JP7198302B2 - Ｐｄ－１を介した免疫チェックポイント阻害剤の生物活性試験法 - Google Patents
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本発明は、高精度かつ簡便なＰＤ－１を介した免疫チェックポイント阻害剤の生物活性試験法及びこれに用いる細胞株に関する。
Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ－１（ＰＤ－１）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞等の免疫細胞に発現しており、そのリガンドであるＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ １－ Ｌｉｇａｎｄ １（ＰＤ－Ｌ１）との相互作用によって免疫抑制性シグナルを伝達する受容体である（非特許文献１）。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞傷害活性によってがん細胞の増殖を抑制するため、がん免疫において重要である。しかしながら、一部のＮＫ細胞に発現するＰＤ－１とがん細胞のもつＰＤ－Ｌ１の結合によりＮＫ細胞の機能低下を引き起こすことが報告されている（非特許文献２）。
２００２年にマウスを用いた研究で、がん細胞の免疫回避機構にＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナルが関与し、同シグナルを阻害することでがん細胞の増殖が抑制されることが示された（非特許文献３）。その後の研究でもＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナルの阻害が良好な抗腫瘍作用を示したことから、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル阻害薬として、多くのＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対する治療用抗体が開発されている（非特許文献４）。今後、後続品も含めてＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を介する免疫チェックポイント阻害薬開発の需要は更に高まることが予想されるが、効率的な開発には薬効を評価するための適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系が必要である。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１分子間の結合阻害作用は、Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ－ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）等で簡便に測定可能である。また、ＰＤ－１シグナルによって発現が調節されるルシフェラーゼ遺伝子を導入したＴ細胞株とＰＤ－Ｌ１を発現させた標的細胞株を用いるレポーターアッセイ系が開発され、細胞間のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達阻害作用についても簡便に測定可能となった（非特許文献５）。
しかしながら、上記の通り、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナルの阻害による実際の細胞傷害活性の増強の測定については、動物実験又はがん患者由来細胞を用いる測定系で数週間要する方法が一般的であり、簡便に測定可能なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系は現在存在しない（非特許文献６及び７）。
Ｇｏｒｄｏｎ Ｊ．Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｄ－１ Ｉｍｍｕｎｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｂ７ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ Ｌｅａｄｓ ｔｏ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．， Ｊ． Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，第１９２巻（第７号），第１０２７－１０３４頁（２０００年）
Ｐａｏｌａ Ｖａｃｃａら，Ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ：Ｆｒｉｅｎｄｓ ｏｒ ｆｏｅｓ？， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．，第２０１巻，第１４－１９頁（２０１８年）
Ｙｏｓｈｉｋｏ Ｉｗａｉら，Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ＰＤ－Ｌ１ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｓｃａｐｅ ｆｒｏｍ ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ＰＤ－Ｌ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，第９９巻（１９），第１２２９３－７頁（２００２年）
Ｘｉｎ Ｌｉｎら，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ： Ｆｒｏｍ ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．，第１８６巻，第１１１８７６頁（２０２０年）
Ｌａｎ Ｗａｎｇら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒｏｂｕｓｔ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ－ＰＤ－１／ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ．，第１４５巻，第４４７－４５３頁（２０１７年）
Ｒａｙｍｏｎｄ Ｍ Ｗｏｎｇら，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬｓ．， Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第９巻（１０），第１２２３－３４頁（２００７年）
Ｒｏｓｓ Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＥＤＩ４７３６， ａｎ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．，第３巻（９），第１０５２－６２頁（２０１５年）
したがって、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を介する免疫チェックポイント阻害薬の効率的な開発には薬効を評価するための適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系が必要であり、さらなる信頼性のある効果的な体系的試験法の開発が望まれる。
高精度かつ簡便な試験方法にするために、発明者らは鋭意研究の結果、新しくＰＤ－１を発現させたＮＫ細胞株及びＰＤ－Ｌ１を発現させた標的細胞株を作製し、ＮＫ細胞株による標的細胞株の傷害活性を指標として治療用抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体の薬効を評価可能な試験系を開発し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
＜１＞ ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ－１）を介した免疫チェックポイント阻害剤の生物活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験する方法であって、
（ｉ） ＰＤ－１発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたナチュラルキラー（ＮＫ）活性を有するエフェクター細胞にさらに、ＩＬ－２発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ活性を有するエフェクター細胞、
及び、
（ｉｉ）ＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ １－ Ｌｉｇａｎｄ １）発現遺伝子導入用のレンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞、
を用い、
免疫チェックポイント阻害剤のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル阻害による細胞傷害活性の増強を測定することを特徴とする、免疫チェックポイント阻害剤の生物活性試験方法。
