DE68922806T2

DE68922806T2 - Monoklonale antikörper und herstellung eines impfstoffes gegen menschliche krebsantigene durch immunisierung mit menschlichem und tierischem mucin und mit synthetischen gluciden-trägerkonjugaten.

Info

Publication number: DE68922806T2
Application number: DE68922806T
Authority: DE
Inventors: Henrik The Biomembrane Clausen; Sen-Itiroh The Biomem Hakomori; Thomas Kjeldsen; Anil The Biomembrane I Singhai; Helio The Biomembran Takahashi; Tatsushi The Biomembr Toyokuni
Original assignee: Biomembrane Institute
Current assignee: Biomembrane Institute
Priority date: 1988-03-11
Filing date: 1989-03-10
Publication date: 1996-02-29
Anticipated expiration: 2009-03-11
Also published as: JP3066741B2; JPH1192400A; JP2849683B2; EP0357767A1; JPH02503387A; DE68922806D1; EP0357767A4; CA1340587C; WO1989008711A1; EP0357767B1; ATE123066T1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die spezifisch sind auf menschliches Krebsantigen und auf die daraus hergestellten Hybridomae und monoklonalen Antikörper. Im besonderen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf neue Verfahren zur Bereitung monoklonaler Antikörper gegen menschliche Krebsantigene, welche als Immunogen gereinigtes Antigen verwenden, dessen Struktur chemisch definiert ist und wobei die Auswahl der Hybridomzellinien, welche den gewünschten monoklonalen Antikörper produzieren, unter Verwendung des muzinartigen Glykoproteins mit einer definierten chemischen Struktur vorgenommen wird. Das Verfahren verzichtet auf eine Anzahl zusätzlicher Schritte im Vergleich zu den derzeit für die Herstellung monoklonaler Antikörper für menschliche Krebsantigene verwendeten Verfahren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Hybridomae, welche durch das neuartige Verfahren hergestellt wurden, und monoklonale Antikörper, die von den Hybridomae abgeschieden werden. Die Qualität der Hybridomae hat sich als ebenso gut erwiesen wie die jener Hybridomae, welche durch herkömmliche Verfahren hergestellt wurden, und die monoklonalen Antikörper, welche von den Hybridomae produziert werden, sind qualitätsmäßig ebenso gut wie jene, die durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden, oder sogar noch besser, da die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung keine unerwünschte Kreuzreaktivität aufweisen.
Eine Anzahl monoklonaler Antikörper wurde nach Immunisierung mit menschlichen Tumorzellen durch positive Reaktivität mit menschlichen Krebszellinien und negativer Reaktivität mit normalem Gewebe und normalen Zellinien ausgewählt. Viele dieser Antikörper wurden als gegen muzinartige Glykoproteine gerichtet definiert, welche durch extrem heterogene Disulfide gekennzeichnet sind, die mit hochmolekularen Polypeptiden verknüpft sind, welche eine große Anzahl von O-verbundenen Oligosacchariden aufweisen. Die Mehrheit der O-verbundenen Oligosaccharide besteht aus einem Dissacchariden-Kern (Galß1-3GalNAcα1- O-Ser/Thr), an den eine Anzahl von Zuckerrückständen wie z.B. Sialinsäure, Fucose, und N-Acetyl-Glukosamin gebunden ist, um hochkomplexe Strukturen im Menschen zu bilden. Diese muzinartigen Glykoproteine kommen hauptsächlich in Epithelzellen vor und werden von Becherzellen ausgeschieden, um muzinöse Abscheidungen zu bilden. In Verbindung mit onkogener Umwandlung wird die Synthese vieler Zuckerketten blockiert (Hakomori S., Murakami W.T, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 59: 254-261, 1968, und Hakomori S., Cancer Res., 45: 2405-2414, 1985). Die Synthese von Kohlehydrat-Ketten in muzinartigen Glykoproteinen wird also in vielen menschlichen Krebsarten stark blockiert, wodurch eine Anzahl muzinartiger Glykoproteine mit kurzen Kohlehydrat-Ketten und ohne periphere Struktur gebildet wird, d.h. ohne Modifizierung der Kernstruktur. Unter diesen Glykoproteinen mit unvollständigen Oligosaccharid-Ketten wurde T, Tn und Sialyl-Tn identifiziert. Dies sind die gemeinsamen Kernstrukturen aller muzinartigen Glykoproteine, die in einer kryptischen Form in normalen Geweben vorhanden sind (Springer G., Science, 224: 1198-1206, 1984, und Hirohashi S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7039-7043, 1985).
Die derzeit zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen menschliche Krebsantigene angewandten Verfahren verwenden als Immunogen ein Krebsgewebehomogenat oder Tumorzellinien, und das Hybridom wird durch eine Analyse der Spezifität der produzierten Antikörper mit einer großen Anzahl von Tumorzellen und Gewebeabschnitten ausgewählt.
Die kreuzreagierende Blutgruppe-A-Antigenität von α-Gal-Nac-Rückstand verbunden mit einem Serin oder Threonin eines Glykoproteins wurde von Uhlenbruck und Kollegen als das durch verschiedene GalNac-Lektine (Helix pomatia, Soja hispida und Sarothamnus scoparius) erkennbare Tn-Antigen beschrieben, welches vorzugsweise Blutgruppe-A-Erythrozyten agglutiniert. Das Epitop stellt den innersten α-GalNAc-Rückstand von O-verbundenen Kohlehydratketten dar, die sowohl in transmembranen Glykoproteinen als auch in muzinartigen Glykoproteinen vorhanden sind. Daher ist das Antigen in normalen Zellen oder Sekretionen kryptisch, doch wird es nach Desialylation gefolgt von einem Smith-Abbau freigelegt (Dahr, W., et al. Vox Sang., 27: 29-42, 1974). Das Tn-Antigen wurde auch von Springer und Kollegen als Vorläufer des Thomsen-Friedenreich-Antigens (T-Antigen) beschrieben, und sowohl Tn- wie auch T-Antigen kommen beim Brustkrebs (Springer, G.F., et al., J. Natl. Cancer Inst., 54: 335, 1975) und verschiedenen anderen Krebsarten (Springer, G.F., et al., Cancer, 55: 561-569, 1985) vor. Die weite Verbreitung des Antigens in verschiedenen menschlichen Krebsarten und die eingeschränkte Verbreitung in normalem Gewebe wurde jedoch nicht richtig erkannt, bis vor kurzem monoklonale Antikörper, die spezifisch auf diese Epitope sind, nachgewiesen wurden (Hirohashi, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7039-7043, 1985) . Die IgM-Antikörper NCC-LU-35 und NCC-LU-81 wurden ursprünglich nach der Immunisierung von Mäusen durch squamöse menschliche Lungenkrebszellen LU-65 nachgewiesen und durch eine spezifische Reaktivität mit Tumoren, nicht aber mit normalem Gewebe ausgewählt. Diese Antikörper zeigten eine Kreuzreaktion mit A-Antigen, und es konnte nachgewiesen werden, daß sie gegen das Tn-Antigen gerichtet sind (Hirohashi, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7039-7043, 1985). Obwohl ein großer Teil der Kreuzreaktion mit dem Blutgruppe-A-Antigen für NCC-LU-35 und in einem geringeren Ausmaß für NCC-LU-81 nachgewiesen wurde, können diese Antikörper Tn-Antigene definieren, die besonders in Tumoren von Lebewesen mit der Blutgruppe O oder B vorkommen.
Da sich gezeigt hat, daß die Reaktivität dieser Anti-Tn- Antikörper in höchstem Maße auf Nicht-A-Tumorgewebe beschränkt war (Hirohashi, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7039-7043, 1985), wäre es äußerst wünschenswert, die IgG-Version des Anti-Tn-Antikörpers ohne Kreuzreaktion zur Blutgruppe A zu erhalten, da nur IgG-Antikörper antikörperabhängige zytotoxische Effekte auf Tumorzellen hervorrufen können (Young, W.W., Jr. und Hakamori, S., Science, 211:487-489, 1981; Houghton, A.N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 1242-1246, 1985; Herberman, R.B., et al., In: R.A. Reisfeld und S. Sell (Herausgeber), Monoklonale Antikörper und Krebstherapie, Seiten 193-203, Alan R. Liss, Inc., New York, 1985; und Herlyn, D.M., et al., Cancer Res., 40: 717-721, 1980). IgG-Antikörper sind auch besser als IgM zur Herstellung von Konjugaten mit Toxinen, anderen Antitumor-Reagentien und radioaktiven oder paramagnetischen Markern für Heilmittel und für die Betrachtung von Tumoren geeignet.
Darüberhinaus wurden zwei monoklonale Antikörper, B72.3 (Nuti, M., et al., J. Inst. Cancer, 29: 539-545, 1982; Thor, A., et al., Cancer Res., 46: 3118-3124, 1986; und Johnson, V.G., et al., Cancer Res., 46: 850-857, 1986) und MSL102 (Kurasawa, A. et al., In: Tumormarker und deren Bedeutung für die Behandlung von Brustkrebs. (Herausgeber Dao, T., Brodie, A., und Ip, C., Seiten 47-70, Alan R. Liss Inc., N.Y., 1986) nach der Immunisierung mit menschlichem metastasiertem Brustkrebs bzw. einer Darmkrebszellinie nachgewiesen, welche eine hochspezifische Reaktivität mit verschiedenen menschlichen Krebsarten und eingeschränkte Reaktivität mit normalem Gewebe zeigen.
