KR102133857B1 - Ｐｄ－ｌ１에 의해 유도된 면역관용의 감소 - Google Patents

Ｐｄ－ｌ１에 의해 유도된 면역관용의 감소 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CAR T 세포 치료와 관련된 면역관용을 감소시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 실시예는 변형된 예정된 세포사멸 단백질 1(PD-1)을 암호화하는 핵산 서열 및 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열을 포함한다.

Description

ＰＤ－Ｌ１에 의해 유도된 면역관용의 감소
관련 특허 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2015년 3월 2일에 출원된 "변형된 세포 및 그것의 용도(Modified Cell and Uses thereof)"라는 제목의 미국 가출원 번호 제62/126,804호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조문헌으로 인용된다.
기술 분야
본 명세서는 변형된 세포 및 용도에 관한 것으로, 특히 CAR T 세포 치료법과 관련된 면역관용(immune tolerance)을 감소시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
T 세포 치료법은 암 치료에 대한 효능 및 치료 가능성(curative potential)이 입증되었다. 그러나, 그것들의 용도는 면역 억제성 미세환경(immunosuppressive microenvironment)의 존재에 의해 제한된다. 면역 억제성 미세환경은 예정된 사멸-1(programmed death-1, PD-1)과 예정된 사멸-리간드 1(programmed death-ligand 1, PD-L1) 사이의 상호작용에 의해 유도된 면역관용을 포함한다. PD-1은 T 세포 및 항원표출 세포(antigen-presenting cell)상에 있는 음성 공동조절 수용체(negative coregulatory receptor)이다. PD-L1은 몇몇의 세포 유형(예를 들어, 종양 세포 및 기타 조직 세포)에 의해 발현되고, 면역 미세환경에 의해 동력학적(dynamically)으로 조절되는 것으로 나타났다.
따라서, T 세포 치료법의 효능을 개선시키기 위하여 PD-L1에 의해 유도된 면역관용을 해결할 필요가 있다.
요약
본 명세서의 실시예는 변형된 예정된 세포사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1, PD-1)을 암호화하는 핵산 서열 및 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열에 관한 것이다. 특정 실시예에서, 변형된 PD-1 및 CAR은 별개의 폴리펩티드인 유전자 산물로서 발현된다.
일부 실시예에서, CAR은 암세포에 존재하는 종양 항원에 특이적이며, 여기에서 상기 암세포는 PD-L1을 발현한다.
일부 실시예에서, 종양 항원은 HER2, CD19, CD20, CD22, 카파(Kappa) 또는 경쇄(light chain), CD30, CD33, CD123, CD38, ROR1, ErbB3/4, EGFR, EGFRvIII, EphA2, FAP, 발암배아성 항원(carcinoembryonic antigen), EGP2, EGP40, 메소텔린(mesothelin), TAG72, PSMA, NKG2D 리간드, B7-H6, IL-13 수용체 α2, IL-11 수용체 α, MUC1, MUC16, CA9, GD2, GD3, HMW-MAA, CD171, 루이스 Y(Lewis Y), G250/CAIX, HLA-A1 MAGE A1, HLA-A2 NY-ESO-1, PSC1, 엽산 수용체-α(folate receptor-α), CD44v7/8, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아(Fetal) AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, TEM1, TEM8, 또는 종양에 의해 발현된 바이러스-관련 항원을 포함한다.
일부 실시예에서, 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열은 야생형 PD-1의 세포내 부분을 암호화하는 핵산 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환(substitution) 또는 결실(deletion)을 포함한다.
일부 실시예에서, 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열은 야생형 PD-1의 세포내 부분을 암호화하는 핵산 서열과 비교하여 복수의(multiple) 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시예에서, 변형된 PD-1은 SEQ ID NO: 14의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열은 세포내 도메인을 포함하지 않는 절단된(truncated) PD-1을 암호화하는 핵산을 포함한다. 특정 실시예에서, 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 12의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 변형된 PD-1은 야생형 PD-1과 비교하여 하나 또는 그 이상의 점 돌연변이(point mutation)를 포함한다. 특정 실시예에서, 점 돌연변이는 야생형 PD-1의 인산화 부위(phosphorylation site)의 하나 또는 두 개의 아미노산 점 돌연변이를 포함한다.
실시예는 또한, 앞서 기술한 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 발현 벡터는 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector), 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector) 및 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector)로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 벡터이다.
실시예는 또한, 본 명세서의 발현 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 세포는 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시예는 또한, 항종양적 유효량의 인간 T 세포의 집단(population)을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이며, 여기에서 인간 T 세포의 집단은 앞서 기술한 바와 같은 분리된 핵산 서열을 포함하는 인간 T 세포를 포함한다. 일부 실시예에서, 인간 T 세포 집단의 사이토카인 생산에 대한 PD-L1의 억제 효과는 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열의 적어도 일부를 포함하지 않는 인간 T 세포의 사이토카인 생산에 대한 PD-L1의 억제 효과보다 작다.
실시예는 또한, 인간 환자에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본 명세서에 기술된 것과 같은 약제학적 조성물을 인간 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
실시예는 또한, 변형된 PD-1과 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된(engineered) 세포에 관한 것이며, 여기에서 변형된 PD-1은 PD-1의 막횡단(transmembrane) 부분 또는 세포내 부분, 또는 그것들의 조합을 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 세포는 PD-L1에 대한 PD-1의 결합을 파괴하는 가용성 PD-1을 발현한다. 예를 들어, 가용성 PD-1은 세포의 세포막에 부착되지 않는다.
실시예는 또한, 대상체의 암을 치료 및/또는 억제하는 방법에 관한 것이다. 방법은 PD-1의 세포외 도메인을 포함하는 치료학적 유효량의 가용성 수용체를 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 수용체는 PD-L1 단백질에 결합하고, 가용성 수용체는 암세포의 PD-1 신호전달(signaling)을 파괴하고/파괴하거나 PD-L1에 대한 PD-1 결합을 파괴한다. 특정 실시예에서, 분리된 가용성 수용체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 잔기 20-519를 포함한다.
실시예는 또한, 수용체 폴리펩티드를 포함하는 변형된 세포에 관한 것이며, 상기 수용체 폴리펩티드의 세포질 도메인(cytoplasmic domain)은 절단되고; 상기 수용체 폴리펩티드는 예정된 세포사멸 단백질 1(PD-1) 수용체 폴리펩티드, 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4) 수용체 폴리펩티드, 또는 B- 및 T-림프구 감쇠인자(BTLA) 수용체 중 적어도 하나이다.
실시예는 또한, 질병을 가진 대상체를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 질병을 가진 대상체에 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 세포는 수용체 폴리펩티드, 상기 수용체 폴리펩티드의 세포질 도메인은 절단되고, 상기 수용체 폴리펩티드는 예정된 세포사멸 단백질 1(PD-1) 수용체 폴리펩티드, 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4) 수용체 폴리펩티드, 또는 B- 및 T-림프구 감쇠인자(BTLA) 수용체 중 적어도 하나이고; 및 항체의 항원 인식 도메인(antigen recognition domain) 및 세포내 도메인, 또는 변형된 또는 야생형 T 세포 수용체를 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 변형되고, 상기 특정 항체는 항원에 결합한다.
일부 실시예에서, 수용체 폴리펩티드는 PD-1 수용체 폴리펩티드이고, 여기에서 PD-1 수용체 폴리펩티드의 세포질 도메인은 면역수용체 티로신-기반 모티프(immunoreceptor tyrosine-based motif)를 함유한다.
실시예는 또한, 상응하는 야생형 세포와 비교하여 감소된 양의 하나 또는 그 이상의 수용체를 포함하는 변형된 세포에 관한 것이며, 상기 하나 또는 그 이상의 수용체는 예정된 세포사멸 단백질 1(PD-1), 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4), 또는 B- 및 T-림프구 감쇠인자(BTLA) 중 적어도 하나를 포함한다.
실시예는 또한, 질병을 가지는 대상체를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 질병을 가지는 대상체에 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 세포는 상응하는 야생형 세포와 비교하여 감소된 양의 하나 또는 그 이상의 수용체를 발현하도록 변형되고, 상기 하나 또는 그 이상의 수용체는 예정된 세포사멸 단백질 1(PD-1), 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4), 또는 B- 및 T-림프구 감쇠인자(BTLA) 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시예에서, 변형된 세포는 특정 항체의 항원 인식 도메인과 세포내 도메인, 또는 변형된 또는 야생형 T 세포 수용체를 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 더 포함한다. 특정 실시예에서, 변형된 세포는 특정 항체의 항원 인식 도메인과 세포내 도메인 또는 변형된 또는 야생형 T 세포 수용체를 포함하는 키메릭 항원-수용체(CAR)를 더 포함하며, 상기 특정 항체는 항원에 결합한다.
일부 실시예에서, 변형된 세포는 상응하는 야생형 세포와 비교하여 하나 또는 그 이상의 수용체의 생합성 경로 또는 수송 경로, 또는 그것들의 조합과 관련된 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 감소시킨다. 특정 실시예에서, 변형된 세포는 하나 또는 그 이상의 유전자의 파괴를 포함한다. 특정 실시예에서, 변형된 세포는 하나 또는 그 이상의 유전자의 부분적 또는 완전 결실을 포함한다. 특정 실시예에서, 유전적으로 변형된 세포는 인간 환자의 생체 내(in vivo)에서 자기 복제를 한다.
일부 실시예에서, 변형된 세포는 인간 환자에서 기억 세포(memory cell)를 형성한다. 이러한 경우, 변형된 세포는 인간 환자에게 정맥 내로 투여된다. 특정 실시예에서, 변형된 세포는 인간 환자에서 지속된다. 예를 들어, 변형된 세포는 자가 유래(autologous) T 세포이다. 다른 예를 들면, 세포는 B 세포, T 세포, NK 세포, 배아 세포(embryonic cell) 또는 수지상 세포(dendritic cell) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 질병은 암, 면역결핍(immune deficiency), 자가면역 질환(autoimmune disease) 또는 비만(obesity) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
이 요약은 아래의 발명의 상세한 설명에서 더 기술될 개념의 선별을 단순화된 형태로 소개하기 위해 제공되었다. 이 요약은 청구된 대상의 주요 특징이나 필수적인 특징을 인정하기 위한 것이 아니며, 청구된 대상의 범위를 한정하기 위해 사용된 것도 아니다.
