로부터 유래될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 상기 scFv는 Fab로부터 유래될 수 있다(항체 대신에, 예컨대 Fab 라이브러리로부터 수득됨). 소정 구현예에서, 상기 scFv는 상기 막통과 도메인에 융합된 후 상기 세포내 신호전달 도메인에 융합된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 항원에 대한 높은 결합 친화도 또는 결합도(avidity)를 갖도록 선택된다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "핵산 분자"는 관심있는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 암호화하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열에 100% 상동성이거나 동일할 필요는 없지만, 실질적인 동일성(identity)을 나타낼 수 있다.
"실질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 상동성인"은 기준(reference) 아미노산 서열(예를 들면, 본 명세서에 개시된 아미노산 서열 중 임의의 하나) 또는 기준 핵산 서열(예를 들면, 본 명세서에 개시된 핵산 서열 중 임의의 하나)과 적어도 50% 상동성 또는 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 핵산 분자를 의미한다. 소정 구현예에서, 이러한 서열은 비교를 위해 사용된 기준 아미노산 또는 기준 핵산의 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 상동성이거나 동일하다.
서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어(예를 들면, [Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705], BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 이용해 측정될 수 있다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실, 및/또는 다른 변형에 대한 상동성의 정도를 배치함으로써 동일하거나 유사한 서열을 맞춘다. 보존적 치환은 전형적으로 다음의 군 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소루이신, 루이신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성의 정도를 결정하기 위한 예시적인 접근법에서, BLAST 프로그램이 매우 연관된 서열을 나타내는 e-3 및 e-100 사이의 가능성 점수로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 2개의 아미노산 서열 사이의 상동성 백분율은 상기 2개 서열 사이의 동일성 백분율과 동등하다. 상기 2개 서열 사이의 동일성 백분율은 갭(gap)의 수를 고려한 상기 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수(즉, % 상동성 = 동일한 위치의 수 / 위치의 총 수×100), 및 상기 2개의 서열을 최적으로 정렬하기 위해 도입될 필요가 있는 각각의 갭의 길이의 함수이다. 2개의 서열 사이의 서열의 비교 및 동일성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 이용해 달성될 수 있다.
2개의 아미노산 서열 사이의 상동성 백분율은 ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내로 통합된 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))을 이용하여 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 벌점 및 4의 갭 벌점을 이용해 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 상동성 백분율은 GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 이용가능함) 내의 GAP 프로그램 내로 통합된 Needleman 및 Wunsch 알고리즘(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))을 이용하여 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 이용해 결정될 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 본 개시된 주제의 아미노산 서열은, 예를 들면, 관련 서열을 확인하기 위해 공공 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "쿼리(query) 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌(Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)의 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 이용해 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 점수=50, 단어길이=3을 이용해 수행하여 본 명세서에 개시된 특정 서열(예컨대, scFv m903, m904, m905, m906, 및 m900의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열)과 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위하여, 문헌(Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402)에 개시된 것과 같은 Gapped BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 해당 프로그램(예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 이용될 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "구성적 발현" 또는 "구성적으로 발현되는"은 모든 생리학적 조선 하에서 발현 또는 발현되는 것을 나타낸다.
"질환"은 세포, 조직, 또는 기관의 정상 기능에 손상을 주거나 간섭하는 임의의 증상, 질환 또는 질병, 예컨대 신생물, 및 세포의 병원체 감염을 의미한다.
"유효량"은 치료 효과를 갖기에 충분한 양을 의미한다. 소정 구현예에서, "유효량"은 신생물의 지속적인 증식, 성장, 또는 전이(예컨대, 침입, 또는 이동)를 억제, 개선, 또는 억제하기에 충분한 양이다.
"조절하다"는 양성적 또는 음성적으로 변경하는 것을 의미한다. 예시적인 조절은 약 1%, 약 2%, 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 50%, 약 75%, 또는 약 100% 변화를 포함한다.
"증가하다"는 적어도 약 5% 양성적으로 변경하는 것을 의미한다. 변경은 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 30%, 약 50%, 약 75%, 약 100%, 또는 그 이상까지일 수 있다.
"감소시키다"는 적어도 약 5% 음성적으로 변경하는 것을 의미한다. 변경은 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 30%, 약 50%, 약 75%, 또는 심지어 약 100%까지일 수 있다.
"단리된 세포"는 세포와 자연적으로 동반되는 분자 및/또는 세포 성분들로부터 분리된 세포를 의미한다.
용어 "단리된", "정제된", 또는 "생물학적으로 정제된"은 그 자연 상태에서 발견되는 것과 같은 정상적으로 동반되는 성분들이 다양한 정도로 없는 물질을 나타낸다. "단리된"은 본래의 공급원(source) 또는 주변으로부터 분리된 정도를 나타낸다. "정제된"은 단리보다 더 높은 분리 정도를 나타낸다. "정제된" 또는 "생물학적으로 정제된" 단백질은 다른 물질들이 충분히 제거되어서, 임의의 불순물이 상기 단백질의 생물학적 특성에 물질적으로 영향을 미치거나 다른 부정적 결과를 초래하지 않는다. 즉, 핵산 또는 펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 때에는 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지가, 화학적으로 합성될 때에는 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다면 정제된 것이다. 순도 및 동질성(homogeneity)은 전형적으로 분석적 화학 기술, 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용해 결정된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔 내에서 본질적으로 하나의 밴드만을 생성하는 것을 나타낼 수 있다. 변형, 예를 들면, 인산화 또는 글리코실화를 거칠 수 있는 단백질의 경우, 상이한 변형은 별도로 정제될 수 있는 상이한 단리된 단백질을 생성할 수 있다.
"신생물"은 세포 또는 조직의 병리학적 증식과 그 이후의 다른 조직 또는 기관으로의 이동 또는 침입에 의해 특정되는 질환을 의미한다. 신생물 성장은 전형적으로 조절되지 않고 진행성이며, 정상 세포의 증식을 일으키지 않거나, 이의 중단을 초래하는 조건 하에 일어난다. 신생물은 방광, 뼈, 뇌, 유방, 연골, 교세포, 식도, 나팔관, 쓸개, 심장, 장, 신장, 간, 폐, 림프절, 신경 조직, 난소, 췌장, 전립선, 골격근, 피부, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기도, 비뇨생식로, 요관, 요도, 자궁, 및 질로 이루어진 군으로부터 선택되는 기관, 또는 그의 조직 또는 세포 타입을 비제한적으로 포함하는 다양한 세포 타입, 조직, 또는 기관에 영향을 미칠 수 있다. 신생물은 암, 예컨대 육종, 암종, 또는 형질세포종(혈질 세포의 악성 종양)을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 신생물은 고형 종양이다. 상기 신생물은 원발성 종양 또는 원발성 암일 수 있다. 또한, 상기 신생물은 전이 상태일 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "보존적 서열 변형"은 그 아미노산 서열을 포함하는 본 개시된 메소텔린-표적화 CAR(예컨대, CAR의 세포외 항원-결합 도메인)의 결합 특징에 현저하게 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 나타낸다. 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함할 수 있다. 변형은 위치-지정 돌연변이화 및 PCR-매개성 돌연변이화와 같은 본 기술분야에 알려진 표준 기술에 의해 본 개시된 CAR의 세포외 항원-결합 도메인 내로 도입될 수 있다. 아미노산은 전하 및 극성과 같은 그 생리화학적 특성에 따라 그룹으로 분류될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 동일한 그룹 내의 아미노산으로 교체되는 치환이다. 예를 들면, 아미노산은 전하에 의해 분류될 수 있다: 양전하 아미노산은 리신, 아르기닌, 히스티딘을 포함하고, 음전하 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산을 포함하며, 중성 전하 아미노산은 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다. 또한, 아미노산은 극성에 의해 분류될 수 있다: 극성 아미노산은 아르기닌(염기성 극성), 아스파라긴, 아스파르트산(산성 극성), 글루탐산(산성 극성), 글루타민, 히스티딘(염기성 극성), 리신(염기성 극성), 세린, 트레오닌, 및 티로신을 포함한다; 비-극성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 글리신, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 및 발린을 포함한다. 따라서, CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 그룹 유래의 다른 아미노산 잔기로 교체될 수 있고, 상기 변경된 항체는 본 명세서에 개시된 기능 분석법을 이용하여 유지된 기능(즉, 상기 (c) 내지 (l)에 개시된 기능)에 대해 테스트될 수 있다. 소정 구현예에서, 특정된 서열 또는 CDR 영역 내의 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하의 잔기가 변경된다.
"신호 서열" 또는 "리더 서열"은 분비 경로로의 진입을 인도하는 새롭게 합성된 단백질의 N-말단에 존재하는 펩티드 서열(예컨대, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30개 아미노산)을 의미한다. 예시적인 리더 서열은 인간 IL-2 신호 서열(예컨대, MYRMQLLSCIALSLALVTNS [서열번호 67]), 마우스 IL-2 신호 서(예컨대, MYSMQLASCVTLTLVLLVNS [서열번호 68]); 인간 카파 리더 서열(예컨대, METPAQLLFLLLLWLPDTTG [서열번호 69]), 마우스 카파 리더 서열(예컨대, METDTLLLWVLLLWVPGSTG [서열번호 70]); 인간 CD8 리더 서열(예컨대, MALPVTALLLPLALLLHAARP [서열번호 71]); 절단된 인간 CD8 신호 펩티드(예컨대, MALPVTALLLPLALLLHA [서열번호 72]); 인간 알부민 신호 서열(예컨대, MKWVTFISLLFSSAYS [서열번호 73]); 및 인간 프로락틴 신호 서열(예컨대, MDSKGSSQKGSRLLLLLVVSNLLLCQGVVS [서열번호 74])을 비제한적으로 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR은 N-말단에 CD8 신호 펩티드를 포함하며, 예컨대 상기 신호 펩티드는 CAR의 세포외 항원-결합 도메인에 연결된다. 소정 구현예에서, 상기 CD8 신호 펩티드는 서열번호 71에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
서열번호 71의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드는 서열번호 125에 나타낸다. 서열번호 125는 아래에 제공된다.
ATGGCCCTGCCAGTAACGGCTCTGCTGCTGCCACTTGCTCTGCTCCTCCATGCAGCCAGGCCT [서열번호 125]
용어 "포함하다", 및 "포함하는"은 미국 특허법에서 이들에 대해 주어진 넓은 의미를 갖게 하기 위한 의도이며, "함유하다", "함유하는" 등을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "치료"는 치료되는 개체 또는 세포의 질환 경과를 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 나타내며, 예방을 위해 또는 임상 병리 경과 동안 수행될 수 있다. 치료의 치료적 효과는 질환의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리적 결과의 약화, 전환 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 완화 또는 억제, 및 면제 또는 개선된 예후를 비제한적으로 포함한다. 질환 또는 질병의 진행을 방지함으로써, 치료는 영향받거나 진단받은 대상체 또는 질병을 갖는 것으로 추정되는 대상체에서 질병으로 인한 악화를 방지할 수 있지만, 또한 치료는 질병에 대한 위험에 처하거나 질병을 갖는 것으로 추정되는 대상체에서 질병의 개시 또는 질병의 증상을 방지할 수 있다.
본 명세서에서 "개체" 또는 "대상체"는 척추동물, 예컨대 인간 또는 비-인간 동물, 예를 들면, 포유동물이다. 포유동물은 인간, 영장류, 가축, 스포츠 종물, 설치류 및 애완동물을 비제한적으로 포함한다. 비-인간 동물 대상체의 비제한적 예는 마우스, 래트, 햄스터, 및 기니 피그와 같은 설치류; 토끼; 개; 고양이; 양; 돼지; 염소; 소; 말; 및 유인원 및 원숭이와 같은 비-인간 영장류를 포함한다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "면역손상된"은 면엽결핍을 갖는 대상체를 나타낸다. 상기 대상체는 대개 건강한 면역 시스템을 갖는 인간에서는 질환을 초래하지 않지만 면역 시스템이 불량하게 기능하거나 저해된 인간에게는 영향을 미칠 수 있는 유기체에 의해 초래되는 감염인 기회 감염에 대해 매우 취약하다.
본 개시된 주제의 다른 측면들이 아래에 개시되며, 본 개시된 주제의 영역 이내이다.
5.2. 폴리펩티드 조성물
본 개시된 주제는 메소텔린-표적화 키메라 항원 수용체(CAR) 및 우성 음성 형태의 프로그램화 죽음 1(PD-1 DN)을 포함하는 폴리펩티드 조성물을 제공한다.
5.2.1. 우성 음성 형태의 프로그램화 죽음 1(PD-1 DN)
우성 음성 형태의 프로그램화 죽음 1("PD-1 DN"으로 나타냄)은 CAR을 포함하는 면역반응성 세포의 치료 효능을 향상시킬 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 (a) 리간드 결합 영역을 포함하는 프로그램화 죽음 1(PD-1)의 세포외 도메인의 적어도 일부, 및 (b) 막통과 도메인을 포함한다.
소정 구현예에서, 면역반응성 세포, 예컨대 T 세포, 또는 그의 전구체 세포는 우성 음성 형태(DN 형태)의 PD-1을 발현하기 위해 조작된다.
악성 세포는 면역 인식 및 제거로부터 세포를 보호하는 면역억제성 미세환경을 생성하도록 적응된다(Sharpe et al., Dis. Model Mech. 2015;8:337-350). 상기 면역억제성 미세환경은 면역치료 방법에 제한을 둔다. 본 개시된 주제는 면역반응성 세포, 또는 그의 전구체 세포에서 DN 형태의 세포-매개성 면역 반응의 억제제를 발현함으로써 상기 제한을 해소한다. DN 형태의 세포-매개성 면역 반응의 억제제의 상세한 내용은 그 내용 전체가 본 명세서에 포함되는 WO2017/040945 및 WO2017/100428에 개시되어 있다.
프로그램화 세포 죽음 단백질 1(PD-1)은 내인성 대식세포 및 수지상 세포에서 발현되는 그 대응 리간드인 PD-L1 및 PD-L2와 결합시 활성화된 T 세포의 음성 면역 조절자이다. PD-1은 268개 아미노산의 타입 I 막 단백질이다. PD-1은 B7 패밀리의 일원인 PD-L1 및 PD-L2의 2개의 리간드를 갖는다. 상기 단백질의 구조는 세포외 IgV 도메인과, 이어서 막통과 영역 및 세포내 꼬리를 포함한다. 상기 세포내 꼬리는 면역수용체 티로신-기반 억제성 모티프 및 면역수용체 티로신-기반 스위치 모티프에 위치하는 2개의 인산화 부위를 함유한다. PD-1은 TCR 신호를 음성적으로 조절한다. SHP-1 및 SHP-2 포스파타아제는 리간드 결합시 PD-1의 세포질 꼬리에 결합한다. PD-L1의 상향조절은 종양 세포가 숙주 면역 시스템을 벗어나기 위해 사용하는 한 메커니즘이다. 전임상 및 임상 시험에서, 길항성 항체에 의한 PD-1 차단은 숙주 내인성 면역 시스템을 통해 매개되는 항-종양 반응을 유도하였다.
소정 구현예에서, PD-1 폴리펩티드는 진뱅크(GenBank) 번호 NP_005009.2(서열번호 48), 또는 그의 단편을 갖는 아미노산으로 이루어진다. 소정 구현예에서, 서열번호 48의 아미노산 1 내지 20은 PD-1의 신호 펩티드(또는 펩티드 신호)이다. 소정 구현예에서, 서열번호 48의 아미노산 21 내지 170은 PD-1의 세포외 도메인이다. 소정 구현예에서, 서열번호 48의 아미노산 171 내지 191은 PD-1의 막통과 도메인이다. 소정 구현예에서, 서열번호 48의 아미노산 192 내지 288은 PD-1의 세포내 도메인이다. 서열번호 48은 아래에 제공된다:
MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL [서열번호 48]
소정 구현예에서, PD-1의 세포외 도메인은 리간드 결합 도메인("세포외 리간드 결합 도메인"으로 나타냄)을 포함한다. 소정 구현예에서, PD-1의 세포외 리간드 결합 도메인은 하나 이상의 이종성(heterologous) 폴리펩티드 서열에 융합되며, 즉 상기 PD-1 DN은 키메라 서열이다. 예를 들면, PD-1의 세포외 리간드 결합 도메인은 그 N-말단에서 본 명세서에 기술된 다양한 신호 펩티드를 포함하는 선택적으로 이종성 신호 펩티드일 수 있는 신호 펩티드에 융합될 수 있다. 또한, 상기 PD-1 DN은 본 명세서에 기술된 임의의 다양한 막통과 도메인을 포함하는 선택적으로 이종성 막통과 도메인인 막통과 도메인을 포함할 수 있다.
소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 PD-1 폴리펩티드의 세포외 도메인(예컨대, 서열번호 48의 아미노산 21 내지 170) 또는 그의 리간드 결합 부위(예컨대, 서열번호 48의 아미노산 21 내지 165)를 포함한다. 예컨대 PD-1 DN을 발현하는 세포는 PD-1 면역 체크포인트 경로에서 신호를 하는 능력이 없거나 능력이 감소될 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 세포내 도메인(예컨대, PD-1 DN은 서열번호 48의 아미노산 192 내지 288이 없음) 또는 그의 일부가 결실되어 이루어지는 결실 돌연변이체이다. 세포내 도메인이 결실되어 이루어지는 PD-1은 PD-1에 의해 매개되는 면역 체크포인트 경로가 감소되거나 억제될 수 있다.
소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 PD-1의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 PD-1 폴리펩티드의 세포외 리간드 결합 도메인, 및 PD-1 폴리펩티드의 막통과 도메인을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 서열번호 58에 나타낸 아미노산 서열(또는 서열번호 48의 아미노산 21 내지 165)을 포함하거나 이로 이루어진다. 서열번호 58은 아래에 제공된다.
PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQ [서열번호 58]
서열번호 58(또는 서열번호 48의 아미노산 21 내지 165)을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 59에 나타낸다.
CCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCTTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAG [서열번호 59]
소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 신호 펩티드를 추가로 포함하며, 예컨대 상기 PD-1 DN은 PD-1 폴리펩티드의 세포외 리간드 결합 도메인, PD-1 폴리펩티드의 막통과 도메인, 및 PD-1 폴리펩티드의 신호 펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 신호 펩티드는 서열번호 48의 아미노산 1-20을 포함하거나 이로 이루어진다. 서열번호 48의 아미노산 1-20을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 60에 나타낸다.
ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGG [서열번호 60]
소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 서열번호 48의 아미노산 1 내지 165를 포함하거나 이로 이루어진다.
서열번호 48의 아미노산 1-165를 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 61에 나타낸다.
ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCTTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAG [서열번호 61]
소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 서열번호 48의 아미노산 21 내지 151을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, PD-1 DN은 서열번호 48의 아미노산 1 내지 151을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, PD-1 DN은 서열번호 48의 아미노산 21 내지 151을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 서열번호 48의 아미노산 21에서 시작하여 서열번호 48의 아미노산 151 내지 165 사이의 아미노산까지 통하는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 CD8 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 CD8의 막통과 도메인 및/또는 힌지 도메인에 융합된 PD-1의 세포외 도메인 또는 그의 일부(예컨대, 세포외 리간드 결합 도메인)를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 CD8의 막통과 도메인(예컨대, 서열번호 86의 아미노산 183 내지 203)을 포함한다. 이러한 구현예는 상이한 (이종성) 폴리펩티드 유래의 막통과 도메인을 포함하는 키메라 DN 형태를 대표한다. 전술한 것과 같이, 막통과 도메인과 같은 이종성 도메인을 포함하는 PD-1 DN은 선택적으로 이종성 폴리펩티드 유래의 부가적인 서열을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 막통과 도메인의 이종성 폴리펩티드 N-말단 유래의 부가적인 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, PD-1 DN은 CD8의 힌지 도메인을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 이종성 서열은 CD8 폴리펩티드의 부가적인 N-말단 서열(예컨대, 서열번호 86의 아미노산 137 내지 182(또는 선택적으로 아미노산 138 또는 139에서 시작함))을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 CD8의 막통과 도메인의 이종성 폴리펩티드 C-말단 유래의 부가적인 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 부가적인 C-말단 서열은 서열번호 86의 아미노산 204 내지 209이다.
소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 CD8 폴리펩티드의 막통과 도메인(예컨대, 서열번호 86의 아미노산 183 내지 203), CD8 폴리펩티드의 힌지 도메인(예컨대, 서열번호 86의 아미노산 137 내지 182), 및 CD8 폴리펩티드의 부가적인 C-말단 서열(예컨대, 서열번호 86의 아미노산 204 내지 207)을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 서열번호 86의 아미노산 137 내지 207로 이루어지는 CD8 폴리펩티드를 포함한다.
서열번호 86의 아미노산 137 내지 207을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 62에 나타낸다:
CCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACCCCGGCGCCCACGATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAC [서열번호 62]
소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 CD8 폴리펩티드의 막통과 도메인(예컨대, 서열번호 86의 아미노산 183 내지 203), CD8 폴리펩티드의 힌지 도메인(예컨대, 서열번호 86의 아미노산 137 내지 182), 및 CD8 폴리펩티드의 부가적인 C-말단 서열(예컨대, 서열번호 86의 아미노산 204 내지 209)을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 서열번호 86의 아미노산 137 내지 209로 이루어지는 CD8 폴리펩티드를 포함한다.
서열번호 86의 아미노산 137 내지 209를 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 63에 나타낸다:
CCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACCCCGGCGCCCACGATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGG [서열번호 63]
소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 아래에 제공되는 서열번호 49에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCN [서열번호 49]
서열번호 49에 나타낸 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 64에 나타낸다:
ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCTTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGGCGGCCGCACCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACCCCGGCGCCCACGATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAC [서열번호 64]
소정 구현예에서, 상기 PD-1 DN은 아래에 제공되는 서열번호 118에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR [서열번호 118]
서열번호 118에 나타낸 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 119에 나타낸다:
ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCTTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGGCGGCCGCACCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACCCCGGCGCCCACGATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGG [서열번호 119]
소정 구현예에서, PD-1 DN의 막통과 도메인은 막의 적어도 일부를 가로지르는 소수성의 알파 나선을 포함한다. 상이한 막통과 도메인은 상이한 수용체 안정성을 야기한다. 본 개시된 주제에 따라, 상기 PD-1 DN의 막통과 도메인은 본 명세서에 개시된 임의의 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인, 예컨대 키메라 항원 수용체에 포함될 수 있는 임의의 막통과 도메인을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD40 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD84 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, (면역 반응과 연관된 단백질에 기반하지 않은) 합성 폴리펩티드, 또는 이들의 조합이다. 소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인은 CD8 폴리펩티드이다. 상기 막통과 도메인의 상세한 내용은 아래의 섹션에 기술될 것이다.
5.2.2. 메소텔린-표적화 키메라 항원 수용체(CAR)
본 개시된 폴리펩티드 조성물은 메소텔린, 예컨대 인간 메소텔린을 특이적으로 표적화하는 CAR을 포함한다.
CAR은 면역 이펙터 세포 상에 관심있는 특이성을 이식 또는 부여하는 조작된 수용체이다. CAR은 T 세포에 레트로바이러스 벡터에 의해 용이하게 되는 그 코딩 서열을 전달하여 단일클론 항체의 특이성을 이식하기 위해 사용될 수 있다.
3세대의 CAR이 있다. "1세대" CAR은 전형적으로 막통과 도메인에 융합되고 세포질/세포내 신호전달 도메인에 융합된 세포외 항원-결합 도메인(예컨대, scFv)으로 이루어진다. "1세대" CAR은 데노보(de novo) 항원 인식을 제공하고, HLA-매개성 항원 제공과 무관하게 단일 융합 분자 내의 CD3ζ 사슬 신호전달 도메인을 통해 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두의 활성화를 유발할 수 있다. "2세대" CAR은 CAR의 세포질 꼬리에 다양한 공-자극성 분자(예컨대, CD28, 4-1BB, ICOS, OX40, CD27, CD40/My88 및 NKGD2) 유래의 세포내 도메인을 추가하여 T 세포에 추가적인 신호를 제공한다. "2세대" CAR은 공-자극(예컨대, CD28 또는 4-1BB) 및 활성화(CD3ζ) 모두를 제공하는 것들을 포함한다. "3세대" CAR은 복수의 공-자극(예컨대, CD28 및 4-1BB) 및 활성화(CD3ζ)를 제공하는 것들을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 2세대 CAR이다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 항원에 결합하는 세포외 항원-결합 도메인, 막통과 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하며, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공-자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 힌지/스페이서 영역을 추가로 포함한다.
5.2.2.1. CAR의 세포외 항원-결합 도메인
CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 메소텔린, 예컨대 인간 메소텔린에 특이적으로 결합한다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 scFv이다. 소정 구현예에서, 상기 scFv는 인간 scFv이다. 소정 구현예에서, 상기 scFv는 인간화 scFv이다. 소정 구현예에서, 뮤린(murine) scFv이다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 선택적으로 가교결합되는 Fab이다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 F(ab)2이다. 소정 구현예에서, 임의의 외래 분자가 이종성 서열을 갖는 융합 단백질 내에 포함되어 세포외 항원-결합 도메인을 형성할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 scFv는 항원-Fc 융합 단백질로 scFv 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인된다. 상기 scFv는 인간 VL 및/또는 VH 유전자를 보유하는 마우스로부터 유래될 수 있다. 상기 scFv는 또한 낙타과(camelid) 중쇄(예컨대, 낙타, 라마, 등으로부터의 VHH) 또는 세포 표면 수용체에 대한 부분적인 자연형 리간드로 치환될 수 있다.
메소텔린은 고형 암에서 높게 발현되는 면역원성 세포 표면 항원이다. 메소텔린은 세포 증식, 부착, 침입, 세포 신호전달, 및 전이에 관여된다. 연구는 메소텔린-발현 종양에 의해 분비되는 혈청 가용성 메소텔린-연관 펩티드가 인간 및 마우스 모두에서 측정될 수 있고, 치료 반응 및 예후와 연관이 있음을 입증하였다. 정상 조직에서, 메소텔린은 흉막, 심막, 및 복막에서만 낮은 레벨로 발현된다. 항-메소텔린 재조합 면역독소 SS1P은 환자에서 생체내 특이성 및 현저한 항-종양 활성을 보여주었다. 췌장암 백신 시험에서, 생존 이점을 갖는 환자는 백신-유도 지연형 과민 반응과 연관된 메소텔린에 대한 일관된 CD8+ T 세포 반응을 갖는다. 메소텔린 유래의 특이적 T 세포 에피토프는 메소텔린을 발현하는 인간 종양을 효율적으로 용해시키기 위해 인간 T 세포를 활성화시키는 것으로 나타났다. 따라서, 메소텔린을 표적화하는 입양적(adoptive) 면역치료법이 메소텔린-발현 종양을 표적화할 수 있음을 뒷받침하는 강한 증거가 있다.
소정 구현예에서, 상기 CAR은 인간 메소텔린에 결합한다. 소정 구현예에서, 상기 인간 메소텔린은 NCBI 참조 번호 AAV87530.1(서열번호 75) 또는 그의 단편을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
서열번호 75는 아래에 제공된다:
MALPTARPLL GSCGTPALGS LLFLLFSLGW VQPSRTLAGE TGQEAAPLDG VLANPPNISS LSPRQLLGFP CAEVSGLSTE RVRELAVALA QKNVKLSTEQ LRCLAHRLSE PPEDLDALPL DLLLFLNPDA FSGPQACTHF FSRITKANVD LLPRGAPERQ RLLPAALACW GVRGSLLSEA DVRALGGLAC DLPGRFVAES AEVLLPRLVS CPGPLDQDQQ EAARAALQGG GPPYGPPSTW SVSTMDALRG LLPVLGQPII RSIPQGIVAA WRQRSSRDPS WRQPERTILR PRFRREVEKT ACPSGKKARE IDESLIFYKK WELEACVDAA LLATQMDRVN AIPFTYEQLD VLKHKLDELY PQGYPESVIQ HLGYLFLKMS PEDIRKWNVT SLETLKALLE VNKGHEMSPQ VATLIDRFVK GRGQLDKDTL DTLTAFYPGY LCSLSPEELS SVPPSSIWAV RPQDLDTCDP RQLDVLYPKA RLAFQNMNGS EYFVKIQSFL GGAPTEDLKA LSQQNVSMDL ATFMKLRTDA VLPLTVAEVQ KLLGPHVEGL KAEERHRPVR DWILRQRQDD LDTLGLGLQG GIPNGYLVLD LSVQEALSGT PCLLGPGPVL TVLALLLAST LA [서열번호 75]
소정 구현예에서, (예를 들면, scFv 또는 그의 유사체에서 구현되는) 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의해 측정될 때 약 1 nM 내지 약 25 nM의 EC50 값으로 인간 메소텔린에 결합한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 ELISA에 의해 측정될 때 약 20 nM의 EC50 값을 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제8,357,783호에 기술되어 있는 항-메소텔린 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 인간 메소텔린에 결합하는 항체, 예컨대 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 [Feng et al., Mol. Cancer Therapy (2009);8(5):1113-1118]에 개시된 것과 같은 항체 m912의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로부터 유래된다. 항체 m912는 재조합 메소텔린에 대한 패닝(panning)에 의해 인간 Fab 라이브러리로부터 단리되었다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 Fab(예컨대, 인간 또는 마우스 Fab 라이브러리)로부터 유래된다.
(예를 들면, scFv 또는 그의 유사체에서 구현되는) 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인의 결합은, 예를 들면, 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사면역분석법(RIA), FACS 분석, 바이오분석법(예컨대, 성장 억제), 또는 웨스턴 블롯 분석법에 의해 확인될 수 있다. 각각의 이들 분석법은 일반적으로 관심있는 복합체에 특이적인 표지된 시약(예컨대, 항체 또는 scFv)을 도입함으로써 특정 관심있는 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들면, 상기 scFv는 방사성 표지되고 방사면역분석법(RIA)에서 사용될 수 있다(예를 들면, 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 [Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986] 참조). 상기 방사성 동위원소는 γ 카운터 또는 섬광(scintillation) 카운터를 이용하는 수단 또는 오토라디오그라피(autoradiography)에 의해 검출될 수 있다. 소정 구현예에서, 메소텔린 표적화 세포외 항원-결합 도메인은 형광 마커로 표지된다. 형광 마커의 비제한적 예는 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(예컨대, EBFP, EBFP2, Azurite 및 mKalama1), 시안색 형광 단백질(예컨대, ECFP, Cerulean 및 CyPet), 및 황색 형광 단백질(예컨대, YFP, Citrine, Venus 및 YPet)을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 메소텔린-표적화 인간 scFv는 GFP로 표지된다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 약 1,000 이상의 메소텔린 결합 부위/세포의 메소텔린 레벨로 인간 메소텔린에 결합한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 약 1,000 내지 약 50,000 메소텔린 결합 부위/세포의 메소텔린 레벨로 인간 메소텔린에 결합한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 1,000 미만의 메소텔린 결합 부위/세포의 메소텔린 발현 레벨로 인간 메소텔린, 예컨대 정상 조직, 예컨대 정상 흉막, 심막, 및 복막 조직에 발현되는 인간 메소텔린에 결합하지 않는다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 50,000 이상의 메소텔린 결합 부위/세포의 메소텔린 발현 레벨로 인간 메소텔린에 결합하지 않는다. 소정 구현예에서, 상기 CAR에 포함되는 인간 scFV는 약 1,000 내지 약 50,000 메소텔린 결합 부위/세포의 메소텔린 발현 레벨로 인간 메소텔린에 결합한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR에 포함되는 인간 scFV는 50,000 이상 또는 1,000 미만의 메소텔린 결합 부위/세포의 메소텔린 발현 레벨로 인간 메소텔린에 결합하지 않는다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인(예컨대, scFv)은 서열번호 76에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR1, 서열번호 77에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR2, 및 서열번호 78에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 VH는 서열번호 76에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR1, 서열번호 77에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR2, 및 서열번호 78에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR3을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인(예컨대, scFv)은 서열번호 79에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR1, 서열번호 80에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR2, 및 서열번호 81에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 VL은 서열번호 79에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR1, 서열번호 80에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR2, 및 서열번호 81에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR3을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 VH는 서열번호 76에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR1, 서열번호 77에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR2, 및 서열번호 78에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR3을 포함한다; 그리고, 상기 VL은 서열번호 79에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR1, 서열번호 80에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR2, 및 서열번호 81에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR3을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 VH는 서열번호 76에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR1, 서열번호 77에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR2, 및 서열번호 78에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR3을 포함한다; 그리고, 상기 VL은 서열번호 79에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR1, 서열번호 80에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR2, 및 서열번호 81에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CDR3을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CDR은 카밧 번호지정 시스템에 따라 확인된다.
소정 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호 82에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호 83에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 VH는 서열번호 82에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 83에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, 선택적으로 (ⅲ) 상기 VH 및 VL 사이에 링커 서열, 예를 들면 링커 펩티드를 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 링커는 서열번호 66에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 VH는 서열번호 82에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%) 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 상기 VH는 서열번호 82에 나타낸 아미노산 서열과 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 VH는 서열번호 82에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 VL은 서열번호 83에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%) 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 상기 VL은 서열번호 83에 나타낸 아미노산 서열과 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 VL은 서열번호 83에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 VH는 서열번호 82에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%) 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 83에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%) 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 VH는 서열번호 82에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 83에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
서열번호 82의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 서열번호 52에 나타낸다.
서열번호 83의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 서열번호 53에 나타낸다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인(예컨대, scFv)은 서열번호 84에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%(예컨대, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%) 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인(예컨대, scFv)은 서열번호 84에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인(예컨대, scFv)은 인간 메소텔린 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 75에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 인간 메소텔린 폴리펩티드)에 특이적으로 결합한다.
서열번호 84의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 85에 나타낸다.
소정 구현예에서, 상기 scFv는 인간 scFv이다.
서열번호 52, 서열번호 53, 및 서열번호 76-85는 아래에 제공된다:
CAGGTTCAGCTTCAGGAGAGTGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCAAGTGAGACTCTCAGCTTGACTTGCACAGTTTCTGGAGGCAGTGTCTCCTCAGGCAGCTATTATTGGTCCTGGATTCGGCAGCCCCCTGGGAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATATATTACAGTGGCAGCACAAATTACAATCCATCCCTGAAGTCTCGAGTAACTATCAGTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTTTCACTCAAACTGTCTTCTGTGACTGCTGCTGACACTGCTGTTTATTATTGTGCCAGGGAGGGGAAAAATGGGGCATTTGATATTTGGGGTCAGGGCACAATGGTGACAGTCAGCTCT [서열번호 52]
CGCCATCAGATGACTCAGTCCCCCTCCAGTCTTTCTGCCTCAGTTGGGGATAGAGTGACCATCACATGCAGAGCAAGTCAGAGCATATCATCCTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCCAAATTGCTGATTTATGCAGCCTCAAGTCTCCAGAGTGGGGTGCCAAGCAGGTTCTCAGGCAGTGGCAGTGGGACAGATTTCACATTGACAATCAGCTCCCTCCAACCTGAAGATTTTGCCACCTACTATTGCCAGCAATCCTACAGCACGCCCCTGACTTTTGGAGGTGGCACAAAGGTAGAGATCAAGAGGACT [서열번호 53]
GGSVSSGSYY [서열번호 76]
IYYSGST [서열번호 77]
AREGKNGAFDIW [서열번호 78]
QSISSY [서열번호 79]
AASS [서열번호 80]
QQSYSTPLTF [서열번호 81]
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGKNGAFDIWGQGTMVTVSS [서열번호 82]
RHQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRT [서열번호 83]
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGKNGAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSRHQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRT [서열번호 84]
CAGGTTCAGCTTCAGGAGAGTGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCAAGTGAGACTCTCAGCTTGACTTGCACAGTTTCTGGAGGCAGTGTCTCCTCAGGCAGCTATTATTGGTCCTGGATTCGGCAGCCCCCTGGGAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATATATTACAGTGGCAGCACAAATTACAATCCATCCCTGAAGTCTCGAGTAACTATCAGTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTTTCACTCAAACTGTCTTCTGTGACTGCTGCTGACACTGCTGTTTATTATTGTGCCAGGGAGGGGAAAAATGGGGCATTTGATATTTGGGGTCAGGGCACAATGGTGACAGTCAGCTCTGGAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGCAGTGGAGGTGGTGGGTCACGCCATCAGATGACTCAGTCCCCCTCCAGTCTTTCTGCCTCAGTTGGGGATAGAGTGACCATCACATGCAGAGCAAGTCAGAGCATATCATCCTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCCAAATTGCTGATTTATGCAGCCTCAAGTCTCCAGAGTGGGGTGCCAAGCAGGTTCTCAGGCAGTGGCAGTGGGACAGATTTCACATTGACAATCAGCTCCCTCCAACCTGAAGATTTTGCCACCTACTATTGCCAGCAATCCTACAGCACGCCCCTGACTTTTGGAGGTGGCACAAAGGTAGAGATCAAGAGGACT [서열번호 85]
소정 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 아래에 제공되는 서열번호 36에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%(예컨대, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%) 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다.
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGKNGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTSGQAG [서열번호 36]
서열번호 36의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 아래에 제공되는 서열번호 37에 나타낸다.
caggtgcagctgcaggagtccggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctc 60
acctgcactgtctctggtggctccgtcagcagtggtagttactactggagctggatccgg 120
cagcccccagggaagggactggagtggattgggtatatctattacagtgggagcaccaac 180
tacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacacgtccaagaaccagttc 240
tccctgaagctgagctctgtgaccgctgcggacacggccgtgtattactgtgcgagagag 300
gggaagaatggggcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcagcc 360
tccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggc 420
acagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtgg 480
aactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcagga 540
ctctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctac 600
atctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaa 660
tcttgtgacaaaactagtggccaggccggccac 693 [서열번호 37]
소정 구현예에서, 상기 경쇄 가변 영역은 아래에 제공되는 서열번호 38에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%(예컨대, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%) 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다.
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSGFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열번호 38]
서열번호 38의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 아래에 제공되는 서열번호 39에 나타낸다.
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcacc 60
atcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaacca 120
gggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatca 180
gggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacct 240
gaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtaccccgctcactttcggcgga 300
gggaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgcca 360
tctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctat 420
cccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccag 480
gagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctactgcctcagcagcaccctgacg 540
ctgagcaaagcagactacgagaaacacaaactctacgcctgcgaagtcacccatcagggc 600
ctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagt [서열번호 39]
소정 구현예에서, 상기 경쇄 가변 영역은 아래에 제공되는 서열번호 40에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%(예컨대, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%) 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다.
RHQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSGFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열번호 40]
소정 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 아래에 제공되는 서열번호 41에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% (예컨대, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%) 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다.
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGKNGAFDIWGQGTMVTVSSS [서열번호 41]
소정 구현예에서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 38의 아미노산 1-107을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 40의 아미노산 1-107을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인(예컨대, scFv)은 아래에 제공되는 서열번호 42에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%(예컨대, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%) 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다.
Q V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S L T C T V S G G S V S S G S Y Y W S W I R Q P P G K G L E W I G Y I Y Y S G S T N Y N P S L K S R V T I S V D T S K N Q F S L K L S S V T A A D T A V Y Y C A R E G K N G A F D I W G Q G T M V T V S S S G G G G S G G G G S G G G G S R H Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S S Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q S Y S T P L T F G G G T K V E I K G Q A G H H H H H H G D Y K D D D D K G [서열번호 42]
서열번호 42의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 아래에 제공되는 서열번호 45에 나타낸다.
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcaggtgcagctgcaggagtccggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccgtcagcagtggtagttactactggagctggatccggcagcccccagggaagggactggagtggattgggtatatctattacagtgggagcaccaactacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagctctgtgaccgctgcggacacggccgtgtattactgtgcgagagaggggaagaatggggcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcacgacatcagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtaccccgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggactgcggccgca [서열번호 45]
서열번호 42의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 아래에 제공되는 서열번호 46에 나타낸다. 서열번호 46에 나타낸 핵산 서열은 CAR의 발현을 증가시킬 수 있는 코돈 사용법을 위해 최적으로 합성된다.
ATGGCGCTGCCGGTGACCGCGCTGCTGCTGCCGCTGGCGCTGCTGCTGCATGCGGCGCGCCCGCAGGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGCCCGGGCCTGGTGAAACCGAGCGAAACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCGGCAGCGTGAGCAGCGGCAGCTATTATTGGAGCTGGATTCGCCAGCCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTTATTATAGCGGCAGCACCAACTATAACCCGAGCCTGAAAAGCCGCGTGACCATTAGCGTGGATACCAGCAAAAACCAGTTTAGCCTGAAACTGAGCAGCGTGACCGCGGCGGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAAGGCAAAAACGGCGCGTTTGATATTTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCGCCATCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTAGCAGCTATCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATGCGGCGAGCAGCCTGCAGAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGAGCTATAGCACCCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGCACCGCGGCGGCG [서열번호 46]
서열번호 42의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 아래에 제공되는 서열번호 47에 나타낸다. 서열번호 47에 나타낸 핵산 서열은 CAR의 발현을 증가시킬 수 있는 코돈 사용법을 위해 최적으로 합성된다.
atggccCTCCCGGTAACGGCTCTGCTGCTTCCACTCGCACTGCTCTTGCATGCTGCCAGACCACAGGTCCAGCTGCAGGAGAGTGGGCCTGGACTGGTTAAGCCGAGTGAGACACTTTCCTTGACGTGCACTGTGAGCGGGGGAAGTGTGTCCTCAGGTAGTTATTACTGGTCCTGGATTCGCCAGCCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGATAGGTTATATCTATTATTCTGGCAGCACTAATTACAATCCTTCTCTCAAAAGTAGGGTGACAATTTCAGTGGATACTTCCAAAAATCAGTTTAGTCTGAAGCTCAGCTCTGTGACAGCTGCTGATACTGCAGTTTACTACTGCGCCAGGGAGGGGAAGAATGGCGCCTTCGATATTTGGGGACAGGGCACTATGGTGACTGTATCAAGCGGAGGCGGTGGCAGCGGCGGGGGAGGGAGTGGAGGCGGCGGGTCTCGACATCAGATGACACAGAGCCCATCATCACTTAGCGCCAGCGTTGGCGACCGGGTTACGATAACATGCAGGGCTTCCCAATCTATCAGTTCTTATCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGTAAGGCCCCCAAGCTGCTCATCTACGCAGCCTCATCCCTGCAGAGCGGCGTCCCTAGTCGATTTTCCGGTAGTGGGTCAGGGACAGATTTTACCCTGACTATCAGTTCACTGCAGCCCGAGGACTTCGCGACATACTATTGCCAACAGTCCTATAGTACACCCTTGACATTTGGCGGCGGGACTAAAGTAGAAATTAAACGCACCgcggccgca [서열번호 47]
특정 서열(예컨대, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 41, 또는 서열번호 42)과 적어도 약 80%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%(예컨대, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%) 상동성 또는 서열 동일성으로 이루어지는 VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 상기 특정 서열(들)과 비교하여 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함할 수 있지만, 표적 항원(예컨대, 메소텔린)에 결합하는 능력을 유지한다. 소정 구현예에서, 특정 서열(예컨대, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 41, 또는 서열번호 42)에서 총 1 내지 10개 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 소정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 상기 세포외 항원-결합 도메인의 CDR 바깥의 영역에서(예컨대, FR에서) 일어난다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 그 서열(서열번호 82 및 서열번호 83)의 번역-후 변형을 포함하여 서열번호 82, 및 서열번호 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 및/또는 VL 서열을 포함한다.
5.2.2.2. CAR의 막통과 도메인
소정 구현예에서, 상기 CAR은 막통과 도메인을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 막의 적어도 일부를 가로지르는 소수성의 알파 나선을 포함한다. 상이한 막통과 도메인은 상이한 수용체 안정성을 야기한다. 항원 인식 후, 수용체 클러스터(cluster) 및 신호가 세포에 전달된다. 본 개시된 주제에 따르면, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD40 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD84 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, (면역 반응과 연관된 단백질에 기반하지 않는) 합성 폴리펩티드, 또는 이들의 조합의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인을 포함할 수 있다.
CD8
소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인은 CD8 폴리펩티드(예컨대, CD8의 막통과 도메인 또는 그의 일부)를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인은 인간 CD8 또는 그의 일부의 막통과 도메인을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CD8 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_001139345.1(서열번호 86)을 갖는 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하거나 이로 이루어지고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 CD8 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 또는 적어도 약 60개, 또는 적어도 약 70개, 및 약 235개까지의 아미노산 길이인 서열번호 86의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CD8 폴리펩티드는 서열번호 86의 아미노산 1 내지 235, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 137 내지 209, 또는 200 내지 235의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 본 개시된 주제의 CAR은 서열번호 86의 아미노산 137 내지 209의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CD8 폴리펩티드를 포함하는 막통과 도메인을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 서열번호 86의 아미노산 137 내지 207을 포함하거나 이로 이루어지는 CD8 폴리펩티드를 포함한다.
MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV [서열번호 86]
소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인은 마우스 CD8의 막통과 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CD8 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 AAA92533.1(서열번호 87)을 갖는 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하거나 이로 이루어지고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 CD8 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 또는 적어도 약 60개, 또는 적어도 약 70개, 또는 적어도 약 100개, 또는 적어도 약 200개, 및 247개까지의 아미노산 길이인 서열번호 87의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CD8 폴리펩티드는 서열번호 87의 아미노산 1 내지 247, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 151 내지 219, 또는 200 내지 247의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 서열번호 87의 아미노산 151 내지 219를 포함하거나 이로 이루어지는 CD8 폴리펩티드를 포함한다.