Die derzeit angewandten Verfahren erfordern jedoch eine große Anzahl an Schritten und sind daher langwierig und zeitaufwendig.
Dementsprechend wäre ein wirksameres Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen menschliche Krebsantigene erwünscht, ebenso wie die Isolierung von Hybridomae, die monoklonale Antikörper abscheiden, welche keine unerwünschte Kreuzreaktion mit Glykoproteinen mit normaler Kohlenhydratsequenz und -struktur aufweisen.
Darüberhinaus wird die aktive Immunisierung zur Unterdrückung des Tumorwachstums schon sehr lange in der Tumorimmunologie durchgeführt. Bei einigen experimentalen Tumoren wurden einige erfolgreiche Ergebnisse erzielt, doch viele andere Versuche sind gescheitert. Dies ist teilweise auf die Tatsache zurückzuführen, daß die verwendeten Tumorantigene chemisch nicht gut definiert waren und ihre Fähigkeit, eine Wirtimmunreaktion zur Unterdrückung des Tumorwachstums hervorzurufen, daher eingeschränkt war. In letzter Zeit wurde eine Anzahl von Tumor-Kohlehydratantigenen, die durch monoklonale Antikörper definiert sind, chemisch sehr gut charakterisiert. Die Verwendung dieser Antigene als Immunogene zur Unterdrückung des Tumorwachstums ist nun möglich.
Chemisch definierte Krebs-Glykoproteine selbst könnten zur aktiven Immunisierung von Krebspatienten verwendet werden, um deren endogene Immunreaktion gegen Tumore zu aktivieren. Ein Glykoprotein, TCA, isoliert aus einem Lewis-Lungenkarzinom mit T- und Tn-Antigenen, wurde verwendet, um Krebspatienten zu immunisieren, was zu einer teilweisen oder vollständigen Rückbildung bei 33/71 Krebspatienten führte (Adachi, M., et al., Krebsforschung 4:1-4, 1984; Adachi, M., et al., Krebsforschung, zur Veröffentlichung freigegeben).
In Krebsforschung 48 4361-67 (1988), H. Takahashi, R. Metoki und S. Hakomori, wurden in einer Veröffentlichung nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung IgG&sub3;-Antikörper diskutiert. Es wird ein IgM-isotypischer Antikörper gegen das Tn-Antigen erwähnt. Dieser Antikörper soll nicht fähig sein, antikörperabhängige Zytotoxizität in vitro oder Tumorwachstum in vivo hervorzurufen.
Gemäß der Erfindung wird ein Hybridom geschaffen, das einen monoklonalen Antikörper mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften abscheidet:
(1) IgM-Isotyp;
(2) reagiert mit Sialyl-Tn-Antigen und nicht mit T-Antigen, und
(3) epitopische Spezifität zu NeuAcα2T6GalNAcα1TO-Ser/Thr und nicht zu NeuAcα2T6GalNAcβ1TO-Ser/Thr.
Gemäß der Erfindung wird ein Hybridom geschaffen, das einen monoklonalen Antikörper mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften abscheidet:
(1) IgG&sub1;-Isotyp;
(2) reagiert mit Sialyl-Tn-Antigen und nicht mit T- oder Tn- Antigen;
(3) epitopische Spezifität zu NeuAcα2T6GalNAcα1TO-Ser/Thr und nicht zu NeuAcα2T6GalNAcβ1TO-Ser/Thr.
(4) kann leicht in Fab- oder (Fab)&sub2;-Fragmente umgewandelt werden.
Gemäß der Erfindung wird ein monoklonaler Antikörper mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften geschaffen:
(1) IgM-Isotyp;
(2) reagiert mit Sialyl-Tn-Antigen und nicht mit T-Antigen; und
(3)epitopische Spezifität zu NeuAcα2T6GalNAcα1TO-Ser/Thr und nicht zu NeuAcα2T6GalNAcß1T O-Ser/Thr.
Gemäß der Erfindung wird ein monoklonaler Antikörper mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften geschaffen:
(1) IgG&sub1;-Isotyp;
(2) reagiert mit Sialyl-Tn-Antigen und nicht mit T- oder Tn- Antigen;
(3) epitopische Spezifität zu NeuAcα2T6GalNAcα1TO-Ser/Thr und nicht zu NeuAcα2T6GalNAcβ1TO-Ser/Thr.
(4) kann leicht in Fab- oder (Fab)&sub2;-Fragmente umgewandelt werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Figur 1 zeigt Gelfiltrationsmuster, welche Tn-Aktivität von Glykoprotein zeigen, das am Kulturenüberstand eines menschlichen Karzinoms LU-65 mit squamösen Zellen vorhanden ist.
Diagramm A: Gelfiltrationsmuster auf Sepharose CL-48 des gesamten Glykoproteins im Überstand von LU-65-Zellen und die geprüfte Tn-Aktivität, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ordinate zeigt die Bindung des Anti-Tn-Antikörpers NCC-LU-81, und die Abszisse zeigt die Fraktionsnummer. Die durch den durchgängigen Strich angezeigten Fraktionen (Fraktionen 7-15) wurden weiter auf Sephacryl S200 gereinigt (siehe unten).
Diagramm B: Gelfiltrationsmuster auf Sephacryl S200 der Tn-Aktivität in den im Diagramm A dargestellten Fraktionen 7- 15. Die linke Ordinate zeigt die UV-Absorption bei 280 nm, und die rechte Ordinate zeigt die Bindungsaktivität des Tn-Antikörpers. Die Abszisse zeigt die Fraktionsnummer und das Gesamtvolumen des Eluants. Offene Kreise zeigen Tn-Antikörperaktivität; geschlossene Kreise zeigen die Proteinkonzentration, welche durch Absorption bei 280 nm angezeigt wird.
Figur 2 zeigt Graphen, welche die Ergebnisse von Assays zur Bestimmung der Hemmung von BM-8-Antikörperbindung an ein Festphasen-Tn-Antigen durch Monosaccharide und Glykoside darstellen. Die Ordinaten zeigen die Bindungsaktivität des Antikörpers, und die Abszisse zeigt die Zuckerkonzentration in mM.
Diagramm A: Hemmung der Antikörperbindung durch Monosaccharide. Geschlossene Quadrate zeigen GlcNAc- oder Glc- Hemmung für BM-8-Bindung; geschlossene Kreise zeigen GalNAc- Hemmung für BM-8-Bindung; offene Quadrate zeigen die Gal-Hemmung für BM-8-Bindung.
Diagramm B: Hemmung der BM-8-Antikörperbindung an ein Festphasen-Tn-Antigen durch P-Nitrophenyl α- und β-GalNAc. Geschlossene Kreise zeigen die Hemmung durch P-Nitrophenyl α- GalNAc; offene Dreiecke zeigen P-Nitrophenyl-β-GalNAc; offene Quadrate zeigen GalNAc (Mischung aus α und β); geschlossene Quadrate zeigen GlcNAc.
Diagramm C: Hemmung von LU-81-Antikörperbindung an ein Festphasen-Tn-Antigen durch P-Nitrophenyl α- und β-GlcNAc. Offene Kreise zeigen P-Nitrophenyl α-GalNAc; geschlossene Dreiecke zeigen GalNAc (Mischung aus α und β); offene Dreiecke zeigen P-Nitrophenyl-β-GalNAc; offene Quadrate zeigen GlcNAc.
Figur 3 ist ein Graph, der die Fähigkeit von BM-8-Antikörper zur Bindung an verschiedene Zellinien darstellt. Zellinien werden durch die einzelnen Säulen dargestellt. Die Antikörperbindung wird als Prozentaktivität von QG-56 (100 Prozent) ausgedrückt.
Figur 4 ist ein Graph, der die antikörperabhängige Zytotoxizität verschiedener Zelleitungen hervorgerufen durch BM-8- Antikörper darstellt. Vier Diagramme zeigen die Tumorzellenlyse, die bei verschiedenen Effektor-an-Targetzellen-Verhältnissen auftritt.
Figur 5 besteht aus zwei Graphen, welche die Reaktivität des monoklonalen Antikörpers BM-3 auf Festphasen-OSM zeigen.
Diagramm A: Reaktivität von BM-3 mit OSM bei verschiedenen Konzentrationen des BM-3-Überstands.
Diagramm B: Reaktivität von BM-3 mit verschiedenen Konzentrationen von OSM.
Die Reaktivität mit nativem OSM wird durch geschlossene Kreise angezeigt, und die Reaktivität mit OSM, welches mit Neuraminidasen behandelt wurde, wird durch offene Kreise angezeigt.
Figur 6 besteht aus zwei Graphen, welche die Hemmung der BM-3-Reaktivität mit OSM mit unterschiedlichen Sacchariden zeigt.
Diagramm A: Hemmung von BM-3 mit der Monosaccharid-Fucose (offene Kreise) Galaktose (offene Quadrate), Glucose (geschlossene Dreiecke), N-Acetylglukosamin (offene Dreiecke), N- Acetylgalaktosamin (geschlossene Quadrate), und N-Acetylneuraminsäure (geschlossene Kreise)
Diagramm B: Hemmung von BM-3 mit den Disacchariden Neu- Acc2T6GalNAccl-Serin (geschlossene Quadrate) und Laktose (geschlossene Kreise).
Figur 7 zeigt die Immunoperoxidase-Färbung von formalinfixierten, paraffineingebetteten bösartigen Tumoren unter Verwendung des monoklonalen BM-3-Antikörpers.
Diagramm A: BM-3-Reaktivität mit einem Lungen-Adenokarzinom, wobei die normale Lunge nicht eingefärbt ist (X90).
Diagramm B: Färbung eines gemäßigt differenzierten Darm- Adenokarzinoms, wobei die umgebenden normalen Zellen und das Stroma nicht reaktiv sind.
Diagramm C: Muköses Magenkarzinom mit heterologer BM-3- Färbung der Krebszellen (X90).
Diagramm D: BM-3-Färbung eines Azinus-Lungen-Adenokarzinoms; normales Lungengewebe ist nicht eingefärbt.
Figur 8 zeigt die Immunoperoxidase-Färbung von formalinfixierten, paraffineingebetteten bösartigen Tumoren unter Verwendung des monoklonalen BM-4-Antikörpers.
Diagramm A: BM-4-Reaktivität mit einem Lungen-Adenokarzinom (X40).
Diagramm B: BM-4-Färbung eines mukösen Magenkarzinoms (X90).
Diagramm C: BM-4-Reaktivität mit einem gemäßigt differenzierten Darm-Adenokarzinoms, wobei die normalen Darmzellen und das Stroma nicht reaktiv sind (X90).