발명의 상세한 설명
개요
본 명세서는 CAR T 세포 기반 치료에서 PD-L1에 의해 유도된 면역관용이 이러한 T 세포 상의 유전적으로 변형된 PD-1의 발현에 의해 감소될 수 있다는 발견에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 이들 T 세포는 변형된 PD-1 및 CAR이 이들 T 세포 상에서 별개의 폴리펩티드인 유전자 산물로서 발현되도록, CAR 및 유전적으로 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 유전적 변형의 예는 PD-1의 세포내 부분의 발현 또는 기능과 관련된 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환 또는 결실을 포함한다.
일부 실시예에서, 본 명세서는 T 세포의 사이토카인 생산에 대한 PD-L1의 억제 효과가 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열의 적어도 일부를 포함하지 않는 T 세포의 사이토카인 생산에 대한 PD-L1의 억제 효과보다 현저하게 작도록, CD19 및 변형된 PD-1에 대해 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포를 제공한다. 일부 예에서, CAR은 종양 세포에 존재하는 종양 항원에 특이적이고, 상기 종양 세포는 PD-L1을 발현한다. 따라서, 본 명세서의 조작된 T 세포는 환자에게 주입될 때 종양 세포의 PD-L1에 의해 유도된 면역관용을 감소시킬 수 있고, 또한 환자의 생체 내(in vivo)에서 이러한 종양 세포를 제거할 수 있다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 명세서가 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기재되어 있다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어들이 아래에 정의된다.
관사 "a" 및 "an"은 본원에서 관사의 문법적인 객체의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 말하는데 사용된다. 예로서, "요소(an element)"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
"약"은 기준(reference) 수량(quantity), 레벨(level), 값(value), 수(number), 빈도(frequency), 백분율(percentage), 차원(dimension), 크기(size), 양(amount), 무게(weight) 또는 길이(length)에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1%만큼 변화하는 수량, 레벨, 값, 수, 빈도, 백분율, 차원, 크기, 양, 무게 또는 길이를 의미한다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "활성화(activation)"는 검출 가능한 세포 증식(cellular proliferation)을 유도할 만큼 충분히 자극된 T 세포의 상태를 말한다. 활성화는 또한 유도된 사이토카인 생산 및 검출 가능한 작동자 기능(effector function)과 관련이 있을 수 있다. 용어 "활성화된 T 세포(activated T cell)"는 무엇보다도 세포 분열을 겪는 T 세포를 말한다.
용어 "항체(antibody)"는 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 단일클론 항체(전장 단일클론 항체를 포함), 다중-특이성(multi-specific) 항체(예를 들어, 이중 특이성(bispecific) 항체), 및 원하는 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다. 본 발명에서 항체는 예를 들어, 다중클론 항체, 단일클론 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2뿐만 아니라, 단일 사슬(single chain) 항체 및 인간화(humanized) 항체를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
"항체 단편(antibody fragments)"은 전장(full length) 항체의 일부, 일반적으로 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역(variable region)을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형(linear) 항체; 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로 만들어진 다중-특이성 항체를 포함한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 부위 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 단편은 단단하고(tight), 비-공유적(non-covalent)으로 결합된 하나의 중쇄(heavy-chain) 및 하나의 경쇄(light-chain) 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하며 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프(hypervariable loop)(H 및 L 사슬로부터 각각 3 루프)가 이들 두 도메인의 접힘(folding)으로부터 나온다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 단지 3개의 상보성 결정 영역(complementarity determining regions, CDRs)만을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도를 나타낼지라도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가진다. 본원에 사용된 것과 같은 "항체 중쇄(antibody heavy chain)"는 자연 발생적인(naturally occurring) 형태로 모든 항체 분자에 존재하는 두 가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 큰 것을 말한다. 본원에 사용된 것과 같은 "항체 경쇄(antibody light chain)"는 자연 발생적인 형태로 모든 항체 분자에 존재하는 두 가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 작은 것을 말한다. κ 및 λ 경쇄는 두 개의 주요 항체 경쇄 아이소타입(isotype)을 말한다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "합성 항체(synthetic antibody)"는 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 박테리오파지에 의해 발현된 항체와 같은, 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체를 의미한다. 상기 용어는 또한 항체를 암호화하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되는 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 상기 DNA 분자는 항체 단백질 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하고, 여기에서 상기 DNA 또는 아미노산 서열은 당해 기술분야에서 입수 가능하고 잘 알려져 있는 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 얻어진다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "항원(antigen)"은 항체 생산 또는 특정 면역 적격 세포(immunologically-competent cell)의 활성화 중 어느 하나, 또는 이들 모두를 포함할 수 있는, 면역 반응을 유발하는 분자로서 정의된다. 항원은 사실상 모든 단백질 또는 펩티드, 또는 재조합 또는 게놈 DNA(genomic DNA)로부터 유래된 분자를 포함하는 임의의 거대 분자(macromolecule)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 유도하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA는 따라서, 본원에서 사용된 것과 같은 용어 "항원"을 암호화한다. 또한, 항원은 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 암호화될 필요는 없다. 게다가, 항원은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 포함하는 생물학적 샘플로부터 생성, 합성 또는 유래될 수 있다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "항종양 효과(anti-tumor effect)"는 종양 부피의 감소, 종양 세포 수의 감소, 전이(metastase) 수의 감소, 종양 세포를 가지는 대상체의 기대 수명의 증가, 또는 암성 조건(cancerous condition)과 관련된 다양한 생리학적 증상의 개선과 관련된 생물학적 효과를 말한다. "항종양 효과"는 또한 처음부터 종양 발생의 예방에서 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 드러날 수 있다.
용어 "자가-항원(auto-antigen)"은 면역계에 의해 외부물질(foreign)로 잘못 인식된 항원을 말한다. 자가-항원은 세포 단백질(cellular protein), 인단백질(phosphoprotein), 세포 표면 단백질(cellular surface protein), 세포 지질(cellular lipid), 핵산(nucleic acid), 세포 표면 수용체를 포함하는 당단백질(glycoprotein)을 포함한다.
용어 "자가유래(autologous)"는 나중에 개체에게 다시 도입될, 동일한 개체로부터 유래된 물질을 기술하는데 사용된다.
"동종(allogeneic)"은 동일한 종의 다른 동물로부터 유래된 이식편(graft)을 기술하는데 사용된다.
"이종(xenogeneic)"은 다른 종의 동물로부터 유래된 이식편을 기술하는데 사용된다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "암(cancer)"은 비정상(aberrant) 세포의 빠르고 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질병으로 정의된다. 암세포는 국소적으로 또는 혈류와 림프계를 통해 신체의 다른 부위로 전파될 수 있다. 다양한 암의 예는 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 피부암(skin cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 대장암(colorectal cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 뇌암(brain cancer), 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia), 폐암(lung cancer) 등을 포함한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다(comprise)", "포함한다(include)" 및 "포함하는(including)"은 언급된 단계 또는 요소(element), 또는 단계 또는 요소의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 단계 또는 요소, 또는 단계 또는 요소의 그룹을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
"이루어지는(consisting of)"은 "이루어지는"이라는 어구에 뒤따르는 어떤 것을 포함하며 이로 한정되는 것을 의미한다. 따라서, 상기 어구 "이루어지는"은 열거된 요소가 필수적(required or mandatory)이며, 어떤 다른 요소도 존재할 수 없음을 나타낸다.
"필수적으로 이루어지는(consisting essentially of)"은 그 어구 다음에 열거된 모든 요소들을 포함하며, 열거된 요소에 대한 개시내용에 명시된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나 이에 기여하는 기타 요소로 한정된다. 따라서, 상기 어구 "필수적으로 이루어지는"은 열거된 요소가 필수적(required or mandatory)임을 나타내지만, 기타 요소는 선택적이며 그것들이 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있다.
용어 "상보적(complementary)" 및 "상보성(complementarity)"은 염기쌍(base-paring) 규칙과 관련된 폴리뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드의 서열)를 말한다. 예를 들어, 서열 "A-G-T"는 서열 "T-C-A"에 상보적이다. 상보성은 핵산 염기의 일부만이 염기쌍 규칙에 따라 매칭되는 "부분(partial)"일 수 있다. 또는, 핵산들 사이에 "완전한(complete)" 또는 "전체적(total)" 상보성이 있을 수 있다. 핵산 가닥들 사이에서의 상보성의 정도는 핵산 가닥들 사이의 혼성화(hybridization)의 효율 및 강도에 현저한 영향을 미친다.
"상응하는('corresponds to' or 'corresponding to')"은 (a) 참조(reference) 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부와 실질적으로 동일하거나 이에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지거나, 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 또는 (b) 참조 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다.
"공자극 리간드(co-stimulatory ligand)"는 T 세포 상의 동종의(cognate) 공자극 분자에 특이적으로 결합하고, 그것에 의하여 예를 들어, TCR/CD3 복합체를 펩티드를 가진 MHC 분자와 결합시킴으로써 제공되는 일차 신호(primary signal)에 추가하여, 증식(proliferation), 활성화(activation), 분화(differentiation) 등을 포함하는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 표출 세포(예를 들어, APC, 수지상 세포, B 세포 등) 상의 분자를 포함한다. 공자극 리간드는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공자극 리간드(inducible costimulatory ligand, ICOS-L), 세포간 부착 분자(intercellular adhesion molecule, ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림프독소 베타 수용체(lymphotoxin beta receptor), 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, 톨(Toll) 리간드 수용체 및 B7-H3과 특이적으로 결합하는 리간드와 결합하는 작용제(agonist) 또는 항체를 포함할 수 있다. 공자극 리간드는 또한 그 중에서도, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능관련 항원-1(lymphocyte function-associated antigen-1, LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3와 같은 T 세포 상에 존재하는 공자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
"공자극 분자(co-stimulatory molecule)"는 공자극 리간드와 특이적으로 결합하여 증식과 같은 T 세포에 의한 공자극 반응을 매개하는, T 세포 상의 동종 결합 파트너(binding partner)를 말한다. 공자극 분자는 MHC 클래스 I 분자(MHC class I molecule), BTLA 및 톨-유사 수용체(Toll-like receptor)를 포함한다.