1 MASPLTRFLS LNLLLMGESI ILGSGEAKPQ APELRIFPKK MDAELGQKVD LVCEVLGSVS
61 QGCSWLFQNS SSKLPQPTFV VYMASSHNKI TWDEKLNSSK LFSAVRDTNN KYVLTLNKFS
121 KENEGYYFCS VISNSVMYFS SVVPVLQKVN STTTKPVLRT PSPVHPTGTS QPQRPEDCRP
181 RGSVKGTGLD FACDIYIWAP LAGICVAPLL SLIITLICYH RSRKRVCKCP RPLVRQEGKP
241 RPSEKIV [서열번호 87]
소정 구현예에서, 상기 CD8 폴리펩티드는 아래에 제공되는 서열번호 88에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
STTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICY [서열번호 88]
서열번호 88의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 89에 나타낸다.
TCTACTACTACCAAGCCAGTGCTGCGAACTCCCTCACCTGTGCACCCTACCGGGACATCTCAGCCCCAGAGACCAGAAGATTGTCGGCCCCGTGGCTCAGTGAAGGGGACCGGATTGGACTTCGCCTGTGATATTTACATCTGGGCACCCTTGGCCGGAATCTGCGTGGCCCTTCTGCTGTCCTTGATCATCACTCTCATCTGCTAC [서열번호 89]
CD28
소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD28 폴리펩티드(예컨대, CD28의 막통과 도메인 또는 그의 일부)를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인은 인간 CD28의 막통과 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CD28 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_006130(서열번호 90)을 갖는 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하거나 이로 이루어지고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 CD28 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 및 약 220개까지의 아미노산 길이인 서열번호 90의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CD28 폴리펩티드는 서열번호 90의 아미노산 1 내지 220, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 114 내지 220, 153 내지 179, 150 내지 200, 또는 200 내지 220의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 서열번호 92(또는 서열번호 90의 아미노산 153 내지 179)를 포함하거나 이로 이루어지는 CD28을 포함한다. 서열번호 92의 아미노산 서열 또는 서열번호 90의 아미노산 153 내지 179를 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 서열번호 93에 나타낸다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 서열번호 90의 아미노산 114 내지 220의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CD28 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 92의 아미노산 서열(또는 서열번호 90의 아미노산 153 내지 179)를 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 91에 나타낸다. 서열번호 90-93은 아래에 제공된다:
1 MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLD
61 SAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPP
121 PYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLV TVAFIIFWVR
181 SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS [서열번호 90]
ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtg [서열번호 91]
FWVLVVVGGV LACYSLLVTV AFIIFWV [서열번호 92].
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG [서열번호 93]
소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인은 마우스 CD28의 막통과 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CD28 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_031668.3(서열번호 97)을 갖는 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하거나 이로 이루어지고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 CD28 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 및 218개까지의 아미노산 길이인 서열번호 97의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CD28 폴리펩티드는 서열번호 97의 아미노산 1 내지 218, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 114 내지 220, 150 내지 200, 151 내지 177, 또는 200 내지 218의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 서열번호 97의 아미노산 151 내지 177을 포함하거나 이로 이루어지는 CD28 폴리펩티드를 포함한다.
서열번호 97은 아래에 제공된다:
1 MTLRLLFLAL NFFSVQVTEN KILVKQSPLL VVDSNEVSLS CRYSYNLLAK EFRASLYKGV
61 NSDVEVCVGN GNFTYQPQFR SNAEFNCDGD FDNETVTFRL WNLHVNHTDI YFCKIEFMYP
121 PPYLDNERSN GTIIHIKEKH LCHTQSSPKL FWALVVVAGV LFCYGLLVTV ALCVIWTNSR
181 RNRLLQSDYM NMTPRRPGLT RKPYQPYAPA RDFAAYRP [서열번호 97]
CD84
소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD84 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 상기 CD84 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_001171808.1(서열번호 1)을 갖는 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열 또는 그의 단편을 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 CD84 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 및 약 345개까지의 아미노산 길이인 서열번호 1의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CD84 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 1 내지 345, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 226 내지 250, 250 내지 300, 또는 300 내지 345의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 서열번호 1의 아미노산 226 내지 250을 포함하거나 이로 이루어지는 CD84 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다.
서열번호 1 아래에 제공된다:
1 maqhhlwill lclqtwpeaa gkdseiftvn gilgesvtfp vniqeprqvk iiawtsktsv
61 ayvtpgdset apvvtvthrn yyerihalgp nynlvisdlr medagdykad intqadpytt
121 tkrynlqiyr rlgkpkitqs lmasvnstcn vtltcsveke eknvtynwsp lgeegnvlqi
181 fqtpedqelt ytctaqnpvs nnsdsisarq lcadiamgfr thhtgllsvl amffllvlil
241 ssvflfrlfk rrqgrifpeg sclntftknp yaaskktiyt yimasrntqp aesriydeil
301 qskvlpskee pvntvysevq fadkmgkast qdskppgtss yeivi [서열번호 1]
서열번호 1의 아미노산 226 내지 250을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 2에 나타낸다.
TTGCTGAGCGTGCTGGCTATGTTCTTTCTGCTTGTTCTCATTCTGTCTTCAGTGTTTTTGTTCCGTTTGTTCAAG [서열번호 2]
CD166
소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD166 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 상기 CD166 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_001618.2(서열번호 3)를 갖는 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열 또는 그의 단편을 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 CD166 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 적어도 약 100개, 및 약 583개까지의 아미노산 길이인 서열번호 3의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CD166 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 1 내지 583, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 528 내지 579, 또는 500 내지 583의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인 내에 포함되는 CD166 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 528 내지 553의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인 내에 포함되는 CD166 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 528 내지 549의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
서열번호 3은 아래에 제공된다:
1 MESKGASSCR LLFCLLISAT VFRPGLGWYT VNSAYGDTII IPCRLDVPQN LMFGKWKYEK
61 PDGSPVFIAF RSSTKKSVQY DDVPEYKDRL NLSENYTLSI SNARISDEKR FVCMLVTEDN
121 VFEAPTIVKV FKQPSKPEIV SKALFLETEQ LKKLGDCISE DSYPDGNITW YRNGKVLHPL
181 EGAVVIIFKK EMDPVTQLYT MTSTLEYKTT KADIQMPFTC SVTYYGPSGQ KTIHSEQAVF
241 DIYYPTEQVT IQVLPPKNAI KEGDNITLKC LGNGNPPPEE FLFYLPGQPE GIRSSNTYTL
301 TDVRRNATGD YKCSLIDKKS MIASTAITVH YLDLSLNPSG EVTRQIGDAL PVSCTISASR
361 NATVVWMKDN IRLRSSPSFS SLHYQDAGNY VCETALQEVE GLKKRESLTL IVEGKPQIKM
421 TKKTDPSGLS KTIICHVEGF PKPAIQWTIT GSGSVINQTE ESPYINGRYY SKIIISPEEN
481 VTLTCTAENQ LERTVNSLNV SAISIPEHDE ADEISDENRE KVNDQAKLIV GIVVGLLLAA
541 LVAGVVYWLY MKKSKTASKH VNKDLGNMEE NKKLEENNHK TEA [서열번호 3]
서열번호 3의 아미노산 528 내지 553을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 4에 나타낸다.
CTAATTGTGGGAATCGTTGTTGGTCTCCTCCTTGCTGCCCTTGTTGCTGGTGTCGTCTACTGGCTGTACATGAAGAAG [서열번호 4]
CD8a
소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD8a 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 상기 CD8a 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_001139345.1(서열번호 5)로 이루어지는 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열, 또는 그의 단편을 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 CD8a 폴리펩티드 적어도 약 20개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 및 약 235개까지의 아미노산 길이인 서열번호 5의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CD8a 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 1 내지 235, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 183 내지 207, 150 내지 200, 또는 200 내지 235의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 서열번호 5의 아미노산 183 내지 207을 포함하거나 이로 이루어지는 CD8a 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 5는 아래에 제공된다:
1 MALPVTALLL PLALLLHAAR PSQFRVSPLD RTWNLGETVE LKCQVLLSNP TSGCSWLFQP
61 RGAAASPTFL LYLSQNKPKA AEGLDTQRFS GKRLGDTFVL TLSDFRRENE GYYFCSALSN
121 SIMYFSHFVP VFLPAKPTTT PAPRPPTPAP TIASQPLSLR PEACRPAAGG AVHTRGLDFA
181 CDIYIWAPLA GTCGVLLLSL VITLYCNHRN RRRVCKCPRP VVKSGDKPSL SARYV [서열번호 5]
서열번호 5의 아미노산 183 내지 207을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 6에 나타낸다.
atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaac [서열번호 6]
CD8b
소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD8b 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 상기 CD8b 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_742099.1(서열번호 7)을 갖는 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열, 또는 그의 단편을 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 CD8b 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 및 약 221개까지의 아미노산 길이인 서열번호 7의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CD8b 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 1 내지 221, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 171 내지 195, 150 내지 200, 또는 200 내지 221의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 서열번호 7의 아미노산 171 내지 195를 포함하거나 이로 이루어지는 CD8b 폴리펩티드는를 포함한다. 서열번호 7은 아래에 제공된다:
1 MRPRLWLLLA AQLTVLHGNS VLQQTPAYIK VQTNKMVMLS CEAKISLSNM RIYWLRQRQA
61 PSSDSHHEFL ALWDSAKGTI HGEEVEQEKI AVFRDASRFI LNLTSVKPED SGIYFCMIVG
121 SPELTFGKGT QLSVVDFLPT TAQPTKKSTL KKRVCRLPRP ETQKGPLCSP ITLGLLVAGV
181 LVLLVSLGVA IHLCCRRRRA RLRFMKQLRL HPLEKCSRMD Y [서열번호 7]
서열번호 7의 아미노산 171 내지 195를 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 8에 나타낸다.
ATCACCCTTGGCCTGCTGGTGGCTGGCGTCCTGGTTCTGCTGGTTTCCCTGGGAGTGGCCATCCACCTGTGCTGC [서열번호 8]
ICOS
소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 ICOS 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 상기 ICOS 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_036224.1(서열번호 9)을 갖는 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열 또는 그의 단편을 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 ICOS 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 및 약 199개까지의 아미노산 길이인 서열번호 9의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 ICOS 폴리펩티드는 서열번호 9의 아미노산 1 내지 199, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 141 내지 165, 또는 150 내지 199의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 서열번호 9의 아미노산 141 내지 165를 포함하거나 이로 이루어지는 ICOS 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 9는 아래에 제공된다:
1 MKSGLWYFFL FCLRIKVLTG EINGSANYEM FIFHNGGVQI LCKYPDIVQQ FKMQLLKGGQ
61 ILCDLTKTKG SGNTVSIKSL KFCHSQLSNN SVSFFLYNLD HSHANYYFCN LSIFDPPPFK
121 VTLTGGYLHI YESQLCCQLK FWLPIGCAAF VVVCILGCIL ICWLTKKKYS SSVHDPNGEY
181 MFMRAVNTAK KSRLTDVTL [서열번호 9]
서열번호 9의 아미노산 141 내지 165를 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 10에 나타낸다.
TTCTGGTTACCCATAGGATGTGCAGCCTTTGTTGTAGTCTGCATTTTGGGATGCATACTTATTTGTTGGCTTACA [서열번호 10]
CTLA-4
소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CTLA-4 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 상기 CTLA-4 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_005205.2(서열번호 11)를 갖는 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열 또는 그의 단편을 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 CTLA-4 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 및 약 223개까지의 아미노산 길이인 서열번호 11의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CTLA-4 폴리펩티드는 서열번호 11의 아미노산 1 내지 223, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 162 내지 186, 150 내지 200, 또는 200 내지 223의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 서열번호 11의 아미노산 162 내지 186을 포함하거나 이로 이루어지는 CTLA-4 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 11은 아래에 제공된다:
1 MACLGFQRHK AQLNLATRTW PCTLLFFLLF IPVFCKAMHV AQPAVVLASS RGIASFVCEY
61 ASPGKATEVR VTVLRQADSQ VTEVCAATYM MGNELTFLDD SICTGTSSGN QVNLTIQGLR
121 AMDTGLYICK VELMYPPPYY LGIGNGTQIY VIDPEPCPDS DFLLWILAAV SSGLFFYSFL
181 LTAVSLSKML KKRSPLTTGV YVKMPPTEPE CEKQFQPYFI PIN [서열번호 11]
서열번호 11의 아미노산 162 내지 186을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 12에 나타낸다.
TTCCTCCTCTGGATCCTTGCAGCAGTTAGTTCGGGGTTGTTTTTTTATAGCTTTCTCCTCACAGCTGTTTCTTTG [서열번호 12]
ICAM-1
소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 ICAM-1 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 상기 ICAM-1 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_000192.2(서열번호 13)를 갖는 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동질성인 아미노산 서열 또는 그의 단편을 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 ICAM-1 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 및 약 220개까지의 아미노산 길이인 서열번호 13의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 ICAM-1 폴리펩티드는 서열번호 13의 아미노산 1 내지 532, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 481 내지 507, 400 내지 500, 또는 500 내지 532의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 서열번호 13의 아미노산 481 내지 507을 포함하거나 이로 이루어지는 ICAM-1 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 13은 아래에 제공된다:
1 MAPSSPRPAL PALLVLLGAL FPGPGNAQTS VSPSKVILPR GGSVLVTCST SCDQPKLLGI
61 ETPLPKKELL LPGNNRKVYE LSNVQEDSQP MCYSNCPDGQ STAKTFLTVY WTPERVELAP
121 LPSWQPVGKN LTLRCQVEGG APRANLTVVL LRGEKELKRE PAVGEPAEVT TTVLVRRDHH
181 GANFSCRTEL DLRPQGLELF ENTSAPYQLQ TFVLPATPPQ LVSPRVLEVD TQGTVVCSLD
241 GLFPVSEAQV HLALGDQRLN PTVTYGNDSF SAKASVSVTA EDEGTQRLTC AVILGNQSQE
301 TLQTVTIYSF PAPNVILTKP EVSEGTEVTV KCEAHPRAKV TLNGVPAQPL GPRAQLLLKA
361 TPEDNGRSFS CSATLEVAGQ LIHKNQTREL RVLYGPRLDE RDCPGNWTWP ENSQQTPMCQ
421 AWGNPLPELK CLKDGTFPLP IGESVTVTRD LEGTYLCRAR STQGEVTRKV TVNVLSPRYE
481 IVIITVVAAA VIMGTAGLST YLYNRQRKIK KYRLQQAQKG TPMKPNTQAT PP [서열번호 13]
서열번호 13의 아미노산 481 내지 507을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 14에 나타낸다.
ATTGTCATCATCACTGTGGTAGCAGCCGCAGTCATAATGGGCACTGCAGGCCTCAGCACGTACCTCTATAACCGCCAGCGG [서열번호 14]
5.2.2.3. CAR의 힌지/스페이서 영역
소정 구현예에서, 상기 CAR은 상기 세포외 항원-결합 도메인을 상기 막통과 도메인에 결합시키는 힌지/스페이서 영역을 포함한다. 상기 힌지/스페이서 영역은 항원 결합 도메인을 상이한 방향으로 배향하게 하여 항원 인식을 용이하게 하기에 충분히 유연할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD40 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD84 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, (면역 반응과 연관된 단백질에 기반하지 않는) 합성 폴리펩티드, 또는 이들의 조합의 자연형 또는 변형된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 상기 힌지/스페이서 영역은 IgG1, 또는 면역글로불린의 CH2CH3 영역 및 CD3의 일부, CD28 폴리펩티드의 일부(예컨대, 서열번호 90의 일부), CD8 폴리펩티드의 일부(예컨대, 서열번호 86의 일부, 또는 서열번호 87의 일부), 여기에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 임의의 변경 유래의 힌지 영역, 또는 합성 스페이서 서열일 수 있다.
CD28
소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 본 명세서에 개시된 것과 같은 CD28 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 힌지 영역 또는 그의 일부를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 서열번호 15(또는 서열번호 90의 아미노산 114 내지 152)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CD28 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 15는 아래에 제공된다.
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP [서열번호 15]
서열번호 15(또는 서열번호 90의 아미노산 114 내지 152)의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 54에 나타낸다.
attgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagccc [서열번호 54]
CD84
소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 본 명세서에 개시된 것과 같은 CD84 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 힌지 영역 또는 그의 일부를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 서열번호 1의 아미노산 187 내지 225를 포함하거나 이로 이루어지는 CD84 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 1의 아미노산 187 내지 225를 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 16에 나타낸다.
CAAGAGCTGACTTACACGTGTACAGCCCAGAACCCTGTCAGCAACAATTCTGACTCCATCTCTGCCCGGCAGCTCTGTGCAGACATCGCAATGGGCTTCCGTACTCACCACACCGGG [서열번호 16]
CD166
소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 본 명세서에 개시된 것과 같은 CD166 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 힌지 영역 또는 그의 일부를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 서열번호 3의 아미노산 489 내지 527을 포함하거나 이로 이루어지는 CD166 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 3의 아미노산 489 내지 527을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 17에 나타낸다.
ACCAACTGGAGAGAACAGTAAACTCCTTGAATGTCTCTGCTATAAGTATTCCAGAACACGATGAGGCAGACGAGATAAGTGATGAAAACAGAGAAAAGGTGAATGACCAGGCAAAA [서열번호 17]
소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 서열번호 3의 아미노산 484 내지 527을 포함하거나 이로 이루어지는 CD166 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 서열번호 3의 아미노산 506 내지 527을 포함하거나 이로 이루어지는 CD166 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 서열번호 3의 아미노산 517 내지 527을 포함하거나 이로 이루어지는 CD166 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 서열번호 109 또는 서열번호 110에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CD166 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 109 및 서열번호 110은 아래에 제공된다.
NQLERTVNSLNVPAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAK [서열번호 109]
AAANQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAK [서열번호 110]
소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역 및 막통과 도메인 내에 포함되는 CD166 폴리펩티드는 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 114, 서열번호 115, 서열번호 116 또는 서열번호 117에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 서열번호 111-117은 아래에 제공된다.
PEHDEADEISDENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWLYMKK [서열번호 111]
ENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWLYMKK [서열번호 112]
NQLERTVNSLNVPAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWLYMKK [서열번호 113]
TCTAENQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWL [서열번호 114]
PEHDEADEISDENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWL [서열번호 115]
NQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWL [서열번호 116]
AAANQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWLYMKK [서열번호 117]
CD8a
소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 본 명세서에 개시된 것과 같은 CD8a 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 힌지 영역 또는 그의 일부를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 서열번호 5의 아미노산 137 내지 182를 포함하거나 이로 이루어지는 CD8a 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 5의 아미노산 137 내지 182를 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 18에 나타낸다.
cccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat [서열번호 18]
CD8b
소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 본 명세서에 개시된 것과 같은 CD8b 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 힌지 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역 내에 포함되는 CD8b 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 132 내지 170을 포함하거나 이로 이루어진다. 서열번호 7의 아미노산 132 내지 170을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 19에 나타낸다.
CTGAGTGTGGTTGATTTCCTTCCCACCACTGCCCAGCCCACCAAGAAGTCCACCCTCAAGAAGAGAGTGTGCCGGTTACCCAGGCCAGAGACCCAGAAGGGCCCACTTTGTAGCCCC [서열번호 19]
ICOS
소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 본 명세서에 개시된 것과 같은 ICOS 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 힌지 영역 또는 그의 일부를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 서열번호 9의 아미노산 102 내지 140을 포함하거나 이로 이루어지는 ICOS 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 9의 아미노산 102 내지 140을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 20에 나타낸다.
tctcatgccaactattacttctgcaacctatcaatttttgatcctcctccttttaaagtaactcttacaggaggatatttgcatatttatgaatcacaactttgttgccagctgaag [서열번호 20]
CTLA-4
소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 본 명세서에 개시된 것과 같은 CTLA-4 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 힌지 영역 또는 그의 일부를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 서열번호 11의 아미노산 123 내지 161을 포함하거나 이로 이루어지는 CTLA-4 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 11의 아미노산 123 내지 161을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 21에 나타낸다.
GACACGGGACTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCATGTACCCACCGCCATACTACCTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTAATTGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGAC [서열번호 21]
ICAM-1
소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 본 명세서에 개시된 것과 같은 ICAM-1 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 힌지 영역 또는 그의 일부를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 서열번호 13의 아미노산 442 내지 480을 포함하거나 이로 이루어지는 ICAM-1 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 13의 아미노산 442 내지 480을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 22에 나타낸다.
GGGGAATCAGTGACTGTCACTCGAGATCTTGAGGGCACCTACCTCTGTCGGGCCAGGAGCACTCAAGGGGAGGTCACCCGCAAGGTGACCGTGAATGTGCTCTCCCCCCGGTATGAG [서열번호 22]
소정 구현예에서, 메소텔린-표적화 CAR은 힌지/스페이서 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 힌지/스페이서 영역은 세포외 항원-결합 도메인 및 막통과 도메인 사이에 위치된다. 소정 구현예에서, 상기 힌지/스페이서 영역은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD4 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, (면역 반응과 연관된 단백질에 기반하지 않는) 합성 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD4 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, (면역 반응과 연관된 단백질에 기반하지 않는) 합성 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역은 동일한 분자로부터 유래된다. 소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역은 상이한 분자로부터 유래된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 CD28 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD28 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 CD28 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD28 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 CD84 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD84 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 CD166 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD166 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 CD8a 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD8a 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 CD8b 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD8b 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 CD28 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CAR의 막통과 도메인은 ICOS 폴리펩티드를 포함한다.
5.2.2.4. CAR의 세포내 신호전달 도메인
A. CD3ζ
소정 구현예에서, 상기 CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 세포(예컨대, 림프 계통의 세포, 예컨대 T 세포)를 활성화 또는 자극할 수 있는 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 야생형("자연형") CD3ζ는 3개의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프("ITAM")(예컨대, ITAM1, ITAM2 및 ITAM3), 3개의 염기성-풍부 스트레치(BRS) 영역(BRS1, BRS2 및 BRS3)을 포함하고, 항원이 결합된 후 활성화 신호를 세포(예컨대, 림프 계통의 세포, 예컨대 T 세포)에 전달한다. 상기 자연형 CD3ζ-사슬의 세포내 신호전달 도메인은 내인성 TCR 유래 신호의 1차적 전달자이다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 자연형 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 자연형 CD3ζ 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_932170(서열번호 94)을 갖는 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 자연형 CD3ζ 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 또는 적어도 약 100개, 또는 적어도 약 110개, 및 164개까지의 아미노산 길이인 서열번호 94의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 자연형 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 94의 아미노산 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 50 내지 164, 55 내지 164, 또는 150 내지 164의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 자연형 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 94의 아미노산 52 내지 164의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
서열번호 94는 아래에 제공된다:
1 MKWKALFTAA ILQAQLPITE AQSFGLLDPK LCYLLDGILF IYGVILTALF LRVKFSRSAD
61 APAYQQGQNQ LYNELNLGRR EEYDVLDKRR GRDPEMGGKP QRRKNPQEGL YNELQKDKMA
121 EAYSEIGMKG ERRRGKGHDG LYQGLSTATK DTYDALHMQA LPPR [서열번호 94]
소정 구현예에서, CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 95에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하거나 이로 이루어지고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 서열번호 95는 아래에 제공된다.
RVKFSRSADA PAYQQGQNQL YNELNLGRRE EYDVLDKRRG RDPEMGGKPR RKNPQEGLYN ELQKDKMAEA YSEIGMKGER RRGKGHDGLY QGLSTATKDT YDALHMQALP PR [서열번호 95]
서열번호 95의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 96에 나타낸다.
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC [서열번호 96]
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 변형된 인간 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 35에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하거나 이로 이루어지고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 서열번호 35는 아래에 제공된다:
RVKFSRSADA PAYQQGQNQL YNELNLGRRE EYDVLDKRRG RDPEMGGKPR RKNPQEGLFN ELQKDKMAEA FSEIGMKGER RRGKGHDGLF QGLSTATKDT FDALHMQALP PR [서열번호 35]
서열번호 35의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 55에 나타낸다.
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtTcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctTcagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttTccaggggctcagtacagccaccaaggacacctTcgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc [서열번호 55]
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 1개, 2개 또는 3개의 ITAM 변이체를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형 ITAM1을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 자연형 ITAM1은 서열번호 23에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
QNQLYNELNLGRREEYDVLDKR [서열번호 23]
서열번호 23의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 아래에 제공되는 서열번호 24에 나타낸다.
cagaaccagctctataacgagctcaatctagga cgaagagaggagtacgatgttttggacaagaga [서열번호 24]
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM1 변이체를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기ITAM1 변이체는 2개의 기능-소실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 하나 이상(예컨대, 2개)의 각각의 기능 소실 돌연변이는 ITAM1 내의 티로신 잔기의 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 ITAM1 변이체(예컨대, 2개의 기능-소실 돌연변이로 이루어지는 변이체)는 아래에 제공되는 서열번호 25에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
QNQLFNELNLGRREEFDVLDKR [서열번호 25]
서열번호 25의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 아래에 제공되는 서열번호 26에 나타낸다.
cagaaccagctctTtaacgagctcaatctagga cgaagagaggagtTcgatgttttggacaagaga [서열번호 26]
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형 ITAM2를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 자연형 ITAM2는 아래에 제공되는 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK [서열번호 27]
서열번호 27의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 아래에 제공되는 서열번호 28에 나타낸다.
caggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaa [서열번호 28]
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM2 변이체를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 ITAM2 변이체는 2개의 기능-소실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 하나 이상(예컨대, 2개)의 각각의 기능 소실 돌연변이는 ITAM2 내의 티로신 잔기의 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 ITAM2 변이체(예컨대, 2개의 기능-소실 돌연변이로 이루어지는 변이체)는 아래에 제공되는 서열번호 29에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
QEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMK [서열번호 29]
서열번호 29의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 아래에 제공되는 서열번호 30에 나타낸다.
caggaaggcctgtTcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctTcagtgagattgggatgaaa [서열번호 30]
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형 ITAM3을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 자연형 ITAM3은 아래에 제공되는 서열번호 31에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
HDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ [서열번호 31]
서열번호 31의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 아래에 제공되는 서열번호 32에 나타낸다.
cacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcag [서열번호 32]
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM3 변이체를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 ITAM3 변이체는 2개의 기능-소실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 하나 이상(예컨대, 2개)의 각각의 기능 소실 돌연변이는 ITAM3 내의 티로신 잔기의 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 ITAM3 변이체(예컨대, 2개의 기능-소실 돌연변이로 이루어지는 변이체)는 아래에 제공되는 서열번호 33에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
HDGLFQGLSTATKDTFDALHMQ [서열번호 33]
서열번호 33의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 아래에 제공되는 서열번호 34에 나타낸다.
cacgatggcctttTccaggggctcagtacagccaccaaggacacctTcgacgcccttcacatgcag [서열번호 34]
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM1 변이체, 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM2 변이체, 및/또는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM3 변이체, 또는 이들의 조합을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상(예컨대, 2개)의 기능 상실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM2 변이체 및 하나 이상(예컨대, 2개)의 기능 상실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 자연형 ITAM1을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드, 2개의 기능 상실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM2 변이체 및 2개의 기능 상실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM3 변이체를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 23에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 자연형 ITAM1, 서열번호 29에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 ITAM2 변이체, 및 서열번호 33에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, "1XX"로 표기된 구조체)를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 35에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상(예컨대, 2개)의 기능 상실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM1 변이체 및 하나 이상(예컨대, 2개)의 기능 상실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 2개의 기능 상실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM1 변이체, 자연형 ITAM2, 및 2개의 기능 상실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 25에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 ITAM1 변이체, 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 자연형 ITAM2, 및 서열번호 33에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, "X2X"로 표기된 구조체)를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상(예컨대, 2개)의 기능 상실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM1 변이체 및 하나 이상(예컨대, 2개)의 기능 상실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM2 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 2개의 기능 상실 돌연변이를 포함하는 ITAM1 변이체, 2개의 기능 상실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM2 변이체, 및 자연형 ITAM3을 포함하거나 이로 이루어지는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 25에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 ITAM1 변이체, 서열번호 29에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 ITAM2 변이체, 및 서열번호 31에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 자연형 ITAM3을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, "XX3"으로 표기된 구조체)를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상(예컨대, 2개)의 기능 상실 돌연변이를 포함하는 ITAM1 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 2개의 기능 상실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM1 변이체, 자연형 ITAM2, 및 자연형 ITAM3을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 25에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 ITAM1 변이체, 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 자연형 ITAM2 및 서열번호 31에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 자연형 ITAM3을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, "X23"으로 표기된 구조체)를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 자연형 ITAM1, 자연형 ITAM2, 및 하나 이상(예컨대, 2개)의 기능 상실 돌연변이를 포함하는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 자연형 ITAM1, 자연형 ITAM2, 및 2개의 기능 상실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM1 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 23에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 자연형 ITAM1, 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 자연형 ITAM2 및 서열번호 33에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, "12X"로 표기된 구조체)를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 자연형 ITAM1, 하나 이상(예컨대, 2개)의 기능 상실 돌연변이를 포함하는 ITAM2 변이체, 및 자연형 ITAM3을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 자연형 ITAM1, 2개의 기능 상실 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어지는 ITAM2 변이체, 및 자연형 ITAM3을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 23에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 자연형 ITAM1, 서열번호 29에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 ITAM2 변이체 및 서열번호 31에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 자연형 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, "1X3"으로 표기된 구조체)를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 1개 또는 2개 ITAM의 결실을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM1 및 ITAM2의 결실을 포함하거나 이로 이루어지며, 예컨대 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형 ITAM3 또는 ITAM3 변이체를 포함하고, ITAM1 또는 ITAM2를 포함하지 않는다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 31에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 자연형 ITAM3을 포함하고, (자연형 또는 변형된) ITAM1, 또는 (자연형 또는 변형된) ITAM2를 포함하지 않는다(예컨대, D12로 표기된 구조체).
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM2 및 ITAM3의 결실을 포함하거나 이로 이루어지며, 예컨대 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형 ITAM1 또는 ITAM1 변이체를 포함하고, 및 ITAM2 또는 ITAM3을 포함하지 않는다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 23에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 자연형 ITAM1을 포함하고, 및 (자연형 또는 변형된) ITAM2, 또는 (자연형 또는 변형된) ITAM3을 포함하지 않는다(예컨대, D23으로 표기된 구조체).
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM1 및 ITAM3의 결실을 포함하거나 이로 이루어지며, 예컨대 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형 ITAM2 또는 ITAM2 변이체를 포함하고, ITAM1 또는 ITAM3을 포함하지 않는다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 자연형 ITAM2를 포함하고, (자연형 또는 변형된) ITAM1, 또는 (자연형 또는 변형된) ITAM3을 포함하지 않는다(예컨대, D13으로 표기된 구조체).
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM1의 결실을 포함하거나 이로 이루어지며, 예컨대 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형 ITAM2 또는 ITAM2 변이체, 및 자연형 ITAM3 또는 ITAM3 변이체를 포함하고, (자연형 또는 변형된) ITAM1을 포함하지 않는다.
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM2의 결실을 포함하거나 이로 이루어지며, 예컨대 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형 ITAM1 또는 ITAM1 변이체, 및 자연형 ITAM3 또는 ITAM3 변이체를 포함하고, (자연형 또는 변형된) ITAM2를 포함하지 않는다.
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM3의 결실을 포함하거나 이로 이루어지며, 예컨대 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형 ITAM1 또는 ITAM1 변이체, 및 자연형 ITAM2 또는 ITAM2 변이체를 포함하고, (자연형 또는 변형된) ITAM3을 포함하지 않는다.
B. 공-자극성 신호전달 영역
소정 비제한적 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 적어도 공-자극성 신호전달 영역을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 최적의 림프구 활성화를 제공할 수 있는 공-자극성 분자의 적어도 일부를 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때, "공-자극성 분자"는 항원에 대한 림프구의 효과적인 반응을 위해 요구되는 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 세포 표면 분자를 나타낸다. 공-자극성 분자의 비제한적 예는 CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, DAP-10, CD27, CD40, 및 NKGD2를 포함한다. 상기 공-자극성 분자는 그 수용체에 결합시에 공-자극성 반응, 즉 항원이 그 CAR 분자에 결합할 때 자극이 제공되게 하는 세포내 반응을 생성하는 세포 표면에 발현되는 단백질인 공-자극성 리간드에 결합할 수 있다. 공-자극성 리간드는 CD80, CD86, CD70, OX40L, 및 4-1BBL을 비제한적으로 포함한다. 한 예로서, 4-1BB 리간드(즉, 4-1BBL)는 4-1BB("CD137"로도 알려짐)에 결합하여 CAR 신호와 조합하여 CAR+ T 세포의 이펙터 세포 기능을 유도하는 세포내 신호를 제공할 수 있다. 4-1BB, ICOS 또는 DAP-10을 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR은 인용에 의해 그 전체가 본 명세서에 통합되는 미국 제7,446,190호에 개시되어 있다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD28 폴리펩티드를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역(예컨대, CD28의 세포내 도메인 또는 그의 일부)을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 인간 CD28의 세포내 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 서열번호 90의 아미노산 180 내지 220을 포함하거나 이로 이루어지는 CD28 폴리펩티드를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 서열번호 101에 나타낸 아미노산 서열(또는 서열번호 90의 아미노산 180 내지 220)을 포함하거나 이로 이루어지는 CD28 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 101은 아래에 제공된다.
RSKRSRLLHS DYMNMTPRRP GPTRKHYQPY APPRDFAAYR S [서열번호 101]
서열번호 101(또는 서열번호 90의 아미노산 180 내지 220)의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 102에 나타낸다.
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC [서열번호 102]
소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 서열번호 108(또는 서열번호 90의 아미노산 180 내지 219)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CD28 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 108은 아래에 제공된다.
RSKRSRLLHS DYMNMTPRRP GPTRKHYQPY APPRDFAAYR K [서열번호 108]
소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 마우스 CD28의 세포내 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 서열번호 97의 아미노산 178 내지 218을 포함하거나 이로 이루어진다.
서열번호 97의 아미노산 178 내지 218을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 98에 나타낸다.
aat agtagaagga acagactcct tcaaagtgac tacatgaaca tgactccccg gaggcctggg ctcactcgaa agccttacca gccctacgcc cctgccagag actttgcagc gtaccgcccc [서열번호 98]
소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 서열번호 99에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CD28 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 서열번호 99는 아래에 제공된다:
NSRRNRLLQS DYMNMTPRRP GLTRKPYQPY APARDFAAYR P [서열번호 99].
서열번호 99의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 아래에 제공되는 서열번호 100에 나타낸다.
AATAGTAGAAGGAACAGACTCCTTCAAAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGGAGGCCTGGGCTCACTCGAAAGCCTTACCAGCCCTACGCCCCTGCCAGAGACTTTGCAGCGTACCGCCCC [서열번호 100]
소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 제1 공-자극성 분자의 일부 및 제2 공-자극성 분자의 일부, 예컨대 CD28의 세포내 도메인 및 4-1BB의 세포내 도메인 또는 CD28의 세포내 도메인 및 OX40의 세포내 도메인을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 4-1BB 폴리펩티드(예컨대, 4-1BB의 세포내 도메인 또는 그의 일부)를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 인간 4-1BB의 세포내 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 4-1BB는 종양 괴사 인자(TNF) 리간드로서 작용하며, 자극 활성을 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 4-1BB 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_001552.2(서열번호 103)를 갖는 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하거나 이로 이루어지고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 4-1BB 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 및 약 255개까지의 아미노산 길이인 서열번호 103의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 4-1BB 폴리펩티드는 서열번호 103의 아미노산 1 내지 255, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 214 내지 255, 또는 200 내지 255의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 서열번호 104(또는 서열번호 103의 아미노산 214 내지 255)를 포함하거나 이로 이루어지는 4-1BB 폴리펩티드를 포함한다. 서열번호 103 및 104는 아래에 제공된다:
1 MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP NSFSSAGGQR
61 TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC
121 CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE
181 PGHSPQIISF FLALTSTALL FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR PVQTTQEEDG
241 CSCRFPEEEE GGCEL [서열번호 103]
KRGRKKLLYI FKQPFMRPVQ TTQEEDGCSC RFPEEEEGGC EL [서열번호 104].
서열번호 104(또는 서열번호 103의 아미노산 214 내지 255)의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 105에 나타낸다.
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG [서열번호 105]
소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 OX40 폴리펩티드(예컨대, OX40의 세포내 도메인 또는 그의 일부)를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 인간 OX40의 세포내 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 OX40 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_003318.1(서열번호 106)을 갖는 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하거나 이로 이루어지고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 OX40 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 및 약 277개까지의 아미노산 길이인 서열번호 106의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 OX40 폴리펩티드는 서열번호 106의 아미노산 1 내지 277, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 또는 200 내지 277의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 서열번호 106은 아래에 제공된다.
1 MCVGARRLGR GPCAALLLLG LGLSTVTGLH CVGDTYPSND RCCHECRPGN GMVSRCSRSQ
61 NTVCRPCGPG FYNDVVSSKP CKPCTWCNLR SGSERKQLCT ATQDTVCRCR AGTQPLDSYK
121 PGVDCAPCPP GHFSPGDNQA CKPWTNCTLA GKHTLQPASN SSDAICEDRD PPATQPQETQ
181 GPPARPITVQ PTEAWPRTSQ GPSTRPVEVP GGRAVAAILG LGLVLGLLGP LAILLALYLL
241 RRDQRLPPDA HKPPGGGSFR TPIQEEQADA HSTLAKI [서열번호 106]
소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 ICOS 폴리펩티드(예컨대, ICOS의 세포내 도메인 또는 그의 일부)를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 인간 ICOS의 세포내 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 ICOS 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_036224(서열번호 65)를 갖는 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하거나 이로 이루어지고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 ICOS 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 및 약 199개까지의 아미노산 길이인 서열번호 65의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 소정 구현예에서, 상기 ICOS 폴리펩티드는 서열번호 65의 아미노산 1 내지 199, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 또는 150 내지 199의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 서열번호 65는 아래에 제공된다.
1 MKSGLWYFFL FCLRIKVLTG EINGSANYEM FIFHNGGVQI LCKYPDIVQQ FKMQLLKGGQ
61 ILCDLTKTKG SGNTVSIKSL KFCHSQLSNN SVSFFLYNLD HSHANYYFCN LSIFDPPPFK
121 VTLTGGYLHI YESQLCCQLK FWLPIGCAAF VVVCILGCIL ICWLTKKKYS SSVHDPNGEY
181 MFMRAVNTAK KSRLTDVTL [서열번호 65]
소정 구현예에서, 본 개시된 메소텔린-표적화 CAR은 인간 세포 내에서 핵산 서열을 발현하기 위한 유도가능한 프로모터를 추가로 포함한다. CAR 유전자의 발현에 사용하기 위한 프로모터는 구성적 프로모터, 예컨대 유비퀴틴 C(UbiC) 프로모터일 수 있다.
소정 구현예에서, 상이한 단백질로부터 유래되는 CAR의 도메인/모티프/영역들 사이의 돌연변이 부위 및/또는 접합부는 탈-면역화된다. 상이한 CAR 모이어티(moiety) 사이의 접합부의 면역원성은 NetMHC 4.0 Server를 이용해 예측될 수 있다. 그 다음 모이어티로부터의 적어도 하나의 아미노산을 함유하는 각각의 펩티드의 경우, 모든 대립유전자(allele)에 대하여, HLA A, B 및 C에 대한 결합 친화도가 예측될 수 있다. 각각의 펩티드의 면역원성의 점수가 각각의 펩티드에 대해 할당될 수 있다. 면역원성 점수는 면역원성 점수 = [(50 - 결합 친화도) × HLA 빈도]n의 식을 이용해 계산될 수 있다. n은 각각의 펩티드에 대한 예측의 수이다.
5.2.2.5. 예시적인 CAR
소정 구현예에서, 상기 메소텔린-표적화 CAR은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 76에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열번호 77에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열번호 78에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 VH; 및 서열번호 79에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열번호 80에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열번호 81에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 VL;를 포함하는 세포외 항원-결합 도메인;
(b) CD28 폴리펩티드를 포함하는 막통과 도메인(예컨대, 인간 CD28의 막통과 도메인 또는 그의 일부);
(c) CD28 힌지/스페이서 영역(예컨대, 인간 CD28의 힌지/스페이서 영역 또는 그의 일부); 및
(d) (ⅰ) 자연형 ITAM1, 2개의 기능 상실 돌연변이로 이루어지는 ITAM2 변이체, 및 2개의 기능 상실 돌연변이로 이루어지는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, 변형된 인간 CD3ζ 폴리펩티드), 및 (ⅱ) CD28 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD28 폴리펩티드, 예컨대 인간 CD28의 세포내 도메인 또는 그의 일부)를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함하는 세포내 신호전달 도메인.
소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인은 서열번호 92(또는 서열번호 90의 아미노산 153 내지 179)에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CD28 폴리펩티드를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CD28 힌지/스페이서 영역은 서열번호 15(또는 서열번호 90의 아미노산 114 내지 152)에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진다.
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 35에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진다.
소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 서열번호 101(또는 서열번호 90의 아미노산 180 내지 220)에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CD28 폴리펩티드를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR은 서열번호 56에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 서열번호 56에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 56은 아래에 제공된다.
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGKNGAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSRHQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR [서열번호 56]
서열번호 56의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 57에 나타낸다.
CAGGTTCAGCTTCAGGAGAGTGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCAAGTGAGACTCTCAGCTTGACTTGCACAGTTTCTGGAGGCAGTGTCTCCTCAGGCAGCTATTATTGGTCCTGGATTCGGCAGCCCCCTGGGAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATATATTACAGTGGCAGCACAAATTACAATCCATCCCTGAAGTCTCGAGTAACTATCAGTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTTTCACTCAAACTGTCTTCTGTGACTGCTGCTGACACTGCTGTTTATTATTGTGCCAGGGAGGGGAAAAATGGGGCATTTGATATTTGGGGTCAGGGCACAATGGTGACAGTCAGCTCTGGAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGCAGTGGAGGTGGTGGGTCACGCCATCAGATGACTCAGTCCCCCTCCAGTCTTTCTGCCTCAGTTGGGGATAGAGTGACCATCACATGCAGAGCAAGTCAGAGCATATCATCCTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCCAAATTGCTGATTTATGCAGCCTCAAGTCTCCAGAGTGGGGTGCCAAGCAGGTTCTCAGGCAGTGGCAGTGGGACAGATTTCACATTGACAATCAGCTCCCTCCAACCTGAAGATTTTGCCACCTACTATTGCCAGCAATCCTACAGCACGCCCCTGACTTTTGGAGGTGGCACAAAGGTAGAGATCAAGAGGACTGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTTCAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTTCAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTTCCAGGGGCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTTCGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC [서열번호 57]
소정 구현예에서, 상기 CAR은 CD8 리더를 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CD8 리더는 서열번호 71에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
서열번호 71의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 120에 나타낸다.
ATGGCCCTGCCAGTAACGGCTCTGCTGCTGCCACTTGCTCTGCTCCTCCATGCAGCCAGGCCT [서열번호 120]
소정 구현예에서, 상기 CAR은 아래에 제공되는 서열번호 43에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 서열번호 43에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 서열번호 43은 서열번호 71에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CD8 리더를 포함한다. 서열번호 43은 아래에 제공된다:
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGKNGAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSRHQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR [서열번호 43]
서열번호 43의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 44에 나타낸다.
ATGGCCCTGCCAGTAACGGCTCTGCTGCTGCCACTTGCTCTGCTCCTCCATGCAGCCAGGCCTCAGGTTCAGCTTCAGGAGAGTGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCAAGTGAGACTCTCAGCTTGACTTGCACAGTTTCTGGAGGCAGTGTCTCCTCAGGCAGCTATTATTGGTCCTGGATTCGGCAGCCCCCTGGGAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATATATTACAGTGGCAGCACAAATTACAATCCATCCCTGAAGTCTCGAGTAACTATCAGTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTTTCACTCAAACTGTCTTCTGTGACTGCTGCTGACACTGCTGTTTATTATTGTGCCAGGGAGGGGAAAAATGGGGCATTTGATATTTGGGGTCAGGGCACAATGGTGACAGTCAGCTCTGGAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGCAGTGGAGGTGGTGGGTCACGCCATCAGATGACTCAGTCCCCCTCCAGTCTTTCTGCCTCAGTTGGGGATAGAGTGACCATCACATGCAGAGCAAGTCAGAGCATATCATCCTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCCAAATTGCTGATTTATGCAGCCTCAAGTCTCCAGAGTGGGGTGCCAAGCAGGTTCTCAGGCAGTGGCAGTGGGACAGATTTCACATTGACAATCAGCTCCCTCCAACCTGAAGATTTTGCCACCTACTATTGCCAGCAATCCTACAGCACGCCCCTGACTTTTGGAGGTGGCACAAAGGTAGAGATCAAGAGGACTGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTTCAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTTCAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTTCCAGGGGCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTTCGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC [서열번호 44]
5.2.3. 예시적인 폴리펩티드 조성물
소정 구현예에서, 상기 폴리펩티드 조성물은 서열번호 56에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 메소텔린-표적화 CAR, 및 서열번호 48의 아미노산 21 내지 165을 포함하거나 이로 이루어지는 PD-1 DN을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 폴리펩티드 조성물은 서열번호 56에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 메소텔린-표적화 CAR, 및 서열번호 48의 아미노산 1 내지 165를 포함하거나 이로 이루어지는 PD-1 DN을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 폴리펩티드 조성물은 서열번호 56에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 메소텔린-표적화 CAR, 및 서열번호 49에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 PD-1 DN을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 폴리펩티드 조성물은 서열번호 56에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 메소텔린-표적화 CAR, 및 서열번호 118에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 PD-1 DN을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 폴리펩티드 조성물은 서열번호 56에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 메소텔린-표적화 CAR 및 서열번호 71에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CD8 리더, 및 서열번호 48의 아미노산 21 내지 165를 포함하거나 이로 이루어지는 PD-1 DN을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 폴리펩티드 조성물은 서열번호 56에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 메소텔린-표적화 CAR 및 서열번호 71에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CD8 리더, 및 서열번호 48의 아미노산 1 내지 165를 포함하거나 이로 이루어지는 PD-1 DN을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 폴리펩티드 조성물은 서열번호 56에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 메소텔린-표적화 CAR 및 서열번호 71에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CD8 리더, 및 서열번호 49에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 PD-1 DN을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 폴리펩티드 조성물은 서열번호 56에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 메소텔린-표적화 CAR 및 서열번호 71에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 CD8 리더, 및 서열번호 118에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 PD-1 DN을 포함한다.
