DE68912353T2

DE68912353T2 - Leu-23: Monoclonaler Antikörper zur Überwachung von Leukozyten-Aktivierung.

Info

Publication number: DE68912353T2
Application number: DE68912353T
Authority: DE
Inventors: Lewis L Lanier; Joseph H Phillips
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1988-01-21
Filing date: 1989-01-20
Publication date: 1994-06-23
Anticipated expiration: 2009-01-21
Also published as: ATE100491T1; DE68912353D1; EP0325489B1; JPH0795945B2; JPH0216978A; ES2061965T3; EP0325489A1

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper (MAb), der für die Überwachung der Leukozyten-Aktivierung von Nutzen ist, und sie betrifft insbesondere einen monoklonalen Antikörper, der ein Antigen bindet, das auf natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) erscheint, auf einer Untermenge von T-Lymphozyten mit geringer Schwimmdichte (LBD), kurz nachdem diese Zellen mit Interleukin-2 (IL-2) aktiviert werden, und auf bestimmten T-Lymphozyten nach der Stimulierung des T-Zellen-Antigen-Rezeptorkomplexes.

Hintergrund der Erfindung

IL-2 verstärkt das Wachstum und die zytotoxische Funktion sowohl der T-Lymphozyten als auch der NK-Zellen. Nach der Einwirkung von IL-2 (oder Rekombinant-IL-2) weisen ruhende NK-Zellen, die aus peripherem Blut isoliert werden, innerhalb von 4 Stunden nach der Aktivierung eine verstärkte zytotoxische Wirkung auf. Diese zytotoxische Aktivität ist nach 18 Stunden am größten.
Die meisten anderen peripheren Blutleukozyten dagegen reagieren nicht allein auf IL-2. Zusätzliche Signale, wie IL-1 oder Protein-Kinase C, sind erforderlich, um Wachstum zu induzieren. Eine Untermenge der LBD-T-Zellen aber spricht allein auf IL-2 an und erscheint folglich in einem "gestarteten" Zustand.
Sobald Leukozyten aktiviert sind, bringen sie eine Vielzahl von neuen Zelloberflächen-Antigenen zur Expression. NK-Zellen beispielsweise bringen den Transferrin-Rezeptor, HLA-DR und den CD25-IL-2-Rezeptor nach der IL-2- Aktivierung zur Expression. Diese Antigene werden aber auf dem Mehrheit der Zellen erst nach einer Zeitspanne von 4 bis 18 Stunden zur Expression gebracht, wenn die NK-Zellen am stärksten zytotoxisch sind. Es besteht daher keine direkte Korrelation zwischen der Aktivierung der NK-Zellen und der zytotoxischen Funktion und der Expression dieser Antigene. Im Ergebnis dessen gibt es kein Mittel, die Effektivität der Aktivierug zu messen, bevor die maximale Zytotoxizität überschritten ist.
Die Messung der Effektivität der Aktivierung von NK-Zellen und folglich von deren Effektivität als zytotoxisches Mittel ist beispielsweise bei der Behandlung von bestimmten Krankheiten wichtig. Kürzlich haben Rosenberg et al. in N. Eng. J. Med., 164:814 (1985), und Rosenberg in US-PS 54 690 915 eine Methode der Krebstherapie vorgeschlagen, welche die kombinierte In-vivo-Anwendung von IL-2 mit der Verabreichung von autologen Lymphozyten des Patienten, die in vitro mit IL-2 aktiviert wurden, beinhaltet. Es wäre nützlich, die Aktivierung der Lymphozyten vor der Verabreichung zu messen, um einen maximalen therapeutiscien Nutzen zu gewährleisten.
Neben der Aktivierung von Leukozyten durch IL-2 ist es möglich, T- Zellen zu stimulieren, beispielsweise durch Wechselwirkung mit dem T- Zellen-Antigen-Rezeptorkomplex, der die Alpha- und Beta-Ketten im Antigen- Rezeptor umfaßt und die mit verschiedenen anderen Proteinen erscheinen und einen Komplex bilden, der als CD3&spplus;-Komplex bezeichnet wird. Der T-Zellen- Antigen-Rezeptor ist für die Erkennung von Fremd-Antigenen (z. B. Alloantigenen und Viren) verantwortlich und bewirkt, daß eine aktivierte T-Zelle bestimmte Transformationen durchläuft, die Immunreaktionen bewirken können. Es wäre außerdem nützlich, über Marker zu verfügen, um Zellen zu identifizieren, die über den T-Zellen-Antigen-Rezeptorkomplex stimuliert wurden.
Hara et al., Human T Cell Activation: III, Rapid Induction of a Phosphorylated 28 kD/32 kD Disulfide-linked Early Activation Antigen (EA-1) by 12-O-tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate, Mitogens and Antigens (Aktivierung von menschlischen T-Zellen: III, Schnelle Induzierung eines phosphorylierten disulfid-gebundenen 28 kD/32 kD-Frühaktivierungsantigens (EA-1) durch 12-O-Tetradecanoyl-Phorbol-13-Azetat, Mitogene und Antigene), J. Exp. Med., 164:1988 (1986), und Cosulich et al. Functional Characterization of an Antigen (MLR3) Involved in an Early Step of T-Cell Activation (Funktionelle Charakterisierung eines an einem frühen Schritt der T-Zellen-Aktivierung beteiligten Antigens (MLR3)), PNAS, 84:4205 (1987), haben kürzlich Zelloberflächen-Antigene beschrieben, die kurz nach der Aktivierung auf T-Zellen zur Expression gebracht werden. Diese Antigene, EA-1 bzw. MLR3, sind Glykoproteine mit größeren Komponenten von 28 kD und 32 kD. EA-1 und MLR3 sind keine Antigene der HLA-Klasse II, und ein MLR3-MAb blockiert die IL-1-Bindung. Diese Antigene erscheinen innerhalb von 18 Stunden auf aktivierten T-Zellen und erscheinen auch noch 48 Stunden nach der Aktivierung.