＜２＞ 前記エフェクター細胞が、配列番号１で表される配列を有する遺伝子を挿入したＰＤ－１発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ活性を有するエフェクター細胞にさらに、配列番号３で表される配列を有する遺伝子を挿入したＩＬ－２発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ活性を有するエフェクター細胞であることを特徴とする、＜１＞項に記載の方法。
＜３＞ 前記ＮＫ－感受性標的がん細胞が、配列番号２で表される配列を有する遺伝子を挿入したＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞であることを特徴とする、＜１＞項に記載の方法、
である。
＜１＞ ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ－１）を介した免疫チェックポイント阻害剤の生物活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験する方法であって、
（ｉ） ＰＤ－１発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたナチュラルキラー（ＮＫ）活性を有するエフェクター細胞にさらに、ＩＬ－２発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ活性を有するエフェクター細胞、
及び、
（ｉｉ）ＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ １－ Ｌｉｇａｎｄ １）発現遺伝子導入用のレンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞、
を用い、
免疫チェックポイント阻害剤のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル阻害による細胞傷害活性の増強を測定することを特徴とする、免疫チェックポイント阻害剤の生物活性試験方法。
＜２＞ 前記エフェクター細胞が、配列番号１で表される配列を有する遺伝子を挿入したＰＤ－１発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ活性を有するエフェクター細胞にさらに、配列番号３で表される配列を有する遺伝子を挿入したＩＬ－２発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ活性を有するエフェクター細胞であることを特徴とする、＜１＞項に記載の方法。
＜３＞ 前記ＮＫ－感受性標的がん細胞が、配列番号２で表される配列を有する遺伝子を挿入したＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞であることを特徴とする、＜１＞項に記載の方法、
である。
本発明の免疫チェックポイント阻害剤の生物活性試験法は、ＰＤ－１発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ活性を有するエフェクター細胞にさらに、ＩＬ－２発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ活性を有するエフェクター細胞、及び
ＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用のレンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞、
を用い、免疫チェックポイント阻害剤のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル阻害による細胞傷害活性の増強を測定することを特徴とする、免疫チェックポイント阻害剤の生物活性試験方法であり、
下記（１）～（６）の工程を有することを特徴とする。
即ち、
（１）配列番号１で表される配列を有する遺伝子を挿入したＰＤ－１発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ活性を有するエフェクター細胞にさらに、配列番号３で表される配列を有する遺伝子を挿入したＩＬ－２発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ活性を有するエフェクター細胞を提供する工程、
（２）工程（１）の培養液に被験物質を添加する工程、
（３）配列番号２で表される配列を有する遺伝子を挿入したＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用のレンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞を提供する工程、
（４）前記工程（３）のＮＫ－感受性標的がん細胞をＣｒ－５１標識し、前記工程（２）の培養液に添加し、細胞を培養する工程、
（５）培養後、Ｃｒ－５１量を測定する工程、
（６）細胞傷害活性を算出する工程、
からなる。
ＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用のレンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞、
を用い、免疫チェックポイント阻害剤のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル阻害による細胞傷害活性の増強を測定することを特徴とする、免疫チェックポイント阻害剤の生物活性試験方法であり、
下記（１）～（６）の工程を有することを特徴とする。
即ち、
（１）配列番号１で表される配列を有する遺伝子を挿入したＰＤ－１発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ活性を有するエフェクター細胞にさらに、配列番号３で表される配列を有する遺伝子を挿入したＩＬ－２発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ活性を有するエフェクター細胞を提供する工程、
（２）工程（１）の培養液に被験物質を添加する工程、
（３）配列番号２で表される配列を有する遺伝子を挿入したＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用のレンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞を提供する工程、
（４）前記工程（３）のＮＫ－感受性標的がん細胞をＣｒ－５１標識し、前記工程（２）の培養液に添加し、細胞を培養する工程、
（５）培養後、Ｃｒ－５１量を測定する工程、
（６）細胞傷害活性を算出する工程、
からなる。
次に、本発明の方法の各工程について述べる。
本発明の方法において、エフェクター細胞及び標的細胞を用いるが、例えば、以下の通りである。
ＰＤ－１発現ナチュラルキラー（ＮＫ） 細胞の作製には、ＫＨＹＧ－１細胞株（以下、ＫＨＹＧ－１とする。ＪＣＲＢ０１５６、ＪＣＲＢ細胞バンク、大阪、日本）を宿主細胞として用いる。
ＰＤ－Ｌ１発現細胞の作製には、ＮＫ感受性のＫ５６２細胞株（以下、Ｋ５６２とする。ＲＣＢ００２７、理研ＢＲＣ細胞バンク、茨城、日本）を宿主細胞として用いる。
ＫＨＹＧ－１細胞株の培養用培地には、非働化ウシ血清（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）及びＩＬ－２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）を用い、Ｋ５６２細胞株の培養用培地には、非働化ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いる。各細胞は３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で維持するものとする。
本発明の方法において、エフェクター細胞及び標的細胞を用いるが、例えば、以下の通りである。
ＰＤ－１発現ナチュラルキラー（ＮＫ） 細胞の作製には、ＫＨＹＧ－１細胞株（以下、ＫＨＹＧ－１とする。ＪＣＲＢ０１５６、ＪＣＲＢ細胞バンク、大阪、日本）を宿主細胞として用いる。
ＰＤ－Ｌ１発現細胞の作製には、ＮＫ感受性のＫ５６２細胞株（以下、Ｋ５６２とする。ＲＣＢ００２７、理研ＢＲＣ細胞バンク、茨城、日本）を宿主細胞として用いる。
ＫＨＹＧ－１細胞株の培養用培地には、非働化ウシ血清（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）及びＩＬ－２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）を用い、Ｋ５６２細胞株の培養用培地には、非働化ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いる。各細胞は３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で維持するものとする。
その他、エフェクター細胞としては、ＮＫ細胞、キラーＴ細胞等を用いることができ、例えば、ＮＫ９２（ＡＴＣＣ， ＣＲＬ－２４０７）、ＮＫ９２ＭＩ（ＡＴＣＣ， ＣＲＬ－２４０８）等をはじめとするＮＫ細胞を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