5.3. 면역반응성 세포
본 개시된 주제는 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 조성물을 포함하는 면역반응성 세포를 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 상기 면역반응성 세포를 활성화시킬 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 폴리펩티드 조성물은 상기 면역반응성 세포의 항-종양 효과를 촉진할 수 있다. 상기 면역반응성 세포는 상기 폴리펩티드 조성물로 형질도입되어서, 상기 세포가 상기 CAR 및 PD-1 DN을 공-발현할 수 있다.
본 개시된 주제의 면역반응성 세포는 림프 계통의 세포일 수 있다. B, T 및 자연 살해(NK) 세포를 포함하는 상기 림프 계통은 항체의 생산, 세포 면역 시스템의 조절, 혈액 내 외래 제제의 검출, 숙주에 외래성인 세포의 검출 등을 위해 제공된다. 상기 림프 계통의 면역반응성 세포의 비제한적 예는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 배아 줄기 세포, 및 다능성 줄기 세포(예컨대, 림프성 세포로 분화될 수 있는 세포)를 포함한다. T 세포는 흉선에서 성숙되고 세포-매개성 면역력을 주로 담당하는 림프구일 수 있다. T 세포는 적응성(adaptive) 면역 시스템에 관여된다. 본 개시된 주제의 T 세포는 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 메모리 T 세포(중심 메모리 T 세포, 줄기-세포-유사 메모리 T 세포(또는 줄기-유사 메모리 T 세포), 및 2가지 타입의 이펙터 메모리 T 세포: 예컨대, TEM 세포 및 TEMRA 세포를 포함함), 조절성 T 세포(저해성 T 세포로도 알려짐), 자연 살해 T 세포, 점막 연관성 불변(invariant) T 세포, 및 γδ T 세포를 비제한적으로 포함하는 임의의 타입의 T 세포일 수 있다. 세포독성 T 세포(CTL 또는 킬러 T 세포)는 감염된 체세포 또는 종양 세포의 죽음을 유도할 수 있는 T 림프구의 서브세트(subset)이다. 환자 자신의 T 세포는 유전자적으로 변형되어 항원-인식 수용체, 예컨대 CAR 또는 TCR의 도입을 통해 특정 항원을 표적화할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 T 세포이다. 상기 T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포일 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 T 세포는 CD4+ T 세포이다. 소정 구현예에서, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포이다.
자연 살해(NK)세포는 세포-매개성 면역력의 일부이고 선천성 면역 반응 동안에 작용하는 림프구일 수 있다. NK 세포는 표적 세포에 대한 세포독성 효과를 수행하기 위해 사전 활성화를 필요로 하지 않는다.
본 개시된 주제의 인간 림프구의 타입은 말초 공여자 림프구, 예컨대 [Sadelain, M., et al. 2003 Nat Rev Cancer 3:35-45](CAR을 발현하기 위해 유전자적으로 변형된 말초 공여자 림프구를 개시함), [Morgan, R.A., et al. 2006 Science 314:126-129](α 및 β 헤테로다이머를 포함하는 전장 종양 항원-인식 T 세포 수용체 복합체를 발현하기 위해 유전자적으로 변형된 말초 공여자 림프구를 개시함), [Panelli, M.C., et al. 2000 J Immunol 164:495-504]; [Panelli, M.C., et al. 2000 J Immunol 164:4382-4392](종양 생검에서 종양 침입 림프구(TIL)로부터 유래되는 림프구 배양물을 개시함), 및 [Dupont, J., et al. 2005 Cancer Res 65:5417-5427]; [Papanicolaou, G.A., et al. 2003 Blood 102:2498-2505](인공 항원-제공 세포(AAPC) 또는 펄스화 수지상 세포를 도입하는 시험관내-확장 항원-특이적 말초 혈액 백혈구를 선택적으로 개시함)에 개시된 것들을 제한없이 포함한다. 상기 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)는 자가성, 비-자가성(예컨대, 동종성)이거나, 조작된 전구체 또는 줄기 세포로부터 시험관내에서 유래될 수 있다.
소정 구현예에서, 본 개시된 면역반응성 세포는 서열번호 56에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 메소텔린-표적화 CAR, 및 서열번호 48의 아미노산 1 내지 165를 포함하거나 이로 이루어지는 PD-1 DN을 포함한다.
소정 구현예에서, 본 개시된 주제의 CAR 및/또는 PD-1/DN 폴리펩티드 중 하나 이상을 포함하는 본 개시된 면역반응성 세포는 동종성 또는 자가성 EBV-감작된(sensitized) 세포독성 T 림프구(CTL)이다. 예를 들면, EBV-감작된 세포독성 T 세포의 생성은 EBV-혈청양성 자가성 또는 동종성 공여자로부터 PBMC를 단리하고, 단핵구 및 NK 세포를 고갈시킴으로써 T 세포에 대해 이를 강화하는 것을 수반할 수 있다. EBV-감작된 세포독성 T 세포는 또한 공여자 PBMC 또는 정제된 공여자 T 세포를 하나 이상의 EBV 항원(들)을 발현하고 미자극 T 세포에 EBV 항원(들)을 제공함으로써 EBV-감작된 CTL의 자극 및 확장을 초래하는 "자극자(stimulator)" 세포와 접촉시킴으로써 생산될 수 있다. 특히, 소정 구현예에서, 이러한 방법은 CD3+ 세포를 포함하는 대상체로부터 세포(예컨대, PBMC)의 샘플을 수득하는 단계 및 상기 CD3+ 세포를 항원 및/또는 항원-제공 자극자 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CD3+ T 세포는 상기 항원을 접촉시키기 전에 본 기술분야에 알려진 방법(예컨대, 샘플로부터 CD3+ 세포의 양성 선택 및/또는 샘플로부터 원하지 않는 세포 또는 성분을 고갈시키는 음성 선택)에 의해 샘플로부터 단리된다. 소정 구현예에서, 이러한 방법은 항-CD3 비드(예컨대, 자성 비드)를 이용한 형광 활성화 세포 분류법(FACS), 플라스틱 부착제, 항-CD56을 이용한 NK 세포의 고갈, 세정, 및/또는 이들의 조합을 이용한 선별을 포함한다. EBV 항원은, 예를 들면, 잠재성 막 단백질(LMP) 및 EBV 핵 항원(EBNA) 단백질, 예컨대 LMP-1, LMP-2A, 및 LMP-2B 및 EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C 및 EBNA-LP을 포함한다. 하나 이상의 EBV-특이적 항원을 인식하는 T 세포 수용체(들)를 포함하는 세포독성 T 세포는 상기 EBV 항원(들)에 "감작된" 것으로 생각되고, 따라서 본 명세서에서 "EBV-감작된 세포독성 T 세포"로 명명된다. 하나 이상의 본 개시된 CAR 폴리펩티드를 포함할 수 있는 동종성 또는 자가성 EBV-특이적 세포독성 T 세포 개체군(population) 생성하기 위한 공지된 방법은, 예를 들면, 상기 개시를 위해 인용에 의해 포함되는 [Barker et al., Blood 116(23):5045-49 (2010)]; [Doubrovina et al., Blood 119(11):2644-56 (2012)]; [Koehne et al., Blood 99(5):1730-40 (2002)]; 및 [Smith et al., Cancer Res. 72(5):1116-25 (2012)]에 기술되어 있다. 유사하게, 세포독성 T 세포는 사이토메갈로바이러스(CMV), 파필로마바이러스(예컨대, HPV), 아데노바이러스, 폴리오마바이러스(예컨대, BKV, JCV, 및 메르켈 세포 바이러스), 레트로바이러스(예컨대, HTLV-I, 또한 HIV와 같은 렌티바이러스를 포함함), 피코마바이러스(예컨대, A형 간염 바이러스), 헤파드나바이러스(예컨대, B형 간염 바이러스), 헤파시바이러스(예컨대, C형 간염 바이러스), 델타바이러스(예컨대, D형 간염 바이러스), 헤페바이러스(예컨대, E형 간염 바이러스), 등을 포함하는 다른 바이러스 항원에 "감작될" 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 표적 항원은 종양바이러스로부터 유래된다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR-T 세포의 생성을 위해 사용되는 T 세포는, 예를 들면, 단일 면역 이펙터(예컨대, 사이토카인 또는 CD107a와 같은 단일 바이오마커)만을 생산하는 세포보다 병원체에 대한 보다 효과적인 면역 반응을 제공하는 다중 면역 이펙터 기능을 유도할 수 있는 T 세포와 같은 다기능성 T-세포이다. 덜-다기능성, 단일기능성, 또는 심지어 "고갈된" T 세포는 만성 감염 동안에 면역 반응을 지배할 수 있고, 따라서 바이러스-연관 합병증에 대한 보호에 부정적인 영향을 미친다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR-T 세포는 다기능성이다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR-T 세포를 생성하기 위해 사용되는 T 세포의 적어도 약 50%는 CD4+ T 세포이다. 이러한 소정 구현예에서, 상기 T 세포는 약 50% 미만이 CD4+ T 세포이다. 소정 구현예에서, 상기 T 세포는 우세하게 CD4+ T 세포이다.
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR-T 세포를 생성하기 위해 사용되는 T 세포의 적어도 약 50%는 CD8+ T 세포이다. 이러한 소정 구현예에서, 상기 T 세포는 약 50% 미만이 CD8+ T 세포이다. 소정 구현예에서, 상기 T 세포는 우세하게 CD8+ T 세포이다. 소정 구현예에서, 상기 T 세포(예컨대, 본 명세서에 기술된 감작된 T 세포 및/또는 CAR-T 세포)는 대상체에게 투여되기 전에 세포 라이브러리 또는 은행에 보관된다.
본 개시된 면역반응성 세포는 적어도 하나의 외인성 공-자극성 리간드를 추가로 포함할 수 있어서, 상기 면역반응성 세포는 메소텔린-특이적 CAR 및 적어도 하나의 외인성 공-자극성 리간드를 공-발현하거나, 공-발현하기 위해 유도된다. 상기 메소텔린-특이적 CAR 및 적어도 하나의 공-자극성 리간드 사이의 상호작용은 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)의 완전한 활성화를 위해 중요한 비-항원-특이적 신호를 제공한다. 공­자극성 리간드는 종양 괴사 인자(TNF) 수퍼패밀리, 및 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리 리간드의 일원을 비제한적으로 포함한다. TNF는 전신 염증에 연관되며, 급성기 반응을 자극한다. 그 주된 역할은 면역 세포의 조절에 있다. TNF 수퍼패밀리의 일원은 다수의 공통 특징을 공유한다. TNF 수퍼패밀리 일원의 대부분은 짧은 세포질 세그먼트(segment) 및 상대적으로 긴 세포외 영역을 함유하는 타입 II 막통과 단백질(세포외 C-말단)로서 합성된다. TNF 수퍼패밀리 일원은 신경 성장 인자(NGF), CD40L(CD40L)/CD154, CD137L/4-1BBL, TNF-a, CD134L/OX40L/CD252, CD27L/CD70, Fas 리간드(FasL), CD30L/CD153, 종양 괴사 인자 베타(TNFβ)/림프독소-알파(LTa), 림프독소-베타(LTβ), CD257/B 세포-활성화 인자(BAFF)/Blys/THANK/Tall-1, 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 리간드(GITRL), 및 TNF-연관 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL), LIGHT(TNFSF14)를 비제한적으로 포함한다. 상기 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리는 세포 인식, 결합, 또는 부착 공정과 관련되는 세포 표면 및 가용성 단백질의 큰 그룹이다. 상기 단백질은 면역글로불린과 구조적 특징을 공유한다 - 이들은 면역글로불린 도메인(접힘)을 갖고 있다. 면역글로불린 수퍼패밀리 리간드는 모두 CD28에 대한 리간드인 CD80 및 CD86, PD-1에 대한 리간드인 PD-L1/(B7-H1)을 비제한적으로 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 적어도 하나의 공-자극성 리간드는 4-1BBL, CD80, CD86, CD70, OX40L, CD48, TNFRSF14, PD-L1, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 공-자극성 리간드는 4-1BBL이다. 4-1BBL은 메소텔린-표적화 CAR의 세포외 항원-결합 도메인의 5' 말단에 공유적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 4-1BBL은 메소텔린-표적화 CAR의 세포내 신호전달 도메인의 3' 말단에 공유적으로 연결될 수 있다.
아울러, 본 개시된 면역반응성 세포는 적어도 하나의 외인성 사이토카인을 추가로 포함할 수 있어서, 상기 면역반응성 세포는 메소텔린-특이적 CAR 및 적어도 하나의 외인성 사이토카인을 공-발현하거나, 공-발현하기 위해 유도된다. 소정 구현예에서, 상기 적어도 하나의 외인성 사이토카인은 IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-12, IL-15, IL-17, 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 적어도 하나의 외인성 사이토카인은 IL-12를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 메소텔린-표적화 CAR 및 외인성 IL-12를 공-발현한다. IL-12 는 메소텔린-표적화 CAR의 세포내 신호전달 도메인의 3' 말단에 공유적으로 연결될 수 있다.
부가적으로, 상기 면역반응성 세포는 메소텔린 또는 메소텔린 이외의 항원인 제2 항원에 결합하는 제2 CAR을 발현할 수 있다. 본 개시된 주제에서 메소텔린-특이적 CAR과 조합하여 제2 CAR로서 사용될 수 있는 CAR은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 [Sadelain, et al., "The Basic Principles of Chimeric Antigen Receptor Design." Cancer Discovery, OF1-11, (2013)], [Chicaybam, et al., (2011), Brentjens et al. Nature Medicine 9:279-286 (2003)], 및 미국 제7,446,190호에 기술되어 있는 것들, 예컨대 이들 모두 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 CD19-표적화 CAR(미국 제7,446,190호; 미국 2013/0071414 참조), HER2-표적화 CAR([Ahmed, et al., Clin Cancer Res., 2010] 참조), MUC16-표적화 CAR([Chekmasova, et al., 2011] 참조), 전립선 -특이적 막 항원(PSMA)-표적화 CAR(예를 들면, [Zhong, et al., Molecular Therapy, 18(2):413-420 (2010)])을 포함한다. 2 이상의 항원 인식 수용체(예컨대, CAR)를 발현하는 면역반응성 세포는 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 WO 2014/055668에 기술되어 있다.
상기 제2 항원은 종양 항원 또는 병원체 항원일 수 있다. 임의의 적합한 종양 항원(항원성 펩티드)이 본 명세서에 기술된 종양-연관 구현예에 사용하기에 적합하다. 종양 항원의 공급원은 암 단백질을 비제한적으로 포함한다. 상기 제2 항원은 펩티드로서, 또는 온전한 단백질 또는 그의 일부로서 발현될 수 있다. 상기 온전한 단백질 또는 그의 일부는 자연형이거나 돌연변이될 수 있다. 적합한 제2 항원은 전립선 특이적 막 항원(PSMA) 및 전립선 줄기 세포 항원(PCSA)을 비제한적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 종양 항원은 탄산 무수화효소 IX(CAIX), 암종배아 항원(CEA), CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD123, CD133, CD138, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원(예컨대, 세포 표면 항원), 상피 당단백질2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), 수용체 티로신-단백질 키나아제 Erb­B2, Erb-B3, Erb-B4, 폴레이트-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 폴레이트 수용체-a, 강글리오시드 G2(GD2), 강글리오시드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나아제 삽입 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(LlCAM), 흑색종 항원 패밀리 A, 1(MAGE-AI), 뮤신 16(Muc-16), 뮤신 1(Muc-1), NKG2D 리간드, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 암태아 항원(h5T4), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 종양­연관 당단백질 72(TAG-72), 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­ R2), 윌름 종양 단백질(WT-1), 타입 1 티로신-단백질 키나아제 막통과 수용체(ROR1), 또는 이들의 조합일 수 있다.
예를 들면, 면역손상된 대상체에서 병원체 감염 또는 다른 감염성 질환의 치료에 사용하기에 적합한 병원체성 항원은 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스테인 바 바이러스(EBV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 인플루엔자 바이러스에 존재하는 바이러스 항원을 비제한적으로 포함한다. 바이러스 항원을 표적화하는 제2 CAR을 포함하는 면역반응성 세포는 바이러스 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 소정 구현예에서, CMV 항원에 결합하는 메소텔린-표적화 CAR 및 제2 CAR은 CMV를 치료하기 위해 사용될 수 있는 면역반응성 세포(예컨대, 세포독성 T 림프구)에서 공-발현된다.
본 개시된 주제의 방법에서 사용될 수 있는 메소텔린-특이적 또는 메소텔린-표적화 인간 림프구는, 예컨대 (CAR을 발현하기 위해 유전자적으로 변형된 말초 공여자 림프구를 개시하는) [Sadelain, M., et al. 2003 Nat Rev Cancer 3:35-45], (a 및 β 헤테로다이머를 포함하는 전장 종양 항원-인식 T 세포 수용체 복합체를 발현하기 위해 유전자적으로 변형된 말초 공여자 림프구를 개시하는) [Morgan, R.A., et al. 2006 Science 314:126-129], (종양 생검에서 종양 침입 림프구(TIL)로부터 유래된 림프구 배양물을 개시하는) [Panelli, M.C., et al. 2000 J Immunol 164:495-504]; [Panelli, M.C., et al. 2000 J Immunol 164:4382-4392], 및 (인공 항원-제공 세포(AAPC) 또는 펄스화 수지상 세포를 도입하는 선택적으로 시험관내 확장된 항원-특이적 말초 혈액 백혈구를 개시하는) [Dupont, J., et al. 2005 Cancer Res 65:5417-5427]; [Papanicolaou, G.A., et al. 2003 Blood 102:2498-2505]에 개시된 말초 공여자 림프구를 비제한적으로 포함한다. 상기 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)는 자가성, 비-자가성(예컨대, 동종성)이거나, 조작된 전구체 또는 줄기 세포로부터 시험관내에서 유래될 수 있다.
분석법은 반복된(매주) 항원 자극시에 메소텔린-표적화 CAR-형질도입된 T 세포 증식, 이펙터 기능, 및 축적을 향상시키는데 대한 공-자극성 신호전달의 영향을 비교하기 위해 사용될 수 있다. 말초 혈액 림프구(PBL)는 IRB-승인된 프로토콜 하에 건강한 자원자로부터 수확 및 형질도입될 수 있다. 유전자 전달 효율은 GFP+ 형질도입 T 세포의 분획을 정량하기 위한 FACS 분석 및/또는 정량적 PCR에 의해 추적될 수 있다. 잘 확립된 공-배양 시스템(Gade, T.P., et al. Cancer Res. 65, 9080-9088 (2005); Gong, M.C., et al. Neoplasia. 1, 123-127 (1999); Latouche, J.B. & Sadelain, M. Nat.Biotechnol. 18, 405-409 (2000))을 이용하여, 메소텔린(대 메소텔린-대조군)을 발현하는 섬유아세포 AAPC가 형질도입된 T 세포로부터의 사이토카인 방출(IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ, TNF-α, 및 GM-CSF에 대한 세포 상등액 루미넥스 분석법), (CFSE 표지화에 의한) T 세포 증식, 및 (아넥신 V 염색에 의한) T 세포 생존을 지향하는지 여부를 결정할 수 있다. T 세포 생존, 증식, 및 효능에 대한 CD80 및/또는 4-1BBL의 영향이 평가될 수 있다. T 세포는 메소텔린+(MSLN+) 표적 세포에 의한 반복적인 자극에 노출되고, T 세포 증식 및 사이토카인 반응이 자극의 반복과 함께 유사하게 유지되거나 줄어드는지 여부를 결정할 수 있다. 다수의 E:T 비를 이용한 세포독성 분석법은 크롬-방출 분석법을 이용해 수행될 수 있다. 통계적 분석은 선택적으로 2-원(way) ANNOVA와, 이어서 쌍별 다중 비교 절차를 이용해 수행될 수 있고, 데이터는 평균±SEM으로 표시될 수 있다. 어떤 조건이 중심 메모리 표현형을 유지 또는 확장하는데 선호되는지를 결정하기 위하여 CD4 및 CD8 T 세포 서브타입(활성화 이펙터, 중심 메모리, 이펙터 메모리)을 확인할 수 있다.
소정 구현예에서, 본 개시된 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)는 약 1 내지 약 4개, 약 2 내지 약 4개, 약 3 내지 약 4개, 약 1 내지 약 2개, 약 1 내지 약 3개, 또는 약 2 내지 약 3개 벡터 사본 수/세포의 메소텔린-표적화 CAR을 발현한다. 예를 들면, 본 개시된 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)는 약 1개, 약 2개, 약 3개, 또는 약 4개 벡터 사본 수/세포의 메소텔린-표적화 CAR을 발현한다. 소정 구현예에서, 본 개시된 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)는 약 3 약 4개 벡터 사본 수/세포의 메소텔린-표적화 CAR을 발현한다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)의 세포독성 및 사이토카인 생산은 세포에서 상기 메소텔린-특이적 CAR의 발현 레벨에 비례한다. 예를 들면, 면역반응성 세포에서 CAR 발현 레벨이 높을수록 상기 면역반응성 세포에서 더 큰 세포독성 및 사이토카인 생산을 나타낸다. 높은 메소텔린-CAR 발현 레벨을 갖는 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)는 항원-특이적 사이토카인 생산 또는 분비를 유도하고, 및/또는 낮은 레벨의 메소텔린 발현, 예컨대 약 2,000개 이하, 약 1,000개 이하, 약 900개 이하, 약 800개 이하, 약 700개 이하, 약 600개 이하, 약 500개 이하, 약 400개 이하, 약 300개 이하, 약 200개 이하, 약 100개 이하의 메소텔린 결합 부위/세포를 갖는 조직 또는 세포에 세포독성을 나타낼 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 본 개시된 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)의 세포독성 및 사이토카인 생산은 표적 조직 또는 표적 세포에서 인간 메소텔린의 발현 레벨에 비례한다. 예를 들면, 표적에서 인간 메소텔린의 발현 레벨이 높을수록 상기 면역반응성 세포에서 더 큰 세포독성 및 사이토카인 생산을 나타낸다.
소정 구현예에서, 상기 표적 세포는 이질성(heterogeneous) MSLN-발현 세포이며, 낮은 MSLN-발현 세포 및 높은 MSLN-발현 세포를 포함하는 세포의 개체군이다. 본 개시된 면역반응성 세포는 높은 MSLN-발현 세포의 존재시에 낮은 MSLN-발현 세포(예컨대, 약 2,000개 이하, 약 1,000개 이하, 약 900개 이하, 약 800개 이하, 약 700개 이하, 약 600개 이하, 약 500개 이하, 약 400개 이하, 약 300개 이하, 약 200개 이하, 또는 약 100개 이하의 MSLN 결합 부위/세포)에 대한 증가된 세포독성 및 항-종양 활성을 나타낼 수 있다. 소정 구현예에서, 높은 MSLN-발현 세포의 존재시에도, 상기 면역반응성 세포는 MSLN-음성 세포에 대해 증가된 세포독성 또는 비특이적 살상을 나타내지 않는다. 따라서, 상기 면역반응성 세포는 높은 MSLN-발현 세포의 존재시에 낮은 MSLN-발현 세포에 대한 증가된 세포독성 및 항-종양 활성을 나타내지만 MSLN-음성 세포에 대한 안전성을 유지할 수 있다.
소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 특히 CAR가 낮은 친화도의 CAR일 때 MSLN-특이적 CAR의 결합도를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 부착 분자를 발현할 수 있다. 부착 분자의 비제한적 예는 CD2 및 VLA-4를 포함한다. 상기 면역반응성 세포에 발현되는 CD2는 표적 세포(예컨대, 암성 세포)에 발현되는 CD58에 결합할 수 있다. 상기 면역반응성 세포에 발현되는 VLA-4는 표적 세포(예컨대, 암성 세포) 상의 VCAM-1에 결합할 수 있다.
CTL의 비정제된 공급원은 본 기술분야에 알려진 임의의 것들, 예컨대 골수, 태아, 신생아 또는 성인 또는 다른 조혈성 세포 공급원, 예컨대 태아 간, 말초 혈액 또는 제대혈일 수 있다. 다양한 기술이 세포를 분리하기 위해 도입될 수 있다. 예를 들면, 음성 선택 방법은 처음에 비-CTL을 제거할 수 있다. mAB는 양성 및 음성 선택 모두의 경우에 특정 세포 계통 및/또는 분화 상태와 연관된 마커를 확인하기 위해 특히 유용하다.
많은 비율의 최종적으로 분화된 세포는 처음에 상대적으로 대충 분리함으로써 제거될 수 있다. 예를 들면, 자성 비드 분리가 처음에 많은 수의 무관한 세포를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 소정 구현예에서, 적어도 약 80%, 대개는 적어도 70%의 총 조혈성 세포가 세포 단리 이전에 제거될 것이다.
분리를 위한 절차는 밀도 구배 원심분리; 리셋팅; 세포 밀도를 변형하는 입자와의 커플링; 항체-코팅된 자성 입자를 이용한 자성 분리; 친화성 크로마토그래피; 보체 및 사이토톡신을 비제한적으로 포함하는 mAb와 연결되거나 접목되어 사용되는 세포독성 제제; 및 플레이트, 칩과 같은 고형 매트릭스에 부착된 항체와의 패닝, 일루트리에이션(세정) 또는 임의의 다른 편리한 기술을 비제한적으로 포함한다.
분리 및 분석을 위한 기술은 복수의 컬러 채널, 낮은 각 및 둔한 광 산란 검출 채널, 임피던스(임피던스) 채널과 같은 다양한 정도의 소피스티케이션(sophistication)을 갖는 유세포분석을 비제한적으로 포함한다.
상기 세포는 프로피디움 아이오다이드(PI)와 같은 죽은 세포와 연관된 염료를 도입함으로써 죽은 세포에 대해 선택될 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 세포는 2% 송아지 태아 혈청(FCS) 또는 0.2% 소 혈청 알부민(BSA) 또는 임의의 다른 적합한, 예컨대 멸균의 등장 배지를 포함하는 배지 내에 수집된다.
5.4. 핵산 조성물 및 벡터
본 개시의 주제는 본 명세서에 개시된(예컨대, 섹션 5.2에 개시된) 폴리펩티드 조성물을 암호화하는 핵산 조성물을 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 핵산 조성물은 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 조성물(예컨대, 섹션 5.2에 개시된 것)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 이러한 핵산 조성물을 포함하는 벡터, 및 이러한 핵산 조성물 또는 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
소정 구현예에서, 상기 핵산 조성물은 상기 폴리펩티드 조성물에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 프로모터는 내인성 또는 외인성이다. 소정 구현예에서, 상기 외인성 프로모터는 신장 인자(EF)-1 프로모터, CMV 프로모터, SV40 프로모터, PGK 프로모터, 및 메탈로티오네인 프로모터로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 프로모터는 유도가능한 프로모터이다. 소정 구현예에서, 상기 유도가능한 프로모터는 NFAT 전사 반응 요소(TRE) 프로모터, CD69 프로모터, CD25 프로모터, 및 IL-2 프로모터로부터 선택된다.
상기 핵산 조성물은 본 기술분야에 알려진 방법에 의해 또는 본 명세서에 기술된 것과 같이 대상체에게 투여되고, 및/또는 세포 내로 운반될 수 있다.
면역반응성 세포(예컨대, T 세포 또는 NK 세포)의 유전적 변형은 실질적으로 균일한 세포 조성물을 재조합 DNA 구조체로 형질도입함으로써 달성될 수 있다. 소정 구현예에서, 레트로바이러스 벡터(감마-레트로바이러스 또는 렌티바이러스)가 상기 DNA 구조체를 세포 내로 도입하기 위해 도입된다. 예를 들면, 항원-인식 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 레트로바이러스 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 발현은 그 내인성 프로모터, 상기 레트로바이러스 긴 말단 반복, 또는 관심있는 표적 세포 타입에 대해 특이적인 프로모터로부터 구동될 수 있다. 비-바이러스 벡터도 역시 사용될 수 있다.
항원 인식 수용체(예컨대, CAR 또는 TCR)를 포함하기 위한 면역반응성 세포의 초기 유전적 변형을 위하여, 레트로바이러스 벡터가 형질도입을 위해 일반적으로 도입되지만, 임의의 다른 적합한 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 운반 시스템이 사용될 수 있다. 상기 CAR 및 PD-1 DN은 단일, 다중시스트론성 발현 카세트, 단일 벡터의 다중 발현 카세트, 또는 다중 벡터 내에서 구축될 수 있다. 폴리시스트론성 발현 카세트를 생성하는 요소들의 예는 다양한 바이러스 및 비-바이러스 내부 리보솜 진입 부위(IRES, 예컨대 FGF-1 IRES, FGF-2 IRES, VEGF IRES, IGF-II IRES, NF-κB IRES, RUNX1 IRES, p53 IRES, A형 간염 IRES, C형 간염 IRES, 페스티바이러스 IRES, 아프토바이러스 IRES, 피코르나바이러스 IRES, 폴리오바이러스 IRES 및 뇌심근염 바이러스 IRES) 및 절단가능한 링커(예컨대, 2A 펩티드, 예컨대 P2A, T2A, E2A 및 F2A 펩티드)를 비제한적으로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 P2A 펩티드는 아래에 제공되는 서열번호 107에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPM [서열번호 107]
소정 구현예에서, 상기 P2A 펩티드는 아래에 제공되는 서열번호 121에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
ATNFSLLKQAGDVEENPGP [서열번호 121]
서열번호 121의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 아래에 제공되는 서열번호 122에 나타낸다:
GCAACAAACTTCTCACTACTCAAACAAGCAGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCA [서열번호 122]
레트로바이러스 벡터 및 적절한 패키징 라인의 조합이 또한 적합하며, 이때 캡시드 단백질은 인간 세포의 감염을 위해 기능을 할 것이다. PA12(Miller, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437); PA317 (Miller, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902); and CRIP (Danos, et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464)를 비제한적으로 포함하는 다양한 암포트로픽(amphotropic) 바이러스-생성 세포주가 알려져 있다. 비-암포트로픽 입자, 예컨대 VSVG, RD114 또는 GALV 외피로 위형화된(pseudotyped) 입자 및 본 기술분야에 알려진 임의의 다른 입자도 역시 적합하다.
형질도입의 가능한 방법은 또한, 예컨대 [Bregni, et al. (1992) Blood 80:1418-1422]의 방법에 의해 세포를 프로듀서 세포와 직접 공-배양하거나, 예컨대 [Xu, et al. (1994) Exp. Hemat. 22:223-230]; 및 [Hughes, et al. (1992) J. Clin. Invest. 89:1817]의 방법에 의해 적절한 성장 인자 및 다가양이온의 존재 또는 부재시 바이러스 상등액과 단독으로 또는 농축된 벡터 스톡과 함께 배양하는 것을 포함한다.
다른 형질도입 바이러스 벡터가 면역반응성 세포를 변형하기 위해 사용될 수 있다. 소정 구현예에서, 선택된 벡터는 높은 감염 효율 및 안정한 통합 및 발현을 나타낸다(예컨대, [Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997]; [Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996]; [Bloomer et al., Journal of Virology 71:6641-6649, 1997]; [Naldini et al., Science 272:263 267, 1996]; 및 [Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997] 참조). 사용될 수 있는 다른 바이러스 벡터는, 예를 들면, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-연관 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스, 소 파필로마 바이러스, 또는 엡스테인-바(Epstein-Barr) 바이러스와 같은 헤르페스 바이러스(또한, 예를 들면, [Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990]; [Friedman, Science 244:1275-1281, 1989]; [Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614, 1988]; [Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990]; [Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991]; [Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987]; [Anderson, Science 226:401-409, 1984]; [Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991]; [Miller et al., Biotechnology 7:980-990, 1989]; [Le Gal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993]; 및 [Johnson, Chest 107:77S-83S, 1995]의 벡터 참조)를 포함한다. 레트로바이러스 벡터가 특히 잘 개발되었고, 임상적 세팅에서 사용되고 있다(Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323:370, 1990; Anderson et al., 미국 특허 제 5,399,346호).
소정 구현예에서, 본 개시된 폴리펩티드 조성물을 암호화하는 벡터는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병-기반 레트로바이러스 벡터일 수 있는 SGF γ-레트로바이러스 벡터이다. 소정 구현예에서, 상기 벡터는 아래에 제공되는 서열번호 123에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
ATGGCCCTGCCAGTAACGGCTCTGCTGCTGCCACTTGCTCTGCTCCTCCATGCAGCCAGGCCTCAGGTTCAGCTTCAGGAGAGTGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCAAGTGAGACTCTCAGCTTGACTTGCACAGTTTCTGGAGGCAGTGTCTCCTCAGGCAGCTATTATTGGTCCTGGATTCGGCAGCCCCCTGGGAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATATATTACAGTGGCAGCACAAATTACAATCCATCCCTGAAGTCTCGAGTAACTATCAGTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTTTCACTCAAACTGTCTTCTGTGACTGCTGCTGACACTGCTGTTTATTATTGTGCCAGGGAGGGGAAAAATGGGGCATTTGATATTTGGGGTCAGGGCACAATGGTGACAGTCAGCTCTGGAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGCAGTGGAGGTGGTGGGTCACGCCATCAGATGACTCAGTCCCCCTCCAGTCTTTCTGCCTCAGTTGGGGATAGAGTGACCATCACATGCAGAGCAAGTCAGAGCATATCATCCTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCCAAATTGCTGATTTATGCAGCCTCAAGTCTCCAGAGTGGGGTGCCAAGCAGGTTCTCAGGCAGTGGCAGTGGGACAGATTTCACATTGACAATCAGCTCCCTCCAACCTGAAGATTTTGCCACCTACTATTGCCAGCAATCCTACAGCACGCCCCTGACTTTTGGAGGTGGCACAAAGGTAGAGATCAAGAGGACTgcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtTcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctTcagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttTccaggggctcagtacagccaccaaggacacctTcgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcGGATCTGGAGCAACAAACTTCTCACTACTCAAACAAGCAGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCAATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCTTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGGCGGCCGCACCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACCCCGGCGCCCACGATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGCGGATCCAATAAcagccactcgaggatccGGATTAGTCCAATTTGTTAAAGACAGGATATCAGTGGTCCAGGCTCTAGTTTTGACTCAACAATATCACCAGCTGAAGCCTATAGAGTACGAGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCACACATGCAGCATGTATCAAAATTAATTTGGTTTTTTTTCTTAAGTATTTACATTAAATGGCCATAGTACTTAAAGTTACATTGGCTTCCTTGAAATAAACATGGAGTATTCAGAATGTGTCATAAATATTTCTAATTTTAAGATAGTATCTCCATTGGCTTTCTACTTTTTCTTTTATTTTTTTTTGTCCTCTGTCTTCCATTTGTTGTTGTTGTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTGGTTGGTTGGTTAATTTTTTTTTAAAGATCCTACACTATAGTTCAAGCTAGACTATTAGCTACTCTGTAACCCAGGGTGACCTTGAAGTCATGGGTAGCCTGCTGTTTTAGCCTTCCCACATCTAAGATTACAGGTATGAGCTATCATTTTTGGTATATTGATTGATTGATTGATTGATGTGTGTGTGTGTGATTGTGTTTGTGTGTGTGACTGTGAAAATGTGTGTATGGGTGTGTGTGAATGTGTGTATGTATGTGTGTGTGTGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCATGTGTGTGTGTGTGACTGTGTCTATGTGTATGACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTGTGAAAAAATATTCTATGGTAGTGAGAGCCAACGCTCCGGCTCAGGTGTCAGGTTGGTTTTTGAGACAGAGTCTTTCACTTAGCTTGGAATTCactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgatgacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatc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[서열번호 123]
소정 구현예에서, 상기 벡터는 아래에 제공되는 서열번호 124에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
ATGGCCCTGCCAGTAACGGCTCTGCTGCTGCCACTTGCTCTGCTCCTCCATGCAGCCAGGCCTCAGGTTCAGCTTCAGGAGAGTGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCAAGTGAGACTCTCAGCTTGACTTGCACAGTTTCTGGAGGCAGTGTCTCCTCAGGCAGCTATTATTGGTCCTGGATTCGGCAGCCCCCTGGGAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATATATTACAGTGGCAGCACAAATTACAATCCATCCCTGAAGTCTCGAGTAACTATCAGTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTTTCACTCAAACTGTCTTCTGTGACTGCTGCTGACACTGCTGTTTATTATTGTGCCAGGGAGGGGAAAAATGGGGCATTTGATATTTGGGGTCAGGGCACAATGGTGACAGTCAGCTCTGGAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGCAGTGGAGGTGGTGGGTCACGCCATCAGATGACTCAGTCCCCCTCCAGTCTTTCTGCCTCAGTTGGGGATAGAGTGACCATCACATGCAGAGCAAGTCAGAGCATATCATCCTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCCAAATTGCTGATTTATGCAGCCTCAAGTCTCCAGAGTGGGGTGCCAAGCAGGTTCTCAGGCAGTGGCAGTGGGACAGATTTCACATTGACAATCAGCTCCCTCCAACCTGAAGATTTTGCCACCTACTATTGCCAGCAATCCTACAGCACGCCCCTGACTTTTGGAGGTGGCACAAAGGTAGAGATCAAGAGGACTgcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtTcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctTcagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttTccaggggctcagtacagccaccaaggacacctTcgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcGGATCTGGAGCAACAAACTTCTCACTACTCAAACAAGCAGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCAATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCTTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGGCGGCCGCACCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACCCCGGCGCCCACGATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGCGGATCCAATAAcagccactcgaggatccGGATTAGTCCAATTTGTTAAAGACAGGATATCAGTGGTCCAGGCTCTAGTTTTGACTCAACAATATCACCAGCTGAAGCCTATAGAGTACGAGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCACATGCAGCATGTATCAAAATTAATTTGGTTTTTTTTCTTAAGTATTTACATTAAATGGCCATAGTACTTAAAGTTACATTGGCTTCCTTGAAATAAACATGGAGTATTCAGAATGTGTCATAAATATTTCTAATTTTAAGATAGTATCTCCATTGGCTTTCTACTTTTTCTTTTATTTTTTTTTGTCCTCTGTCTTCCATTTGTTGTTGTTGTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTGGTTGGTTGGTTAATTTTTTTTTAAAGATCCTACACTATAGTTCAAGCTAGACTATTAGCTACTCTGTAACCCAGGGTGACCTTGAAGTCATGGGTAGCCTGCTGTTTTAGCCTTCCCACATCTAAGATTACAGGTATGAGCTATCATTTTTGGTATATTGATTGATTGATTGATTGATGTGTGTGTGTGTGATTGTGTTTGTGTGTGTGAtTGTGtAtATGTGTGTATGGtTGTGTGTGAtTGTGTGTATGTATGTtTGTGTGTGAtTGTGTGTGTGTGatTGTGCATGTGTGTGTGTGTGAtTGTGTtTATGTGTATGAtTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTGTGtAtAtATATTTATGGTAGTGAGAGgCAACGCTCCGGCTCAGGTGTCAGGTTGGTTTTTGAGACAGAGTCTTTCACTTAGCTTGGAATTCactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctgga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[서열번호 124]
비-바이러스 접근법이 또한 면역반응성 세포의 유전적 변형을 위해 도입될 수 있다. 예를 들면, 핵산 분자는 상기 핵산을 리포펙션(lipofection)(Feigner et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512, 1983), 아시알로오로소뮤코이드(asialoorosomucoid)-폴리리신 접합(Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989)의 존재 하에 투여하거나, 외과적 조건(Wolff et al., Science 247:1465, 1990) 하에 미세-주사함으로써 면역반응성 세포 내로 도입될 수 있다. 유전자 전달을 위한 다른 비-바이러스 수단은 칼슘 포스페이트, DEAE 덱스트란, 전기천공(electroporation), 및 원형질체(protoplast) 융합을 이용한 시험관내 형질주입(transfection)을 포함한다. 리포좀은 또한 세포 내로의 DNA의 운반에 대해 잠재적인 이점을 가질 수 있다. 정상 핵산을 생체외에서 배양가능한 타입의 세포(예컨대, 자가성 또는 이종성 원발 세포 또는 그의 자손) 내로 전달하고, 이후 상기 세포(또는 그의 후손)를 표적화 조직 내로 주입하거나 전신 주입함으로써 대상체의 손상된 조직 내로의 정상 유전자의 이식이 또한 달성될 수 있다. 재조합 수용체는 또한 트랜스포자제(transposase) 또는 표적화 뉴클레아제(예컨대, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 또는 TALE 뉴클레아제, CRISPR)를 이용하여 유래 또는 얻어질 수 있다. 일시적 발현은 RNA 전기천공에 의해 얻어질 수 있다.
임의의 표적화 게놈 편집 방법이 상기 폴리펩티드 조성물을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 소정 구현예에서, CRISPR 시스템이 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 조성물을 발현하기 위해 사용된다. 소정 구현예에서, 징크-핑거 뉴클레아제가 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 조성물을 발현하기 위해 사용된다. 소정 구현예에서, TALEN 시스템이 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 조성물을 발현하기 위해 사용된다.
클러스터되고 규칙적으로-이격된 짧은 팔린드롬 반복물(CRISPR) 시스템은 원핵생물 세포에서 발견된 게놈 편집 도구이다. 게놈 편집을 위해 이용될 때, 상기 시스템은 Cas9(그 가이드로서 crRNA를 이용하여 DNA를 변형할 수 있는 단백질), CRISPR RNA(crRNA, 숙주 DNA의 올바른 섹션으로 이를 가이드하기 위해 Cas9에 의해 이용되는 RNA와 함께 tracrRNA(일반적으로 헤어핀 루프 형태)에 결합하는 영역을 포함하여 Cas9와 활성 복합체를 형성함), 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA, crRNA에 결합하고 Cas9와 활성 복합체를 형성함), 및 선택적인 섹션의 DNA 복구 주형(세포의 복구 프로세스를 가이드하여 특정 DNA 서열이 삽입되도록 하는 DNA)을 포함한다. CRISPR/Cas9은 종종 표적 세포를 형질주입하기 위한 플라스미드를 도입한다. 상기 crRNA는 Cas9가 세포 내에서 표적 DNA를 확인하고 직접 결합하기 위해 사용하는 서열이기 때문에, 각각의 적용을 위해 디자인될 필요가 있다. CAR 발현 카세트를 운반하는 복구 주형은 절단된 각각의 측 상의 서열과 중첩되고 삽입 서열을 코딩해야 하기 때문에, 또한 각각의 적용을 위해 디자인될 필요가 있다. 다중 crRNA 및 tracrRNA가 함께 패키지되어 단일-가이드 RNA(sgRNA)를 형성할 수 있다. 상기 sgRNA는 세포 내로 형질주입되기 위하여 상기 Cas9 유전자와 함께 연결되어 플라스미드로 제조될 수 있다.
징크-핑거 뉴클레아제(ZFN)는 인공 제한 효소이며, 징크 핑거 DNA-결합 도메인과 DNA-절단 도메인을 조합함으로써 생성된다. 징크 핑거 도메인은 특정 DNA 서열을 표적화하기 위해 조작되어서 징크-핑거 뉴클레아제가 게놈 내에서 원하는 서열을 표적화하도록 할 수 있다. 개별 ZFN의 DNA-결합 도메인은 전형적으로 복수의 개별 징크 핑거 반복물을 함유하고, 각각 복수의 염기쌍을 인식할 수 있다. 새로운 징크-핑거 도메인을 생성하기 위한 가장 평범한 방법은 특이성이 공지된 더 작은 징크-핑거 "모듈"을 조합하는 것이다. ZFN 내의 가장 평범한 절단 도메인은 타입 II 제한 엔도뉴클레아제 FokI 유래의 비-특이적 절단 도메인이다. 상기 내인성 상동성 재조합(HR) 구성요소(machinery) 및 CAR 발현 카세트를 운반하는 상동성 DNA 주형을 이용함으로써, ZFN은 게놈 내로 CAR 발현 카세트를 삽입하기 위해 사용될 수 있다. 상기 표적화 서열이 ZFN에 의해 절단될 때, 상기 HR 구성요소는 손상된 염색체와 상동성 DNA 주형 사이의 상동성에 대해 검색한 후, 염색체의 2개의 깨어진 말단 사이의 주형의 서열을 복사하고, 이로 인해 상기 상동성 DNA 주형이 상기 게놈 내로 통합된다.
