DE69430846T2 - Für natürliche killerzellen spezifische antigene und sie identifizierende antikörper - Google Patents

Für natürliche killerzellen spezifische antigene und sie identifizierende antikörper

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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf neue Zelloberflächenstrukturen, welche selektiv auf einer Subpopulation von natürlichen Killerzellen ausgedrückt sind, und auf Antikörper, welche sich an einzigartige bzw. einmalige Epitope auf diesen Strukturen binden.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Natürliche Killerzellen (nachfolgend manchmal als "NK-Zellen" bezeichnet) sind große, granuläre bzw. körnige Lymphozyten ("LGLs"), umfassend 2-15% mononukleäre bzw. einkernige Zellen von peripherem Blut in gesunden Individuen. Obwohl NK-Zellen keine der bekannten T-Zellen-Rezeptorkomplexe wieder arrangieren oder exprimieren bzw. ausdrücken, können sie bestimmte, virusinfizierte und -transformierte Zellen in einer nicht-MHC-beschränkten Weise ohne vorherige Sensibilisierung bzw. Abtastung erkennen und töten. Mit der Ausnahme von CD16, einem FC-Rezeptor für Immunglobulin, welcher Antikörper-beschichtete Zielzellen erkennt, wurden die NK-Zelloberflächenrezeptoren, die für die Zielzellerkennung verantwortlich sind, nicht identifiziert. Das Fehlen eines definierenden Oberflächenrezeptors erfordert, daß NK-Zellen durch eine Kombination von phänotypischen und funktionellen Charakteristika identfiziert werden.
  • Obwohl die meisten NK-Zellen CD3 : TCR-, CD16+, CD56+ LGLs sind, besteht eine bemerkenswerte, phänotypische und funktionelle Heterogenität innerhalb dieser Population (Trinchieri, Adv. Immunol., 47: 187 (1989)). Beispielsweise wurde gezeigt, daß die Oberflächendichte von CD56 funktionell unterschiedliche NK-Zellpopulationen definiert. CD56bright NK- Zellen sind überwiegend CD16+, nicht-granuläre Lymphozyten, denen eine zytolytische Effektorfunktion mangelt, welche heftig in Antwort auf exogenes IL-2 proliferieren bzw. sich vermehren. CD56dim NK-Zellen sind CD16+ LGLs, die eine wirksame, zytolytische Effektorfunktion besitzen, welche nicht in Antwort auf IL-2 proliferieren. Da einige T-Zellen sowohl CD16 als auch CD56 ausdrücken, können diese Moleküle selbst nicht die NK-Zellpopulation definieren. (Trinchieri, 1989). Da weiters die Expression von CD56 auf der funktionell differenzierten Populationen von NK-Zellen niedrig ist, können monoklonale Antikörper, die mit CD56 reaktiv sind, nicht verwendet werden, um zuverlässig diese Subpopulation von NK-Zellen von anderen Zellen in einer Probe zu unterscheiden.
  • Die EP-A 0 160 486 offenbart Verfahren zum Detektieren und Lysieren bzw. Auflösen von NK-Zellen.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Ein monoklonaler Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung (oder ein immunreaktives Fragment oder Derivat davon) bildet einen Immunkomplex mit dem Glykoprotein PEN5, welches auf der Oberfläche einer natürlichen Killerzelle vorhanden ist, und der Antikörper ist mit Antigenen, die auf T-Zellen, B-Zellen, Monozyten, Granulozyten, roten Blutkörperchen und Plättchen vorhanden sind, nicht reaktiv, wobei das Glykoprotein PEN5 auf der Oberfläche einer natürlichen Killerzelle vorhanden ist und ein N-gebundenes bzw. verknüpftes Glykoprotein PEN5α, das ein mittleres Molekulargewicht von 227 ±4 kDa aufweist, und ein O-gebundenes Glykoprotein PEN5β umfaßt, das ein mittleres Molekulargewicht von 140 ±3 kDa aufweist.
  • Antikörper dieser Erfindung binden sich an einzigartige Epitope, die auf einer Zelloberflächenstruktur, die selektiv auf funktionell differenzierten NK Zellen ausgedrückt ist, vorhanden sind
  • Das neue, NK-Zellen-spezifische Molekül dieser Erfindung besteht im wesentlichen aus einem Paar von polydispergierten Glykoproteinen, die hier als PEN5α und PEN5β bezeichnet werden, die scheinbare Molekulargewichte von 120-150 bzw. 210-245 kdal besitzen, wie dies durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese auf einem 6% Polyacrylamidgel unter nicht-reduzierenden Bedingungen bestimmt wird. Die einzigartigen Epitope des PEN5α/PEN5β-Glykoprotein-Paars sind vorzugsweise auf der Subpopulation von peripheren Blut-NK- Zellen exprimiert bzw. ausgedrückt, welche von dem Phänotyp CD16&spplus; CD56dim abhängig von ihrer Expression auf NK-Zellen von peripherem Blut sind, die den Phänotyp CD16&spplus; CD56bright aufweisen, und sind nicht auf CD3&spplus; T-Lymphozyten oder CD20&spplus; B-Lymphozyten vorhanden. In bevorzugten Ausbildungen der Erfindung ist der Antikörper nicht mit T-Zellen von peripherem Blut, aktivierten T-Zellen, Thymozyten, B-Zellen von peripherem Blut, Milz-B-Zellen, aktivierten B-Zellen, Monozyten, Granulozyten, Plättchen und roten Blutkörperchenzellen reaktiv. Die Antikörper der Erfindung sind vorzugsweise monoklonale Antikörper und in insbesondere bevorzugten Ausbildungen stammen sie von Mäusen oder sind menschlichen Ursprungs oder sie sind Chimären-Antikörper, die wenigstens den konstanten Bereich desselben mit menschlichem Ursprung aufweisen.
  • Alle monoklonalen Antikörper, die die obige Spezifität und Charakteristika aufweisen, sind durch die vorliegende Erfindung mitumfaßt. Die monoklonalen Antikörper werden durch Hybridzellinien unter Verwendung von konventionellen Hybridisierungs- und Screeningtechniken, wie sie in Anderson et al. J. Immunol., 143: 1899 (1989) beschrieben sind, hergestellt. Wie dies in der Technik der monoklonalen Antikörper gut bekannt ist, sind unabhängig voneinander hergestellte Hybridzellinien, welche monoklonale Antikörper herstellen, die für eine gegebene, antigenische Determinante spezifisch sind, typischerweise voneinander verschieden, wie dies jeder so hergestellte, monoklonale Antikörper ist. Daher ist es, während eine Wiederholung des hier beschriebenen Verfahrens in der Herstellung einer Hybridzellinie resultieren kann, die einen verwendbaren bzw. nützlichen, monoklonalen Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung bildet, nicht wahrscheinlich, daß sie eine Hybridzellinie bilden wird, welche einen monoklonalen Antikörper produziert, der chemisch eine exakte Kopie des unten beschriebenen, monoklonalen Antikörpers ist.
  • In einer weiteren Ausbildung der Erfindung ist das durch die Antikörper der Erfindung erkannte Epitop ein sulfatiertes Polylactosamin-Kohlenhydrat, das zu Keratansulfat-Glycosaminoglycan in Beziehung steht.
  • In noch einer Ausbildung weisen die Antikörper die Charakteristika bzw. Merkmale des monoklonalen Antikörpers auf, der hier alternativ entweder Anti-PEN5 oder mAb 5H10 bezeichnet wird, der durch ein Hybridom sekretiert wird, das durch die ATCC-Zugangsnr. HB11441 identifiziert ist.
  • Die Antikörper und/oder immunreaktiven Fragmente oder Derivate der Erfindung können markiert sein, z. B. mit einem radioaktiven, enzymatischen oder fluoreszierenden Marker, und können verwendet werden, um funktionell voneinander unterschiedene NK-Zellen in einer gemischten Population von Zellen zu detektieren, aufzuzählen und/oder zu reinigen und um diese Zellen von Nicht-NK-Zellen und NK-Zellen, welche nicht funktionell unterschieden sind, zu unterscheiden. Eine Identifizierung der funktionell unterschiedenen Subpopulation von NK-Zellen umfaßt (a) ein Kontaktieren einer geeigneten Probe, welche eine gemischte Population von Zellen enthält, welche beispielsweise peripheres Blut, Knochenmarkaspirat oder Lymphoidgewebe sein kann, mit einem Antikörper der Erfindung oder einem immunreaktiven Fragment oder Derivat davon und (b) Detektieren bzw. Feststellen einer Immunkomplexbildung. Immunkomplexbildung kann durch jede der Techniken, welche konventionell und in der Technik gut bekannt sind, durchgeführt werden.
  • Die Antikörper der Erfindung können auch verwendet werden, um selektiv funktionell unterschiedene NK-Zellen, welche von dem Phänotyp CD16&spplus; CD56dim sind, in einer Probe, umfassend eine gemischte Population von Zellen, zu eliminieren. So werden in einem weiteren Aspekt der Erfindung Verfahren zum selektiven Eliminieren oder Entfernen von funktionell unterschiedenen, natürlichen Killerzellen aus einer geeigneten Probe, vorzugsweise einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, welche (a) ein Kontaktieren der Probe mit einem Antikörper der Erfindung oder einem immunreaktiven Fragment oder Derivat davon, welches gegebenenfalls an ein Radionukleotid oder ein Toxin gebunden ist, und (b) ein Entfernen der Zellen von der Probe beinhalten, welche sich an den Antikörper, das Fragment oder Derivat binden. In einer bevorzugten Ausbildung ist die biologische Probe Knochenmarkaspirat.
  • Diese ebenso wie andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der folgenden, detaillierten Beschreibung und den Ansprüchen offensichtlich werden.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • Fig. 1 umfaßt vier zweifarbige Flußzytometrie-Histogramme, welche insgesamt zeigen, daß das PEN5-Epitop selektiv auf CD56&spplus; CD16&spplus; Lymphozyten von peripherem Blut ("PBL") ausgedrückt ist. PBL wurde mit 2-Farb-Flußzytometrie unter Verwendung von Rhodamin-konjugiertem Anti-CD56 mAb, Rhodamin- konjugiertem Anti-CD3 mAb, Rhodamin-konjugiertem Anti-CD20 mAb, FITC-konjugiertem Anti-CD16 mAb oder biotinyliertem Anti-PEN5 mAb gefärbt. Die Bindung von biotinyliertem Anti- PEN5 mAb wurde unter Verwendung von APC-konjugiertem Avidin nachgewiesen. Die Zahlen in jedem Quadranten zeigen die Prozent bzw. der Prozentsatz an positiv gefärbten Zellen.
  • Fig. 2 umfaßt drei Sätze von Histogrammen, die kollektiv die Expression des PEN5-Epitops an distinkten bzw. unterschiedenen NK-Zellen-Subsätzen zeigen. Für die Experimente, die diese Histogramme bildeten, waren gereinigte NK-Zellen entweder nicht sortiert oder in CD56dim- und CD56bright-NK- Zellen-Untersätze unter Verwendung von Rhodamin-konjugiertem Anti-CD56 mAb und Flußzytometrie sortiert. Nicht-sortierte NK-Zellen, CD56dim- und CD56bright-NK-Zellen wurden weiters in bezug auf die Expression des PEN5-Epitops unter Verwendung von biotinyliertem Anti-PEN5 mAb und FITC-konjugiertem Avidin analysiert. Vergleiche bzw. Kontrollen wurden unter Verwendung von Maus-Isotyp angepasstem bzw. abgeglichenem Vergleichs- bzw. Kontroll-mAb durchgeführt. Die Zahlen in jedem der Histogramme zeigen die Prozent an positiv gefärbten Zellen.
  • Fig. 3 umfaßt eine Serie von Flußzytometrie-Histogrammen, die die Kinetik von PEN5-Expression auf aktivierten NK-Zellen illustrieren. Sortierte CD56dim- und CD56bright NK-Zellen wurden 20 Tage mit Ionomycin und Lymphozyten-konditioniertem Medium, wie in den Beispielen beschrieben, aktiviert. Am angegebenen Zeitraum (d. h. 0, 6, 8, 10, 14 und 20 Tage Kultur) wurden Aliquote der aktivierten NK-Zellpopulationen in bezug auf ihren Zelloberflächen-Phänotyp durch Flußzytometrie unter Verwendung von Isotyp-angepasster VergleichsmAb, Anti-CD56 und Anti- PEN5 mAb analysiert. Ergebnisse zeigen die Prozent an positiv gefärbten Zellen (%); die gesamte, mittlere Fluoreszenzintensität ist unten angegeben.
  • Fig. 4 ist eine Serie von Flußzytometrie-Histogrammen, die die Zelloberflächen-Expression des PEN5-Epitops an leukämischen NK-Zellen zeigen. NK-Zellen von peripherem Blut ebenso wie mononukleäre Zellen von peripherem Blut (PBMC), die von drei Patienten isoliert wurden, die an einer granulären, Lymphozyten-proliferativen Störung "GLPD"-Anfallskrise (GLPD1-3) litten, wurden in bezug auf die Zelloberflächen- Expression von CD56 und PEN5 analysiert, indem indirekte Immunfluoreszenz und Flußzytometrie verwendet wurden. Die Zahlen in jedem Histogramm zeigen Prozent an positiv gefärbten Zellen.
  • Fig. 5 ist eine Reproduktion eines SDS-Gels aus einer Immunausfällung von PEN5-Glykoproteinen. Detergenslysate, die aus radioiodierten NK-Zellen hergestellt wurden, wurden unter Verwendung von 5H10 mAb oder Maus-IgM-Vergleich immunausgefällt. Proben wurden dann unter nicht-reduzierenden Bedingungen auf einem 6% SDS-Poylacrylamidgel getrennt.
  • Fig. 6 ist eine Reproduktion eines SDS-Gels von Immunausfällungen, die nach enzymatischer Deglykosilierung von PEN5-Glykoproteinen durchgeführt wurde. Detergenslysate, die aus radioiodierten NK-Zellen gebildet wurden, wurden unter Verwendung von 5H10 mAb immunausgefällt. Affinitätsgereinigte PEN5α- und PEN5β-Glykoproteine wurden von den Antikörperbeschichteten Sepharosekügelchen unter Verwendung von 0,15 M NH&sub4;OH, pH 10,5, eluiert. Aliquote dieser getrockneten Probe wurden dann einer Deglykosilierung für 24 h bei 37ºC unter Verwendung von PNgase F (Weg 6), O- Glykanase (Weg bzw. Route 3), Keratanase I (Weg 2), O-Glykanase und Keratanase (Weg 4), Neuraminidase (Weg 6) und PNgase F und Neuraminidase (Weg 7) unterworfen. Vergleichseluate, die in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne irgendwelche Enzyme inkubiert wurden, wurden in Weg 1 abgetrennt. Proben wurden unter nicht-reduzierenden Bedingungen auf einem 6-12% SDS-Polyacrylamid-Gradientengel abgetrennt.
  • Fig. 7A bis 7C zeigen die Reaktivität von Anti-PEN5 mAb mit Keratansulfat-Glykosaminoglykanen.
  • In Fig. 7A wurde ein I¹²&sup5;-markierter 5H10 mAb (1 · 10&sup6; cpm/Probe) für 20 min bei 4ºC in PBS in der Anwesenheit der angegebenen Konzentrationen von Rinderhornhaut-Keratansulfat (BC) vorinkubiert. Die Mischung wurde dann zu NK- Zellen für eine weitere 20 minütige Inkubation bei 4ºC zugesetzt, bevor sie dreimal in PBS-1%BSA gewaschen wurde. Die Proben wurden in einem &tau;-Zähler gezählt und die Ergebnisse sind als mittlere cpm von Doppelproben (SD < 10%) ausgedrückt. Wenn sie in Inkubation mit NK-Zellen oder Anti-PEN5 mAb verwendet wurden, waren die folgenden Kohlenhydrate, die mit 10 mg/ml verwendet wurden, ohne irgendeinen Effekt auf die Anti-PEN5-Bindung an die NK-Zelloberfläche: Chondroitinsulfat B, Heparin, Heparansulfat, Dextransulfat, GlcNAc, Mannose-6-phosphat, Lactose, Galactose-6-phosphat, Fucose, Glucose-6-phosphat, Glucose und Galactose.
  • In Fig. 7B wurden NK-Zellen von peripherem Blut in PBS- 1%BSA für 3 h mit Glykosidasen (0,025 U/ml) oder 45 min mit Proteasen (5 mg/ml) bei 37ºC inkubiert. Die Zelloberflächen-Expression des PEN5-Epitops wurde dann durch Flußzytometrie unter Verwendung von Anti-PEN5 mAb analysiert. Prozent Modulation wurden als das Verhältnis der gesamten, linearen, mittleren Fluoreszenzintensität der behandelten Zellen gegenüber jener der nicht-behandelten Vergleichszellen berechnet.