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe mit den unten festgelegten Bedeutungen verwendet.
Muzinartiges Glykoprotein -- Protein mit hohem Molekulargewicht (Mr > 10&sup6;) mit einem hohen Grad an O-verbundener Glykosylation bei Serin- oder Threoninrückständen. Muzinartige Glykoproteine werden weiter polymerisiert durch S-S-abhängige Bindung und stellen die wichtigsten Teile der Epithelabscheidungen dar.
Kernstruktur muzinartigen Glykoproteins -- Basiskohlenhydratstruktur ohne periphere Substitution, direkt verbunden mit dem Proteinanteil eines Muzinglykoproteins. Die häufigste und wichtigste Struktur dieser Art ist dieselbe wie das T- Antigen (siehe unten). Alle folgenden Kernstrukturen -- T, Tn und Sialyl-Tn -- kommen in allen Arten von Muzinglykoproteinen unabhängig von der Art (verschiedene tierische und menschliche Arten) vor.
T-Antigen -- Ein Disaccharid bestehend aus je einem Mol Gal und GalNAc mit folgender Struktur: Galß1-3GalNAc. Das reduzierende Ende GalNAc ist mit der Hydroxylgruppe eines Serin- oder Threoninrückstandes einer Polypeptidkette α-verbunden.
Tn-Antigen -- Ein Antigen, dessen innerster α-GalNAc- Rückstand direkt mit der Hydroxylgruppe eines Serin- oder Threoninrückstands einer Polypeptidkette verbunden ist. Da das α-GalNAc ein Teil des Blutgruppe-A-Antigens ist, können Anti- Tn-Antikörper eine Kreuzreaktion mit dem A-Antigen aufweisen.
Sialyl-Tn-Antigen -- Ein Antigen, dessen sechste Hydroxylgruppe des α-GalNAc-Rückstands des Tn-Antigens durch Sialinsäure substituiert wird, d.h. NeuAcα2T6GalNAc α-verbunden mit der Hydroxylgruppe eines Serin- oder Threoninrückstandes einer Polypeptidkette.
Die Strukturen des T-Antigens, Tn-Antigens und Sialyl-Tn- Antigens sind in der untenstehenden Tabelle dargestellt.
Antigen Struktur
Tn GalNAcα1TO-Ser oder Thr
Sialyl-Tn NeuAcα2T6GalNAcα1TO-Ser oder Thr
T Galβ1T3GalNAcα1TO-Ser oder Thr