전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)는 DNA의 특정 서열을 절단하도록 조작될 수 있는 제한 효소이다. TALEN 시스템은 ZEN과 거의 동일한 원리로 작동한다. 이들은 전사 활성자-유사 이펙터 DNA-결합 도메인과 DNA 절단 도메인을 조합함으로써 생성된다. 전사 활성자-유사 이펙터(TALE)는 33-34개의 아미노산 반복 모티프와 특정 뉴클레오티드에 대한 강한 인식을 갖는 2개의 가변성 위치로 구성된다. 상기 TALE의 조립 배열에 의해, 상기 TALE DNA-결합 도메인은 원하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있고, 이로 인해 상기 뉴클레아제가 게놈 상의 특정 위치를 절단하도록 가이드한다. 폴리뉴클레오티드 치료 방법에서 사용하기 위한 cDNA 발현은 임의의 적합한 프로모터(예컨대, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV), 유인원 바이러스 40(SV40), 또는 메탈로티오네인 프로모터)로부터 지향되고, 임의의 적절한 포유동물 조절성 인자 또는 인트론(예컨대, 신장 인자 1a 인핸서/프로모터/인트론 구조)에 의해 조절될 수 있다. 예를 들면, 원한다면, 특정 세포 타입에서의 유전자 발현을 우세하게 지향하는 것으로 알려져 있는 인핸서가 핵산의 발현을 지향하기 위해 사용될 수 있다. 사용되는 인핸서는 조직- 또는 세포-특이적 인핸서로 특정되어 있는 것들을 비제한적으로 포함할 수 있다. 대안적으로, 게놈성 클론이 치료적 구조체로 사용된다면, 조절은 전술한 임의의 프로모터 또는 조절성 인자를 포함하는 동족의(cognate) 조절성 서열에 의해, 또는, 원한다면, 이종성 공급원으로부터 유래되는 조절성 서열에 의해 매개될 수 있다.
상기 게놈 편집 제제/시스템을 운반하기 위한 방법은 필요에 따라 변할 수 있다. 소정 구현예에서, 선택된 게놈 편집 방법의 성분들은 하나 이상의 플라스미드 내의 DNA 구조체로서 운반된다. 소정 구현예에서, 상기 성분들은 바이러스 벡터를 통해 운반된다. 보통의 운반 방법은 전기천공, 미세주입(microinjection), 유전자 총, 임페일펙션(impalefection), 정수압(hydrostatic pressure), 계속적 주입, 초음파, 자기주입(magnetofection), 아데노-연관 바이러스, 바이러스 벡터의 외피 단백질 슈도타이핑(pseudotyping), 복제-적격(competent) 벡터 시스 및 트랜스-작용성 요소, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 및 화학적 비히클(예컨대, 올리고뉴클레오티드, 리포플렉스, 폴리머솜, 폴리플렉스, 덴드리머, 무기 나노입자, 및 세포-침투성 펩티드)을 비제한적으로 포함한다.
5.5. 폴리펩티드 및 유사체
본 개시된 주제에는 또한 면역반응성 세포에서 발현될 때 그 항-신생물 활성을 향상시키는 방식으로 변형된 본 명세서에 개시된 폴리펩티드(예컨대, 메소텔린, CD28, CD8, CD3ζ, 및 PD-1 DN, 등) 또는 그의 단편이 포함된다. 본 개시된 주제는 서열 내에 변경을 도입함으로써 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 최적화하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 변경은 소정의 돌연변이, 결실, 삽입, 또는 번역후 변형을 포함할 수 있다. 본 개시된 주제는 본 명세서에 개시된 임의의 폴리펩티드(메소텔린, CD28, CD8, CD3ζ 및 PD-1 DN을 비제한적으로 포함함)의 유사체를 추가로 포함한다. 유사체는 아미노산 서열의 차이, 번역후 변형, 또는 이들 모두에 의해 본 명세서에 개시된 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 유사체는 본 개시된 주제의 아미노산 서열의 전체 또는 일부와 적어도 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상의 상동성을 나타낼 수 있다. 서열 비교의 길이는 적어도 5, 10, 15 또는 20개 아미노산 잔기, 예컨대 적어도 25, 50, 또는 75개 아미노산 잔기, 또는 100개 이상의 아미노산 잔기이다. 다시, 동일성의 정도를 결정하기 위한 예시적인 접근법에서, BLAST 프로그램이 매우 연관된 서열을 나타내는 e-3 및 e-100 사이의 가능성 점수로 사용될 수 있다. 변형은 폴리펩티드의 생체내 및 시험관내 화학적 유도체화, 예컨대 아세틸화, 카르복실화, 인산화, 또는 글리코실화를 포함한다; 이러한 변형은 폴리펩티드 합성 또는 단리된 변형 효소를 이용한 공정 또는 그 이후의 처리 동안에 일어날 수 있다. 유사체는 또한 1차 서열에서의 변경에 의해 자연-발생형 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 이들은 자연형 또는 유도형 모두의 유전적 변이체(예를 들면, 방사선조사 또는 에탄메틸설페이트에 대한 노출 또는 전술한 [Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), CSH Press, 1989, 또는 Ausubel et al.]에 개시되어 있는 것과 같은 위치-특이적 돌연변이화에 의한 무작위 돌연변이화의 결과물)를 포함한다. 또한, 환형화된 펩티드, 분자, 및 L-아미노산 이외의 잔기를 함유하는 유사체, 예컨대 D-아미노산 또는 비-자연 발생형 또는 합성 아미노산, 예컨대 β 또는 γ 아미노산이 포함된다.
전장 폴리펩티드 이외에도, 본 개시된 주제는 또한 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 또는 펩티드 도메인 중 임의의 하나의 단편을 제공한다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "단편"은 적어도 5, 10, 13, 또는 15개 아미노산을 의미한다. 소정 구현예에서, 단편은 적어도 20개의 인접한(contiguous) 아미노산, 적어도 30개의 인접한 아미노산, 또는 적어도 50개의 인접한 아미노산을 포함한다. 소정 구현예에서, 단편은 적어도 60 내지 80, 100, 200, 300개 또는 그 이상의 인접한 아미노산을 포함한다. 단편은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법에 의해 생성될 수 있거나, 정상적인 단백질 처리(예컨대, 초기의 폴리펩티드로부터 생물학적 활성에 필요하지 않는 아미노산의 제거 또는 대안적 mRNA 스플라이싱 또는 대안적 단백질 처리 사건에 의한 아미노산의 제거)의 결과물일 수 있다.
비-단백질 유사체는 본 명세서에 개시된 단백질의 기능적 활성을 모방하도록 디자인된 화학적 구조를 갖는다. 이러한 유사체는 본래의 폴리펩티드의 생리학적 활성을 상회할 수 있다. 유사체의 디자인 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 유사체의 합성은 결과물인 유사체가 면역반응성 세포에서 발현될 때 본래의 폴리펩티드의 항-신생물 활성을 증가시키도록 화학적 구조를 변형함으로써 이러한 방법에 따라 수행될 수 있다. 이러한 화학적 변형은 기준 폴리펩티드의 특정 탄소 원자에서 대안적 R 기를 치환하고 포화 정도를 변경하는 것을 비제한적으로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 단백질 유사체는 생체내 분해에 대해 상대적으로 저항성이어서, 투여시 보다 연장된 치료 효과를 야기할 수 있다. 기능적 활성의 측정을 위한 분석법은 아래의 실시예에서 개시된 것들을 비제한적으로 포함한다.
본 개시된 주제에 따라, 인간 메소텔린, CD3z, CD8, CD28, 4-1BB, 4-1BBL, 및 IL-12에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-결합 도메인(예컨대, scFv, Fab, 또는 (Fab)2)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈 최적화에 의해 변형될 수 있다. 코돈 최적화는 임의의 해당 발현 시스템에서 가장 높은 가능한 생산성 레벨을 달성하기 위하여 자연 발생형 및 재조합 유전자 서열 모두를 변경할 수 있다. 단백질 발현의 상이한 단계에 관여되는 인자는 코돈 적응성, mRNA 구조, 및 전사 및 번역에서의 다양한 cis-요소를 포함한다. OptimumGene™, Encor 최적화, 및 Blue Heron을 비제한적으로 포함하는 본 기술분야의 기술자에게 알려진 임의의 적합한 코돈 최적화 방법 또는 기술이 본 개시된 주제의 폴리뉴클레오티드를 변형하기 위해 사용될 수 있다.
코돈 최적화는 4가지 상이한 알고리즘(예컨대, Blue Heron 및 Encore 알고리즘)에 기반하여 수행될 수 있다. 모든 4가지 알고리즘으로부터 수득된 코돈 최적화 서열은 블렌드되고, 모든 CPG 및 BAM-H1은 최적 클로닝을 위해 제걷된다. 소정 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화 이전의 원래 서열과 약 70% 상동성이다. 면역반응성 세포(예컨대, 인간 원발성 T 세포)에서 효율적인 발현을 얻기 위하여, 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 CD8 리더, 예컨대 서열번호 71을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 라이게이션(ligation)된다. CD8 리더는 최적 신호 절단 선행(preceding) scFv 중쇄(QVQL)를 제공한다. 코돈 최적화는 면역반응성 세포, 예컨대 다중 인간 공여자 원발성 T 세포에서 양호한 형질도입 효율로 메소텔린 CAR 발현을 최적화한다. 다중 공여자 T 세포에서 다중 CAR 벡터 사본 수를 다양한 메소텔린 발현을 갖는 다중 혈액학적 및 고형 암 세포에 대한 기능적 효율, 특이성 및 민감성에 대해 테스트한다. 1-4(보다 구체적으로는, 약 3-4)의 벡터 사본 수를 갖는 코돈 최적화된 메소텔린-표적화 CAR은 높은 메소텔린 발현 표적에 대해 높은 효율적인 세포독성을 제공하지만, 낮은 메소텔린 발현 표적, 즉 정상 조직에 대해서는 최소 반응성을 제공한다. 높은 메소텔린을 발현하는 암 세포에 대해 반응성이지만 낮은 메소텔린을 발현하는 정상 조직에는 미약한 구체적인 메소텔린 CAR을 생성하는 전술한 유전자 조작법은 안전성을 보장하면서 암 치료법을 위한 임상 벡터로서 사용하기에 최적이다.
5.6. 약학적 조성물 및 투여
본 개시된 주제는 (예컨대, 섹션 5.3에 개시된 것과 같은) 본 개시된 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물에 포함되는 세포의 양은 상기 조성물을 사용하는 목적, 및/또는 상기 조성물을 받는 대상체의 크기, 연령, 성별, 중량, 및 증상에 따라 변할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 조성물은 약 104 내지 약 1010, 약 104 내지 약 106, 약 105 내지 약 106, 약 105 내지 약 107, 약 105 내지 약 109, 또는 약 106 내지 약 108의 본 개시된 면역반응성 세포를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 약 1×105, 적어도 약 5×105, 적어도 약 1×106, 적어도 약 1×107, 적어도 약 1×108의 본 개시된 면역반응성 세포를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 조성물은 약 1×105의 본 개시된 세포를 포함한다.
본 개시된 면역반응성 세포를 포함하는 조성물은 항원에 대한 면역 반응을 유도 및/또는 향상시키거나, 및/또는 신생물, 병원체 감염, 또는 감염성 질환, 염증성 질환, 또는 이식 거부를 치료 및/또는 예방하기 위하여 대상체에 전신적으로 또는 직접적으로 제공될 수 있다. 소정 구현예에서, 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물은 관심있는 기관(예컨대, 신생물에 의해 발병된 기관) 내로 직접 주사될 수 있다. 대안적으로, 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물은, 예를 들면, 순환 시스템(예컨대, 종양 맥관구조) 내로 투여함으로써 관심있는 기관에 직접 제공된다. 확장 및 분화 제제는 시험관내 또는 생체내에서 T 세포, NK 세포, 또는 CTL 세포의 생산을 증가시키기 위하여 상기 세포 또는 조성물을 투여하기 전, 투여하는 동안 또는 투여 후에 제공될 수 있다.
본 개시된 면역반응성 세포는 임의의 생리학적으로 허용가능한 비히클 내에서 보통은 혈관내로 투여될 수 있지만, 뼈 또는 세포의 재생산 및 분화를 위한 적절한 부위로 발견될 수 있는 다른 편리한 부위(예컨대, 흉선) 내로 도입될 수도 있다. 대개, 적어도 약 1×105 세포가 투여될 것이고, 최종적으로 1×1010 또는 그 이상에 도달한다. 본 개시된 면역반응성 세포는 정제된 세포 개체군을 포함할 수 있다. 본 기술분야의 기술자는 다양한 잘 알려진 방법, 예컨대 형광 활성화 세포 분류법(FACS)을 이용하여 개체군 내에서 본 개시된 면역반응성 세포의 백분율을 즉시 결정할 수 있다. 본 개시된 면역반응성 세포를 포함하는 개체군 내에서 순도의 적합한 범위는 약 50% 내지 약 55%, 약 5% 내지 약 60%, 및 약 65% 내지 약 70%이다. 소정 구현예에서, 상기 순도는 약 70% 내지 약 75%, 약 75% 내지 약 80%, 또는 약 80% 내지 약 85%이다. 소정 구현예에서, 상기 순도는 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 및 약 95% 내지 약 100%이다. 복용량(dosage)은 본 기술분야의 기술자에 의해 즉시 조정될 수 있다(예컨대, 순도가 떨어지면 복용량의 증가가 필요할 수 있음). 상기 세포는 주사, 카테터 등에 의해 도입될 수 있다.
본 개시된 조성물은 본 개시된 면역반응성 세포 또는 그의 전구체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물일 수 있다. 투여는 자가성 또는 이종성일 수 있다. 예를 들면, 면역반응성 세포, 또는 전구체는 한 대상체로부터 수득하고, 동일한 대상체 또는 상이한 호환가능한 대상체에 투여될 수 있다. 말초혈 유래의 면역반응성 세포 또는 그의 후손(예컨대, 생체내, 생체외 또는 시험관내 유래)은 카테터 투여를 포함하는 국소 주사, 전신 주사, 국소 주사, 정맥 주사, 또는 비경구 투여를 통해 투여될 수 있다. 본 개시된 주제의 치료적 조성물(예컨대, 본 개시된 면역반응성 세포를 포함하는 약학적 조성물)을 투여할 때, 주사가능한 단위 제형(용액, 현탁액, 에멀전)으로 제형화될 수 있다.
5.7. 제형
본 개시된 면역반응성 세포를 포함하는 조성물은 선택된 pH로 버퍼화될 수 있는 멸균 액체 제조물, 예컨대 등장 수용액, 현탁액, 에멀전, 분산액, 또는 점성 조성물로서 편리하게 제공될 수 있다. 액체 제조물은 보통 겔, 다른 점성 조성물, 및 고형 조성물보다 제조하기에 더 용이하다. 부가적으로, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기에 다소 더 편리하다. 반면에, 점성 조성물은 적절한 점도 범위 내로 제형화되어 특정 조직과의 접촉 기간을 더 길게 제공할 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은, 예를 들면, 물, 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 프로필렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매체일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
멸균 주사가능 용액은 필요시 다양한 양의 다른 성분들과 함께 필요한 양의 적절한 용매 내에 유전자적으로 변형된 면역반응성 세포를 포 통합함으로써 제조될 수 있다. 이러한 조성물은 멸균수, 생리 식염수, 글루코오스, 덱스트로오스 등과 같은 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 혼합될 수 있다. 상기 조성물은 또한 동결건조될 수 있다. 상기 조성물은 투여 경로 및 원하는 제조법에 따라 습윤제, 분산제, 또는 에멀전화제(예컨대, 메틸셀룰로오스), pH 버퍼화제, 겔화 또는 점도 증진 첨가제, 보존제, 착향제, 색소 등과 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 ["REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985]과 같은 표준 교과서가 과도한 실험 없이 적합한 제조물을 제조하기 위해 검토될 수 있다.
항균 보존제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 버퍼를 포함하는 상기 조성물의 안정성 및 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 보장될 수 있다. 주사가능한 약학적 형태의 장기간의 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴를 사용함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 본 개시된 주제에 따르면, 사용되는 임의의 비히클, 희석제, 또는 첨가제는 유전자적으로 변형된 면역반응성 세포 또는 그의 전구체와 호환성이어야 한다.
상기 조성물은 등장일 수 있으며, 즉 혈액 및 눈물과 동일한 삼투압을 가질 수 있다. 상기 조성물의 원하는 등장성은 염화나트륨, 또는 덱스트로오스, 붕산, 나트륨 타르트레이트, 프로필렌 글리콜과 같은 다른 약학적으로 허용가능한 제제 또는 다른 무기 또는 유기 용질을 이용하여 달성될 수 있다. 염화나트륨이 나트륨 이온을 함유하는 버퍼용으로 특히 바람직할 수 있다.
상기 조성물의 점도는, 원한다면, 약학적으로 허용가능한 증점제를 이용하여 선택된 레벨로 유지될 수 있다. 예를 들면, 메틸셀룰로오스는 즉시 경제적으로 이용가능하고, 작업하기가 쉽다. 다른 적합한 증점제는, 예를 들면, 잔탄 검, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 카르보머 등을 포함한다. 상기 증점제의 농도는 선택되는 제제에 의존할 수 있다. 중요한 점은 선택된 점도를 달성하게 되는 양을 사용하는 것이다. 명백하게, 적합한 담체 및 다른 첨가제의 선택은 정확한 투여 경로 및 특정 제형, 예컨대 액체 제형의 본성(예컨대, 상기 제형이 용액, 현탁액, 겔 또는 시간 방출 형태 또는 액체-충진 형태와 같은 다른 액체 형태로 제형화되어야 하는지 여부)에 의존할 것이다.
투여되는 세포의 함량은 치료되는 대상체에 따라 다양할 것이다. 소정 구현예에서, 약 104 내지 약 1010, 약 105 내지 약 109, 약 104 내지 약 106, 약 105 내지 약 106, 약 105 내지 약 107, 또는 약 106 내지 약 108의 본 개시된 면역반응성 세포가 인간 대상체에 투여된다. 보다 효과적인 세포는 훨씬 적은 수로 투여될 수 있다. 소정 구현예에서, 적어도 약 1×105, 적어도 약 1×106, 적어도 약 1×107, 1×108, 적어도 약 2×108, 적어도 약 3×108, 적어도 약 4×108, 또는 적어도 약 5×108의 본 개시된 면역반응성 세포가 인간 대상체에 투여된다. 소정 구현예에서, 약 1×107 및 5×108의 본 개시된 면역반응성 세포가 인간 대상체에 투여된다. 무엇이 효과적인 용량으로 간주되어야 하는가에 대한 정확한 결정은 그 크기, 연령, 성별, 중량, 및 특정 대상체의 상태를 포함하는 각각의 대상체에 대한 개별적인 인자들에 기반할 수 있다. 복용량은 즉시 본 발명의 설명 및 본 기술분야의 지식으로부터 본 기술분야의 기술자에 의해 파악될 수 있다. 소정 구현예에서, 약 1×105의 본 개시된 세포가 대상체에 투여된다.
숙련된 기술자는 상기 방법에서 투여되어야 하는 조성물 내의 세포 및 선택적인 첨가제, 비히클 및/또는 담체의 양을 즉시 결정할 수 있다. 전형적으로, (활성 세포(들) 및/또는 제제(들) 이외의) 임의의 첨가제는 포스페이트 완충 식염수 내에서 0.001 내지 50%(중량) 용액의 양으로 존재하고, 상기 활성 성분은 약 0.0001 내지 약 5 wt%, 약 0.0001 내지 약 1 wt%, 약 0.0001 내지 약 0.05 wt% 또는 약 0.001 내지 약 20 wt%, 약 0.01 내지 약 10 wt%, 또는 약 0.05 내지 약 5 wt%와 같이 대략 마이크로그램 내지 밀리그램으로 존재한다. 동물 또는 인간에게 투여되는 임의의 조성물의 경우, 적합한 동물 모델, 예컨대 마우스와 같은 설치류에서 치사 용량(LD) 및 LD50을 결정하는 것과 같은 독성; 및 적합한 반응을 일으키는 상기 조성물(들)의 복용량, 그 내부의 성분들의 농도 및 상기 조성물(들)의 투여 시간이 결정될 수 있다. 이러한 결정은 숙련된 기술자의 지식, 본 발명의 설명 및 본 명세서에 인용된 문헌들로부터 과도한 실험을 필요로 하지 않는다. 그리고, 연속적인 투여를 위한 시간은 과도한 실험없이 파악될 수 있다.
5.8. 치료 방법
본 개시된 주제의 면역반응성 세포 및 이를 포함하는 조성물은 신생물, 병원체 감염, 감염성 질환, 염증성 질환, 또는 이식 거부의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 이러한 면역반응성 세포는 고형 종양(예컨대 중피종, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 결장암, 흉막 종양, 교모세포종, 식도암, 위의 암, 활막 육종, 흉선 암종, 자궁내막 암종, 위암, 및/또는 담관암종)의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체(예컨대, 인간 대상체)에게 투여될 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 T 세포이다. 상기 T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포일 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 T 세포는 CD4+ T 세포이다.
본 개시된 주제는 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도 및/또는 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 본 개시된 면역반응성 세포 및 이를 포함하는 조성물은 대상체에서 신생물을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 본 개시된 면역반응성 세포 및 이를 포함하는 조성물은 신생물을 앓고 있는 대상체의 생존을 연장하기 위해 사용될 수 있다. 본 개시된 면역반응성 세포 및 이를 포함하는 조성물은 또한 대상체, 예컨대 면역손상된 인간 대상체에서 병원체 감염 또는 다른 감염성 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 기존의 증상의 완화 또는 재발의 방지와 같은 원하는 효과를 달성하기 위한 유효량의 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물(예컨대, 약학적 조성물)을 투여하는 단계를 포함한다. 치료의 경우, 투여되는 양은 원하는 효과를 생성하기에 효과적인 양이다. 유효량은 1회 또는 일련의 투여로 제공될 수 있다. 유효량은 볼루스(boulus)로, 또는 연속적 관류에 의해 제공될 수 있다.
"유효량"(또는, "치료적 유효량")은 치료시 유익하거나 원하는 임상적 결과를 발생시키기에 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 치료의 측면에서, 유효량은 질환의 진행을 완화, 개선, 안정화, 되돌림 또는 늦추거나, 달리 질환의 병리학적 결과를 감소시키기에 충분한 양이다. 상기 유효량은 일반적으로 사례별 기준으로 내과의사에 의해 결정되며, 본 기술분야의 기술자의 범위 이내이다. 유효량을 달성하기 위한 적절한 복용량을 결정할 때 몇 가지 인자가 전형적으로 고려된다. 상기 인자는 대상체의 연령, 성별 및 중량, 치료되는 상태, 상기 상태의 증세 및 투여되는 면역반응성 세포의 형태 및 효과적인 농도를 포함한다.
항원-특이적 T 세포을 이용한 입양적 면역치료법의 경우, 약 106 내지 약 1010(예컨대, 약 109) 범위의 세포 용량이 전형적으로 주입된다. 그러나, 본 개시된 폴리펩티드 조성물의 높은 효율로 인하여, 원하는 효과를 달성하기 위해 더 적은 양의 본 개시된 세포가 요구된다. 예를 들면, 원하는 효과를 달성하기 위해 약 1 × 105의 본 개시된 세포가 충분하다.
상기 면역반응성 세포를 대상체 내로 투여하고 이어서 분화할 때에, 상기 면역반응성 세포는 한 특이적 항원(예컨대, 인간 메소텔린)에 대해 구체적으로 지향되어 유도된다. T 세포의 "유도"는, 예컨대 결실 또는 아네르기(anergy)에 의한항원-특이적 T 세포의 불활성화를 포함할 수 있다. 불활성화는 특히 예컨대 자가면역 질병에서의 내성을 확립 또는 재확립하는데 유용하다. 본 개시된 주제의 면역반응성 세포는 흉막 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 결절내(intranodal) 투여, 종양내 투여, 척추강내 투여, 흉막내 투여, 복강내 투여, 및 흉선으로의 직접 투여를 비제한적으로 포함하는 본 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포 및/또는 이를 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 흉막으로 투여된다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포 및/또는 이를 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 흉막내로 투여된다.
본 개시된 주제는 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)를 이용하는 다양한 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 개시된 주제는 대상체에서 종양 부하를 감소시키는 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, 종양 부하를 감소시키는 방법은 유효량의 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시된 면역반응성 세포는 대상체에서 종양 세포의 수를 감소시키고, 종양 크기를 감소시키고, 및/또는 종양을 근절할 수 있다. 상기 종양은 고형 종양일 수 있다. 고형 종양의 비제한적 예는 중피종, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 결장암, 흉막 종양, 교모세포종, 식도암, 위의 암, 활막 육종, 흉선 암종, 자궁내막 암종, 위암, 및 담관암종을 포함한다.
본 개시된 주제는 또한 신생물을 갖는 대상체의 생존을 증가시키거나 늘리는 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, 신생물을 갖는 대상체의 생존을 증가시키거나 늘리는 방법은 유효량의 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 대상체에서 종양 부하를 감소시키거나 근절할 수 있다. 부가적으로, 본 개시된 주제는 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 면역 반응을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 본 개시된 주제는 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 신생물을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 추가로 제공한다.
소정 구현예에서, 상기 신생물은 고형 종양이다. 상기 신생물은 원발성 종양 또는 원발성 암일 수 있다. 또한, 상기 신생물은 전이 상태일 수 있다.
본 개시된 주제의 면역반응성 세포를 이용하여 그 성장이 억제될 수 있는 암은 전형적으로 면역치료법에 반응성인 암을 포함한다. 치료용 암의 비제한적 예는 중피종, 폐암(예컨대, 비-소세포 폐암), 췌장암, 난소암, 유방암(예컨대, 전이성 유방암, 전이성 3중-음성 유방암), 결장암, 흉막 종양, 교모세포종, 식도암, 위의 암, 활막 육종, 흉선 암종, 자궁내막 암종, 위암, 담관암종, 자궁경부암, 및 침샘암을 포함한다. 부가적으로, 본 개시된 주제는 그 성장이 본 개시된 주제의 면역반응성 세포를 이용해 억제될 수 있는 난치성 또는 재발성 악성물을 포함한다.
본 개시된 주제의 방법을 이용해 치료될 수 있는 다른 신생물 또는 암의 예는 뼈암, 장암, 간암, 피부암, 두경부암, 흑색종(피부 또는 안구내 악성 흑색종), 신장암(예컨대, 투명 세포 암종), 인후암, 전립선 암(예컨대, 호르몬 난치성 전립선 선암종), 혈액암(예컨대, 백혈병, 림프종, 및 골수종), 자궁암, 직장암, 항문 영역의 암, 방광암, 뇌암, 위암, 고환암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 백혈병(예컨대, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수아구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수단핵구성 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 급성 적백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병), 진성 다혈구증, 림프종(호지킨 질환, 비-호지킨 질환), 소장의 암, 내분비 시스템의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 어린이의 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신우의 암종, 중추신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관형성, 척추 축 종양, 뇌간 교종, 뇌하수체 선종, 카포시(Kaposi) 육종, 표피모양 암, 편평 세포 암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유도되는 것을 포함하는 환경 유도성 암을 포함하고, 발덴스트롬(Waldenstrom) 마크로글루불린혈증, 중쇄 질환, 및 육종 및 암종(예컨대, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉(Ewing) 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 간종양, 담관 암종, 융모암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 침샘암, 자궁암, 고환암, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 신경초종, 뇌수막종, 흑색종, 신경모세포종, 및 망막모세포종)과 같은 고형 종양을 포함한다.
부가적으로, 본 개시된 주제는 대상체에서 암 세포 또는 병원체에 대한 반응으로 면역-활성화 사이토카인 생산을 증가시키는 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 방법은 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 면역-활성화 사이토카인은 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-3, IL-6, IL-11, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, 인터페론 조절 인자 7(IRF7), 및 이들의 조합일 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 GM-CSF, IFN-γ, 및/또는 TNF-α의 생산을 증가시킨다.
본 개시된 주제는 고형 종양(예컨대, 중피종, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 결장암, 흉막 종양, 교모세포종, 식도암, 위의 암, 활막 육종, 흉선 암종, 자궁내막 암종, 위암, 및 담관암종)의 치료에 특히 유용한 치료법을 제공한다. 고형 종양은 원발성 종양 또는 전이 상태인 종양일 수 있다. 어떤 고형 종양은 이질성 MSLN을 발현하는 종양, 예컨대 유방암(예컨대, TNBC), 폐암, 난소암, 췌장암, 식도암, 결장암, 위의 암, 및 악성 흉막 중피종(MPM)이다. 이질성 MSLN을 발현하는 세포(예컨대, 종양 세포)는 낮은 MSLN-발현 세포 및 높은 MSLN-발현 세포를 포함하는 세포의 개체군이다. 본 개시된 면역반응성 세포는 높은 MSLN-발현 세포의 존재시에 낮은 MSLN-발현 세포(예컨대, 약 2,000개 이하, 약 1,000개 이하, 약 900개 이하, 약 800개 이하, 약 700개 이하, 약 600개 이하, 약 500개 이하, 약 400개 이하, 약 300개 이하, 약 200개 이하, 또는 약 100개 이하의 MSLN 결합 부위/세포)에 대해 증가된 세포독성 및 항-종양 활성을 나타낼 수 있다. 소정 구현예에서, 높은 MSLN-발현 세포의 존재시에도, 면역반응성 세포는 MSLN-음성 세포에 대해 증가된 세포독성 또는 비특이적 살상을 나타내지 않는다. 따라서, 상기 면역반응성 세포는 높은 MSLN-발현 세포의 존재시에 낮은 MSLN-발현 세포에 대한 증가된 세포독성 및 항-종양 활성을 나타내지만 MSLN-음성 세포에 대한 안전성을 유지할 수 있다.
아울러, 본 개시된 주제는 병원체 감염(예컨대, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염, 또는 원생동물 감염)을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 본 개시된 주제는 면역손상된 대상체에서 면역 반응을 향상시키기에 특히 유용하다. 본 발명의 방법을 이용한 치료에 감수성인 예시적인 바이러스 감염은 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스테인 바 바이러스(EBV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 인플루엔자 바이러스 감염을 비제한적으로 포함한다. 따라서, 본 개시된 주제는 대상체에서 병원체 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시된 주제에 따라, 전술한 다양한 방법은 적어도 하나의 면역조절제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 면역조절제의 비제한적 예는 면역자극제, 체크포인트 면역 차단제, 방사선 치료법 제제, 및 화학치료법 제제를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 면역조절제는 면역자극제이다. 면역자극제의 비제한적 예는 IL-12, 및 작용성 공-자극성 단일클론 항체를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 면역자극제는 IL-12이다. 소정 구현예에서, 본 개시된 면역반응성 세포 또는 항-IL-12 항체와 조합하여 이를 포함하는 조성물은 유방암(BC), 예컨대 전이성 3중-음성 유방암(TNBC)을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 비 작용성 공-자극성 단일클론 항체의 비제한적 예는 항-4-1BB 항체, 항-OX40 항체, 및 항-ICOS 항체를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 작용성 공-자극성 단일클론 항체는 항-4-1BB 항체이다.
소정 구현예에서, 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물은 종양-표적화 입양적 T-세포 치료법을 나타낼 수 있을 뿐만 아니라, 개선된 항원 수용체의 디자인을 통해, 및 IL-12를 이용한 면역조절에 의한 숙주 미세환경에서의 개입을 통해 T 세포 기능을 향상시킬 수 있다. 모든 면역치료 접근법 중에서, 다기능성 사이토카인인 IL-12는 BC를 치료하기 위한 가장 유망한 접근법 중 하나로 간주되어 왔다(Boggio, K., et al., Cancer Res 60, 359-364 (2000); Czerniecki, B.J., et al., Cancer Res 67, 1842-1852 (2007); Nanni, P., et al., J Exp Med 194, 1195-1205 (2001)). IL-12는 항-종양 반응에 관련되는 핵심적인 경로인 적응성 타입 1 세포-매개성 면역력의 마스터 조절자로 간주된다(Del Vecchio, M., et al., Clin Cancer Res 13, 4677-4685 (2007)). IL-12는 다양한 레벨로 항-종양 반응을 조정하며, including Th1 표현형을 향한 CD4 T 세포의 극성화(Wesa, et al., J Immunother 30, 75-82 (2007)), T 세포 및 NK 이펙터 기능의 부스팅(boosting)(Curtsinger et al., J Exp Med 197, 1141-1151 (2003)), 선천성 면역 반응의 리모델링(Chmielewski et al., Cancer Res 71, 5697-5706 (2011)), 및 종양 혈관형성의 조절(Voest et al., J Natl Cancer Inst 87, 581-586 (1995))을 포함한다. IL-12의 면역조절 및 혈관형성 기능은 암, 예컨대 BC(예컨대, TNBC)를 치료하기 위하여 본 개시된 주제의 면역반응성 세포와 조합하여 상기 사이토카인을 이용하기 위한 근거를 제공하였다. 암을 갖는 환자에게 IL-12를 투여하는 것으로 포함하는 148 건의 임상 시험(이 중 36 건은 최근에 발표되었음) 중에서, 복강내(Lenzi et al. Clin. Cancer Res. 8, 3686-3695 (2002)) 또는 피하(Mahvi et al. Cancer Gene Ther. 14, 717-723 (2007); Kang et al. Hum. Gene Ther. 12, 671-684 (2001))에서의 II상 연구가 성공적이었다. IL-12는 유전자 전달에 의해 생성된 IL-12의 주변분비성(paracrine) 분비가 국소적으로 및 원거리 위치에서 종양에 대한 면역력을 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 몇가지 연구가 유방암(BC)의 전임상 모델에서 IL-12의 항암 유효성을 문서화하였으나(Boggio et al. Cancer Res 60, 359-364 (2000); Nanni et al. J Exp Med 194, 1195-1205 (2001)), 진행된 암에서의 몇 가지 임상 시험에서 관찰된 재조합 인간 IL-12의 투여로 인한 현저한 독성은 그 임상적 사용을 불가능하게 한다. 상기 제한을 극복하기 위하여, 다수의 그룹은 아데노바이러스 벡터를 이용해 IL-12를 종양내 운반하면 BC의 전임상 모델에서 종양 축소 및 및 T 세포 활성화를 유도함을 입증하였다(Gyorffy et al. J Immunol 166, 6212-6217 (2001); Bramson et al. Hum Gene Ther 7, 1995-2002 (1996)). 보다 최근에는, 사벨(Sabel) 등은 종양 내로 IL-12를 방출하기 위해 폴리락트산 마이크로스피어(microsphere)를 사용하였고, 항-종양 반응이 주로 NK 세포에 의해 매개됨을 확인하였다(Sabel et al. Breast Cancer Res Treat 122, 325-336 (2010)). 다른 연구자들은 마우스 BC로 IL-12를 국소적으로 운반하기 위해 중간엽 기질 세포를 이용하였다(Eliopoulos et al. Cancer Res 68, 4810-4818 (2008)). HER2/neu-발현 악성물을 갖는 환자에서 IL-12와 조합한 파클리탁셀 및 트라스투주맙의 I상 시험은 NK-세포 사이토카인 분비의 자극에 대한 IL-12 및 트라스투주맙 사이의 인상적인 상승작용을 보여주었다(Bekaii-Saab et al. Molecular cancer therapeutics 8, 2983-2991 (2009)). 따라서, IL-12는 항암제로서 상당한 가능성을 가질 수 있고, 입양적 T 세포 치료 접근법에서 공-자극제로서 이를 사용하는 것은 매우 정당하다.
소정 구현예에서, 상기 면역조절제는 체크포인트 면역 차단제이다. 체크포인트 면역 차단제의 비제한적 예는 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-LAG3 항체, 항-B7-H3 항체, 및 항-TIM3 항체를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 체크포인트 면역 차단제는 항-PD-L1 항체이다. 소정 구현예에서, 본 개시된 주제의 면역반응성 세포 또는 항-PD-L1 항체와 조합하여 이를 포함하는 조성물은 유방암(BC), 예컨대 TNBC를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
프로그램화 세포 죽음 리간드 1(PD-L1/B7-H4/CD274)은 전형적으로 활발한 염증 조직에서 발현되는 억제성 신호이며, T 세포 활성화를 제환하기 위한 음성 피드백 루프로 작용한다. 전형적으로 (유방(Dong et al. Nature medicine 8, 793-800 (2002))을 포함하는) 염증이 없는 정상 조직에서는 PD-L1 발현이 없으며, 대신에 암 조직, 특히 염증성 침입물을 갖는 경우에 가장 우세하다(Spranger et al. Science translational medicine 5, 200ra116 (2013)). 염증과의 이러한 연관성은 T 세포 활성화시에 생성된 T 세포-분비 사이토카인에 대한 종양 세포 노출시에 PD-L1의 상향조절로 인한 것일 수 있다. 상기 발현 패턴은 BC에 의해 나타나며, 50%-75%의 BC 검체가 PD-L1에 대해 양성으로 염색되고, 그 발현은 심각한 림프구성 침입물과 강하게 연관된다(Brown et al. Journal of immunology 170, 1257-1266 (2003); Ghebeh et al. Neoplasia 8, 190-198 (2006); Ghebeh et al. BMC cancer 8, 57 (2008)). BC-침입 T 세포는 또한 54%의 환자에서 PD-L1을 발현하였다(Ghebeh et al. BMC cancer 8, 57 (2008)). BC는 또한 암발생 신호전달에 부차적으로 PD-L1을 선천적으로 발현할 수 있다. PI(3)K 경로의 활성화는 BC 세포에서 PD-L1 단백질의 상향조절로 귀결되고, 환자 종양에서 PI(3)K 활성화는 PD-L1 발현과 현저하게 연관된다(Crane et al. Oncogene 28, 306-312 (2009)). 활성화된 T 세포에 의한 PD-1의 발현은 면역억제성 TME 내에서 리간드와 수용체 발현을 시공간적으로 연결한다. BC 조직에서 PD-L1의 발현은 상기 환자에 대한 면역치료 표적으로서 이를 제시한다. (유방(Ge et al. Cancer letters 336, 253-259 (2013))을 포함하는) 다중 전임상 암 모델에서 PD-L1/PD-1 차단의 효능은 진행된 암을 갖는 환자에 대해 PD-L1- 또는 PD-1-표적화 항체를 이용한 I상 시험에 대한 길을 닦았다. (PD-1 항체를 이용한) I상 연구는 PD-L1+ 환자에서만 효능을 입증하였다(Topalian et al. The New England journal of medicine 366, 2443-2454 (2012)). 유전자적으로 조작된 T 세포는 공-억제성 체크포인트 및 TME 내에서 발견되는 전형적인 공-자극의 부재를 극복하기 위한 특유의 이점을 제공한다. CAR-발현 T 세포는 사실 T 세포 확장, 생존, 및 기능을 뒷받침하기 위하여 그 공-자극성 필요사항을 최적화하기 위해 조작된다.
일부 구현예에서, 상기 면역조절제는 방사선 치료법 제제이다. 국소화된 방사선-유도 면역학적 환경은 종양에서 표적화 T 세포의 생착을 향상시키기 위한 사전조건을 제공할 수 있을 뿐만 아니라(이로 인해 전신 림프고갈(lymphodepleting) 요법에 대한 필요성을 제거하고), 방사선 치료법 및 입양적 T 세포 치료법의 조합으로부터 생기는 면역학적 반응은 압스코팔(abscopal) 항-종양 효능을 향상시킨다. 방사선-저항성 종양에서, CAR T 세포에서의 4-1BB 공-자극성 신호전달은 면역억제를 극복할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 면역조절제는 시스플라틴을 비제한적으로 포함하는 화학치료법 제제이다. 케모카인 및 사이토카인의 시스플라틴-유도 분비는 MSLN-표적화 및 내인성 T-세포 반응을 촉진할 수 있다.
연구는 높은 레벨의 세포독성 종양 침입 림프구(cTIL) 및 낮은 레벨의 조절성 T 세포(Treg)가 함께 존재하는 폐 선암종(LAC) 및 악성 흉막 중피종(MPM)을 갖는 환자는 더 나은 예후 및 더 긴 진행-부재 생존을 갖는 것을 보여주었다(Servais, et al., Clin Cancer Res (May 1, 2012);18:2478-2489; Kachala et al., Clin Cancer Res (2013);20(4); 1020-8). MSLN-표적화 CAR을 이용한 입양적 T-세포 치료법은 LAC 및 MPM에서cTIL을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 세르바이스(Servais)(2012) 및 카찰라(Kachala)(2013)는 MSLN이 LAC 및 MPM에서 과발현되고 침해력을 촉진함을 발표한다 - 이는 CAR T-세포 치료법을 위한 표적으로서 MSLN을 선택하는 것을 정당화한다. 시스플라틴 및 방사선 치료법 이후에 TIL의 비율이 더 높은 것은 마우스 모델 및 환자 모두에서 개선된 결과와 연관된다.
종양 방사선- 및 시스플라틴 치료법-유도된 종양 및 압스코팔 면역조절은 입양적으로 전달된 T 세포의 더 나은 생착을 위해 필요한 사전조건을 제공할 수 있다; 종양 및 기질 면역조절을 이용하는 T-세포 공-자극성 전략은 내인성 및 입양적으로 전달된 T 세포 모두의 항-종양 효능을 강화할 수 있다.
부가적으로, 예컨대 대상체에서 암을 치료하거나 대상체에서 종양 부하를 감소시키기 위하여 메소텔린-특이적 CAR을 발현하는 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)를 이용하는 전술한 다양한 방법은 암 세포 항원 조절과 조합될 수 있다. 메소텔린-특이적 CAR을 발현하는 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)는 종양 또는 암성 세포의 막에 발현되는 MSLN("세포막 MSLN"으로 나타냄)을 표적화 및 살상할 수 있지만, 세포질 MSLN은 그럴 수 없다. 어떤 종양 또는 암(예컨대, 폐암, 및 중피종)은 낮은 세포막 MSLN과 높은 세포질 MSLN을 갖는다. 암 세포 항원 조절은 종양 또는 암성 세포에서 세포막 MSLN의 발현을 증가시킬 수 있고, 이것은 상기 종양 또는 암성 세포를 CAR-발현 면역반응성 세포에 의해 보다 더 표적화되게 하고, 따라서 면역반응성 세포에 의한 살상에 대해 보다 감수성이 되게 할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 암 세포 항원 조절은 방사선이다.
추가적인 변형이 상기 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)에 도입되어 면역학적 합병증("악성 T-세포 형질전환"으로 알려짐), 예컨대 이식편대숙주 질환(GvHD)의 위험성을 방지 또는 최소화할 수 있거나, 건강한 조직이 종양 세포와 동일한 표적 항원을 발현할 때, GvHD와 유사한 결과를 유도할 수 있다. 이러한 문제점에 대한 잠재적인 해결법은 CAR-발현 T 세포 내로 자살 유전자를 조작하는 것이다. 적합한 자살 유전자는 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제(hsv-tk), 유도가능한 카스파아제(Caspase) 9 자살 유전자(iCasp-9), 및 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체(EGFRt) 폴리펩티드를 비제한적으로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 자살 유전자는 EGFRt 폴리펩티드이다. 상기 EGFRt 폴리펩티드는 항-EGFR 단일클론 항체(예컨대, 세툭시맙)을 투여함으로써 T 세포 제거를 할 수 있다. EGFRt는 메소텔린-표적화 CAR의 세포내 신호전달 도메인의 3' 말단에 공유적으로 연결될 수 있다. 상기 자살 유전자는 본 개시된 메소텔린-특이적 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 방식에서, 악성 T-세포 형질전환(예컨대, GVHD) 동안에 자살 유전자를 활성화시키기 위해 디자인된 전구약물(예컨대, 전구약물(예컨대, iCasp-9을 활성화시킬 수 있는 AP1903))을 투여하면 자살 유전자-활성화 CAR-발현 T 세포에서 아폽토시스를 촉발한다.
또한, 본 개시된 주제는 대상체에서 염증성 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 방법은 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 면역억제성 세포이다. 소정 구현예에서, 상기 면역억제성 세포는 조절성 T 세포이다. 소정 구현예에서, 상기 염증성 질환은 췌장염이다. 소정 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다. 소정 구현예에서, 상기 대상체는 기관 이식의 수용자, 예컨대 췌장 이식의 수용자이다.
아울러, 본 개시된 주제는 기관 이식의 수용자인 대상체에서 이식 거부를 방지하는 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 방법은 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 면역억제성 세포이다. 소정 구현예에서, 상기 면역억제성 세포는 조절성 T 세포이다. 소정 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다. 추가 구현예에서, 상기 대상체는 췌장 이식의 수용자이다.
본 개시된 메소텔린-표적화 CAR은 면역억제성 세포, 예컨대 조절성 T 세포 내로 형질도입될 수 있다. 형질도입된 면역억제성 세포는 염증성 증상 또는 염증성 질환을 갖는 대상체(예컨대, 인간)에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 염증 부위 또는 염증성 질환의 부위는 높은 발현 레벨의 메소텔린을 갖고, 이것은 본 개시된 MSLN-CAR에 의해 인식된다. 상기 염증성 증상은 중증 췌장염과 같이 극심할 수 있다. 또한, 형질도입된 면역억제성 세포는 기관 이식의 수용자인 대상체에게 투여될 수 있다.
부가적으로, 본 개시된 메소텔린-표적화 CAR 뿐만 아니라 MHC 항원을 표적화하는 제2 CAR이 면역억제성 세포(예컨대, 조절성 T 세포) 내로 동시-형질도입될 수 있고, 이로 인해 상기 면역억제성 세포는 이식된 췌장 부위에 수집될 수 있다. 소정 구현예에서, MHC 클래스 I 대상체는 MHC 클래스 II 공여자로부터 췌장 이식을 받는다; 수용자의 조절성 T 세포는 본 개시된 MSLN-특이적 CAR 및 MHC 클래스 II 항원을 표적화하는 제2 CAR로 형질도입되고, 따라서 수용자의 형질도입된 조절성 T 세포가 이식된 췌장 부위에서 수집/모이고 이식 또는 기관 거부를 피한다.