  • In Fig. 7C wurde die Antigenizität von Anti-PEN5 mAb für Aggrecanproteoglykane durch ELISA, wie dies in den Beispielen beschrieben ist, analysiert. Der Antikeratansulfat mAb 5D4 wurde als ein positiver Vergleich verwendet. Chondroitinase ABC wurde in 0,04 U/ml verwendet, Keratanase I wurde in 0,05 U/ml verwendet und Keratanase II wurde in 0,004 U/ml für 1 h bei 37ºC verwendet. In Fig. 7C zeigen die kreuzschraffierten Balken die Reaktivität mit dem Anti-PEN5 Antikörper 5H10 an, während die offenen Balken die Reaktivität mit dem Vergleichs-Antikörper 5D4 zeigen. Die verwendeten Abkürzungen sind: CD1 = embryonisches Hühnerknorpelaggrecan; BNC = Rinder-nasales Knorpelaggrecan; RC = Kletterratten-Chondrosarcomaaggrecan; und SHK = Hai-Schädel- Knorpelaggrecan.
  • Fig. 8A bis 8C zeigen die Ergebnisse von Immungoldfärbung des PEN5-Epitops an NK-Zellen. NK-Zellen von peripherem Blut wurden mit Anti-PEN5 mAb, gefolgt durch goldmarkierte Anti-Maus IgM Antikörper gefärbt und Glutaraldehyd-festgelegte Zellen wurden dann durch Transmissions-Elektronenmikroskopie analysiert. Vergrößerung: X48500, 0,972 cm = 200 nm. Die drei Fotomikrografien 8A-8C zeigen unterschiedliche Ansichten derselben gefärbten Zelle.
  • Fig. 9 zeigt ein vergleichendes hystochemisches Färben eines normalen Lymphknotens und Mandel eines Erwachsenen. Vergrößerung von PEN5-Färbung, die in den ganz rechten Tafeln gezeigt ist, ist 40X. Vergrößerung in allen anderen Tafeln ist 10X. Monoklonale Antikörper, die verwendet werden, um Gewebeschnitte zu färben, und spezifische Verfahren sind in dem Kapitel Materialien und Methoden, das in Beispiel 6 angegeben ist, beschrieben.
  • Fig. 10 illustriert ein vergleichendes, histochemisches Färben eines normalen Thymus eines Erwachsenen und eines Fötus. Vergrößerung von Erwachsenen-Thymus, der mit Vergleich und PEN5-spezifischen Antikörpern gefärbt ist, ist 20X. Vergrößerung von allen anderen Tafeln ist 10X. Monoklonale Antikörper, die verwendet werden, um Gewebeschnitte zu färben, und spezifische Verfahren sind in Materialien und Methoden beschrieben, welche in Beispiel 6 gefunden werden.
  • Fig. 11 illustriert ein vergleichendes histochemisches Färben von Leber eines normalen Erwachsenen und eines Fötus. Vergrößerung der Erwachsenen-Leber, die mit Anti-PEN5 gefärbt ist, ist 20X (linke Tafel) und 40X (rechte Tafel). Vergrößerung von fötaler Leber, die mit PEN5 gefärbt ist, ist 10X (linke Tafel) und 60X (rechte Tafel). Vergrößerung von allen anderen Tafeln ist 10X. Monoklonale Antikörper, die verwendet werden, um Gewebeschnitte zu färben, und spezifische Verfahren sind in Materialien und Methoden beschrieben, welche in Beispiel 6 gefunden werden.
  • Fig. 12 illustriert das vergleichende, histochemische Färben von Lunge und Colon bzw. Dickdarm eines normalen Erwachsenen. Vergrößerung der Lunge, die mit Anti-CD56 und Anti-PEN5 gefärbt ist, ist 20X. Vergrößerung von allen anderen Schnitten ist 10X.
  • Fig. 13A bis 13D zeigen ein doppeltes Markieren von Gewebeinfiltrierenden Lymphozyten. Gewebeschnitte von Erwachsenenmilz (Tafeln A und B) oder Erwachsenenappendix (Tafeln C und D) wurden doppelt mit Fluorescein-markiertem Anti-PEN5 (Tafeln A und C) und Rhodamin-markiertem Anti-TIA-1 (Tafeln B und D), vor einer Überprüfung durch Fluoreszenzmikroskopie markiert. Schwarze Pfeilspitzen zeigen den Ort von PEN5&spplus;-Zellen in Tafeln A und C. Weiße Pfeilspitzen zeigen den Ort von sowohl PEN5&spplus;-Zellen und TIA-1&spplus;-Zellen in Tafeln B und D.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Natürliche Killerzellen sind CD3 : TCR&supmin; CD16&spplus;, CD56&spplus; große, granuläre Lymphozyten. Zwei funktionell unterschiedliche Populationen von NK-Zellen von peripherem Blut können durch ihre Oberflächen-Expression von einer Isoform des Neuralzelladhäsionsmoleküls, NCAM (auch bekannt als CD56), unterschieden werden. CD56brignt NK-Zellen haben die Attribute einer nichtdifferenzierten Zelle dahingehend, daß sie in Antwort auf exogene Zytokine heftig proliferieren, es ihnen jedoch weitgehend an zytolytischer Wirksamkeit fehlt bzw. mangelt. CD56dim NK-Zellen haben die Attribute einer differenzierteren Zelle dahingehend, daß sie schlecht bzw. wenig in Antwort auf exogene Zytokine proliferieren bzw. sich vermehren, jedoch potente, zytolytische Effektorzellen sind. Zahlreiche monoklonale Antikörper, die menschliches CD56 erkennen, sind im Handel erhältlich, beispielsweise von Coulter Corp. (Hialeah, Florida) und AMAC, Inc. (Westbrook, Maine).
  • NK-Zellen sind fähig, zwei Arten von zytotoxischen Effektorfunktionen zu mediatisieren: natürliche Zytotoxizität und Antikörper-abhängige, zelluläre Zytotoxizität ("ADCC"). In dieser Fähigkeit spielen NK-Zellen eine wichtige Rolle bei der Wirtsverteidigung gegen virale Infektion und in der Immunüberwachung gegen die Errichtung bzw. den Aufbau von transformierten Zellen. Neuere Ergebnisse zeigen, daß NK- Zellen eine primitive Form von Allorekognition bewirken können, was zu einer Transplantatabstoßung während allogenischer Transplantation und auch zu der Transplantat-gegen- Empfänger-Erkrankung beitragen kann. Aus diesen Gründen ist die zuverlässige Identifikation von NK-Zellen innerhalb der mononukleären Zellpopulation von großer Wichtigkeit. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Identifikation und molekulare Charakterisierung eines neuen, sulfatierten Polylactosamin-Epitops, dessen Expression weitgehend auf die funktionell differenzierte Population von LGLs, die zuvor als CD16&spplus; CD56dim charakterisiert wurden, zytologische Effektoren und auf Antikörper eingeschränkt, die fähig sind, dieselben zu erkennen. Da dieses Epitop nicht auf ruhenden bzw. verbleibenden oder aktivierten T-Zellen, verbleibenden bzw. ruhenden oder aktivierten B-Zellen, Monozyten, Granulozyten, Plättchen oder roten Blutkörperchen exprimiert bzw. ausgedrückt wird, können Antikörper, welche sich an einzigartige Epitope auf dem PEN5-Glykoproteinpaar binden, verwendet werden, um direkt diese bedeutende Population von einkernigen Zellen zu identifizieren. Da das Epitop vorzugsweise an der funktionell unterschiedenen Subpopulation von NK-Zellen relativ zu CD56bright NK-Zellen ausgedrückt wird, welche die Attribute einer nichtdifferenzierten Zelle besitzen, können darüber hinaus Antikörper, die sich an das Epitop binden, verwendet werden, um diese zwei Subpopulationen von NK-Zellen voneinander zu unterscheiden.
  • So wird in einem Aspekt der Erfindung ein Antikörper oder Fragment oder Derivat desselben zur Verfügung gestellt, welcher bzw. welches ein einzigartiges Epitop des PEN5-Glykoproteinpaars erkennt. Wie sie hier verwendet wird, bedeutet die Phrase "einmaliges bzw. einzigartiges Epitop" jedes Epitop an dem PEN5&alpha;-Glykoprotein und/oder dem PEN5&beta;-Glykoprotein, welches ähnlich dem neuartigen, sulfatierten Polylactosamin-Epitop, das hier identifiziert wird, in einem hohen Prozentsatz, d. h. zumindest 70% der Population von LGLs, die zuvor als CD56dim, CD16&spplus; natürliche Killerzellen identifiziert wurden, und in einem signifikant niedrigeren Prozentsatz der Population von NK-Zellen, welche phänotypisch CD16&spplus; CD56bright, jedoch nicht CD3&spplus; T-Zellen oder CD20&spplus; B-Zellen sind, vorhanden ist. Das "einzigartige Epitop" kann auf einer glykosylierten Form des PEN5-Glykoproteinpaars vorhanden sein, wie es üblicherweise auf der Zelloberfläche von CD56dim, CD16&spplus; natürlichen Killerzellen, wie zuvor beschrieben, vorhanden ist, oder das "einzigartige Epitop" kann auf einer nicht-glykosylierten oder deglykosylierten Form des PEN5-Glykoproteinpaars vorhanden sein. Wie er hier verwendet wird, bedeutet der Ausdruck "nicht-glykosyliert" ein PEN5-Molekül, worin sowohl die PEN5&alpha;- als auch die PEN5&beta;-Glykoproteine frei von irgendwelchen konvalent festgelegten Kohlenhydratresten sind. Wie er hier verwendet wird, bedeutet der Ausdruck "deglycosyliert" ein PEN5-Molekül, worin entweder eines oder beide des PEN5&alpha;- Glykoproteins oder des PEN5&beta;-Glykoproteins teilweise glykosyliert ist (sind), jedoch nicht dasselbe volle Kontingent an Kohlenhydratresten enthält (enthalten) wie das PEN5&alpha;- Glykoprotein oder das PEN5&beta;-Glykoprotein, wie es üblicherweise auf der Zelloberfläche von CD56dim, CD16&spplus; natürlichen Killerzellen ausgedrückt ist.
  • Die Antikörper, Fragmente und Derivate der Erfindung sind als Forschungsreagentien verwendbar, um zweifelsfrei natürliche Killerzellen in einer gemischten Population von Zellen zu identifizieren, quantifizieren und/oder zu reinigen und um diese natürlichen Killerzellen daraus zu isolieren. Die Antikörper, Fragmente und Derivate dieser Erfindung können auch therapeutisch verwendbar bzw. nützlich sein, entweder allein oder in Kombination mit einem Komplement oder konjugiert an ein radioaktives Material oder ein Toxin, um Störungen des Immunsystems, wo NK-Zellen als Mediatoren der Krankheit impliziert sind, zu behandeln, insbesondere Transplantat-gegen-Empfänger-Erkrankung und feste Organ- oder allogene Knochenmarktransplant-Abstoßung. Monoklonale Antikörper und Chimären- und vermenschlichte Antikörper sind für eine Detektion bzw. Therapie bevorzugt. Antikörper, Fragmente und Derivate derselben, die ein einzigartiges Epitop auf einer deglykosylierten oder nicht-glykosylierten Form des PEN5-Moleküls erkennen, können in der Diagnose und Behandlung von Immunsystemstörungen nützlich bzw. verwendbar sein, die mit NK-Zellen in Verbindung stehen, die PEN5 exprimieren, das ein aberrantes bzw. abweichendes Glykosylierungsmuster im Vergleich zu PEN5 zeigt, das normalerweise auf NK-Zellen ausgedrückt wird.
  • In der folgenden Beschreibung wird auf verschiedene Methodologien, die dem Fachmann der Immunlogie, Zellbiologie und Molekularbiologie bekannt sind, Bezug genommen.
    • Herstellung und Forschungsverwendungen von Antikörpern
  • Monoklonale Antikörper der Erfindung können unter Verwendung von jeder Technik, die die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zellinien in Kultur zur Verfügung stellt, hergestellt werden. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die ursprünglichen Techniken von Köhler und Milstein, Nature, 265: 495-497 (1975), modifiziert wie in Anderson et al. J. Immunol., 143 : 1899 (1989) beschrieben, und die neuere Hybridom-Technik für menschliche B-Zelle und EBV-Hybridom-Technik, die den Fachleuten gut bekannt ist.
  • Als Teil der Herstellung der monoklonalen Antikörper der Erfindung können verschiedene Wirtstiere, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf Kaninchen, Mäuse, Hamster und Ratten, durch Injektion mit NK-Zellen, die das PEN5-Glykoprotein exprimieren bzw. ausdrücken, immunisiert werden und nach einer ausreichenden Zeit wird das Tier geopfert bzw. getötet und Milz- oder andere Immunzellen werden erhalten. Das bevorzugte, in dem Immunisierungsprotokoll zu verwendende Immunogen ist eine Präparation aus frisch isolierten NK- Zellen, die aus Lymphozyten von peripherem Blut durch Negativauswahl gereinigt wurden. Andere Immunogene, die alternativ verwendet werden könnten, umfassen teilweise gereinigte Zubereitungen des PEN5-Moleküls, des PEN5&alpha;-Glykoproteins oder des PEN5&beta;-Glykoproteins, umfassend die glykosylierten, deglykosylierten oder nicht-glykosylierten Formen davon und Derivate und Fragmente davon. Eine teilweise gereinigte Zubereitung des PEN5-Moleküls kann aus permeabilisierten NK-Zellen nach einer Immunausfällung und SDS-Gelelektrophorese unter Verwendung von 6% Polyacrylamidgel, wie dies nachfolgend beschrieben wird, unter Verwendung von Techniken, die Fachleuten gut bekannt sind, hergestellt werden. Jedoch kann jedes geeignete Verfahren für das teilweise Reinigen des PEN5-Moleküls oder des PEN5&alpha;- oder des PEN5&beta;-Glykoproteins, wie dies oben beschrieben ist, zufriedenstellend angewandt werden und alternative Verfahren zur teilweisen Reinigung werden dem Fachmann auf diesem Gebiet der Technologie offensichtlich sein. Sobald der Kern bzw. die Kerne des Proteins von PEN5&alpha;- und PEN5&beta;-Molekülen geklont wurden, können rekombinant hergestellte Moleküle auch als ein Immunogen verwendet werden. Die Milz- oder anderen Immunzellen, die von dem Tier erhalten wurden, werden durch Verschmelzen der Milzzellen mit einer immortalisierten Zellinie, allgemein in der Anwesenheit eines Fusionsbeschleunigungsreagens, beispielsweise Polyethylenglykol immortalisiert bzw. haltbar gemacht. Die resultierenden Zellen, welche die verschmolzenen Hybridome enthalten, werden dann in einem selektiven Medium, wie HAT-Medium, wachsen gelassen und die überlebenden Zellen werden in einem derartigen Medium unter Verwendung von beschränkenden Verdünnungsbedingungen gezüchtet. Die Zellen werden in einem geeigneten Behälter, z. B. Mikrotitervertiefungen, angezüchtet und die überstehende Lösung wird in bezug auf monoklonale Antikörper, die die gewünschte Spezifität besitzen, untersucht bzw. gescreent.
  • In einer bevorzugten Ausbildung werden die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung, wie in den Beispielen beschrieben, hergestellt.
  • Screening- bzw. Untersuchungs-Verfahren, die verwendet werden können, um Hybridomzellen bzw. Hybridzellen, die Antikörper für ein PEN5-Epitop herstellen, zu screenen bzw. untersuchen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf (1) enzymgebundene Immunadsorbens-Versuche (ELISA), (2) Immunausfällung und (3) fluoreszenzaktivierte Zellsortieranalysen (FACS). Zahlreiche unterschiedliche ELISAs, die verwendet werden können, um auf Anti-PEN5 monoklonale Antikörper zu screenen, können durch Fachleute ins Auge gefaßt werden. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Formate, umfassend gereinigte oder rekombinant hergestellte PEN5- Glykoproteine, die an eine feste Phase festgelegt sind, oder Formate, umfassend die Verwendung von frisch isolierten, gesamten NK-Zellen oder Zellysatmembranpräparaten, die entweder an die feste Phase festgelegt oder an Antikörper, die an die feste Phase festgelegt sind, gebunden sind. Proben von Hybrid- bzw. Hybridom-überstehenden Lösungen würden mit einem dieser zwei Formate umgesetzt, gefolgt durch Inkubation mit beispielsweise Ziegen-Anti-Maus Immunglobulin, komplexiert an ein Enzymsubstrat, welches visuell identifiziert werden kann.