Immunogenpräparation

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das zur Erlangung des Antikörpers verwendete Immunogen eine Kernstruktur eines muzinartigen Glykoproteins wie oben beschrieben. Im besonderen kann jede Kernstruktur eines muzinartigen Glykoproteins verwendet werden, solange das Glykoprotein ein genügend hohes Molekulargewicht für die Immunogenität aufweist und im selben Grad glykosiliert ist wie das Muzin, d.h. mehr als 50% des Gesamtgewichts ist glykosiliert.
Beispiele für Kernstrukturen muzinartigen Glykoproteins, die als Immunogene in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen das T-Antigen, das Tn-Antigen, und das Sialyl-Tn-Antigen sowie tierische Muzine, die diese Antigene enthalten. Andere Kernstrukturen wie z.B. Galβ1T3[GlcNAcβ1- > 4]GalNAc, GlcNAcß1T4GalNAc und Galβ1T3[Galβ1T4GlcNAcβ1- > 4]GalNAc können ebenso verwendet werden.
Besonders bevorzugte Immunogene sind das T-Antigen, das Tn-Antigen und das Sialyl-Tn-Antigen sowie tierische Muzine, die diese Antigene enthalten.
Die Immunogene können durch enzymatische oder chemische Veränderung eines muzinartigen Glykoproteins erlangt werden, um eine Kernstruktur freizulegen, oder durch Isolierung von Muzinen, die Kernstrukturen aufweisen. Diese Muzine kommen bei einigen Tierarten vor.
Beispiele von Arten enzymatischer Veränderungen, die zur Freilegung der Kernstruktur verschiedener muzinartiger Glykoproteine verwendet werden können, umfassen die Eliminierung des am Ende sitzenden α2-3-Sialylrückstands durch Grippeviren- Sialidase oder die vollständige Eliminierung aller Sialylrückstände durch Clostridium perfringense-Sialidase. Enzymatische Veränderungen können auch die Behandlung mit β-Galaktosidase (vorzugsweise von Charonia lampas), α-Fucosidase und N-Acetylhexasaminidase umfassen. Die enzymatische Hydrolyse von Muzin- Glykoprotein wird von Hirohashi et al. beschrieben (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82: 7039-7043, 1985)
Beispiele für chemische Reaktionen, die zur Freilegung der Kernstrukturen muzinartiger Glykoproteine verwendet werden können, umfassen Periodatoxidation gefolgt von einer Reduktion mit Natriumborhydrid und einer Behandlung mit schwacher Säure. Dieser Vorgang wird Smith-Abbau genannt (Spiro, G., Methods Enzymol., 28:3-43, 1972). Diese chemische Behandlung eliminiert nichtreduzierende Enden von Kohlehydratrückständen außer Sialinsäure, welche durch die oben beschriebene Sialidasebehandlung eliminiert werden kann.
Beispiele für Muzine, die von Tieren isoliert wurden und als Immunogene verwendet werden können, umfassen das aus dem Unterkiefer des Schafes gewonnene Muzin (OSM), in welchem 90% der Kohlehydratketten aus dem Sialyl-Tn-Antigen bestehen, und das aus dem Unterkiefer des Rindes gewonnene Muzin (BSM), in welchem 50% der Kohlehydratketten aus dem Sialyl-Tn-Antigen und 30% der Kohlehydratketten aus dem Tn-Antigen bestehen und andere nicht identifizierte Rückstände vorhanden sind. Nicht alle Strukturen des tierischen Muzinglykoproteins sind bisher geklärt; neuartige Strukturen wie z.B. der Trihexosamin-Kern (GlcNAcβ1-)4[GlcNAcβ1T3]GalNAc), der kürzlich im Magenmuzin des Schafes gefunden wurde (Hounsell, E. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 92: 1143-1159, 1979), können sehr wohl auch in einigen Kernstrukturen des menschlichen Krebsmuzins vorhanden sein, und wenn dies der Fall ist, können sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das systematische Wissen über die Muzinkernstrukturen verschiedener Tierarten ist zwar unvollständig, doch wenn die Muzinkernstrukturen bekannt werden, ist ein Fachmann leicht in der Lage, zu bestimmen, ob sie für die vorliegende Erfindung hilfreich sind.
Darüberhinaus könnten bei weiterer systematischer Anwendung mit verschiedenen Tierarten gemeinsame Strukturen als Immunogene gefunden werden. Verfahren zur Klärung solcher Strukturen umfassen die Alkalihydrolyse bei Vorhandensein von Borhydrid (β-Eliminierung), die Methylationsanalyse und die Massenspektrometrie der einzelnen freigesetzten Oligosaccharide. Diese Verfahren sind in einem kürzlich veröffentlichten Abschnitt zusammengefaßt (Hakomori, S., und Kannagi, R. 1986, Im Handbuch experimenteller Immunologie, Band I, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Seiten 9.1-9.39).
Die Immunogene werden unter Anwendung herkömmlicher Verfahren isoliert und gereinigt.
Zum Beispiel können die muzinartigen Glykoproteine, die zur Herstellung von Kernstrukturen enzymatisch oder chemisch modifiziert werden, durch Gelfiltration durch Sepharose 4B oder Sephacryl 200S isoliert werden.
Das isolierte Glykoprotein wird dann durch die oben beschriebenen Verfahren enzymatisch oder chemisch modifiziert, um die Kernstruktur freizulegen, und die Kernstruktur wird zur Verwendung als Immunogen folgendermaßen gereinigt: Das modifizierte Muzin kann durch Gelfiltration durch Sepharose 4B oder Sephacryl 200 getrennt werden. Hochdruckchromatographie an einer synthetischen Molekularfiltersäule (Schnellflüssigkeitschromatographie; Pharmacia) hilft ebenso beim Trennen enzymatisch oder chemisch modifizierter Muzine. Als Immunogen muß das modifizierte Muzin jedoch nicht gereinigt werden. Das Vorhandensein einer geringen Menge an nichtmodifiziertem Muzin hat bei der Verwendung als Immunogen gemäß der vorliegenden Erfindung keine schädlichen Auswirkungen. Desweiteren ist die Modifizierung für gewöhnlich quantitativ, wenn entsprechende Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.
Muzine, die von Tierarten abgeleitet werden und bereits Glykoprotein in der Form einer Kernstruktur enthalten, werden durch herkömmliche Verfahren erhalten, z.B. durch Gelfiltration durch Sepharose 4B, Sephacryl 200 oder FPLC, wie oben beschrieben.
Das dermaßen abgeleitete tierische Muzin kann zur Verwendung als Immunogen durch dieselben Verfahren, wie z.B. herkömmliche Gelfiltration oder FPLC wie oben beschrieben, noch weiter gereinigt werden. Die Reinheit des Immunogens ist jedoch nicht ausschlaggebend.
Wie bereits erwähnt, sind besonders bevorzugte Antigene das T-Antigen, das Tn-Antigen und das Sialyl-Tn-Antigen.
Das T-Antigen kann durch Sialidasebehandlung (Hirohashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7039-7043, 1985) verschiedener Glykoproteine bereitet werden, welche Oligosaccharide mit der unten gezeigten Kernstruktur aufweisen:
Typische Beispiele für solche Glykoproteine sind das Unterkiefermuzin des Rindes und das menschliche Erythrozyten- Glykophorin. Das Rinderunterkiefermuzin kann aus den Unterkieferdrüsen des Rindes durch ein Verfahren gewonnen werden, das von Nisizawa, K. und Pigman, W. (Arch. Oral Biol., 1: 161, 1959) beschrieben wird. Das Schafsunterkiefermuzin kann durch ein ähnliches Verfahren wie kürzlich beschrieben (Tettamanti, G., und Pigman, W., Arch. Biochem. Biophys., 124: 45-50, 1968) bereitet werden.
Menschliches Erythrozytenglykophorin kann von menschlichen Erythrozytenmembranen durch das zuerst von Marchesi, V.T. und Andrews, E.D. (Science, 174: 1247-1248, 1971) beschriebene Verfahren erhalten werden.
Das Rinderunterkiefermuzin und das menschliche Erythrozytenglykoprotein sind gekennzeichnet durch deren starke Reaktivität mit Erdnußlektin. Es kann jedoch auch jede andere Art von Glykoprotein mit der oben beschriebenen Struktur zur Erlangung des T-Antigens verwendet werden.
Ob ein Glykoprotein die obige Struktur aufweist, kann durch die Affinitätschromatographie mit einer Erdnußlektinsäule (Carter, W.G., und Sharon, N., Arch. Biochem. Biophys., 180: 570-582, 1977) oder durch das Immunblotting von Glykoproteinen mit einem Anti-T-Antikörper (erhältlich bei ChemBiomed, Edmonston, Alberta, Kanada) bestimmt werden.
Die native Form des Schafsunterkiefermuzins enthält einen T-Antigenkern ohne Sialidase-Behandlung; daher kann es ohne weitere Modifizierung als T-Antigen-Immunogen verwendet werden.
Die native Form des Schafsunterkiefermuzins wird aus der Unterkieferdrüse des Schafs ohne weitere Reinigung gewonnen; es wird mit dem oben beschriebenen Verfahren (Tettamanti und Pigman, Supra) direkt entnommen und gereinigt.
Das Tn-Antigen kann aus jeder Art von Glykoprotein durch aufeinanderfolgende Behandlung mit Exoglykosidasen und β-Galaktosidase hergestellt werden; die β-Galaktosidase muß jedoch fähig sein, die an das α-GalNAc gebundene β1-3Galaktosyl- Struktur zu spalten.
Beispiele geeigneter Exoglykosidasen und β-Galaktosidasen umfassen die Sialidase von Clostridium perfringense (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und die β-Galaktosidase von Charonia lampas (seikagaku Kogyo, Tokyo, Japan) (Hirohashi et al., Supra).
Die aufeinanderfolgende Behandlung mit Exoglykosidase und β-Galaktosidase wird folgendermaßen ausgeführt. Eine stabile Muzinlösung in einem geeigneten Puffer mit 0,02% eines geeigneten Detergens wird mit Enzym gemischt und bei 37ºC für einige Stunden bis zu 18 Stunden inkubiert. Sehr oft werden 50 mM Acetatpuffer, pH 4,5-5,0, enthaltend 0,02-0,05% Triton X-100 oder NP40, verwendet.
Das derart behandelte Glykoprotein wird dann für die Verwendung als Immunogen durch Gelfiltration mit einer geeigneten Säule wie oben beschrieben gereinigt. Die Reinigung des Immunogens ist nicht sehr wichtig, da das Vorhandensein von unmodifiziertem Muzin nicht die Immunreaktion mit dem veränderten Muzin in vivo beeinflußt.
Darüberhinaus enthalten einige tierische Muzine, wie z.B. das Schafsunterkiefermuzin, in ihrer nativen Form einen großen Anteil an Tn-Antigen. Daher ist das native Schafsunterkiefermuzin ein ausgezeichnetes Immunogen, um eine Tn-Immunantwort hervorzurufen.
Das Schafsunterkiefermuzin kann wie oben beschrieben erhalten werden.
Ein anderes wirkungsvolles Tn-Immunogen ist ein natives Tn-Glykoprotein, das von der menschlichen Karzinomzellinie LU- 65 mit squamösen Zellen abgeschieden wird. Die Zellen werden in einer Suspension kultiviert, und das gespendete Kulturmedium wird lyophilisiert, um sein Volumen auf 1/50 seines ursprünglichen Volumens zu verringern. Das konzentrierte gespendete Medium wird dann bei 4ºC extensiv gegen phosphatgepufferte Salzlösung dialysiert, welche 0,01% Natriumazid enthält. Das dialysierte Material wird dann auf Sepharose 4B gegeben und gelfiltriert. Das Hohlraumvolumen wird gesammelt, weiter konzentriert und auf Sephacryl 200 nochmals chromatographiert (siehe Figur 1). Die Glykoproteinfraktion im Hohlraumvolumen wird als Immunogen verwendet. Das gespendete Kulturmedium jener Zellinien, die eine hohe Reaktivität mit Anti- Tn-Antikörper zeigen, wie z.B. die menschliche squamöse Lungenkarzinomzellinie QG56 und die menschlichen Hepatomzellinien HUH-7 (siehe Figur 5) können auch zur Bereitung des Tn-Antigens verwendet werden.
Die Verteilung des Sialyl-Tn-Antigens ist ziemlich eingeschränkt. Eine Quelle des Sialyl-Tn-Antigens jedoch, die in der vorliegenden Erfindung hilfreich ist, sind die Überstände der squamösen Lungenkarzinomzellinien QG 56 und LU-65 (Hirohashi S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7039-7043, 1985).
Eine zweite Quelle ist wiederum das Schafsunterkiefermuzin, das eine hohe Dichte an Sialyl-Tn enthält.
Um Sialyl-Tn-Antigen vom Überstand in einer Form zu erhalten, die als Immunogen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, werden die verschiedenen oben beschriebenen Zellinien nach bekannten Verfahren kultiviert. Die Überstände werden zur Erlangung von Sialyl-Tn-Antigen mit demselben Verfahren behandelt wie mit dem oben beschriebenen zur Erlangung von Tn-Antigen. Alle Verfahren müssen jedoch innerhalb einer begrenzten Zeit und bei niedrigen Temperaturen (4ºC) beendet werden, da die Sialylbindung instabil ist.
Ein typisches Beispiel zur Präparation eines Muzins von einem Kulturüberstand wird im Beispiel 1 unten beschrieben.
Schafsunterkiefermuzin wird aus der Schafsunterkieferdrüse gewonnen und mit Hilfe des Verfahrens von Tettamanti und Pigman (supra) gereinigt.
Die Kohlehydratepitope T, Tn und Sialyl-Tn können wie in Figur 12 dargestellt chemisch synthetisiert und kovalent an synthetische oder natürliche Träger wie z.B. Polylysin, menschliches Serumalbumin oder hoch verzweigte synthetische Trägermoleküle basierend auf der T-Butoxycarbonyl β-Alanin- Einheit gebunden werden, wie von Tam (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5409-5413, 1988) beschrieben. Eine genaue Beschreibung der chemischen Synthese des Kohlehydratepitops Tn wird in Beispiel 4 gegeben. Die Synthese von Sialyl-Tn kann leicht enzymatisch oder chemisch durch den Zusatz von Sialyl-Rückstand erfolgen.