치료법을 위한 적합한 인간 대상체는 전형적으로 임상적 기준에 의해 구별될 수 있는 2가지 치료 그룹을 포함한다. "진행된 질환" 또는 "높은 종양 부하"를 갖는 대상체는 임상적으로 측정가능한 종양을 갖는 대상체이다. 임상적으로 측정가능한 종양은 종양 질량을 기초로 검출할 수 있는 종양이다(예컨대, 촉진, CAT 스캔, 소노그램, 맘모그램 또는 X-선에 의함; 그 자신에 대한 양성 생화학적 또는 조직병리학적 마커는 본 개체군을 확인하는데 불충분함). 약학적 조성물은 그 증상을 완화시킬 목적으로 항-종양 반응을 일으키기 위해 상기 대상체에 투여된다. 이상적으로, 종양 질량의 감소는 결과로서 일어나지만, 임의의 임상적 개선은 이점을 구성한다. 임상적 개선은 진행의 위험성 또는 속도의 감소 또는 상기 종양의 병리학적 결과에서의 감소를 포함한다.
적합한 대상체의 두 번째 그룹은 "어주번트 그룹"으로 본 기술분야에 알려져 있다. 이들은 신생물의 이력을 갖고 있지만 다른 방식의 치료법에 반응성인 개체이다. 상기 이전의 치료법은 외과적 절제, 방사선치료법, 및 전통적인 화학치료법을 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 그 결과, 상기 개체는 임상적으로 측정가능한 종양을 갖지 않는다. 그러나, 이들은 본래의 종양 부위 근처에 또는 전이에 의해 상기 질환이 진행할 위험성이 있는 것으로 의심된다. 상기 그룹은 추가로 고-위험성 및 저-위험성 개체로 세분될 수 있다. 상기 세분은 초기 치료 전후에 관찰되는 특성에 기반하여 행해진다. 상기 특성은 임상 기술분야에 알려져 있으며, 각각의 상이한 신생물에 대해 적합하게 정의된다. 고-위험성 서브그룹의 전형적인 특성은 상기 종양이 이웃하는 조직을 침입하거나, 림프절이 관여됨을 보여주는 것들이다.
다른 그룹은 신생물에 대한 유전적 성향을 갖고 있지만, 신생물의 임상적 조짐에 대한 증거가 아직 없다. 예를 들면, 유방암과 연관된 유전자 돌연변이에 대해 양성으로 테스트되고 아직 가임기인 여성은 예방적 수술을 수행하기에 적합할 때까지 신생물의 발생을 방지하기 위한 예방적 치료로서 본 명세서에 개시된 하나 이상의 면역반응성 세포를 받기 원할 수 있다.
항-메소텔린 CAR 및 면역반응성 세포의 항-종양 효과를 향상시키는 PD-1 DN의 표면 발현의 결과로서, 입양적으로 전달된 T 또는 NK 세포는 종양 부위에서 증대되고 선별적인 세포용해 활성이 부여된다. 아울러, 종양 또는 바이러스 감염에 대한 국소화 및 그의 증식에 이어서, T 세포는 종양 또는 바이러스 감염 부위를 생리학적 항-종양 또는 항-바이러스 반응과 관련되는 넓은 범위의 면역 세포(종양 침입 림프구, NK-, NKT-세포, 수지상 세포, 및 대식세포)를 위한 매우 유리한 환경으로 바꾼다.
부가적으로, 본 개시된 주제는 대상체, 예컨대 면역손상된 대상체에서 병원체 감염(예컨대, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염, 또는 원생동물 감염)을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효량의 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 병원체 감염을 갖는 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 치료에 감수성인 예시적인 바이러스 감염은 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스테인 바 바이러스(EBV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 인플루엔자 바이러스 감염을 비제한적으로 포함한다.
추가적인 변형이 본 개시된 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)에 도입되어 면역학적 합병증("악성 T-세포 형질전환"으로 알려짐), 예컨대 이식편대숙주질환(GvHD)의 위험성을 피하거나 최소화할 수 있거나, 건강한 조직이 종양 세포와 동일한 표적 항원을 발현할 때, GvHD와 유사한 결과를 유도할 수 있다. 이러한 문제에 대한 잠재적인 해결책은 자살 유전자를 본 개시된 면역반응성 세포 내로 조작하는 것이다. 적합한 자살 유전자는 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제(hsv-tk), 유도가능한 카스파아제 9 자살 유전자(iCasp-9), 및 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체(EGFRt) 폴리펩티드를 비제한적으로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 자살 유전자는 EGFRt 폴리펩티드이다. 상기 EGFRt 폴리펩티드는 항-EGFR 단일클론 항체(예컨대, 세툭시맙)를 투여함으로써 T 세포를 제거할 수 있다. EGFRt는 본 개시된 CAR의 항원-인식 수용체의 상류에 공유적으로 연결될 수 있다. 상기 자살 유전자는 본 개시된 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터 내에 포함될 수 있다. 이러한 방식으로, 악성 T-세포 형질전환(예컨대, GVHD) 동안에 상기 자살 유전자를 활성화시키도록 디자인된 전구약물(예컨대, 전구약물(예컨대, iCasp-9를 활성화시킬 수 있는 AP1903))을 투여하면 상기 자살 유전자-활성화된 CAR-발현 T 세포에서 아폽토시스를 촉발한다. 본 개시된 CAR 내로 자살 유전자를 통합시키면 매우 짧은 기간 내에 대부분의 CAR T 세포를 제거할 수 있는 능력을 가져서 추가된 레벨의 안정성을 제공한다. 자살 유전자와 함께 통합되는 본 개시된 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)는 CAR T 세포 주입 후 해당 시점에서 선제적으로 제거되거나, 가장 빠른 독성의 조짐시에 근절될 수 있다.
5.9. 키트
본 개시된 주제는 대상체에서 면역 반응을 유도 및/또는 향상시키거나, 및/또는 신생물 또는 병원체 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 키트를 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 키트는 유효량의 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 키트는 멸균 용기를 포함한다; 이러한 용기는 박스, 앰풀, 병, 바이알, 튜브, 가방, 파우치, 블리스터-팩, 또는 본 기술분야에 알려진 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 적층 종이, 금속 포일, 또는 약물을 보유하기에 적합한 다른 재료로 만들어질 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 키트는 발현가능한 형태로 항-메소텔린 CAR을 암호화하는 단리된 핵산 분자 및 PD-1 DN을 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하고, 이들은 선택적으로 동일하거나 상이한 벡터 내에 포함될 수 있다.
원한다면, 상기 면역반응성 세포 및/또는 핵산 분자는 신생물 또는 병원체 또는 면역 질병을 갖고 있거나 발생할 위험성이 있는 대상체에 상기 세포 또는 핵산 분자를 투여하기 위한 설명서와 함께 제공된다. 상기 설명서는 일반적으로 신생물 또는 병원체 감염의 치료 및/또는 예방을 위해 상기 조성물을 이용하기 위한 정보를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 설명서는 다음 중 적어도 하나를 포함한다: 치료제의 처방; 신생물, 병원체 감염, 또는 면역 질병 또는 그의 증상을 치료 또는 예방하기 위한 투여 스케줄 및 투여; 예방법; 주의문; 지시문; 금기문; 과복용 정보; 부작용; 동물 약리학; 임상 연구; 및/또는 참고문헌. 상기 설명서는 상기 용기(존재시) 상에 직접 인쇄되거나, 상기 용기에 적용된 라벨, 또는 상기 용기 내에 또는 이와 함께 공급된 별도의 시트, 팜플렛, 카드, 또는 폴더일 수 있다.
6. 실시예
본 발명의 실행은, 달리 나타내지 않는 한, 숙련된 기술자의 범위 이내인 종래의 분자생물학(재조합 기술을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학 기술을 도입한다. 이러한 기술은 전체적으로 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989)]; ["Oligonucloetide Synthesis" (Gait, 1984)]; ["Animal Cell Culture" (Freshney, 1987)]; ["Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996)]; ["Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987)]; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994)]; ["Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)]와 같은 문헌 내에 설명된다. 상기 기술은 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 제조에 적용가능하며, 이와 같이, 본 개시된 주제의 제조 및 실행에 고려될 수 있다. 특히, 특정 구현예에 대한 유용한 기술은 다음의 섹션에서 논의될 것이다.
다음의 실시예는 본 기술분야의 통상의 기술자에게 본 개시된 세포 및 조성물을 제조 및 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위한 것이며, 본 발명자들이 본 발명으로서 간주하는 것들의 범위를 제한하기 위한 의도는 아니다.
실시예 1
본 개시된 폴리펩티드 조성물을 생성하였다. 상기 폴리펩티드 조성물은 도 1에 나타낸 것과 같이 다음을 포함한다: (ⅰ) 인간 메소텔린에 결합하는 CAR, 및 (ⅱ) 우성 음성 형태의 프로그램화 죽음 1(PD-1 DN). 상기 메소텔린-표적화 CAR은 다음을 포함한다: (a) CD8 신호 펩티드(예컨대, 서열번호 71에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CD8 신호 펩티드), (b) 서열번호 76에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열번호 77에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열번호 78에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 VH; 및 서열번호 79에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열번호 80에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열번호 81에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 VL;을 포함하는 scFv인 세포외 항원-결합 도메인, (c) CD28 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 92(또는 서열번호 90의 아미노산 153 내지 179)에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CD28 폴리펩티드)를 포함하는 막통과 도메인, (d) CD28 힌지/스페이서 영역(예컨대, 서열번호 15(또는 서열번호 90의 아미노산 114 내지 152)에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CD28 폴리펩티드), 및 (e) 서열번호 35에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및 CD28 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 101(또는 서열번호 90의 아미노산 180 내지 220)에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CD28 폴리펩티드)를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역. 상기 PD-1 DN은 서열번호 48의 아미노산 1 내지 20으로 이루어지는 PD-1 신호 펩티드, 서열번호 48의 아미노산 21 내지 165로 이루어지는 PD-1 세포외 도메인, 및 서열번호 86의 아미노산 137 내지 207로 이루어지는 CD8 폴리펩티드를 포함한다. 상기 폴리펩티드 조성물은 또한 도 1에 나타낸 것과 같이 CAR 및 PD-1 DN 사이에 위치하는 서열번호 121에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 P2A 펩티드를 포함한다. 상기 폴리펩티드 조성물은 "M28z1XXPD1DNR"로 나타낸다.
상기 폴리펩티드 구조체에 포함되는 CAR은 서열번호 56에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 상기 폴리펩티드 구조체를 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 123에 나타낸다. 상기 폴리펩티드 조성물을 암호화하는 다른 예시적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 124에 나타낸다.
실시예 2
실시예 1에 기술된 것과 같은 폴리펩티드 조성물의 구조를 갖는 M28z1XX-P2A-PD1DNR의 활성을 연구하였다. 도 2에 나타낸 것과 같이 대안적인 대조군 구조체의 구조를 M28z1XX-P2A-PD1DNR과 비교하였다.
도 3a 내지 도 3d에 나타낸 것과 같이 상기 CAR 구조체를 포함하는 바이러스 벡터를 프로듀서 세포주 RD114에서 생성하였다. RD114 세포를 상이한 희석의 H29 바이러스 상등액(비희석, 1:2, 및 1:4)으로 형질도입하였고, 항-Fab 항체를 이용하는 유세포분석에 의해 CAR 발현에 대해 염색하였다. RD114 엠프티는 음성 대조군으로 기능하였다. 도 4a 내지 도 4e, 도 5a 내지 도 5e, 및 도 6a 내지 도 6f에 나타낸 것과 같이 인간 T 세포를 M28z1XX-P2A-PD1DNR로 성공적으로 형질도입하였다. PHA-활성화 T 세포를 상이한 농도의 RD114 바이러스 상등액으로 형질도입하였고, 유세포분석을 이용하여 항-Fab 염색에 의한 CAR 발현 및 항-PD1 염색에 의한 PD1DNR에 대해 염색하였다. 벡터 사본 수(VCN)가 중앙 형광 강도(MFI)와 연관되는지 여부를 연구하였다. PHA-활성화 T 세포를 상이한 농도의 RD114 바이러스 상등액으로 형질도입하였고, 항-Fab 염색 및 유세포분석법에 의해 CAR 발현에 대해 염색하였다. 형질도입된 T 세포의 게놈 DNA를 단리하였고, 벡터 사본 수를 qPCR을 이용하여 VCN/㎍ DNA로서 결정하였다. 도 7a 내지 도 7c에 나타낸 것과 같이, CAR-양성 세포의 MFI는 모든 3명의 테스트된 공여자에 대해 VCN/㎍ DNA와 연관되었다. 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 형질도입 비는 표 1에 나타나 있다.
Figure pct00001
다음으로, M28z1xx-PD1DNR CAR T 세포의 세포용해 효과를 연구하였다. MSLN 높음 표적 세포(MGM)를 임피던스-기반 분석법을 이용하여 상이한 E:T 비에서 상이한 공여자 유래의 M28z1XX-PD1DNR CAR T 세포와 함께 공-배양하였다. 그 결과는 도 8에 나타나 있다. 도 8에 나타낸 것과 같이, M28z1XX-PD1DNR CAR 형질도입된 T 세포는 모든 3명의 테스트된 상이한 공여자에 대해 효과적인 세포독성이 있음을 입증하였다(데이터는 나타내지 않음).
결론:
M28z1xx-PD1DNR 벡터를 RD114 세포에서 성공적으로 생산하였다. 안정한 프로듀서 세포주를 모든 구조체에 대해 성공적으로 확립하였다. 바이러스 벡터를 적정하여 다중 공여자 T 세포에서 ∼40-60%의 형질도입을 생성하였다. CAR 및 PD1DNR을 발현하도록 CD4 및 CD8 T 세포를 성공적으로 형질도입하였다. 벡터 사본 수 및 형질도입 사이에 상관관계가 관찰되었다.
실시예 3
본 실시예는 M28z1XX-PD1DNR을 포함하는 다양한 구조체의 비교 분석을 기술한다. 임피던스 분석법을 이용하여 세포독성을 측정하였다. 임피던스-기반 세포독성 측정(eCTL)의 원리는 도 9에 나타나 있다. CAR 구조체, 공여자, CAR 표적 및 E:T 비를 포함하는 비교 분석의 파라미터는 도 10에 나타나 있다. 표적 세포주에서의 MSLN 및 PD-L1 발현을 측정하였다. 중피종(MGM, MGM-PDL1 및 MSTOG) 및 폐암(A549GM 및 A549G) 세포주를 유세포분석에 의한 MSLN 및 PD-L1 발현에 대해 평가하였다. 그 결과는 도 11a 내지 도 11e에 나타나 있다. MGM, MGM-PDL1 및 A549GM은 MSLN을 과발현하였다. MGM-PDL1 세포는 부가적으로 PD-L1을 과발현하였다.
형질도입된 T 세포의 CAR 및 PD1 발현을 또한 측정하였다. M28z, M28z1xx, M28z-PD1DNR 또는 M28z1xx-PD1DNR로 형질도입된 인간 T 세포를 유세포분석을 이용하여 항-myc 염색에 의한 CAR 발현 및 항-PD1 염색에 의한 PD1/PD1DNR 발현에 대해 분석하였다. 그 결과는 도 12a 내지 도 12e에 나타나 있다.
MSLN 높음 종양 세포(MGM)에 대하여 M28z, M28z1xx, M28z-PD1DNR 또는 M28z1xx-PD1DNR을 발현하는 CAR T 세포의 항-종양 효능의 비교 분석을 수행하였다. MSLN 높음 표적 세포(MGM)를 다양한 E:T 비에서M28z, M28z1xx, M28z-PD1DNR, M28z1XX-PD1DNR 또는 비-형질도입된 T 세포와 함께 공-배양하였다. 임피던스-기반 분석법을 이용하여 항-종양 효능을 평가하였다. 그 결과는 도 13a 내지 도 13c에 나타나 있다. 또한, 크롬-51로 표지된 MSLN 높음 표적 세포(MGM)를 다양한 E:T 비에서 18시간 동안 M28z, M28z1xx, M28z-PD1DNR, M28z1xx-PD1DNR 또는 비-형질도입된 T 세포와 함께 공-배양하였다. 세포독성을 크롬-51 CTL에 의해 결정하였다. 그 결과는 도 14에 나타나 있다.
다음으로, MSLN 음성 종양 세포(MSTOG)에 대하여 M28z, M28z1xx, M28z-PD1DNR 또는 M28z1xx-PD1DNR을 발현하는 CAR T 세포의 항-종양 효능의 비교 분석을 측정하였다. MSLN 음성 표적 세포(MSTOG)를 표시된 E:T 비에서 M28z, M28z1xx, M28z-PD1DNR, M28z1xx-PD1DNR 또는 비-형질도입된 T 세포와 함께 공-배양하였다. 임피던스-기반 분석법을 이용하여 항-종양 효능을 평가하였다. 그 결과는 도 15a 내지 도 15c에 나타나 있다. 또한, 크롬-51로 표지된 MSLN 음성 표적 세포(MSTOG)를 다양한 E:T 비에서 18시간 동안 M28z, M28z1XX, M28z-PD1DNR, M28z1XX-PD1DNR 또는 비-형질도입된 T 세포와 함께 공-배양하였다. 세포독성을 크롬-51 CTL에 의해 결정하였다. 그 결과는 도 16에 나타나 있다.
아울러, PDL1을 과발현하는 MSLN 높음 종양 세포에 대하여 M28z, M28z1xx, M28z-PD1DNR 또는 M28z1xx-PD1DNR을 발현하는 CAR T 세포의 항-종양 효능의 비교 분석을 측정하였다. PDL1 (MGM-PDL1)을 과발현하는 MSLN 높음 표적 세포를 다양한 E:T에서 M28z, M28z1XX, M28z-PD1DNR, M28z1XX-PD1DNR 또는 비-형질도입된 T 세포와 함께 공-배양하였다. 임피던스-기반 분석법을 이용하여 항-종양 효능을 평가하였다. 그 결과는 도 19a 내지 도 19c에 나타나 있다. 유사하게, MSLN 높음 종양 세포(A549GM)에 대하여 M28z, M28z1xx, M28z-PD1DNR 또는 M28z1xx-PD1DNR을 발현하는 CAR T 세포의 항-종양 효능의 비교 분석을 측정하였고, 그 결과는 도 18a 내지 도 18c에 나타나 있다; 또한, MSLN 낮음 종양 세포(A549G)에 대하여 M28z, M28z1xx, M28z-PD1DNR 또는 M28z1xx-PD1DNR을 발현하는 CAR T 세포의 항-종양 효능의 비교 분석을 측정하였고, 그 결과는 도 19a 내지 도 19c에 나타나 있다.
결론:
M28z1xx-PD1DNR 구조체는 E:T 비-의존적 방식으로 MSLN+ 표적 세포를 살상하였고, 상기 결과는 상이한 암(폐암 및 중피종 세포주)에서 상이한 T 세포 공여자를 이용해 재생산되었다. 표적화된 살상은 MSLN 발현의 레벨과 연관되었고, PD-L1의 발현이 높은 MSLN+ 표적 세포에 대해 효율적이었다.
실시예 4 - 세포-내재적 PD-1 체크포인트 차단을 갖는 임상-등급 메소텔린-표적화 CAR T 세포의 국지적 운반: I상 시험으로의 번역
요약 : 본 실시예는 임상-등급 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 전임상 안전성 및 향상된 항-종양 효능의 증거를 제공한다.
방법 : M28z 또는 M28z1XXPD1DNR CAR을 발현하도록 조작된 인간 T 세포의 세포독성, 증식, 및 사이토카인 분비의 비교를 각각 크롬-방출, 축적, 및 루미넥스 분석법에 의해 평가하였다. 단일 용량(1×105 CAR T 세포; E:T 1:1000)으로 흉막내로 투여된 M28z 또는 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 항-종양 효능을 일련의 생체발광 이미징 및 생존 비교에 의해 동소성 흉막 중피종을 갖는 NSG 마우스에서 조사하였다. 종양 근절 이후, CAR T 세포의 기능의 지속성을 반복된 종양 도전(2×106 내지 11×106 종양 세포의 증가하는 용량)에 의해 테스트하였다.
결과 : 시험관내에서, M28z 및 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 모두 항원-특이적 세포독성, 축적, 및 이펙터 사이토카인 분비를 나타내었다(표 2 참조). 생체내에서, 단일 용량의 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 10회 종양 재도전 시에 단일 용량의 M28z CAR T 세포에 비해 종양 근절, 향상된 생존, 및 종양 재확립에 대한 저항성을 유도하였다(표 2 참조).
결론 : 항-PD1 항체의 사용 없이 CAR T 세포의 안전성, 종양 근절, 및 기능의 지속성에 대한 데이터는 흉막 중피종을 갖는 환자에서 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 흉막내 투여의 임상 I상 시험의 개시를 뒷받침한다.
M28z 및 M28z1XXPD1DNR CAR T-세포 구조체의 비교
M28z M28z1XXPD1DNR
표적 메소텔린 메소텔린
공-자극성 도메인 CD28 CD28
CD3z 돌연변이 없음 2개 ITAM 돌연변이(1XX)
T-세포 내재적 체크포인트 차단(PD1DNR) 없음 있음
시험관내 결과
인간 T-세포 형질도입, 범위 25%-82% 30%-87%
비-형질도입과 비교하여 PD-1 세포외 도메인의 mRNA 발현, 배수 4 157
세포독성, 범위
E:T 10:1 35%-45% 25%-51%
E:T 5:1 28%-44% 20%-38%
E:T 2:1 17%-32% 14%-24%
축적, 범위, 배수 110-390 53-622
이펙터 사이토카인(E:T 1:1, 24시간), 범위
IL-2 18-23 ng/㎖ 9-19 ng/㎖
TNF-α 545-977 pg/㎖ 380-852 pg/㎖
IFN-γ 8-11 ng/㎖ 6-15 ng/㎖
생체내 결과
종양 근절 26일 19일
중앙 생존 56일 도달하지 않음
재도전 이후 생체발광 이미징에 의해 측정된 종양 진행
15일에 걸쳐 재도전 3회 +1 log +0.2 log
52일에 걸쳐 재도전 10회 +1-2 log +0.2 log
현재 상태 임상 II상 시험으로 이행 중 ● 임상-등급 벡터 및 바이러스 상등액 생산
실시예 5 - 세포-내재적 PD-1 차단을 갖는 차세대 CAR T-세포: 임상적 근거, 전임상 및 임상 시험 프로토콜 개발
악성 흉막 중피종(MPM)은 항-PD1 항체에 대해 실망스러운 반응을 갖는 낮은 돌연변이 부하 및 낮은-PDL1 발현 암이다. 진행중인 I/II상 시험(NCT02414269, n=41)에서, 흉막내로 투여된 메소텔린-표적화 키메라 항원 수용체(M28z CAR) T 세포와 후속하는 PD-1 항체의 안전성 및 항-종양 효능은 확립되어 있다. 세포-내재적 항-PD1 전략을 갖는 CAR T 세포는 안전하고, 항-PD1 항체의 반복 투여에 대한 필요 없이 낮은- 및 높은-PDL1 종양 모두에 대한 항-종양 효능을 제공할 수 있다.
요약 : 본 실시예는 임상-등급 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 전임상 안전성 및 향상된 항-종양 효능의 증거를 제공한다.
방법 : 임상-등급 M28z 및 M28z1XXPD1DNR(PD-1 우성 음성 수용체를 갖는 변형된 CD3z 도메인) CAR을 이펙터로서 다중 공여자 T 세포에 형질도입하였고, 낮은- 및 높은-PDL1을 갖는 MPM 세포를 표적으로 사용하였다. 다양한 E:T 비에서, 시험관내 및 생체내 항-종양 효능의 비교를 동소성 MPM을 갖는 마우스에서 평가하였다. 전신 항-종양 면역력을 원거리 부위에서 반복된 종양 도전에 의해 테스트하였다.
결과 : 시험관내에서, M28z 및 M28z1XXPD1DNR CAR(항원-특이적 세포독성, 축적, 및 이펙터 사이토카인 분비) 사이에 현저한 차이점은 나타나지 않았다. 생체내에서, 항-PD1 항체의 반복된 투여 또는 세포-내재적 PD1DNR와 함께 단일 용량(1×105 CAR T 세포)으로 흉막내로 투여된 M28z CAR T 세포는 비교할 만한 종양 근절, 및 중량 증가와 함께 향상된 생존을 유도하였다. 도 20a 및 표 3 참조. 동소성 MPM을 갖는 마우스에서, 단일한 저용량(1×105 CAR T 세포)의 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 흉막 종양을 근절하였고, 임의의 독성 없이 원거리 복강 부위에서 종양 재도전에 저항함으로써 M28z CAR T 세포와 비교하여 향상된 전신 면역력이 있음을 입증하였다(PD1DNR은 마우스 PDL1/2에 결합함). 도 20b 및 도 20c 참조. 수확된 종양은 비-형질도입된 T 세포와 비교하여 더 높고 더 깊은 CAR T 세포의 침입을 입증하였다. 도 20d 참조.
결론: 단일한 저용량으로 흉막내로 투여된 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 실행가능성, 안전성, 종양 근절, 기능의 지속성 및 전신 항-종양 면역력을 입증하였다.
PD-1 DNR CAR T 세포를 이용한 치료법 대 CAR T 세포를 이용한 체크포인트 차단제의 특징 비교
특징 PD-1 DNR CAR T 세포 CAR T 세포를 이용한
체크포인트 차단제
메커니즘 세포 내재적 세포 외부적
잠재적 용량 단일 다중
독성 종양에 국소화 전신
종양 침투에 대한 제한 부정적(unlikely) 항체 침투의 제한
환자 선별 필요하지 않음 종양 PD-L1 높음
항원 반응성 다중 다중
실시예 6
1. 요약
악성 흉막 중피종(MPM)은 석면 노출과 연관되는 드물고 치사적인 악성물이다. MPM은 특징으로서 생명 기관(vital organ) 또는 흉벽 내로의 침입을 갖는 국지적으로 공격적인 흉막의 원발성 악성물이다(Carbone et al., CA Cancer J Clin. 2019;69(5):402-429). 환자의 대부분(60%-70%) 제공시에 국소국지적으로 진행된 질환을 가지며, 절제할 수 없다(Nelson et al., J Clin Oncol. 2017;35(29):3354-3362; Flores et al., J Thorac Oncol. 2007;2(10):957-965). 화학치료법, 공격적인 외과적 절제 및 방사선 치료법과의 조합이 성공적으로 완료될 때라도, 치료된 환자의 중앙 생존은 단지 9-17개월이다(Flores et al., J Thorac Oncol. 2007;2(10):957-965).
2003년 이후로 MPM에 대해 새롭게 FDA 승인된 치료법은 없다(Tsao et al., J Thorac Oncol. 2018;13(11):1655-1667). MPM을 갖는 환자의 제1선 전신 치료를 위한 현재의 표준 치유는 시스플라틴 단독인 경우의 9.3개월과 비교하여 12.1개월인 중앙 총 생존에 기반하여 시스플라틴+페메트렉시드이다(Vogelzang et al., J Clin Oncol. 2003;21(14):2636-2644). MPM을 갖는 환자는 낮은 종양 돌연변이 부하 및 낮은 프로그램화 죽음-리간드 1(PD-L1) 발현을 갖기 때문에, 면역 체크포인트 억제제에 대한 그 반응은 제한적이고, 많은 충족되지 않은 필요사항이 지속된다(Yarchoan et al., JCI Insight. 2019;4(6); Forde et al., Curr Treat Options Oncol. 2019;20(2):18). 제공시에 MPM의 국소화 본성, 잠재적인 접근가능성, 및 상대적인 전이의 부재는 이것이 국지적 표적화 치료법에 대한 적합한 후보가 되게 한다(Nelson et al., J Clin Oncol. 2017;35(29):3354-3362).
본 실시예는 M28z1XXPD1DNR 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 흉막내 용량의 임상적 이용을 뒷받침하기 위해 수행된, 적어도 하나의 화학치료 요법을 받았고 종양을 갖는 것으로 문서화된 MPM으로 (조직학적 또는 세포학적으로 문서화된) 진단을 갖는 환자의 치료를 위한 새로운 약물을 조사하는 비임상 연구를 기술한다.
이것은 시클로포스파미드를 이용한 전처리 이후에 유전자적으로 지향된 자가성 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 안전성, 용량 필욧겅, 및 표적화 효율을 평가하기 위해 디자인된 최대 36명의 참여자를 갖는 단일-기관 I상 연구이다. 본 연구에는 5가지 용량 레벨이 계획되어 있다: 용량-제한 독성은 없다면, 1×106, 3×106, 6×106, 1×107, 및 3×107 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포/㎏. M28z1XXPD1DNR CAR T 세포를 유치(indwelling) 흉막 카테터를 통해 주입한다. 환자를 생검된 종양의 면역조직화학 분석 및/또는 처리 전의 가용성 메소텔린-연관 펩티드의 혈액 레벨에 의해 메소텔린이 발현에 대해 스크리닝한다.
M28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 벡터-생산 마스터 세포 은행, 293VEC-GALV-SFG-M28z1XXPD1DNR으로부터 생성된 감마 레트로바이러스 벡터 스톡 상등액을 이용하여 생체외에서 형질도입된 자가성 T 세포이다. 상기 벡터 내에 암호화되는 CAR의 주된 성분은 다음과 같다:
1) 메소텔린을 발현하는 종양을 표적화하기 위한 인간 항-메소텔린 scFv,
2) T-세포 생존 및 증식의 신호전달을 위한 인간 CD28 공-자극성 도메인,
3) T-세포 활성화를 교정하기 위한 단일 기능 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 갖는 점-돌연변이된 인간 CD3ζ, 및
4) 항원 노출시에 기능장애 또는 고갈의 상태로 들어가는 것으로부터 T 세포를 보호하기 위한 프로그램화 세포 죽음 단백질 1(PD1) 우성 음성 수용체(PD1DNR)(도 21 참조).
메소텔린은 대부분의 MPM, 폐암, 3중-음성 유방암, 췌장암, 및 난소암 및 일부 식도암에서 과발현되는 암 세포-표면 항원이다(Pastan et al., Cancer Res. 2014;74(11):2907-2912; Kachala et al., Clin Cancer Res. 2014;20(4):1020-1028; Tang et al., Anticancer Agents Med Chem. 2013;13(2):276-280; Servais et al., Clin Cancer Res. 2012; Kelly et al., Mol Cancer Ther. 2012;11(3):517-525; Tchou et al., Breast Cancer Res Treat. 2012;133(2):799-804). 본 발명자들은 이미 메소텔린 과발현이 폐 선암종(n=1200)(Kachala et al., Clin Cancer Res. 2014;20(4):1020-1028), MPM(n=250)(Servais et al., Clin Cancer Res. 2012; Kelly et al., Mol Cancer Ther. 2012;11(3):517-525), 및 3중-음성 유방암(n=250)(Tozbikian et al., PLoS One. 2014;9(12):e114900)에서 침해력을 촉진함을 입증하였다. 메소텔린 발현이 정상 조직과 비교하여 종양에서 상대적으로 높은 것에 더하여, 이것은 또한 정상 복막, 흉막, 및 심장막 중피 표면에 매우 낮은 레벨로 발현되어(Villena-Vargas et al., Ann Cardiothorac Surg. 2012;1(4):466-471), 고형-종양 CAR T-세포 치료법을 위한 이상적인 치료법이 되게 한다. 메소텔린의 생물학적 기능은 잘 이해되지 않으며, 연구 중에 있다.
이전에, 메소텔린-표적화 CAR T 세포는 펜실베니아 대학교에서 수행된 임상 연구(NCT01355965)에서 인간에게 정맥내로(3×108 세포/㎡ 또는 4.8×107 세포/용량) 제공되었고, 이때 상기 CAR은 뮤린 scFv를 포함한다. 1명의 환자에서 나타난 과민 반응은 본 연구에서 사용된 CAR 구조체의 인간화 마우스 scFv 부위에 대해 발생한 항-뮤린 항체 반응에 의해 초래된 것으로 발표되었다(Beatty et al., Cancer Immunol Res. 2014). 이와 대조적으로, 본 발명자들의 실험실에 의해 수행된 최근의 I상 연구(NCT02414269)에서, 인간 Fab 라이브러리로부터 유래되는 완전 인간 scFv로 구성되는 메소텔린-표적화 CAR T 세포(최대 6×107 CAR T 세포/㎏까지)를 흉막내로 투여하였다(Feng et al., Mol Cancer Ther. 2009). 지금까지, 40명의 환자가 용량-제한 독성의 관찰없이 치료되었다. 본 연구에서 CAR T-세포 치료법 이후에 최소 3 용량의 펨브롤리주맙(항-PD1)을 받고 부가적으로 3개월의 기간 동안 후속조사된 환자의 코호트(cohort)(n=18)에서 예비적 효능이 관찰되었다. 중요하게는, 상기 코호트에서 83%의 환자는 6개월에 새롭거나 부가적인 치료를 필요로 하지 않았고, 환자의 절반은 18개월 동안 부가적인 치료를 받지 않았다. 아울러, 대부분의 환자에서, CAR T 세포는 흉막내 투여 100일 이후에 말초 혈액에서 검출되었는데, 이는 환자 신체에서 상기 세포의 지속성을 나타낸다.
인간대상-최초(first-in-human) 임상 시험을 뒷받침하는 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포에 대한 약리학적 프로그램은 마우스에서 일련의 직교하는 시험관내 특이성, 세포독성, 축적, 및 사이토카인 분비 연구 및 생체내 종양 효능 및 생존 연구로 이루어지며, 그 결과는 임상 용도로 번역하기 위한 효과적인 용량을 제시한다. 표 4는 그 핵심 소견과 함께 수행된 비임상 약리학 및 독성학 분석법의 통합된 요약을 제공한다.
약리학 및 독성학 분석법 및 그 핵심 소견의 통합된 요약
실험 목적 핵심 소견
인간 종양에서의 메소텔린 발현 인간 종양에서
세포-표면 메소텔린의 분포를 정의함		 - 메소텔린이 고형 종양에서 발현됨
- 정상 폐 및 유방 조직에서 메소텔린이 발현되지 않음
형질도입 바이러스 상등액의 형질도입 효율을 결정함 - 바이러스 상등액 농도는 CAR 및 PD1DNR 형질도입 효율과 직접적으로 비례함
벡터 사본 수(VCN) T-세포 게놈에 삽입된 벡터의 수를 결정함
 - CAR 발현 및 VCN 사이의 양성 상관관계
- VCN ≤5를 유지하기 위해 35%-70%로 최적화된 CAR 형질도입
PD1DNR 정량화 내인성 PD1 및 PD1DNR 레벨을 별도로 정량함 - mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포에 대하여 단백질 레벨(>2배) 및 mRNA 레벨(>100배)에서 상향조절된 PD1 세포외 도메인
Myc-태그 간섭 CAR 기능에 대한 myc-태그의 영향을 조사함 - myc-태그가 있거나 없는 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 모두 시험관내에서 동일한 항-종양 효능을 나타냄
세포독성 항원-특이적 세포독성을 결정함 - mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 항원-특이적, HLA-비의존적 종양 용해를 매개함
축적 CAR T-세포 축적을 조사함 - mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 6가지 항원 자극에 대해 최대 622배까지 증식 및 축적되는 것으로 나타남
반복된 항원 자극 계속적 항원 노출 하의 세포독성을 조사함 - 초기 항원 자극: mycM28z1XXPD1DNR 및 mycM28z CAR T 세포 사이에 유사한 세포독성
- 반복된 항원 자극: 세포독성이 mycM28z1XXPD1DNR에서는 유지되지만
mycM28z CAR T 세포에서는 감소됨
사이토카인 분비 항원 자극시의 사이토카인 분비를 정량함 - mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 항원 자극시에 이펙터 사이토카인(IL-2, IFN-γ, TNF-α)을 분비함
- 반복된 항원 자극시에 이펙터 사이토카인의 분비가 감소됨
생체내 항-종양 효능 생체내 항-종양 효능 및 생존을 조사함 - 3×104의 단일 흉막내 용량의 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포/마우스에서 효능 및 종양 근절이 관찰됨
- mycM28z1XXPD1DNR(5×104 및 1x×105의 용량) CAR T 세포로 처리된 마우스는 연구가 종료될 때까지 종양-부재를 유지함(68일; 1×105 mycM28z CAR T 세포로 처리된 마우스에 대한 50일에 비해 중앙 생존이 도달하지 않음)
- mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스에서 중량 증가 및 독성 없음이 관찰됨
생체외에서 종양의 면역형광 염색 흉막내로 처리된 마우스의 원발성 종양에서 CAR T 세포를 검출함 - 국지적으로 투여된 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 침입 종양에서 발견되고 종양 주위 영역에서 강화됨
생체내에서 반복된 항원 도전 기능의 지속성 및 장기간의 항-종양 효능을 조사함 - 단일 흉막내 용량의 1×105 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 재도전된 복강내 종양의 확립에 저항함으로써 더 우수한 기능의 지속성 및 향상된 장기간의 항-종양 활성이 있음을 입증함
- mycM28z CAR T 세포는 항원 재도전시 기능장애가 됨
생체내에서 임상-등급 CAR T 세포의 항-종양 효능 임상 시험을 위한 벡터 스톡으로 형질도입된 냉동보존된 T 세포의 항-종양 효능을 검증함 - 냉동보존된 임상-등급 M28z1XXPD1DNR CAR T는 해동 후 높은 생존력을 입증하였고, 생체내에서 항-종양 효능, 및 연장된 생존을 나타냄
- 독성은 관찰되지 않음
독성 생체내에서 독성을 조사함 - 사망률 또는 발병률이 없음
- 현저한 임상 징후 없음
- 비-종양 대조군과 비교하여 체중에서 현저한 차이가 없음
- 조직병리학: 급성 또는 지연된 독성과 연관된 현미경적 소견 없음
- 혈액학: 연구 15일에 희생된 암컷 마우스는 높은 평균 % 단핵구 값을 가짐; 임의의 현미경적 소견과 상관관계 없음
- 임상 화학: 연구 14일에 희생된 수컷 마우스는 낮은 평균 총 단백질 값을 가짐; 임의의 현미경적 소견과 상관관계 없음
- 중피종 이종이식 모델에서 1×105 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 단일 동소성 투여는 잘 용인됨
전임상 연구에서 CAR T 세포의 검출을 용이하게 하기 위하여, 메소텔린-특이적 scFv의 N-말단에 myc-태그를 포함하는 CAR T 세포(mycM28z1XXPD1DNR)를 생성하였다. mycM28z1XXPD1DNR 및 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포 사이의 일관성을 평가하기 위하여, 바이러스 상등액의 형질도입 효율을 비교하였고, 2가지 구조체 사이에 벡터 성분의 일치되고 농도-의존적인 발현이 관찰되었다. 또한, CAR 및 PD1DNR은 모두 양시스트론성 전이유전자(bicistronic transgene) 발현을 효율적으로 매개하는 P2A 자가-절단 펩티드의 존재로 인하여 각각의 형질도입된 세포 내에서 비례해서 발현되었다. CAR을 발현하는 형질도입된 세포의 백분율과 T-세포 게놈에 삽입된 벡터 사본의 수를 비교할 때, 형질도입을 위해 사용된 바이러스 상등액의 희석과 생성된 벡터 사본 수(VCN) 사이에 양성 선형 연관성이 관찰되었다. 상기 관찰로부터, CAR을 발현하는 T 세포의 35%-70% 범위가 최적 형질도입 효율을 보장하는 것으로 결정하였고, 이것은 (1) 낮은 VCN:세포 비를 유지하고, (2) 대개 높은 VCN:세포 비에서 더 높은 삽입 돌연변이화의 위험성을 낮춘다.
PD1DNR의 발현을 확인하고 이를 내인성 상대물(counterpart)과 구별하기 위하여, mycM28z1XXPD1DNR 및 mycM28z로 형질도입된 T 세포에서 각각 PD1의 세포-표면 단백질 및 세포내 mRNA 발현을 측정 및 비교하기 위하여 유세포분석 및 qPCR 분석법을 수행하였다. 세포-표면 단백질 레벨에서, mycM28z CAR T 세포와 비교하여, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 PD1에 대해 양성으로 염색된 세포의 백분율에서 2배 증가 및 PD1-양성 세포에 의해 표시된 중앙 형광 강도(MFI)에서 3배 증가를 나타내었다. mRNA 레벨에서, 비-형질도입된 T 세포와 비교하여, mycM28z CAR T 세포는 PD1 세포외 및 세포내 도메인 모두에서 4배 증가를 보였지만, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 PD1 세포외 도메인에서 157배 증가 및 PD1 세포내 도메인에서 2배 증가만 나타내었다. PD1 세포외 도메인의 발현이 크기의 차수(order)만큼 더 높은 것은 체크포인트 억제와 싸우는 기능을 하는 PD1DNR의 발현이 높음을 시사한다.
마지막으로, CAR 기능에 대한 (전임상 연구에서 사용된) myc-태그의 임의의 잠재적인 감섭을 배제하기 위하여, mycM28z1XXPD1DNR 및 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 항-종양 효능을 임피던스-기반 세포독성 분석법을 이용해 비교하였고, 3명의 상이한 공여자에 걸쳐서 메소텔린-양성 종양 세포의 동역학 및 총 살상에 있어서 차이를 나타내지 않았으며, 이는 myc-태그가 CAR 기능을 간섭하지 않음을 확인한다.
다음으로, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 특이성, 세포독성, 축적, 및 사이토카인 분비를 분석하였다. 51Cr 세포독성 분석법에서, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 PD-L1의 구성적 발현 및 과발현 모두를 갖는 메소텔린-양성 종양 세포에 대해 항원-특이적 및 인간 백혈구 항원(HLA)-비의존적 세포독성을 나타내었다. 메소텔린-음성 종양 세포에 대한 비특이적 세포독성은 관찰되지 않았다. mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 메소텔린 항원 발현의 부재시에 PD-L1-과발현 표적에 대한 임의의 세포독성을 나타내지 않았다. 반복된 항원 자극 분석법(항원 스트레스 테스트)를 수행할 때, 6가지 항원 자극의 기간에 걸쳐서 mycM28z1XXPD1DNR 및 mycM28z CAR T 세포 모두에서 최대 622배 확장이 보였다. 테스트된 시점에서, 상기 구조체는 1번째 항원 자극 이후에 유사한 세포독성을 나타내었고, 4번째 항원 자극까지 유사한 세포독성을 유지하였다. 항원 스트레스를 증가시키기 위해 이펙터-대-표적(E:T) 비가 추가로 감소될 때, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 7번째 항원 자극시에 mycM28z CAR T 세포보다 세포독성을 더 유지하였다. 그러나, 상기 분석법의 과정에 걸쳐서, 이펙터 사이토카인(IL-2, IFN-γ, 및 TNF-α)의 분비는 mycM28z1XXPD1DNR 및 mycM28z CAR T 세포 모두에서 서서히 감소하였으며, 이는 양쪽 구조체 모두의 안정성 프로필을 나타낸다.
반딧불이 루시퍼라아제(ffLuc)로 동시-형질도입된 MPM 종양 세포를 흉막내로 투여하여 MPM의 동소성 암 모델을 나타내는 종양을 확립하였다. 종양 성장을 비침습적으로 추적하기 위하여, 종양-보유 마우스를 150 ㎎/㎏ 용량의 루시페린(luciferin)으로 복강내 주사하였고, 15분 후에 본 발명자들의 실험실에서 이전에 공개한 흉막 종양 축소 또는 진행을 정량적으로 추적하기 위해 최적화된 프로토콜을 이용하여 IVIS 스펙트럼 이미징 시스템(PerkinElmer, Waltham, MA)으로 시각화하였다(Servais et al., Curr Protoc Pharmacol. 2011;Chapter 14:Unit14 21).
생체내에서 CAR T 세포의 항-종양 활성을 연구하기 위해 수행된 초기 실험에서, 동소성 종양을 보유하는 NSG 마우스를 단일 흉막내 용량의 3×104 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리하였고, 전립선-특이적 막 항원(P28z)에 대해 특이적인 단일 흉막내 용량의 대조군 CAR T 세포로 처리된 마우스와 비교하였다. 15일 후, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스는 종양 부하에서 현저한 감소를 보였지만(p=0.0002), P28z CAR T 세포로 처리된 마우스는 높은 종양 부하로 인해 빈사되기 시작하였다.