  • Das anfängliche Screening wird vorzugsweise durch Screenen von überstehenden Lösungen von Hybridom durch Flußzytometrie in bezug auf ihre Reaktivität mit NK-Zellen, jedoch nicht mit T-Zellen, B-Zellen oder Monozyten durchgeführt. Eine weitere Charakterisierung der Hybridome in bezug auf jene, die monoklonale Antikörper bilden, welche bevorzugt an NK-Zellen ausgedrückt werden, die phänotypisch für CD16&spplus; CD56dim sind, relativ zu NK-Zellen, die phänotypisch CD16&spplus; CD56bright sind, können durch ein Testen an gereinigten Populationen von Lymphoid- und Nicht-Lymphoidzellen durch indirekte Immunfluoreszenzversuche und Flußzytometrie, wie dies im wesentlichen in den Beispielen hier beschrieben ist, durchgeführt werden. Monoklonale Antikörper, die ein PEN5- Epitop erkennen, das vorzugsweise auf funktionell differenzierten NK-Zellen ausgedrückt bzw. exprimiert ist, werden mit einem Epitop reagieren, das in einem hohen Prozentsatz an NK-Zellen, die phänotypisch CD56dim CD16&spplus; Zellen sind, beispielsweise wenigstens etwa 70-90%, vorzugsweise etwa 80%, von derartigen Zellen und in einem bedeutend niedrigeren Prozentsatz an NK-Zellen vorhanden ist, die phänotypisch CD16&spplus; CD56bright sind (z. B. 10 bis 35%), wobei sie jedoch nicht mit CD3&spplus; T-Zellen oder CD20&spplus; B-Zellen reagieren werden. In bevorzugten Ausbildungen wird der Antikörper auch mit Monozyten, Granulozyten, Plättchen und roten Blutkörperchen nicht reaktiv sein. Monoklonale Antikörper, die mit dem 5H10 Antikörper in Konkurrenzversuchen konkurrieren, die den Fachleuten in der Technik gut bekannt sind, werden wahrscheinlich im wesentlichen dasselbe Epitop wie mAb 5H10 erkennen, während monoklonale Antikörper, die mit mAb 5H10 nicht konkurrieren, jedoch dennoch die Kriterien erfüllen, daß sie einzigartig in bezug auf die CD16&spplus;, CD56dim Subpopulation von NK-Zellen sind, werden wahrscheinlich ein unterschiedliches Epitop an dem PEN5-Glykoproteinpaar erkennen. Beide Klassen von Antikörpern werden als in dem Rahmen der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet.
  • Sobald das gewünschte Hybridom bzw. Hybrid ausgewählt und geklont wurde, kann der resultierende Antikörper auf einem von zwei Hauptwegen hergestellt werden. Der reinste, monoklonale Antikörper wird durch in vitro Kultivierung des gewünschten Hybridoms in einem geeignetem Medium für eine geeignete Zeitdauer, gefolgt durch die Rückgewinnung des gewünschten Antikörpers aus der überstehenden Lösung hergestellt. Die Zeitdauer und das Medium sind bekannt oder können leicht bestimmt werden. Diese in vitro Technik bildet im wesentlichen monospezifischen, monoklonalen Antikörper, der im wesentlichen frei von anderen Spezies von antimenschlichem Immunglobulin ist. Jedoch kann das in vitro Verfahren eine ausreichende Menge oder Konzentration von Antikörper für einige Zwecke nicht herstellen, da die Menge an gebildetem Antikörper nur etwa 50 ug/ml ist.
  • Um eine viel größere Menge an monoklonalem Antikörper herzustellen, kann das gewünschte Hybridom in ein Tier, wie eine Maus, injiziert werden. Vorzugsweise sind die Mäuse syngenisch oder halbsyngenisch zu dem Stamm, von welchem die monoklonalen Antikörper bildenden Hybridome erhalten wurden. Eine Injektion des Hybridoms bewirkt eine Ausbildung von Antikörper produzierenden Tumoren nach einer geeigneten Inkubationszeit, was in einer hohen Konzentration des gewünschten Antikörpers (etwa 5-20 mg/ml) in den Aszites des Wirtstiers resultiert.
  • Antikörpermoleküle können durch bekannte Techniken gereinigt werden, z. B. durch Immunabsorption oder Immunaffinitätschromatografie, chromatografische Verfahren, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie, oder eine Kombination davon.
  • Nach diesen Protokollen kann jeder Fachmann auf diesem Gebiet der Technologie einfach Hybridome isolieren, welche monoklonale Antikörper produzieren, die eine Spezifität für ein einzigartiges Epidop an funktionell differenzierten bzw. unterschiedenen, natürlichen Killerzellen zeigen. Obwohl nur ein einziges Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper (5H10) gegen das menschliche PEN5-Epitop bildet, mittels eines Ausführungsbeispiels exemplarisch dargestellt ist, ist beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung alle monoklonalen Antikörper umfaßt, die die Charakteristika von mAb 5H10, wie hier beschrieben, zeigen.
  • Beispielsweise wurde bestimmt, daß der vorliegende bzw. gegenständliche, monoklonale Antikörper 5H10 zu der Klasse IgM gehört. Jedoch kann ein monoklonaler Antikörper, der die hier beschriebenen Charakteristika zeigt, von der Klasse IgG, Unterklasse IgG&sub1;, IgG&sub2;&alpha;, IgG&sub2;&beta; oder IgG&sub3;, oder von den Klassen IgM, IgA oder jeder anderen bekannten Ig-Klasse stammen. Die Unterschiede zwischen diesen Klassen oder Subklassen werden die Selektivität des Reaktionsmusters des Antikörpers nicht beeinflussen, sondern können die weitere Reaktion des Antikörpers mit anderen Materialien betreffen, wie (beispielsweise) Komplement- oder Anti-Maus-Antikörper. Obwohl der gegenständliche Antikörper spezifisch IgM ist, ist beabsichtigt, daß Antikörper, die die Muster der Reaktivität, die hier dargestellt sind, aufweisen, in der vorliegenden Erfindung enthalten sind, unabhängig von der Immunglobulinklasse oder -unterklasse, zu welcher sie gehören.
  • Darüber hinaus soll, während das spezifische Beispiel des neuen Antikörpers der vorliegenden Erfindung von einer Mäusequelle stammt, dies nicht bedeuten, daß dies eine Beschränkung ist. Der obige Antikörper und jene Antikörper, die die Charakteristika des mAb 5H10 besitzen, unabhängig davon, ob sie von einer Mäusequelle oder einer anderen Säugerquelle, umfassend Menschen, Ratten oder andere Quellen oder Kombinationen davon stammen, sind innerhalb des Rahmens dieser Erfindung, wie dies oben ausgeführt wurde, umfaßt.
  • Die Antikörper können für die Detektion bzw. Freistellung und Auflistung bzw. Enumeration durch indirektes Färben von CD16&spplus;, CD56dim Subpopulation von NK-Zellen bei normalen Individuen oder bei Krankheitszuständen, beispielsweise durch Fluoreszenzmikroskopie, Flußzytometrie, Immunperoxidase oder andere indirekte Methodologien, verwendet werden. "Panning-" bzw. Auffang-Techniken sind ebenfalls möglich. Die Antikörper können auch für eine Reinigung von menschlichen, natürlichen Killerzellen, welche CD16&spplus;, CD56dim sind, verwendet werden.
    • Herstellung von Fragmenten und Derivaten von Antikörpern
  • Ebenfalls in dem Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt sind Antikörper-Fragmente und -Derivate, welche wenigstens den funktionellen Bereich der Antigen-bindenden Domäne eines Anti-PEN5 Antikörpermoleküls umfassen.
  • Antikörper-Fragmente, welche die bindende Domäne bzw. den bindenden Bereich des Moleküls enthalten, können durch bekannte Techniken gebildet bzw. erzeugt werden. Beispielsweise umfassen derartige Fragmente, jedoch sind sie nicht darauf beschränkt: das F(ab')&sub2;-Fragment, welches durch Pepsindigestion des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann; die Fab'-Fragmente, welche durch Reduzieren der Disulfid-Brücken des F(ab')&sub2;-Fragments gebildet werden können, und die Fab-Fragmente, welche durch Behandeln des Antikörpermoleküls mit Papain und einem reduzierenden Agens gebildet werden können. Siehe z. B. National Institutes of Health, 1 Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Ausgabe §§ 2.8, 2.10 (Wiley Interscience, 1991).
  • Antikörper-Fragmente umfassen auch Fv-Fragmente, d. h. Antikörperprodukte, in welchen keine Aminosäureresten mit konstantem Bereich existieren. Derartige Fragmente können, wie beispielsweise in WO 92/04381 oder US-Patent Nr. 4,642,334 beschrieben, hergestellt werden.
  • Wenn Antikörper, die in nicht-menschlichen Subjekten gebildet wurden, therapeutisch bei Menschen verwendet werden, werden sie in variierendem Ausmaß bzw. Grad als fremd erkannt und eine Immunantwort kann in dem Patienten generiert werden. Ein Ansatz bzw. Zugang zum Minimieren oder Eliminieren dieses Problems, welches für eine allgemeine Immunsuppression bevorzugt ist, ist es, Chimären-Antikörper-Derivate herzustellen, d. h. Antikörpermoleküle, welche einen nicht-menschlichen, tierischen, variablen Bereich und einen menschlichen, konstanten Bereich kombinieren. Chimären- Antikörpermoleküle können beispielsweise die Antigen-bindende Domäne von einem Antikörper einer Maus, Ratte oder einer anderen Spezies mit menschlichen, konstanten Bereichen umfassen. Eine Vielzahl von Zugängen zur Herstellung von Chimären-Antikörpern wurde beschrieben und kann verwendet werden, um Chimären-Antikörper, enthaltend den Immunglobulin-variablen-Bereich, welcher ein einzigartiges Epitop auf dem PEN5-Antigen erkennt, zu bilden. Siehe beispielsweise Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851 (1985); Takeda et al., Nature 314: 452 (1985), Cabilly et al., US-Patent Nr. 4,816,567; Boss et al. US-Patent Nr. 4,816,397; Tanaguchi et al., Eur. Patentveröffentlichung EP 171496; Eur. Patentveröffentlichung EP 0173494; Vereinigtes Königreich Patent GB 2177096B. Derartige Chimären produzieren eine weniger markante Immunantwort als Nicht-Chimären-Antikörper.
  • Für menschliche, therapeutische Zwecke können die monoklonalen oder Chimären-Antikörper der Erfindung weiter durch Herstellen von Chimären mit menschlichem konstanten Bereich vermenschlicht werden, in welchen selbst Teile der variablen Bereiche, insbesondere die konservierten oder Netzwerkbereiche der Antigen-bindenden Domäne, menschlichen Ursprungs sind und nur die hypervariablen. Bereiche nichtmenschlichen Ursprungs sind. Derartige veränderte Immunglobulinmoleküle können durch eine aus mehreren Techniken, die in der Technik bekannt sind, hergestellt werden (z. B. Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16 (1982)) und werden vorzugsweise entsprechend den Lehren der PCT-Publikation WO 92/06193 oder EP 0 239 400 hergestellt. Es existiert auch eine Anzahl von Firmen, welche kommerziell Antikörper vermenschlichen, beispielsweise Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Großbritannien.
  • Diese vermenschlichten bzw. humanisierten Antikörper sind für eine Immuntherapie dahingehend bevorzugt, daß sie die Effekte einer Immunantwort minimieren. Dies führt wiederum zu einem Absenken von jeder gleichzeitigen Immunsuppression und zu einer Aufnahme von erhöhter Langzeiteffizienz in beispielsweise chronischen Krankheitssituationen oder Situationen, die wiederholte Antikörper-Behandlungen erfordern.
    • Antikörperkonjugate zur Detektion und Therapie
  • Zusätzlich zu molekularen Antikörper-Fragmenten und -Derivaten können Antikörper-Derivate oder Immunkonjugate, bestehend aus einem Antikörpermolekül oder einem Bindungsbereich desselben, gebunden an einen Marker, wie ein Radioisotop, fluoreszierenden Anhang bzw. Tag (z. B. Fluoreszein- Isothiocanat, Phycoerythrin, Phycoerythrin Cy5 oder Rhodamin), Enzym (z. B. Biotin) oder ein anderes Tracermolekül bzw. Markierungsmolekül, durch Techniken, die in der Technik bekannt sind, hergestellt werden. Alternativ kann das Antikörpermolekül oder Fragment davon an ein therapeutisch verwendbares bzw. nützliches, biologisches oder chemisches Molekül gebunden sein, das auf seine gewünschte Wirkungsstelle mittels der Antikörper-Bindungsspezifität abzielt. Als ein Beispiel einer derartigen Ausbildung kann eine zytotoxische Verbindung an einen Antikörper der Erfindung konjugiert sein, welcher spezifisch für NK-Zellen ist, welche die verursachenden Keime bzw. ursächlichen Agentien für eine Immunstörung sind, beispielsweise Knochenmark-Transplantatabstoßung. Die zytotoxische Verbindung, welche beispielsweise ein Radionukleotid oder ein Toxin, wie Diphterietoxin, in einer konjugierten Form sein kann, wird so auf die implizierten NK-Zellen gerichtet.
    • Immunversuche
  • Die Antikörper der Erfindung und die Fragmente und Derivate davon, enthaltend den Bindungsbereich (z. B. Fab, Fab', F(ab')&sub2;), können in verschiedenen Immungssays bzw. Immunversuchen verwendet werden. Derartige Immunversuche umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf konkurrierende und nicht-konkurrierende Versuchssysteme unter Verwendung von Techniken, wie Radioimmunversuche, ELISA (enzymgebundener Immunsorbensversuch), "Sandwich"-Immunversuche, Präzipitinreaktionen, Geldiffusions-Präzipitinreaktionen, Immundiffusionsversuche, Agglutinierungsversuche, Komplementfestlegungsversuche, immunradiometrische Versuche, Fluoreszenzimmunversuche, Protein-A-Immunversuche und Immunelektrophoreseversuche, um lediglich einige zu nennen.
  • Differenzierte NK-Zellen, insbesondere menschliche NK-Zellen, können in einer biologischen Probe, umfassend eine gemischte Population von Zellen, beispielsweise hämatopoetische- und Lymphoid-Zellen, unter Verwendung der Antikörper, Fragmente oder Derivate detektiert bzw. festgestellt werden. Geeignete, biologische Proben umfassen peripheres Blut, Knochenmarkaspirat und Lymphoidgewebe. Wenn er in einem Versuch, wie beschrieben, verwendet wird, wird der Antikörper typischerweise so markiert, daß seine Bindung mit der relevanten NK-Zellsubpopulation detektiert werden kann. Jeder geeignete Marker, der Fachleuten in der Technik gut bekannt ist, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf fluoreszierende Farbstoffe, radioaktive Isotope, Enzyme, welche eine Reaktion, die detektierbare Produkte bildet, katalysieren, Biotin oder Metallionen, die durch kernmagnetische Resonanz detektierbar sind, kann angewandt werden.
    • Therapeutische Anwendungen von NK-zellspezifischen Antikörpern, Fragmenten und Derivaten
  • Knochenmarktransplanation wird steigend für die Behandlung von Störungen des Immunsystems, aplastischer Anämie und insbesondere hämatopoetischen Malignitäten, wie akute, lymphozytische Leukämie, verwendet. Zahlreiche Jahre haben die Transplantat-gegen-Empfänger-Erkrankung ("GVHD") und ihre zugehörigen Komplikationen ein schwerwiegendes Problem bei der Transplantation von menschlichem Knochenmark dargestellt. Als es offensichtlich wurde, daß T-Zellen, die innerhalb des Knochenmarkinokulums bzw. der Knochenmarkimpfung enthalten sind, Effektoren von GVHD sind, machten zahlreiche Knochenmark-Transplantationsprogramme Gebrauch von der Verwendung von Knochenmarkszellen, die frei von T- Zellen waren. Dieses Verfahren hat in gewisser Weise erfolgreich das Auftreten und die Schwere von GVHD reduziert. Jedoch traten zahlreiche neue Probleme als ein Ergebnis der Entfernung von T-Zellen auf, umfassend ein erhöhtes Auftreten von Knochenmark-Transplantatabstoßung. Weiters bleibt GVHD ein schwerwiegendes Problem bei zahlreichen Empfängern von Knochenmarktransplantat, insbesondere bei nicht von T- Zellen befreiten Transplantaten.
  • Zahlreiche Nachweise haben direkt auf natürliche Killerzellen bei der Transplantatabstoßung und in jüngerer Zeit Transplantat-gegen-Empfänger-Erkrankung hingewiesen. Beispielsweise verringerte eine Behandlung von Rezipienten mit einem Antiserum, das für NK-Zellen spezifisch ist (Lotzova et al., Transplanation, 35: 490 (1983)), einen Allotransplantat-Widerstand und eine Injektion von Rezipienten mit NK-Klonen bewirkte eine Allotransplantat-Abstoßung bei beigen Mäusen mit NK-Zellen-Defizit, welche eine Marktransplantat-Abstoßung nicht manifestieren. Warner et al., Nature 300: 31 (1982). Siehe auch Martin et al., Advances Immunol., 40: 379-431 (1987); Yu et al Amer. Rev. Immunol., 10: 189-213 (1992); und Moretta et al. Immunol. Today, 13: 300-305 (1992).
  • Die wissenschaftliche Literatur legt auch nahe, daß NK-Zellen eine schädliche Rolle in der Transplantat-gegen-Empfänger-Erkrankung ("GVHD") nach festen Organ- oder Gewebetransplantation spielen können. (Ferrara et al. Transplantation, 47: 50-54 (Jänner, 1989); MacDonald und Gartner, Transplantation, 54: 147-151 (Juli, 1992)). Siehe auch US- Patent Nr. 4,772,552.