Immunisierungsverfahren

Die Immunogene, die wie oben beschrieben bereitet wurden, werden für die Immunisierung wie folgt behandelt.
Das Glykoprotein-Antigen (z.B. 4,0 mg) wird in destilliertem Wasser (z.B. 4 ml) gelöst, gut mit einer entsprechenden Menge säurebehandeltem Salmonella minnesota (z.B. 16 mg) gemischt und lyophilisiert. Die getrocknete Mixtur wird in einem geeigneten Volumen (z.B. 4,0 ml) eines entsprechenden Trägers (z.B. 140 mM NaCl enthaltend 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,0) suspendiert, und aliquote Mengen zu ungefähr je 100 ul (d.h. 100 ug Muzin und 400 ug Bakterien) werden intravenös injiziert.
Unabhängig von der Art des Muzinantigens ist der Immunisierungsablauf ungefähr der selbe.
Die Immunisierung kann auch mit einem vollständigen Freundschen Adjuvans anstelle der Adsorption auf Bakterien durchgeführt werden, und das Verhältnis zwischen der Muzinmenge und der Menge der Salmonella minnesota kann variiert werden. Die besten Ergebnisse können beobachtet werden, wenn Salmonella minnesota mit Essigsäure behandelt wird, wie kürzlich beschrieben (Young, W.W., et al., J. Exp. Med., 150: 1008-1019, 1979)
Der für die Immunisierung verwendete Wirt kann eine Maus oder eine Ratte jeder Art oder irgend ein anderes Tier sein, dessen Splenozyten für die Bereitung von Hybridomae geeignet sind, d.h. empfänglich für eine Zellverschmelzung mit HAT- sensitiven Myelomzellinien, um stabile Hybridomae hervorzubringen.
Der Immunisierungsablauf hängt von der Empfänglichkeit des Wirttieres für die Muzinimmunisierung ab, doch das oben beschriebene Protokoll gilt für Mäuse. Auch andere Bedingungen können angewandt werden. Der geübte Fachmann kann geeignete Immunisierungsabläufe bestimmen.
Ein geeigneter Immunisierungsablauf für Balb/c-Mäuse ist zum Beispiel das intravenöse Injizieren des Immunogenpräparats in die Schwanzvene einmal pro Woche über 5 Wochen hinweg und dann, nach einer einmonatigen Unterbrechung, die Wiederholungsimpfung mit dem Immunogenpräparat.
Die Menge des dem Wirt verabreichten Immunogenpräparats hängt vom Molekulargewicht des Muzins, der Exposition des Kohlehydratepitops und der Neuheit und der Dichte des Epitops ab, welches mit den muzinartigen Glykoproteinen assoziiert ist. Der in die Mäuse injizierte Bereich von Glykoprotein beträgt 3- 5 ug beschichtet auf 30-50 ug Salmonella minnesota suspendiert in 100 ul Salzlösung, intravenös injiziert in jede einzelne Maus, deren Körpergewicht zwischen 100-150 g liegt.
Bei Verwendung eines vollständigen Freundschen Adjuvans werden ungefähr 20 ug Glykoprotein in 500 ul Salzlösung mit 500 ul vollständigem Freundschem Adjuvans emulgiert, und ungefähr 200 ul wird subkutan an mehreren Stellen (ungefähr 50 ul pro Stelle) injiziert.
Ähnliche Mengen Antigen, entweder beschichtet auf Salmonella minnesota oder gemischt mit vollständigem Freundschem Adjuvans, werden für andere Wirte wie z.B. Ratten, Hamster oder Meerschweinchen verwendet, und einige Male größere Mengen werden für andere Wirte wie z.B. Hasen verwendet. Es ist nicht notwendig, die Menge des Antigens proportional zum Gewicht des Tieres zu erhöhen.
Die Immunisierung wird so oft wiederholt, bis genügend Antikörper im ganzen Serum erkennbar sind. Die Milzzellen des Wirtes werden entfernt, und die Splenozyten werden mit Hilfe der gut eingeführten Technik (Köhler, G. und Milstein, C., Nature, 256: 495-497, 1975, und Young, W.W. et al., supra) mit den HAT-sensitiven Myelomzellen verschmolzen.
HAT-sensitive Myelomzellen können zum Beispiel NS-1, SP-1 oder SP-2 sein, doch es kann auch jede andere Art HAT-sensitiver Myelomzellen verwendet werden. Gelegentlich können Hybridomae nach Verschmelzung der Wirtsplenozyten mit Myelomzellen gewonnen werden, obwohl keine Antikörper im Wirtserum zu erkennen waren. Daher ist es nicht unbedingt erforderlich, Antikörper vor der Zellverschmelzung zu entdecken. Verschmelzungen werden für gewöhnlich in Polyethylenglykol durchgeführt, wie von Young et al. (supra) beschrieben.
Eine bevorzugte Myelomzellinie zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist SP-2.
Die verschmolzenen Zellen werden in Platten mit 96 Vertiefungen kultiviert, bis Miniklons gebildet werden. Es ist wichtig, die Splenozyten innerhalb von 48-72 Stunden nach der letzten Wiederholungsimpfung zu verwenden und sie mit gut proliferierenden Myelomzellen zu verschmelzen, um eine große Anzahl an überlebenden verschmolzenen Zellen zum Züchten zu erhalten. Feuchtigkeit und CO&sub2;-Konzentration im Inkubator müssen zu Beginn der Kultivierung der verschmolzenen Zellen sorgfältig überwacht werden.
Nährzellen sind zum Züchten der verschmolzenen Zellen gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht notwendig.
Ein Fachmann kann sehr einfach die geeigneten Kulturbedingungen bestimmen.
Nach einer entsprechenden Kulturperiode werden Hybridomae, die Antikörper abscheiden, welche mit der Glykoproteinkernstruktur reagieren, die zur Immunisierung verwendet wurde, durch eine limitierte Verdünnung, d.h. durch Verdünnung bis zu einem Punkt, an dem weniger als eine Zelle pro neuer Kultur zu erwarten ist, und anschließender Beschichtung in die Vertiefungen geklont und untergeklont.
Im allgemeinen wird jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen mit Muzinglykoprotein beschichtet, das die als Immunogen verwendete Kernstruktur enthält; die Beschichtung erfolgt durch die Inkubation einer jeden einzelnen Vertiefung mit einer Glykoproteinlösung in PBS, d.h. 5-10 ug/50 ul/Vertiefung wird hinzugefügt und über Nacht inkubiert. Die Glykoproteinlösung wird entfernt, gewaschen und weiter inkubiert mit Rinderserumalbumin (10 ug/50 ul/Vertiefung), um die Platte zu blockieren, bevor sie zum Aussondern der Antikörper verwendet wird. Dieses Verfahren wird von Hirohashi et al. (supra) beschrieben.
Die Hybridomae, welche die Antikörper abscheiden, die mit den bestimmten Antigenen reagieren, werden folgendermaßen gefiltert. Antikörper, die an eine antikörperbeschichtete Vertiefung gebunden sind, werden normalerweise durch Sekundärantikörper (Antimaus-IgM und IgG-Geiβ- oder Hasenantikörper) entdeckt, gefolgt von einem ¹²&sup5;I-markierten Protein A, wie anfänglich von Young et al. (supra) beschrieben. Das Verfahren ist noch empfindlicher als verfügbare ELISA-Analysen, obwohl eine ELISA auch verwendet werden kann. ELISAs können durch die Verwendung der im Handel erhältlichen automatischen Lesegeräte und die ELISA-Sätze bequemer verarbeitet werden.
Monoklonale Antikörper, die von Hybridomae abgeschieden werden, die solcherart gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert wurden, können in Mengen produziert werden durch die Züchtung großer Stapel von Hybridomzellkulturen und das Reinigen der Antikörper vom Überstand oder durch das Injizieren der Hybridomlinie in Mäuse zur Stimulierung der Produktion von Aszitesflüssigkeit. Beide Verfahren sind im Fachbereich gut bekannt.
Verfahren zur Produktion monoklonaler Antikörper in Mengen gemäß der vorliegenden Erfindung werden in Young et al. (supra) beschrieben.
Die Hybridomae, die gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert wurden, können in großen Stapeln in Suspensionkulturen oder, noch bequemer, in einem Glasfaserbehälter gezüchtet werden, in welchen die Zellen in großer Dichte gepackt und worin sie gezüchtet werden, und wo die Antikörper in das Kulturmedium diffundieren können.
Die monoklonalen Antikörper können durch bekannte Verfahren gereinigt werden, wie zum Beispiel durch die Affinitätstrennung unter Verwendung von Protein A oder durch die Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf umkehrphasenalkyliertem Silicagel oder mit einer künstlichen Polystyrengel-Filtrationssäule.
Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren können Hybridomae, die monoklonale Antikörper abscheiden, produziert werden, die qualitativ mindestens ebenso gut sind wie jene, die durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden, oder die sogar besser sind als bekannte, auf menschliche Krebsantigene spezifische monoklonale Antikörper, da die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung keine unerwünschte Kreuzreaktion mit normalen Glykoproteinen zeigen, die eine normale Zuckersequenz mit vollständiger glykosilierter Struktur besitzen.
Die bevorzugten monoklonalen Antikörper sind gemäß der Erfindung BM-3 und BM-4. Die Hybridomae, welche diese monoklonalen Antikörper abscheiden und als Hybridom BM-3 und BM-4 bezeichnet werden, wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, deponiert und haben die ATCC- Deponienummern HB-9653 bzw. HB-9654.
Zwei Hybridomae, NCC-LU-35 und -81, welche monoklonale IgM-Antikörper gegen das Tn-Antigen abscheiden, wurden kürzlich nachgewiesen. Diese Antikörper wurden nach Immunisierung mit Lungenkarzinom LU-65 mit squamösen Zellen (Hirohashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7029-7043, 1985) erhalten. Die zellwachstumshemmenden und zytotoxischen Eigenschaften von BM-8 unterscheiden diesen Antikörper klar von NCC-LU-35 und -81.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der monoklonale Antikörper BM-3 durch das Hybridom BM-3 abgeschieden und weist folgende kennzeichnende Merkmale auf:
(1) IgM-Isotyp
(2) Reagiert mit Sialyl-Tn-Antigen und nicht mit T-Antigen, und
(3) epitopische Spezifität zu NeuAcα2T6GalNAcα1TO- Ser/Thr und nicht zu NeuAcα2T6GalNAcβ1TO-Ser/Thr.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der monoklonale Antikörper BM-4 durch das Hybridom BM-4 abgeschieden und weist folgende kennzeichnende Merkmale auf:
(1) IgG&sub1;-Isotyp
(2) Reagiert mit Sialyl-Tn-Antigen und nicht mit T- oder Tn-Antigen, und
(3) epitopische Spezifität zu NeuAcα2T6GalNAcα1TO- Ser/Thr und nicht zu NeuAcα2T6GalNAcβ1TO-Ser/Thr, und
(4) kann leicht in Fab- oder (Fab)&sub2;-Fragmente umgewandelt werden.

Bestimmung der Antikörper-Isotypen

Der gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung isolierte Isotyp der monoklonalen Antikörper kann durch herkömmliche Verfahren wie z.B. durch Festphasen-Radioimmunassay unter Verwendung von Antikörpern bestimmt werden, die gegen isotypspezifische Anti-Maus-Antikörper gerichtet sind, welche von verschiedenen Händlern wie z.B. Cappel Laboratories im Handel erhältlich sind.

Bestimmung der Antikörperspezifität

Die Spezifität der gemäß der vorliegenden Erfindung isolierten Antikörper kann auf zahlreiche Arten festgestellt werden, unter anderem auch durch: (1) kompetitive Bindungsassays, (2) Inhibierungsassays, und (3) Bindungsassays zu natürlichen und enzymatisch oder chemisch behandelten muzinartigen Glykoproteinen.