Diese Antigene können zwar bei der Feststellung der Aktivierung von Nutzen sein, die vorliegende Erfindung sieht jedoch eine alternative Möglichkeit zum Nachweis der Aktivierung von Leukozyten und insbesonders von natürlichen Killerzellen und einer Untermenge von T-Zellen vor.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Nach der vorliegenden Erfindung ist ein monoklonaler Antikörper vorgesehen, der in Wechselwirkung mit einem Zell-Antigen tritt, welches durch den monoklonalen Antikörper erkannt wird, der durch das als ATCC Nr. HB-9627 bezeichnete Hybridom produziert wird.
[)ie Erfindung sieht außerdem ein Hybridom vor, welches einen monoklonalen Antikörper produziert, wobei dieser monoklonale Antikörper mit dem Zell-Antigen in Wechselwirkung tritt, das durch den monoklonalen Antikörper erkannt wird, der durch das als HB-9627 bezeichnete Hybridom produziert wird.
Zwischen den Zellen der Popliteal-Lymphknoten von Balb/c-Mäusen, die mit einer CD8&spplus;-alloantigen-gerichteten zytotoxischen T-Lymphozyten-Zell- Linie (TCL) immunisiert wurden, und der Maus-Myelom-Zell-Linie SP2/0 Ag 14 wurde ein Maus-Hybridom L78 gebildet. Die vereinigten hellen wurden gezüchtet und in einem Azaserin-Hypoxanthin-Medium selektiert. Ausgewählt wurde Klon LR3-8H3 und in L78 umbenannt. L78 wurde bei der ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) nach den Bestimmungen des Budapester Abkommens unter der Zugriffsnummer ATCC HB-9627 deponiert.
Ein Maus-Hybridom L-184 wurde zwischen den Splenozyten von Balb/c- Mäusen, die mit rIL-2-aktivierten natürlichen Killerzellen immunisiert wurden, und der Maus-Myelom-Zell-Linie SP2/0 Ag 14 gebildet. Es wurde Klon E14/A97 isoliert und in L184 umbenannt.
Die durch L78 und L184 produzierten monoklonalen Antikörper wurden als Anti-Leu 23 bezeichnet und haben ein IgG&sub1;-Isotop. Folglich kennzeichnet in dieser Spezifikation die Bezeichnung "Leu-23" insbesondere das Zell- Antigen, das durch den monoklonalen Antikörper erkannt wird, der durch das als ATCC Nr. HB-9627 bezeichnete Hybridom erkannt wird, und analog dazu ist "Anti-Leu 23" der Antikörper, welcher dieses Antigen erkennt.
Anti-Leu 23 erkennt ein Zelloberflächen-Antigen auf aktivierten und antigen-stimulierten Leukozyten. Auf rIL-2-aktivierten NK-Zellen wird das Antigen, Leu 23, innerhalb von 4 Stunden nach der Aktivierung zur Expression gebracht, und diese Expression dauert bis zu 72 Stunden nach der Aktivierung an. Leu 23 ist ein disulfid-gebundenes Homodimer, das aus 24 kD-Untereinheiten mit wenigstens zwei N-gebundenen Kohlehydraten zusammengesetzt ist. Leu 23 wird durch einen IL-2-abhängigen Prozeß sowohl induziert als auch phosphoryliert.
Da das Auftreten von Leu 23 auf natürlichen Killerzellen in Wechselbeziehung mit der Entwicklung von Zytotoxizität steht und da das Auftreten von Leu 23 auf bestimmten T-Zellen in Wechselbeziehung mit der Stimulation des T-Zellen-Antigen-Rezeptorkomplexes steht, ist Anti-Leu 23 bei der Überwachung der Aktivierung oder Stimulierung von Leukozyten von Nutzen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1A ist ein Autoradiograph von immunologischen Anti-Leu 23- Präzipitaten von ¹²&sup5;I-markierten, rIL-2-aktivierten NK-Zellen, Thymozyten und peripheren Blut-T-Lymphozyten in 2,3 % Natriumdodecylsulfat (SDS) mit oder ohne 5 % 2-Mercaptoethanol (2-ME) und getrennt durch Polyacrylimid- Gelelektrophorese (PAGE) unter Verwendung von 10 % Polyacrylimid;
Fig 1B ist ein Autoradiograph eines immunologischen Anti-Leu 23- Präzipitats der ¹²&sup5;I-markierten, IL-2-aktivierten Thymozyten aus Fig. 1A, durch SDS-PAGE-Analyse (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese) in zwei Dimensionen getrennt, wobei die erste Dimension nichtreduzierend war und einer Elektrophorese auf einem 7,5 %igen Polyacrylimid unterzogen wurde und wobei die zweite Dimension reduzierend war und einer Elektrophorese auf 10 %igem Polyacrylimid unterzogen wurde;
Fig. 2 ist ein autoradiographischer Film eines immunologischen Anti- Leu 23-Präzipitats der ¹²&sup5;I-markierten, rIL-2-aktivierten Thymozyten aus Fig. 1A, worin das immunologische Präzipitat unter Verwendung von Endo-B-N- Acetylglucosaminidase F (Endo F) deglycosyliert und durch SES-PAGE-Analyse auf 10 %igem Polyacrylimid abgetrennt wurde;
Fig. 3 zeigt mehrere Fluoreszenzhistogramme für LBD-, HBD- und natürliche Killerzellen, die mit 500 Einheiten/ml rIL-2 aktiviert wurden, welche 0, 2, 6 und 18 Stunden nach der Aktivierung gemessen wurden und durch Strömungszytometrie nachgewiesen wurden, wobei die aktivierten Zellen unterschiedlichmarkiertwurdenmit: fluorescein-isothiocyanat-konjugiertem (FITC-konjugiertem) IgG und phycoerythrin-konjugiertem (PE-konjugiertem) Anti-IgG als Kontroll-Antikörper; Anti-Leu 11 (FITC) und Anti-Leu 23 (PE) bei natürlichen Killerzellen (CD16&spplus;) und Anti-Leu 4 (FITC) und Anti-Leu 23 (PE) bei LBD- und HBD-Zellen (CD3&spplus;);