  • Da die Antikörper der Erfindung verwendet werden können, um auf die funktionell unterschiedlichen Subpopulationen von NK-Zellen spezifisch abzuzielen, kann die Erfindung auch prophylaktisch und therapeutisch bei der Prävention und Behandlung von Transplantatabstoßung bei einer Transplantation eines festen Organs und Knochenmark und bei der Transplantat-gegen-Empfänger-Erkrankung verwendbar sein, indem die Funktion und die Anzahl von zytolytischen Effektor-NK- Zellen in vivo moduliert wird. Obwohl es beabsichtigt ist, daß die anti-NK-zellspezifischen Antikörper und Fragmente und Derivate davon zusätzlich zu Menschen für tierische Subjekte, wie z. B. Haustiere, eine Anwendung aufweisen, sind die therapeutischen Aspekte der Erfindung von größtem Wert bei der Behandlung von Störungen bei Menschen.
  • Beispielsweise bei der Knochenmarktransplantation können die Antikörper, Fragmente und Derivate der Erfindung verwendet werden, um die CD16&spplus; CD56dim zytolytische Effektorpopulation von Zellen von Knochenmarkaspiraten ex vivo vor der Transplantation des Marks in den Markrezipienten zu entfernen. Eine Entfernung dieser natürlichen Killerzellen von dem Knochenmarkaspirat kann durch konventionelle Verfahren durchgeführt werden, wie jene die in der immunologischen T-Zellen-Entfernung verwendet werden. Antikörper, welche die Fähigkeit besitzen bzw. zeigen, NK-Zellen in der Anwesenheit eines Komplements zu lysieren, können in Kombination mit Komplement verwendet werden, um das Knochenmark ex vivo vor einer Transplantation zu behandeln, um die NK- Zellen abzutöten, die ansonsten zu der Etiologie der Transplantat-gegen-Empfänger-Erkrankung bei dem Rezipienten beitragen könnten. Alternativ kann der Anti-PEN5 Antikörper an ein Toxin gebunden sein, wie dies beschrieben ist, um die zytolytischen Effektor-NK-Zellen abzutöten. Die Antikörper, Fragmente oder Derivate der Erfindung könnten auch an den Knochenmarkrezipienten in vivo vor dem Transplantationsverfahren verabreicht werden.
  • Die selektive in vivo Entfernung von NK-Zellen kann sich auch bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wie SLE, welche teilweise durch NK-Zellen mediatisiert sind, als wirksam bzw. nützlich erweisen.
  • Die Antikörper, Fragmente oder Derivate der Erfindung können auch in der Prophylaxe und/oder Behandlung von Transplantatabstoßung eines festen Organs oder Knochenmarkabstoßung, insbesondere bei allogenen Knochenmarktransplantat-Rezipienten, wo eine Entfernung der T-Zellen angewandt wurde, verwendet werden.
  • Wenn sie in vivo prophylaktisch oder therapeutisch verwendet werden, können die NK-spezifischen Antikörper, Fragmente oder Derivate der Erfindung in nicht-modifizierter Form zum Modulieren der Anzahl und Funktion der zytolytischen Effektorpopulation von NK-Zellen verwendbar sein oder sie können an Radionukleotide oder Toxine mittels in der Technik gut bekannter Mittel konjugiert sein und verwendet werden, um die konjugierte Substanz an schädliche NK-Zellen für negative Modulation zu übermitteln bzw. liefern. Nicht-limitierende Beispiele von Radionukleotiden, welche an Antikörper konjugiert werden können und verabreicht werden können, umfassen ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹&sup8;&sup6;Re und &sup9;&sup0;Y. Diese Elemente üben ihren Effekt durch lokales Bestrahlen der Zellen aus, was zu verschiedenen intrazellulären Läsionen bzw. Verletzungen, die Fachleuten der Radiotherapie gut bekannt sind, führt.
  • Zytotoxische Wirkstoffe, die an Antikörper konjugiert sein können und für die in vivo Therapie verabreicht werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Daunorubicin, Doxorubicin, Methotrexat und Mytomycin C. Für eine detailliertere Diskussion dieser Klassen von Wirkstoffen und ihrer Wirkmechanismen siehe Goodman et al., Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis Of Therapeutics, 8. Ausgabe, Pergamon Press (1991).
  • Als ein Beispiel der Konjugation an ein Toxin kann ein Anti-PEN5 monoklonaler Antikörper mit Diphterietoxin mit dem Verfahren von Bumol, Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 529 (1983) kombiniert werden. Kurz gesagt, werden monoklonale Antikörper, die mit einem NK-Zellen spezifischen Epitop reaktionsfähig sind, wie durch Bumol beschrieben, hergestellt. Die Antikörper werden gereinigt und mit Überschuß (6 Mol/Mol) N-Succinimydyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (Pharmacia, Uppsala, Schweden) in PBS kombiniert. Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur wird die Lösung gegen PBS dialysiert. Die modifizierten Antikörper werden mit einem geeigneten Toxin, wie Diphterietoxin-A-Kette, konjugiert. Andere Toxine, wie Ricin A, können auch verwendet werden. Die Diphterietoxin-A-Kette wird isoliert, wie dies in Bumol, siehe oben, detailliert ist. Die modifizierten Antikörper werden mit Überschuß (3 Mol/Mol) reduzierter Diphterietoxin-A-Kette (10% des Gesamtvolumens) vermischt, 36 h bei 4 ºC reagieren gelassen und mit Chromatografie auf Sephadex G-2000 konzentriert. Das Produkt wird auf eine Sephadex G200 Säule (1,0 · 100 cm) aufgebracht, equilibrieren gelassen und mit PBS eluiert.
  • Unter Verwendung dieser und anderer ähnlicher Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, kann die Effektorpopulation von natürlichen Killerzellen selektiv bei dem Transplantatrezipienten eliminiert werden.
  • Die Verabreichungsroute für die in vivo therapeutischen Modalitäten können intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse oder subkutane Injektion, intranasale Wege und Formen mit langsamer Freisetzung umfassen, wie jene, die in transplantierbaren Formen, auf Pflastern oder in anderen kolloidalen Formen verabreicht werden. In einer Ausbildung können die Antikörper in Liposomen verkapselt sein.
  • Die wirksame Dosis des therapeutischen Reagens wird eine Funktion des speziell angewendeten Reagens, der Anwesenheit und Art von konjugiertem, therapeutischem Reagens, des Patienten und seines oder ihres klinischen Zustands sein. Effiziente Dosen der Antikörper, Fragmente oder Derivate der Erfindung zur Verwendung bei der Prävention, Unterdrückung oder Behandlung einer immunbezogenen Erkrankung liegen in dem Bereich von etwa 1 ng bis 100 mg/kg Körpergewicht. Ein bevorzugter Dosierungsbereich liegt zwischen etwa 10 ng und 10 mg/kg und ein noch bevorzugterer Dosierungsbereich ist zwischen 100 ng und 1 mg/kg.
  • Verschiedene pharmakologische Zusammensetzungen können verwendet werden, um die Antikörper, oder Fragmente oder Derivate davon gemäß der Erfindung zu verabreichen. Jedes geeignete pharmazeutische Agens mit wünschenswerten Löslichkeitscharakteristika und chemischen Eigenschaften kann verwendet werden, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, wo dies geeignet bzw. erforderlich ist, Kochsalz- oder Dextroselösungen. Das Reagens selbst muß geeignet formuliert sein, beispielsweise als ein humanisierter oder Chimären- Antikörper, kombiniert mit verschiedenen Puffern, Zuckern oder Stabilisierungsverbindungen, die die Stabilität oder die Halbwertszeit des Antikörpers erhöhen. Um die Halbwertszeit auszudehnen, kann das Reagens zuerst modifiziert werden, um die Menge an daran komplexiertem Kohlenhydrat anzuheben bzw. abzusenken, oder alternativ kann es mit einem Reagens, wie Polyethylenglykol, komplexiert werden. Schließlich sind pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend das therapeutische Reagens in den geeigneten Puffern, Salze und pH-Werte erforderlich.
  • Therapeutische Bausätze bzw. Vorrichtungen können die therapeutischen Zusammensetzungen der Erfindung in einem oder mehreren Behältern umfassen.
    • Das Glykoproteinpaar PEN5&alpha;/PEN5&beta;
  • Die Erfindung stellt auch teilweise gereinigte Präparate des NK-Zellen-spezifischen Moleküls, das PEN5&alpha;/PEN5&beta; genannt wird, zur Verfügung, welches vorzugsweise auf der Subpopulation von NK-Zellen, die zuvor als CD16&spplus;, CD56dim NK-Zellen charakterisiert wurden, ausgedrückt bzw. exprimiert wird. Das Molekül besteht im wesentlichen aus zwei membrangebundenen Glykoproteinen.
  • Wie dies hier verwendet wird, bedeutet die Verwendung des Ausdrucks "teilweise gereinigte Zubereitung" in bezug auf das PEN5 das PEN5-Molekül, bestehend im wesentlichen aus dem PEN5&alpha; und PEN5&beta; Glykoproteinpaar, wie dies hier beschrieben wurde, welches aus permeabilisierten NK-Zellen, gefolgt durch Immunausfällung und SDS-Gelelektrophorese unter Verwendung von 6% Polyacrylamidgel, wie dies nachfolgend beschrieben wird, gereinigt wurde. Nachdem die Glykoproteine auf einem Gel fraktioniert wurden, können sie rückgewonnen werden und in Übereinstimmung mit bekannten und eingeführten Techniken renaturiert werden.
  • Wie es von einem Marker mit funktioneller Differenzierung erwartet wird, wird die Expression des PEN5-Epitops durch Stimuli, welche eine Proliferation bzw. Vermehrung von NK- Zellen induzieren, nach unten moduliert und ist weitgehend abwesend von den leukämischen NK-Zellen von Patienten mit granulärer, Lymphozyten-proliferativer Störung.
  • Immunausfällungen von frisch isolierten, menschlichen NK- Zellen-Detergenslysaten mit mAb 5H10 zeigten, daß das Molekül im wesentlichen aus zwei unterschiedlichen Glykoproteinen besteht, und zeigte auch, daß das mittlere Molekulargewicht der größeren Spezies PEN5&alpha; 227 ±4 kDa (n = 12) ist. Der Molekulargewichtsbereich der polydispergierten PEN5&alpha;-Spezies war 210 ± 3 kDA bis 245 ±5 kDa. Das mittlere Molekulargewicht der kleineren Spezies PEN5&beta; war 140 ±3 kDa mit einem Bereich von 123 ± 3 kDa bis 170 ±4 kDa. Die Migration sowohl von PEN5&alpha; als auch PEN5&beta; als polydispergierte Banden legt nahe, daß beide Spezies hoch glykosyliert sind.
  • Eine enzymatische Deglykosylierung deutet an, daß sowohl PEN5&alpha; als auch PEN5&beta; zu 80 bis 90 Gew.-% aus Kohlenhydraten bestehen. Dieses Ergebnis erhöhte die Möglichkeit, daß diese Proteine entweder Proteoglykane oder Muzin-artige Glykoproteine sind.
  • Proteoglykane sind Glykoproteine mit hohem Molekulargewicht, in welchen spezifische Glykosaminoglykane an Proteine über Gal-Xylose-Ser-Bindungen [Bhavanandan, Glycobiology, (1991)] oder in dem Fall von Keratansulfatketten terminale Galactosaminbindungen an Serin oder Threonin gebunden sind. Die Studien, die in den unten folgenden Beispielen beschrieben sind, zeigen, daß PEN5-Moleküle frei von Xylose-gebundenen Kohlenhydraten sind. Jedoch sind die PEN5 mAbs mit sulfatierten Polylactosamin-Kohlenhydraten, die an Keratansulfat-Glykosaminoglykanen vorhanden sind, reaktiv, was die Möglichkeit erhöhte, daß PEN5&alpha;- und/oder PEN5&beta;-Glykoproteine Zelloberflächen-assoziierte Keratansulfatproteoglykane sind.
  • Zwei Arten von Keratansulfatproteoglykanen wurden beschrieben: Knorpel-artige Keratansulfatproteoglykane sind O-gebundene bzw. -verknüpfte Glykoproteine, wohingegen Hornhaut-artige Keratansulfatproteoglykane N-gebundene bzw. - verknüpfte Glykoproteine sind. Da PEN5&alpha; ein N-gebundenes Glykoprotein ist, ist es möglich, daß PEN5&alpha; ein Hornhaut- artiges Keratansulfatproteoglykan unüblicher Zelloberfläche ist. Analogerweise ist PEN5&beta; ein O-gebundenes Glykoprotein, das gegenüber Keratanasebehandlung empfindlich ist, und kann ein Knorpel-artiges Keratansulfatproteoglykan sein. Die Unfähigkeit von sechs unterschiedlichen Keratansulfat mAbs, sich an NK-Zellen zu binden, gekoppelt mit dem Fehlen einer Detektion von S³&sup5; schwefelmarkiertem Material in 5H10 (Anti-PEN5) Immunprezipitaten, die aus mit S³&sup5; Schwefel metabolisch markierten NK-Zellen hergestellt wurden, zeigt jedoch an, daß die PEN5-Glykoproteine keine Keratansulfatproteoglykane sind.
  • Alternativ wurde berichtet, daß Muzin-artige Glykoproteine, die durch kultivierte Hamster-Trachea-Epithelzellen sekretiert wurden, gegenüber Keratanase-I-Behandlung empfindlich sind und Polylactosamin-Kohlenhydrate enthalten [Wu, Biochem. J., 277: 713 (1991)]. Muzin-artige Glykoproteine sind hoch glykosylierte Proteine, enthaltend einen Hauptteil von O-gebundenen Oligosacchariden und sind mit der Zellmembran in einer Anzahl von Zellarten assoziiert [Carraway, Glycobiology 1: 131 (1991); Strous, Rev. Biochem. Mol. Bio. 27: 57 (1992); Devine, 35 (1992)]. Eine Klassifikation von PEN5&beta; als ein NK-Zellen-spezifisches Membran-gebundenes, Muzinartiges Glykoprotein ist mit unseren Daten am übereinstimmendsten. Im Gegensatz dazu ist der hohe Gehalt an N-gebundenen Kohlenhydraten in PEN5&alpha; nicht mit seiner Klassifikation als ein Muzin-artiges Glykoprotein übereinstimmend. Daher scheint der PEN5&alpha;/PEN5&beta; Komplex analog zu dem ASGP- 1 : ASGP-2 Komplex zu sein, welcher von aszitischen, mamären Adenokarzinomzellen abgeleitet ist [Sherblom, J. Biol. Chem., 225: 12051 (1980)], in welchen nur eine Komponente (ASGP-1) des Komplexes ein Muzin-artiges Glykoprotein ist. Das entwicklungsmäßig regulierte PEN5&beta; Muzin-artige Glykoprotein kann ähnlich wie andere Zelloberflächen-Muzine zu einer Zytoprotektion während einer Lymphozyten-mediatisierten Zytolyse beitragen.
  • Die biochemischen Merkmale der PEN5-Moleküle zeigen den Weg für zukünftige Forschung auf. Zuerst sind Kohlenhydrate Hauptmediatoren von Zell-Zell-Wechselwirkungen [Jessel, Annu. Rev. NeuroSci., 13: 227 (1990)]. Insbesondere von Liganden für E- und P-Selektine wurde gezeigt, daß sie entweder Sialyl-CD15 oder CD57 Polylactosamin-Epitope enthalten [Philips, Science, 250: 1130 (1990); Larsen, Cell, 63: 467 (1990); Needham, PNAS, 90: 927 (1993)], und GlyCAM-1, ein Membran-gebundenes, die an Muzin-Glykoprotein, ist der Ligand für L-Selektin [Lasky, 1992, #1853]. Die NK-Zellen- Oberflächenexpression des sulfatierten Polylactosamin PEN5- Epitops ebenso wie die Muzin-ähnlichen, biochemischen Charakteristika von PEN5&beta; erhöhen die Möglichkeit, daß PEN5- Glykoproteine zu der NK-Zellen-spezifischen Adhäsion beitragen. Zweitens ähneln die PEN5-Glykoproteine in ihrer Proteaseresistenz bzw. -widerstandsfähigkeit ebenso wie in ihrer ausgedehnten, stabartigen Struktur Epithelzellen-Muzinen. Die Muzin-artigen Glykoproteine spielen eine Schutzrolle auf der Epithelzellen-Oberfläche und es wurde gezeigt, daß sie Zellen vor einem Angriff durch zytotoxische Lymphozyten schützen. Die PEN5-Glykoproteine können daher NK-Zellen vor ihrer eigenen zytolytischen Maschinerie schützen. Die selektive Expression von PEN5-Proteinen an den terminal unterschiedenen Subsätzen von NK-Zellen würde mit ihrer Akquisition von vollkommen kompetenten, zytotoxischen Funktionen übereinstimmen. Von exogenen Muzinen wurde gezeigt, daß sie eine Abtötung von NK-Zellen inhibieren, was ihre potentielle Involvierung in dem Widerstand gegenüber zytolytischen Funktionen von NK-Zellen unterstützt [Ogata, Cancer Res., 52: 4741 (1992)].
  • Das PEN5-Antigen kann bei der Herstellung und/oder Reinigung der Antikörper der Erfindung verwendet werden und sollte auch bei dem Identifizieren des natürlichen Gegenrezeptors für das PEN5-Antigen an Zielzellen verwendbar sein. Aminosäuresequenzinformation, die aus dem PEN5-Glykoproteinpaar erhalten wurde, kann auch verwendet werden, um die PEN5&alpha;- und PEN5&beta;-Glykoproteinketten in Übereinstimmung mit eingeführten Techniken zu klonen.