Kompetitive Bindungsassays

Dieser Assay ist ein Festphasen-Radioimmunassay- (RIA) Kompetitivassay. Der Assay schließt die Verwendung der gemäß der vorliegenden Erfindung isolierten Antikörper und eines oder mehrerer Antikörper mit ein, die bekanntermaßen über eine Spezifität zum selben Antigen verfügen, gegen das vermutlich auch die Spezifität des gemäß der vorliegenden Erfindung isolierten monoklonalen Antikörpers gerichtet ist. Weiters müssen die beiden monoklonalen Antikörper verschiedene Isotypen aufweisen oder von unterschiedlicher Spezies sein, so daß sie getrennt voneinander von Sekundär-Antikörpern erkannt werden können, wenn sie gemeinsam vorkommen.
In diesem Assay werden für jeden der beiden monoklonalen Antikörper mit bekannter Spezifität zwei Inkubationen durchgeführt. Im besonderen wird eine Inkubation unter Verwendung von einem der zwei monoklonalen Antikörper in einer konstanten Menge durchgeführt und unter Verwendung zunehmender Mengen des erregenden monoklonalen Antikörpers. Bei der anderen Inkubation werden die Rollen der beiden monoklonalen Antikörper vertauscht. Das heißt, der eine, welcher in konstanter Menge bei der ersten Inkubation verwendet wurde, wird nun in zunehmender Menge in der zweiten Inkubation verwendet, und jener, der in der ersten Inkubation in zunehmender Menge verwendet wurde, wird in der zweiten Inkubation in konstanter Menge verwendet.
Bei jeder Inkubation werden die beiden Antikörper zuerst miteinander vermischt, und dann wird die Mischung der Antikörper mit dem in Frage stehenden Antigen inkubiert. Kurz gesagt werden serielle Dilutionen (ungefähr 12 Dilutionen sind ausreichend) eines Antikörpers (ungefähr 1,5 ug bis 60 Nanogramm) einer Menge von ungefähr 1,5 ug des anderen Antikörpers in 100 ul geeigneten Puffers, z.B. PBS, zugefügt. Das Umgekehrte wird dann gemacht, indem die Rollen der beiden monoklonalen Antikörper vertauscht werden. Das Volumen jeder Mixtur wird dann auf ungefähr 200 ul mit demselben Puffer, z.B. PBS, eingestellt, und aliquote Mengen von ungefähr 100 ul der Mixtur der beiden Antikörper werden über Nacht bei 4ºC in Assayplatten inkubiert, die kurz zuvor mit dem in Frage stehenden Antigen (ungefähr 5 ug/Vertiefung) behandelt und mit 1% BSA in PBS geblockt wurden.
Nach der Inkubation werden die Platten entsprechend oft, z.B. dreimal, mit einem geeigneten Puffer wie z.B. PBS gewaschen, und die Menge der monoklonalen Antikörper, die nach der Erregung noch immer an das Antigen gebunden sind, wird durch die Reaktion mit einem Spezies- oder unterklassenspezifischen Antikörper (z.B. einem Anti-Maus-IgM für ein Maus-IgM oder ein Anti-Maus-IgG&sub3; für ein Maus-IgG&sub3;) bestimmt, gefolgt von der Reaktion mit einer geeignet markierten Probe.
Eine geeignete Reaktionszeit für die Reaktion mit einem spezies- oder unterklassenspezifischen Antikörper sind ungefähr 2 Stunden, und eine geeignete Reaktionstemperatur ist die Raumtemperatur, d.h. 22-25ºC.
Nach der Reaktion werden die Platten entsprechend oft, z.B. dreimal, mit einem geeigneten Puffer wie z.B. PBS gewaschen, und es wird eine geeignete markierte Probe hinzugefügt. Ein Beispiel für eine geeignete Probe wäre ein ¹²&sup5;I- markiertes Protein A. Nach geeigneter Inkubation, z.B. für 1,3 Stunden bei Raumtemperatur, d.h. 22-25ºC, werden die Platten wieder mit einem geeigneten Puffer, z.B. PBS, gewaschen, z.B. 5 mal, und die Menge der Probe wird der Art der verwendeten Markierung entsprechend quantifiziert. Eine ¹²&sup5;I-markierte Probe wird zum Beispiel in einem Gammazähler gezählt.
Wenn die Bindung des monoklonalen Antikörpers, der gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert wurde, an das jeweilige Antigen durch den monoklonalen Antikörper mit der bekannten Spezifität gehemmt wird, ist der monoklonale Antikörper, der gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert wurde, als eine Spezifität zum jeweiligen Antigen habend anzusehen.
Ein Fachmann kann leicht erkennen, daß diese Analyse auch ohne dem zweiten Antikörper, der normalerweise ein Anti-Maus- IgG + IgM ist, durchgeführt werden kann.

Inhibierungsassays

Da die Antikörper, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert wurden, gegen die Glykoproteinkernstrukturen gerichtet sind, kann die Spezifität durch das Prüfen der Fähigkeit verschiedener Monosaccharide und Disaccharide zur Hemmung der Fähigkeit des monoklonalen Antikörpers zur Bindung an das Antigen, gegen welches der monoklonale Antikörper vermutlich gerichtet ist, bestimmt werden.
Die Assays werden durchgeführt, indem der monoklonale Antikörper mit verschiedenen Mono- oder Disacchariden inkubiert wird. Ein geeignetes Molverhältnis zwischen monoklonalem Antikörper und Sacchariden reicht von ungefähr 1:5 bis ungefähr 1:100, und ein geeigneter Puffer ist PBS. Die Inkubation wird bei einer Temperatur und über eine Zeitdauer hinweg durchgeführt, welche für den monoklonalen Antikörper ausreichen, um mit den Sacchariden zu reagieren, z.B. bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Nach der Inkubation werden aliqote Mengen der Mixtur aus monoklonalem Antikörper und Sacchariden entfernt und mit dem Antigen inkubiert, gegen welches der monoklonale Antikörper vermutlich gerichtet ist, und zwar ähnlich wie in der oben beschriebenen Art und Weise. Das heißt, aliquote Mengen der Mixtur werden Vertiefungen hinzugefügt, die kurz zuvor mit dem Antigen beschichtet wurden, und mit BSA in einem geeigneten Puffer wie z.B. PBS geblockt. Geeignete Inkubationsbedingungen mit dem Antigen sind 4ºC über Nacht.
Der Inhibierungseffekt der verschiedenen Saccharide auf die Bindung des monoklonalen Antikörpers an das Antigen wird dann wie oben beschrieben durch den Festphasen-RIA bestimmt.
Ein Fachmann kann sehr leicht geeignete Saccharide bestimmen, die im Inhibierungsexperiment zu verwenden sind.
Zum Beispiel können für monoklonale Antikörper, die vermutlich gegen das Tn-Antigen gerichtet sind, die Monosaccharide GalNAc, GlcNAc, Gal und Glc verwendet werden. Wenn der monoklonale Antikörper tatsächlich auf das Tn-Antigen spezifisch ist, sollte die Bindung des monoklonalen Antikörpers an das Antigen durch GalNAc gehemmt werden, nicht aber durch die anderen drei Monosaccharide.
Desweiteren kann für monoklonale Antikörper, die spezifisch auf das Tn-Antigen sind, das aktuelle Epitop von GalNAc, gegen welches der Antikörper gerichtet ist, durch das Ausführen eines Inhibierungsassays unter Verwendung von P-Nitrophenyl α- D-GalNAc, P-Nitrophenyl β-D-GalNAc und einer Mixtur vom α- und der Mixtur von β-p-Nitrophenyl-Derivaten bestimmt werden.
Wenn der monoklonale Antikörper spezifisch auf das Tn- Antigen ist, wird die Bindung des monoklonalen Antikörpers zum Tn-Antigen durch das α-p-Nitrophenyl-Derivat, nicht aber durch das β-p-Nitrophenyl-Derivat gehemmt werden. Desweiteren wird eine gewisse, jedoch keine völlige Hemmung mit der Mixtur von α- und β-p-Nitrophenyl-Derivaten beobachtet werden.
Wenn, um ein weiteres Beispiel zu nennen, der monoklonale Antikörper gegen das Sialyl-Tn-Antigen gerichtet ist, kann ein Inhibierungsassay unter Verwendung von Monosacchariden, wie z.B. GalNAc und NeuAc, L-Fucose, D-Galaktose, D-Glukose und D- N-Acetylglukosamine durchgeführt werden.
Wenn der Antikörper spezifisch auf das Sialyl-Tn-Antigen ist, sollte die Bindung des Antikörpers zum Antigen durch GalNAc und NeuAc, nicht jedoch durch die anderen Monosaccharide gehemmt werden.
Auf ähnliche Weise sollte das Disaccharid-NeuAcα- 6GalNAcα1-0-Serin die Reaktivität eines monoklonalen Antikörpers hemmen, der spezifisch auf das Sialyl-Tn-Antigen ist, doch Laktose sollte keine Inhibierungsaktivität entwickeln. Der monoklonale Antikörper jedoch, der gegen das Tn gerichtet ist, kann mit der NeuAcα2T6GalNAcβ1T0-Struktur kreuzreagieren und ist daher schwach hemmend durch O-Propyl-Derivate dieser Struktur.