また、標的細胞としては、ＲＰＭＩ１８２２６（ＪＣＲＢ００３４）、ＨＬ－６０（ＪＣＲＢ００８５）、ＨＴ２９（ＡＴＣＣ， ＨＴＢ－３８）等をはじめとするＮＫ感受性の細胞が用いられ得るが、これらに限定されるものではない。
また、標的細胞としては、ＲＰＭＩ１８２２６（ＪＣＲＢ００３４）、ＨＬ－６０（ＪＣＲＢ００８５）、ＨＴ２９（ＡＴＣＣ， ＨＴＢ－３８）等をはじめとするＮＫ感受性の細胞が用いられ得るが、これらに限定されるものではない。
本発明のＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１安定発現細胞株作製において、例えば、ＰＤ－１発現遺伝子導入用のレンチウイルスベクターを作製するために、配列番号１に記載の配列の遺伝子を、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を含むｐＬＶＳＩＮ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）に挿入し、ｐＬＶＳＩＮ－ＰＤ－１－Ｐｕｒを作製する。
本発明に用いられる遺伝子配列の配列番号１は、以下の通りである。
本発明のＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用のレンチウイルスベクターの作製において、配列番号２に記載の配列の遺伝子を、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むｐＬＶＳＩＮ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）に挿入し、ｐＬＶＳＩＮ－ＰＤ－Ｌ１－Ｐｕｒを作製する。
本発明に用いるＩＬ－２発現遺伝子導入用のレンチウイルスベクターの作製において、配列番号３に記載の配列の遺伝子を、ハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を含むｐＬＶＳＩＮ に挿入し、ｐＬＶＳＩＮ－ＩＬ２－Ｈｙｇを作製する。
本発明に用いられる遺伝子配列の配列番号２は、以下の通りである。
本発明に用いられる遺伝子配列の配列番号３は、以下の通りである。
上記の各遺伝子導入用のレンチウイルスベクターは、ｐＬｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｈｉｇｈ Ｔｉｔｅｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）を用いて作製する。即ち、ｐＬＶＳＩＮ－ＰＤ－１－Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ－ＰＤ－Ｌ１－ＰｕｒもしくはｐＬＶＳＩＮ－ＩＬ２－Ｈｙｇとパッケージングミックスを、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３トランスフェクション導入試薬（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）を用いてＬｅｎｔｉ－Ｘ（登録商標）２９３Ｔ細胞（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）へ同時にトランスフェクションする。トランスフェクションした細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で４８時間培養する。その後、培養液上清を取得し、簡易レンチウイルス量測定試薬であるＬｅｎｔｉ－Ｘ（登録商標） ＧｏＳｔｉｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）を用いてウイルス力価を測定する。５×１０５ＩＦＵ／ｍＬ以上のウイルス力価が確認できた培養液上清を、ＤＩＳＭＩＣ－２５ＡＳフィルター（０．４４μｍ、東洋ろ紙株式会社、東京、日本）を用いて細胞デブリを除去し、ろ過液を細胞への感染用のウイルス液として用いる。しかしながら、本発明に係る方法の好ましい実施態様として挙げた上記具体的方法及び細胞株に限定されるものではない。
本発明の方法に用いるＰＤ－１発現遺伝子を挿入するためのレンチウイルスベクターは、ＮＫ活性を有するエフェクター細胞に感染させる。例えば、ＰＤ－１発現遺伝子を挿入するためのレンチウイルスベクターを、ＫＨＹＧ－１に感染させ、ピューロマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）１２．５μｇ／ｍＬを含む培地で培養し、増殖した細胞を、ＰＤ－１発現ＫＨＹＧ－１とする。ＰＤ－１発現の確認の方法は、後述の通りである。また、ＫＨＹＧ－１は、培養にＩＬ－２添加が必須であるが、ＩＬ－２不含でも培養可能とするためＩＬ－２を強制発現させることを目的として、ＰＤ－１発現ＫＨＹＧ－１に、さらにＩＬ－２発現遺伝子を挿入するためのレンチウイルスベクターを感染させ、ハイグロマイシンＢゴールド（インビボゲン社、カリフォルニア州、米国）２５０μｇ／ｍＬ及びピューロマイシン１２．５μｇ／ｍＬを含む培地で培養する。増殖しＰＤ－１及びＩＬ－２発現を確認した細胞を、ＰＩＣＫ－１細胞とする。しかしながら、一例として挙げた上記具体的方法に限定されるものではない。
本発明の方法に用いるＰＤ－Ｌ１を挿入するためのレンチウイルスベクターは、ＮＫ－感受性標的がん細胞に感染させる。例えば、ＰＤ－Ｌ１を挿入するためのレンチウイルスベクターを、Ｋ５６２に感染させ、ピューロマイシン１２．５μｇ／ｍＬを含む培地で培養し、増殖しＰＤ－Ｌ１の発現を確認した細胞をＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２とする。しかしながら、本発明に係る方法の好ましい実施態様として挙げた上記具体的方法及び細胞株に限定されるものではない。
ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の発現確認方法は、特に限定されるものではないが、例えば以下の方法により確認される。
ＰＤ－１発現確認用の抗体として、例えば、ＰＥ標識されたマウス抗ヒトＣＤ２７９（ＰＤ－１）（ＢＤバイオサイエンス社、ニュージャージー州、米国）を用いる。
ＰＤ－Ｌ１発現確認用の抗体として、例えば、ＦＩＴＣ標識されたマウス抗ヒト ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）（ＢＤバイオサイエンス社、♯５５８０６５）を用いる。
作製した細胞を回収（遠心：４℃、３００×ｇ、５分）し、ＰＢＳで１回洗浄（遠心：４℃、３００×ｇ、５分）する。洗浄後、１×１０７細胞／ｍＬとなるように１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳに懸濁させ、マイクロチューブに５０μＬずつ添加する。その後、抗体を１０μＬずつ添加混合し、４℃、１時間反応させる。反応後、０．５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄（遠心：４℃、３００×ｇ、５分）した後、０．５ｍＬのＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターにて蛍光強度を測定するものとする。
ＰＤ－１発現確認用の抗体として、例えば、ＰＥ標識されたマウス抗ヒトＣＤ２７９（ＰＤ－１）（ＢＤバイオサイエンス社、ニュージャージー州、米国）を用いる。
ＰＤ－Ｌ１発現確認用の抗体として、例えば、ＦＩＴＣ標識されたマウス抗ヒト ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）（ＢＤバイオサイエンス社、♯５５８０６５）を用いる。
作製した細胞を回収（遠心：４℃、３００×ｇ、５分）し、ＰＢＳで１回洗浄（遠心：４℃、３００×ｇ、５分）する。洗浄後、１×１０７細胞／ｍＬとなるように１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳに懸濁させ、マイクロチューブに５０μＬずつ添加する。その後、抗体を１０μＬずつ添加混合し、４℃、１時間反応させる。反応後、０．５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄（遠心：４℃、３００×ｇ、５分）した後、０．５ｍＬのＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターにて蛍光強度を測定するものとする。
ＰＤ－１の発現確認のアイソタイプコントロールとして、例えば、ＰＥ標識されたマウス ＩｇＧ１、κ アイソタイプコントロール（ＢＤバイオサイエンス社、ニュージャージー州、米国）が用いられるが、これに限定されるものではない。
ＰＤ－Ｌ１の発現確認アイソタイプコントロールとして、例えば、ＦＩＴＣ標識された マウスＩｇＧ１、 κ アイソタイプコントロール（ＢＤバイオサイエンス社、ニュージャージー州、米国）が用いられるが、これに限定されるものではない。
本発明によるＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１安定発現細胞株作製が有効に行われることを示すものとして、後述する実施例２のフローサイトメトリーにより、ＰＩＣＫ－１のＰＤ－１発現と、ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２のＰＤ－Ｌ１の発現が確認できる。フローサイトメトリーの結果、ＰＩＣＫ－１の細胞表面にＰＤ－１の発現が確認でき、ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２の細胞表面に、上記方法においてＰＤ－Ｌ１の発現が確認できる（図１及び図２）。