    • Hinterlegungsinformation
  • Proben des Hybridoms (hier als 5H10 bezeichnet), das Anti- NK-Zellen-spezifische Maus-monoklonales mAb 5H10 sekretiert, wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, am 19. August 1993 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt und erhielten die ATCC-Zugangsnr. HB11441. Ohne zuzustimmen, daß der Zugang zu der Hybridzellinie notwendig ist, um die beanspruchte Erfindung auszuführen, wird zugestimmt, daß nach Zulassung und Erteilung eines Patents auf diese Erfindung alle Beschränkungen betreffend die Verfügbarkeit der Kulturhinterlegung, die hier bezeichnet ist, zurückgezogen werden und die bezeichnete Kultur über die effektive Laufdauer des erteilten Patents für 30 Jahre vom Tag der Hinterlegung oder für 5 Jahre nach dem letzten Antrag auf Hinterlegung nach Ausgabe des Patents, was immer länger ist, aufrecht erhalten werden wird.
  • Die Erfindung wird nun vollständiger aus den folgenden Beispielen verstanden werden.
    • BEISPIELE Abkürzungen.
  • Die folgenden Abkürzungen werden in den Beispielen, die unten wiedergegeben sind, verwendet: BCK: Rinder-Hornhaut-Keratansulfat; BNC: Rinder-Nasalknorpelaggrecan; CD1: embryonisches Hühner-Knorpelaggrecan; LCM: Leukozyten-konditioniertes Medium; GLPD: granuläre Lymphozyten-proliferative Störung; RC: Kletterraten-Chondrosarkomaggrecan; SHK: Hai- Schädelknorpelaggrecan.
    • Materialien und Methoden.
  • Die folgenden Methoden und Materialien beziehen sich auf Beispiele 1-5.
    • Reagentien.
  • Peptid-N-glykosidase (PNgase F) und Endo-a-N-acetylgalactosaminidase (O-Glykanase) wurden in dem Puffer, der durch den Hersteller (Oxford Glycosystems) zur Verfügung gestellt wurde, verwendet. Keratanase I (Keratansulfat-1,4 b-D-galactanohydrolase; ICN Biomedicals, (Costa Mesa, CA), Keratanase II, welche übersulfatierte Formen von (Keratansulfat-1,4 b-D-galactanohydrolase angreift; ICN Biomedicals (Costa Mesa, CA), Keratanase II, welche übersulfatierte Formen von Keratansulfat, das gegenüber Keratanase I resistent ist, angreift (Seikagaku America, Rockville, MD) und Neuraminidase (Calbiochem) wurden entweder in PBS, PNgase F oder O-Glykanasepuffern verwendet. Chondroitinase ABC (ICN Biomedicals) wurde in Natriumacetat, 0,05 M, pH 7,4, verwendet. Rinderhornhaut-keratansulfat (BC) ebenso wie andere Glykosaminoglykane und Kohlenhydrate wurden von Sigma (St. Louis, MO) gekauft, Trypsin, Chymotrypsin und Pronase E wurden ebenfalls von Sigma erhalten. FITC- und PE-konjugiertes Avidin wurden von Becton-Dickinson (Paramus, NJ) erworben.
    • Antikörper.
  • Mäuse-monoklonale Antikörper (mAb), die mit CD2 (T11.1, IgG1), CD3 (RW24B6, IgG2b), CD56 (N901, IgG1), CD20 (B1, IgG1) reaktiv sind, wurden von Coulter Corp. erhalten, ebenso wie Isotyp-angepaßte Vergleichs-Maus mAb (IgG und IgM). Radioiodinierung von PEN5 mAb wurde unter Verwendung von Iodkügelchen (Pierce) wie zuvor beschrieben durchgeführt [Vivier, J. Immunol. 132: 1410 (1991)]. Die Charaktierisierung des Anti-CD16 mAb (3G8, IgG1) und des Anti-Keratansulfat mAb 5D4 (IgM) wurde anderswo berichtet [Perussia, J. Immunol, 134: 1410 (1984), Caterson, J. Biol. Chem., 258: 8848 (1983)]. Der folgende mAb erkennt unterschiedliche Epitope an den meisten Keratansulfatketten: 1B4 (IgG), 2D3 (IgG), 3D2 (IgM), 4D1 (IgM) und 8C2 [Sorrell, J. Invest. Dermatol. 95: 347 (1990)]. FITC-markierter Ziegen-Antimaus- Ig(G+M) wurde von Tago gekauft.
    • Zellen.
  • Alle Zellen wurden in Finalmedium kultiviert, bestehend aus RPMI 1640 (Whittaker Bioproducts, (Walkersville, MD), das mit 10% fötalem Kalbsserum, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM Glutamin und 50 mg/ml Gentamicin, alle von Gibco (Grand Island, N. Y.) erhalten, ergänzt wurde. Gereinigte NK-Zellen und T-Zellen wurden aus einkernigen Zellen aus peripherem Blut (PBMC), die von gesunden Freiwilligen durch Negativauswahl unter Verwendung immunmagnetischer Tröpfchenbefreiung gewonnen wurden, erhalten [Vivier, Int. Immunol. 4: 1313-1323 (1992)]. In einigen Experimenten wurden NK-Zellen und NK-Zellen-Subsätze (CD56bright und CD56dim) durch flußzytometrisches Sortieren auf einem Epics V Flußzytometer (Coulter Electronics) nach Färben mit Anti-CD56 mAb weiter gereinigt. Eine Aktivierung von NK-Zellen wurde unter Verwendung von Ionomycin (1 uM) und 20% Lymphozytenkonditioniertem Medium (LCM), wie dies zuvor beschrieben wurde, durchgeführt [Robertson, J. Immunol., 150: 1705 (1993)]. PBMC von drei Patienten mit einer CD3 : TCR&supmin;, CD16&spplus;, CD56&spplus; granulären, Lymphozyten-proliferativen Störung (GLPD) [Oshimi, Leukemia, 2: 617 (1988)] wurde durch Ficoll-Hypaque-Gradientzentrifugierung isoliert.
    • Immunausfällungen.
  • Zellen wurden in PBS resuspendiert und einer Radioiodierung unter Verwendung von ¹²&sup5;I durch das Lactoperoxidaseverfahren unterworfen [Vivier, 1991 #1031]. Nach drei Waschungen in PBS wurden die Zellen in NP-40-Lysispuffer (1% NP-40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl, pH 8,0, 1 mM PMSF, 10 ug/ml Leupeptin, 10 ug/ml Aprotinin, 10 ug/ml AEBSF) für 15 min auf Eis solubilisiert. Nach Entfernung von unlöslichem Material durch Zentrifugieren bei 12000 U/min für 15 min wurden radioiodierte Lysate in 1 ml Lysispuffer verdünnt und dreimal mit 3 ul Affinitäts-gereinigtem Kaninchen-Anti-Maus IgM oder IgG (RAM, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) und 50 ml einer 50%-igen Lösung von Protein-A-Sepharosekügelchen (Parmacia, Milwaukee, WI) vorgereinigt. Die Immunausfällungen wurden unter Verwendung von 3 ml des angegebenen mAb, 3 ul RAM und 50 ul Protein-A- Sepharosekügelchen bei 50% durchgeführt. Sepharose-gebundene Immunkomplexe wurden viermal in Lysispuffer gewaschen und entweder direkt in dem Probenpuffer (2% SDS, 10% Glycerin, 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8, 0,02% Bromphenolblau) vor einer elektrophoretischen Trennung oder in Elutionspuffer (0,15 M NH&sub4;OH, pH 10,5) vor Deglykosylierungsexperimenten eluiert.
    • Deglykosylierung von radioiodiertem PEN5.
  • Radioiodierte PEN5-Proben, die aus 5H10-beschichteten Sepharosekügelchen eluiert wurden, wurden unter Vakuum getrocknet und in geeigneten Deglykosylierungs-Enzympuffern resuspendiert. Die folgenden Enzyme wurden alleine oder in Kombination verwendet: PNgase F (310 U/ml), O-Glykanase (0,06 U/ml), Keratanase I (0,25 U/ml) und Neuraminidase (0,2 U/ml).
    • ELISA für Aggrecan-artige Proteoglykane.
  • Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit 10 ug/ml Lösungen der angegebenen, Aggrecan-artigen Proteoglykane über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nach Waschen wurden die Vertiefungen mit 0,1 M Tris, pH 7,6, enthaltend 1% BSA, oder mit den angegebenen Enzymen in diesem Puffer inkubiert. Nach einer enzymatischen Digestion wurde ein Standard-ELISA unter Verwendung von einer 1/1000 Verdünnung von 5H10 (Anti- PEN5) und 5D4 (Anti-Keratansulfat) und einer 1/500 Verdünnung von Anti-Maus Ig(G+M), konjugiert mit alkalischer Phosphatase, durchgeführt. Die Farbe wurde unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphatsubstrat in 0,86 M Diethanolamin, pH 9,8, entwickelt. Alle Absorptionswerte sind das Mittel von 4 Vertiefungen (SD < 10%) und wurden in bezug auf nicht-spezifische Bindung des zweiten Antikörpers korrigiert.
    • Transmissionselektronen-Mikroskopie.
  • NK-Zellen von peripherem Blut wurden zuerst unter Verwendung von 5H10 (Anti-PEN5) und kolloidalem, goldmarkiertem Ziegen-Anti-Maus IgM (Amersham) gefärbt. Nach Fixierung unter Verwendung von % Glutaraldehyd wurden die gefärbten Zellen durch Transmissionselektronen-Mikroskopie überprüft.
    • Beispiel 1 Herstellung und Charakterisierung von Anti-PEN5 Antikörper
  • Um neue Zelloberflächenstrukturen, die selektiv auf NK-zellen ausgedrückt werden, zu identifizieren, wurde eine Platte von Maus mAb (Anti-PEN mAb) gebildet, welche NK-Zellen, jedoch nicht T-Zellen erkannte. Diese Antikörper wurden durch Immunisieren von BALB/c-Mäusen mit Digitonin-permeabilisierten NK-Zellen von peripherem Blut, wie zuvor in [Anderson, J. Immunol. 143: 1889 (1989)] beschrieben, hergestellt. Kurz gesagt, wurden mononukleäre Zellen aus Leukophereseresten (erhalten von normalen Blutdonoren bei der Dana-Farber Cancer Institute Blood Bank) durch Zentrifugieren über Ficoll isoliert. Diese Zellen wurden in Kunststoffflaschen in RPMI-Medium, enthaltend 10% fötales Kalbsserum für 6 bis 12 h kultiviert, um das Anhaften von Monozyten zu ermöglichen. Nicht-anhaftende Zellen wurden mit monoklonalen Antikörpern, die mit CD5 (24T6G12, IgG2A), CD3 (RW24B6, IgG1), CD20 (B1H299, IGG2A), CD24 (MY4322A-1, IgG2B) reaktiv sind, bei optimalen Konzentrationen für 30 min inkubiert und dann extensiv gewaschen. Nach dem Zusatz von magnetischen Kügelchen, die an Ziegen- und Anti-Maus Ig gekoppelt sind (Advanced Magnetics, Inc., Cambridge, MA), wurden diese Populationen von T-Zellen, B-Zellen, Monozyten durch negative Selektion unter Verwendung eines Magneten befreit. Die verbleibenden Zellen, welche an NK-Zellen angereichert waren, waren phänotypisch weniger als 5% CD3&spplus;, 75-95% CD56&spplus; und 65-80% CD16&spplus;, wie dies durch Flußzytometrie unter Verwendung eines Epics-Profils (Coulter Electronics, Hialeah, FL) bestimmt wurde. Diese Zellen wurden dann mit Digitonin, wie in Anderson, J. Immunol. 143: 1889 (1989), beschrieben, permeabilisiert. Permeabilisierte NK-Zellen (50 · 10&sup6; Zellen pro ml PBS) wurden in eine fünf Wochen alte Balb/c-Maus in Intervallen von drei Wochen für insgesamt vier Immunisierungen injiziert. Drei Tage nach der letzten Immunisierung wurde immunisierte Maus getötet und Splenozyten wurden unter Verwendung von Standardverfahren präpariert. Immunsplenozyten wurden an die NS1-Hybridom-Zellinie in einem Verhältnis von 1 : 1 unter Verwendung von Polyethylenglykol, wie in Anderson, J. Immunol, 143: 1889 (1989), beschrieben, verschmolzen. Nach der Fusion wurden die Zellen bei einer begrenzenden Verdünnung in einer Platte mit 96-Vertiefungen in Anwesenheit von RPMI-Medium, enthaltend 10% fötales Kalbsserum und HAT-Selektionsmedium, kultiviert. Individuelle, überstehende Lösungen wurden in bezug auf ihre Reaktivität mit permeabilisierten und nicht-permeabilisierten NK-Zellen, T-Zellen, B- Zellen, Monozyten untersucht bzw. reihenuntersucht. Monoklonaler Antikörper 5H10 (Anti-PEN5) wurde als ein Antikörper gewählt, welcher spezifisch mit NK-Zellen von peripherem Blut reagierte.
  • Spezifischer wurde das Reaktivitäts- bzw. Reaktionsmuster von 5H10 zuerst durch Testen von gereinigten Lymphozyten von peripherem Blut bestimmt, die von gesunden Freiwilligen unter Verwendung eines Epics V Flußzytometers (Coulter Electronics, Hialeah, Florida) erhalten wurden. Lymphozyten von peripherem Blut (PBLs), die, wie in Methoden und Materialen beschrieben, gereinigt wurden, wurden durch 2-Farb- Flußzytometrie unter Verwendung von Rhodamin-konjugiertem Anti-CD56 mAb, Rhodamin-konjugiertem Anti-CD3 mAb, Rhodamin-konjugiertem Anti-CD20 mAb, FITC-konjugiertem Anti-CD16 mAb oder biotinyliertem Anti-PEN5 mAb in Übereinstimmung mit gut eingeführten Techniken gefärbt. Die Bindung von biotinyliertem Anti-PEN5 mAb wurde unter Verwendung von APC-konjugiertem Avidin entdeckt bzw. nachgewiesen.
  • Die Ergebnisse der Zweifarb-Flußzytometrie sind in Fig. 1 gezeigt, in welcher die Ziffern in jedem Quadranten die Prozent an positiv gefärbten Zellen angeben.
  • Wie in Fig. 1 gezeigt, zeigte die Analyse von PBLs ein einzigartiges Epitop, PEN5, das an dem Hauptteil bzw. der Mehrzahl von CD56&spplus; (Fig. 1, obere, linke Tafel) und CD16&spplus; (Fig. 1, obere, rechte Tafel) PBLs ausgedrückt wird. Im Gegensatz dazu wurde PEN5 nicht signifikant an CD3&spplus; T-Zellen (Fig. 1, untere, linke Tafel) oder an CD20&spplus; B-Zellen (Fig. 1, untere, rechte Tafel) ausgedrückt.
  • Um die Zelloberflächenexpression von aktivierten T-Zellen und aktivierten B-Zellen zu testen, wurden T-Zellen von peripherem Blut, die, wie beschrieben, isoliert wurden, mit optimalen, mitogenischen Konzentrationen von PHA und Con A aktiviert. Milz-B-Zellen wurden mit optimalen Konzentrationen von Staphylococcus aureas Cowan-Stamm I in Übereinstimmung mit Standard-Laboratoriumsprotokollen aktiviert. Immunfluoreszenzfärben wurde 2, 4 und 6 Tage nach der Aktivierung durchgeführt. Weder die T-Zellen-Aktivierung, die durch mitogenische Konzentrationen von PHA oder Con A (in der Anwesenheit oder Abwesenheit von PMA) induziert wurde, noch die B-Zellen-Aktivierung, die durch Staphylococcus aureus Cowan-Stamm I induziert wurde, induzierten für 1 bis 6 Tage die Zelloberflächenexpression des PEN5-Epitops (siehe Tabelle 1 unten). In analoger Weise drückten die allogenischen T-Zellklone (CD3&spplus;CD4&spplus; oder CD3&spplus;CD8&spplus;) das PEN5- Epitop nicht aus (siehe Tabelle 2).
  • Eine Zelloberflächenexpression des Antigens, das durch den Antikörper 5H10 auf hämatopoetischen Zellen erkannt wurde, wurde auch durch indirekte Immunfluoreszenz und Flußzytometrie in Übereinstimmung mit eingeführten Protokollen nachgewiesen. Wie dies in Tabelle 1 unten zusammengefaßt ist, versagte ein Zelloberflächenfärben von Monozyten, Granulozyten, Plättchen und Erythrozyten auch, um das PEN5-Epitop zutage zu bringen, was bestätigt, daß PEN5 ein auf NK- Zellen beschränktes Molekül ist.