두번째 생체내 연구에서, 동소성 종양을 갖는 마우스를 3개 군으로 나누었고, 각각 단일 흉막내 용량의 1×105 또는 5×104 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포 또는 1×105 mycM28z CAR T 세포를 받았다. 일련의 종양 이미징은 CAR T-세포 투여 후 5일만큼 빨리 종양 부하에서 감소를 보여주었고, 1×105 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스의 경우 대략 19일 및 1×105 mycM28z CAR T 세포로 처리된 마우스의 경우 대략 26일에 기준선 레벨로 생체발광 이미징(BLI) 신호가 감소되는 것에 의해 결정되는 완전한 종양 근절을 보였다. 양쪽 용량의 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스는 연구가 종료될 때까지(68일) 종양-부재를 유지하였다. 중앙 생존은 1×105 mycM28z CAR T 세포로 처리된 마우스의 경우 50일이었다; 상기 중앙 생존은 양쪽 용량의 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스의 경우에는 도달되지 않았다(>68일; p=0.0085-0.0427). 흉막 종양의 생체외 면역형광 이미징은 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포가 종양 주변을 높은 밀도로 둘러싸고 국지적 운반 후 3일 이내에 종양 실질을 침입하였음을 보였다. 상기 결과는 mycM28z1XXPD1DNR CAR로 형질도입된 상이한 백분율의 CD4 및 CD8 T 세포를 갖는 다중 공여자 유래의 T 세포를 사용함으로써 재생산되었다.
mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 기능의 지속성을 조사하기 위하여, 단일 흉막내 용량의 1×105 mycM28z1XXPD1DNR 또는 mycM28z CAR T 세포를 받은 동소성 MPM을 갖는 마우스를 4-8일마다 최대 10회까지 복강내 투여된 증가하는 용량(2×106 내지 11×106 세포/용량)의 메소텔린-양성 종양 세포로 재도전하였다(세포의 반복된 투여는 흉강에서보다 복강에서 보다 실행가능함). mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스에 대한 BLI 신호는 각각의 종양 재도전 직후에 피크였고, 모든 재도전 시점에서 기준선 레벨로 되돌아갔다. 이와 대조적으로, mycM28z CAR T 세포로 처리된 마우스는 최대 5회까지의 종양 재도전 동안 동일한 경양을 보여주었지만, 후기 종양 재도전 시점(6 내지 10회)에서 더 높은 종양 용량을 투여한 후 종양 재확립을 조절하는데 실패하였고, 종양 재발 및 빈사 상태를 유발하였다. mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 단일 흉막내 용량의 1×105 CAR T 세포 후 >126일에서 조차도 10회 반복된 도전 동안 임의의 명호가한 독성 징후 없이 복강내 종양 확립에 저항하였다. 높은 항원 스트레스의 환경에서, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 생체내에서 mycM28z CAR T 세포와 비교하여 더 뛰어난 기능의 지속성 및 향상된 항-종양 효능을 나타내었다. 상기 향상된 효능이 상기 시점에서 CAR T 세포로 처리된 NSG 마우스에서 흔히 보여지는 이식편대숙주 질환으로 인한 것이 아님을 확인하기 위하여, 비-항원-발현 표적을 투여한 결과, 항-종양 반응 없이 종양 BLI가 증가하였고, 이는 관찰된 항-종양 효능이 항원-특이적이었음을 확인한다.
임상 시험에서 사용하기 위해 생산된 M28z1XXPD1DNR CAR-암호화 바이러스 상등액으로 형질도입된 냉동보존된 T 세포의 항-종양 효능을 검증하기 위하여, MSK 세포 치료법 및 세포 조작 시설(CTCEF, Cell Therapy and Cell Engineering Facility)에 의해 생성된 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포를 해동하고(생존율: 해동 후 88%), 6×104 및 2×105 CAR T 세포/마우스의 용량으로 동소성 MPM을 갖는 마우스 내로 흉막내 주사하였다. 양쪽 용량에 대해 종양 축소 및 근절이 관찰되었고, 관찰 기간(70일)이 종료될 때까지 100%의 마우스가 생존하였지만, 처리되지 않은 마우스에서는 종양이 진행되었고, 19일에 죽음을 초래하였다. 냉동보존된 CAR T 세포는 해동 후 높은 생존율을 나타내었고, 임의의 독성 징후 없이 효과적이었다.
상기 효능 실험을 수행할 때, 전반에 걸쳐서 마우스에서 독성은 관찰되지 않았고, 중량은 안정하게 유지되었다.
본 실시예의 섹션 3(제목이 "비임상 독성학"임)은 MPM의 동소성 마우스 모델에서 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 잠재적인 독성을 구체적으로 평가하기 위하여 마우스에서 수행된 연구를 기술한다. 사망률, 발병률, 중량, 임상 징후, 혈액학 및 임상 화학, 육안 부검(gross necropsy), 및 조직병리학적 평가를 무작위로 대조군 및 처리군으로 할당된 8일령의 동소성 중피종을 보유하는 96마리(48마리 수컷 및 48마리 암컷) NSG 마우스에서 평가하였다. 1×105 용량의 CAR T 세포/마우스 또는 대조군 비히클(5×106 CAR T 세포/㎏)을 동소성 주사를 통해 1회 투여하였다. CAR T-세포 또는 비히클 투여 후 2일 및 14일에(각각 잠정 및 최종 희생), 마우스를 부검 및 혈액학적 및 임상 화학적 파라미터의 평가를 위해 진정시켰다. 14일을 최종 희생을 위한 시점으로 선택하였는데, 그 이유는 (이전 실험으로부터의 BLI 또는 부검에 의해 입증되는 것과 같이) 종양이 상기 시점에서 현저하게 축소되거나 근절되었기 때문이다. 상기 시점에서 희생 및 부검을 수행하는 것은 낮은 레벨의 메소텔린의 발현을 갖는 높은 항원 발현을 갖는 종양 부하의 부재시 피크 CAR T-세포가 확장된 이후에 정상 조직(구체적으로 흉막, 복막, 및 심막)에 대한 임의의 표적-내(on-target), 종양-외(off-tumor) 효과(본 발명의 CAR에서 사용된 scFv는 마우스 메소텔린과 반응함)(Feng et al., Mol Cancer Ther. 2009)를 조사하게 한다.
본 연구에서는 종양 투여 후 20-22일에 발병률 및 호흡 곤란으로 인해 선별적으로 희생시킨 대조군 비히클-처리군으로부터의 2마리 동물을 제외하고는 동물에서 사망률 또는 발병률이 관찰되지 않았다. 본 발명자들의 실험실에서의 이전의 작업은 대조군 비히클-처리 동물이 종양 투여 후 대략 20-22일에 종양 부하로 인해 빈사될 수 있음을 보였다(Servais et al., Clin Cancer Res. 2012; Servais et al., Curr Protoc Pharmacol. 2011;Chapter 14:Unit14 21; Adusumilli et al., Sci Transl Med. 2014;6(261):261ra151; Cherkassky et al., J Clin Invest. 2016;126(8):3130-3144; Servais et al., PLoS One. 2011;6(10):e26722). 따라서, 상기 희생은 계획되지 않은 것이지만 예상 못한 것은 아니었다. CAR T 세포에 대한 사망률 또는 발병률은 추적되지 않았다. 대조군 비히클을 받은 동물은 본 연구 기간 동안에 비-종양 대조군 및 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스와 비교하여 체중에서의 점진적인 감소 및 중량에서의 현저한 차이를 보였다. 이것은 대조군 비히클-처리 동물의 종양 부하의 증가로 인한 것이다. mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스의 경우 현저한 임상 징후는 관찰되지 않았다. 테스트 물품-처리 마우스 1마리는 약간의 딱지를 갖는 것으로 관찰되었는데, 다른 동물들은 영향이 없었고 동물 활성도 정상이었기 때문에, 이것은 외과용 클립에 의해 유발된 자극으로 인한 것이었다. 마우스는 추적 기간 전체에 걸쳐 정상으로 보였다.
CAR T-세포 투여 후 14일에 최종 희생된 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 암컷 마우스는 종양 대조군 비히클 마우스(평균, 3.34%, n=5)과 비교하여 높은 평균 백분율의 단핵구 값(평균, 18.44%, n=5)을 가졌다(p≤0.0001). 단핵구 백분율에 대해 확립된 참조 범위는 0.9%-18%이다. 그러나, 이것은 임의의 현미경적 소견과 연관되지는 않았다. 평가된 혈액학 파라미터에 대해 다른 현저하거나 비정상적인 결과는 없었다. 테스트 물품-처리군 및 해당 비히클-처리군 사이의 임의의 차이점은 정상 참조 범위 내이거나, 생물학적으로 관련있거나 통계적으로 유의미하지 않았다.
CAR T-세포 투여 후 14일에 최종 희생된 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 수컷 마우스는 종양 대조군 비히클 마우스(평균, 4.68 g/dL, n=4)와 비교하여 낮은 평균 총 단백질 값(평균, 3.83 g/dL, n=5)을 가졌다(p=0.0022). 총 단백질에 대해 확립된 참조 범위는 4.1-6.4 g/dL이다. 그러나, 이것은 임의의 현미경적 소견과 연관되지는 않았다. 테스트 물품 투여와 관련하여 이용한 임상 화학 파라미터에 대한 다른 부작용은 관찰되지 않았다. 테스트 물품-처리군 및 대응 비히클-처리군 사이의 임의의 차이점은 정상 참조 범위 내이거나, 생물학적으로 관련있거나 통계적으로 유의미하지 않았다.
조직병리학적 검토는 mycM28z1XXPD1DNR CAR T-세포 투여로부터 급성 또는 지연된 독성과 관련되어 잠정 및 최종 희생일에 현미경적 소견은 없음을 보여주었다. CAR T-세포 잠정 희생 군에서 동물에 대한 현미경적 소견은 이종이식 종양 내에서 혼합된 세포 침입의 존재를 포함하였다. 이것은 테스트 물품 투여와는 연관되지만 임의의 테스트 물품 독성과는 연관되지 않은 것으로 간주되었다. 임의의 다른 관찰된 소견은 대조군에서와 유사한 발생률로 산발적으로 일어난 것으로 결정되거나, 이용된 종/스트레인(strain)에서 흔한 것이었다.
mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 흉막내 투여 후 8일에 종양 및 비장에서 발견되었고, BLI는 2주 시점에 CAR T 세포-처리 마우스에서 종양 부하가 현저하게 감소되었음을 밝혀서, 테스트 물품의 성공적인 투여 및 약리학적 활성 모두를 확인하였다. 동일한 시점에서 수득된 마우스 혈장 사이토카인 레벨은 비히클 대조군으로 처리된 마우스보다 CAR T 세포로 처리된 마우스에서 IL-4의 레벨이 약간 더 높음을 보였다. IL-10, IL-6, KC/GRO, 및 TNF-α의 레벨은 일반적으로 낮았고, CAR T 세포를 받은 마우스 및 비히클 대조군을 받은 마우스 사이에 현저하게 상이하지 않았다. IFN-γ, IL-12p70, IL-1β, IL-2, 및 IL-5는 검출가능하지 않았다(정량화 한계 이하).
결론적으로, 상기 데이터는 t M28z1XXPD1DNR CAR T 세포가 잘 용인됨을 시사한다. 1×105 세포/마우스의 용량은 환자에 대한 출발 용량(체중 기준으로 1×106 세포/㎏)보다 5배 더 높으며, 이는 5×106 세포/㎏에 해당한다. M28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 M28z CAR T 세포와 동일한 항원-표적화 모이어티를 가지며, 이에 대한 환자-안전성 데이터(n=50)는 이미 이용가능하다. 본 발명자들의 임상 시험(IND16354)에서, 본 발명자들은 임의의 용량-제한 독성은 관찰할 수 없었고, CAR T-세포 투여 후 3주에 제공된 항-PD1 체크포인트 차단 항체와 조합하여 흉막내로 투여된 최대 6×107까지의 M28z CAR T 세포/㎏에 대해 표적-내, 종양-외 독성은 없었다. 4명의 환자는 다중 용량의 항-PD1 제제(4주의 휴약(washout) 기간) 이후에 제2 용량의 흉막내 M28z CAR T 세포를 받았고, 관찰된 독성은 없었다. 함께, 이용가능한 모든 전임상 및 임상 데이터는 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 제안된 출발 용량 및 투여 경로는 환자에게 허용가능하지 않은 위험성을 제기하지 않음을 합리적으로 시사한다.
2. 비-임상적 약리학
A. 방법
CAR 벡터. 비임상 연구에 사용된 벡터는 표 5에 요약되어 있다.
비인상 연구에 사용된 벡터의 요약
벡터 단백질 발현
mycM28z 메소텔린-특이적 scFv(myc 태그), CD28, CD3ζ
mycM28z1XXPD1DNR 메소텔린-특이적 scFv(myc 태그), CD28, CD3ζ(1XX), P2A, PD1DNR
M28z1XXPD1DNR(연구-등급) 메소텔린-특이적 scFv, CD28, CD3ζ(1XX), P2A, PD1DNR
M28z1XXPD1DNR(임상-등급*) 메소텔린-특이적 scFv, CD28, CD3ζ(1XX), P2A, PD1DNR
GFP-ffLuc(종양 세포 내로 형질도입됨) GFP, 반딧불이 루시퍼라아제
P28z(음성 대조군) 전립선-특이적 막 항원(PSMA) scFv, CD28, CD3ζ
*임상 등급: 임상 시험을 위해 생산된 바이러스 상등액을 이용하여 MSK 세포 치료법 및 세포 조작 시설에 의해 제조된 CAR T 세포.
메소텔린-표적화 CAR 구조체는 CD28 공-자극성 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인(M28z)에 융합된 메소텔린-특이적 scFv(클론 m912)(Feng et al., Mol Cancer Ther. 2009)를 함유한다. 상기 CD3ζ 사슬은 그 3개의 ITAM 중 2개가 돌연변이되어 단일 기능 ITAM(1XX로 명명됨)를 생성하였다(Feucht et al., Nat Med. 2019;25(1):82-88). 상기 CAR은 돼지 테스코바이러스-1로부터 유래된 P2A 부위를 통해 PD1DNR에 융합된다. PD1DNR은 PD1 신호전달 펩티드 및 CD8 막통과 및 힌지 도메인에 융합된 PD1 세포외 도메인으로 구성된다(Cherkassky et al., J Clin Invest. 2016;126(8):3130-3144). 상기 유인용 수용체는 PD1 신호전달 도메인이 없고, 이로 인해 T-세포-내재적 체크포인트 차단을 제공한다. CAR의 검출을 용이하게 하기 위하여, myc-태그(아미노산 서열 EQKLISEEDL ×2)가 구조체 mycM28z 및 mycM28z1XXPD1DNR에서 scFv의 N-말단에 융합되었다. 인간에서 면역원성의 임의의 잠재적인 위험성을 방지하기 위하여, 임상-등급 구조체 M28z1XXPD1DNR은 myc-태그를 함유하지 않는다. 또한, 단백질 발현이 코돈-최적화되어서 강기 CAR 및 PD1DNR의 구조체에서 임의의 면역원성을 방지한다. 비임상 연구에서 사용된 구조체의 상세한 구조는 도 22에 도시되어 있다.
상기 CAR 구조체의 발현은 레트로바이러스 SFG 벡터의 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 긴 말단 반복(LTR)의 제어 하에 있다(Riviere et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92(15):6733-6737). CAR 및 PD1DNR의 발현은 모두 레트로바이러스 LTR에 의해 구동된다.
모든 CAR 벡터는 293T H29 패키징 세포주 내로 형질주입되었고, 상기 세포에 의해 생산된 바이러스 상등액을 사용하여 안정한 293T RD114 세포주를 형질도입 및 생성하였다.
CAR T 세포. 인간 원발성 T 림프구를 기관 윤리 위원회가 승인한 프로토콜 하에 건강한 자원 공여자의 혈액으로부터 단리하였다. 피토헴아글루티닌(phytohemagglutinin)-활성화 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 림프구 분리 배지(Corning, New York, NY)에서 저-밀도 원심분리에 의해ㅐ 단리하였다. 단리 후 2일에, PBMC를 15 ㎍/㎖ 레트로넥틴(RetroNectin)(Takara, Shiga, Japan)으로 코팅된 6-웰 배양 플레이트에서 24℃에서 60분 동안 1800 g에서의 스핀접종(spinoculation)을 통해 mycM28z, mycM28z1XXPD1DNR, 또는 M28z1XXPD1DNR 벡터를 함유하는 바이러스 상등액으로 형질도입하였다. 스핀접종한 다음에, 형질도입된 PBMC를 10% 우태아혈청(FBS), 2 mM L-글루타민, 100 유닛/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 및 20 유닛/㎖ IL-2로 보충된 RPMI-1640에서 유지하였다. 태그된 CAR의 scFv에 대한 myc-태그 발현의 유세포분석법에 의해, 또는 M28z1XXPD1DNR의 태그되지 않은 CAR의 scFv의 발현을 검출하기 위한 F(ab')2 단편-특이적 항-인간 IgG 항체를 이용한 염색에 의해 형질도입 효율을 결정하였다. 생존율>70%, 항-인간 CD3 염색에 의한 T-세포 순도>95%, 유세포분석에 의한 35%-70%의 형질도입 효율, 및 CD4/CD8 발현에 대해 CAR T 세포를 테스트하였다. 비임상 연구에 사용된 T 세포의 특징은 표 6에 요약되어 있다.
비임상 연구에 사용된 T 세포의 특징
PBMC 공여자 % CD3 % CD3+ CAR+ % CD3+ CAR CD4+ % CD3+ CAR CD8+
H16 97-98 43-62 48-57 33-45
H18 97-99 38-57 42-45 45-52
H19 98 37-64 41-46 47-51
C 97-98 65-66 37-38 55-57
C1 97 64-70 46 48-49
H1 97 56-60 38 결정되지 않음
종양 세포. MSTO-211H 인간 흉막 중피종 세포주(ATCC CRL-2081) 유래의 세포를 유전자적으로 변형하였고, 시험관내 및 생체내 연구를 위해 사용하였다(표 7).
비임상 연구에 사용된 종양 세포의 요약
종양 세포 단백질 발현
MSTOG GFP, ffLuc
MGM GFP, ffLuc, 메소텔린
MGM-PDL1 GFP, ffLuc, 메소텔린, PD-L1
MSTO-211H는 내인성 CD80/86 공-자극성 리간드가 발현되지 않는 2상(biphasic) MPM 암 세포주이다. MSTO-211H 세포는 MSTOG로 명명된 GFP 및 ffLuc 단백질을 발현하도록 레트로바이러스적으로 형질도입되어, MSK에서 구축된 SFG 레트로바이러스 벡터를 이용하여 생체내에서 비침습적 BLI를 허용한다. 여과된 바이러스를 함유하는 배지를 8 ㎍/㎖ 폴리브렌(Polybrene)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 이용하여 투과가능하게 된 세포에 첨가하였다. 24시간 후에 세포를 신선하게 수집된 바이러스로 재-감염시켰다. 상기 세포를 (인간 난소암 세포주 [OVCAR-3]로부터 단리된) 인간 메소텔린-변이체 1로 형질도입하였고, SFG 레트로바이러스 벡터로 서브클로닝하여 MGM으로 명명된 메소텔린+ MSTO-211H 세포를 생성하였다. 유사하게, MGM 세포를 PD-L1(SFG 벡터로 서브클로닝된 OriGene cDNA)로 형질도입하여 MGM-PDL1을 생성하였다. 종양 세포를 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 유닛/㎖ 페니실린, 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 갖는 RPMI-1640 배지에서 5% CO2 가습 인큐베이터에서 37℃에서 유지하였다. 시험관내에서 루시퍼라아제-발현 종양 세포의 수 및 BLI 광자 카운트 사이의 선형 상관관계(Pearson r=0.999, p<0.0001, 데이터는 나타내지 않음)가 관찰되었다. 형질도입된 단백질의 상대적 발현 레벨은 도 23에 도시되어 있다.
유세포분석. Attune NxT 유세포분석기(ThermoScientific, Waltham, MA) 또는 BD LSRFortessa(BD Biosciences, San Jose, CA)를 이용하여 유세포분석을 수행하였다. 피코에리트린(phycoerythrin)-접합된 항-인간 메소텔린 래트 IgG2a(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 종양 세포에 대한 인간 메소텔린 세포-표면 발현을 검출하였다. 피코에리트린-시아닌(cyanine) 7-접합된 항-인간 PD-L1 마우스 IgG1(BD Biosciences)을 이용하여 종양 세포에 대한 인간 PD-L1 세포-표면 발현을 검출하였다. 알로피코시아닌(allophycocyanin)-시아닌 7-접합된 항-인간 CD3 마우스 IgG2a 또는 피코에리트린-시아닌 7-접합된 항-인간 CD3 마우스 IgG1 항체(BioLegend, San Diego, CA)를 이용하여 인간 CD3의 그 세포-표면 발현 및 각각 플루오레세인 이소티오시아네이트-접합된 항-인간 CD4 마우스 IgG1(BioLegend) 또는 Alexa Fluor 488-접합된 항-인간 CD8 마우스 IgG1(BioLegend)을 이용하여 인간 CD4 또는 인간 CD8의 그 세포-표면 발현에 대해 인간 T 세포를 분석하였다. 피코에리트린-접합된 항-myc-태그 항체(Cell Signaling Technology, Danvers, MA) 또는 Alexa Fluor 647-접합된 F(ab')2 단편-특이적 염소 항-인간 F(ab')2 단편(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)을 이용하여 CAR의 세포-표면 발현을 정량하였다. CAR T 세포에 대한 PD1의 세포-표면 발현을 Brilliant Violet 711-접합된 항-인간 PD1 마우스 IgG1(BioLegend)을 이용하여 분석하였다. 인간 T 세포의 생체외 검출을 위하여, 처리된 마우스 조직을 피코에리트린-시아닌 7-접합된 항-인간 CD3 마우스 IgG1 항체 및 알로피코시아닌-시아닌 7-접합된 항-인간 CD45 마우스 IgG1 항체(BioLegend)로 염색하였다. 죽은 세포로부터 살아있는 세포를 식별하는 것은 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) 또는 eFluor 506(ThermoFisher Scientific)을 이용하여 세포를 염색함으로써 수행하였다. FCS Express(De Novo Software, Pasadena, CA) 및 FlowJo (BD Biosciences) 소프트웨어를 이용하여 데이터 분석을 수행하였다. 표 8은 유세포분석을 위해 사용된 항체를 요약한 것이다.
비임상 약리학 연구를 위한 유세포분석 항체
마커 클론(들) 종 항체 포맷 형광단 제조사
CD3 HIT3a 마우스 IgG2a APC-CY7 BioLegend
UCHT1 마우스 IgG1 PE-CY7 BioLegend
CD45 2D1 마우스 IgG1 APC-CY7 BioLegend
CD4 RPA-T4 마우스 IgG1 FITC BioLegend
CD8 RPA-T8 마우스 IgG1 AF700 BioLegend
PD1 EH12.2H7 마우스 IgG1 BV711 BioLegend
Myc-태그 1B11 마우스 IgG2a PE Cell Signaling
항-F(ab')2 폴리클론 염소 F(ab')2 AF647 Jackson ImmunoResearch
메소텔린 420411 래트 IgG2a PE R&D Systems
PD-L1 MIH1 마우스 IgG1 PE-CY7 BD Biosciences
VCN의 결정. Miniprep 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 CAR T 세포로부터 총 게놈 DNA를 단리하였다. TaqMan PCR 프라이머 및 프로브를 사용하여 SFG 및 하우스키핑(housekeeping) 유전자 알부민(ALB)을 검출하였다. 인간 SFG 프로브 및 프라이머 서열은 다음과 같다:
프로브 서열: 5'-VIC-AGGACCTTACACAGTCCTGCTGAC-TAMRA-3' [서열번호 126]
정방향 프라이머 서열: 5'-AGAACCTAGAACCTCGCTGGA-3' [서열번호 127]
역방향 프라이머 서열: 5'-CTGCGATGCCGTCTACTTTG-3' [서열번호 128]
인간-ALB 프로브 및 프라이머 서열은 다음과 같다:
프로브 서열: 5'-VIC-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3' [서열번호 129]
정방향 프라이머 서열: 5'-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3' [서열번호 130]
역방향 프라이머 서열: 5'-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3' [서열번호 131]
증폭 반응물(25 ㎕)은 5 ㎕(150 ㎍)의 게놈 DNA 및 12.5 ㎕의 TaqMan Fast Advanced Master Mix(ThermoFisher Scientific), 0.8 ㎕의 프라이머(정방향 및 역방향), 0.2 ㎕의 TaqMan 프로브, 및 5.7 ㎕의 증류수를 함유하였다. qPCR 조건은 다음과 같았다: QuantStudio 7-Flex 실시간 PCR 시스템(ThermoFisher Scientific)을 이용하여 50℃(2분), 95℃(20분), 이어서 42 사이클의 95℃(15초) 및 60℃(1분). 모든 PCR 측정은 3중으로 수행하였다. (SFG의 평균 함량/ ALB의 평균 함량)*2의 비로서 세포 당 VCN을 계산하였다. 평균 함량은 SFG 및 ALB 표준 곡선으로부터 추론하였다.
PD1 mRNA 발현의 결정. Miniprep 키트(Qiagen)를 이용하여 CAR T 세포로부터 총 RNA를 단리하였고, 고용량 cDNA 역전사 키트(ThermoFisher Scientific)를 이용하여 역전사 반응을 거쳤다. SYBR 그린 분석법을 사용하여 인간 PDCD1의 세포외 및 세포내 도메인을 검출하였다. 인간 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH)를 사용하여 표준화하였다. 다음의 프라이머를 사용하였다.
GAPDH 프라이머 서열:
정방향 프라이머 서열: 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3' [서열번호 132]
역방향 프라이머 서열: 5'-CATGGGTGGAATCATATTGGAA-3' [서열번호 133]
PD1 세포외 도메인 프라이머 서열(Yoon et al., Science. 2015;349(6247):1261669):
정방향 프라이머 서열: 5'-CCAGGATGGTTCTTAGACTCCC-3' [서열번호 134]
역방향 프라이머 서열: 5'-TTTAGCACGAAGCTCTCCGAT-3' [서열번호 135]
PD1 세포내 도메인 프라이머 서열(Hsu et al., J Immunol. 2016;197(5):1884-1892:
정방향 프라이머 서열: 5'-ACGAGGGACAATAGGAGCCA-3' [서열번호 136]
역방향 프라이머 서열: 5'-GGCATACTCCGTCTGCTCAG-3' [서열번호 137]
cDNA를 이후의 qPCR 분석법을 위해 5배 희석하였다. 증폭 반응물(20 ㎕)은 200 ng의 총 RNA로부터의 cDNA 및 10 ㎕의 QuantiTect SYBR 그린 PCR 믹스(Qiagen), 4 ㎕의 프라이머(정방향 및 역방향, 각각 200 nM), 및 증류수를 함유하였다. qPCR 조건은 다음과 같았다: QuantStudio 7 Flex 실시간 PCR 시스템(ThermoFisher Scientific)을 이용하여 95℃(15분), 95℃(20분), 이어서 45 사이클의 94℃(15초), 60℃(30초), 72℃(30초), 및 50℃(데이터 수집을 위해 20초). 모든 PCR 측정은 3중으로 수행하였다. 모든 프라이머는 Integrated DNA Technologies(Coralville, IA)에 의해 합성하였고, 증폭 효능(E) 값을 계산하였다. 표적 유전자의 상대적 발현을 다음의 Pfaffl 식(Pfaff, Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45)에 따른 비로서 참조군에 대해 표준화하였다:
상대적 비 = (E표적)ΔCt표적(대조군-샘플) / (Eref )ΔCt ref (대조군-샘플)
표적 = PD1 세포외/세포내 도메인; Ref = GAPDH; 대조군 = 비-형질도입된 T 세포.
51 Cr 세포독성 분석법. mycM28z T 세포와 비교하여 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 세포독성을 표준 51Cr-방출 분석법에 의해 결정하였다. 96-웰 둥근-바닥 플레이트에, 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 유닛/㎖ 페니실린, 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 갖는 200 ㎕의 RPMI 중의 5×105 내지 1×106 총 T 세포를 100 ㎕의 배지에서 1:2로 연속 희석하였다. 표적 세포를 1×106 세포 당 75 μCi의 51Cr으로 2시간 동안 인큐베이션하였고, 5×103 세포/100 ㎕의 최종 농도로 재현탁시켰다. 배지로 3회 세척한 후, 100 ㎕의 표적 세포를 3중으로 T 세포에 첨가하였고, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 37℃에서 4-18시간 동안 인큐베이션하였다. 상등액을 수집하였고, 96-웰 Lumina 플레이트(PerkinElmer)에 플레이팅하였고, PerkinElmer TopCount에서 측정하였다. 자연적 51Cr 방출을 배지 단독으로 인큐베이션된 표적 세포에서 평가하였고, 100 ㎕의 0.2% Triton X-100에서 인큐베이션된 표적 세포를 이용해 최대 51Cr 방출을 결정하였다. 특유의 용해(specific lysis)의 백분율을 다음과 같이 계산하였다: [(실험적 분 당 카운트(cpm) - 자연적 방출 cpm)/(총 cpm - 자연적 방출 cpm)] × 100. 3중 측정의 평균 +/- 상기 평균의 표준 오차로서 데이터를 기록하고, Microsoft Excel(Microsoft, Redmond, WA) 또는 GraphPad Prism(GraphPad Software, La Jolla, CA)을 이용해 분석하였다.
임피던스 분석법. 시험관내에서 표적 세포의 CAR T 세포-유도 살상을 xCELLigence 실시간 세포 분석 기기(ACEA Biosciences, San Diego, CA)를 이용하여 실시간으로 평가하였다. 첫번째로, 표적 및 이펙터 세포에 대한 배양 배지로서 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 유닛/㎖ 페니실린, 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 갖는 50 ㎕의 RPMI를 금 미세전극(ACEA Biosciences)으로 코팅된 96-웰 미세적정 플레이트에 첨가하여 배경 임피던스를 측정하였다. 두번째로, 웰 당 100 ㎕의 배지 중에 10,000개 표적 세포를 플레이팅하였고, CAR T 세포를 1:1 내지 1:3의 E:T 비에서 3중으로 50 ㎕의 배지에 첨가하기 전에 24-34시간 동안 표적 세포 부착을 추적하였다. CAR T 세포-유도 살상 및 표적 세포의 탈착의 결과로서 임피던스에서의 변화를 평가하기 위하여, 이펙터 세포를 첨가한 후 최대 4일까지 5% CO2 가습 인큐베이터에서 37℃에서 15분마다 데이터를 기록하였다.
반복된 항원 자극. 시험관내에서 반복된 항원 자극시에 CAR T 세포의 항-종양 효능을 조사하기 위하여, mycM28z1XXPD1DNR 또는 대조군으로서 mycM28z로 형질도입된 3.3×105 내지 1×106 T 세포를 24-웰 세포-배양 플레이트에서 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 유닛/㎖ 페니실린, 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 갖는 1 ㎖의 RPMI에서 3.3×105 조사된 표적 세포(E:T 비, 1:1 내지 3:1)와 함께 공-배양하였다. 48시간의 공-배양 후, T 세포를 모았고, 계수하였고, 유세포분석에 의해 CAR의 발현을 분석하였고, 동일한 E:T 비에서 최대 6 라운드까지 반복적으로 항원에 노출된 조사된 표적 세포로 다시 플레이팅하였다. 1, 3, 및 6 라운드의 항원 노출 후, 51Cr-방출 및 임피던스-기반 분석법을 이용하여 CAR T 세포의 세포독성을 평가하였다.
축적. mycM28z1XXPD1DNR 또는 대조군으로서 mycM28z로 형질도입된 3.3×105 T 세포를 24-웰 세포-배양 플레이트에서 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 유닛/㎖ 페니실린, 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 갖는 1 ㎖의 RPMI에서 3.3×105 조사된 표적 세포(E:T 비, 1:1)와 함께 공-배양함으로써 축적을 평가하였다. 48시간의 공-배양 후, T 세포를 모았고, 계수하였고, 유세포분석에 의해 CAR의 발현을 분석하였고, 동일한 E:T 비에서 최대 6 라운드까지 반복적으로 항원에 노출된 조사된 표적 세포로 다시 플레이팅하였다. 각각의 항원 자극 사이클 후 CAR T 세포의 수를 사용하여 절대적 T-세포 카운트에 의해 시간에 따른 CAR T 세포의 축적을 결정하였다.
사이토카인 정량화. mycM28z1XXPD1DNR 또는 대조군으로서 mycM28z로 형질도입된 3.3×105 T 세포를 24-웰 세포-배양 플레이트에서 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 유닛/㎖ 페니실린, 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 갖는 RPMI에서 3.3×103 표적 세포(E:T 비, 1:1)와 함께 공-배양함으로써 사이토카인-방출 분석법을 수행하였다. 48시간의 공-배양 후, T 세포를 모았고, 계수하였고, 유세포분석에 의해 CAR의 발현을 분석하였고, 동일한 E:T 비에서 최대 6 라운드까지 반복적으로 항원에 노출된 조사된 표적 세포로 다시 플레이팅하였다. 사이토카인 정량화를 위하여, 반복된 항원 자극 1, 3, 및 6에 대해 공-배양한 후 24시간에 상등액을 수집하였고, 실온에서 10분 동안 800 g에서 원심분리하여 세포 및 잔해물(debris)을 제거하였다. 사이토카인 레벨을 인간 사이토카인 Magnetic 30-plex 패널(Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 MAGPIX 시스템(Luminex, Austin, TX)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 2중으로 결정하였다.
동소성 마우스 모델. 동소성 종양 모델은 표준 피하 모델보다 약물 효능을 예측함에 있어서 임상적으로 더 관련있고 나은 것으로 간주된다. 종양 세포가 기원 기관 내로 직접 이식된다는 사실로 인해, 상기 종양은 종래의 피하 이종이식 종양 모델보다 훨씬 더 나은 원래의 상황(예컨대, 미세환경)을 반영한다. 루시퍼라아제 유전자-형질주입된 종양 세포와 함께 상기 세포의 동소성 이식을 조합하면 종양 성장, 종양 분포, 및 전이의 성장의 비침습적 시각화를 허용한다.
6-10주령의 암컷 및 수컷 NOD/SCID 감마 마우스(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)를 사용하여 동소성 모델을 생성하였다. 모든 절차는 기관동물실험윤리 위원회(IACUC) 프로토콜의 승인 하에 수행하였다. 마우스를 이소플루란 및 산소를 흡입시켜 마취시켰다. 동소성 MPM 종양을 확립하기 위하여, 200 ㎕의 혈청-부재 배지 중의 메소텔린-발현 세포(8×105 종양 세포)를 오른쪽 흉부 절개를 통해 직접 흉막내에 주사하였다. 주사 후 8-12일에 접종하여 >95%의 마우스에서 종양을 확립하였다. 빈사하였을 때 IACUC 지침에 따라 마우스를 희생시켰다.
상기 모델은 MPM의 육안 외형 및 조직병리학적 프로필을 반영한다는 점에서 인간 종양 미세환경을 요약한다(도 24a 참조). 또한, 본 발명의 마우스 모델에서 MPM 종양의 대규모 림프-혈관형성(도 24b 참조)은 인간 MPM의 특징이다.
BLI는 흉막 공간에서 1×103만큼 적은 종양 세포를 검출할 수 있는 생체내에서 민감한 기법(modality)이다. 표준화 및 민감도는 본 발명자들 자체의 실험에 기반한다(Kachala et al., Clin Cancer Res. 2014;20(4):1020-1028; Servais et al., Clin Cancer Res. 2012; Servais et al., Curr Protoc Pharmacol. 2011;Chapter 14:Unit14 21; Servais et al., PLoS One. 2011;6(10):e26722; Servais et al., J Mol Med (Berl). 2011;89(8):753-769). BLI 종양 신호 및 종양 부피 평가를 위한 금 표준인 자기 공명 영상(MRI)에 의해 결정된 흉막 종양 부피 사이에 강한 연관성이 관찰되었다(r=0.86, p<0.0001, 마우스-내(within-mouse) 클러스터링에 대해 조정됨; 도 24c 및 도 24d). 정량적 BLI에 대한 본 발명자들의 소견은 종양이 흉막 외피(rind)의 비후와 같이 흉벽을 따라 성장하여 종양 깊이를 최소화한다는 사실에 기인할 수 있다(도 24a). 따라서, 동소성 흉막 암 모델에서 BLI는 종양 부하의 정확한 정량적 평가를 제공할 수 있고, 이로 인해 살아있는 마우스에서 바이오마커 성능에 대한 일련의 비침습성 평가를 위한 비교할 만한 표준을 제공한다. 면역조직화학 및 유세포분석법을 이용하여, 본 발명자들은 메소텔린 발현은 질환이 진행된 단계에서 조차도 동소성 MPM 모델에서 지속됨을 관찰하였다(데이터는 나타내지 않음).
마우스 조직 처리. 마우스를 CO2로 안락사시켰고, 흉막 종양 및 비장을 아주 찬 RPMI-1640으로 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 수집하였다. 처리를 위하여, 상기 조직을 40 ㎛ 세포 스트레이너(strainer)를 통해 갈았고, 4℃에서 5분 동안 450 g에서 원심분리하였다. 세포 펠렛이 혈액처럼 보인다면, 이를 2 ㎖의 ACK 용해 버퍼(Lonza, Basel, Switzerland)에 재부유시켰고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 4℃에서 5분 동안 450 g에서 부가적인 원심분리 단계를 한 후, 세척 및 유세포분석에서 즉시 사용하기 위한 항체 염색을 위하여 세포 펠렛을 5% 소 혈청 알부민을 갖는 PBS에 재현탁시켰다.
면역형광. 확립된 MGM 흉막 종양을 갖는 암컷 NSG 마우스에 5×105 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포, mycM28z CAR T 세포, 또는 비-형질도입된 T 세포를 주사하였다. 주사 후 3일에, 마우스를 희생시켰고, 흉막 종양을 단리하였고, 4% 파라포름알데히드로 실온에서 밤새 고정하였고, Leica ASP6025 조직 처리기(Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)를 이용해 파라핀 포매(embedding)를 처리하였다. 신선하게 절단한 5 ㎛ 파라핀 절편(section)을 Leica Bond Protocol F에 대하여 10분의 1:200 Tyramide Alexa Fluor 594 검출(Life Technologies, Carlsbad, CA)과 함께 1.25 ㎍/㎖ CD45 마우스 단일클론 항체 클론 2B11 + PD7/26(Dako)으로 1시간 동안, 이어서 Leica Bond Protocol F에 대하여 10분의 1:200 Tyramide Alexa Fluor 488 검출(Life Technologies)과 함께 0.03 ㎍/㎖ 메소텔린 토끼 단일클론 클론(Cell Signaling)으로 1시간 동안 Leica Bond RX (Leica Biosystems)에 대한 순차적인 이중 면역형광에 대해 염색하였다. 각각의 염색 전에 상기 절편을 Leica Bond ER2 버퍼(Leica Biosystems)로 100℃에서 20분 동안 전처리하였다. 염색 후, 상기 절편을 20× 대물렌즈를 갖는 Vectra 3.0 다중스펙트럼 현미경(Perkin Elmer)을 이용해 디지털 스캔을 하기 위하여 Mowiol로 마운팅하였다.
종양 조직학 및 면역염색. 파라핀-포매된, 4% 파라포름알데히드-고정된 조직 샘플의 헤마톡실린 및 에오신 염색 후에 종양의 조직병리학적 평가를 수행하였다. Ventana 플랫폼을 이용하여 마우스 항-인간 메소텔린 IgG(1:100; Vector Labs, Burlingame, CA)로 인간 메소텔린에 대한 면역조직화학 분석을 수행하였다. 임상 데이터를 모르는 병리학자에 의해 다음과 같이 메소텔린의 등급화를 수행하였다: 0(염색 없음), 1(약한 발현), 2(보통의 발현), 및 3(강한 발현). 단일 코어에서 발견되는 메소텔린-양성 종양 세포 대 모든 종양 세포를 0(없음), 1(1%-50%), 및 2(51%-100%)로 등급화하였다.
MRI. 400 mT/m 구배 코일 및 32-㎜ ID 주문 제작 새장형 공명장치가 장착된 Bruker 4.7T USR 스캐너(Bruker Biospin, Ettlingen, Germany)를 이용하여 MRI를 수행하였다. 호흡-유도 움직임 인공물(artifact)을 감소시키기 위하여 동물 호흡에 의해 촉발되는 RARE 신속 스핀-에코 시퀀스[반복 시간(TR) = 1.7초, 에코 시간(TE) = 40밀리초, 및 12 평균]를 이용해 가슴 축 MRI 이미지를 수득하였다. 슬라이드 두께는 0.7 ㎜였고, 플레인-내(in-plane) 이미지 해상도는 117×156 ㎜였다. Bruker ParaVision Xtip 소프트웨어(Bruker Biospin)를 이용해 각각의 슬라이스에서 종양 경계면을 투사한 후, 각각의 슬라이드에서 종양 영역의 면적을 계산함으로써 종양 부피(㎣)를 측정하였다.
BLI. BLI를 사용하여 비침습적으로 종양 부하를 이미지화하였다. 150 ㎎/㎏의 용량으로 D-루시페린을 마우스에 복강내 주사하였다. 15분 후, IVIS 스펙트럼 생체내 이미징 시스템(PerkinElmer)을 이용하여 마우스의 등쪽 및 복부 위치에서 종양 생체발광을 측정하였다. 등쪽 및 복부의 평균 총 플럭스를 초 당 광자로 BLI 신호로서 기록하였다.
마우스 혈장 샘플에서 사이토카인의 정량화. 독성학 연구로부터 마우스의 서브세트에서 혈장 중 사이토카인 레벨을 10-플렉스 V-Plex 마우스 전염증성 패널 1 분석법(Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD)을 이용해 정량하였다. 다음의 사이토카인을 분석하였다: IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, KC/GRO, 및 TNF-α. 이용가능하다면, 60 ㎕의 혈장을 2배 희석하고, 2중으로 웰에 플레이팅하였다. 결과(샘플 당 n=2)를 혈장 1 밀리미터 당 피코그램으로 기록하였다. MSK의 면역 추적 시설(I㎜une Monitoring Facility)에 의해 사이토카인 정량화를 수행하였다.
B. 인간 조직 메소텔린 및 시험관내 CAR T-세포 연구
B.1. 종양 및 정상 조직에서 메소텔린 발현
공개된 연구는 정상 흉막, 복막, 및 심막에서 매우 낮은 메소텔린 발현을 관찰하였다. 메소텔린 면역조직화학 분석을 이용하여 정상 조직 대조군과 함께 MPM, 폐 선암종, 및 3중-음성 유방암 인간 조직에서의 대규모 연구를 수행하였다(Kachala et al., Clin Cancer Res. 2014;20(4):1020-1028; Servais et al., Clin Cancer Res. 2012; Rizk et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2012;21(3):482-486). 도 25a 내지 도 25c에 나타낸 것과 같이, 메소텔린은 정상 조직과 비교하여 인간 MPM 및 폐 암종에서 과발현되었다(도 25a 참조). 메소텔린은 폐 선암종의 69%에서 과발현되었고, 정상 폐에서는 발현되지 않았다(도 25b 참조). 유사하게, 메소텔린은 정상 유방 조직에서는 발현되지 않았지만 3중-음성 유방암에서는 과발현되었다(도 25c 참조).
B.2. M28z1XXPD1DNR을 이용한 인간 T 세포의 형질도입
안정한 293T RD114 세포주로부터 수득된 M28z1XXPD1DNR 또는 mycM28z1XXPD1DNR을 암호화하는 바이러스 상등액을 적정하여 유세포분석에 의해 인간 T 세포의 형질도입 효능을 평가하였다. T 세포를 CAR 및 PD1DNR로 성공적으로 형질도입하였고, 바이러스 상등액의 테스트된 희석에 대하여 32% 내지 73% CAR 및 22% 내지 64% PD1(PD1DNR 및 내인성 PD1 발현을 포함함) 범위의 공여자-의존적 표면 발현 레벨을 보였다(도 26 참조). CAR 및 PD1DNR은 P2A 자가-절단 펩티드에 의해 매개된 양시스트론성 전이유전자 발현으로 인해 비례해서 발현되었다.
B.3. 벡터 사본 수(VCN)
M28z1XXPD1DNR으로 인간 T 세포를 성공적으로 형질도입한 후, 다음으로 CAR 발현 및 T-세포 게놈 내에 통합된 벡터 사본 사이의 상관관계를 분석하였다. 다중 공여자 및 M28z1XXPD1DNR 또는 mycM28z1XXPD1DNR을 암호화하는 바이러스 상등액의 희석에 걸쳐서 CAR-양성 세포의 MFI 및 VCN 사이에 밀접한 상관관계가 나타났으며, 0.89 내지 0.99 범위의 R2 값을 생성하였다(도 27 참조). 형질도입 효율 및 VCN은 공여자-의존적인 것으로 나타났지만, 특히 형질도입 효율>70%에 대해서는 높은 VCN(>5/세포)이 관찰되었고, 특히 형질도입 효율<35%에 대해서는 낮은 VCN(<1/세포)이 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 삽입성 돌연변이화의 높은 위험성을 방지하고 T 세포의 효율적인 형질도입을 보장하기 위하여, 본 발명자들은 모든 구조체에 대해 바이러스 상등액을 적정하여 모든 후속 시험관내 및 생체내 실험에 대해 35%-70% 범위의 형질도입 효율을 생성하였다.
B.4. M28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 PD1 세포외 도메인을 과발현한다.
M28z1XXPD1DNR로 형질도입된 인간 T 세포는 세포내 PD1 신호전달 도메인이 없는 유인용 수용체인 PD1DNR을 발현한다. mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포 및 mycM28z CAR T 세포에서의 상대적 PD1 단백질 표면 및 mRNA 발현을 각각 유세포분석 및 qPCR에 의해 조사하였다. 비교할 만한 CAR 표면 발현(64%-70%, 도 28a 참조)에서, 세포-표면 PD1 염색은 mycM28z CAR T 세포와 비교하여 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포에 대해 양성 세포 백분율(2배) 및 강도(3.4배) 모두에서 더 높은 PD1 레벨의 검출을 유도하였다(도 28b 및 도 28c 참조). PD1 세포-표면 발현의 검출은 PD1DNR뿐만 아니라 내인성 PD1에서도 존재하는 세포외 도메인에 한정하였다. 따라서, PD1 세포외 도메인의 더 높은 표면 발현은 PD1DNR의 발현에 의해 초래되고 이를 시사하지만, PD1DNR 및 내인성 PD1 사이를 식별하는 것은 세포-표면 레벨에서는 가능하지 않았다.