"공자극 신호(co-stimulatory signal)"는 TCR/CD3 라이게이션(ligation)과 같은 일차 신호와 조합하여, T 세포 증식 및/또는 주요 분자들의 상향조절(upregulation) 또는 하향조절(downregulation)을 야기하는 신호를 말한다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "질병(disease)" 및 "상태(condition)"는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 또는 특정 병(malady) 또는 상태가 병인(causative agent)이 알려지지 않았을 수 있다는 점에서 (원인이 아직 밝혀지지 않았기 때문에) 서로 다를 수 있고, 따라서 아직 질병으로 인식되지는 않지만 바람직하지 않은 상태 또는 증상으로만 인식되며, 여기에서 어느 정도 일련의 특정 증상만이 임상의에 의해 확인된다. 본원에 사용된 것과 같은 "질병"은 대상체의 건강 상태이며, 여기에서 상기 대상체는 항상성(homeostasis)을 유지할 수 없고, 질병이 개선되지 않으면 대상체의 건강은 계속 악화된다. 대조적으로, 대상체의 "장애(disorder)"는 동물이 항상성을 유지할 수 있는 건강 상태지만, 동물의 건강 상태가 장애가 없을 경우보다 바람직하지 못하다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "효과적인(effective)"은 원하는, 예상된 또는 의도된 결과를 달성하기에 적합함을 의미한다. 예를 들어, "유효량(effective amount)"은 치료적 또는 예방적 이득을 보기에 충분한 화합물의 양일 수 있다.
"암호화(encoding)"는 정의된 뉴클레오티드의 서열(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산의 서열 중 어느 하나를 가지며 이로부터 생성된 생물학적 특성을 가지는, 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형(template)으로서 작용하는, 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 내 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한(inherent) 특성을 말한다. 따라서, 유전자에 상응하는 mRNA의 전사(transcription) 및 번역(translation)이 세포 또는 다른 생물계에서 단백질을 생산한다면, 유전자는 단백질을 암호화한다. 암호화 가닥(coding strand) 모두, 그 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고, 일반적으로 서열 목록에 제공되며, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-암호화 가닥(non-coding strand)은 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 암호화하는 것으로 칭해질 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 관하여, 용어 "외생적(exogenous)"은 야생형 세포 또는 생물체에서 자연 발생적이지는 않지만, 전형적으로 분자 생물학 기술에 의해 세포 내로 도입되는 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 외생적 폴리뉴클레오티드의 예는 벡터, 플라스미드 및/또는 소정의 단백질을 암호화하는 인공 핵산 구조물(man-made nucleic acid construct)을 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 관하여, 용어 "내생적(endogenous)" 또는 "천연(native)"은 주어진 야생형 세포 또는 생물체에서 발견될 수 있는 자연 발생적인 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 또한, 제1 생물체로부터 분리되어 분자 생물학 기술에 의해 제2 생물체로 옮겨진 특정 폴리펩티드 서열은 전형적으로 제2 생물체에 대해 "외생적" 폴리뉴클레오티드로 간주된다. 특정 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 분자 생물학 기술에 의해, 예를 들어 다른(otherwise) 자연 발생적인 폴리뉴클레오티드 서열의 하나 또는 그 이상의 추가 카피를 만들고 그것에 의해 암호화된 폴리펩티드의 과발현을 용이하게 하기 위해, 그러한 폴리뉴클레오티드 서열을 이미 함유하고 있는 생물체 내로 "도입(introduced)될" 수 있다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "발현(expression)"은 그것의 프로모터(promoter)에 의해 촉발된 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로 정의된다.
"발현 벡터(expression vector)"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 말한다. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스-작용 요소(cis-acting element)를 포함하며; 발현을 위한 다른 요소들은 숙주 세포에 의해서, 또는 시험관 내(in vitro) 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 혼입시키는 코스미드(cosmid), 플라스미드(plasmid)(예를 들어, 노출되거나(naked) 리포좀 내에 함유됨) 및 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은, 본 기술분야에 공지된 모든 것들을 포함한다.
"상동성(homologous)"은 두 개의 폴리펩티드 사이 또는 두 개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성(similarity) 또는 서열 동일성(identity)을 말한다. 두 개의 비교 서열 모두에서 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 모노머 서브유닛에 의해 점유되는 경우, 예를 들어 두 개의 DNA 분자의 각각에서의 위치가 아데닌으로 점유된다면, 그 후 분자들은 그 위치에서 상동성이다. 두 개의 서열 간의 상동성의 백분율은 두 서열에 의해 공유되는 일치하는(matching) 또는 상동성 위치의 수를 비교될 위치의 수로 나눈 것에 100을 곱한 것의 함수이다. 예를 들어, 두 개의 서열 내의 위치 10개 중 6개가 일치하거나 상동성이라면, 두 개의 서열은 60% 상동성이다. 예를 들어, DNA 서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로, 비교는 두 개의 서열이 주어진 최대 상동성을 제공하도록 정렬된 경우에 이루어진다.
용어 "면역글로불린(immunoglobulin)" 또는 "Ig"는 항체로서 작용하는 단백질의 부류(class)를 말한다. 단백질의 이러한 부류에 포함된 5개의 구성원은 IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE이다. IgA는 타액, 눈물, 모유, 위장관 분비물 및 호흡기관과 비뇨생식관의 점액성 분비물과 같은 신체 분비물에 존재하는 일차 항체이다. IgG는 가장 통상적인 순환 항체(circulating antibody)이다. IgM은 대부분의 대상체에서 일차 면역 반응에서 생성되는 주된 면역글로불린이다. 이것은 응집(agglutination), 보체 결합(complement fixation) 및 다른 항체 반응에서 가장 효율적인 면역글로불린이며, 세균과 바이러스에 대한 방어에 중요하다. IgD는 공지된 항체 기능을 갖지는 않지만, 항원 수용체로서의 역할을 할 수 있는 면역글로불린이다. IgE는 알러젠(allergen)에 대한 노출시에 비만세포(mast cell) 및 호염구(basophil)로부터 매개물질의 방출을 야기함으로써 즉시성 과민증(immediate hypersensitivity)을 매개하는 면역글로불린이다.
"분리된(isolated)"은 천연 상태에서 통상적으로 동반되는 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는 물질을 의미한다. 예를 들어, 본원에 사용된 것과 같은 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 예를 들어, 보통 단편에 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편인, 자연 발생적인 상태에서 그 서열의 측면에 있는(flanking) 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오티드를 말한다. 대안적으로, 본원에 사용된 것과 같은 "분리된 펩티드" 또는 "분리된 폴리펩티드" 등은 그것의 천연 세포 환경 및 그 세포의 다른 성분과 관련된 것들로부터의 펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 시험관 내(in vitro) 분리 및/또는 정제를 말한다.
본 발명의 맥락에서, 통상 발생하는 핵산 염기에 대하여 다음의 약자가 사용된다. "A"는 아데노신(adenosine)을 말하고, "C"는 사이토신(cytosine)을 말하고, "G"는 구아노신(guanosine)을 말하고, "T"는 티미딘(thymidine)을 말하고, "U"는 우리딘(uridine)을 말한다.
달리 특정하지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버전(degenerate version)이며, 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드라는 표현은 또한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 인트론(들)을 함유하는 일부 버전일 수 있는 범위에서 인트론을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것과 같은 "렌티바이러스(lentivirus)"는 레트로바이러스과(Retroviridae family)의 속(genus)을 말한다. 렌티바이러스는 레트로바이러스 중에서 비-분열성(non-dividing) 세포를 감염시킬 수 있는 것으로 유일하고; 그것들은 상당한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA로 전달할 수 있으므로, 이는 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다. 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 생체 내(in vivo)에서 유의 수준(significant level)의 유전자 전이를 달성하기 위한 수단을 제공한다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "조절하는(modulating)"은 치료 또는 화합물의 부재하에 대상체에서의 반응 수준과 비교하여, 및/또는 그렇지 않으면 동일하지만 치료되지 않은 대상체에서의 반응 수준과 비교하여, 대상체에서의 반응 수준에서 검출 가능한 증가 또는 감소를 매개하는 것을 의미한다. 상기 용어는 천연 신호 또는 반응을 교란하고/하거나 영향을 미침으로써 대상체, 바람직하게는 인간에게 유익한 치료학적 반응을 매개하는 것을 포함한다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동 가능하게 연결(operably linked)" 된다. 예를 들어, 전서열(presequence) 또는 분비 리더(secretory leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서(enhancer)는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩(coding) 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치되는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우 인접해 있으면서 리딩 프레임에 내에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하지 않아도 된다. 연결은 편리한 제한 부위(restriction site)에서 라이게이션(ligation)에 의해 달성된다. 그러한 부위가 존재하지 않는다면, 관례에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 아답터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)가 사용된다.
용어 "과발현된(overexpressed)" 종양 항원 또는 종양 항원의 "과발현(overexpression)"은 조직 또는 장기로부터 유래된 정상 세포에서의 발현 수준에 비해 환자의 특정 조직 또는 장기 내에서의 고형 종양(solid tumor)과 같은 질병 영역으로부터 유래된 세포에서의 종양 항원의 비정상적인 발현 수준을 나타내는 것으로 의도된다. 고형 종양 또는 혈액학상 악성종양(hematological malignancy)을 가지는 환자는 당해 기술분야에 공지된 표준 분석법에 의해 측정될 수 있는 종양 항원의 과발현을 특징으로 한다.
면역원성(immunogenic) 조성물의 "비경구(parenteral)" 투여는 예를 들어, 피하(subcutaneous, s.c.), 정맥내(intravenous, i.v.), 근육내(intramuscular, i.m.), 또는 흉골내(intrasternal) 주사 또는 주입(infusion) 기술을 포함한다.