ＩＬ－２産生確認は、特に限定されるものではないが、例えば以下の方法により確認される。
上記のＰＤ－１／ＩＬ－２発現ＫＨＹＧ－１（ＰＩＣＫ－１）を、２４時間培養し、遠心分離（４℃、３００×ｇ、５分）した後の培養上清を、ＩＬ－２産生量測定用のサンプルとする。ＩＬ－２産生量の確認は、Ｈｕｍａｎ ｓｉｍｐｌｅ ｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡキット（アブカム（Ａｂｃａｍ）社製、ａｂ１７４４４４）を用いて、キットの定める方法に従い実施する。
上記のＰＤ－１／ＩＬ－２発現ＫＨＹＧ－１（ＰＩＣＫ－１）を、２４時間培養し、遠心分離（４℃、３００×ｇ、５分）した後の培養上清を、ＩＬ－２産生量測定用のサンプルとする。ＩＬ－２産生量の確認は、Ｈｕｍａｎ ｓｉｍｐｌｅ ｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡキット（アブカム（Ａｂｃａｍ）社製、ａｂ１７４４４４）を用いて、キットの定める方法に従い実施する。
ＩＬ－２産生確認の対照としては、例えば、ＩＬ－２不含の培地でＫＨＹＧ－１細胞を用いるが、これに限定されるものではない。
本発明による細胞株における有効なＩＬ－２産生を確認するものとして、後述する実施例３において、ＫＨＹＧ－１は、ＩＬ－２不含の培地では増殖できず、２４時間培養後の培地中ＩＬ－２の濃度は定量下限以下である結果を示す。一方、ＰＩＣＫ－１はＩＬ－２不含培地でも増殖し、２４時間培養後の、培地中ＩＬ－２産生量（ｐｇ／ｍＬ）は、５９．７±１６．４であり、ＩＬ－２産生が確認された結果を得ている（図３）。
本発明の試験により測定・評価する対象物質は、ＰＤ－１阻害剤（抗ＰＤ－１抗体）及びＰＤ－Ｌ１阻害剤（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）である。
当該抗ＰＤ－１抗体として、例えば、ニボルマブ（一般名）、ペムブロリズマブ（一般名）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。当該抗ＰＤ－Ｌ１抗体として、例えば、アテゾリズマブ（一般名）、アベルマブ（一般名）、デュルバルマブ（一般名）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。アイソタイプコントロールとしてヒトＩｇＧ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
当該抗ＰＤ－１抗体として、例えば、ニボルマブ（一般名）、ペムブロリズマブ（一般名）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。当該抗ＰＤ－Ｌ１抗体として、例えば、アテゾリズマブ（一般名）、アベルマブ（一般名）、デュルバルマブ（一般名）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。アイソタイプコントロールとしてヒトＩｇＧ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
抗ＰＤ－１抗体による細胞傷害活性の増強の測定用として、例えば、治療用抗ＰＤ－１抗体であるニボルマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、培地を用いて希釈し、２００μｇ／ｍＬ溶液を調製し、以下、公比１０で５濃度調製する。
一方、抗ＰＤ－Ｌ１抗体による細胞傷害活性の増強の測定用として、例えば、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体であるアテゾリズマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、培地を用いて希釈し、２０μｇ／ｍＬ溶液を調製し、以下、公比１０で５濃度調製する。
細胞障害性測定における細胞が１００％死滅対照区（Ｍａｘ ｒｅｌｅａｓｅ）用として、１０％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ－１００／ＰＢＳを培地に懸濁させ、０．４％溶液を調製する。
一方、抗ＰＤ－Ｌ１抗体による細胞傷害活性の増強の測定用として、例えば、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体であるアテゾリズマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、培地を用いて希釈し、２０μｇ／ｍＬ溶液を調製し、以下、公比１０で５濃度調製する。
細胞障害性測定における細胞が１００％死滅対照区（Ｍａｘ ｒｅｌｅａｓｅ）用として、１０％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ－１００／ＰＢＳを培地に懸濁させ、０．４％溶液を調製する。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナルの阻害による細胞傷害活性の増強の測定
上述のＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用のレンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞を、遠心分離（３００×ｇ、４分）し、上清を除去して１×１０６の細胞を回収する。その後、それぞれ１００μＬの培地に懸濁し、Ｃｒ－５１クロム酸ナトリウム（５１Ｃｒ）を添加（５０μＣｉ）した後、１時間培養してＣｒ－５１標識する。
ＰＩＣＫ－１を、回収し、培地で１回洗浄後細胞数をカウントし、１×１０６細胞／ｍＬに調製し、９６ウェルＵ底プレートに５０μＬ／ウェルを添加（５×１０４細胞／ウェル）する。
その後、Ｃｒ－５１標識したＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用のレンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞を、１ｍＬの培地で４回洗浄（遠心：３００ｇ×３分）した後、培地に懸濁させ細胞濃度を測定して１×１０５細胞／ｍＬに調製する。その後細胞懸濁液を９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェル添加（５×１０３細胞／ウェル、Ｅ／Ｔ＝１０）し、前述の抗体調製液を終濃度で、１０ｎｇ／ｍＬ～１０００００ｎｇ／ｍＬになるように１００ μＬ／ウェル添加し、混合する。
上記以外に、細胞傷害活性の算出用に、Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ（ＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用のレンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞の自発的Ｃｒ－５１放出量）、Ｍａｘ ｒｅｌｅａｓｅ（ＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用のレンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞が全て死滅した時のＣｒ－５１放出量）測定区を設定する。Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ測定ウェルには、培地を１５０μＬ／ウェル添加する。Ｍａｘ ｒｅｌｅａｓｅ測定ウェルには、培地を１００μＬ／ウェルと０．４％トリトン溶液を５０μＬ／ウェル添加し混合する。
３７℃で４時間培養後、上清５０μＬを測定用チューブに採取し、ガンマカウンター（２４８０ ＷＩＺＡＲＤ２オートガンマカウンター、パーキンエルマー社製）を用いて測定する。
上述のＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用のレンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞を、遠心分離（３００×ｇ、４分）し、上清を除去して１×１０６の細胞を回収する。その後、それぞれ１００μＬの培地に懸濁し、Ｃｒ－５１クロム酸ナトリウム（５１Ｃｒ）を添加（５０μＣｉ）した後、１時間培養してＣｒ－５１標識する。
ＰＩＣＫ－１を、回収し、培地で１回洗浄後細胞数をカウントし、１×１０６細胞／ｍＬに調製し、９６ウェルＵ底プレートに５０μＬ／ウェルを添加（５×１０４細胞／ウェル）する。
その後、Ｃｒ－５１標識したＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用のレンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞を、１ｍＬの培地で４回洗浄（遠心：３００ｇ×３分）した後、培地に懸濁させ細胞濃度を測定して１×１０５細胞／ｍＬに調製する。その後細胞懸濁液を９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェル添加（５×１０３細胞／ウェル、Ｅ／Ｔ＝１０）し、前述の抗体調製液を終濃度で、１０ｎｇ／ｍＬ～１０００００ｎｇ／ｍＬになるように１００ μＬ／ウェル添加し、混合する。