Bindung an behandeltes und unbehandeltes muzinartiges Glykoprotein

Dieser Assay beruht auf der Tatsache, daß bestimmte enzymatische und/oder chemische Behandlungen verschiedener Muzine Antigenstrukturen entweder freisetzen oder zerstören. Der Assay wird wie folgt durchgeführt.
Muzinartiges Glykoprotein wird auf einer Plastikplatte mit 96 Vertiefungen durch Inkubieren von 10 ug/50 ul PBS/Vertiefung über Nacht beschichtet. Das auf die Plastikoberfläche adsorbierte Glykoprotein wird getrennt jeweils mit Sialidase, β-Galaktosidase und (α-N-Acetylgalaktosaminidase behandelt oder unbehandelt gelassen. Die Antikörperbindung derart behandelter oder unbehandelter Festphasen-Glykoproteine wird dann miteinander verglichen. Die durch Antikörper BM-3 definierte Sialyl-Tn-Aktivität kann in eine durch BM-8 definierte Tn- Aktivität umgewandelt werden, wenn das Sialyl-Tn-Antigen, wie z.B. jenes vom Schafskiefermuzin, adsorbiert auf eine Plastikoberfläche, mit Sialidase behandelt wird. Das Glykophorin A der menschlichen Erythroyzten, welches keine T- oder Tn-Aktivität hat, kann in ein T- oder Tn-Antigen umgewandelt werden, wenn es auf eine Plastikoberfläche adsorbiert und mit Sialidase (zur Umwandlung in ein T-Antigen) behandelt wird, oder durch nachfolgende Behandlung mit Sialidase und β- Galaktosidase (zur Umwandlung in ein Tn-Antigen). Ein solches Vorgehen wird von Hirohashi (supra) beschrieben.
Ein Fachmann kann leicht geeignete muzinartige Glykoproteine und enzymatische und chemische Behandlungen bestimmen, die für die Assays hilfreich wären.
Wenn zum Beispiel der monoklonale Antikörper spezifisch auf Sialyl-Tn-Antigen ist, dann kann ein Vergleich der Reaktivität des Antikörpers mit OSM vor und nach verschiedenen enzymatischen Degradationen durchgeführt werden. Im besonderen bestehen ungefähr 90% der Kohlehydratketten auf nativem OSM aus Sialyl-Tn-Antigen. Das Antigen kann jedoch durch enzymatische Behandlung mit Sialidase zerstört werden. Daher würde ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch auf das Sialyl-Tn- Antigen ist, mit nativem OSM, aber nicht mit sialidasebehandeltem OSM reagieren.
Darüberhinaus haben die betreffenden Erfinder herausgefunden, daß Glykophorin A in seiner nativen Form kein T-, Tn- oder Sialyl-Tn-Antigen enthält. Das desialylierte Glykophorin A setzt zwar das T-Antigen frei, nicht aber das Tn-Antigen. Daher sollte ein monoklonaler Antikörper, der sich an das T-Antigen bindet, mit sialyliertem Glykophorin A, nicht aber mit nativem Glykophorin A reagieren.
Desweiteren können der Glykophorin-Antikörper und das sialylierte Derivat zum Erkennen des gegen das Sialyl-Tn-Antigen gerichteten monoklonalen Antikörpers verwendet werden. Die Umwandlung von Glykophorin A zur Freisetzung des Sialyl-Tn- Antigens ist schwierig. Wenn natives Glykophorin A mit Grippeviren-Sialidase oder Newcastle-disease-virus-Sialidase behandelt wird, welche Sialyl 2T3Gal, nicht aber Sialyl 2T6GalNAc spaltet, würde die Kernstruktur Galβ1T3[NeuAcα1T6]GalNAc enthalten. Diese Struktur kann weiter in das Sialyl-Tn-Antigen umgewandelt werden durch Eliminierung des Gal-Rückstandes mit β-Galaktosidase. Dies ist in der Praxis jedoch sehr schwierig, weil β-Galaktosidase nicht wirkungsvoll eliminiert wird, wenn eine NeuAcα2T6-verbundene Struktur in einer benachbarten Position vorhanden ist.

BEISPIELE

Die Erfindung wird nun durch Bezug auf bestimmte Beispiele beschrieben. Dies kann jedoch nicht so ausgelegt werden, daß die Erfindung auf die Beispiele beschränkt ist.
Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich alle Prozentzahlen, Verhältniszahlen usw. auf das Gewicht.

BEISPIEL 1 (komparativ)

Herstellung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen Tn-Antigen

Präparierung von Tn-Antigen

Das Tn-Antigen wurde vom Kulturenüberstand von sqamösen menschlichen Lungenkarzinomzellen LU-65 (erhältlich bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD) durch Gelfiltration wie von Hirohashi et al. (Hirohashi, S. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82: 7039-7043, 1985) beschrieben präpariert.
Im besonderen wurden die Zellen in RPMI-Medium gezüchtet, dem 15% Kalbsfötusserum zugesetzt war. (Die Zellen können aber auch in anderen Medien gezüchtet werden, wie z.B. in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, und unter bestimmten Bedingungen können Zellen in chemisch definierten Medien ohne Zusatz von Serum gezüchtet werden.)
Dann wurden 500 ml des Überstandes, welcher durch Zentrifugieren zum Trennen der Zelltrümmer gewonnen wurde, zu 1/10 des ursprünglichen Volumens lyophilisiert, gegen destilliertes Wasser dialysiert und wieder lyophilisiert. Der Rückstand wurde in 10 ml PBS aufgelöst; ein kleiner Teil des Rückstandes konnte in PBS nicht aufgelöst werden. Aliquote Mengen von 5 ml wurden auf eine Säule von Sepharose-CL4B aufgetragen, zuvor equilibriert mit PBS zusammen mit 0,1% Natriumazid, und die Elution wurde mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) durchgeführt, d.h. 25-30 mM NaH&sub2;PO&sub4;-Na&sub2;HPO&sub4; in 0,9% NaCl bei pH 7,0. Fraktionen von 5,0 mF wurden gesammelt, und aliquote Mengen von 100 ul von jeder Fraktion wurden in jede Vertiefung der Plastikplatten mit 96 Vertiefungen (Falcon, Microtest III, flexible Assayplatte, Falcon Labware, Oxnard, CA) gegeben und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert, um eine wirksame Adsorption des muzinartigen Glykoproteins auf die Plastikplatte zu erzielen. Jede Platte wurde dreimal mit PBS gewaschen, und 150 ul 1%-iger BSA in PBS wurden jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platten wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (25ºC) gehalten, um das Blockieren der unbedeckten Plastikoberfläche zu ermöglichen, d.h. um eine nicht-spezifische Adsorption des Primärantikörpers auf die unbedeckte Plastikoberfläche zu verhindern. Jede Platte wurde wiederum dreimal mit PBS gewaschen, und 100 ul Anti-Tn-Antikörper, NCC-LU-81 (1:1000 verdünnt) wurden jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platten wurden 18 Stunden lang bei 4ºC gehalten, um die Bildung von Antigen-Antikörperkomplexen zu ermöglichen. Die Platten wurden wieder dreimal mit PBS gewaschen, und 50 ul eines Sekundärantikörpers (Hase-Anti-Maus-IgM und IgG) verdünnt mit 1:1000 mit 1% BSA in PBS wurden jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platten wurden 2 Stunden lang bei 25ºC inkubiert und dreimal mit PBS gewaschen. Die Sekundärantikörper wurden bei Cappel Laboratories (Cochranville, PA) gekauft. Schließlich wurden jeder Vertiefung 50 ul ¹²&sup5;I-markiertes Protein A mit einer ungefähren Aktivität von 10&sup5; cpm zugefügt, und die Platten wurden 1-1/2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen, und die Radioaktivität wurde in jeder einzelnen Vertiefung mit einem Gammazähler gezählt, um zu bestimmen, welche Fraktionen Tn-Aktivität aufwiesen. Die Fraktionen mit Tn-Aktivität (Fraktionen 8-15) (Diagramm A, Figur 1) wurden gesammelt und auf 1/5 des ursprünglichen Volumens lyophilisiert, und die Probe von 1,0 ml wurde auf eine Säule von Sephacryl S-200 (1,2 x 110 cm) aufgetragen. Die Probe wurde mit PBS, pH 7,0, eluiert, und Fraktionen von 2,0 ml wurden gesammelt. Aliquote Mengen von 100 ul jeder Fraktion wurden durch UV-Absorption bei 280 nm auf Proteinkonzentration analysiert, und, wie oben beschrieben, für die von der Sepharose abgeleiteten Fraktionen durch Festphasen-Radioimmunassay (RIA) auf Tn-Aktivität geprüft. Nur die hochaktiven Fraktionen am Hohlraumvolumen (V&sub0;) wurden genommen (siehe Diagramm B, Fig. 1), ausgiebig gegen destilliertes Wasser dialysiert, lyophilisiert, gewogen und für die Immunisierung verwendet.

Immunisierung und Nachweis der monoklonalen Antikörper

Das wie oben beschrieben isolierte Glykoprotein-Tn-Antigen mit hohem Molekulargewicht wurde in destilliertem Wasser in einer Menge von 4,0 mg Protein/4 ml Wasser aufgelöst, und 16 mg säurebehandeltes, durch herkömmliche Verfahren erhaltenes Salmonella minnesota wurde hinzugefügt. Die Mixtur wurde 1 Stunde lang bei 57ºC gründlich gemischt und dann lyophilisiert. Die lyophilisierte Probe wurde dann in 4,0 ml PBS suspendiert, und aliquote Mengen von 100 ul (d.h. 100 ug Glykoprotein und 400 ug Bakterien) wurden intravenös durch die Schwanzvene in jede der fünf Balb/c-Mäuse injiziert. Die Injektion wurde einmal pro Woche fünf Wochen lang durchgeführt, und nach einer Unterbrechung von einem Monat wurde den Mäusen die Wiederholungsimpfung mit 200 ul Antigensuspension (d.h. 200 ug Glykoprotein und 800 ug Bakterien) verabreicht. Drei Tage nach der Wiederholungsimpfung wurden die Tiere getötet, die Milzzellen entnommen und die Splenozyten mit Mausmyelom-SP-2- Zellen durch herkömmliche Verfahren verschmolzen (Hirohashi, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82: 7039-7043, 1985, und Fukushi, Y. et al., J. Biol. Chem., 259: 4681-4685, 1984).
Antikörperabscheidende Hybridomae, die mit dem Tn-Antigen reagieren, welches für die anfängliche Immunisierung verwendet wurde und nicht mit nativem Glykophorin A von menschlichen Erythrozyten reagiert, wurden durch limitierte Verdünnung in Platten mit 96 Vertiefungen (Falcon, Microtest III) geklont und subgeklont.
Positive Reaktivität mit Tn-Antigen und negative Reaktivität mit nativem Glykophorin A von menschlichen Erythrozyten wurde durch Beschichtung von Plastikplatten mit dem Tn-Antigen oder Glykophorin A durch Hinzufügen von 50 ul PBS mit 5 ug Antigen in jede Vertiefung und Inkubation bei Raumtemperatur (22-25ºC) für 18-24 Stunden getestet. Die antigen-beschichtete Platte wurde mit 1% Rinderserumalbumin in PBS geblockt, gefolgt von Waschen mit PBS. Danach wurden 50 ul Hybridom-Überstand hinzugefügt und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Jede Vertiefung wurde dann mit PBS gewaschen, gefolgt von einer Reaktion mit Anti-Maus-IgG + IgM und ¹²&sup5;I-markiertem Protein A.
Das native Glykophorin A von menschlichen Erythrozyten wurde bei Sigma Chemical Co. gekauft und mit dem von Marchesi und Andrews beschriebenen Verfahren (Science, 174: 1247, 1971) präpariert.
Hybridomae, die eine positive Reaktivität mit Tn-Antigen und eine negative Reaktivität mit nativem Glykophorin A von menschlichen Erythrozyten aufweisen, wurden maßstäblich vergrößert, und die Reaktivität des Tn-Antigens und des Glykophorin A wurde nochmals überprüft, und zusätzlich wurde die Reaktivität mit Blutgruppe-A-Glykolipiden durch Festphasen- Radioimmunassay wie von Hirohashi et al. (supra) und Fukushi et al. (supra) beschrieben überprüft. Das Verfahren wird weiter beschrieben von S. Hakomori und R. Kannagi (J. Natl. Cancer Inst., 71:231-257, 1983).
Sieben Klone zeigten Reaktivität mit Tn-Antigen. Von diesen wurde ein Hybridom, welches positive Reaktivität mit Tn- Antigen und negative Reaktivität mit Glykophorin A und Blutgruppe-A-Glykolipiden aufwies, ausgewählt und weiter geklont.
Diese geklonte Zellinie wurde verwendet, um eine maβstäblich vergrößerte Kultur in RPMI-Medium mit 15% Kalbsfötusserum herzustellen, von dem Überstände durch Zentrifugieren geerntet wurden. Die geklonten Zellinien wurden auch verwendet, um Aszitesflüssigkeit durch herkömmliche Verfahren (Young et al., J. Exp. Med., 150: 1008, 1979) herzustellen.
Das Hybridom und der davon hergestellte monoklonale Antikörper wurden BM-8 genannt.