용어 "환자(patient)", "대상체(subject)", "개체(individual)" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 시험관 내(in vitro) 또는 동소(in situ)에 관계없이 본원에 기술된 방법으로 처리할 수 있는 임의의 동물 또는 그것들의 세포를 말한다. 특정 비-제한적 실시예에서, 상기 환자, 대상체 또는 개체는 인간이다. 일부 실시예에서, 용어 "대상체"는 면역반응이 유발될 수 있는 생물(living organism)(예를 들어, 포유류)을 포함하도록 의도된다. 대상체의 예는 인간, 개, 고양이, 생쥐, 쥐 및 그것들의 형질전환(transgenic) 종을 포함한다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 mRNA, RNA, cRNA, rRNA, cDNA 또는 DNA를 나타낸다. 상기 용어는 전형적으로 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 중 어느 한 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태인, 적어도 10 염기 길이의 뉴클레오티드의 중합 형태를 말한다. 상기 용어는 단일 및 이중 나선 형태의 DNA 및 RNA를 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오티드 변이체(polynucleotide variant)" 및 "변이체(variant)" 등은 하기에 정의되는 엄격한(stringent) 조건하에서 참조 서열과 혼성화되는 참조 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드와 실질적인 서열 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 이들 용어는 또한 적어도 하나의 뉴클레오티드의 첨가, 결실 또는 치환에 의해 참조 폴리뉴클레오티드와 구별되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 용어 "폴리뉴클레오티드 변이체" 및 "변이체"는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 첨가되거나 결실된, 또는 다른 뉴클레오티드로 대체된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이와 관련하여, 변경된(altered) 폴리뉴클레오티드가 참조 폴리뉴클레오티드의 생물학적 기능 또는 활성을 유지하거나 또는 참조 폴리뉴클레오티드와 비교하여 증가된 활성을 가지도록(즉, 최적화 됨) 참조 폴리뉴클레오티드에 대해 돌연변이, 첨가, 결실 및 치환을 포함하는 특정 변경(alteration)이 이루어질 수 있음은 당업계에 잘 알려져 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 예를 들어, 본원에 기술된 참조 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 50% (및 적어도 51% 내지 적어도 99% 및 그 사이에 있는 모든 정수의 백분율, 예를 들어 90%, 95% 또는 98%)의 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 용어 "폴리뉴클레오티드 변이체" 및 "변이체"는 또한 자연 발생적인 대립유전자 변이체(allelic variant) 및 이러한 효소를 암호화하는 오솔로그(ortholog)를 포함한다.
"폴리펩티드(polypeptide)", "폴리펩티드 단편(polypeptide fragment)", "펩티드(peptide)" 및 "단백질(protein)"은 본원에서 아미노산 잔기의 중합체 및 이의 변이체와 합성 유사체(analogue)를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 이들 용어는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생적인 아미노산의 화학적 유사체뿐만 아니라 자연 발생적인 아미노산 중합체와 같은 합성의 비-자연 발생적인 아미노산인 아미노산 중합체에 사용된다. 특정 양상에서, 폴리펩티드는 효소적(enzymatic) 폴리펩티드, 또는 전형적으로 다양한 화학 반응을 촉매하는(즉, 그것의 속도를 증가시키는) "효소(enzyme)"를 포함할 수 있다.
용어 폴리펩티드 "변이체(variant)"는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 첨가, 결실 또는 치환에 의해 참조 폴리펩티드 서열과 구별되는 폴리펩티드를 말한다. 특정 실시예에서, 폴리펩티드 변이체는 보존적(conservative) 또는 비보존적(non-conservative)일 수 있는 하나 또는 그 이상의 치환에 의해 참조 폴리펩티드와 구별된다. 특정 실시예에서, 폴리펩티드 변이체는 보존적 치환을 포함하며, 이와 관련하여 일부 아미노산은 폴리펩티드의 활성의 본질을 변화시키지 않으면서 넓은 유사 특성을 가지는 다른 아미노산으로 바뀔 수 있음은 당업계에 잘 알려져 있다. 폴리펩티드 변이체는 또한 하나 또는 그 이상의 아미노산이 첨가되거나 결실된, 또는 다른 아미노산 잔기로 대체된 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "프로모터(promoter)"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특정 전사를 개시하는데 필요한 세포의 합성 기구(synthetic machinery), 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식된 DNA 서열로 정의된다. "조절 서열(control sequence)"이라는 표현은 특정 숙주 생물체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 말한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열은 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 작동 서열(operator sequence), 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal) 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
용어 "결합하는(bind or binds)" 또는 "상호작용하는(interacts with)"은 하나의 분자가 샘플 또는 생물체에서 특정의 제2 분자를 인식하고 이에 부착되나, 해당 샘플에서 다른 구조적으로 관련이 없는 분자를 실질적으로 인식하거나 이에 부착되지는 않는 것을 의미한다. 항체와 관련하여 본원에 사용된 것과 같은 용어 "특이적으로 결합하는(specifically bind)"은 샘플에서 특정 항원을 인식하지만, 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 이와 결합하지는 않는 항체를 의미한다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 종으로부터 유래된 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 또는 그 이상의 종으로부터 유래된 그 항원에도 결합할 수 있다. 그러나, 이와 같은 교차-종 반응성(cross-species reactivity) 자체는 항체의 분류를 특이적으로 변화시키지 않는다. 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 다른 대립 형질(allelic form)의 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 이와 같은 교차 반응성 자체는 항체의 분류를 특이적으로 변화시키지 않는다. 경우에 따라, 용어 "특이적 결합(specific binding)" 또는 "특이적으로 결합(specifically binding)"은 상호작용이 화학종(chemical species)의 특정 구조(예를 들어, 항원 결정기(antigenic determinant) 또는 에피토프(epitope))의 존재에 의존한다는 것을 의미하기 위해 항체, 단백질 또는 펩티드와 제2 화학종의 상호작용과 관련하여 사용될 수 있고; 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고 이에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응에서 에피토프 A (또는 유리된 비표지(free unlabeled) A)를 함유하는 분자의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
"가용성 수용체(soluble receptor)"는 세포막에 결합되지 않은 수용체 폴리펩티드이다. 가용성 수용체는 막횡단(transmembrane) 및 세포질 도메인이 결여된 가장 흔한 리간드-결합 수용체 폴리펩티드이다. 가용성 수용체는 폴리펩티드의 정제를 제공하거나 기질에 폴리펩티드의 부착을 위한 부위 또는 면역글로불린 불변 영역(constant region) 서열을 제공하는 친화성 태그(affinity tag)와 같은 추가 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 많은 세포-표면 수용체는 단백질 분해에 의해 생성된 자연 발생적인 가용성 대응물(counterpart)을 가진다. 가용성 수용체 폴리펩티드는 그것들이 각각 막 고정(membrane anchring) 또는 신호전달을 제공하기 위한 이들 분절(segment)의 충분한 부분이 결핍된 경우, 막횡단 및 세포내 폴리펩티드 분절을 실질적으로 포함하지 않는 것으로 간주된다.
"통계적으로 유의한(statistically significant)"은 결과가 우연히 발생하지 않았음을 의미한다. 통계적 유의성(statistical significance)은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 사용되는 유의성의 척도는 귀무가설(null phpothesis)이 참(true)이라면, 관측된 사건이 발생할 빈도(frequency) 또는 확률(probability)인 p-값(p-value)을 포함한다. 관찰된 p-값이 유의수준(significance level)보다 작으면, 귀무가설은 기각된다. 단순한 경우, 유의 수준은 0.05 이하의 p-값으로 정의된다. "감소된(decreased)" 또는 "감소된(reduced)" 또는 "적은(less)" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의한" 또는 생리학적으로 유의한 양이고, 본원에 기술된 양 또는 레벨의 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50배 또는 그 이상의 배수(예를 들어, 100, 500, 1000배) (1 이상 및 그 사이의 모든 정수 및 소수점, 예를 들어 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 등을 포함)의 감소를 포함할 수 있다.
용어 "자극(stimulation)"은 자극 분자(예를 들어, TCR/CD3 복합체)와 그것의 동족 리간드가 결합하고, 그것에 의하여 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달과 같은 신호 전달 사건을 매개함으로써 유도된 일차 반응을 의미한다. 자극은 TGF-β의 하향조절 및/또는 세포 골격 구조의 인식 등과 같은 특정 분자의 변경된 발현을 매개할 수 있다.
"자극 분자(stimulatory molecule)"는 항원 표출 세포 상에 존재하는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포 상의 분자를 말한다.
"자극 리간드(stimulatory ligand)"는 항원 표출 세포(예를 들어, APC, 수지상 세포, B-세포 등) 상에 존재할 때, T 세포 상의 동족 결합 파트너(본원에서 "자극 분자"로 칭함)와 특이적으로 결합하여 활성화, 면역반응의 개시, 증식 등을 포함하는 T 세포에 의한 일차 반응을 매개할 수 있는 리간드를 말한다. 자극 리간드는 당업계에 잘 알려져 있으며, 특히 펩티드, 항-CD3 항체, 과작동제(superagonist) 항-CD28 항체 및 과작동제 항-CD2 항체가 로딩된 MHC 클래스 I 분자를 포함한다.
본원에 사용된 것과 같은 "실질적으로 정제된(substantially purified)" 세포는 다른 세포 유형을 본질적으로 포함하지 않는 세포이다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 자연 발생적인 상태와 보통 관련이 있는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 말한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포 집단은 균질한(homogeous) 세포 집단을 말한다. 다른 경우에, 이 용어는 단지 그것의 자연 상태와 자연적으로 관련이 있는 세포로부터 분리된 세포만을 말한다. 일부 실시예에서, 세포는 시험관 내(in vitro)에서 배양된다. 다른 실시예에서, 세포는 시험관 내에서 배양되지 않는다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "치료적(therapeutic)"은 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료학적 효과는 질병 상태의 억제(suppression), 소멸(remission) 또는 근절(eradication)에 의해 얻어진다.
용어 "치료학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 의도되는 조직, 시스템 또는 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응을 이끌어낼 수 있는 대상 화합물의 양을 말한다. 상기 용어 "치료학적 유효량"은 투여되었을 때 치료될 질환 또는 질병의 하나 또는 그 이상의 징후 또는 증상의 발병(development)을 예방하거나 이를 어느 정도 완화시키는데 충분한 화합물의 양을 포함한다. 치료학적 유효량은 화합물, 치료될 대상체의 질병 및 질병의 심각성 및 연령, 무게 등에 따라 달라질 것이다.
본원에 사용된 용어로서 질병을 "치료한다(treat)"는 것은 대상체가 겪는 질병 또는 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 심각성을 감소시키는 것을 의미한다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "형질감염된(transfected)" 또는 "형질전환된(transformed)" 또는 "형질도입된(transduced)"은 외생적 핵산이 숙주 세포 내로 전달 또는 도입되는 과정을 말한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외생적 핵산으로 형질감염되고, 형질전환되거나 그것이 형질도입된 세포이다. 세포는 일차 대상 세포와 그것의 자손을 포함한다.
본원에 사용된 것과 같은 어구 "전사적 조절하에(under transcriptional control)" 또는 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 프로모터가 RNA 폴리머라아제에 의한 전사의 개시와 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하기 위해 폴리뉴클레오티드와 관련하여 정확한 위치 및 배향에 있음을 의미한다.