上記以外に、細胞傷害活性の算出用に、Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ（ＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用のレンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞の自発的Ｃｒ－５１放出量）、Ｍａｘ ｒｅｌｅａｓｅ（ＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用のレンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞が全て死滅した時のＣｒ－５１放出量）測定区を設定する。Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ測定ウェルには、培地を１５０μＬ／ウェル添加する。Ｍａｘ ｒｅｌｅａｓｅ測定ウェルには、培地を１００μＬ／ウェルと０．４％トリトン溶液を５０μＬ／ウェル添加し混合する。
３７℃で４時間培養後、上清５０μＬを測定用チューブに採取し、ガンマカウンター（２４８０ ＷＩＺＡＲＤ２オートガンマカウンター、パーキンエルマー社製）を用いて測定する。
細胞傷害活性の増強の測定の際のアイソタイプコントロールは、例えば、ヒトＩｇＧを用いるが、これに限定されるものではない。
被験物質の細胞傷害活性のデータ解析方法は、例えば、以下の式により算出される。
解析ソフトは、例えば、市販解析ソフト（ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（商標登録）Ｖｅｒ．５．０３、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて５０％有効濃度（ＥＣ５０）を算出するが、当該ソフトに限定されるものではない。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナルの阻害による細胞傷害活性の増強の測定方法の有効性は、以下の通りである。実施例４において、エフェクター細胞にＰＩＣＫ－１を用い、ターゲット細胞にＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２を用いたＮＫ活性測定系にニボルマブを添加した系では、細胞傷害活性の増強が認められ、ＥＣ５０（ｎｇ／ｍＬ）は、４２３±８３と算出された（表１、図４）。同ＮＫ活性測定系にアテゾリズマブを添加した系においても、細胞傷害活性の増強が認められ、ＥＣ５０（ｎｇ／ｍＬ）は、３０±７と算出された（表１、図４）。
それに対し、アイソタイプコントロールであるヒトＩｇＧを加えた系では、細胞傷害活性が認められず、ＥＣ５０は算出されなかった（図４）。
それに対し、アイソタイプコントロールであるヒトＩｇＧを加えた系では、細胞傷害活性が認められず、ＥＣ５０は算出されなかった（図４）。
本発明の方法に用いる細胞について、エフェクターとなるＮＫ細胞には、高いＮＫ活性を有するＫＨＹＧ－１を用い、ターゲットとなるがん細胞にはＫ５６２を用いた。レンチウイルスを用いてＫＨＹＧ－１にはＰＤ－１を強制発現させ、Ｋ５６２にはＰＤ－Ｌ１を発現させた。
なお、ＰＤ－１強制発現ＫＨＹＧ－１にはＩＬ－２非存在下でも培養できるように、２次改変としてさらにＩＬ－２を強制発現させた。
ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の発現確認をフローサイトメトリーにて行った結果、ＰＤ－１強制発現ＫＨＹＧ－１の細胞表面には強いＰＤ－１発現が認められ、ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２の細胞表面にも同様に強いＰＤ－Ｌ１の発現が確認できた。
ＩＬ－２の産生確認は、ＥＬＩＳＡを用いて行い、通常のＫＨＹＧ－１ではＩＬ－２不含培地では増殖せず、２４時間培養後のＩＬ－２産生が確認できなかったが、ＩＬ－２を強制発現させたＰＤ－１強制発現ＫＨＹＧ－１はＩＬ－２不含培地でも増殖し、２４時間培養後の、培地中ＩＬ－２産生量（ｐｇ／ｍＬ）は５９．７±１６．４であり、ＩＬ－２産生が確認され、ＩＬ－２不含の培地においても増殖可能となった。
ＰＤ－１及びＩＬ－２を強制発現させたＫＨＹＧ－１をＰＩＣＫ－１と名づけ、ＰＩＣＫ－１をエフェクターとし、ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２をターゲットとしたＮＫ活性測定系を構築し、ＮＫ活性を指標とした治療用抗ＰＤ－１抗体（ニボルマブ）及び治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）の細胞傷害活性の増強作用を測定した。アイソタイプコントロールは、ヒトＩｇＧを用いたが、アイソタイプコントロールでは細胞傷害活性の増強は認められなかった（図４）。一方で、ＰＩＣＫ－１－ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２のＮＫ活性測定系に抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体を添加したところ、ＮＫ活性の増強が認められ、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）はそれぞれ４２３±８３及び３０±７と算出された。
なお、ＰＤ－１強制発現ＫＨＹＧ－１にはＩＬ－２非存在下でも培養できるように、２次改変としてさらにＩＬ－２を強制発現させた。
ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の発現確認をフローサイトメトリーにて行った結果、ＰＤ－１強制発現ＫＨＹＧ－１の細胞表面には強いＰＤ－１発現が認められ、ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２の細胞表面にも同様に強いＰＤ－Ｌ１の発現が確認できた。
ＩＬ－２の産生確認は、ＥＬＩＳＡを用いて行い、通常のＫＨＹＧ－１ではＩＬ－２不含培地では増殖せず、２４時間培養後のＩＬ－２産生が確認できなかったが、ＩＬ－２を強制発現させたＰＤ－１強制発現ＫＨＹＧ－１はＩＬ－２不含培地でも増殖し、２４時間培養後の、培地中ＩＬ－２産生量（ｐｇ／ｍＬ）は５９．７±１６．４であり、ＩＬ－２産生が確認され、ＩＬ－２不含の培地においても増殖可能となった。
ＰＤ－１及びＩＬ－２を強制発現させたＫＨＹＧ－１をＰＩＣＫ－１と名づけ、ＰＩＣＫ－１をエフェクターとし、ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２をターゲットとしたＮＫ活性測定系を構築し、ＮＫ活性を指標とした治療用抗ＰＤ－１抗体（ニボルマブ）及び治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）の細胞傷害活性の増強作用を測定した。アイソタイプコントロールは、ヒトＩｇＧを用いたが、アイソタイプコントロールでは細胞傷害活性の増強は認められなかった（図４）。一方で、ＰＩＣＫ－１－ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２のＮＫ活性測定系に抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体を添加したところ、ＮＫ活性の増強が認められ、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）はそれぞれ４２３±８３及び３０±７と算出された。
これらの結果は、本発明に係る試験系がＮＫ活性を指標として抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体の細胞傷害活性の増強を測定が可能であり、免疫チェックポイント阻害剤の評価がｉｎ ｖｉｔｒｏで可能であることを示している。
本発明は、これまでに報告のないＮＫ活性を指標としたｉｎ ｖｉｔｒｏでの治療用抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体の細胞傷害活性の増強の測定法の開発を目的として、ＰＩＣＫ－１及びＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２を用いた新規ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性増強測定系を開発したものである。本発明に係る細胞により、治療用抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＮＫ活性増強作用が確認されたことから、本発明に係る試験系は、ＮＫ活性を指標として抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体の細胞傷害活性の増強を測定可能であり、ＰＤ－１を介した免疫チェックポイント阻害剤の薬効評価に有用な試験法である。
材料と方法
抗体