Fig. 4 zeigt mehrere Fluoreszenzhistogramme für LBD-Zellen, die in 500 Einheiten/ml rIL-2 gezüchtet wurden und die nach 18 Stunden unterschiedlich markiert wurden mit: den Kontrollen aus Fig. 3; Anti-Leu 23 (FITC) und Anti-Leu 11 (PE) beim Antigen CD16; Anti-Leu 11 (FITC) und Anti-HLA-DR (PE) beim Antigen HLA-DR und Anti-Leu 11 (FITC) und Anti-IL-2R (PE) beim IL-2-Rezeptor-Antigen;
Fig. 5 zeigt mehrere Fluoreszenzhistogramme für LBD-Zellen, die in unterschiedlichen Mengen von IL-2 gezüchtet wurden und die nach 18 Stunden mit den Kontrollen von Fig. 3 und Anti-Leu 11 (FITC) und Anti-Leu 23 (PE) markiert wurden;
Fig. 6A zeigt zwei Fluoreszenzhistogramme für LBD-Zelien, die in 6 Einheiten/ml oder 12 Einheiten/ml rIL-2 gezüchtet wurden und die nach 18 Stunden mit Anti-Leu 23 (FITC) und Anti-Leu 11 (PE) markiert wurden;
Fig. 6B zeigt zwei graphische Darstellungen der prozentualen Zytotoxizität in Relation zu den Effektor-Zielzellen-Verhältnissen für unsortierte LBD-, CD16&spplus;/Leu 23&supmin;- und CD16&spplus;/Leu 23&spplus;-Zellen, die aus Fig. 6A isoliert und mit FACS400 -Strömungszytometrie- Instrumenten sortiert wurden, getestet im Vergleich zu &sup5;¹Cr-markierten Colo-205-Karzinom-Zellen;
Fig. 7 zeigt Autoradiographen von immunologischen Leu 23- und Kontroll-Präzipitaten von IL-2-aktivierten LBD-Zellen., die mit ³²[P]- Orthophosphat markiert wurden, nach der Analyse durch zweidimensionale SDS- PAGE auf 10 %igem Polyacrylimid, wie das in Fig. 1B beschrieben wurde; und
Fig. 8 zeigt zwei Fluoreszenzhistogramme für eine Leukämie-Zell-Linie (Jurkat), die über Nacht mit (a) einem irrelevanten Kontroll-MAb oder mit (b) einem Anti-CD3-Antikörper (Anti-Leu 4) stimuliert und dann mit Anti-Leu 23 (FITC) oder mit einem irrelevanten Kontrol MAb markiert wurde.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Das L78-Hybridom und der durch dieses produzierte MAb Anti-Leu 23 werden folgendermaßen hergestellt. 5 x 10&sup5; Zellen einer alloantigengerichteten zytotoxischen CD8&spplus;-Lymphozyten-Linie (E1xPGF/JY von Dr. Betty Evans, Becton Dickinson Immunocytometry Systems) wurden an den Tagen 0, 4, 7, 11, 14 und 18 in die Fußballen von Balb/c-Mäusen injiziert.
Am Tag 19 wurden die Mäuse getötet und die Popliteal- Lymphknoten herausgeschnitten. Dann wurden die Zellen mit dem kontinuierlichen Plasmacytom-Fusionspartner SP2/0 AG 14, Shulman et al., Nature, 276:269 (1978), in 35 % Polyethylenglycol verschmolzen. Ähnliche Verfahren und Präparationen von Milzzellen und deren Fusion wurden bereite in den US-PS 4 172 124 und 4 196 265 beschrieben, die in die vorliegende Beschreibung als Referenz einbezogen werden.
Lebensfähige Zellen aus dem Fusionsprozeß wurden in Mikrokulturplatten (B-D Falcon) mit 96 Vertiefungen in einem Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, GIBCO), das 20 % fötales Kalbsserum (KC Biologicals) enthielt, plattiert. In jede Vertiefung wurde eine Lösung von 15 mM HEPES (GIBCO) und Azaserin-Hypoxanthin (2 ug/ml bzw. 10&supmin;&sup4; Endkonzentration) als Selektionsmedium nach den Verfahren von Buck et al., Production of Human Monoclonal Antibodies (Produktion von menschlichen monoklonalen Antikörpern) in Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines (Monoklonale Antikörper und Funktionszell-Linien), Plenum Publishing Corp. (Kennett et al., Hsg.) (1984), gegeben. Hybridome, die in diesem Medium gezüchtet werden, können von den nichtverschmolzenen Myelom-Zellen und den Milzzellen, die kurz nach der Fusion absterben, getrennt werden. Die Inkubation wurde über 7 - 10 Tage oder bis zum Auftreten von sichtbaren Kolonien fortgesetzt.
Die Überstände von den Vertiefungen, in denen Zellen wuchsen, wurden zuerst nach dem immunologischen Pandex-Test (Pandex Laboratories, Inc.) unter Verwendung von CTL als der positiven Selektion durchmustert (gescreent). In jede Vertiefung einer Pandex-Platte mit 96 Vertiefungen wurden 5 x 10&sup5; CTL gegeben. Nach 30 min wurden die Zellen in 0,15 M phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Dann wurde in jede Vertiefung Ziegen-Antimaus-Ig-Antikörper, der an Fluoreszin-Isothiozyanat gekoppelt war, gegeben. Die Ergebnisse des immunologischen Tests wurden unter Verwendung von Pandex-Instrumenten abgelesen.
Zellen aus den Vertiefungen, deren Überstände im Test positiv reagierten, wurden erneut in Mikrokultur-Platten mit 24 Vertiefungen plattiert und ohne Selektionsmedien in DMEM gezogen. Die Überstände von jeder dieser Vertiefungen wurden dann erneut durch Zusetzen des Überstandes zu Vertiefungen, die entweder mit rIL-2 (Cetus Corp.) aktivierte T- Lymphozyten oder ruhende periphere Blut-Leukozyten enthielten, durchmustert. Dann wurde jeder Vertiefung Ziegen-Antimaus-Ig (FITC) zugesetzt. Gefärbte Zellen aus diesen Vertiefungen wurden einer Analyse mit Strömungszytometrie-Instrumenten (FACS440 ) unterzogen.
Gefärbte Zellen wurden auf Vorwärts- und Rechtwinkel-Lichtstreuung und Fluoreszenz untersucht. Es wurde dann ein Fenster für Lymphozyt- Populationen festgesetzt. Aus dieser Analyse wurde Klon LR3-8H3 ausgewählt. Er wurde bei der ATCC nach den Bestimmungen des Budapester Abkommens unter der Zugriffs-Nr. HB-9627 deponiert. Das Hybridom wurde als L78 bezeichnet.