"벡터(vector)"는 분리된 핵산을 포함하고, 상기 분리된 핵산을 세포의 내부로 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 구성이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성(amphiphilic) 화합물과 결합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하는 많은 벡터들이 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 상기 용어 "벡터"는 자기 복제(autonomously replicating) 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 예를 들어, 폴리리신 화합물, 리포좀 등과 같은 세포 내로의 핵산의 전달을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스성 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 렌티바이러스는 복잡한 레트로바이러스이며, 일반적인 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env 이외에 조절 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 몇 가지의 렌티바이러스의 예는 인간 면역 결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Viruses: HIV-1, HIV-2) 및 원숭이 면역 결핍 바이러스(Simian Immunodeficiency Viruses: SIV)를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 HIV 독성 유전자(virulence gene)를 다중으로 약화(attenuating)시킴으로써 생성되고, 예를 들어 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef가 결실되어 벡터는 생물학적 안전하다.
범위: 본 명세서 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 양상들이 다양한 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의상 간략화를 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위 범위와 그 범위 내의 개별 값을 갖는 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6과 같이 특별히 개시된 하위 범위뿐만 아니라, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6과 같은 그 범위 내의 개별 값을 갖는 것으로 고려되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용한다.
본 발명은 분리된 핵산 서열, 상기 분리된 핵산 서열을 포함하는 벡터, 상기 분리된 핵산 서열을 포함하는 세포 및 이러한 세포를 이용하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
조성물 및 치료학적 적용
본원의 실시예는 변형된 예정된 세포사멸 단백질 1(PD-1)을 암호화하는 핵산 서열 및 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 변형된 PD-1 및 CAR은 별개의 폴리펩티드인 유전자 산물로서 발현된다. 이러한 경우, CAR은 암세포 상에 존재하는 종양 항원에 특이적이며, 상기 암세포는 PD-L1을 발현한다.
CAR은 일반적으로 세포외 및 세포내 도메인을 포함하는 분자이다. 세포외 도메인은 표적-특이적 결합 요소(target-specific binding element)를 포함한다. 세포내 도메인(예를 들어, 세포질 도메인)은 공자극 신호 영역 및 제타 사슬 부분(zeta chain portion)을 포함한다. 공자극 신호 영역은 공자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분을 말한다. 공자극 분자는 항원 수용체 또는 그것의 리간드 외에, 항원에 대한 림프구의 효과적인 반응에 필요한 세포 표면 분자이다.
CAR의 세포외 도메인과 막횡단 도메인 사이에, 스페이서 도메인(spacer domain)이 통합될 수 있다. 본원에 사용된 것과 같은 용어 "스페이서 도메인"은 일반적으로 폴리펩티드 사슬에 있는 세포외 도메인 또는 세포질 도메인 중 어느 하나에 막횡단 도메인을 연결시키는 기능을 하는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 스페이서 도메인은 300개까지의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100개의 아미노산 및 가장 바람직하게는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명에서 CAR의 표적-특이적 결합 요소는 종양 항원을 인식할 수 있다. 종양 항원은 면역 반응, 특히 T-세포 매개성 면역 반응을 이끌어내는 종양 세포에 의해 생성된 단백질이다. 종양 항원은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 신경교종-관련 항원(glioma-associated antigen), 암배아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA), β-인간 융모성 성선자극 호르몬(β-human chorionic gonadotropin), 알파 태아단백질(alphafetoprotein, AFP), 렉틴-반응성(lectin-reactive) AFP, 티로글로불린(thyroglobulin), RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라아제 역전사 효소(human telomerase reverse transcriptase), RU1, RU2 (AS), 장내 카르복실 에스테라아제(intestinal carboxyl esterase), mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타아제(prostase), 전립선-특이적 항원(prostate-specific antigen, PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인(prostein), PSMA, Her2/neu, 서바이빈(survivin)과 텔로머라아제, 전립선-암종 종양 항원-1(prostate-carcinoma tumor antigen-1, PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타아제(neutrophil elastase), 에피린B2(ephrinB2), CD22, 인슐린 성장 인자(insulin growth factor, (IGF)-1, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린(mesothelin)을 포함한다.
일부 실시예에서, 종양 항원은 HER2, CD19, CD20, CD22, 카파 사슬 또는 경쇄, CD30, CD33, CD123, CD38, ROR1, ErbB3/4, EGFR, EGFRvIII, EphA2, FAP, 암배아성 항원, EGP2, EGP40, 메소텔린, TAG72, PSMA, NKG2D 리간드, B7-H6, IL-13 수용체 α2, IL-11 수용체 α, MUC1, MUC16, CA9, GD2, GD3, HMW-MAA, CD171, 루이스 Y, G250/CAIX, HLA-AI MAGE A1, HLA-A2 NY-ESO-1, PSC1, 엽산 수용체-α, CD44v7/8, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아 AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, TEM1, TEM8, 또는 종양에 의해 발현된 바이러스-관련 항원을 포함한다.
일부 실시예에서, 본 발명의 CAR의 항원 결합 요소는 CD19를 표적으로 한다. 일부 경우, 본 발명의 CAR의 항원 결합 요소는 SEQ ID NO: 1로 제시되는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD19 scFV를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 발명의 CAR의 막횡단 도메인은 CD8 또는 CD9 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 CAR의 세포내 도메인은 4-1BB(CD137) 또는 CD28의 세포내 도메인을 포함한다. CD28 패밀리의 구성원인 PD-1은 단일 면역글로불린(Ig)-유사 가변 도메인을 함유하는 세포외 도메인과 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프를 함유하는 세포내 도메인을 가지는 타입 1 막횡단 단백질이다. PD-1은 활성화된 T-세포, B 림프구, 자연 살해 세포(natural killer cell), 수지상 세포, 및 활성화된 단핵구(monocyte) 상에서 발현된다. PD-1과 그것의 리간드인 PD-L1 및 PD-L2 사이에서의 상호작용은 T-세포 소모(exhaustion), 불활성화(inactivation) 및 아폽토시스(apoptosis)를 야기한다.
소모성(exhausted) T 림프구는 IL-2, 종양 괴사 인자-α 및 인터페론-γ를 포함하는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 생산하는 능력을 상실한다. 다양한 조직들에 의한 PD-L1의 발현은 말초성(peripheral) 면역관용을 매개하고, PD-1/PD-L1 축(axis)의 활성화는 조직 손상 후 지속적인 면역/염증 반응을 제한한다. PD-1을 발현하는 종양-침윤성(tumor-infiltrating) 림프구는 손상된 항종양 효과 및 PD-1의 상향조절과 관련이 있고, PD-L1은 여러 종양 유형에서의 결과와 관련이 있다.
실시예는 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열과 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열은 야생형 PD-1의 세포내 부분을 암호화하는 핵산 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환 또는 결실을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열은 야생형 PD-1의 세포내 부분을 암호화하는 핵산 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 예를 들어, 변형된 PD-1은 SEQ ID NO: 14의 핵산 서열을 포함하는 인간 PD-1이다.
일부 실시예에서, 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열은 세포내 도메인을 포함하지 않는 절단된(truncated) PD-1을 암호화하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 12의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 변형된 PD-1은 야생형 PD-1과 비교하여 하나 또는 그 이상의 점 돌연변이를 포함한다. 특정 실시예에서, 점 돌연변이는 야생형 PD-1의 인산화 부위의 하나 또는 둘 이상의 아미노산 점 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 점 돌연변이는 티로신 잔기 223 및/또는 티로신 잔기 248의 점 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 실시예는 또한 CAR을 암호화하는 서열과 변형된 PD-1을 포함하는 DNA 구조물(construct)에 관한 것이다. 일부 실시예에서, CAR은 CD3-제타, CD28, 4-1BB 등의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 CAR은 항-CD19 scFv, 인간 CD8 힌지(hinge)와 막횡단 도메인, 및 인간 4-1BB 및 CD3제타 신호 도메인을 포함한다. 일 실시예에서, 본 발명의 CAR은 SEQ ID NO: 1로 제시된 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site) 요소는 다중 유전자(multigene), 또는 다시스트론성(polycistronic) 또는 메세지를 생성하는데 사용된다. 예를 들어, IRES 요소는 CAR을 암호화하는 핵산 서열 및 다양한 변형된 PD-1 중 하나를 암호화하는 핵산 서열을 연결시킬 수 있다(표 1을 참조).
원하는 분자를 코딩하는 핵산 서열은 예를 들어, 표준 기술을 사용하여 그 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의하여, 그 유전자를 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 유전자를 유도하는 것에 의하여, 또는 그 유전자를 함유하는 세포 또는 조직으로부터 직접적으로 분리하는 것에 의한 것과 같은 당업계에 공지된 재조합 방법을 사용하여 얻어질 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자는 복제(cloned)보다는 합성적으로 생산될 수 있다.
본 발명의 실시예는 또한, 본 발명의 DNA가 삽입된 벡터에 관한 것이다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 전이유전자(transgene)를 장기간, 안정적으로 통합(integration)시키고 딸 세포(daughter cell)에서 증식시킬 수 있게 하므로, 장기적인 유전자 전달을 달성하는데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 간세포와 같은 비증식성 세포를 형질도입시킬 수 있다는 점에서, 쥣과의 백혈병 바이러스(leukemia virus)와 같은 암성 레트로바이러스(onco-retrovirus)로부터 유래된 벡터에 비해 부가적인 이점을 가진다. 그것들은 또한 낮은 면역원성의 부가적인 이점을 가진다.
CAR 및 변형된 PD-1을 암호화하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 CAR 폴리펩티드 또는 그것들의 일부를 암호화하는 핵산을 하나 또는 그 이상의 프로모터에 작동 가능하게 연결시키고, 그 구조물을 발현 벡터 내로 통합시킴으로써 달성된다. 벡터는 진핵생물의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결자(terminator), 개시 서열(initiation sequence), 및 원하는 핵산 서열의 발현을 조절하는데 유용한 프로모터를 함유한다.
CAR 및 변형된 PD-1을 암호화하는 합성 핵산의 발현 및 포유동물 세포 내로의 유전자 전달에 관한 추가 정보는 그 전체가 참조문헌으로 본원에 인용되어 있는 미국 특허 제8,906,682호에 제공되어 있다.
실시예는 또한, CAR 및 변형된 PD-1을 발현하는 유전적으로 변형된 세포(예를 들어, T 세포)에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 우성 음성(dominant negative) PD-1은 우성 음성 PD-1이 종양 세포의 PD-L1에 의해 유도된 야생형 PD-1 활성을 억제하도록 T 세포에 도입된다. 특정 실시예에서, 유전적으로 변형된 T 세포는 비기능적(non-functional) PD-1을 발현한다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 T 세포는 세포내 도메인을 포함하지 않는, 세포내 도메인과 막횡단 도메인 모두를 포함하지 않는, 또는 본 발명에 기술된 것과 같은 점 돌연변이를 포함하는 PD-1 분자를 발현한다.