抗ＰＤ－１抗体としてニボルマブ（一般名）（小野薬品工業株式会社、大阪、日本）を用いた。抗ＰＤ－Ｌ１抗体としてアテゾリズマブ（一般名）（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ．ｃｏｍ， テキサス州、米国）を用いた。アイソタイプコントロールとしてヒトＩｇＧ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）を用いた。
抗体
抗ＰＤ－１抗体としてニボルマブ（一般名）（小野薬品工業株式会社、大阪、日本）を用いた。抗ＰＤ－Ｌ１抗体としてアテゾリズマブ（一般名）（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ．ｃｏｍ， テキサス州、米国）を用いた。アイソタイプコントロールとしてヒトＩｇＧ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）を用いた。
細胞
ＰＤ－１発現ナチュラルキラー（ＮＫ） 細胞の作製には、ＫＨＹＧ－１細胞株（以下、ＫＨＹＧ－１とする。ＪＣＲＢ０１５６、ＪＣＲＢ細胞バンク、大阪、日本）を宿主細胞として用いた。
ＰＤ－Ｌ１発現細胞の作製には、ＮＫ感受性のＫ５６２細胞株（以下、Ｋ５６２とする。ＲＣＢ００２７、理研ＢＲＣ細胞バンク、茨城、日本）を宿主細胞として用いた。
ＫＨＹＧ－１細胞株の培養用培地には、非働化ウシ血清（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）及びＩＬ－２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）を用い、Ｋ５６２細胞株の培養用培地には、非働化ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
各細胞は３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で維持した。
ＰＤ－１発現ナチュラルキラー（ＮＫ） 細胞の作製には、ＫＨＹＧ－１細胞株（以下、ＫＨＹＧ－１とする。ＪＣＲＢ０１５６、ＪＣＲＢ細胞バンク、大阪、日本）を宿主細胞として用いた。
ＰＤ－Ｌ１発現細胞の作製には、ＮＫ感受性のＫ５６２細胞株（以下、Ｋ５６２とする。ＲＣＢ００２７、理研ＢＲＣ細胞バンク、茨城、日本）を宿主細胞として用いた。
ＫＨＹＧ－１細胞株の培養用培地には、非働化ウシ血清（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）及びＩＬ－２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）を用い、Ｋ５６２細胞株の培養用培地には、非働化ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
各細胞は３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で維持した。
実施例１
ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１安定発現細胞株作製
（１） ＰＤ－１発現遺伝子導入用のレンチウイルスベクターを作製するために、配列番号１に示した配列の遺伝子を、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を含むｐＬＶＳＩＮ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）に挿入し、ｐＬＶＳＩＮ－ＰＤ－１－Ｐｕｒを作製した。
ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１安定発現細胞株作製
（１） ＰＤ－１発現遺伝子導入用のレンチウイルスベクターを作製するために、配列番号１に示した配列の遺伝子を、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を含むｐＬＶＳＩＮ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）に挿入し、ｐＬＶＳＩＮ－ＰＤ－１－Ｐｕｒを作製した。
（２） ＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用のレンチウイルスベクターを作製するために、配列番号２に示した配列の遺伝子を、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むｐＬＶＳＩＮ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）に挿入し、ｐＬＶＳＩＮ－ＰＤ－Ｌ１－Ｐｕｒを作製した。
（３） ＩＬ－２発現遺伝子導入用のレンチウイルスベクターを作製するために、配列番号３に示した配列の遺伝子を、ハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を含むｐＬＶＳＩＮ に挿入し、ｐＬＶＳＩＮ－ＩＬ２－Ｈｙｇを作製した。
（４） 各遺伝子導入用のレンチウイルスベクターは、ｐＬｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｈｉｇｈ Ｔｉｔｅｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）を用いて作製した。ｐＬＶＳＩＮ－ＰＤ－１－Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ－ＰＤ－Ｌ１－ＰｕｒもしくはｐＬＶＳＩＮ－ＩＬ２－Ｈｙｇとパッケージングミックスを、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３トランスフェクション導入試薬（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）を用いてＬｅｎｔｉ－Ｘ（登録商標）２９３Ｔ細胞（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）へ同時にトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で４８時間培養した。その後、培養液上清を取得し、簡易レンチウイルス量測定試薬であるＬｅｎｔｉ－Ｘ（登録商標） ＧｏＳｔｉｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）を用いてウイルス力価を測定した。５×１０５ＩＦＵ／ｍＬ以上のウイルス力価が確認できた培養液上清を、ＤＩＳＭＩＣ－２５ＡＳフィルター（０．４４μｍ、東洋ろ紙株式会社、東京、日本）を用いて細胞デブリを除去し、ろ過液を細胞への感染用のウイルス液として用いた。
（５） ＰＤ－１発現遺伝子を挿入するためのレンチウイルスベクターを、ＫＨＹＧ－１に感染させ、ピューロマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ州、米国）１２．５μｇ／ｍＬを含む培地で培養し、増殖した細胞を、ＰＤ－１発現ＫＨＹＧ－１とした。ＰＤ－１発現の確認の方法は、後述の通りである。また、ＫＨＹＧ－１は、培養にＩＬ－２添加が必須であるが、ＩＬ－２不含でも培養可能とするためＩＬ－２を強制発現させることを目的として、ＰＤ－１発現ＫＨＹＧ－１に、さらにＩＬ－２発現遺伝子を挿入するためのレンチウイルスベクターを感染させ、ハイグロマイシンＢゴールド（インビボゲン社、カリフォルニア州、米国）２５０μｇ／ｍＬ及びピューロマイシン１２．５μｇ／ｍＬを含む培地で培養し、増殖しＰＤ－１及びＩＬ－２発現を確認した細胞を、ＰＩＣＫ－１細胞と名づけ、試験に用いた。
（６） ＰＤ－Ｌ１を挿入するためのレンチウイルスベクターを、Ｋ５６２に感染させ、ピューロマイシン１２．５μｇ／ｍＬを含む培地で培養し、増殖しＰＤ－Ｌ１の発現を確認した細胞をＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２とした。
実施例２
ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の発現確認
（１） ＰＤ－１発現確認用の抗体として、ＰＥ標識されたマウス抗ヒトＣＤ２７９ （ＰＤ－１）（ＢＤバイオサイエンス社、ニュージャージー州、米国）を用いた。
ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の発現確認
（１） ＰＤ－１発現確認用の抗体として、ＰＥ標識されたマウス抗ヒトＣＤ２７９ （ＰＤ－１）（ＢＤバイオサイエンス社、ニュージャージー州、米国）を用いた。
（２） ＰＤ－Ｌ１発現確認用の抗体として、ＦＩＴＣ標識されたマウス抗ヒト ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）（ＢＤバイオサイエンス社、♯５５８０６５）を用いた。
（３） 実施例１（５）又は（６）で作製した細胞を回収（遠心：４℃、３００×ｇ、５分）し、ＰＢＳで１回洗浄（遠心：４℃、３００×ｇ、５分）した。洗浄後、１×１０７細胞／ｍＬとなるように１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳに懸濁させ、マイクロチューブに５０μＬずつ添加した。その後、抗体を１０μＬずつ添加混合し、４℃、１時間反応させた。反応後、０．５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄（遠心：４℃、３００×ｇ、５分）した後、０．５ｍＬのＰＢＳに懸濁させ、フローサイトメーターにて蛍光強度を測定した。