L78 ist jedoch nicht das einzige Hybridom, das einen MAb produziert, der Leu 23 binden kann. Im Labor von Dr. Joe Phillips (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) wurde unter der Bezeichnung L184 ein Hybridom deponiert, das einen monoklonalen Antikörper Anti-Leu 23 produziert.
L184 wurde entwickelt durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit Leu 11&spplus;-sortierten NK-Zellen, die vorher eine Woche lang in rIL-2 aktiviert worden waren. Die CTL-Zell-Linie und die natürlichen Killerzellen, die hierbei als Immunogene verwendet wurden, weisen aktivierte Lymphozyten auf. Mäuse wurden mit den aktivierten natürlichen Killerzellen nach dem folgenden Schema aktiviert: 2 x 10&sup6; NK-Zellen intraperetoneal an den Tagen 0, 28, 35, 42 und 49 und 2 x 10&sup6; NK-Zellen intravenös an den Tagen 50, 51, 52 und 53.
Am Tag 54 wurde die Milz entfernt, und die Splenozyten wurden wie oben mit der Zell-Linie SP2/0 Ag 14 verschmolzen. Es wurden die gleichen Selektionsverfahren angewendet und schließlich der Klon E14/A97 ausgewählt. Klon E14/A97 wurde in L184 umbenannt.
Die monoklonalen Antikörper, welche durch die Hybridome L78 und L184 produziert werden, wurden als Anti-Leu 23 bezeichnet. Sie haben einen IgG&sub1;- Isotyp. Außerdem sind sie durch das Antigen gekennzeichnet, mit dem sie reagieren.
Anti-Leu 23 reagiert im wesentlichen mit allen IL-2-aktivierten CD16&spplus;-NK-Zellen. Ebenso reagiert Anti-Leu 23 mit den meisten IL-2- abhängigen CD8&spplus;-CTL-Zell-Linien, CD4&spplus;-tetanusspezifischen Helfer-T- Zellklonen, IL-2-abhängigen Thymozytenkulturen und mitogen-aktivierten T- Lymphozyten. Die Bindung von Anti-Leu 23 an jeden dieser Zelltypen wurde durch direkte oder indirekte Immunofluorezenz unter Verwendung von FITC- oder PE-markiertem Anti-Leu 23 und eines komplementären monoklonalen Antikörpers für jeden anderen Zelltyp eingeschätzt. Diese monoklonalen Antikörper (z. B. Anti-Leu 11 (CD16), Anti-Leu 4 (CD3) und Anti-Leu 12 (CD19)) und andere, auf die hier Bezug genommen wird, sind wenn nichts Gegenteiliges angegeben wird, kommerziell von den Becton Dickinson Immunocytometry Systems erhältlich. Die markierten Zellen wurden durch Strömungszytometrie auf FACS440 -Instrumenten, zu denen auch ein Datananalysesystem Consort 40 gehört (beide erhältlich bei den Becton Dickinson Immunocytometry Systems), analysiert. Die Ergebnisse dieser Analysen werden in Tabelle I dargestellt. TABELLE I Zelltyp Reaktivität NORMALES PERIPHERES BLUT T-Lymphozyten (CD3&spplus;) B-Lymphozyten (CD19&spplus;) NK-Lymphozyten (CD16&spplus;) Monozyten Granulozyten Normale Thymozyten Normale Splenozyten IL-2-ABHÄNGIGE ZELL-LINIEN CD8&spplus;-alloantigen-gerichtete CTL Zell-Linien CD4&spplus;-Tetanus-Toxoid-Helfer-T-Klone Thymozyt-Zell-Linien NK-Zell-Linien PHA-aktivierte T-Lymphoblaste (3 Tage) 0-5% positiv* schwach positiv 4/4 positiv** * Auf der Grundlage der Analyse von 10 normalen erwachsenen Blutspendern ** Gibt an, daß wenigstens 50 % der Zellen innerhalb der Zell-Linie nachweisbare Mengen des Antigens Leu 23 zur Expression brachten.
Während Leu 23 auf aktivierten Leukozyten vorherrscht, wird es auf proliferierenden nicht vorzugsweise zur Expression gebracht. Verschiedene gezüchtete T-Leukämiezell-Linien (z. B. HPB-ALL, PEER und CEM) bringen Leu 23 nicht zur Expression. Ebenso bringt die EBV-transformierte B- Lymphoblastoid-Zell-Linie, CCRF-SB, Leu 23 nicht zur Expression. Folglich ist Leu 23 kein Marker für die Proliferation an sich, sondern ist auf aktivierte Leukozyten verteilt.
Es wurde eine biochemische Analyse des Antigens Leu 23 vorgenommen, um den Nachweis zu erbringen, daß die unterschiedlichen Zelltypen dasselbe Antigen zur Expression brachten. Mononukleare Zellen wurden unter Verwendung von Ficoll/Hypaque (Pharmacia) aus normalem peripheren Blut isoliert. Nach dem Aufbringen auf Petrischalen aus Plaste (B-D Falcon) und dem Durchgang durch Nylonwolle zur Entfernung von Monozyten bzw. B- Lymphozyten wurden die verbleibenden Zellen durch Zentrifugation auf diskontinuierlichen Percoll-Gradienten (Pharmacia) in phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) fraktioniert. Die LBD-Fraktion (LBD - niedrige Schwimmdichte) enthält natürliche Killerzellen (CD16&spplus;) und T-Lymphozyten (CD3&spplus;). Die Fraktion mit hoher Schwimmdichte (HBD-Fraktion) enthielt ruhende T-Lymphozyten. Thymozyten wurden von Kindern, die einem herzchirurgischen Eingriff unterzogen wurden, gewonnen.