    • Tabelle 1. Zelloberflächenexpression von PEN5 auf hämatopoetischen Zellen. Zellart Relative Expression*
  • T-Zellen von peripherem Blut -
  • aktivierte T-Zellen -
  • Thymozyten -
  • NK-Zellen von peripherem Blut ++
  • NK-Zellinien: YT. N17 -
  • 3.3 ±
  • NKL -
  • B-Zellen von peripherem Blut -
  • Milz-B-Zellen -
  • aktivierte B-Zellen$ -
  • Monozyten -
  • Granulozyten -
  • Plättchen -
  • rote Blutkörperchen -
  • * Die Zelloberflächenexpression von 5H10 wurde durch indirekte Immunfluoreszenz und Flußzytometrie ausgewertet bzw. untersucht; -: < 5% positiv gefärbte Zellen; ±: zwischen 5 und 20% positiv gefärbte Zellen; ++: > 60% positiv gefärbte Zellen.
  • T-Zellen von peripherem Blut wurden mit optimalen, mitogenischen Konzentrationen von PHA und CON A aktiviert und Immunfluoreszenzfärben wurde an den Tagen 2, 4 und 6 nach der Aktivierung durchgeführt.
  • $ Milz-B-Zellen wurden mit optimalen, mitogenischen Konzentrationen von Staphylococcus aureus Cowan-Stamm I aktiviert und Immunfluoreszenzfärben wurde an den Tagen 2, 4 und 6 nach der Aktivierung durchgeführt. Tabelle 2. Abwesenheit von Oberflächenexpression von PEN5 auf zytotoxischen T-Zellklonen
  • * Der Zelloberflächen-Phänotyp der angegebenen T-Zellklone wurde durch Immunfluoreszenz und Flußzytometrie durchgeführt. -: 5% positiv gefärbte Zellen; +: > 60% positiv gefärbte Zellen.
  • Um genauer die Expression von PEN5 auf NK-Zellen zu analysieren, wurde eine flußzytometrische Analyse von PEN5-Expression auf frisch isolierten NK-Zellen von peripherem Blut durchgeführt, die durch Negativauswahl unter Verwendung von Befreiung bzw. Verarmung mit immunmagnetischer Kugel gereinigt wurden (siehe Materialien und Methoden). PEN5 wurde klar bei 71,7 ±3,5% (Mittelwert ± SEM, n = 16) dieser NK-Zellzubereitungen ausgedrückt, deren mittlerer Phänotyp 75,6 ±3,3% CD56&spplus;, 4,2 ±4,0% CD16&spplus; und 8,3 ±3,5% CD3&spplus; war.
  • Die phänotypische Heterogenität der NK-Zellen von peripherem Blut erforderte einen sorgfältigeren Vergleich der relativen Expression von PEN5 und CD56. Der zweifarb-flußzytometrische Vergleich, der in Fig. 1 gezeigt ist, legte nahe, daß PEN5 vorzugsweise auf der CD56dim Population ausgedrückt wird. Dies wurde durch Vergleich der Expression von PEN5 auf sortierten Populationen von CD56dim- und CD56bright NK-Zellen, wie dies in Fig. 2 gezeigt ist, bestätigt.
  • Kurz gesagt, wurden gereinigte NK-Zellen in CD56dim und CD56bright NK-Zellsubsätze unter Verwendung von Rhodamin-konjugiertem Anti-CD56 mAb und Flußzytometrie sortiert. Nicht sortierte NK-Zellen, CD56dim und CD56bright NK-Zellen wurden weiters in bezug auf die Expression von 5H10 unter Verwendung von biotinyliertem Anti-PEN5 mAb und FITC-konjugiertem Avidin analysiert. Vergleiche bzw. Kontrollen wurden unter Verwendung von Maus-Isotyp abgeglichenem Vergleichs-IgM mAb durchgeführt. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 2 dargestellt, in welcher die Ziffern in jedem Histogramm den Prozentsatz an positiv gefärbten Zellen anzeigen. Wie dies in Fig. 2 gezeigt ist, wurde PEN5 in einer hohen Dichte auf 85,9 ±2, 2% von CD56dim NK-Zellen (n = 4) und in einer niedrigen Dichte auf 31,1 ±5,3% von CD56bright NK- Zellen ausgedrückt. Diese Ergebnisse zeigen bzw. deuten an, daß die hochdichte Zelloberflächenexpression des PEN5-Epitops auf die funktionell differenzierten CD56dim NK-Zellen beschränkt ist. Diese Ergebnisse zeigen auch an, daß die Zelloberflächenexpression von PEN5 zwei unterschiedliche Subsätze von NK-Zellen, PEN5&spplus; und PEN5dim/-, definieren, welche mit den CD56CD56dim und CD56bright NK-Zellsubsätzen überlappen.
    • Beispiel 2 PEN5-Expression wird durch NK-Zellaktivierung hinunterreguliert.
  • CD56dim und CD56bright NK-Zellen unterscheiden sich stark in ihrer Antwort auf proliferative Stimuli. Obwohl CD56dim NK- Zellen nicht in Antwort auf entweder IL-2 oder die Kombination von Ionomycin und PMA proliferieren, proliferieren CD56bright NK-Zellen in Antwort auf jeden Stimulus. Es wurde der Vorteil aus der kürzlich gemachten Beobachtung gezogen, daß CD56dim NK-Zellen veranlaßt werden können, um in Antwort auf eine Kombination von LCM und Ionomycin zu proliferieren, um PEN5-Expression mit dem proliferativen Zustand von NK-Zellen zu korrelieren. Kurz gesagt, wurden sortierte CD56dim und CD56bright NK-Zellen für 20 Tage mit Ionomycin und LCM, wie dies in Materialien und Verfahren beschrieben ist, aktiviert. An den Tagen 0, 6, 8, 10, 14 und 20 der Kultur wurden Aliquote der aktivierten NK-Zellpopulationen in bezug auf ihren Zelloberflächen-Phänotyp durch Flußzytometrie unter Verwendung von Isotyp-abgeglichenem Vergleichs mAb, Anti-CD56 und 5H10 mAb analysiert. Die Ergebnisse, die in Fig. 3 dargestellt sind, zeigen die Prozent an positiv gefärbten Zellen (%); die gesamte mittlere Fluoreszenzintensität ist unten in den Histogrammen angeführt.
  • Wie dies in Fig. 3 gezeigt ist, resultiert eine Aktivierung von CD56dim NK-Zellen in der temporären Reduktion der PEN5- Expression. Parallel wurde die Zelloberflächenexpression von CD56 temporär erhöht und nach 20 Tagen Aktivierung war die Zelloberflächenexpression von PEN5 und CD56 auf den CD56dim NK-Zellen analog zu jener von nicht-aktivierten CD56bright NK-Zellen (d. h. PEN5dim/- und CD56bright. Diese Ergebnisse sind übereinstimmend mit der Abwesenheit von PEN5 von der Zelloberfläche von menschlichen Langzeit-NK-Zellklonen (A. Moretta, persönliche Mitteilung). Zusätzlich wurde PEN5 nicht auf leukämischen NK-Zellen ausgedrückt (CD3 : TCR&supmin;, CD16&spplus;, CD56&spplus;), die von Patienten mit granulärer, Lymphozyten-proliferativer Störung isoliert wurden (siehe Fig. 4). Schließlich war 5H10 abwesend oder nur sehr gering bzw. schwach an drei menschlichen Langzeit-NK-Zellinien ausgedrückt, 3,3, NKL und YT.N17. Diese Ergebnisse zeigen an, daß die PEN5-Expression umgekehrt mit der proliferativen Fähigkeit von NK-Zellen korreliert.
    • Beispiel 3 Biochemische Charakterisierung des PEN5-Epitops. 5H10 immunpräzipitiert zwei polydispergierte Banden.
  • Radioiodierte Lysate, die aus übriggebliebenen NK-Zellen hergestellt wurden, wurden unter Verwendung von 5H10 (Anti- PEN5) mAb oder einem Isotyp-abgeglichenem Maus-IgM-Vergleichs-mAb, immunausgefällt. Immunausfällungen bzw. -präzipitate wurden dann unter nicht-reduzierenden Bedingungen auf SDS-Polyacrylamidgelen (6% SDS) getrennt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt.
  • Wie dies in den Figuren dargestellt ist, wurden zwei diffuse Banden selektv durch den 5H10 mAb immunausgefällt. Das mittlere Molekulargewicht (m. w.) der größeren Spezies, PEN5&alpha;, war 227 ±4 kDa (n = 12). Der mittlere Molekulargewichtsbereich der polydispergierten PEN5-Spezies war 210 ± 3 kDa bis 245 ±5 kDa. Das mittlere Molekulargewicht der kleineren Spezies, PEN5&beta;, war 140 ± 3 kDa mit einem Bereich von 123 ± 3 kDA bis 170 ± 4 kDa. Die Migration sowohl von PEN5&alpha;- als auch -&beta;-Molekülen als polydispergierte Banden legt nahe, daß sie hoch glykosyliert waren.
    • PEN5 &alpha; und -&beta; sind Kohlenhydrate mit Keratanase-I-empfindlichen Ketten
  • Diese Ergebnisse wurden durch Deglykosylierungsexperimente bestätigt, deren Ergebnisse in Fig. 6 gezeigt sind. In diesen Experimenten wurden Detergenslysate, die aus radioiodierten NK-Zellen hergestellt wurden, unter Verwendung von 5H10 mAb immungefällt. Affinitäts-gereinigte PEN5&alpha;- und -&beta;-Glykoproteine wurden von den Antikörperbeschichteten Sepharosekügelchen unter Verwendung von 0,15 M NH&sub4;OH, pH 10,5, eluiert. Aliquote dieser getrockneten Probe wurden dann einer Deglykosylierung für 24 h bei 37ºC unter Verwendung von PNgase F (Reihe bzw. Spalte 6), O-Glykanase (Reihe 3), Keratanase I (Reihe 2), O-Glykanase und Keratanase (Reihe 4), Neuraminidase (Reihe 6) und PNgase F und Neuraminidase (Reihe 7) unterworfen. Vergleichseluate, die in PBS ohne irgendwelche Enzyme inkubiert wurden, wurden in Reihe 1 getrennt. Die Proben wurden unter nicht-reduzierenden Bedingungen auf einem 6 bis 12% SDS-Polyacrylamidgradientengel getrennt.
  • Verglichen mit der Migration von nicht-behandelten PEN5- Glykoproteinen (Fig. 6, Reihe 1) induzierte die PNgase-Behandlung das Verschwinden von PEN5&alpha; von dem 210-245 kDa m.w-Bereich und das Auftreten einer deglykosylierten Form von PEN5&alpha;, die um 20-25 kDa (c2) wanderte. Im Gegensatz dazu wurde die offensichtliche Beweglichkeit von PEN5&beta; um nur etwa 20 kDa nach PNgase F Inkubation reduziert. Eine Behandlung von PEN5-Glykoproteinen mit O-Glykanase (Fig. 6, Reihe 3) beeinflußte ihr SDS-PAGE-Migrationsmuster nicht signifikant. Diese Ergebnisse zeigen bzw. deuten an, daß PEN5&alpha; und PEN5&beta; merkbar in ihrer Kohlenhydratzusammensetzung unterschieden sind und daß ungefähr 85% des offensichtlichen bzw. augenscheinlich Molekulargewichts von PEN5&alpha; auf N-gebundenen Kohlenhydrate beruht.
    • PEN5&alpha; enthält 80% N-gebundene, Keratanase-empfindliche Kohlenhydrate, wohingegen PEN5&beta; 80% O-gebundene, Keratanase-empfindliche Kohlenhydrate enthält
  • Die extensive, N-gebundene Glykosylierung von PEN5&alpha; legte nahe, daß es ein Glied von einer der zwei Hauptgruppen von Glykoproteinen ist, die durch einen derart hohen Kohlenhydratgehalt (50-90%) charakterisiert sind, d. h. Proteoglykane und Muzin-artige Glykoproteine. Chondroitinase-ABC, Heparitinase und Heparinase beeinflußten das Migrationsmuster von PEN5&alpha; oder PEN5&beta; nicht (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu reduziert eine Inkubation von PEN5-Molekülen mit Keratanase I das offensichtliche Molekulargewicht von PEN5&alpha; von 210-245 kDa auf 35-40 kDa (Fig. 6, Reihe 2; c1). Es ist wahrscheinlich, daß der Unterschied zwischen den PNgase-F-verdauten (35-40 kDa) c1-Kernprotein (Fig. 6, Reihe 6) und dem Keratanase-verdauten (25-30 kDa) c2- Kernprotein (Fig. 6, Reihe 4) die Folge einer vollständigeren Deglykosylierung des PEN5&alpha;-Glykoproteins ist. Während eine Keratanase-Behandlung nur geringfügig die Polydispersität von PEN5&beta; reduzierte, reduzierte die Behandlung einer Kombination von O-Glykanase- und Keratanase-I das offensichtliche Molekulargewicht von PEN5&alpha; von 120-170 kDa auf 25-30 kDa (Fig. 6, Reihe 4). Gemeinsam gesehen, zeigen diese Ergebnisse, daß gewichtsmäßig PEN5&alpha; etwa 80% N- gebundene, Keratanase-I-empfindliche Kohlenhydrate enthält, wohingegen PEN5&beta; ungefähr 80% O-gebundene, Keratanase-I- empfindliche Kohlenhydrate enthält. Zusätzlich induzierte eine Behandlung mit Neuraminidase eine geringe Reduktion in der Polydispersität ebenso wie eine Verschiebung in dem offensichtlichen Molekulargewicht sowohl von PEN5&alpha; als auch &beta;, was anzeigt, daß Sialinsäurereste ebenfalls auf beiden Glykoproteinen vorhanden sind (Fig. 6, Reihe 5). Eine Behandlung von PEN5-Glykoproteinen mit einer Kombination von PNgase F und Neuraminidase (Fig. 6, Reihe 7) resultierte in demselben Effekt wie PNgase F allein, was die Anwesenheit von terminalen Sialinsäureresten an N-gebundenen Kohlenhydraten, die an PEN5&alpha; vorhanden sind, bestätigt. Die c1- und c2-deglykosylierten Formen von PEN5&alpha;- und -&beta;- Proteinen waren durch den 5H10 mAb nicht immunausfällbar (Daten nicht gezeigt), was anzeigt, daß das durch den Anti- PEN5 mAb erkannte Epitop die Keratanase-I-empfindlichen Kohlenhydratketten erfordert.
    • Beispiel 4 Reaktivität von Anti-PEN5 mAb mit Keratansulfat-Glykosaminoglykanen.
  • Um zu testen, ob Anti-PEN5 mAb gegen Keratansulfatkohlenhydrate gerichtet war, untersuchten wir als nächstes der Effekt von exogenen Keratansulfatkohlenhydraten auf die Bindung von PEN5 mAb an NK-Zellen. Radioiodierter 5H10 (Anti- PEN5) mAb wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Rinderhornhaut-Keratansulfat-Proteoglykan (BC) kombiniert und die Mischung wurde dann mit NK-Zellen inkubiert.
  • Kurz gesagt, wurde I¹²&sup5;-markierter 5H10 mAb (1 · 10&sup6; cpm/Probe) für 20 min bei 4ºC in PBS in der Anwesenheit der Konzentrationen von Rinderhornhaut-Keratansulfat (BC), die in Fig. 7A angezeigt sind, vorinkubiert. Die Mischung wurde dann zu NK-Zellen für eine weitere 20 minütige Inkubation bei 4ºC zugesetzt, bevor drei Waschungen in PBS- 1%BSA durchgeführt wurden. Proben wurden in einem t-Zähler gezählt und die Ergebnisse wurden als mittlere cpm von Duplikat- bzw. Doppelproben (SD < 10%) ausgedrückt. Wenn sie in der Inkubation mit NK-Zellen oder Anti-PEN5 mAb verwendet wurden, waren die folgenden Kohlenhydrate, die in 10 mg/ml verwendet wurden, ohne irgendeinen Effekt auf die 5H10-Bindung an die NK-Zelloberfläche: Chondroitinsulfat B, Heparin, Heparansulfat, Dextransulfat, G1cNAc, Mannose-6- phosphat, Lactose, Galactose-6-phosphat, Fucose, Glucose-6- phosphat, Glucose und Galactose.
  • Wie dies in Fig. 7A gezeigt ist, war die Bindung von radiomarkiertem 5H10 mAb an NK-Zellen in einer dosisabhängigen Weise in der Anwesenheit von BC-Proteoglykan inhibiert.
  • Eine Vorinkubation von NK-Zellen mit denselben Konzentrationen von BC-Proteoglykan beeinflußte nicht die Bindung von 5H10 mAb (Daten nicht gezeigt), was anzeigt, daß der Anti-PEN5 mAb mit Kohlenhydratdeterminanten, die auf Keratansulfat-Glykosaminoglykanen vorhanden sind, reagiert. Eine Inkubation von Anti-PEN5 mAb mit einfachen Zuckern oder anderen Glykosaminoglykanen war ohne irgendeinen Effekt (siehe kurze Beschreibung von Fig. 7A).