PD1DNR 및 내인성 PD1의 발현에서의 차이점을 추가로 분석하기 위하여, qPCR에 의한 상대적 mRNA 발현을 조사하였다. PD1DNR의 발현 및 내인성 PD1의 발현 사이를 구별하기 위하여, PD1 세포외 및 세포내 도메인에 대해 특이적인 프라이머를 디자인하였고, 비-형질도입된 T 세포와 비교하여 mycM28z1XXPD1DNR 및 mycM28z CAR T 세포의 PD1 세포외 및 세포내 도메인 모두의 mRNA 발현을 측정하였다. mycM28z CAR T 세포는 PD1DNR을 발현하지 않았고, 따라서 세포외 대 세포내 도메인의 등몰(equimolar) 비로 내인성 PD1만을 발현한다. 세포내 도메인의 발현은 내인성 PD1에 국한되지만, 세포외 도메인은 PD1DNR 및 내인성 PD1 모두에 의해 발현된다. mycM28z CAR T 세포는 비-형질도입된 T 세포와 비교하여 PD1 세포외 및 세포내 도메인을 4배 더 높은 레벨로 발현하는 것으로 나타났다. 그러나, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 PD1 세포외 도메인의 157배 상향조절을 나타내었다; 비-형질도입된 T 세포는 PD1 세포내 도메인의 2배 상향조절만을 나타내었다(도 28d 참조).
요약하면, 상기 데이터는 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포에서 내인성 PD1과 비교하여 mRNA 레벨 및 단백질 레벨 모두에서 PD1DNR이 과발현됨을 확인한다. 상기 소견은 T 세포-내재적 체크포인트 차단에 대한 근거를 제공한다.
B.5. myc-태그를 갖거나 갖지 않는 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 기능적 비교
CAR 발현의 검출을 용이하게 하기 위하여, M28z1XXPD1DNR CAR T 세포를 항-메소텔린 scFv의 N-말단에 융합된 myc-태그를 이용해 생성하여 mycM28z1XXPD1DNR을 생성하였다. myc-태그가 CAR 기능을 간섭하는 임의의 가능성을 배제하기 위하여, M28z1XXPD1DNR(태그 없음) 및 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포 사이의 항-종양 효능의 머리-대-머리(head-to-head) 비교를 수행하였다. 유사한 형질도입 레벨(37%-63%, 항-인간 F(ab')2 단편-특이적 염소 F(ab')2 단편으로 염색된 세포의 유세포분석에 의해 결정됨)로 M28z1XXPD1DNR 및 mycM28z1XXPD1DNR 모두로 형질도입된 3명의 독립적 공여자로부터 제조된 인간 T 세포는 상이한 E:T 비에서 MGM 표적 세포의 동역학 및 총 살상에 있어서 차이를 나타내지 않았다(도 29 참조).
B.6. mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 항원-특이적, HLA-비의존적 종양 용해를 매개한다.
메소텔린 발현을 갖거나(GM) 갖지 않고(G), 또한 구성적 PD-L1 발현을 갖는 인간 중피종 세포(MSTO-211H)를 포함하는 종양 세포주의 패널에 대하여 mycM28z1XXPD1DNR 대 mycM28z CAR T 세포의 세포독성 활성을 51Cr-방출 분석법에 의해 결정하였다. 아래의 세포독성 분석법 결과에 나타낸 것과 같이, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 다중 E:T 비에서 메소텔린-발현 종양 세포와 함께 18시간 공-배양하였을 때 MGM 및 MGM-PDL1 표적과, 이와 유사하게 mycM28z CAR T 세포를 효율적으로 살상하였다(도 30 참조). 메소텔린에 대해 음성인 MSTOG 종양 세포에 대하여 mycM28z1XXPD1DNR 또는 mycM28z CAR T 세포에 의한 비특이적 살상은 관찰되지 않았다. 비-형질도입된 T 세포는 표적에 대한 어떠한 살상도 나타내지 않았다. 상기 결과는 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포가 메소텔린-특이적 및 HLA-비의존적 방식으로 표적 세포를 살상함을 확인한다.
B.7. mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포가 축적된다.
유도가능한 PD-L1 발현(MGM) 또는 구성적 PD-L1 발현(MGM-PDL1)을 갖는 메소텔린-발현 종양 세포에 의한 반복된 항원 자극에 대해 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포가 T-세포 축적을 지속하는지 여부를 조사하기 위하여, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 확자을 정량하였고, mycM28z CAR T 세포의 경우와 비교하였다. 6회의 반복된 항원 자극의 과정에 걸쳐서, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 mycM28z CAR T 세포와 유사하게 최대 622배까지 확장하였다(도 31 참조).
B.8. 반복된 항원 자극시의 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 항-종양 효능
1번째 항원에 노출시, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 mycM28z CAR T 세포와 비교하여 MGM 및 MGM-PDL1 표적 세포에 대해 E:T 비-의존적 세포독성을 나타내었지만, 세포독성에 있어서 차이를 보이지는 않았다(도 32 참조). 계속된 항원 노출(또는 높은 항원 스트레스) 동안에 mycM28z1XXPD1DNR 및 mycM28z CAR T 세포의 세포독성 능력을 조사하기 위하여, CAR T 세포를 4 사이클 동안 3:1의 E:T 비에서 48시간마다 조사된 MGM 또는 MGM-PDL1 표적 세포와 함께 반복적으로 공-배양하였다. 3번째 사이클의 종료시, CAR T 세포의 샘플을 51Cr 세포독성 분석법에서 4번째 항원 자극을 거쳤다. mycM28z1XXPD1DNR 및 mycM28z CAR T 세포는 4번째 항원 자극 동안에 비교할 만한 세포독성을 입증하였다(도 33 참조).
고형 종양에서 높은 종양 부하를 모방하여 항원 스트레스를 추가로 증가시키기 위하여, 이후 CAR T 세포를 5번째 및 6번째 항원 자극 사이클에서 1:1의 E:T 비에서 표적 세포와 함께 공-배양하였다. 6번째 사이클의 종료시, CAR T 세포의 다른 샘플을 수집하였고, 51Cr 세포독성 분석법에서 7번째 항원 자극의 사이클을 거쳤다. 7번째 항원 자극시 세포독성은 양쪽 표적 세포주에 대하여 mycM28z CAR T 세포의 경우에 상당히 감소하였다. 이와 대조적으로, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 표적 세포에 대한 세포독성을 유지하였다. mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 mycM28z CAR T 세포와 비교하여 높은 구성적 PD-L1 발현과 함께 표적 세포에 대해 더 뛰어난 종양 세포 살상을 나타내었지만(도 33 참조), 세포독성은 처음 및 4번째 항원 자극과 비교하여 감소되었다. 총괄적으로, 상기 데이터는 mycM28z CAR T 세포는 만성 항원 노출에 대한 고갈적 상태에 도달하였지만, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 높은 항원 스트레스의 환경에서 조차도 항-종양 활성을 유지할 수 있음을 시사한다. 상기 관찰된 효과는 공여자, E:T 비, 및 종양 및 CAR T 세포 사이의 공-배양 시간과 같은 생물학적 파라미터에 의존하였다.
B.9. mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포에 의한 표적-자극된 사이토카인 방출
반복된 항원 자극시 mycM28z1XXPD1DNR 및 mycM28z CAR T 세포에 의한 이펙터 사이토카인의 분비를 루미넥스 분석법에 의해 평가하였다. mycM28z1XXPD1DNR 및 mycM28z CAR T 세포는 모두 1번째 항원 자극 후 높은 레벨의 IL-2, IFN-γ, 및 TNF-α를 분비하였다. 그러나, 이펙터 사이토카인 분비는 반복된 항원 자극시 CAR T 세포 모두에서 감소하였다(도 34 참조).
C. 생체내 연구
C.1. ffLuc 종양 세포에 의해 시각화된 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 항-종양 효능
동소성 모델을 이용하여, 종양 부하 및 동물 생존을 측정함으로써 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 특이성 및 강도를 조사하기 위하여 마우스에서 일련의 생체내 실험을 수행하였다. 일련의 BLI를 이용하여 종양의 확립을 확인하고, T-세포 치료법을 시작하기 전에 개입군에 걸친 종양 부하를 동등하게 하고, 후속해서 치료법에 대한 반응을 측정하였다.
mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 항-종양 효능을 조사하기 위하여, 단일 저용량의 3×104 CAR T 세포를 동소성 MGM 종양으로 접종 후 13일에 암컷 NSG 마우스 내로 흉막내 투여하였다. 상기 저용량은 CAR T 세포에 의해 직면한 높은 종양 항원 부하를 모방하기 위한 목적으로 선택하였다. P28z CAR T 세포를 받은 대조군 마우스와 비교하여, 단일 용량의 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스는 T-세포 투여 후 15일에 종양 부하에 있어서 상당한 감소를 보였다(p=0.0002)(도 35 참조). 예상한 것과같이, 치료 후 15일까지 P28z CAR T 세포로 투여된 마우스는 높은 종양 부하로부터 빈사되기 시작하였지만, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포를 받은 마우스에서는 독성의 징후가 관찰되지 않았다.
단일 용량의 3×104 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포/마우스(1.2×106 내지 1.5×106 세포/㎏으로 해석됨; 마우스 중량, 20-25 g)에서 효능 및 종양 근절이 관찰되었으므로, 본 발명자들은 마우스에서 독성을 연구하기 위하여 3-4배까지 용량 레벨을 증가시키도록 선택하였다(본 실시예의 섹션 3에 기록됨(제목: "비임상 독성학")).
후속 실험에서, 확립된 MGM-PDL1 흉막 종양을 갖는 암컷 NSG 마우스를 종양 접종한 후 11일에 마우스 당 1×105 또는 5×104 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포(E:T 비, 1:1000 내지 1:2000; 2.5×106 내지 5×106 세포/㎏; 평균 마우스 중량, 20 g)의 단일 흉막내 투여, 또는 대조군으로서 1×105 mycM28z CAR T 세포/마우스로 처리하였다. E:T 비는 본 발명자들에 의해 이전에 기술된 것과 같이 종양 부하 정량화로부터 추정하였다(Servais et al., Curr Protoc Pharmacol. 2011;Chapter 14:Unit14 21; Servais et al., PLoS One. 2011;6(10):e26722).
D-루시페린(ffluc에 대한 루시페린)을 이용한 일련의 종양 이미징은 CAR T-세포 투여 후 5일만큼 빨리 BLI에 의한 종양 부하의 감소를 보였으며, 1×105 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우수의 경우 대략 19일에, 그리고 1×105 mycM28z CAR T 세포로 처리된 마우스의 경우 대략 26일에 종양이 완전히 근절되었다(배경 BLI 신호)(도 36a 및 36b). 처리되지 않은 마우스는 처리 시작 후 9-12일에 빈사되었다(도 36b 참조). 68일에 연구를 종료할 때까지 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포(용량, 1×105 및 5×104)에 의한 종양 근절이 유지되었다. 그러나, 빈사 상태 및 중량 감소로 인해 68일 이전에 희생된 mycM28z CAR T 세포로 처리된 마우스에서, 부검은 종양의 존재를 보였다. 양쪽 용량의 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스는 연구 기간에 걸쳐서 선형 방식으로 중량을 얻었지만, mycM28z CAR T 세포로 처리된 마우스는 연구 종료될 때 중량을 잃었다(도 36c 참조). 중앙 생존은 처리되지 않은 마우스의 경우 12일이었고, 1×105 mycM28z CAR T 세포로 처리된 마우스의 경우 50일이었다; 중앙 생존은 양쪽 용량의 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스의 경우 도달하지 않았다(도 36d 참조). 생존은 mycM28z CAR T 세포로 처리된 마우스와 비교하여 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스의 경우에 현저하게 연장되었다(1×105 mycM28z CAR T 세포에 비해 5×104 mycM28z1XXPD1DNR의 경우 p=0.0085 및 1×105 mycM28z1XXPD1DNR의 경우 p=0.0427). 독성의 명확한 임상 징후는 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스에서 관찰되지 않았다.
C.2. 원발성 종양에서 mycM28z1XXPD1DNR CAR T-세포 검출
마우스의 서브그룹에서, 5×105 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포, mycM28z CAR T 세포, 또는 비-형질도입된 T 세포를 MGM 흉막 종양-보유 NSG 마우스 내로 흉막간 주사한 후, 흉막 종양을 주사-후 3일에 단리하였고, 면역형광을 이용하여 인간 CD45 및 인간 종양 메소텔린 염색에 의한 인간 T-세포 침입에 대해 분석하였다.
비-형질도입된 T 세포로 처리된 마우스 중에서, 소수의 비-형질도입된 T 세포만이 종양 주변 및 실질에서 발견되었지만, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포 및 mycM28z CAR T 세포는 종양주위 영역 및 종양과 종양주위 영역 사이의 계면에서 더 높은 밀도로 발견되었다(도 37 참조). 상기 데이터는 국지적으로 (흉막내로) 투여된 메소텔린-표적화 T 세포는 종용주위를 강화하고 종양 주변으로부터 종양 내로 침입함을 제시한다.
C.3. 생체내에서 종양 재도전시 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 항-종양 활성
mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 기능의 지속성을 조사하기 위하여, 단일 흉막내 용량의 1×105 mycM28z1XXPD1DNR 또는 mycM28z CAR T 세포로 처리된 흉막 MGM-PDL1 종양을 갖는 마우스(n=5)를 증가하는 용량의 MGM 종양 세포로 복강내에 재도전하였다. 재도전은 흉막내 T-세포 투여 후 68일에 시작하였고, 이후 2×106 종양 세포의 재도전 용량으로 시작하여 흉막 종양을 근절하였다. 매 4-8일마다 총 10회의 재도전에 걸쳐서 종량 용량을 11×106 종양 세포까지 증가시켰다(도 38a 참조). 종양 재도전은 각각의 종양 투여 직후 BLI 신호에서의 증가와 연관되었고, 이후 BLI가 감소되었는데, 이는 T 세포-매개성 종양 축소를 시사한다(도 38b 참조). BLI 피크 신호는 후속하는 증가하는 용량의 종양 세포 이후에 증가하였고, mycM28z CAR T 세포로 처리된 마우스는 동일한 용량의 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스와 비교하여 BLI 신호에서 상당히 더 높은 증가를 보였다. 특히, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스에 대한 BLI 신호는 각각의 종양 재도전 직후에 피크였지만, 가장 높은 재도전 용량에서 조차도 기준선 BLI 신호로 되돌아 갔다(도 38b 참조). 이와 대조적으로, mycM28z CAR T 세포로 처리된 마우스는 최대 5회까지의 종양 재도전 동안에 BLI에서의 초기 증가 이후에 BLI 신호에 있어서 감소를 보였지만, 결국 더 높은 종양 용량 이후에 종양 재확립을 제어하기 위한 그 능력을 상실하여서, BLI 신호 및 종양 부하에서의 계속적인 증가 및 빈사 상태를 유도하였다. mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 단일 흉막내 용량의 1×105 CAR T 세포 후 >126일에서 조차도 임의의 명확한 독성의 임상 징후 없이 10회의 반복된 도전 동안에 복강내 종양 확립에 저항하였다. 상기 데이터는 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포가 흉막 공간에서 국소적으로뿐만 아니라 신체 내의 원거리 위치에서도 종양을 제어할 수 있음을 시사한다. 생체내에서, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 반복된 항원 도전을 통한 만성 항원 노출시에 기능을 유지하였고, 장기간 지속되었지만, mycM28z CAR T 세포는 반복된 항원 재도전시 기능장애가 되었고, 이는 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 뛰어난 기능의 지속성 및 향상된 장기간의 항-종양 활성을 시사한다. 본 발명자들은 상기 향상된 효능이 이식편대숙주 질환으로 인한 것은 아님을 확인하였다. 본 발명자들은 비-항원-발현 표적에 투여하였고, 항-종양 반응 없이 종양 BLI에서 증가를 나타내었으며, 이는 항-종양 효능이 항원-특이적임을 확인하였다.
C.4. 임상-등급 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 항-종양 효능
본 연구의 목적은 MSK 세포 치료법 및 세포 조작 시설(CTCEF)에 의해 생성된 냉동보존된 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 항-종양 효능을 검증하기 위한 것이었다. 흉막내 주사 전에, M28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 냉동보존된 분액(aliquot)을 10% FBS를 갖는 RPMI-1640에서 해동하였고, FBS가 없는 RPMI-1640에서 2회 세척하였고, 주사용 비히클로서 FBS가 없는 RPMI-1640에 재현탁시켰다. 해동 후 주사 전에 CAR T 세포의 생존력은 아크리딘 오렌지/프로피디움 아이오다이드 염색에 의해 88%로 결정되었다. CAR T 세포를 6×104 또는 2×105의 살아있는 CAR T 세포/마우스(n=8-10)의 용량으로 흉막 MGM 종양을 보유하는 암컷 NSG 마우스 내로 흉막내 주사하였다. 일련의 종양 BLI는 2×105 CAR T 세포로 처리된 마우스의 경우 16일까지 종양 근절을 나타내었다(도 39a 참조). 6×104 CAR T 세포로 처리된 마우스는 29일까지 종양 축소 및 근절을 보였다(도 39a 참조). 처리군의 경우에는 중량 감소가 관찰되지 않았지만, 처리되지 않은 종양-보유 마우스는 중량이 손실되었고, 처리 시작 후 19일 이내에 죽었다(도 39b 및 도 39c 참조). CAR T 세포-처리 마우스의 경우 독성은 관찰되지 않았고, 처리된 마우스는 관찰 기간이 종료되었을 때 100% 생존하였다(70일, 도 39c 참조). 본 연구는 제안된 임상 시험에 대해 생산된 벡터 스톡을 이용하여 제조된 냉동보존된 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포가 해동 후 높은 생존력이 있음을 입증하고, 생체내에서 항-종양 효능을 나타내었으며, 마우스에서 잘 용인되었음을 확인하였다.
3. 비임상 독성학
A. 비임상 안전성 연구의 요약
M28z1XXPD1DNR CAR T 세포 결합 및 활성은 인간 메소텔린에 특이적이고, 따라서 비임상 안전성 연구를 수행하기 위한 이상적인 약리학적 관련 종은 없다. 부가적으로, 표적 항원의 발현 패턴에서의 변동성 및 제거 메커니즘에서의 차이점 및 면역적격 마우스에서의 CAR과 같은 인간 폴리펩티드의 면역원성은 인간에서 CAR T 세포의 독성을 예측하기 위한 동물의 유용성을 방해한다. M28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 인간 메소텔린을 발현하는 동소성, 면역-결핍 마우스 모델에서 적절한 약역학적 효과(사이토카인, 축적, 종양 축소)를 갖고 있기 때문에, 본 발명자들은 본 이종이식 모델에서 안전성 연구를 수행하였다. 이것은 항-종양 평가 코어 시설(Antitumor Assessment Core Facility)에 의해 MSK에서 수행된 우수 실험실 관리기준(GLP) 연구였다. 본 연구의 디자인, 방법, 및 결과는 본 섹션에서 논의된다.
본 연구를 위해 선택된 CAR T 세포의 용량은 1×105 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포였다. 상기 용량은 본 발명자들의 전임상 마우스 모델에서 동소성 중피종 종양의 치료를 위해 테스트된 최소 효과 용량(3×104 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포)보다 3-4× 더 높았기 때문에 선택하였다. 중요하게는, 상기 CAR T 세포의 선택된 용량(1×105 세포/마우스 또는 5×106 세포/㎏)은 현재의 연구에서 제안된 출발 용량(1×106 세포/㎏)보다 5× 더 높다. 본 발명자들의 공개된 연구에서, 40,000 내지 50,000 CAR T 세포의 용량으로 PD1DNR을 갖는 메소텔린-표적화 CAR(Cherkassky et al., J Clin Invest. 2016;126(8):3130-3144)은 동소성 흉막 중피종을 갖는 마우스에서 높은 흉막 종양 부하를 근절하는 것으로 나타났다.
상기 CAR T 세포를 흉강에 중피종 이종이식물을 갖는 NSG 마우스 내로 흉막내 주사를 통해 1회 운반하였다. 흉막내 투여가 초기에 흉강으로만 제한되는 항체와 같은 다른 제제와 달리, 마우스 및 인간 모두에서 흉막내로 투여된 CAR T 세포는 하루 또는 이틀 이내에 전신으로 순환하고, 흉강에만 제한되지 않는 것으로 나타났다(Adusumilli et al., Sci Transl Med. 2014;6(261):261ra151; Cherkassky et al., J Clin Invest. 2016;126(8):3130-3144; Adusumilli et al., Cancer Res. 2019;79(13)). 특히, 본 발명자들은 마우스 및 인간 모두에서 흉막내로 투여된 CAR T 세포가 항원을 활성화시키고, 짧은 기간 이내에 초기 투여된 용량보다 5-10배 더 많이 증식하여서(Adusumilli et al., Sci Transl Med. 2014;6(261):261ra151; Cherkassky et al., J Clin Invest. 2016;126(8):3130-3144), 본 연구에서 테스트된 CAR T 세포의 실제 수가 짧은 기간 이내에 초기 투여된 용량보다 5-10배 더 많음을 관찰하였다.
다음의 고려사항들은 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 인간 안전성을 평가함에 있어서 중요하다.
1. CAR T 세포를 이용한 기존의 인간 경험은 과장된 약리학이 추적가능하고 관리가능한 부작용의 주된 원인임을 시사한다. 본 발명자들의 I상 임상 연구에서는 메소텔린-표적화 CAR T 세포의 표적-내, 종양-외 독성과 연관된 부작용은 발표되지 않았다(Adusumilli et al., Cancer Res. 2019;79(13)).
2. 시험관내 연구에서, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 약리학적 활성은 표적 세포 표면의 메소텔린의 발현과 연관된 것으로 관찰되었다.
3. 본 발명자들의 MPM의 동소성 모델에서, MPM 종양을 보유하는 마우스에서 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 단일 흉막내 주사 후에 특이적 세포독성 및 증가된 생존이 관찰되었다. mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리하지 않으면, 마우스는 종양 이식 20-22일 이내에 죽었을 것이다. 7일 이내에, 종양 부하는 상당히 감소되었고, 동물은 68일을 넘어 치유되어 남아 있었다; 이와 대조적으로, 처리되지 않은 대조군은 12일의 중앙 생존을 가졌고, mycM28z-처리 대조군은 50일의 중앙 생존을 가졌다.
사망률, 발병률, 중량, 임상 징후, 혈액학 및 임상 화학, 육안 부검, 및 조직학적 평가를 무작위로 대조군 및 처리군으로 할당된 8일령의 동소성 MGM 종양을 갖는 96마리(48마리 수컷 및 48마리 암컷) NSG 마우스(The Jackson Laboratory)에서 평가하였다. RPMI-1640에서 1×105 세포/마우스(대략 5×106 세포/㎏)의 용량을 선택하였으며, 이는 상기 모델에서 시험관내 및 생체내 원리-검증(proof-of-principle) 실험에서 결정된 근사적인 최소 유효 용량(3×104 세포/마우스)의 적어도 3-4×에 해당한다. 상기 용량 및 부검 요법을 합리적으로 선택하였다: (a) 더 높은 초기 테스트 용량이 용량 투여의 임의의 즉각적인 뜻밖의 효과를 허용할 수도 있지만(이러한 효과는 진행 중인 임상 시험에서는 보이지 않았음), 생물학 및 약리학은 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 기능의 지속성 및 증식을 반영하지 않는다(즉, 고형-종양 미세환경에서, 고용량-유도 종양 근절의 섬광 동역학에서보다 연장된 기간 동안 종양/신체에 상대적으로 더 높은 수의 CAR T 세포가 존재하게 하는 것이 중요하다), 및 (b) (이전 실험으로부터의 BLI 또는 부검에 의해 입증되는 것과 같이) 종양은 이 시점에서 현저하게 축소되거나 근절되었기 때문에 14일이 선택되었다(Adusumilli et al., Sci Transl Med. 2014;6(261):261ra151; Cherkassky et al., J Clin Invest. 2016;126(8):3130-3144). 이 시점에서의 희생 및 부검은 높은 메소텔린 발현을 갖는 종양 부하의 부재시 피크 CAR T-세포가 확장된 이후에 낮은 레벨의 메소텔린의 발현을 갖는 정상 조직, 구체적으로 흉막, 복막, 및 심막에 대한 임의의 표적-내, 종양-외 효과(본 발명자들의 CAR에서 사용된 scFv는 마우스 메소텔린과 반응함)를 조사할 수 있게 한다(Feng et al., Mol Cancer Ther. 2009).
mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포 또는 대조군 비히클을 연구 1일(수컷 마우스) 또는 연구 2일(암컷 마우스)에 동소성 주사를 통해 1회 투여하였다. 연구 -8일 이전에 주 당 2회 모든 동물의 사망률 및 발병률을 관찰하였고, 이후 연구 1일이 될 때까지 (주중에) 매일 추적하였다. 투여한 후, 연구가 끝날 때까지(연구 15일) 동물을 매일 추적하였다. 연구 -8일 이전에 주 당 2회 체중을 기록하였고, 이후 연구 1일이 될 때까지 (주중에) 매일 추적하였다. 투여한 후, 연구가 끝날 때까지(연구 15일) 체중을 매일 기록하였다. 연구 1일 이전에 주 당 2회 임상 징후를 기록한 후, 연구 1일 내지 15일까지 매일 추적하였다. 연구 2일(수컷 마우스의 잠정 희생), 연구 3일(암컷 마우스의 잠정 희생), 연구 14일(수컷 마우스의 최종 희생), 및 연구 15일(암컷 마우스의 최종 희생)에, 이소플루란으로 마우스를 진정시켰고, 혈액학 및 임상 화학을 위해 혈액을 수집하였다. 육안 및 완전한 부검을 위하여, 조직을 수집하였고, 포르말린에 고정하였다. 부검 동안에 어떠한 조직도 버리지 않았다. 부검할 때, 항-종양 평가 코어 시설의 구성원에 의해 각각의 동물의 육안 조사를 수행하였다. 임의의 거시적 병소 또는 다른 비정상 소견을 표준 용어를 이용해 기록하였고, 현미경적 소견과의 연관성을 위해 병리학자에게 제공하였다. 조직병리학적 분석을 위하여, 부검된 동물의 모든 조직을 포르말린에 보존하였다. 적어도 24시간 동안 고정한 후, 조직을 처리하였고 파라핀에 포매하였다. 이후, 파라핀 블록을 4 ㎛로 절편화하였다. 이후, 생성된 염색되지 않은 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 이후, 면허가 있는(board-certified) 병리학자에 의해 조사하기 위하여 슬라이드를 HSRL로 보내었다. 형태학적 진단 이후 표준화된 명명법을 이용하여 병소를 기록하였다. 연구 9일(수컷 마우스) 및 10일(암컷 마우스)에, 마우스의 서브그룹으로부터 혈장을 수집하였고, MSK의 면역 추적 코어 시설에 의해 사이토카인 평가를 수행하였다(비-GLP). 또한, 유세포분석을 통해 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포를 확인하기 위하여 마우스의 서브그룹으로부터 비장 및 종양을 단리하였다(비-GLP). 연구 -1/1일, 7/8일, 및 14/15일에, 동물의 서브그룹을 루시페린(등쪽/복부)을 이용해 이미지화하여 종양 부하 및 테스트 물품 효능을 평가하였다.
본 연구에서는 연구 12일 및 14일(종양 투여 후 20-22일)에 발병률 및 호흡 곤란으로 인해 선별적으로 희생시킨 이미징 코호트에서의 2마리 대조군 동물을 제외하고는 동물에 대한 사망률 또는 발병률이 관찰되지 않았다. 본 발명자들의 실험실에서의 이전의 작업은 대조군 동물이 종양 투여 후 대략 20-22일에 종양 부하로 인해 빈사될 수 있음을 보였다(Servais et al., Clin Cancer Res. 2012; Servais et al., Curr Protoc Pharmacol. 2011;Chapter 14:Unit14 21; Adusumilli et al., Sci Transl Med. 2014;6(261):261ra151; Cherkassky et al., J Clin Invest. 2016;126(8):3130-3144; Servais et al., PLoS One. 2011;6(10):e26722). 따라서, 상기 희생은 계획되지 않은 것이지만 예상 못한 것은 아니었다. 테스트 물품에 대한 사망률 또는 발병률은 추적되지 않았다.
대조군 비히클을 받은 동물은 본 연구 동안에 체중의 점진적인 감소 및 비-종양 대조군 및 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스와 비교하여 현저한 차이를 보였다. 이것은 대조군 동물의 종양 부하의 증가로 인한 것이었다.
mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스의 경우에 현저한 임상 징후는 관찰되지 않았다. 테스트 물품-처리 마우스 1마리는 약간의 딱지를 갖는 것으로 관찰되었는데, 다른 동물들은 영향이 없었고 동물 활성도 정상이었기 때문에, 이것은 외과용 클립에 의해 유발된 자극으로 인한 것이었다. 마우스는 추적 기간 전체에 걸쳐 정상으로 보였다.
제12 군에 있는 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 암컷 마우스(연구 15일에 최종 희생)는 제10 군(종양 대조군 비히클)(평균, 3.34%, n=5)과 비교하여 높은 평균 백분율의 단핵구 값(평균, 18.44%, n=5)(p≤0.0001)을 가졌다. 단핵구 백분율에 대해 확립된 참조 범위는 0.9%-18%이다. 그러나, 이것은 임의의 현미경적 소견과 연관되지는 않았다. 평가된 혈액학 파라미터에 대해 다른 현저한 또는 비정상적인 결과는 관찰되지 않았다. 테스트 물품-처리군 및 대응하는 비히클-처리군 사이의 임의의 차이점은 정상 참조 범위 내이거나, 생물학적으로 관련있거나 통계적으로 유의미하지 않았다.
제11 군에 있는 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 수컷마우스(연구 14일에 최종 희생)는 제9 군(종양 대조군 비히클)(평균, 4.68 g/dL, n=4)과 비교하여 낮은 평균 총 단백질 값(평균, 3.83 g/dL, n=5)(p=0.0022)을 가졌다. 총 단백질에 대해 확립된 참조 범위는 4.1-6.4 g/dL이다. 그러나, 이것은 임의의 현미경적 소견과 연관되지는 않았다. 테스트 물품 투여의 경우 임상 화학 파라미터에 대한 다른 부작용은 관찰되지 않았다. 테스트 물품-처리군 및 대응하는 비히클-처리군 사이의 임의의 차이점은 정상 참조 범위 내이거나, 생물학적으로 관련있거나 통계적으로 유의미하지 않았다.
부검할 때, 종양 조직을 수집하지는 않았지만, 예상한 것과 같이 잠정 희생시에 많은 동물에서 관찰되었다. 최종 희생할 때, 종양 부하는 대조군 비히클 동물에서 명확하였지만, 대부분의 경우 테스트 물품-처리 동물에서는 적거나 종양 초점이 없는 것이 관찰되었다. 개별 동물에 대해 부검할 때의 육안 관찰은 반점이 있는 간(spotted liver), 작은 비장, 청색 정낭, 암녹색 담낭, 청색 담낭, 오일성 신장, 간의 거품, 및 비장의 흰 반점을 포함하였다. 상기 소견 모두 현미경적 소견과 연관이 없었다. 작은 비장은 림프구 고갈로 인한 NSG 마우스 표현형으로 예측된다.
조직병리학적 검토는 테스트 물품 투여로부터 급성 또는 지연된 독성과 관련되어 잠정(연구 2/3일) 및 최종(연구 14/15일) 희생일에 현미경적 소견은 없음을 결정하였다. 제5 군 및 제6 군(테스트 물품; 잠정 희생)에 속하는 동물에 대한 현미경적 소견은 폐에서 이종이식 종양 내에서 혼합된 세포 침입의 존재를 포함하였다. 이것은 테스트 물품 투여와는 연관되지만 임의의 테스트 물품 독성과는 연관되지 않은 것으로 간주되었다. 상기 소견은 흉막내로 처리된 마우스의 원발성 종양에서 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 면역형광 염색에 의한 별도의 연구에서 확인되었다(본 실시예의 섹션 2.C.2 참조). 임의의 다른 관찰된 소견은 대조군에서와 유사한 발생률로 산발적으로 일어난 것으로 결정되거나, 이용된 종/스트레인에서 흔한 것이었다.
연구 -1/1일에 대한 생체내 BLI는 각각의 군에서 모든 동물에 대한 성공적인 종양 투여를 나타내었다. 대조군 비히클 투여 후, 수컷 및 암컷 마우스 군에서 동물에 대한 종양 부하는 각각의 측정 시점에서 증가하였고, 2마리 동물은 발병률로 인해 이른 이미징을 필요로 하였다. 테스트 물품 투여 후, 수컷 및 암컷 마우스 군에서 동물에 대한 종양 부하는 주사 후 1주에 증가됨을 입증하였다; 그러나, 2주 시점에, 상기 부하는 상당히 감소되었다. 인간 T 세포는 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포-처리 마우스에서 흉막내 투여 후 8일에 비장 조직 및 종양에서 검출되었지만 비히클-처리 마우스에서는 그렇지 않았다. 동일한 시점에서 수득된 마우스 혈장 사이토카인 레벨은 비히클 대조군으로 처리된 경우와 비교하여 CAR T 세포로 처리된 마우스에서 약간 상승된 레벨의 IL-4를 보였다. IL-10, IL-6, KC/GRO, 및 TNF-α의 레벨은 일반적으로 낮았고, CAR T 세포를 받은 마우스 및 비히클 대조군을 받은 경우 사이에 현저하게 상이하지 않았다. IFN-γ, IL-12p70, IL-1β, IL-2, 및 IL-5는 검출가능하지 않았다(정량화 한계 이하).
본 연구의 목적은 단일 동소성 주사 이후에 NSG 마우스에서 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 급성 및 지연된 독성을 평가하기 위한 것이다. 연구 전체에 걸쳐서, 체중, 임상 징후, 혈액학, 임상 화학, 및 조직병리학적 데이터를 수집 및 분석하였다. 본 연구의 결과는 중피종 이종이식 모델에서 1×105 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 단일 동소성 투여가 잘 용인됨을 시사한다.
B. 방법
테스트 시스템. [The Jackson Laboratory]로부터의 6-8 주령 수컷 및 암컷 NSG 마우스로 실험을 수행하였다. 종양 군 내의 마우스는 연구 1일(수컷 마우스) 및 연구 2일(암컷 마우스)에 흉막내 주사를 통해 800,000 MGM 세포/마우스를 받았다. 상기 마우스는 주사 후 대략 5-20일에 흉막 질환의 증상이 발생할 것으로 예상된다.
테스트 물품. MSK에서 본 발명자들에 의해 테스트 물품(mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포)을 제조하였다. 건강한 공여자 유래의 PBMC를 2019년 11월 5일에 해동하였고, 2019년 11월 7일에 mycM28z1XXPD1DNR에 대해 암호화하는 레트로바이러스 입자로 형질도입하였다. 주사하기 전에, 형질도입된 PBMC를 10% FBS, 100 유닛/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 및 20 유닛/㎖ IL-2를 갖는 RPMI-1640 배지에서 유지하였다. 2019년 11월 13일(수컷 마우스) 및 2019년 11월 14일(암컷 마우스)의 주사 일에 형질도입된 세포를 모았고, CD3 및 CAR 발현에 대해 유세포분석에 의해 분석하였고, 세척하였고, 비히클(FBS 및 페놀 레드가 없는 RPMI-1640)에서 재현탁하였고, 주사할 때까지 얼음에 보관하였다.
mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포를 5×105 살아있는 CAR T 세포/㎖의 최종 농도로 비히클에 재현탁시켰다. 세포 생존력을 측정하였다. 이후, 제조된 용액을 즉시 사용하기 위해 얼음에서 동물 시설(Animal Facility)로 전달하였다. 사용 준비되고 얼음에 보관된 테스트 물품은 연구 기간 전체를 통해 상기 조건 하에 안정한 것으로 간주하였다. CAR T 세포의 제형화는 무균 조건 하에 실온에서 층류 후드(laminar flow hood) 내에서 본 발명자들의 실험실에서 수행하였다. 투여 전후에 생존력 및 CAR 발현을 결정하였다.
비히클. CAR T 세포 제형의 제조에 사용되고 대조군에 투여하기 위한 비히클은 FBS 및 페놀 레드가 없는 멸균 RPMI-1640 배지(GIBCO, 카탈로그 번호 32404, 로트 번호 2099376)였다. 비히클을 즉시 사용하기 위해 얼음에서 동물 시설로 전달하였다. 사용 준비되고 얼음에 보관된 비히클은, 제조사에 의한 분석 증명서에 의해 뒷받침되는 것과 같이, 연구 기간 전체를 통해 상기 조건 하에 안정한 것으로 간주하였다. 비히클의 제조는 무균 조건 하에 실온에서 층류 후드 내에서 본 발명자들의 실험실에서 수행하였다.
연구 디자인. 연구 1일 이전에 모든 코호트를 무작위로 연구 군으로 나누었다. 도착시, 동물 상자로부터 동물을 무작위로 선별하였고, 아래의 표 9에 개략적으로 나타낸 것과 같이 해당 처리군에 두었다. 마우스는 귀 펀치를 이용함으로써 식별하였다.
종양 군 내의 마우스는 테스트 물품 투여 8일 전에 흉막에서 동소성 주사를 통해 8×105 MGM 세포를 받았다. mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포, 또는 대조군 비히클을 연구 1일(수컷 마우스) 또는 연구 2일(암컷 마우스)에 1회 동소성 주사를 통해 유사하게 투여하였다. 종양 세포, 비히클, 및 테스트 물품은 200 ㎕/마우스의 주사 부피로 투여하였다.
군의 할당
군* 마우스/
군 		성별 마우스 ID# 혈액/조직 수집 부검
잠정 희생(24시간) 2/3일
1. 종양 없음 - 대조군 비히클 3 M 1-3 CBC & Chem 육안
2. 종양 없음 - 대조군 비히클 3 F 4-6 CBC & Chem 육안
3. 종양 - 대조군 비히클 10 M 7-16 CBC & Chem 완전
4. 종양 - 대조군 비히클 10 F 17-26 CBC & Chem 완전
5. 종양 - 테스트 물품 10 M 27-36 CBC & Chem 완전
6. 종양 - 테스트 물품 10 F 37-46 CBC & Chem 완전
최종 희생 14/15일
7. 종양 없음 - 대조군 비히클 3 M 47-49 CBC & Chem 육안
8. 종양 없음 - 대조군 비히클 3 F 50-52 CBC & Chem 육안
9. 종양 - 대조군 비히클 5 M 53-57 CBC & Chem 완전
10. 종양 - 대조군 비히클 5 F 58-62 CBC & Chem 완전
11. 종양 - 테스트 물품 5 M 63-67 CBC & Chem 완전
12. 종양 - 테스트 물품 5 F 68-72 CBC & Chem 완전
TK/사이토카인
13. 종양 - 대조군 비히클 3 M 73-75 종양, 비장, 200 ㎕ EDTA 없음
14. 종양 - 대조군 비히클 3 F 76-78 종양, 비장, 200 ㎕ EDTA 없음
15. 종양 - 테스트 물품 3 M 79-81 종양, 비장, 200 ㎕ EDTA 없음
16. 종양 - 테스트 물품 3 F 82-84 종양, 비장, 200 ㎕ EDTA 없음
이미징
17. 종양 - 대조군 비히클 3 M 85-87 없음 없음
18. 종양 - 대조군 비히클 3 F 88-90 없음 없음
19. 종양 - 테스트 물품 3 M 91-93 없음 없음
20. 종양 - 테스트 물품 3 F 94-96 없음 없음
*군의 설명:
종양 없음 - 대조군 비히클: 비-종양 마우스 + RPMI1640
종양 - 대조군 비히클: MGM 종양을 갖는 마우스 + RPMI1640
종양 - 테스트 물품: MGM 종양을 갖는 마우스 + 1×105 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포
본 연구 전체에 걸쳐서 임상 징후 및 체중을 수집하여 발병률을 평가하였고, 각각 투여 후 1일 및 14일에 급성 및 지연된 독성을 평가하였다. 급성 및 지연 시점에 혈액학, 임상 화학, 및 조직병리학적 데이터를 수집 및 평가하여 테스트 물품 내약성을 결정하였다.
평가된 파라미터
사망률 및 발병률. 모든 동물은 연구 -8일 이전에 주 당 2회 사망률 및 발병률에 대해 관찰하였고, 이후 연구 1일이 될 때까지 (주중에) 매일 추적하였다. 투여한 후, 연구가 끝날 때까지(연구 15일) 동물을 매일 추적하였다.
체중. 연구 -8일 이전에 주 당 2회 체중을 기록하였고, 이후 연구 1일이 될 때까지 (주중에) 매일 추적하였다. 투여한 후, 연구가 끝날 때까지(연구 15일) 체중을 매일 기록하였다.
임상 징후. 연구 1일 이전에 주 당 2회 임상 징후를 기록하였고, 이후 연구 1일부터 15일까지 매일 추적하였다.
혈액학. 연구 2일(수컷 제1, 제3, 제5 군), 연구 3일(암컷 제2, 제4, 제6 군), 연구 14일(수컷 제7, 제9, 제11 군), 및 연구 15일(암컷 제8, 제10, 제12 군)에, 마우스를 이소플루란으로 진정시켰고, 표 10에 나타낸 것과 같은 다음의 측정을 위해 EDTA 튜브에 전혈을 수집하였다:
혈액학 파라미터
호중구 백혈구 카운트
림프구 적혈구 카운트
단핵구 헤모글로빈 농도
호산구 헤마토크릿(hematocrit)
호염기구 평균 혈구 부피
% 호중구 평균 혈구 헤모글로빈
% 림프구s 평균 혈구 헤모글로빈 농도
% 단핵구s 적혈구 분포 폭
% 호산구 혈소판 카운트
% 호염기구 평균 혈소판 부피
임상 화학. 연구 2일(수컷 제1, 제3, 제5 군), 연구 3일(암컷 제2, 제4, 제6 군), 연구 14일(수컷 제7, 제9, 제11 군), 및 연구 15일(암컷 제8, 제10, 제12 군)에, 마우스를 이소플루란으로 진정시켰다. 전혈을 혈청 분리 튜브에 수집하였다. 혈청을 분리하였고, 표 11에 나타낸 것과 같은 다음의 측정을 위해 분석하였다:
임상 화학 파라미터
혈액 요소 질소 콜레스테롤
크레아티틴 알라닌 아미노트랜스퍼라아제
인 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제
칼슘 알칼린 포스파타아제
총 단백질 총 빌리루빈
알부민 나트륨
글로불린 칼륨
알부민/글로불린 비 클로라이드
글루코오스 나트륨/칼륨 비
부검. 연구 2일(수컷 제1, 제3, 제5 군), 연구 3일(암컷 제2, 제4, 제6 군), 연구 14일(수컷 제7, 제9, 제11 군), 및 연구 15일(암컷 제8, 제10, 제12 군)에, 마우스를 CO2 흡입을 통해 안락사시켰다. 제1, 제2, 제7, 및 제8 군에 속하는 동물에 대해 육안 부검을 수행하였고, 제3 내지 제6 및 제9 내지 제12 군에 속하는 동물에 대해 완전한 부검을 수행하였다. 조직을 수집하였고, 포르말린에 고정하였다. 부검 동안에 어떠한 조직도 버리지 않았다.
육안 병리학 관찰. 부검할 때, 항-종양 평가 코어 시설의 구성원에 의해 각각의 동물의 육안 조사를 수행하였다. 임의의 거시적 병소 또는 다른 비정상 소견을 표준 용어를 이용해 기록하였고, 현미경적 소견과의 연관성을 위해 병리학자에게 제공하였다.
조직병리학. 부검된 동물의 모든 조직은 포르말린에 보존하였다. 적어도 24시간 고정한 후, 표 12에 나열된 조직을 처리하였고, 파라핀에 포매하였다(별표로 나타낸 조직은 포매 전에 탈석회화하였다). 이후, 파라핀 블록을 4 ㎛로 절편화하였다. 이후, 생성된 염색되지 않은 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 이후, 면허가 있는 병리학자에 의해 조사하기 위하여 슬라이드를 HSRL로 보내었다. 형태학적 진단 이후 표준화된 명명법을 이용하여 병소를 기록하였다.
현미경적으로 조사된 조직
부신 췌장
뼈(골수)* 직장
뇌(뇌간, 소뇌, 및 대뇌) 침샘
식도 피부
눈 비장
담낭 흉골*
심장 후슬 관절*
서혜부 림프절 위
장(십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장) 고환, 부고환, 정낭, 및 전립선(수컷)
신장 흉선
간 갑상선
폐 혀
장간막 림프절 기관
구강-비강(비인두)* 방광
난소, 자궁각, 자궁, 경부, 및 질(암컷) 척주*
사이토카인 분석(비-GLP). 연구 9일(수컷 마우스) 및 10일(암컷 마우스)에, 제13, 제15 군(수컷), 제14, 및 제16 군(암컷)에 속하는 마우스로부터 EDTA 튜브에 혈액을 수집하였다. 혈장을 분리 및 동결하였다. MSK의 면역 추적 코어 시설에 의해 사이토카인 평가를 수행하였다(비-GLP).
독성동태학: 유세포분석을 통한 CAR T 세포의 확인(비-GLP). 연구 9일(수컷 마우스) 및 10일(암컷 마우스)에, 제13, 제15 군(수컷), 제14, 및 제16 군(암컷)에 속하는 마우스로부터 혈액을 수집하였다. 모든 동물에 대해 육안 부검을 수행하였고, 이때 종양 조직 및 비장을 RPMI 배지에 두었다. 유세포분석을 통해 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포를 확인하기 위하여 샘플을 즉시 본 발명자들에게 제공하였다(비-GLP).