Thymozyten, T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen wurden zwei Wochen lang in einem Medium, das rIL-2 enthielt, gezüchtet. Die gezüchteten natürlichen Killerzellen, T-Zellen und Thymozyten wurden mit ¹²&sup5;I (Amersham Corp.) nach der Glucose-Oxidase/Lactoperoxidase-Methode von Keski-Oja et al. Biochem. Biophys. Res. Comm., 74:699 (1977), markiert. Die Zellen wurden dann in einem Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,02 % Natriumazid, pH-Wert 8,0), der 5 mM eines Detergenten aus 3[3- Cholamidpropyl-dimethylammonio]-1-propansulfat (CHAPS) und 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) (Sigma) enthielt, solubilisiert (löslich gemacht). Das nichteinbezogene ¹²&sup5;I wurde unter Verwendung des Ionenaustauschharzes Dowex 1x8-400 (Sigma) entfernt, und die Lysate wurden mit formalinfixiertem, Staphylococcus aureus-tragenden Protein A (Pansorbin , Calbiochem-Behring Corp.), das mit Kaninchen-Antimaus-Ig- Serum (Pel-Frez Biologicals) oder Anti-Leu 23 überzogen war, vorgeklärt. Immunkomplexe wurden in einen Probenpuffer, der 2,3 % SDS mit oder ohne 5 % 2-ME enthielt, eluiert. Dann wurde eine ein- oder zweidimensionale Elektrophorese durchgeführt.
Wie in Fig. 1A gezeigt wird, wurde eine im wesentlichen identische Struktur von IL-2-abhängigen Zell-Linien von natürlichen Killerzellen, T- Lymphozyten und Thymozyten immunologisch ausgefällt. Anti-Leu 23 fällte immunologisch ein disulfid-gebundenes Glycoprotein von 50 - 60 kD aus, das nach der Reduktion in Untereinheiten von 32 kD und 28 kDF dissoziierte. In Fig. 1B wurde durch zweidimensionale "Diagonal"-SDS-PAGE-Analyse die Disulfidbindung der Untereinheiten bestätigt, und die relative Beweglichkeit der Untereinheiten unter der Diagonale läßt darauf schließen, daß diese Proteine Dimere von Proteinen zu 32 kD + 32 kD, 32 kD + 28 kD und 28 kD + 28 kD bilden können.
Weitere Analysen zeigten das Ausmaß der Glycosylation. Leu 23 wurde aus dem bereits beschriebenen S. aureus/Immun-Komplex durch den Zusatz von 20 ul Phosphatpuffer (0,1 M, pH-Wert 6,1), der 50 mM EDTA, 1 % 2-ME und 1 % SDS enthielt, eluiert. Nach einer Inkubation von 20 min Dauer wurde der Komplex zentrifugiert, das Eluat wurde entfernt und das Pellet zehnfach in Phosphatpuffer, der 50 mM EDTA und 1 % NP-40 enthielt, verdünnt. Aliquote Teile zu 25 ul wurden in Mikrofugenrohre gegeben. Endo-F (New England Nuclear) wurde bis zu einer Endkonzentration von 23 Einheiten/ml zugesetzt, und die Proben wurden 16 Stunden lang bei 37º C inkubiert. Dann wurde ein gleiches Volumen von 2X-Probenpuffer, der 10 % 2-ME enthielt, zugesetzt, um die Verdauung zu stoppen, und die Rohre für die Dauer vor 5 min in ein Bad siedenden Wassers gegeben. Anschließend wurde die SDS-PAGE-Analyse durchgeführt.
Die Deglycosylation des Antigens mit einer im voraus bestimmten optimalen Konzentration des Endo-F-Enzyms erbrachte ein einziges Protein von 24 kD. Siehe Fig. 2. Es wurde eine partiell deglycosylierte Spezies mit einer relativen Beweglichkeit von 28 kD beobachtet. Da Endo F sowohl stark mannosehaltige als auch komplexe Typen von Kohlehydraten, die durch Asparagin an das Peptid gebunden sind, schneidet, ist das Antigen Leu 23 offensichtlich ein Protein von 24 kD mit wenigstens 2 Sequenzen für die N- gebundene Glycosylation. Die zweidimensionale NEPHGE-Analyse des intakten und deglycosylierten Antigens Leu 23 zeigte weiter, daß die Untereinheiten zu 32 kD und 28 kD wahrscheinlich dasselbe Polypeptid darstellen, das sich durch den Zusatz eines einzelnen N-gebundenen Kohlehydrats unterscheidet. Das deglycosylierte Protein zu 24 kD war resistent gegenüber einer weiteren Verdauung mit N-Glykanase, einem Enzym, das asparagin-gebundene Oligosaccharide hydrolysiert, welche gegenüber der Behandlung mit Endo F resistent sein können. Die in dem deglycosylierten Protein zu 24 kD beobachtete Mikroheterogenität kann aus der Carbamylation des Proteins durch Harnstoff während der NEPHGE-Analyse resultieren oder könnte, als Alternative dazu, auf das Vorhandensein von enzymresistenten Kohlehydraten oder O-gebundenen Oligosacchariden zurückzuführen sein.
Abgesehen von den strukturellen Besonderheiten von Leu 23, scheint das Antigen eindeutig reguliert zu sein und ermöglicht eine Methode zur Überwachung/Feststellung der Aktivierung oder Stimulierung. Es wurden die notwendigen Bedingungen definiert, um die Expression von Leu 23 zu induzieren.
LBD und HBD wurden isoliert, wie das bereits von J. H. Phillips, N. L. Warner und L. L. Lanier, Nat. Imm. Cell Growth Regul., 3:73 (1984), beschrieben wurde. Lymphozyten wurden in 500 Einheiten/ml rIL-2 gezüchtet, und nach 2-, 6- und 18-stündiger Kultur wurden aliquote Teile entfernt. Zellen wurden nach dem immunologischen Zweifarben-Fluoreszenzverfahren mit PE-konjugiertem Anti-Leu 23 und entweder FITC-konjugiertem Anti-Leu 11 (CD16) zur Identifikation natürlicher Killerzellen oder FITC-konjugiertem Anti-Leu 4 (CD3) zur Identifikation von T-Lymphozyten gefärbt.