일부 실시예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 T 세포의 사이토카인 생산에 대한 종양 세포의 PD-L1의 억제 효과는 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열의 적어도 한 부분을 포함하지 않는 T 세포의 사이토카인 생산에 대한 PD-L1의 억제 효과보다 작다.
예를 들어, 본 발명의 유전적으로 변형된 T 세포의 사이토카인 생산에 대한 PD-L1의 억제 효과는 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열의 적어도 일부를 포함하지 않는 T 세포의 사이토카인 생산에 대한 PD-L1의 억제 효과를 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 감소시키는데 충분하다.
일부 실시예에서, 유전적으로 변형된 T 세포는 야생형 PD-1과 비교하여 하나 또는 그 이상의 점 돌연변이를 가지는 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 점 돌연변이는 야생형 PD-1의 인산화 부위의 하나 또는 두 개 이상의 아미노산 점 돌연변이를 포함한다. 특정 실시예에서, 유전적으로 변형된 T 세포는 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 야생형 PD-1의 세포내 부분을 암호화하는 핵산 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 예를 들어, 변형된 PD-1을 암호화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14의 핵산 서열을 포함한다.
실시예는 또한, 환자에게 유효량의 본 발명의 조작된(engineered) 세포를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 병(illness)을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 난소 암종(ovarian carcinoma), 유방 암종(breast carcinoma), 결장 암종(colon carcinoma), 다형성 교모세포종(glioblastoma), 전립성 암종(prostate carcinoma) 및 백혈병(leukemia)과 같은 암을 포함하는 다양한 병들이 본 발명에 따라 치료될 수 있다. 일부 실시예에서, 방법은 항종양적 유효량의 인간 T 세포의 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 인간 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 인간 T 세포의 집단은 본 발명에 기술된 것과 같은 핵산 서열을 포함하는 인간 T 세포를 포함한다.
치료될 수 있는 암은 혈관이 형성(vascularized)되지 않은, 또는 아직 실질적으로 혈관이 형성되지 않은 종양뿐만 아니라 혈관이 형성된 종양 또한 포함한다. 상기 암은 (혈액 종양(hematological tumor), 예를 들어 백혈병 및 림프종과 같은) 비-고형 종양(non-solid tumor)을 포함할 수 있거나, 고형 종양을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR로 치료될 암의 유형은 암종(carcinoma), 아세포종(blastoma) 및 육종(sarcoma), 및 특정 백혈병 또는 악성 림프종(lymphoid malignancy), 양성(benign) 및 악성 종양(malignant tumor), 및 악성 종양(malignancy), 예컨대 육종, 암종 및 흑색종(melanoma)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암 또한 포함된다.
혈액암은 혈액 또는 골수(bone marrow)의 암이다. 혈액(또는 혈행성(hematogenous)) 암의 예는 (림프구성 백혈병(lymphocytic leukemia), 급성 골수세포 백혈병(acute myelocytic leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia), 및 골아구성 백혈병(myeloblastic leukemia), 전골수성 백혈병(promyelocytic leukemia), 골수단핵구성 백혈병(myelomonocytic leukemia), 단핵구성 백혈병(monocytic leukemia) 및 적백혈병(erythroleukemia)과 같은 급성 백혈병(acute leukemia), (만성 골수세포(과립구성) 백혈병(chronic myelocytic(granulocytic) leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 및 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)과 같은) 만성 백혈병, 적혈구 증가증(polycythemia vera), 림프종(lymphoma), 호지킨병(Hodgkin's disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)(지연성(indolent) 및 고등급(high grade) 형태), 다발성 골수종(multiple myeloma), 발덴스트롬 거대글로불린혈증(waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄 질병(heavy chain disease), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 모발상세포 백혈병(hairy cell leukemia) 및 골수이형성증(myelodysplasia)을 포함하는 백혈병을 포함한다.
고형 종양은 보통 낭종(cyst) 또는 액체 영역을 함유하지 않는 조직의 비정상적인 덩어리(mass)이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 상이한 유형의 고형 종양은 (육종, 암종 및 림프종과 같은) 종양을 형성하는 세포의 유형에 따라 명명된다. 육종과 암종과 같은 고형 종양의 예는 섬유육종(fibrosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 골육종(osteosarcoma) 및 기타 육종, 활막종(synovioma), 중피종(mesothelioma), 유윙종양(Ewing's tumor), 평활근육종(leiomyosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 결장 암종(colon carcinoma), 악성 림프종(lymphoid malignancy), 췌장암(pancreatic cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 편평세포 암종(squamous cell carcinoma), 기저세포 암종(basal cell carcinoma), 선암(adenocarcinoma), 땀샘 암종(sweat gland carcinoma), 갑상선 수질 암종(medullary thyroid carcinoma), 갑상선 유두 암종(papillary thyroid carcinoma), 갈색세포종(pheochromocytoma), 피지샘 암종(sebaceous gland carcinoma), 유두 암종(papillary carcinoma), 유두 선암(papillary adenocarcinoma), 수질 암종(medullary carcinoma), 기관지원성 암종(bronchogenic carcinoma), 신세포 암종(renal cell carcinoma), 간세포암(hepatoma), 담관 암종(bile duct carcinoma), 융모암종(choriocarcinoma), 빌름스 종양(Wilm's tumor), 자궁 경부암(cervical cancer), 고환 종양(testicular tumor), 정상피종(seminoma), 방광 암종(bladder carcinoma), 흑색종(melanoma) 및 [(뇌간 신경교종(brainstem glioma) 및 혼합 신경교종(mixed glioma)과 같은) 신경교종(glioma), 교모세포종(glioblastoma)(다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme)으로도 알려져 있음), 성상세포종(astrocytoma), CNS 림프종(CNS lymphoma), 배아세포종(germinoma), 수모세포종(medulloblastoma), 신경초종(schwannoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 상의세포종(ependymoma), 송과체종(pinealoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 청신경종(acoustic neuroma), 핍지교종(oligodendroglioma), 뇌수막종(meningioma), 신경모세포종(neuroblastoma), 망막모세포종(retinoblastoma) 및 뇌 전이(brain metastases)와 같은] CNS 종양을 포함한다.
일반적으로, 본원에 기술된 것과 같은 활성화되고 증폭된(expanded) 세포는 면역력이 약화된 개체에서 발생하는 질병의 치료 및 예방에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 조작된 세포는 암의 치료에 사용된다. 특정 실시예에서, 본 발명의 세포는 암 발병의 위험이 있는 환자의 치료에 사용된다. 따라서, 본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 조작된 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 조작된 T 세포는 단독으로, 또는 희석제 및/또는 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 같은 기타 성분과 함께 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 간단하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 약제학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본원에 기술된 것과 같은 표적 세포 집단을 포함할 수 있다. 이와 같은 조성물은 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등과 같은 완충액; 글루코스, 만노오스, 수크로오스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩티드 또는 글리신과 같은 아미노산; 항산화제; EDTA와 같은 킬레이트제 또는 글루타티온; 보조제(adjuvant)(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드); 및 방부제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 정맥내 투여용으로 제형화된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 치료될(또는 예방될) 질병에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 적절한 투여량(dosage)은 임상 시험에 의해 결정될 수 있지만, 투여량과 빈도는 환자의 상태, 환자의 질병의 유형과 심각도와 같은 그러한 인자에 의해 결정될 것이다.
"면역학적 유효량(an immunologically effective amount)", "항종양적 유효량(an anti-tumor effective amount)","종양억제적 유효량(a tumor-inhibiting effective amount)", 또는 "치료량(therapeutic amount)"이 언급될 경우, 투여되는 본 발명의 조성물의 정확한 양은 환자(대상체)의 연령, 무게, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도(extent) 및 상태의 개체차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 본원에 기술된 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 104 내지 109 세포/체중 1kg, 바람직하게는 105 내지 106 세포/체중 1kg의 투여량으로 투여될 수 있으며, 이들 범위 내의 모든 정수값을 포함하는 것이 일반적이다. T 세포 조성물은 또한 이러한 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에서 일반적으로 공지된 주입 기술을 이용하여 투여될 수 있다(예를 들어, Rosenberg et al., New England Journal of Medicine 319 : 1676, 1988 참조). 특정 환자에 대한 최적 투여량 및 치료 요법은 질병의 징후에 대해 환자를 관찰하고, 그에 따라 치료를 조정함으로써 의약 분야에서의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
특정 실시예에서, 활성화된 T 세포를 대상체에 투여하고, 이어서 혈액을 채혈하고(또는 성분채집(apheresis)을 수행하고), 본 발명에 따라 이로부터 T 세포를 활성화시키고, 이러한 활성화되고 증폭된 T 세포를 환자에게 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 과정은 몇 주에 걸쳐 여러 번 수행될 수 있다. 특정 실시예에서, T 세포는 10 cc 내지 400 cc의 혈액 채혈(blood draw)로부터 활성화될 수 있다. 특정 실시예에서, T 세포는 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc, 또는 100 cc의 혈액 채혈로부터 활성화된다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 다중 혈액 채혈/다중 재주입 프로토콜의 사용은 특정 T 세포의 집단을 선택할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여는 에어로졸 흡입(aerosol inhalation), 주사(injection), 섭취(ingestion), 수혈(transfusion), 주입(implantation) 또는 이식(transplantation)에 의한 것을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 환자에게 피하(subcutaneously), 피내(intradermally), 종양내(intratumorally), 비강내(intranodally), 골수내(intramedullary), 근육내(intramuscularly), 정맥내(intravenous, i.v.) 주사, 또는 복강내(intraperitoneally)로 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 환자에게 피내 또는 피하 주사로 투여된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 바람직하게는 정맥내 주사로 투여된다. T 세포의 조성물은 종양, 림프절 또는 감염 부위 내로 직접 주사될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예에서, 본원에 기술된 방법 또는 T 세포가 치료적 수준으로 증폭되는 그 분야에서 공지된 다른 방법을 사용하여 활성화되고 증폭된 세포는, 항바이러스제 치료, 시도포비어(cidofovir) 및 인터류킨-2(interleukin-2), 시타라빈(Cytarabine)(ARA-C로도 알려져 있음)과 같은 약제를 이용한 치료 또는 MS 환자를 위한 나탈리주맙(natalizumab) 치료 또는 건선 환자를 위한 에파리주맙(efalizumab) 치료 또는 PML 환자를 위한 기타 치료를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 수의 관련 치료 방법(treatment modality)과 병행하여 (예를 들어, 이전, 동시 또는 후에) 환자에게 투여된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 T 세포는 화학요법; 방사선; 시클로스포린(cyclosporin), 아자티오프린(azathioprine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미코페놀레이트(mycophenolate) 및 FK506과 같은 면역억제제, 또는 CAM PATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 시톡신(cytoxin), 플루다라빈(fludarabine), 시클로스포린, FK506, 라파마이신(rapamycin), 미코페놀산, 스테로이드(steroid), FR901228, 사이토카인 및 방사선 조사(irradiation)와 같은 면역절제제(immunoablative agent)와 병행하여 사용될 수 있다. 이러한 약물은 칼슘 의존성 포스파타아제 칼시뉴린(calcium dependent phosphatase calcineurin)을 억제하거나(시클로스포린 및 FK506), 신호전달에 의해 유도되는 성장 인자에 중요한 p70S6 키나아제를 억제한다(라파마이신(rapamycin))(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun 5:763-773, 1993; Isoniemi (supra)). 다른 실시예에서, 본 발명의 세포 조성물은 골수 이식; 플루다라빈과 같은 화학치료제, 외부 방사선 요법(external-beam radiation therapy, XRT), 시클로포스파미드(cyclophosphamide) 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체 중 어느 하나를 사용하는 T 세포 절제요법(T-cell ablative therapy)과 병행하여(예를 들어, 이전, 동시 또는 후에) 환자에게 투여된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물은 CD20과 반응하는 제제, 예를 들어 리툭산(Rituxan)과 같은 B-세포 절제요법에 후에 투여된다. 예를 들어, 일 실시예에서, 대상체는 고용량(high dose) 화학요법을 이용한 표준 치료를 받은 다음 말초 혈액 조혈모세포 이식을 받을 수 있다. 특정 실시예에서, 이식 후 대상체는 본 발명의 증폭된 면역 세포를 주입받는다. 추가 실시예에서, 증폭된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다.