比較例１
実施例２（１）のＰＤ－１発現確認用の抗体に代えてアイソタイプコントロールとして、ＰＥ標識されたマウス ＩｇＧ１、κ アイソタイプコントロール（ＢＤバイオサイエンス社、ニュージャージー州、米国）を用い、実施例２（３）の操作を行った。
実施例２（１）のＰＤ－１発現確認用の抗体に代えてアイソタイプコントロールとして、ＰＥ標識されたマウス ＩｇＧ１、κ アイソタイプコントロール（ＢＤバイオサイエンス社、ニュージャージー州、米国）を用い、実施例２（３）の操作を行った。
比較例２
実施例２（２）のＰＤ－Ｌ１発現確認用の抗体に代えてアイソタイプコントロールとして、ＦＩＴＣ標識された マウスＩｇＧ１、 κ アイソタイプコントロール（ＢＤバイオサイエンス社、ニュージャージー州、米国）を用い、実施例２（３）の操作を行った。
実施例２（２）のＰＤ－Ｌ１発現確認用の抗体に代えてアイソタイプコントロールとして、ＦＩＴＣ標識された マウスＩｇＧ１、 κ アイソタイプコントロール（ＢＤバイオサイエンス社、ニュージャージー州、米国）を用い、実施例２（３）の操作を行った。
実施例３
ＩＬ－２産生確認
実施例１（５）のＰＤ－１／ＩＬ－２発現ＫＨＹＧ－１（ＰＩＣＫ－１）を、２４時間培養し、遠心分離（４℃、３００×ｇ、５分）した後の培養上清を、ＩＬ－２産生量測定用のサンプルとした。ＩＬ－２産生量の確認は、Ｈｕｍａｎ ｓｉｍｐｌｅ ｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡキット（アブカム（Ａｂｃａｍ）社製、ａｂ１７４４４４）を用いて、キットの定める方法に従い実施した。
ＩＬ－２産生確認
実施例１（５）のＰＤ－１／ＩＬ－２発現ＫＨＹＧ－１（ＰＩＣＫ－１）を、２４時間培養し、遠心分離（４℃、３００×ｇ、５分）した後の培養上清を、ＩＬ－２産生量測定用のサンプルとした。ＩＬ－２産生量の確認は、Ｈｕｍａｎ ｓｉｍｐｌｅ ｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡキット（アブカム（Ａｂｃａｍ）社製、ａｂ１７４４４４）を用いて、キットの定める方法に従い実施した。
比較例３
ＰＤ－１／ＩＬ－２発現ＫＨＹＧ－１（ＰＩＣＫ－１）に代えてＩＬ－２不含の培地で野生型（ＷＴ）ＫＨＹＧ－１細胞を用いる以外は実施例３と同様の操作を行い、ＩＬ－２産生量測定を行った。
ＰＤ－１／ＩＬ－２発現ＫＨＹＧ－１（ＰＩＣＫ－１）に代えてＩＬ－２不含の培地で野生型（ＷＴ）ＫＨＹＧ－１細胞を用いる以外は実施例３と同様の操作を行い、ＩＬ－２産生量測定を行った。
実施例４
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナルの阻害による細胞傷害活性の増強の測定
（１） 抗ＰＤ－１抗体による細胞傷害活性の増強を測定用として、治療用抗ＰＤ－１抗体であるニボルマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、培地を用いて希釈し、２００μｇ／ｍＬ溶液を調製し、以下、公比１０で５濃度調製した。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナルの阻害による細胞傷害活性の増強の測定
（１） 抗ＰＤ－１抗体による細胞傷害活性の増強を測定用として、治療用抗ＰＤ－１抗体であるニボルマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、培地を用いて希釈し、２００μｇ／ｍＬ溶液を調製し、以下、公比１０で５濃度調製した。
（２） 一方、抗ＰＤ－Ｌ１抗体による細胞傷害活性の増強を測定用として、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体であるアテゾリズマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、培地を用いて希釈し、２０μｇ／ｍＬ溶液を調製し、以下、公比１０で５濃度調製した。
（３） 細胞障害性測定における細胞が１００％死滅対照区（Ｍａｘ ｒｅｌｅａｓｅ）用として、１０％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ－１００／ＰＢＳを培地に懸濁し、０．４％溶液を調製した。
（４） 実施例１（６）のＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２を、遠心分離（３００×ｇ、４分）し、上清を除去して１×１０６の細胞を回収した。その後、それぞれ１００μＬの培地に懸濁し、Ｃｒ－５１クロム酸ナトリウム（５１Ｃｒ）を添加（５０μＣｉ）した後、１時間培養して５１Ｃｒ標識した。
実施例１（５）のＰＩＣＫ－１を、回収し、培地で１回洗浄後細胞数をカウントし、１×１０６細胞／ｍＬに調製し、９６ウェル Ｕ底プレートに５０μＬ／ウェルを添加（５×１０４細胞／ウェル）した。
その後、５１Ｃｒ標識したＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２を、１ｍＬの培地で４回洗浄（遠心：３００ｇ×３分）した後、培地に懸濁させ細胞濃度を測定して１×１０５細胞／ｍＬに調製した。その後細胞懸濁液を９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェル添加（５×１０３細胞／ウェル、Ｅ／Ｔ＝１０）し、前述の抗体調製液を終濃度で、１０ｎｇ／ｍＬ～１０００００ｎｇ／ｍＬになるように１００ μＬ／ウェル添加し、混合した。
上記以外に、細胞傷害活性の算出用に、Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ（ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２の自発的５１Ｃｒ放出量）、Ｍａｘ ｒｅｌｅａｓｅ（ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２が全て死滅した時の５１Ｃｒ放出量）測定区を設定した。Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ測定ウェルには、培地を１５０μＬ／ウェル添加した。Ｍａｘ ｒｅｌｅａｓｅ測定ウェルには、培地を１００μＬ／ウェルと０．４％トリトン溶液を５０μＬ／ウェル添加し混合した。
３７℃で４時間培養後、上清５０μＬを測定用チューブに採取し、ガンマカウンター（２４８０ ＷＩＺＡＲＤ２オートガンマカウンター、パーキンエルマー社製）を用いて測定した。
実施例１（５）のＰＩＣＫ－１を、回収し、培地で１回洗浄後細胞数をカウントし、１×１０６細胞／ｍＬに調製し、９６ウェル Ｕ底プレートに５０μＬ／ウェルを添加（５×１０４細胞／ウェル）した。
その後、５１Ｃｒ標識したＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２を、１ｍＬの培地で４回洗浄（遠心：３００ｇ×３分）した後、培地に懸濁させ細胞濃度を測定して１×１０５細胞／ｍＬに調製した。その後細胞懸濁液を９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェル添加（５×１０３細胞／ウェル、Ｅ／Ｔ＝１０）し、前述の抗体調製液を終濃度で、１０ｎｇ／ｍＬ～１０００００ｎｇ／ｍＬになるように１００ μＬ／ウェル添加し、混合した。
上記以外に、細胞傷害活性の算出用に、Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ（ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２の自発的５１Ｃｒ放出量）、Ｍａｘ ｒｅｌｅａｓｅ（ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２が全て死滅した時の５１Ｃｒ放出量）測定区を設定した。Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ測定ウェルには、培地を１５０μＬ／ウェル添加した。Ｍａｘ ｒｅｌｅａｓｅ測定ウェルには、培地を１００μＬ／ウェルと０．４％トリトン溶液を５０μＬ／ウェル添加し混合した。
３７℃で４時間培養後、上清５０μＬを測定用チューブに採取し、ガンマカウンター（２４８０ ＷＩＺＡＲＤ２オートガンマカウンター、パーキンエルマー社製）を用いて測定した。
比較例４
実施例４のアイソタイプコントロールとして、ヒトＩｇＧを用い、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体と同じ方法で希釈調製し、実施例４（４）の操作を行った。
実施例４のアイソタイプコントロールとして、ヒトＩｇＧを用い、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体と同じ方法で希釈調製し、実施例４（４）の操作を行った。
実施例５
データ解析
次式から細胞傷害活性を算出した。
市販解析ソフト（ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（商標登録）Ｖｅｒ．５．０３、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて５０％有効濃度（ＥＣ５０）を算出した。