Vor der Stimulierung mit rIL-2 war Leu 23 auf LBD-T-Zellen (T-Zellen mit niedriger Schwimmdichte) (groß) oder HBD-T-Zellen (T-Zellen mit hoher Schwimmdichte) (klein) nicht nachweisbar und auf einem kleineren Teil der natürlichen Killerzellen nur in geringen Mengen vorhanden. Siehe Fig. 3. Aber 6 Stunden nach der rIL-2-Stimiulierung wurde Leu 23 auf der Mehrzahl der NK-Zellen und einer Untermenge der T-Lymphozyten in der LBD-Fraktion festgestellt. Innerhalb von 18 Stunden brachten im wesentlichen alle rIL-2- stimulierten NK-Zellen Leu 23 zur Expression. Im Gegensatz dazu brachte nur ein kleinerer Teil der rIL-2-stimulierten natürlichen Killerzellen Transferrin-Rezeptoren, HLA-DR oder CD25 zur Expression. Siehe Fig. 4. Da alle natürlichen Killerzellen innerhalb von 18 Stunden nach der Einwirkung von rIL-2 Leu 23 zur Expression brachten, zeigt das, daß alle NK-Zellen IL- 2-responsiv sind. Natürliche Killerzellen, die 72 Stunden lang in Kultur mit rIL-2 gehalten wurden, bleiben einheitlich Leu 23-positiv. Während alle natürlichen Killerzellen Leu 23 annahmen, brachte auch nach 72 Stunden Kultur mit rIL-2 nur eine Untermenge der T-Lymphozyten in der LBD-Fraktion dieses Antigen zur Expression. Im Gegensatz zu den T-Lymphozyten in der LBD-Fraktion induzierte rIL-2 nicht die Expression von Leu 23 bei einem nennenswerten Teil der kleinen, ruhenden T-Lymphozyten in der HBD-Fraktion (Fig. 3), auch nicht nach einer Kultur von 72 Stunden.
Die Induktion des Antigens Leu 23 durch IL-2 war dosisabhängig. Wie Fig. 5 zeigt, wurden nach 18 Stunden Kultur bei 3 Einheiten/ml rIL-2 nur geringe Werte des Antigens Leu 23 auf natürlichen Killerzelien induziert und reichten 100 Einheiten/ml rIL-2 aus, um das Antigen auf der Mehrzahl der natürlichen Killerzellen zu induzieren. IL-2 war notwendig und ausreichend, um die Expression von Leu 23 auf natürlichen Killerzellen zu induzieren. Natürliche Killerzellen, die durch Isolierung von CD16&spplus;- Lymphozyten aus der LBD-Fraktion unter Verwendung von FACS440 - Zellsortierungsinstrumenten gereinigt wurden, erreichten die Fxpression von Leu 23 nach 18 Stunden Kultur mit rIL-2. Es waren keine T-Lymphozyten, Monozyten oder andere zusätzliche Zellen notwendig, damit IL-2 die Expression von Leu 23 auf natürlichen Killerzellen induzieren konnte.
Es wurden weitere Untersuchungen durchgeführt, um die Korrelation zwischen der durch Il-2 verstärkten Zytotoxizität und der Expression von Leu 23 zu bestimmen. LBD-Zellen wurden 18 Stunden lang in serumfreien Medien mit 100 Einheiten/ml rIL-2 bei Vorhandensein oder Fehlen eines neutralisierenden Kaninchen- oder Ziegen-Anti-IL-2-Serums gezüchtet.
Ziegen-Anti-IL-2 wurde als Verdünnung verwendet, um 100 Einheiten/ml rIL-2 vollständig zu neutralisieren. Kaninchen-Anti-IL-2 (Genzyme) wurde als Verdünnung verwendet, um 50 % Neutralisierung von 100 Einheiten/ml rIL- 2 zu erreichen. Nach 18 Stunden wurden die Zellen geerntet und 4 Stunden auf Zytotoxizität gegenüber mit &sup5;¹CR (Amersham) markierten Tumor-Zielzellen (d. h. Colo-205, ATCC Nr. CCL 222) bei einem Effektor-Ziel-Verhältnis von 12:1 analysiert. Diese Zellen wurden nach dem Färben mit FITC-konjugiertem Kontroil-IgG oder Anti-Leu 23 (FITC) durch Strömungszytometrie weiter analysiert.
Wie in der Tabelle II gezeigt wird, verstärkten beide IL-2 die Zytotoxizität gegenüber einer Dickdarm-Karzinon-Zell-Linie, und die Induzierung von Leu 23 auf natürlichen Killerzellen wurde vegleichsweise durch das neutralisierende Antiserum unterbunden. Es besteht ein quantitatives Verhältnis zwischen der Unterbindung der Zytotoxizität und der Unterbindung der Induzierung des Antigens Leu 23. Diese Ergebnisse weisen nach, daß beide Phänomene IL-2-abhängig sind und möglicherweise koregulierte Ereignisse sind. TABELLE II % ZYTOTOXIZITÄT ANTISERUM IL-2 % UNTERBINDUNG Colo-205 Lyse % UNTERBINDUNG Antigen Leu-23 Keines Normales Serum Kaninchen-Anti-IL-2-Serum ZiegenAnti-IL-2-Serum
Es wird auf Fig. 6A Bezug genommen. Es wurden Experimente durchgeführt, um festzustellen, ob der Pegel der Expression des Antigens Leu 23 mit der lytische Aktivität in Wechselwirkung steht. LBD-Zellen wurden 18 Stunden lang mit 6 Einheiten/ml und 12 Einheiten/ml rIL-2 gezüchtet und dann mit FITC-konjugiertem Anti-Leu 11 und PE-konjugiertem Anti-Leu 23 gefärbt. Unter diesen Bedingungen wurden auf der CD16&spplus;-NK-Zell- Population nur geringe Werte von Leu 23 induziert. Obwohl keine distinktiven negativen oder positiven Untermengen an Leu 23 offensichtlich waren, war es möglich, CD16&spplus;-NK-Zellen zu identifizieren, die negativ waren oder geringe (oder "verschwommene") Werte des Antigens Leu 23 zur Expression brachten, und CD16&spplus;-NK-Zellen, die relativ hohe (oder "klare") Werte des Antigens Leu 23 zur Expression brachten.
Es wird auf Fig. 6B Bezug genommen. Bei Einsatz von 6 Einheiten/ml rIL-2 zur Induzierung wurde keine Verstärkung der Zytotoxizität gegenüber einer NK-insensitiven Dickdarm-Karzinom-Zell-Linie beobachtet, auch wenn geringe Pegel des Antigens Leu 23 auf der NK-Zell-Population festgestellt werden konnten. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Antigen Lau 23 vor der Feststellung der zytotoxischen Aktivität zur Expression gebracht werden kann. Bei Einsatz von 12 Einheiten/ml rIL-2 für die Inzudierung wurde die Zytotoxizität durch natürliche Killerzellen vermittelt, die sowohl "verschwommene" als auch "klare" Pegel des Antigens Leu 23 zur Expression brachten. Ein Vergleich der zytotoxischen Aktivität, die bei verschiedenen Effektor-Ziel-Verhältnissen vermittelt wurde, zeigte eindeutig, daß natürliche Killerzellen, die höhere Pegel des Antigens Leu 23 zur Expression bringen, eine stärkere lytische Aktivität aufweisen als die Population von natürlichen Killerzellen, der Leu 23 fehlt oder die niedrige Pegel dieses Antigens zur Expression bringt.