환자에게 투여되는 상기 치료의 투여량은 치료될 상태의 정확한 특성 및 치료를 받는 수용자(recipient)에 따라 달라질 것이다. 인간에의 투여를 위한 투여량의 스케일링(scaling)은 당해 분야에서 허용되는 관행에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, CAMPATH에 대한 복용량은 일반적으로 성인 환자에 대해 1 내지 약 100 mg의 범위일 수 있고, 통상적으로 1 내지 30일의 기간 동안 매일 투여된다. 일부의 경우 40 mg/1일까지의 더 큰 투여량이 사용될 수 있지만, 바람직한 1일 투여량은 1 내지 10 mg/일이다(그 전체가 본원에 참조문헌으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,120,766호에 기술되어 있다).
조작된 T 세포를 이용하는 암 치료 방법에 대한 추가정보는 그 전체가 본원에 참조문헌으로 인용되어 있는 미국 특허 제8,906,682호에 제공되어 있다.
실시예는 또한, 대상체의 암을 치료 및/또는 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 PD-1의 세포외 도메인을 포함하는 치료학적 유효량의 가용성 수용체를 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 가용성 수용체는 PD-L1 단백질과 결합하고, 상기 가용성 수용체는 암세포의 PD-1 신호전달을 파괴하고/하거나 PD-L1에 결합하는 PD-1을 파괴한다. 특정 실시예에서, 분리된 가용성 수용체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 잔기 20-519를 포함한다.
"가용성 수용체"는 세포막에 결합하지 않는 수용체 폴리펩티드이다. 가용성 수용체는 막횡단 및 세포질 도메인이 결여된 가장 일반적인 리간드-결합 수용체 폴리펩티드이다. 가용성 수용체는 폴리펩티드의 정제를 위해 제공되거나 기질에 대한 폴리펩티드의 부착을 위한 부위 또는면역글로불린 불변 영역 서열을 제공하는 어피니티 태그와 같은 추가 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 많은 세포-표면 수용체는 단백질 분해에 의해 생성된 자연 발생적인 가용성 대응물을 가진다. 가용성 수용체 폴리펩티드는 그것들이 각각 막 고정 또는 신호 전달을 제공하기 위한 이들 분절의 충분한 부분이 결핍된 경우, 막횡단 및 세포내 폴리펩티드 분절을 실질적으로 포함하지 않는 것으로 간주된다.
실시예는 또한, 수용체 폴리펩티드를 포함하는 변형된 세포에 관한 것이고; 상기 수용체 폴리펩티드의 세포질 도메인은 절단되고; 상기 수용체 폴리펩티드는 예정된 세포사멸 단백질 1(PD-1) 수용체 폴리펩티드, 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4) 수용체 폴리펩티드, 또는 B- 및 T-림프구 감쇠인자(BTLA) 수용체 중 적어도 하나이다.
실시예는 또한, 질병을 가진 대상체를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 질병을 가진 대상체에 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 세포는 수용체 폴리펩티드, 상기 수용체 폴리펩티드의 세포질 도메인은 절단되고, 상기 수용체 폴리펩티드는 예정된 세포사멸 단백질 1(PD-1) 수용체 폴리펩티드, 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4) 수용체 폴리펩티드, 또는 B- 및 T-림프구 감쇠인자(BTLA) 수용체 중 적어도 하나이고; 및 특정 항체의 항원 인식 도메인과 세포내 도메인 또는 변형된 또는 야생형 T 세포 수용체를 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 변형되고, 상기 특정 항체는 항원에 결합한다.
일부 실시예에서, 수용체 폴리펩티드는 PD-1 수용체 폴리펩티드이고, 여기에서 PD-1 수용체 폴리펩티드의 세포질 도메인은 면역수용체 티로신-기반 모티프를 함유한다.
실시예는 또한, 상응하는 야생형 세포와 비교하여 감소된 양의 하나 또는 그 이상의 수용체를 포함하는 변형된 세포에 관한 것이며, 상기 하나 또는 그 이상의 수용체는 예정된 세포사멸 단백질 1(PD-1), 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4), 또는 B- 및 T-림프구 감쇠인자(BTLA) 중 적어도 하나를 포함한다.
실시예는 또한, 질병을 가지는 대상체를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 질병을 가지는 대상체에 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 세포는 상응하는 야생형 세포와 비교하여 감소된 양의 하나 또는 그 이상의 수용체를 발현하도록 변형되고, 상기 하나 또는 그 이상의 수용체는 예정된 세포사멸 단백질 1(PD-1), 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4), 또는 B- 및 T-림프구 감쇠인자(BTLA) 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시예에서, 변형된 세포는 특정 항체의 항원 인식 도메인과 세포내 도메인, 또는 변형된 또는 야생형 T 세포 수용체를 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 더 포함한다. 특정 실시예에서, 변형된 세포는 특정 항체의 항원 인식 도메인과 세포내 도메인 또는 변형된 또는 야생형 T 세포 수용체를 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)을 더 포함하며, 상기 특정 항체는 항원에 결합한다.
일부 실시예에서, 변형된 세포는 상응하는 야생형 세포와 비교하여 하나 또는 그 이상의 수용체의 생합성 경로 또는 수송 경로, 또는 그것들의 조합과 관련된 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 감소시킨다. 특정 실시예에서, 변형된 세포는 하나 또는 그 이상의 유전자의 파괴를 포함한다. 특정 실시예에서, 변형된 세포는 하나 또는 그 이상의 유전자의 부분적 또는 완전 결실을 포함한다. 특정 실시예에서, 유전적으로 변형된 세포는 인간 환자의 생체 내(in vivo)에서 자기 복제를 한다.
일부 실시예에서, 변형된 세포는 인간 환자에서 기억 세포를 형성한다. 이러한 경우, 변형된 세포는 인간 환자에게 정맥내로 투여된다. 특정 실시예에서, 변형된 세포는 인간 환자에서 지속된다. 예를 들어, 변형된 세포는 자가 유래 T 세포이다. 다른 예를 들면, 세포는 B 세포, T 세포, NK 세포, 배아 세포 또는 수지상 세포 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 질병은 암, 면역 결핍, 자가면역 질환 또는 비만 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
발명의 상세한 설명은 첨부하는 도면을 참고로 하여 기술된다. 서로 다른 도면에서 동일한 참조 번호의 사용은 유사하거나 동일한 항목을 나타낸다.
도 1은 PO:CD19BBZETA, Pl:CD19BBZETA-ires-가용성(soluble) PD1, P2:CD19BBZETA-ires-절단된(Truncated) PD1, P3: CD19BBZETA-ires-점 돌연변이(point mutation) PD1, P4:CD19BBZETA-ires-결실(Deletion) PD1의 DNA 구성을 나타내는 개략도이다.
도 2는 도 2a 및 도 2b를 포함하며, 형질도입된 293T 및 K562 세포 상의 CAR 및 변형된 PF-1의 발현을 나타내는 시리즈 이미지이다. 도 2a는 형질도입된 293T 및 K562 세포 상의 CAR의 발현을 나타낸다. 도 2b는 형질도입된 293T 및 K562 세포 상의 변형된 PD-1의 발현을 나타낸다.
도 3은 도 3a 내지 3c를 포함하며, 1차 T 세포(primary T cell) 상의 CAR 및 변형된 PD-1의 발현을 나타내는 시리즈 이미지이다. 도 3a는 형질도입된 1차 T 세포 상의 CAR의 발현을 나타낸다. 도 3b 및 3c는 형질도입된 1차 T 세포 상의 변형된 PD-1의 발현을 나타낸다.
도 4는 도 4a 및 도 4b를 포함하며, CAR 및 변형된 PD-1이 형질도입된 T 세포의 세포독성을 나타내는 시리즈 이미지이다. 도 4a는 10:1의 E:T 비율로 24시간 동안 CD19+와 배양한 경우, CAR 및 변형된 PD-1이 도입된 104의 T 세포의 IFN-감마 방출을 나타낸다. 도 4b는 10:1의 E:T 비율로 24시간 동안 배양한 경우, CAR 및 변형된 PD-1이 도입된 104의 T 세포에 의한 CD19+ 세포의 사멸을 보여준다.
도 5는 형질도입된 NalM6 세포에서의 PD-L1의 발현을 나타낸다.