データ解析
次式から細胞傷害活性を算出した。
結果
ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１安定発現細胞株作製
実施例２のフローサイトメトリーにより、ＰＩＣＫ－１のＰＤ－１発現と、ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２のＰＤ－Ｌ１の発現を確認した。フローサイトメトリーの結果、ＰＩＣＫ－１の細胞表面にＰＤ－１の発現が確認でき、ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２の細胞表面にＰＤ－Ｌ１の発現を確認した。（図１及び図２）。
ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１安定発現細胞株作製
実施例２のフローサイトメトリーにより、ＰＩＣＫ－１のＰＤ－１発現と、ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２のＰＤ－Ｌ１の発現を確認した。フローサイトメトリーの結果、ＰＩＣＫ－１の細胞表面にＰＤ－１の発現が確認でき、ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２の細胞表面にＰＤ－Ｌ１の発現を確認した。（図１及び図２）。
ＩＬ－２産生確認
実施例３において、ＫＨＹＧ－１は、ＩＬ－２不含の培地では増殖できず、２４時間培養後の培地中ＩＬ－２の濃度は定量下限以下であった。一方、ＰＩＣＫ－１はＩＬ－２不含培地でも増殖し、２４時間培養後の、培地中ＩＬ－２産生量（ｐｇ／ｍＬ）は、５９．７±１６．４であり、ＩＬ－２産生が確認された。（図３）
実施例３において、ＫＨＹＧ－１は、ＩＬ－２不含の培地では増殖できず、２４時間培養後の培地中ＩＬ－２の濃度は定量下限以下であった。一方、ＰＩＣＫ－１はＩＬ－２不含培地でも増殖し、２４時間培養後の、培地中ＩＬ－２産生量（ｐｇ／ｍＬ）は、５９．７±１６．４であり、ＩＬ－２産生が確認された。（図３）
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナルの阻害による細胞傷害活性の増強の測定
実施例４において、エフェクター細胞にＰＩＣＫ－１を用い、ターゲット細胞にＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２を用いたＮＫ活性測定系にニボルマブを添加した系では、細胞傷害活性の増強が認められ、ＥＣ５０（ｎｇ／ｍＬ）は、４２３±８３と算出された（表１、図４）。同ＮＫ活性測定系にアテゾリズマブを添加した系においても、細胞傷害活性の増強が認められ、ＥＣ５０（ｎｇ／ｍＬ）は、３０±７と算出された（表１、図４）。
それに対し、アイソタイプコントロールであるヒトＩｇＧを加えた系では、細胞傷害活性が認められず、ＥＣ５０は算出されなかった（図４）。
実施例４において、エフェクター細胞にＰＩＣＫ－１を用い、ターゲット細胞にＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２を用いたＮＫ活性測定系にニボルマブを添加した系では、細胞傷害活性の増強が認められ、ＥＣ５０（ｎｇ／ｍＬ）は、４２３±８３と算出された（表１、図４）。同ＮＫ活性測定系にアテゾリズマブを添加した系においても、細胞傷害活性の増強が認められ、ＥＣ５０（ｎｇ／ｍＬ）は、３０±７と算出された（表１、図４）。
それに対し、アイソタイプコントロールであるヒトＩｇＧを加えた系では、細胞傷害活性が認められず、ＥＣ５０は算出されなかった（図４）。
表１．抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体の抗腫瘍活性結果．
本発明は、これまでに報告のないＮＫ活性を指標としたｉｎ ｖｉｔｒｏでの治療用抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体の細胞傷害活性の増強の測定法の開発を目的として、本発明において作製されたＰＩＣＫ－１及びＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２を用いた新規ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性増強測定系を開発した。本発明に係る細胞により治療用抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＮＫ活性増強作用が確認されたことから、本発明に係る試験系は、ＮＫ活性を指標として抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体の細胞傷害活性の増強を測定可能であり、ＰＤ－１を介した免疫チェックポイント阻害剤の薬効評価に有用な試験法である。
本発明に係る試験系は、ＮＫ活性を指標として抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体の細胞傷害活性の増強を測定可能であり、ＰＤ－１を介した免疫チェックポイント阻害剤の薬効評価に有用な試験法である。
Claims (3)
- ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ－１）を介した免疫チェックポイント阻害剤の生物活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験する方法であって、
（ｉ） ＰＤ－１発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたナチュラルキラー（ＮＫ）活性を有するエフェクター細胞にさらに、ＩＬ－２発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ活性を有するエフェクター細胞、
及び、
（ｉｉ）ＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ １－ Ｌｉｇａｎｄ １）発現遺伝子導入用のレンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞、
を用い、
免疫チェックポイント阻害剤のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル阻害による細胞傷害活性の増強を測定することを特徴とする、免疫チェックポイント阻害剤の生物活性試験方法。 - 前記エフェクター細胞が、配列番号１で表される配列を有する遺伝子を挿入したＰＤ－１発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ活性を有するエフェクター細胞にさらに、配列番号３で表される配列を有する遺伝子を挿入したＩＬ－２発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ活性を有するエフェクター細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記ＮＫ－感受性標的がん細胞が、配列番号２で表される配列を有する遺伝子を挿入したＰＤ－Ｌ１発現遺伝子導入用レンチウイルスで感染させたＮＫ－感受性標的がん細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
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| JP2018508539A (ja) | 2015-03-02 | 2018-03-29 | イノベイティブ セルラー セラピューティクス シーオー．，エルティディ．Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． | Ｐｄ−ｌ１によって誘導される免疫寛容の低減 |
| US20190358263A1 (en) | 2016-12-07 | 2019-11-28 | Oslo Universitetssykehus Hf | Compositions and Methods for Cell Therapy |
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| DE68912353T2 (de) * | 1988-01-21 | 1994-06-23 | Becton Dickinson Co | Leu-23: Monoclonaler Antikörper zur Überwachung von Leukozyten-Aktivierung. |
-
2021
- 2021-03-08 JP JP2021036429A patent/JP7198302B2/ja active Active
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Database GenBank [online]，Accession No. AY238517, version AY238517.1，2003年03月19日，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY238517 |
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