Die Wechselbeziehung zwischen der zytotoxischen oder lytischen Aktivität und der Expression von Leu 23 innerhalb von Stunden nach der Zellaktivierung durch Il-2 stellt ein Mittel zur Überwachung der zytotoxischen Funktion dar, bei der es nicht notwendig ist, auf die Expression von Transferrin oder IL-2-Rezeptoren zu warten. Damit verfügt der Kliniker über ein Mittel, die Zellaktivierung vor der Verabreichung zu bestätigen, was zu einer verbesserten Behandlung führen kann.
Beispielsweise wurden bei der Methode zur LAK-Therapie, die von Rosenberg vorgeschlagen wurde, siehe US-PS 4 690 915, die in die vorliegende Beschreibung als Referenz einbezogen wird, autologe LAK-Zellen isoliert und 3 bis 4 Tage vor der intravenösen Verabreichiing mit rIL-2 kombiniert. Die zytotoxische Aktivität wurde anhand der Fähigkeit der LAK- Zellen, die Lyse von NK-insensitiven Tumor-Zell-Linien zu bewirken, gemessen.
Als Ersatz für dieses sehr lange Verfahren wird eine Probe der rIL-2- aktivierten Zellen mit Anti-Leu 23 kombiniert. Die Färburg der rIL-2- aktivierten Zellen kann durch direkte Fluoreszenz (z. B. Kopplung von Anti- Leu 23 an ein Fluorochrom wie FITC oder PE, ein Phykobiliprotein) oder durch indirekte Fluoreszenz (z. B. unter Verwendung von FITC-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Ig) festgestellt werden. In beiden Fällen steht der Grad der Färbung der aktivierten Zellen im Zusammenhang mit der Zytotoxizität. Folglich können die Zellen, denen die Probe entnommen wurde, zur Behandlung verabreicht werden, wobei bekannt ist, daß die Zellen wirksam aktiviert wurden.
Ebenso stellt die Wechselbeziehung zwischen der Mitogenstimulierung des T-Zellen-Antigen-Rezeptors und der Expression von Leu 23 ein zusätzliches Mittel zur Überwachung der Leukozyten-Aktivierung dar. Es wird auf Fig. 8 Bezug genommen. Die T-Leukämie-Zell-Linie, Jurkat, bringt Leu 23 zur Expression, nachdem sie über Nacht mit Anti-Leu 3 stimuliert wurde. Als solche kann die physiologische Stimulierung von normalen T-Zellen über den T-Zell-Antigen-Rezeptor mit speziellen Antigenen (z. B. Alloantigen, Virus oder Autoantigen) zur Expression von Leu 23 führen. Anti-Leu 23 kann daher beispielsweise mit den Leukozyten von einem Patienten oder einer Person, von der angenommen wird, daß sie Anzeichen für eine virale Infektion zur Expression bringt, kombiniert werden. Durch Anwendung der direkten oder indirekten Immunofluoreszenz mit Anti-Leu 23 kann Leu 23 nachgewiesen werden. Dann kann eine angemessene Behandlung festgelegt werden.
Abschließend wurde festgestellt, daß Leu 23 als Folge der IL-2- Stimulierung sowohl induziert als auch phosphoryliert wird. LBD-Zellen wurden gewaschen und eine Stunde lang bei 37º C in einem phosphatfreien Puffer (modifizierte, phosphatfreie Earle-Salze) mit 25 mM HEPES (Irvine Scientific), ergänzt mit 1 mM nichtessentiellen Glutamin-Aminosäuren (GIBCO), 100 ug/ml Gentamyzin (GIBCO) und 2 % wärme-inaktiviertem Pferdeserum (KC Biologicals), inkubiert. Die Zellen wurden wieder in phosphatfreiem Puffer, der 1,25 mCi/ml [³²P]-Orthophosphat (transportsystemfrei, Amershan Corp.) und 800 Einheiten/ml rIL-2 enthielt, aufgeschlämmt. Die Zellen wurden 3 Stunden lang bei 37º C inkubiert und dann dreimal in kaltem PBS, das 0,1 mM Na&sub3;VO&sub4;, 0,4 mM EDTA, 10 mM Na&sub4;P&sub2;O&sub7;, 10 mM NaF und 0,1 % NaN&sub3; enthielt, gewaschen. Dann wurden die Zellen solubilisiert und in der oben beschriebenen Art und Weise Lysate und Eluate hergestellt.
Es wird auf Fig. 7 Bezug genommen. Es wurden disulfid-gebundene, [³²P]-markierte Proteindimere nachgewiesen, die aus Untereinheiten zu 32 kD und 28 kD zusammengesetzt waren. Diese Untereinheiten waren mit den in Fig. 1B dargestellten identisch. Die Induzierung und Phosphorylierung von Leu 23 ist folglich den Ergebnissen ähnlich, die bei der Lymphozyten- Stimulierung beobachtet werden, welche zur Aktivierung von intrazellulären Protein-Kinasen führt, welche wiederum Wachstumsfaktor-Rezeptoren, Komponenten des T-Zellen-Antigen-Rezeptorkomplexes und andere Membran- Glykoproteine phosphorylieren.
Anti-Leu 23 identifiziert folglich ein Antigen, das auf peripheren Blut-NK-Zellen und einer eindeutigen Untermenge von T-Lymphozyten nach der Einwirkung von IL-2 schnell induziert wird, ohne daß exogene Ko-Faktoren oder zusätzliche Zellen erforderlich sind. Die Kinetik der Il-2-induzierten Expression von Leu 23 auf natürlichen Killerzellen verläuft ziemlich parallel zur Erlangung der zytotoxischen Funktion gegenüber festen Tumorzielen, wodurch ein nützlicher Marker für die Aktivierung von natürlichern Killerzellen geschaffen wird.