  • Weiters induzierte eine Behandlung von NK-Zellen mit Keratanase I einen 58,5% ±8,4 (n = 4) Abfall in der Reaktivität von 5H10 mAb mit NK-Zellen (Fig. 7B). In Fig. 7B wurden NK-Zellen von peripherem Blut mit PBS-1%BSA für 3 h oder 45 min bei 37ºC mit Glykosidasen (0,025 U/ml) bzw. Proteasen (5 mg/ml) inkubiert. Die Zelloberflächenexpression des PEN5-Epitops wurde dann durch Flußzytometrie unter Verwendung von 5H10 mAb analysiert. Prozent Modulation wurden als das Verhältnis der gesamten, linearen, mittleren Fluoreszenzintensität der behandelten Zellen gegenüber derjenigen von nicht-behandelten Vergleichszellen berechnet. Wie dies in Fig. 7B gezeigt ist, hatte eine Parallelbehandlung von NK-Zellen mit Chondroitinase-ABC oder Neuraminidase keinen Effekt auf die 5H10-Reaktivität. Interessanterweise war das 5H10-Epitop vollständig unempfindlich gegenüber Trypsin und Chymotrypsin, wurde jedoch durch eine Proteinase-E-Behandlung entfernt.
  • Schließlich wurde ein ELISA verwendet, um die Bindung von 5H10 (Anti-PEN5) und 5D4 (Anti-Keratansulfat) an die Keratansulfat-Glykosaminoglykane, die in verschiedenen Geweben ausdrückt sind, zu vergleichen. Die Antigenizität von 5H10 mAb für Aggrecanproteoglykane wurde durch ELISA, wie in Materialien und Methoden beschrieben, analysiert. Der Anti- Keratansulfat mAb 5D4 wurde als ein positiver Vergleich verwendet. Chondroitinase-ABC wurde bei 0,04 U/ml verwendet, Keratanase I wurde bei 0,05 U/ml verwendet und Keratanase II wurde bei 0,004 U/ml für 1 h bei 37ºC verwendet.
  • Wie in Fig. 7C (obere Tafel) dargestellt, erkannte der 5H10 mAb (kreuzschraffiert) Aggrecan-artige Proteoglykane, die von embryonischem Kükenknorpel (CD1, obere Tafel) und von Rindernasalknorpel (BNC, mittlere Tafel) abgeleitet sind. Als eine positive Kontrolle reagierte der Anti-Keratansulfat mAb 5D4 (offene Balken) auch mit nicht-behandeltem CD1 und BNC, wohingegen seine Reaktivität mit Keratanase-behandelten Proben reduziert war. Eine Behandlung von CD1 und BNC entweder mit Keratanase I oder II reduzierte die 5H10- Reaktivität. Von einer Behandlung von CD1 und BNC mit Chondroitinase-ABC ist bekannt, daß sie die Expression von Keratansulfat-Epitopen erhöht. Folglich erhöhte eine Digestion von CD1 und BNC mit Chondroitinase-ABC die Bindung sowohl von 5H10 als auch 5D4. Als ein negativer Vergleich erkannte kein mAb das Kletterratten-Chondrosarkoma-Aggrecan (RC), welches kein Keratansulfat enthält (Fig. 7C, untere Tafel). Obwohl 5D4 auch mit dem Keratansulfatproteoglykan, das von Hai-Schädelknorpel (SHK) isoliert wurde, reagierte, tat dies 5H10 nicht. Diese Ergebnisse deuten an, daß das 5H10 Epitop in einigen, jedoch nicht allen Keratansulfatketten vorhanden ist. Obwohl 5H10 klar ein Epitop erkennen kann, das auf bestimmten Keratansulfatketten ausgedrückt ist, ist das Epitop, das auf dem PEN5-Molekül auf NK-Zellen ausgedrückt ist, nicht einfach eine Keratansulfatkette, da eine flußzytometrische Analyse unter Verwendung von sechs unterschiedlichen Anti-Keratansulfat mAbs 1B4, 2D3, 3D2, 4D1, 8C2 und 5D4 keine Bindung an NK-Zellen detektierte (Daten nicht dargestellt).
  • Zusammengenommen zeigen diese Resultate, daß das 5H10 Epitop, das, obwohl es auf Keratansulfatkohlenhydraten vorhanden ist, unterschiedlich von der standardmäßigen, sulfatierten, Polylactosamin-Wiederholungssequenz Galb1-4(sulfatiert) GlcNAc ist.
    • Beispiel 5 PEN5-Glykoproteine werden an der NK-Zelloberfläche als ausgedehnte, stabartige Strukturen ausgedrückt.
  • Transmissionselektronenmikroskopie wurde an NK-Zellen durchgeführt, die durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von 5H10 mAb und einem goldmarkierten Anti-IgM- Entwicklungsreagens gefärbt waren. Ultradünne Schnitte von NK-Zellen zeigten eine extensive Markierung an der Zelloberfläche (siehe Fig. 8A-8C). Die Markierung war allgemein kontinuierlich um das gesamte Zellprofil, obwohl es in einigen Zellpräparationen relativ mehr Markierung über den Mikrovilli gab. Überraschender war der Abstand zwischen der Plasmamembran und der Goldmarkierung, der im Mittel 43,4 ± 12,8 nm (n = 50) betrug. Dieses Ergebnis legt nahe, daß, ähnlich anderen Zelloberflächen-Muzinen, die membrangebundenen Glykoproteine, die das PEN5 Epitop tragen, ausgedehnte, fadenartige Proteine sind.
  • Gemeinsam gesehen zeigen diese Ergebnisse an, daß das PEN5 Epitop teilweise eine Kohlenhydratdeterminante ist, welche auf Keratansulfatketten ausgedrückt werden kann. Zuerst konkurrieren Keratansulfat-Glykosaminoglykane selektiv mit PEN5-Molekülen, um sich an den 5H10 (Anti-PEN5) mAb zu binden. Zweitens reguliert eine Behandlung von NK-Zellen mit Keratanase I die Zelloberflächenexpression des PEN5 Epitops hinunter. Drittens erkennt der 5H10 mAb zwei unterschiedliche, Aggrecan-artige Keratansulfatproteoglykane. Keratansulfate sind Glykosaminoglykane, die aus wiederholten Galb1-4(sulfatiert)GlcNac Disacchariden bestehen. Innerhalb dieser Beschränkung können ein unterschiedliches Abzweigen der Disaccharidsubeinheiten, eine unterschiedliche bzw. differentielle Sulfatierung von GlcNAc und unterschiedliche Fucosylierung und/oder Sialylierung von Galb1- 4(sulfatiert)GlcNAc zu Heterogenität in individuellen Keratansulfatketten führen. Das Fehlen an Reaktivität von Anti- PEN5 mAb mit dem Keratansulfatproteoglykan SHK, das von Hai-Schädelknorpel isoliert wurde, legt nahe, daß die standardmäßige Lactosaminoglykan-Wiederholungssequenz nicht das durch 5H10 erkannte Epitop ist. Stattdessen zeigen unsere Daten an, daß 5H10 ein unübliches, sulfatiertes Polylactosamin-Epitop erkennt, das auf einigen, jedoch nicht allen Keratansulfat-Glykosaminoglykanen vorhanden ist.
    • Beispiel 6 Identifizierung von Gewebe infiltrierenden, natürlichen Killerzellen, die das Muzin-ähnliche Glykoprotein PEN51 ausdrücken Materialien und Methoden
  • Die folgenden Methoden und Materialien sind auf Beispiele 6A bis 6D anwendbar.
    • Quelle der Gewebe
  • Histologisch normale, fötale (20 Wochen Gestation) und erwachsene, menschliche Gewebe wurden von chirurgischen und Autopsieproben erhalten. Gefrorene Gewebe, die in OCT-Verbindung eingebettet sind (Baxter Corp., McGaw Park, IL) wurden bei -70ºC bis zum Gebrauch gelagert. Alle Gewebe wurden als gefrorene Gewebeschnitte verwendet und wurden adäquat histologisch konserviert. Die Tafel bzw. der Bereich von normalen Geweben, welche untersucht wurden, umfaßte Nebennieren, Hirn, Brust, Cervix, Dickdarm, Ösophagus bzw. Speiseröhre, Herz, Niere, Leber, Lunge, Lymphknoten, Eierstock, peripherer Nerv, Pankreas bzw. Bauchspeicheldrüse, Skelettmuskel, Haut, Dünndarm, Milz, Magen, Hoden, Schilddrüse, Mandeln, Thymus und Uterus bzw. Gebärmutter.
    • Reagentien
  • Anti-5H10 wurde in einer Verdünnung von 1 : 400 (2,5 mg/ml) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 0,06% kristallines Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Natriumazid, verwendet. Gereinigtes Mäuse-IgM (Coulter Immunlogy, Hialeah, FL) diente als der negative Vergleich. Zur Verwendung wurde es auf dieselbe Konzentration mit derselben Pufferlösung wie der Test-Antikörper verdünnt. N901, ein Mäuse-monoklonaler Antikörper der IgG1-Subklasse, bindet sich an das NKH1-Antigen (CD56), das auf NK-Zellen ausgedrückt ist. Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1 : 664 (2,5 mg/ml) in PBS, enthaltend 0,06% kristallines Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Natriumazid, verwendet. Biotinyliertes, Affinitäts-gereinigtes Ziegen Anti-Maus-IgM (m-kettenspezifisch) und Pferde Anti-Maus-IgG (spezifisch für schwere + leichte Kette) Antikörper (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA) wurden als sekundäre Antikörper in einer Verdünnung 1 : 150 in PBS, enthaltend 2% menschliches AB&spplus;-Serum und 0,1% Natriumazid, verwendet. Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexe (Vector) wurde als das Markierungsreagens in einer Verdünnung von 1 : 1 : 80 in PBS verwendet.
    • Immuhistochemie
  • Immunhistochemische Studien wurden unter Verwendung der Avidin-Biotin-Immunperoxidase-Technik [Rice, et al., Am. J. Path., 138: 385, (1991)] durchgeführt. Um sicherzustellen, daß Gewebeschnitte anhafteten, wurden Objektträger mit Poly-L-Lysin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) beschichtet, die in gereinigtem Wasser rekonstituiert waren. Gefrierschnitte wurden kryostatisch geschnitten (6-8 mm dick), auf beschichteten Objektträger gesammelt, luftgetrocknet und in 2% neutral gepuffertem Paraformaldehyd bei 4ºC für 20 min fixiert, gefolgt durch mehrere Waschungen mit PBS. Um den endogenen Biotingehalt zu blockieren und die Kreuzreaktivität des biotinylierten Antikörpers zu reduzieren, wurden alle Gewebe mit einer Lösung von Avidin (Vector) in 10% normalem Pferdeserum (Vector) in BSA-Verdünnungspuffer bei Raumtemperatur für 15 min inkubiert. Gewebeschnitte wurden von Avidin/Pferdeserum-Puffer drainiert und mit dem Antikörper bei 4ºC über Nacht inkubiert. Nach Waschen in PBS wurden Objektträger für 30 min 0,3% Wasserstoffperoxid und Biotin-blockierender Lösung inkubiert, um endogene Peroxidaseaktivität abzuschrecken bzw. zu quenchen und verbleibendes Avidin zu blockieren. Die Schnitte wurden dann mit PBS gewaschen, entweder mit biotinyliertem Ziegen Anti-Maus-IgM- oder Pferde Anti-Maus-IgG-Antikörpern für 30 min inkubiert, in PBS gewaschen, mit Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexen für 45 min inkubiert und dann neuerlich mit PBS gewaschen. Nach Inkubieren der Objektträger für 5 min in Tris-Imidazol/HCl-Puffer wurde die Peroxidasereaktion durch Inkubieren für 5 min mit 3,3-Diaminobenzidin (DAB) (Sigma Chemical Co.), gelöst in Tris-Imidazol/HCl-Puffer, enthaltend 0,11% Wasserstoffperoxid, initiiert. Gewebeschnitte wurden mit Wasser gewaschen, mit Harris Hematoxylin gegengefärbt und mit reinen Alkoholen und Xylolen dehydriert. Deckgläser wurden dann auf Objektträgern mit E-Z- Mount-Festlegungsmedium festgelegt (Shandon Inc., Pittsburgh, PA).
    • Transmissionelektronenmikroskopie.
  • NK-Zellen von peripherem Blut, die, wie in Vivier, et al, J. Immunol., 146: 206, (1991) berichtet, gereinigt wurden, wurden zuerst unter Verwendung von 5H10 (Anti-PEN5) und kolloidalem, goldmarkiertem Ziegen Anti-Maus-IgM (Amersham) gefärbt. Nach Festlegung für 1 h in 0,1% Glutaraldehyd, 2 % Paraformaldehyd wurden die gefärbten Zellen durch Transmissionselektronenmikroskopie, wie in Watkins, et al., Carbohydrate Res., 213: 185 (1991) beschrieben, überprüft bzw. untersucht.
    • Beispiel 6A: Vergleichende Expression von PEN5&spplus; und CD56&spplus; Lymphozyteninfiltrierenden Lymphoidgeweben.
  • Obwohl CD56 auf der Oberfläche der meisten NK-Zellen von peripherem Blut ausgedrückt ist, ist ihre Expressionsdichte auf den meisten NK-Zellen ziemlich niedrig. Deshalb können Antikörper, die mit CD56 reaktiv sind, nicht ideale Reagentien für die Identifikation von Gewebe infiltrierenden NK- Zellen sein. Die relative Unfähigkeit von Anti-CD56, NK- Zellen in Lymphoidgeweben zu detektieren, wird in Fig. 9 und 10 demonstriert, in welchen CD56&spplus;-Zellen kaum in Lymphknoten, Mandeln oder Schilddrüse detektiert werden. Im Gegensatz dazu identifizierten Antikörper, die mit PEN5 reaktiv sind, Lymphozyten, die jedes dieser Gewebe infiltrieren. Während PEN5&spplus;-Zellen durch den Lymphknoten gestreut bzw. verteilt waren, tendierten sie dazu, in den parafollikulären Bereichen der Mandel konzentriert zu sein. Bei größerer Vergrößerung bzw. Verstärkung wurden von PEN5&spplus;- Zellen beobachtet, daß sie rund oder oval oder manchmal verlängert sind. Sie waren allgemein größer als die verbleibenden Gewebelymphozyten und enthielten ein relativ übermäßiges bzw. relativ viel Zytoplasma. Die Kerne wurden exzentrisch innerhalb der Zellen festgelegt und waren etwas größer als jene der verbleibenden Lymphozyten. Das Kernchromatin war dicht und homogen. Immunfärben war in dem Bereich der Plasmamembran üblich, jedoch wurde es auch in dem Zytoplasma gesehen.
    • Beispiel 6B: Vergleichende Expression von PEN5&spplus; und CD56&spplus; Lymphozyten in fötalen und erwachsenen Geweben.
  • Da fötale Leber und fötaler Thymus als Stellen von NK-Zellen-Differenzierung angedeutet wurden, verglichen wir die Expression von PEN5&spplus; und CD56&spplus; Lymphozyten in jedem dieser Gewebe mit jener von ihren erwachsenen Gegenparts. Wie in Fig. 10 gezeigt, wurden CD56&spplus;-Zellen nicht einfach bzw. leicht entweder in fötalem oder erwachsenem Thymus detektiert. In jedem dieser Gewebe konnten gestreute bzw. verteilte Lymphozyten, die niedrige Niveaus an CD56 ausdrücken, bei großer Vergrößerung detektiert werden, was nahelegt, daß CD56&spplus;-Zellen vorhanden sind, jedoch schwierig unter Verwendung dieses histochemischen Verfahrens zu detektieren sind. Dies mag von der Labilität des Antigens unter diesen Festlegungsbedingungen oder dem niedrigen Niveau der CD56-Expression herrühren, da Sanchez, et al., [J. Exp. Med. 178: 1857 (1993)] gezeigt haben, daß CD56&spplus; Lymphozyten in diesen Geweben unter Verwendung von flußzytometrischen Analysen identifiziert werden können. Im Gegensatz dazu wurden PEN5&spplus;-Zellen leicht detektiert, die sowohl über erwachsenem als auch fötalem Thymus verteilt waren. Die Dichte von PEN5&spplus;-Zellen war durchgehend größer in fötalem Thymus als in erwachsenem Thymus. Gelegentliche CD56&spplus;-Zellen konnten in erwachsener Leber detektiert werden, jedoch war wiederum die Intensität der Färbung sehr schwach (Fig. 11). Gestreute PEN5&spplus;-Zellen wurden in erwachsener Leber aufgrund ihrer intensiveren Färbung leicht detektiert. Relativ mehr PEN5&spplus;-Zellen wurden in fötaler Leber verglichen mit erwachsener Leber beobachtet. Bei größerer Verstärkung bzw. Vergrößerung erschien die PEN5-Expression in Leber, die Lymphozyten infiltrieren, zumindest teilweise zytoplasmisch. Vorherige Ergebnisse haben gezeigt, daß Muzin-artige Glykoproteine in dem Trans-Golgi-Retikulum und in zytoplasmischen Vesikeln identifiziert werden können, die gegebenenfalls mit der Plasmamembran verschmelzen [Watkins, et al., Carbohydrate Res. 213: 185 (1991)]. Es ist möglich, daß Leberinfiltrierende NK-Zellen PEN5 primär in diesen intrazellulären Kompartments ausdrücken.