도 6은 도 6a 및 6b를 포함하며, 변형된 PD-1이 PD-L1에 의해 유도된 면역관용을 감소시킴을 보여주는 시리즈 이미지이다. 도 6a는 10:1의 E:T 비율로 24시간 동안 CD19+ 세포와 CD19+/PD-L1+ 세포를 배양한 경우, CAR 및 변형된 PD-1이 도입된 104의 T 세포의 IFN-감마 방출을 나타낸다. 이러한 결과는 PD-L1에 의해 유도된 세포독성의 억제가 CAR 및 변형된 PD-1이 도입된 T 세포에 의해 감소됨을 나타낸다. 도 6b는 PD-L1에 의해 유도된 세포독성의 소실이 CAR만이 단독으로 도입된 T 세포와 비교하여 CAR 및 변형된 PD-1이 도입된 T 세포에 의해 감소됨을 보여준다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 추가로 기술된다. 이들 실시예는 설명의 목적으로만 제공되며, 달리 명시하지 않는 한 제한하고자 하는 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 하기의 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 및 모든 변형들을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1
HEK293T & K562 세포 상에서의 CAR 및 PD-1의 발현
뇌심근염 바이러스(encephalomyocarditis virus)의 내부 리보송 유입 서열로 분리된 CD19 CAR 및 변형된 PD-1을 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 제작하였다(본원에 참조문헌으로 인용되어 있는 "Chimeric Receptors Chimeric Receptors Containing CD137 Signal Transduction Domains Mediate Enhanced Survival of T Cells and Increased Antileukemic Efficacy In Vivo Molecular Therapy vol. 17 no. 8, 1453 - 1464 Aug. 2009를 참조). CAR과 변형된 PD-1을 암호화하는 DNA 구조물의 정보는 도 1 및 표 1에 제공되어 있다. 이러한 구조물과 분자의 요약은 표 1 - 3에 열거되어 있다.
[표 1] DNA 구조물 및 암호 모듈
Figure 112017095179452-pct00001
HEK293T & K562 세포에 렌티바이러스 벡터를 형질도입시켰다. 유세포 계측(flow cytometry)을 수행하고, 이들 세포에서 CAR 및 PD-1의 발현을 결정하기 위해 분석하였다. 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, KECK293T 및 K562 세포 모두 CAR(도 2a의 박스 참조) 및 PD-1(도 2b의 박스 참조)을 발현하였다.
HEK293T 및 K562 세포는 미국의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, ATCC; Manassas, VA)으로부터 입수하였다. 세포 배양, 렌티바이러스의 제작 및 유세포 계측과 관련된 기술은 본원에 참조문헌으로 인용되어 있는 문헌에서 찾을 수 있다(Chimeric Receptors Containing CD137 Signal Transduction Domains Mediate Enhanced Survival of T Cells and Increased Antileukemic Efficacy In Vivo Molecular Therapy vol. 17 no. 8, 1453 - 1464 Aug. 2009).
[표 2] 다양한 구조물에 대한 서열 식별자(identifier)
Figure 112017095179452-pct00002
실시예 2
1차 T 세포 상에서의 CAR 및 PD-1의 발현
환자로부터 1차 T 세포를 수득하였다. 수득된 1차 T 세포에 렌티바이러스 벡터를 형질도입시켰다. 유세포 계측을 수행하고, 1차 T 세포에서의 CAR 및 PD-1의 발현을 결정하기 위하여 분석하였다. 도 3a, 3b 및 3c에 나타낸 바와 같이, 1차 T 세포는 CAR(도 3a의 박스를 참조) 및 PD-1(도 3b 및 3c의 박스를 참조)를 발현하였다.
세포 배양, 렌티바이러스의 제작 및 유세포 계측과 관련된 기술은 본원에 참조문헌으로 인용되어 있는 문헌에서 찾을 수 있다(Control of large, established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains. 3360 - 3365 PNAS March 3, 2009 vol. 106 no. 9).
[표 3] 서열
Figure 112017095179452-pct00003
Figure 112017095179452-pct00004
Figure 112017095179452-pct00005
Figure 112017095179452-pct00006
실시예 3
세포독성 T-림프구 분석
이 분석에서, 작동자 세포(즉, 형질도입된 T 세포)와 함께 배양된 표적 세포의 생존을 음성 대조군 세포(즉, 형질도입되지 않은 T 세포)와 함께 배양된 표적 세포의 생존과 비교하여 표적 세포(즉, K562-CD19)의 세포독성을 측정하였다. 표적 세포 및 작동자 세포 또는 음성 대조군 세포를, 표적 세포 및 작동자 세포 또는 음성 대조군 세포의 수 비(number ratio)를 약 10:1로 하여 약 24시간 동안 배양하였다. 표적 세포의 생존률 및 형질도입된 T 세포와 형질도입되지 않은 T 세포의 IFN-감마 생산을 측정하였다. 도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이, CAR 및 다양한 PD-1을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 형질도입된 T 세포는 IFN-감마를 방출할 수 있고, CD19 세포를 죽일 수 있다. 모든 오차 막대(error bar)는 표준편차를 나타낸다.
세포 배양, 렌티바이러스의 제작 및 유세포 계측과 관련된 기술은 본원에 참조문헌으로 인용되어 있는 문헌에서 찾을 수 있다(Control of large, established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains. 3360 - 3365 PNAS March 3, 2009 vol. 106 no. 9).
실시예 4
PD-L1-ires- EGFP Nalm -6 세포주의 제작
PD-L1-ires-EGFP(SEQ ID NO: 7)를 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 제작하였다. Nalm-6 세포에 T 세포 렌티바이러스 벡터를 30의 감염다중도(MOI) 또는 100의 감염다중도로 형질도입하였다. 유세포 계측을 수행하고, 이들 세포에서 CAR 및 PD-1의 발현을 결정하기 위하여 분석하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, NalM-6 PD-L1은 PD-L1을 발현하였다.
Nalm-6 세포는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC; Manassas, VA)로부터 입수하였다. 세포 배양, 렌티바이러스 벡터의 제작 및 유세포 계측과 관련된 기술은 본원에 참조문헌으로서 인용되어 있는 문헌에서 찾을 수 있다(Treatment of Advanced Leukemia in Mice with mRNA Engineered T Cells ° HUMAN GENE THERAPY 22:1575 - 1586 (December 2011)).
실시예 5
PD-L1에 의해 유도된 세포독성의 억제는 CAR 및 변형된 PD-1이 형질도입된 T 세포에서 감소되었다
표적 세포(즉, PD-L1을 발현하는 NalM-6 또는 NalM-6) 및 다양한 작동자 세포(즉, 형질도입된 T 세포) 또는 음성 대조군 세포(즉, 형질도입되지 않은 세포)를, 표적 세포 및 작동자 세포 또는 음성 대조군 세포의 수 비(number ratio)를 약 10:1로 하여 약 24시간 동안 배양하였다. 형질도입된 T 세포의 IFN-감마 생산을 측정하였다. 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, CAR T 세포에 의한 IFN-감마 생산은 감소되었고, 이는 NalM-6 세포 상의 PD-L1의 발현에 반응하는 세포독성의 손실을 나타낸다. 게다가, 변형된 PD-1을 가지지 않은 CAR T 세포와 비교하여, PD-L1에 의해 유도된 세포독성의 손실은 변형된 PD-1이 형질도입된 CAR T 세포에서 감소된다. 예를 들어, CAR 및 점 돌연변이를 가지는 PD-1이 형질도입된 T 세포(즉, P3)의 세포독성의 손실은 약 22%이고, 이는 변형된 PD-1을 가지지 않은 CAR T 세포(즉, P0)의 43%보다 더 낮다. 이는 PD-L1에 의해 유도된 세포독성의 억제는 CAR 및 변형된 PD-1이 형질도입된 T 세포에서 감소됨을 나타낸다. 모든 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.
세포 배양, 렌티바이러스의 제작 및 유세포 계측과 관련된 기술은 본원에 참조문헌으로 인용되어 있는 문헌에서 찾을 수 있다(Chimeric Receptors Containing CD137 Signal Transduction Domains Mediate Enhanced Survival of T Cells and Increased Antileukemic Efficacy in Vivo Molecular Therapy vol. 17 no. 8, 1453 - 1464 Aug. 2009).

Claims (41)

  1. CAR T 세포 치료법과 관련된 면역관용(immune tolerance)을 감소시키기 위한 약제학적 조성물로서, 인간 T 세포의 집단을 포함하는 약제학적 조성물에 있어서,
    상기 인간 T 세포의 집단은 핵산 분자를 포함하는 인간 T 세포를 포함하고,
    상기 핵산 분자는,
    SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 변형된 예정된 세포사멸 단백질 1(modified programmed cell death protein 1, PD-1)을 암호화하는 제1 핵산 서열; 및
    종양 항원을 인식하는 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 CD3-제타(CD3-zeta) 신호전달 도메인과 하나 이상의 공자극 분자(costimulatory molecules)의 하나 이상의 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고,
    상기 변형된 PD-1 및 상기 CAR은 별개의 폴리펩티드인 유전자 산물로서 발현되는 것인, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인간 T 세포의 사이토카인 생산에 대한 표적 세포에 의해 유도된 억제 효과는 CAR을 발현하고 변형된 PD-1이 결여된 인간 T 세포와 비교하여 감소되고, 상기 표적 세포는 종양 항원 및 예정된 사멸 리간드 1(PD-L1)을 발현하는, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 종양 항원은 CD19인, 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 하나 이상의 공자극 분자는 4-1 BB를 포함하는, 약제학적 조성물.
  5. 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 발현하는 인간을 제외한 동물 T 세포의 사이토카인 생산에 대한 표적 세포에 의해 유도되는 억제 효과를 감소시키는 방법에 있어서,
    상기 방법은 동물 T 세포 내로 핵산 분자를 도입하는 단계를 포함하며; 여기에서
    상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 변형된 예정된 세포사멸 단백질 1(modified programmed cell death protein 1, PD-1)을 암호화하고,
    상기 CAR은,
    종양 항원을 인식하는 세포외 도메인,
    막횡단 도메인, 및
    CD3-제타(CD3-zeta) 도메인과 하나 이상의 공자극 분자(costimulatory molecules)의 하나 이상의 신호전달 도메인을 포함하고,
    상기 표적 세포는 종양 항원 및 예정된 사멸-리간드 1(programmed death-ligand 1, PD-L1)을 발현하고,
    상기 변형된 PD-1 및 상기 CAR은 별개의 폴리펩티드인 유전자 산물로서 발현되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 종양 항원은 CD19인, 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 하나 이상의 공자극 분자는 4-1 BB를 포함하는, 방법.
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