Claims

1. Hybridom, welches einen monoklonalen Antikörper produziert, wobei der monoklonale Antikörper mit dem Zell-Antigen in Wechselwirkung tritt, welches durch den monoklonalen Antikörper erkannt wird, der durch das als HB-9627 bezeichnete Hybridom produziert wird.

2. Monoklonaler Antikörper, der mit dem Zell-Antigen in Wechselwirkung tritt, welches durch den monoklonalen Antikörper erkannt wird, der durch das als ATCC Nr. HB-9627 bezeichnete Hybridom produziert wird.

3. Methode zur Überwachung der Aktivierung von Leukozyten in einer biologischen Probe, welche die Kombination der Probe mit einen monoklonalen Antikörper, der mit dem Zell-Antigen in Wechselwirkung tritt, welches durch den monoklonalen Antikörper erkannt wird, der durch das als HB-96627 bezeichnete Hybridom produziert wird, den Nachweis der Kombination durch Methoden der direkten oder indirekten Fluoreszenz und die Feststellung der Fluoreszenz durch Methoden der Strömungszytometrie oder der Fluoreszenzmikroskopie umfaßt.

4. Methode nach Anspruch 3, bei welcher die aktivierten Leukozyten aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und NK- Zellen besteht.

5. Methode nach Anspruch 4, bei welcher die aktivierten Leukozyten NK- Zellen sind.

6. Methode nach Anspruch 4, bei welcher die aktivierten Leukozyten T- Lymphozyten sind.

7. Methode nach einem der Ansprüche 3 bis 6, bei welcher der monoklonale Antikörper der monoklonale Antikörper ist, der durch das als ATCC Nr. HB- 9627 bezeichnete Hybridom produziert wird.

8. Methode nach einem der Ansprüche 3 bis 7, bei welcher der monoklonale Antikörper direkt an ein Fluorochrom gekoppelt ist.

9. Methode nach Anspruch 8, bei welcher das Fluorochrom aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Fluoreszein-Isothiocyanat und Phykobiliprotein besteht.

10. Methode nach einem der Ansprüche 3 bis 9, bei welcher die Leukozyten in der Probe durch IL-2 aktiviert werden oder über den T-Zellen-Antigen- Rezeptor durch ein Fremdantigen, Autoantigen, einen Anti-T-Zellen-Rezeptor- Antikörper oder einen Anti-CD3-Antikörper aktiviert werden.