생체발광 이미징. 연구 -1/1일, 7/8일, 및 14/15일에, 제17 내지 제20 군에 속하는 동물을 루시페린을 이용해 이미지화하여(등쪽/복부) 종양 부하 및 테스트 물품 효능을 평가하였다.
통계적 방법. 체중, 혈액학, 및 임상 화학 파라미터에 대해 군의 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 혈액학 및 임상 화학의 경우, 각각의 시점에서 테스트 물품-처리군 및 대응하는 비히클-처리군의 평균 사이의 차이점 백분율을 계산하였다. 상기 차이점의 통계적 유의성을 언페어드 t 테스트를 이용해 분석하였고, p<0.05이면 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다. PDS Life Sciences(Mt. Arlington, NJ)에 의한 전임상 실험실 정보 시스템인 Ascentos Version 1.3.4를 이용하여 통계적 분석을 수행하였다. 1.5 × IQR 테스트를 이용한 잠재적인 이상점(outlier)에 대한 개별 수치 및 실험실에서 확립된 파라미터 참조 범위를 평가함으로써 임상 데이터의 검토를 수행하였다. 이상점인 것으로 결정된 임의의 수치는 통계적 분석으로부터 제거하였다.
C. 결과
C.1. 사망률 및 발병률
본 발명자들에 의한 이전의 작업은 대조군 동물이 종양 투여 후 대략 20-22일에 종양 부하로 인해 빈사될 수 있음을 시사하였다.
이미징 코호트 내의 2마리 대조군 동물(86[제17 군] 및 88[제19 군])은 발병률 및 호흡 곤란으로 인해 연구 12일 및 14일에 선별적으로 희생시켰다. 희생 후 각각의 동물의 육안 부검은 폐 및 심장을 둘러싸는 흉강에서 현저한 종양 부하를 나타내었다. 상기 동물들은 모두 대조군 비히클로 처리되었으며, 예상된 창 내에서 발병률을 나타내었다. 따라서, 상기 희생은 계획되지 않은 것이지만 예상 못한 것은 아니었다. 본 연구에서 임의의 동물에 대한 다른 사망률 또는 발병률은 관찰되지 않았다.
C.2. 체중
군에 의한 평균 체중의 요약은 도 40 내지 도 43에 나타나 있다. 제9 군(대조군 비히클)에 속하는 동물은 연구 동안에 체중에서의 점진적인 감소를 보였고, 연구 14일에 비-종양 대조군(제7 군) 및 테스트 물품 동물(제11 군)과 비교하여 중량에서 상당한 차이를 나타내었다. 이것은 대조군 동물의 증가된 종양 부하로 인한 것이다(도 42 참조). 유사하게, 제10 군(대조군 비히클)에 속하는 동물은 연구 13일에 시작하여 연구가 끝날 때까지 계속해서 제8 군(비-종양 대조군 비히클) 및 제12 군(테스트 물품)과 비교하여 체중에서 상당한 차리를 나타내었다(도 43 참조). 이것은 또한 종양 부하로 인한 것이다. 모든 동물은 수술한 다음 날(수컷 마우스의 경우 2일 및 암컷 마우스의 경우 3일) 체중의 감소를 보였는데, 이것은 수술로 인한 것이다. 비-종양 대조군 및 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포로 처리된 마우스는 수술 후 2-3일 내에 수술 전의 초기 중량을 되찾았고, 나머지 연구 동안에 점진적으로 중량을 얻었지만, 비히클로 처리된 마우스는 수술 후에 체중 회복이 없거나 거의 없었고, 종양 부하의 증가와 동시에 점진적으로 중량을 잃었다(도 42 및 도 43 참조).
C.3. 임상 징후
제17 군(대조군 비히클)에 속하는 동물은 탈모(85, 87) 및 딱지(87)의 징후를 나타내었고, 이것은 우리 내부에서 동물의 공격성으로 인한 것이었다. 동물이 분리되면, 징후는 줄어들었으며, 이는 상기 관찰이 동물의 싸음으로 인한 것임을 시사하였다. 86번 동물은 호흡 곤란을 갖는 것으로 관찰되었고, 연구 12일에 활성이 감소되었는데, 이것은 종양 부하로 인한 것이었고, 선택적으로 희생시켰다. 93번 동물(제19 군, 테스트 물품)은 약간의 딱지를 갖는 것으로 관찰되었다; 그러나, 이것은 외과용 클립에 의해 유발된 자극으로 인한 것이었으며, 우리 내의 다른 동물들은 영향이 없었고, 동물 활성은 정상이었다. 88번 동물(제18 군, 대조군 비히클)은 선별적으로 희생시키기 2일 전에 붉은 눈을 갖는 것으로 관찰되었다. 상기 임상 징후는 종양 부하로 인해 선별적으로 희생시키기 전에 동물이 불편하다는 초기 지표일 수 있다.
본 연구 동안에 다른 현저한 임상 징후는 관찰되지 않았다 - 마우스는 추적 기간에 걸쳐서 정상으로 보였다.
C.4. 혈액학
제12 군(암컷 마우스, 테스트 물품)은 제10 군(종양 대조군 비히클)(평균, 3.34%, n=5)과 비교하여 높은 평균 단핵구 값 백분율(평균, 18.44%, n=5)(p=≤0.0001)을 가졌다. 단해구 백분율에 대해 확립된 참조 범위는 0.9%-18%이다. 그러나, 이것은 임의의 현미경적 소견과 연관되지는 않았다.
평가된 혈액학 파라미터에 대해 다른 현저한 또는 비정상적인 결과는 관찰되지 않았다. 테스트 물품-처리군 및 대응하는 비히클-처리군 사이의 임의의 차이점은 정상 참조 범위 내이거나, 생물학적으로 관련있거나 통계적으로 유의미하지 않았다.
C.5. 임상 화학
제11 군(수컷 마우스, 테스트 물품)은 제9 군(종양 대조군 비히클)(평균, 4.68 g/dL, n=4)과 비교하여 낮은 평균 총 단백질 값(평균, 3.83 g/dL, n=5)(p=0.0022)을 가졌다. 총 단백질에 대해 확립된 참조 범위는 4.1-6.4 g/dL이다. 그러나, 이것은 임의의 현미경적 소견과 연관되지는 않았다.
테스트 물품 투여의 경우에 임상 화학 파라미터에 대한 다른 부작용은 관찰되지 않았다. 테스트 물품-처리군 및 대응하는 비히클-처리군 사이의 임의의 차이점은 정상 참조 범위 내이거나, 생물학적으로 관련있거나 통계적으로 유의미하지 않았다.
C.6. 육안 병리학 관찰
부검할 때, 종양 조직을 수집하지는 않았지만, 예상한 것과 같이 잠정 희생시에 많은 동물에서 관찰되었다. 최종 희생할 때, 종양 부하는 대조군 비히클 동물에서 명확하였지만, 대부분의 경우 테스트 물품-처리 동물에서는 적거나 종양 초점이 없는 것이 관찰되었다. 부검할 때의 부가적인 소견은 아래의 표 13에 상세히 나타낸다.
현미경적 소관과 연관된 거시적 관찰
육안 관찰 관찰된 동물(들)
(군 번호) 		연관된 소견 연관된 테스트 물품?
반점이 있는 간 11(G3 - 대조군 비히클)
32(G5 - 테스트 물품)
59(G10 - 대조군 비히클)
60(G10 - 대조군 비히클)
71(G12 - 테스트 물품)		 현미경적 소견과 연관되지 않음 없음
작은 비장 11(G3 - 대조군 비히클)
16(G3 - 대조군 비히클)
25(G4 - 대조군 비히클)
30(G5 - 테스트 물품)
34(G5 - 테스트 물품)
40(G6 - 테스트 물품)
45(G6 - 테스트 물품)
56(G9 - 대조군 비히클)
58(G10 - 대조군 비히클)
59(G10 - 대조군 비히클)
60(G10 - 대조군 비히클)
65(G11 - 테스트 물품)
71(G12 - 테스트 물품)		 림프구 고갈 - NSG 마우스 표현형의 예상된 요소 없음
청색 정낭 57(G9 - 대조군 비히클) 현미경적 소견과 연관되지 않음 없음
암녹색 담낭 107(G9 - 대조군 비히클) 현미경적 소견과 연관되지 않음 없음
청색 담낭 62(G10 - 대조군 비히클) 현미경적 소견과 연관되지 않음 없음
오일성 신장, 반점 21(G4 - 대조군 비히클)
71(G12 - 테스트 물품)		 현미경적 소견과 연관되지 않음 없음
간의 거품 40(G6 - 테스트 물품) 현미경적 소견과 연관되지 않음 없음
비장의 흰 반점 69(G12 - 테스트 물품) 중등도 화생 - 자연적 소견으로 간주됨 없음
부검 동안에 다른 육안 관찰은 나타나지 않았다.
C.7. 조직병리학
조직병리학적 검토는 잠정(2일) 및 최종(14일) 희생일에 테스트 물품 투여 유래의 급성 또는 지연된 독성과 연관된 현미경적 소견이 없음을 결정하였다.
제5 군 및 제6 군(테스트 물품)에 속하는 동물에 대한 현미경적 소견은 폐에서 이종이식 종양 내에서 혼합된 세포 침입의 존재를 포함하였다. 이것은 테스트 물품 투여와는 연관되지만 임의의 테스트 물품 독성과는 연관되지 않은 것으로 간주되었다. 상기 소견은 흉막내로 처리된 마우스의 원발성 종양에서 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 면역형광 염색에 의한 별도의 연구에서 확인되었다(본 실시예의 섹션 2.C.2 참조).
임의의 다른 관찰된 소견은 대조군에서와 유사한 발생률로 산발적으로 일어난 것으로 결정되거나, 이용된 종/스트레인에서 흔한 것이었다.
C.8. 사이토카인 분석
제13 내지 제16 군으로부터 수집된 혈장 내 사이토카인 레벨(테스트 물품/비히클 투여 후 8일)을 측정하여 처리된 마우스에서 말초 사이토카인 발현에 대한 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포 대 비히클 대조군의 독성을 조사하였다. 다음의 사이토카인을 분석하였다: IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, KC/GRO, 및 TNF-α.
상기 분석으로부터의 결과는 동물들이 CAR T 세포 또는 비히클 대조군을 받았는지 여부와 무관하게 모든 동물에 대해 검출가능하지 않은 레벨의 IFN-γ, IL-12p70, IL-1β, IL-2, 및 IL-5(정량화 한계 이하)를 나타내었다. IL-4는 낮은 레벨로 검출가능하였고, 비히클 대조군을 받은 경우보다 CAR T 세포를 받은 마우스에서 약간 더 높은 레벨을 보인 유일한 사이토카인이었다. 정량화 한계 이상으로 검출된 모든 다른 사이토카인, 예컨대 IL-10, IL-6, KC/GRO, 및 TNF-α의 레벨은 일반적으로 낮았고, CAR T 세포를 받은 마우스 및 비히클 대조군을 받은 경우 사이에 현저하게 상이하지 않았다.
C.9. 종양 및 비장에서 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 확인
mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 주사를 확인하기 위하여, 테스트/비히클 투여 후 8일에 제13 내지 제16 군을 희생시켰다. 비장 및 종양을 단리하였고, 처리하였고, 유세포분석에 의해 인간 T 세포(CD45+ CD3+)에 대해 염색하였다. 인간 T 세포는 모든 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포-처리 마우스 유래의 종양 및 비장 조직에서 검출되었지만 비히클-처리 마우스로부터 유래된 경우에는 검출되지 않았다(도 44 및 도 45 참조).
C.10. 생체발광 이미징
제17 내지 제20 군에 속하는 마우스에 대해 전체 신체 광학 BLI(IVIS)를 수행하여 MGM 종양 부하의 정성적 평가를 제공하였다. 연구 -1/1일로부터의 이미지는 각각의 군의 모든 동물에 대해 성공적인 종양 투여를 나타낸다. 대조군 비히클을 투여한 후, 제17 군(수컷 마우스) 및 제18 군(암컷 마우스)에 속하는 동물에 대한 종양 부하는 각각의 측정된 시점에 증가하였고, 2마리 동물은 발병률로 인해 초기 이미징을 필요로 하였다. 테스트 물품 투여 후, 제19 군(수컷 마우스) 및 제20 군(암컷 마우스)에 속하는 동물에 대한 종양 부하는 주사 후 1주에 증가한 것으로 나타났다; 그러나, 2주 시점에서, 상기 부하는 현저하게 감소하였다. 수컷 및 암컷 마우스에 대한 이미징 결과는 각각 도 46 및 도 47에 나타나 있다.
D. 논의
대규모 약리학 연구를 수행하여 시험관내 및 생체내에서 M28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 항-종양 효능을 결정하였다. 항원으로 자극될 때 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포는 메소텔린-의존적 및 HLA-비의존적 방식으로 표적 세포를 살상하고, 축적하고, 이펙터 사이토카인을 분비하는 것으로 나타났다. 반복된 항원 자극을 이용한 정교한 항원 스트레스 테스트는 분석법의 과정에 걸쳐서 mycM28z CAR T 세포보다 더 긴 세포독성을 유지할 수 있음을 밝혔다. 생체내에서, 반복된 항원 도전은 mycM28z CAR T 세포와 비교하여 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포가 뛰어난 기능의 지속성을 가져서, mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포-처리 마우스의 경우에 증가하는 종양 용량을 이용한 10회의 일련의 종양 재도전에 걸쳐서 연속적으로 종양 축소를 유도하지만, mycM28z CAR T 세포-처리 마우스의 경우에는 결국 종양 진행 및 재발을 유도함을 밝혔다.
동물 약리학 연구는 CAR T 세포의 항-종양 효능을 연구하기 위해 보다 연관성이 있는데, 그 이유는 이것은 시험관내 분석법에서 연구될 수 없는 약리학 및 약물동태학의 중요한 측면들을 아우르기 때문이다. 투여 경로, 종양 부위로의 수송, 림프성 기관으로의 귀소(homing), 전신 순환, 생체내 지속성, 및 사용한 면역손상된 마우스 스트레인의 제한에도 불구하고 종양 면역 미세환경과의 상호작용과 같은 인자들은 궁극적으로 항-종양 효능을 조정한다. 본 발명자들은 인간 질환을 닮은 흉막 중피종과 번역적으로 관련있는 동소성 마우스 모델을 개발하였다(Servais et al., Clin Cancer Res. 2012). 본 발명자들은 T 세포의 국지적(흉막내) 투여가 흉막 질환에 대해서 뿐만 아니라 파종성 종양 부위에 대해서도 대단히 뛰어남을 보였다(Adusumilli et al., Sci Transl Med. 2014;6(261):261ra151). 보다 주요하게는, 진행 중인 임상 시험(IND 16354)에서 관찰된 결과는 본 발명자들의 원래의 동소성 MPM 마우스 모델의 관찰 결과를 반영하며, 임상 관련성을 위한 모델의 타당성을 입증한다(Adusumilli et al., Cancer Res. 2019;79(13)). 본 연구에서, 국지적으로 운반된 단일 저용량의 3×104 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 경우 완전한 종양 근절이 관찰되었고, 표적-내, 종양-외 독성의 징후는 관찰되지 않았다. 2주 회복 기간을 갖는 중피종 이종이식 마우스 모델에서 단일 동소성 용량의 1×105 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 독성 연구는 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포가 잘 용인됨을 확인하였다. 사망률, 임상 관찰, 체중의 변화, 및 육안/거시적 조사에 대한 현저한 소견은 발견되지 않았다. 현미경 조사는 비히클-처리 마우스의 경우에는 발견되지 않았고 mycM28z1XXPD1DNR CAR T 세포의 약리학을 시사하는 혼합된 세포 침입이 이종이식 종양 내부에 있음을 밝혔다. 2주 시점에 처리된 수컷 마우스는 낮은 평균 총 단백질 값을 가졌고, 처리된 암컷 마우스는 높은 평균 단핵구 값 백분율을 나타내었지만, 이들 모두 임의의 현미경적 소견과 연관되지는 않았다.
메소텔린-표적화 CAR T 세포를 포함하는CAR T 세포는 인간에서 평가되었고, 안전하고, T 세포에 의해 유발되는 염증으로 인한 발열, 오한, 근육통, 과민증, 및 아나필락시스와 같은 정의되고 관리가능한 부작용을 갖는 것으로 발표되었다. 복제-적격 레트로바이러스의 위험성은 생성물의 대규모 테스트에 의해 최소화될 것이다. 아울러, 환자 T 세포는 최대 2년까지 또는 질환이 진행될 때까지 12주마다 테스트될 것이다. 환자는 CAR T-세포 투여 후 최대 15년까지 생존에 대해 추적조사될 것이다.
상기 데이터의 조합된 평가는 인간에서 안전한 시작 용량을 확립하고 용량 증가 계획을 뒷받침하기 위해 사용되었다.
본 개시된 주제의 구현예
전술한 설명으로부터, 다양한 용법 및 조건에 채택되도록 변경 및 변형이 본 개시된 주제에 행해질 수 있음이 명확할 것이다. 이러한 구현예는 또한 다음의 청구항의 범위 이내이다.
본 명세서에서 변수의 임의의 정의에서 요소들의 목록을 인용하는 것은 나열된 요소들의 임의의 단일 요소 또는 조합(또는 서브-조합)으로서의 상기 변수의 정의를 포함한다. 본 명세서에서 구현예를 인용하는 것은 임의의 단일 구현예 또는 임의의 다른 구현예 또는 그의 일부와의 조합으로서의 상기 구현예를 포함한다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허 및 공개문헌은 각각의 독립적 특허 및 공개문헌이 인용에 의해 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
<110> Memorial Sloan Kettering Cancer Center <120> MESOTHELIN CARS AND USES THEREOF <130> 2021-FPA-1105 <150> US 62/848,983 <151> 2019-05-16 <150> US 62/975,966 <151> 2020-02-13 <160> 137 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 345 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gln His His Leu Trp Ile Leu Leu Leu Cys Leu Gln Thr Trp 1 5 10 15 Pro Glu Ala Ala Gly Lys Asp Ser Glu Ile Phe Thr Val Asn Gly Ile 20 25 30 Leu Gly Glu Ser Val Thr Phe Pro Val Asn Ile Gln Glu Pro Arg Gln 35 40 45 Val Lys Ile Ile Ala Trp Thr Ser Lys Thr Ser Val Ala Tyr Val Thr 50 55 60 Pro Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Val Thr Val Thr His Arg Asn 65 70 75 80 Tyr Tyr Glu Arg Ile His Ala Leu Gly Pro Asn Tyr Asn Leu Val Ile 85 90 95 Ser Asp Leu Arg Met Glu Asp Ala Gly Asp Tyr Lys Ala Asp Ile Asn 100 105 110 Thr Gln Ala Asp Pro Tyr Thr Thr Thr Lys Arg Tyr Asn Leu Gln Ile 115 120 125 Tyr Arg Arg Leu Gly Lys Pro Lys Ile Thr Gln Ser Leu Met Ala Ser 130 135 140 Val Asn Ser Thr Cys Asn Val Thr Leu Thr Cys Ser Val Glu Lys 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tcactcaaac tgtcttctgt gactgctgct gacactgctg tttattattg tgccagggag 300 gggaaaaatg gggcatttga tatttggggt cagggcacaa tggtgacagt cagctctgga 360 ggtggaggct caggaggagg aggcagtgga ggtggtgggt cacgccatca gatgactcag 420 tccccctcca gtctttctgc ctcagttggg gatagagtga ccatcacatg cagagcaagt 480 cagagcatat catcctatct gaactggtac cagcagaagc cagggaaagc ccccaaattg 540 ctgatttatg cagcctcaag tctccagagt ggggtgccaa gcaggttctc aggcagtggc 600 agtgggacag atttcacatt gacaatcagc tccctccaac ctgaagattt tgccacctac 660 tattgccagc aatcctacag cacgcccctg acttttggag gtggcacaaa ggtagagatc 720 aagaggactg cggccgcaat tgaagttatg tatcctcctc cttacctaga caatgagaag 780 agcaatggaa ccattatcca tgtgaaaggg aaacaccttt gtccaagtcc cctatttccc 840 ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 900 ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 960 cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 1020 ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc 1080 gcagacgccc 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cagggaaagc ccccaaattg 540 ctgatttatg cagcctcaag tctccagagt ggggtgccaa gcaggttctc aggcagtggc 600 agtgggacag atttcacatt gacaatcagc tccctccaac ctgaagattt tgccacctac 660 tattgccagc aatcctacag cacgcccctg acttttggag gtggcacaaa ggtagagatc 720 aagaggact 729 <210> 86 <211> 235 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr 20 25 30 Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser 35 40 45 Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala 50 55 60 Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala 65 70 75 80 Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp 85 90 95 Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe 115 120 125 Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg 130 135 140 Pro Pro Thr Pro Ala Pro 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accccacctg taggtttggc aagctagctt aagtaacgcc 6780 attttgcaag gcatggaaaa atacataact gagaatagaa aagttcagat caaggtcagg 6840 aacagatgga acagctgaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc 6900 cggctcaggg ccaagaacag atggaacagc tgaatatggg ccaaacagga tatctgtggt 6960 aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc ggtccagccc 7020 tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt tccagggtgc cccaaggacc tgaaatgacc 7080 ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt cgcttctcgc ttctgttcgc gcgcttatgc 7140 tccccgagct caataaaaga gcccacaacc cctcactcgg ggcgccagtc ctccgattga 7200 ctgagtcgcc cgggtacccg tgtatccaat aaaccctctt gcagttgcat ccgacttgtg 7260 gtctcgctgt tccttgggag ggtctcctct gagtgattga ctacccgtca gcgggggtct 7320 ttcatttggg ggctcgtccg ggatcgggag acccctgccc agggaccacc gacccaccac 7380 cgggaggtaa gctggccagc aacttatctg tgtctgtccg attgtctagt gtctatgact 7440 gattttatgc gcctgcgtcg gtactagtta gctaactagc tctgtatctg gcggacccgt 7500 ggtggaactg acgagttcgg aacacccggc cgcaaccctg ggagacgtcc cagggacttc 7560 gggggccgtt tttgtggccc 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acccttaccg agtcggcgac acagtgtggg tccgccgaca 8460 ccagactaag aacctagaac ctcgctggaa aggaccttac acagtcctgc tgaccacccc 8520 caccgccctc aaagtagacg gcatcgcagc ttggatacac gccgcccacg tgaaggctgc 8580 cgaccccggg ggtggaccat cctctagact gcc 8613 <210> 124 <211> 8604 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 124 atggccctgc cagtaacggc tctgctgctg ccacttgctc tgctcctcca tgcagccagg 60 cctcaggttc agcttcagga gagtggccca ggcctggtga agccaagtga gactctcagc 120 ttgacttgca cagtttctgg aggcagtgtc tcctcaggca gctattattg gtcctggatt 180 cggcagcccc ctgggaaagg cctggagtgg attgggtaca tatattacag tggcagcaca 240 aattacaatc catccctgaa gtctcgagta actatcagtg tggacacaag caagaatcag 300 ttttcactca aactgtcttc tgtgactgct gctgacactg ctgtttatta ttgtgccagg 360 gaggggaaaa atggggcatt tgatatttgg ggtcagggca caatggtgac agtcagctct 420 ggaggtggag gctcaggagg aggaggcagt ggaggtggtg ggtcacgcca tcagatgact 480 cagtccccct ccagtctttc tgcctcagtt ggggatagag tgaccatcac atgcagagca 540 agtcagagca tatcatccta tctgaactgg taccagcaga agccagggaa agcccccaaa 600 ttgctgattt atgcagcctc aagtctccag agtggggtgc caagcaggtt ctcaggcagt 660 ggcagtggga cagatttcac attgacaatc agctccctcc aacctgaaga ttttgccacc 720 tactattgcc agcaatccta cagcacgccc ctgacttttg gaggtggcac aaaggtagag 780 atcaagagga ctgcggccgc aattgaagtt atgtatcctc ctccttacct agacaatgag 840 aagagcaatg gaaccattat ccatgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt 900 cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat 960 agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc 1020 ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac 1080 cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccagagtgaa gttcagcagg 1140 agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200 ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260 ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgttca atgaactgca gaaagataag 1320 atggcggagg ccttcagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380 gatggccttt tccaggggct cagtacagcc accaaggaca ccttcgacgc ccttcacatg 1440 caggccctgc cccctcgcgg atctggagca acaaacttct cactactcaa acaagcaggt 1500 gacgtggagg agaatcccgg cccaatgcag atcccacagg cgccctggcc agtcgtctgg 1560 gcggtgctac aactgggctg gcggccagga tggttcttag actccccaga caggccctgg 1620 aaccccccca ccttctcccc agccctgctc gtggtgaccg aaggggacaa cgccaccttc 1680 acctgcagct tctccaacac atcggagagc ttcgtgctaa actggtaccg catgagcccc 1740 agcaaccaga cggacaagct ggccgctttc cccgaggacc gcagccagcc cggccaggac 1800 tgccgcttcc gtgtcacaca actgcccaac gggcgtgact tccacatgag cgtggtcagg 1860 gcccggcgca atgacagcgg cacctacctc tgtggggcca tctccctggc ccccaaggcg 1920 cagatcaaag agagcctgcg ggcagagctc agggtgacag agagaagggc agaagtgccc 1980 acagcccacc ccagcccctc acccaggcca gccggccagg cggccgcacc caccacgacg 2040 ccagcgccgc gaccaccaac cccggcgccc acgatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc 2100 ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc 2160 tgtgatatct acatctgggc gcccctggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 2220 gttatcaccc tttactgcaa ccacaggcgg atccaataac agccactcga ggatccggat 2280 tagtccaatt tgttaaagac aggatatcag tggtccaggc tctagttttg actcaacaat 2340 atcaccagct gaagcctata gagtacgagc catagataaa ataaaagatt ttatttagtc 2400 tccagaaaaa ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa 2460 cgccattttg caaggcatgg aaaaatacat aactgagaat agagaagttc agatcaaggt 2520 caggaacaga tggaacagct gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct 2580 gccccggctc agggccaaga acagatggaa cagctgaata tgggccaaac aggatatctg 2640 tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag atgcggtcca 2700 gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag gacctgaaat 2760 gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt tcgcgcgctt 2820 ctgctccccg agctcaataa aagagcccac aacccctcac tcggggcgcc agtcctccga 2880 ttgactgagt cgcccgggta cccgtgtatc caataaaccc tcttgcagtt gcatccgact 2940 tgtggtctcg ctgttccttg ggagggtctc ctctgagtga ttgactaccc gtcagcgggg 3000 gtctttcaca tgcagcatgt atcaaaatta atttggtttt ttttcttaag tatttacatt 3060 aaatggccat agtacttaaa gttacattgg cttccttgaa ataaacatgg agtattcaga 3120 atgtgtcata aatatttcta attttaagat agtatctcca ttggctttct actttttctt 3180 ttattttttt ttgtcctctg tcttccattt gttgttgttg ttgtttgttt gtttgtttgt 3240 tggttggttg gttaattttt ttttaaagat cctacactat agttcaagct agactattag 3300 ctactctgta acccagggtg accttgaagt catgggtagc ctgctgtttt agccttccca 3360 catctaagat tacaggtatg agctatcatt tttggtatat tgattgattg attgattgat 3420 gtgtgtgtgt gtgattgtgt ttgtgtgtgt gattgtgtat atgtgtgtat ggttgtgtgt 3480 gattgtgtgt atgtatgttt gtgtgtgatt gtgtgtgtgt gattgtgcat gtgtgtgtgt 3540 gtgattgtgt ttatgtgtat gattgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 3600 gtgtgtgtgt tgtgtatata tatttatggt agtgagaggc aacgctccgg ctcaggtgtc 3660 aggttggttt ttgagacaga gtctttcact tagcttggaa ttcactggcc gtcgttttac 3720 aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc 3780 ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc 3840 gcagcctgaa tggcgaatgg cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta 3900 tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc 3960 agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat 4020 ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt 4080 catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg 4140 tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 4200 cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 4260 cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 4320 tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 4380 tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 4440 atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 4500 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc 4560 aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 4620 aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 4680 gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 4740 cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 4800 atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 4860 tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 4920 ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 4980 ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 5040 ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 5100 tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 5160 tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 5220 aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 5280 tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 5340 tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 5400 gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 5460 agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 5520 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 5580 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 5640 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 5700 tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 5760 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 5820 gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 5880 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 5940 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 6000 attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 6060 cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 6120 ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 6180 aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg 6240 ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 6300 acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctttg ctcttaggag tttcctaata 6360 catcccaaac tcaaatatat aaagcatttg acttgttcta tgccctaggg ggcgggggga 6420 agctaagcca gcttttttta acatttaaaa tgttaattcc attttaaatg cacagatgtt 6480 tttatttcat aagggtttca atgtgcatga atgctgcaat attcctgtta ccaaagctag 6540 tataaataaa aatagataaa cgtggaaatt acttagagtt tctgtcatta acgtttcctt 6600 cctcagttga caacataaat gcgctgctga gaagccagtt tgcatctgtc aggatcaatt 6660 tcccattatg ccagtcatat taattactag tcaattagtt gatttttatt tttgacatat 6720 acatgtgaaa gaccccacct gtaggtttgg caagctagct taagtaacgc cattttgcaa 6780 ggcatggaaa aatacataac tgagaataga aaagttcaga tcaaggtcag gaacagatgg 6840 aacagctgaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg 6900 gccaagaaca gatggaacag ctgaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc 6960 ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg tccccagatg cggtccagcc ctcagcagtt 7020 tctagagaac catcagatgt ttccagggtg ccccaaggac ctgaaatgac cctgtgcctt 7080 atttgaacta accaatcagt tcgcttctcg cttctgttcg cgcgcttctg ctccccgagc 7140 tcaataaaag agcccacaac ccctcactcg gcgcgccagt cctccgattg actgagtcgc 7200 ccgggtaccc gtgtatccaa taaaccctct tgcagttgca tccgacttgt ggtctcgctg 7260 ttccttggga gggtctcctc tgagtgattg actacccgtc agcgggggtc tttcatttgg 7320 gggctcgtcc gggatcggga gacccctgcc cagggaccac cgacccacca ccgggaggta 7380 agctggccag caacttatct gtgtctgtcc gattgtctag tgtctatgac tgattttatg 7440 cgcctgcgtc ggtactagtt agctaactag ctctgtatct ggcggacccg tggtggaact 7500 gacgagttcg gaacacccgg ccgcaaccct gggagacgtc ccagggactt cgggggccgt 7560 ttttgtggcc cgacctgagt cctaaaatcc cgatcgttta ggactctttg gtgcaccccc 7620 cttagaggag ggatatgtgg ttctggtagg agacgagaac ctaaaacagt tcccgcctcc 7680 gtctgaattt ttgctttcgg tttgggaccg aagccgcgcc gcgcgtcttg tctgctgcag 7740 catcgttctg tgttgtctct gtctgactgt gtttctgtat ttgtctgaaa atatgggccc 7800 gggctagcct gttaccactc ccttaagttt gaccttaggt cactggaaag atgtcgagcg 7860 gatcgctcac aaccagtcgg tagatgtcaa gaagagacgt tgggttacct tctgctctgc 7920 agaatggcca acctttaacg tcggatggcc gcgagacggc acctttaacc gagacctcat 7980 cacccaggtt aagatcaagg tcttttcacc tggcccgcat ggacacccag accaggtccc 8040 ctacatcgtg acctgggaag ccttggcttt tgacccccct ccctgggtca agccctttgt 8100 acaccctaag cctccgcctc ctcttcctcc atccgccccg tctctccccc ttgaacctcc 8160 tcgttcgacc ccgcctcgat cctcccttta tccagccctc actccttctc taggcgcccc 8220 catatggcca tatgagatct tatatggggc acccccgccc cttgtaaact tccctgaccc 8280 tgacatgaca agagttacta acagcccctc tctccaagct cacttacagg ctctctactt 8340 agtccagcac gaagtctgga gacctctggc ggcagcctac caagaacaac tggaccgacc 8400 ggtggtacct cacccttacc gagtcggcga cacagtgtgg gtccgccgac accagactaa 8460 gaacctagaa cctcgctgga aaggacctta cacagtcctg ctgaccaccc ccaccgccct 8520 caaagtagac ggcatcgcag cttggataca cgccgcccac gtgaaggctg ccgaccccgg 8580 gggtggacca tcctctagac tgcc 8604 <210> 125 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 125 atggccctgc cagtaacggc tctgctgctg ccacttgctc tgctcctcca tgcagccagg 60 cct 63 <210> 126 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 126 aggaccttac acagtcctgc tgac 24 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 127 agaacctaga acctcgctgg a 21 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 128 ctgcgatgcc gtctactttg 20 <210> 129 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 129 tgctgaaaca ttcaccttcc atgcaga 27 <210> 130 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 130 tgaaacatac gttcccaaag agttt 25 <210> 131 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 131 ctctccttct cagaaagtgt gcatat 26 <210> 132 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 132 gaaggtgaag gtcggagt 18 <210> 133 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 133 catgggtgga atcatattgg aa 22 <210> 134 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 134 ccaggatggt tcttagactc cc 22 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 135 tttagcacga agctctccga t 21 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 136 acgagggaca ataggagcca 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 137 ggcatactcc gtctgctcag 20

Claims (90)

  1. ⅰ) (a) 서열번호 76에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열번호 77에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열번호 78에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 79에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열번호 80에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열번호 81에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 세포외 항원-결합 도메인;
    (b) ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체를 포함하고, 각각의 ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체는 2개의 기능 상실 돌연변이를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인;을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR); 및
    ⅱ) (a) 리간드 결합 영역을 포함하는 프로그램화 죽음 1(PD-1)의 세포외 도메인의 적어도 일부; 및
    (b) 제1 막통과 도메인;을 포함하는 우성 음성 형태의 프로그램화 죽음 1(PD-1 DN);를 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 약 1 nM 내지 약 25 nM의 EC50 값으로 인간 메소텔린에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 조성물.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 단일-사슬 가변 단편(scFv), 선택적으로 가교결합된 Fab, 또는 F(ab)2를 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 인간 scFv를 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 약 1,000개 이상의 메소텔린 결합 부위/세포의 메소텔린 발현 레벨로 인간 메소텔린을 인식하는 폴리펩티드 조성물.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 82에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 82에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 83에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 83에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 82에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 83에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 82에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 83에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 사이에 링커를 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    리더는 상기 세포외 항원-결합 도메인의 N-말단에 공유적으로 연결되는 폴리펩티드 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 리더는 CD8 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 CD8 폴리펩티드는 서열번호 71에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 조성물.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PD-1의 세포외 도메인의 적어도 일부는 서열번호 48의 아미노산 21 내지 165를 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  17. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PD-1 DN의 제1 막통과 도메인은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD4 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 PD-1 DN의 제1 막통과 도메인은 CD8 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 PD-1 DN의 제1 막통과 도메인에 포함되는 CD8 폴리펩티드는 서열번호 86의 아미노산 137 내지 207을 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  20. 청구항 1 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PD-1 DN은 서열번호 48의 아미노산 21 내지 165 및 서열번호 86의 아미노산 137 내지 207을 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  21. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 2개의 기능 상실 돌연변이 각각은 티로신 아미노산 잔기에 있는 폴리펩티드 조성물.
  22. 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ITAM2 변이체는 서열번호 29에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리펩티드 조성물.
  23. 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ITAM3 변이체는 서열번호 33에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리펩티드 조성물.
  24. 청구항 1 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형 ITAM1을 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  25. 청구항 24에 있어서,
    상기 자연형 ITAM1은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리펩티드 조성물.
  26. 청구항 1 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 35에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리펩티드 조성물.
  27. 청구항 1 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PD-1 DN은 세포내 도메인이 없는 폴리펩티드 조성물.
  28. 청구항 1 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR은 제2 막통과 도메인을 추가로 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  29. 청구항 28에 있어서,
    상기 CAR의 제2 막통과 도메인은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD4 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  30. 청구항 28 또는 청구항 29에 있어서,
    상기 CAR의 제2 막통과 도메인은 CD28 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  31. 청구항 1 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 공-자극성 신호전달 영역을 추가로 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  32. 청구항 31에 있어서,
    상기 공-자극성 신호전달 영역은 CD28 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, DAP-10 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 폴리펩티드, NKGD2 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  33. 청구항 31 또는 청구항 32에 있어서,
    상기 공-자극성 신호전달 영역은 CD28 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  34. 청구항 1 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR은 서열번호 56에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 조성물.
  35. 청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항의 폴리펩티드 조성물을 포함하는 면역반응성 세포.
  36. 청구항 35에 있어서,
    상기 PD-1 DN 및/또는 CAR은 재조합적으로 발현되는 면역반응성 세포.
  37. 청구항 35 또는 청구항 36에 있어서,
    상기 PD-1 DN 및/또는 CAR은 벡터로부터 발현되는 면역반응성 세포.
  38. 청구항 35 내지 청구항 37 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역반응성 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 및 이로부터 림프성 세포가 분화될 수 있는 다능성 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역반응성 세포.
  39. 청구항 38에 있어서,
    상기 면역반응성 세포는 T 세포인 면역반응성 세포.
  40. 청구항 39에 있어서,
    상기 T 세포는 세포독성 T 림프구(CTL), 조절성 T 세포, 및 자연 살해 T(NKT) 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역반응성 세포.
  41. 청구항 38에 있어서,
    상기 다능성 줄기 세포는 배아 줄기 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포인 면역반응성 세포.
  42. 청구항 35 내지 청구항 41 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역반응성 세포는 자가성인 면역반응성 세포.
  43. 청구항 35 내지 청구항 41 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역반응성 세포는 동종성인 면역반응성 세포.
  44. 유효량의 청구항 35 내지 청구항 43 중 어느 한 항의 면역반응성 세포 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  45. 청구항 44에 있어서,
    약 104 내지 106의 면역반응성 세포를 포함하는 약학적 조성물.
  46. 청구항 44 또는 청구항 45에 있어서,
    적어도 약 105의 면역반응성 세포를 포함하는 약학적 조성물.
  47. 청구항 44 내지 청구항 46 중 어느 한 항에 있어서,
    약 105의 면역반응성 세포를 포함하는 약학적 조성물.
  48. 청구항 44 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에서 신생물을 예방 및/또는 치료하거나, 재발된 신생물을 갖는 대상체를 치료하거나, 대상체에서 종양 부하를 감소시키거나, 신생물을 갖는 대상체의 생존을 증가 또는 늘리거나, 대상체에서 염증성 질환을 예방 및/또는 치료하거나, 및/또는 기관 이식의 수용자인 대상체에서 이식 거부를 방지하기 위한 약학적 조성물.
  49. 청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항의 폴리펩티드 조성물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 조성물.
  50. 청구항 49에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 123에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 조성물.
  51. 청구항 49에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 124에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 조성물.
  52. 청구항 49 내지 청구항 51 중 어느 한 항의 핵산 조성물을 포함하는 벡터.
  53. 청구항 52에 있어서,
    레트로바이러스 벡터인 벡터.
  54. 청구항 53에 있어서,
    상기 레트로바이러스 벡터는 γ-레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인 벡터.
  55. 청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항의 폴리펩티드 조성물, 청구항 49 내지 청구항 51 중 어느 한 항의 핵산 조성물, 또는 청구항 52 내지 청구항 54 중 어느 한 항의 벡터를 면역반응성 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 면역반응성 세포의 생산 방법.
  56. 청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항의 폴리펩티드 조성물, 청구항 49 내지 청구항 51 중 어느 한 항의 핵산 조성물, 청구항 52 내지 청구항 54 중 어느 한 항의 벡터, 청구항 35 내지 청구항 43 중 어느 한 항의 면역반응성 세포, 또는 청구항 44 내지 청구항 48 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 포함하는 키트.
  57. 청구항 56에 있어서,
    상기 키트는 대상체에서 신생물을 치료 및/또는 예방하거나, 재발된 신생물을 갖는 대상체를 치료하거나, 대상체에서 종양 부하를 감소시키거나, 신생물을 갖는 대상체의 생존을 증가 또는 늘리거나, 대상체에서 염증성 질환을 예방 및/또는 치료하거나, 및/또는 기관 이식의 수용자인 대상체에서 이식 거부를 방지하기 위한 기록된 설명서를 추가로 포함하는 키트.
  58. 유효량의 청구항 35 내지 청구항 43 중 어느 한 항의 면역반응성 세포, 또는 청구항 44 내지 청구항 48 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 신생물을 예방 및/또는 치료하는 방법.
  59. 유효량의 청구항 35 내지 청구항 43 중 어느 한 항의 면역반응성 세포, 또는 청구항 44 내지 청구항 48 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 종양 부하를 감소시키는 방법.
  60. 청구항 59에 있어서,
    상기 방법은 종양 세포의 수를 감소시키거나, 종양의 크기를 감소시키거나, 및/또는 대상체에서 종양을 근절하는 방법.
  61. 청구항 58 내지 청구항 60 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신생물 및/또는 종양은 고형 종양인 방법.
  62. 청구항 61에 있어서,
    상기 고형 종양은 중피종, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 결장암, 흉막 종양, 교모세포종, 식도암, 위의 암, 활막 육종, 흉선 암종, 자궁내막 암종, 위암, 담관암종, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  63. 유효량의 청구항 35 내지 청구항 43 중 어느 한 항의 면역반응성 세포, 또는 청구항 44 내지 청구항 48 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 재발된 신생물을 갖는 대상체의 치료 방법.
  64. 청구항 63에 있어서,
    상기 대상체는 상기 면역반응성 세포 또는 조성물의 상기 투여 이전에 면역치료법을 받는 방법.
  65. 유효량의 청구항 35 내지 청구항 43 중 어느 한 항의 면역반응성 세포, 또는 청구항 44 내지 청구항 48 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 신생물을 갖는 대상체의 생존을 증가 또는 늘리는 방법.
  66. 유효량의 청구항 35 내지 청구항 43 중 어느 한 항의 면역반응성 세포, 또는 청구항 44 내지 청구항 48 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 암 세포 또는 병원체에 대한 반응으로 면역-활성화 사이토카인 생산을 증가시키는 방법.
  67. 청구항 66에 있어서,
    상기 면역-활성화 사이토카인은 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-3, IL-6, IL-11, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, 인터페론 조절 인자 7(IRF7), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  68. 청구항 58 내지 청구항 69 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 면역조절제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  69. 청구항 68에 있어서,
    상기 적어도 하나의 면역조절제는 면역자극제, 체크포인트 면역 차단제, 방사선 치료법 제제, 화학치료법 제제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  70. 청구항 69에 있어서,
    상기 면역자극제는 IL-12, 작용성 공-자극성 단일클론 항체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  71. 청구항 70에 있어서,
    상기 면역자극제는 IL-12인 방법.
  72. 청구항 69에 있어서,
    상기 작용성 공-자극성 단일클론 항체는 항-4-1BB 항체, 항-OX40 항체, 항-ICOS 항체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  73. 청구항 72에 있어서,
    상기 작용성 공-자극성 단일클론 항체는 항-4-1BB 항체인 방법.
  74. 청구항 69에 있어서,
    상기 체크포인트 면역 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-LAG3 항체, 항-B7-H3 항체, 항-TIM3 항체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  75. 청구항 74에 있어서,
    상기 체크포인트 면역 차단제느 항-PD-L1 항체 또는 항-PD-1 항체인 방법.
  76. 청구항 58 내지 청구항 75 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 인간인 방법.
  77. 청구항 58 내지 청구항 75 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역반응성 세포는 상기 대상체에게 흉막으로 또는 흉막내로 투여되는 방법.
  78. 청구항 35 내지 청구항 43 중 어느 한 항의 면역반응성 세포, 또는 청구항 44 내지 청구항 48 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 염증성 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법.
  79. 청구항 78에 있어서,
    상기 면역반응성 세포는 면역억제성 세포인 방법.
  80. 청구항 79에 있어서,
    상기 면역억제성 세포는 조절성 T 세포인 방법.
  81. 청구항 78 내지 청구항 80 중 어느 한 항에 있어서,
    염증성 질환은 췌장염인 방법.
  82. 청구항 78 내지 청구항 81 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 인간인 방법.
  83. 청구항 78 내지 청구항 82 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 기관 이식의 수용자인 방법.
  84. 청구항 78 내지 청구항 83 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 췌장 이식의 수용자인 방법.
  85. 청구항 35 내지 청구항 43 중 어느 한 항의 면역반응성 세포, 또는 청구항 44 내지 청구항 48 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 기관 이식의 수용자인 대상체에서 이식 거부를 방지하는 방법.
  86. 청구항 85에 있어서,
    상기 면역반응성 세포는 면역억제성 세포인 방법.
  87. 청구항 86에 있어서,
    상기 면역억제성 세포는 조절성 T 세포인 방법.
  88. 청구항 85 내지 청구항 87 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 인간인 방법.
  89. 청구항 85 내지 청구항 88 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 췌장 이식의 수용자인 방법.
  90. 대상체에서 신생물을 치료 및/또는 예방하거나, 재발된 신생물을 갖는 대상체를 치료하거나, 대상체에서 종양 부하를 감소시키거나, 신생물을 갖는 대상체의 생존을 증가 또는 늘리거나, 대상체에서 염증성 질환을 예방 및/또는 치료하거나, 및/또는 기관 이식의 수용자인 대상체에서 이식 거부를 방지하는데 사용하기 위한 청구항 35 내지 청구항 43 중 어느 한 항의 면역반응성 세포, 또는 청구항 44 내지 청구항 48 중 어느 한 항의 약학적 조성물.
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