  • Die obigen Ergebnisse zeigen, daß PEN5&spplus; Lymphozyten insbesondere in fötaler Leber und fötalem Thymus vorherrschend waren. Neuere Studien legen nahe, daß NK-Zellen und T-Zellen von einer gemeinsamen Knochenmark-abgeleiteten Elternzelle stammen [Sanchez, et al., J. Exp. Med. 178: 1857 (1993); Lanier, et al., Immunol. Today, 13: 392 (1992); Rodewald, et al., Cell 69: 139 (1992) und Koyasu, et al., J. Exp. Med. 179: 1957 (1994)]. Ein Aufnehmen dieser Zellen in fötaler Leber, einem Hauptsitz von pränataler Hämatopoesie, pflegt die Entwicklung von CD56&spplus;-Zellen, die peripheren NK- Zellen sowohl in dem Phänotyp als auch in der Funktion ähneln. Einiger Nachweis legt nahe, daß diese Zellen in T- Zellen differenzieren können, wenn sie die Leber verlassen und in dem Thymus aufgenommen werden [Sanchez, et al., J. Exp. Med. 178: 1857 (1993)]. In der Abwesenheit von thymischer Mikroumgebung können diese Zellen in NK-Zellen differenzieren, wenn sie mit geeigneten Wachstumsfaktoren versehen werden [Sanchez, et al., J. Exp. Med. 178: 1857 (1993); und Koyasu, et al., J. Exp. Med. 179: 1957 (1994)]. Analog haben verschiedene Studien gezeigt, daß eine in vitro Kultur von unreifen Thymozyten in der Anwesenheit von IL-2 in der Differenzierung von Zellen resultiert, welche phänotypisch und funktionell NK-Zellen von peripherem Blut ähneln [Sanchez, et al., J. Exp. Med. 178: 1857 (1993); Koyasu, et al., J. Exp. Med. 179: 1957 (1994); Michon, et al., J. Immun. 140: 3660 (1988); und Mingari, et al., J. Exp. Med. 174: 21 (1991)]. Einige dieser Studien beziehen sich auf die Charakterisierung von Lymphozytklonen, welche aus ausgewählten, fötalen und erwachsenen Geweben wachsen. Da klonale Selektion eine Verzerrung jeder Analyse von Zellpopulationen verleihen kann, stellt die Beobachtung, daß PEN5&spplus;- Lymphozyten in fötaler Leber und Thymus vorhanden sind, nicht-verzerrten Nachweis für die Differenzierung von NK- Zellen in diesen Geweben zur Verfügung. Obwohl relativ wenige CD56&spplus;-Zellen an diesen Stellen unter Verwendung von histochemischer Analyse identifiziert wurden, kann dieses Ergebnis die niedrige Dichte der Expression dieses NK-Markers reflektieren. CD56&spplus; Lymphozyten wurden sowohl in fötaler Leber als auch fötalem Thymus unter Verwendung von flußzytometrischer Analyse [Sanchez, et al., J. Exp. Med. 178: 1857 (1993)] detektiert. Unsere Ergebnisse legen nahe, daß erwartet werden kann, daß eine PEN5 Expression ein empfindlicherer Marker von Gewebe-infiltrierenden NK-Zellen als die CD56-Expression ist.
    • Beispiel 6C: Expression von PEN5-Antigen auf Nicht-Lymphoidzellen.
  • Antikörper, die mit PEN5 reaktiv sind, erkannten auch einige nicht-leukozytische Zellen. Diese waren allgemein Epithelzellen, die in dem Ösophagus, Cervix, Endometrium, Trachea, Gallengängen, Dickdarm und Bauchspeicheldrüse gefunden wurden. Das dramatischste Beispiel dieses nicht-lymphoitischen Färbens wurde in der Lunge und dem Colon bzw. Dickdarm gesehen, wo Anti-PEN5 stark die Schleimhautschicht, die Bronchial- und Dickdarm-Epithelzellen auskleidet, färbt (Fig. 12). Die Spezifität dieses Färbens wurde durch die Unfähigkeit von entweder Isotyp-abgeglichenem Vergleichs-Antikörper oder Anti-CD56 bestätigt, Epithelschleimhaut zu färben.
    • Beispiel 6D: Coexpression von PEN5 und TIA-1 in Gewebe infiltrierenden Lymphozyten.
  • Ein weiterer Nachweis, daß PEN5&spplus; Gewebe infiltrierende Lymphozyten NK-Zellen sind, stammt von Doppelmarkierungsexperimenten, unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der mit TIA-1 (2G9, IgG1), einem zytotoxischen, Lymphozyten-beschränkten Körnchenprotein, reaktiv ist [Anderson, et al., J. Immunol. 144: 574 (1990); Tian, et al., Cell 67: 629 (1991); und Sale, et al., Arch. Path. Lab. Med. 116: 622 (1992)]. In diesen Experimenten wurden PEN5&spplus;-Zellen in Milz und Appendix-Lymphoidgewebe unter Verwendung von FITC-markiertem Anti-5H10 identifiziert. Dieselben Schnitte wurden auch unter Verwendung von Phycoerythrin-markiertem Anti-2G9 markiert. Wie in Fig. 13 gezeigt, waren alle vier PEN5&spplus;- Lymphozyten, die über die Milz verstreut waren, auch TIA- 1&spplus;. In Übereinstimmung mit der Lokalisierung dieser Antigene war das PEN5-Färben stark auf die Zelloberfläche beschränkt, während TIA-1-Färben zytoplasmisch und granulär ist. Einige PEN5-Zellen drückten TIA-1 aus. Diese Zellen sind wahrscheinlich zytotoxische T-Zellen, welche TIA-1, jedoch nicht PEN5 ausdrücken. In dem Appendix coexprimierte nur einer von vier PEN5&spplus;-Lymphozyten TIA-1. Dieses Ergebnis legt nahe, daß in einigen Geweben PEN5 weniger differenzierte NK-Zellen, welche keine definierten, zytotoxischen Körnchen besitzen, identifizieren kann. Alternativ könnten diese Ergebnisse Änderungen in der Expression von TIA-1 widerspiegeln, welche auf die NK-Zellendifferenzierung bezogen sind. Tabelle III listet den Prozentsatz von PEN5&spplus; Gewebe infiltrierenden Lymphozyten, die TIA-1 in einigen Geweben ausdrücken, auf. Wie unten zusammengefaßt ist, ist dies, obwohl der Hauptteil von PEN5&spplus; Lymphozyten TIA-1 in Milz und Leber coexprimiert, in Mandel oder Appendix nicht der Fall, wo die meisten PEN5&spplus; Lymphozyten TIA-1 nicht ausdrücken. Ob diese gewebespezifischen Unterschiede unterschiedliche Stufen von NK-Zellen-Differenzierung widerspiegeln oder verschiedene Arten von Gewebe infiltrierenden Lymphozyten, bleibt zu erleuchten bzw. zu untersuchen. Tabelle III: Expression von TIA-1 in PEN5± Gewebe infiltrierenden Lymphozyten*
  • * Doppelmarkierung der angegebenen Gewebe wurde, wie in Materialien und Methoden zu Beispiel 6 und in der kurzen Beschreibung von Fig. 13 beschrieben, durchgeführt. Der Prozentsatz von PEN5&spplus;-Zellen, die TIA-1 ausdrückten, ist angegeben. Gewebe von 4 oder 5 unabhängigen Donoren wurden ausgewertet und der mittlere Standardfehler ist angegeben.
  • Gemeinsam gesehen, illustrieren die in Beispiel 6A bis 6D dargestellten Ergebnisse eine Anzahl von bedeutenden Erkenntnissen. Es wurde ein monoklonaler Antikörper verwendet, der mit einem sulfatierten Poly-N-Lactosamin Epitop, das auf dem auf NK-Zellen beschränkten Glykoprotein PEN5 ausgedrückt ist, reaktiv ist, um die Anwesenheit von Gewebe infiltrierenden NK-Zellen in Lymphoid- und Nicht-Lymphoidgeweben zu überwachen. Während Antikörper, die mit CD56 reaktiv sind, nicht fähig waren, effizient alle Gewebe infiltrierenden NK-Zellen zu detektieren, wurden PEN5&spplus; Lymphozyten leicht in verschiedensten Geweben identifiziert. In der Annahme, daß PEN5 ähnlich sowohl auf Gewebe infiltrierenden und zirkulierenden Lymphoidzellen ausgedrückt wird, legen diese Ergebnisse nahe, daß NK-Zellen verschiedenste Lymphoid- und Nicht-Lymphoidgewebe infiltrieren können, um ihre Immunfunktionen zu mediatisieren. In der Peripherie wird PEN5 selektiv auf großen, granulären Lymphozyten, die zytotoxische Effektorfunktion besitzen, ausgedrückt. Diese Zellen drücken niedrige Niveaus von CD56 aus, was zu der Unfähigkeit von Antikörpern, die mit CD56 reaktiv sind, beitragen kann, diese Zellen in Geweben zu erkennen. Ein Doppelfärben mit zytotoxischem, granulärem Marker, TIA-1, stützt den Schluß, daß PEN5&spplus; Lymphozyten, die in einige Gewebe infiltrieren (z. B. Milz und Leber), zytotoxische Granule enthalten. Überraschenderweise coexprimieren jedoch zahlreiche PEN5&spplus;-Zellen, die andere Gewebe infiltrieren (z. B. Mandel und Appendix), TIA-1 nicht. Dieses Ergebnis legt nahe, daß in einigen Geweben PEN5 auf nichtgranulären Lymphozyten ausgedrückt werden kann.
  • Das PEN5-Epitop, das durch den monoklonalen Antikörper 5H10 erkannt wird, bezieht sich auf Keratansulfat, welches selbst ein Glied der Polylactosaminfamilie von Zuckern ist. Die zwei Isoformen von PEN5 ähneln daher einem Keratansulfatproteoglykan ( PEN5&beta;) und einem Keratansulfatmuzin (PEN5&alpha;). Sekretierte Muzine, die mittels Keratansulfat derivatisiert wurden, wurden in der Trachea-Schleimhaut identifiziert [Kim, et al., Exp. Lung Res. 17: 533 (1991)]. Es ist möglich, daß das Erkennen der trachealen und gastrointestinalen Muzinschicht durch Anti-5H10 aus seiner Erkennung dieser keratansulfatierten Muzine herstammt. Wir haben zuvor gezeigt, daß Anti-5H10 Keratansulfat-tragende Proteoglykane, die von verschiedenen Geweben abgeleitet sind, erkennen kann, umfassend embryonale Kükenknorpel und Rinder- Nasal-Aggrecan [Vivier, et al., J. Exp. Med. 178: 2023 (1993)]. In Epithelzellen sind Muzine sekretiert, um Schutz gegen Umgebungstoxine zu verleihen [Strous, et al., Critical Rev. in Biochem. and Molec. Biol. 27: 57 (1992)]. Es ist durch Analogie möglich, daß PEN5 auf unterschiedenen großen, granulären NK-Zellen exprimiert wird, um diese gegen ihre eigenen zytotoxischen Effektormoleküle zu schützen. Die ausgedehnte, stabartige Struktur von PEN5, die durch Transmissionselektronenmikroskopie gezeigt wurde, könnte eine derartige funktionelle Rolle erleichtern. Zelloberflächen-Muzine wurden auch als Liganden für Lymphozytenadhäsionsmoleküle, die in Gewebeaufnahmen involviert sind, identifiziert [Lasky, et al., Cell 69: 927 (1992)]. Es ist daher möglich, daß die Expression von PEN5 auf terminal differenzierten NK-Zellen seine nachfolgende Infiltration in die verschiedenen Gewebe erlaubt, in welchen diese Zellen gefunden werden.

Claims (1)

1. Monoklonaler Antikörper oder ein immunreaktives Fragment oder Derivat davon, welcher einen Immunkomplex mit dem Glykoprotein PEN5 bildet, welches auf der Oberfläche von natürlichen Killerzellen vorhanden ist, und der Antikörper nicht mit den Antigenen, welche auf T-Zellen, B-Zellen, Monozyten, Granulozyten, roten Blutkörperchenzellen und Thrombozyten vorhanden sind, reagiert, wobei das Glykoprotein PEN5 auf der Oberfläche einer natürlichen Killerzelle vorliegt und ein N-verknüpftes Glykoprotein PEN5&alpha; mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 227 ±4 kDa und ein O- verknüpftes Glykoprotein PEN5&beta; mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 140 ±3 kDa umfaßt.
2. Antikörper nach Anspruch 1, welcher ein Epitop auf dem PEN5-Glykoprotein, umfassend ein Polylactosamin-Kohlenhydratmolekül, erkennt.
3. Antikörper nach Anspruch 2, wobei das Epitop auf der Oberfläche von etwa 70 bis 90% der funktionell differenzierten natürlichen Killerzellen vorhanden ist und nicht auf CD3&spplus; T-Zellen oder CD20&spplus; B-Zellen vorhanden ist.
4. Antikörper nach Anspruch 1, welcher einen Immunkomplex mit dem gleichen Epitop wie der monoklonale Antikörper, hergestellt durch das Hybridom, gekennzeichnet durch die ATCC-Zugangsnr. HB11441, bildet.
5. Antikörper nach Anspruch 1, welcher durch das Hybridom, gekennzeichnet durch die ATCC-Zugangsnr. HB11441, hergestellt wird.
6. Antikörper nach Anspruch 1 oder ein immunreaktives Fragment oder Derivat davon, verknüpft mit einem Marker, Toxin oder festem Träger, wobei der Marker ein fluoreszierender, radioaktiver oder enzymatischer Marker ist.
Hybridom, welches einen monoklonalen Antikörper erzeugt, welcher einen Immunkomplex mit dem Glykoprotein PEN5, wie in Anspruch 1 definiert, bildet.
7. Hybridom nach Anspruch 7, welches durch die ATCC-Zugangsnr. HB11441 gekennzeichnet ist.
8. Teilweise gereinigte Aufarbeitung von einem natürlichen Killerzellenspezifischen Protein, wobei das Protein PEN5, wie in Anspruch 1 definiert, deglykolisiertes PEN5, PEN5&alpha;, deglykolisiertes PEN5&alpha;, PEN5&beta; oder deglykolisiertes PEN5&beta; ist.
10. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von natürlichen Killerzellen in einer biologischen Probe, umfassend die Schritte
(a) des Kontaktierens der biologischen Probe mit einem monoklonalen Antikörper, wie in Anspruch 1 definiert, oder einem immunreaktiven Fragment oder Derivat davon, welcher einen Immunkomplex mit dem natürlichen Killerzell-Oberflächenglykoprotein PEN5 unter Bedingungen bildet, welche ausreichend sind, die Bildung eines Immunkomplex zu ermöglichen, und
(b) des Nachweisens des Immunkomplex als einen Indikator für das Vorhandensein von natürlichen Killerzellen in der biologischen Probe.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die biologische Probe eine Gewebeprobe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lymphe, Nebenniere, Gehirn, Brust, Gebärmutterhals, Dickdarm, Speiseröhre, Herz, Niere, Leber, Lunge, Lymphknoten, Eierstock, peripherer Nerv, Bauchspeicheldrüse, Skelettmuskel, Haut, Dünndarm, Milz, Magen, Hoden, Schilddrüse, Mandeln, Thymus und Gebärmutter, ist.
12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der monoklonale Antikörper mit einem nachweisbaren Marker, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Radioisotop, einem Fluoreszenzmarker oder einem Enzym, verknüpft ist.
13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die biologische Probe eine Probe aus dem peripheren Blut oder Knochenmark ist.
14. Verfahren zur selektiven Entfernung natürlicher Killerzellen aus einer biologischen Probe, umfassend die Schritte
(a) des Kontaktierens der biologischen Probe mit einem monoklonalen Antikörper, wie in Anspruch 1 definiert, oder einem immunreaktiven Fragment oder Derivat davon, welcher einen Immunkomplex mit dem natürlichen Killerzellen-Oberflächenglykoprotein PEN5, unter Bedingungen, welche ausreichend sind, die Bildung eines Immunkomplex zu ermöglichen, bildet, und
(b) des Entfernens der Zellen, umfassend den Immunkomplex aus der biologischen Probe.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die biologische Probe peripheres Blut oder eine Knochenmarkspunktion ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Probe mit dem Antikörper oder immunreaktiven Fragment davon in Anwesenheit von Komplement kontaktiert wird.
17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der monoklonale Antikörper an ein Toxin konjugiert ist.
18. Kit zum Nachweis oder zum Entfernen natürlicher Killerzellen aus einer biologischen Probe, umfassend einen monoklonalen Antikörper, wie in Anspruch 1 definiert, oder ein immunreaktives Fragment oder Derivat davon, welcher einen Immunkomplex mit dem natürlichen Killerzellen- Oberflächenprotein PEN5 bildet.
19. Kit nach Anspruch 18, wobei der monoklonale Antikörper an das gleiche Epitop, wie der Antikörper, sekretiert von dem Hybridom, gekennzeichnet durch die ATCC-Nr. HB11441, bindet.
20. Kit nach Anspruch 18, wobei der monoklonale Antikörper mit einem Marker, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Radioisotop, einem Fluoreszenzmarker oder einem Enzym, verknüpft ist.
21. Kit nach Anspruch 18, weiter umfassend einen Antikörper, welcher ein T- Zellen-Oberflächenantigen, CD20, erkennt.
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