Bestimmung des Antikörperisotyps

Der Antikörperisotyp wurde durch einen Festphasen-Radioimmunassay unter Verwendung verschiedener monoklonaler Antikörper gegen Maus-IgM, IgG&sub1;, IgG2a, IgG2b und IgG&sub3; gemäß den herkömmlichen Verfahren (Young et al., supra und Fukushi et al., supra) bestimmt.
Die Ergebnisse zeigten, daß der Isotyp des Antikörpers BM- 8 IgG2a ist, der Isotyp des Antikörpers BM-3 IgM ist und der Isotyp des Antikörpers BM-4 IgG&sub1; ist.

Bestimmung der Antikörperspezifität

Die Spezifität von BM-8 wurde bestimmt durch i) kompetitive Bindung von BM-8 an Tn-Antigen mit NCC-LU-81 ("LU-81"), welches ein Anti-Tn-Antikörper ist (Hirohashi, S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7039-7043, 1985); ii) Hemmung der Antikörperbindung mit verschiedenen Monosacchariden, und iii) Hemmung der Antikörperbindung mit P-Nitrophenyl α- oder β-D-N- Acetyl-Galaktosaminid. Jedes einzelne Verfahren wird unten beschrieben.
Kompetitiver Bindungsassay: ein Festphasen-RIA-Kompetitivassay wurde entwickelt, der das Inkubieren eines monoklonalen Antikörpers in einer konstanten Menge und das Erregen eines monoklonalen Antikörpers in zunehmenden Mengen umfaßte. LU-81 und BM-8 wurden vor der Inkubation mit Tn-Antigen wie folgt zusammengemischt. In einer Platte wurden serielle Diluationen von LU-81 (1,5 ug bis 60 ng) 100 ul (1,5 ug) BM-8 (12 Vertiefungen) zugefügt; umgekehrt wurden in einer anderen Platte serielle Diluationen von BM-8 (1,5 ug bis 15 ng) 100 ul (1,5 ug) LU-81 (12 Vertiefungen) zugefügt. Das Volumen der einzelnen Vertiefungen wurde dann auf 200 ul mit PBS eingestellt, und aliquote Mengen von 100 ul der Mixtur der zwei Antikörper wurden über Nacht in Platten mit 96 Vertiefungen (Falcon, Microtest III, Flexible Assayplatte) inkubiert, welche zuvor mit Tn-Antigen (5 ug/Vertiefung) beschichtet und mit 1% BSA in PBS geblockt wurden, und zwar durch Verfahren, die analog zu jenen waren, die oben offenbart wurden. Nach der Inkubation über Nacht bei 4ºC wurden die Platten dreimal mit PBS gewaschen. Die Menge von LU-81 oder BM-8, die nach der Erregung noch an das Tn-Antigen gebunden war, wurde wie folgt bestimmt. Der gebundene Antikörper wurde über 2 Stunden bei Raumtemperatur mit unterartenspezifischen Antikörpern zur Reaktion gebracht -- Hasen-Anti-Maus-IgM für LU-81 und Hasen-Anti-Maus- IgG&sub3; für BM-8. Nach dreimaligem Waschen der Platten mit PBS wurden ungefähr 10&sup5; cpm (50 ul) ¹²&sup5;I-markiertes Protein A mit 1% BSA in PBS hinzugefügt, und nach 1,3 Stunden wurden die Platten fünfmal mit PBS gewaschen und die in den Vertiefungen verbliebene Radioaktivität in einem Gammazähler gezählt.
Die Ergebnisse zeigten, daß die Bindung von BM-8 durch LU- 81 kompetitiv gehemmt wurde, was darauf hinweist, daß BM-8 ein Anti-Tn-Antikörper ist.

Hemmung von Antikörperbindung durch Monosaccharide:

Zuerst wurden 200 ul einer 500 mM-Lösung der folgenden Monosaccharide -- GalNAc, GlcNAc, Gal oder Glc (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) -- mit PBS auf 0,24 mM doppelverdünnt, und 100 ul jeder Monosaccharidlösung wurden 100 ul BM-8 hinzugefügt und bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 1 Stunde wurden aliquote Mengen von 100 ul der monoklonale-Antikörper/Monosaccharide- Mixturen genommen und über Nacht bei 4ºC in Platten mit 96 Vertiefungen (Falcon, Microtest III, Flexible Assayplatte) inkubiert, welche zuvor mit Tn-Antigen beschichtet und mit 1% BSA in PBS wie oben beschrieben geblockt wurden. Der Hemmeffekt der verschiedenen Monosaccharide auf die Bindung von BM-8 an das Tn-Antigen wurde durch Festphasen-RIA wie oben beschrieben bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Figur 2A dargestellt. In Figur 2A stellen die geschlossenen Quadrate Mixturen dar, die GlcNAc oder Glc enthalten; die geschlossenen Kreise stellen Mixturen dar, die GalNAc enthalten; und die offenen Quadrate stellen Mixturen dar, die Gal enthalten.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Bindung des BM-8-Antikörpers an das Tn-Antigen durch GalNAc wirksam gehemmt wird, nicht aber durch GlcNAc, Glc oder Gal.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Spezifität von BM-8 eher direkt gegen GalNAc als gegen GlcNAc, Gal oder Glc gerichtet ist.

Hemmung der Antikörperbindung durch P-Nitrophenyl α-D- oder β- D-GalNAc:

Um festzustellen, ob das GalNAc, welches an BM-8 bindet, ein α- oder β-GalNAc (Sigma Co.) ist, wurde die Hemmaktivität durch α- und β-p-Nitrophenylderivate wie oben beschrieben bestimmt: p-Nitrophenyl α- oder β-GalNAc wurde in 200 ul Dioxan/PBS, 50/50, V/V aufgelöst und in Serie von 75 mM auf 0,03 mM in PBS verdünnt. 100 ul dieser Lösung wurden dann 100 ul BM-8 oder LU-81 hinzugefügt und bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 1 Stunde wurden 100 ul der monoklonale-Antikörper/Monosaccharide-Mixtur genommen und in Platten inkubiert, die zuvor mit Tn-Antigen beschichtet und mit 1% BSA in PBS wie oben beschrieben geblockt wurden, und der Hemmeffekt der α- und β-p-Nitrophenyl-Glykoside auf die Antikörperbindung an das Tn-Antigen wurde durch Festphasen-RIA wie oben beschrieben bestimmt. 100 ul Dioxan/PBS (50/50, V/V) wurden mit 100 ul BM-8 und LU-81 zur Kontrolle für die denaturierende Wirkung des Dioxans auf die Proteine inkubiert.
Die Ergebnisse sind in den Figuren 2B und 2C dargestellt, in denen das Diagramm B die Ergebnisse für BM-8 und das Diagramm C die Ergebnisse für LU-81 darstellt. Im Diagramm B stellen die geschlossenen Kreise die Mixturen dar, welche β- GalNAc enthalten; die offenen Quadrate stellen Mixturen dar, die sowohl α- als auch β-GalNAc enthalten; und die geschlossenen Quadrate stellen Mixturen dar, die GlcNAc enthalten. Im Diagramm C stellen die offenen Kreise Mixturen dar, die α- GalNAc enthalten; die offenen Dreiecke stellen Mixturen dar, die β-GalNAc enthalten; die geschlossenen Dreiecke stellen Mixturen dar, die α- und β-GalNAc enthalten; und die geschlossenen Quadrate stellen Mixturen dar, die GlcNAc enthalten.
Wie aus den in Figur 2B und Figur 2C dargestellten Ergebnissen erkennbar ist, werden sowohl der BM-8-Antikörper der vorliegenden Erfindung als auch der LU-81-Antikörper in der Bindung zum Tn-Antigen durch P-Nitrophenol-α-D-GalNAc gehemmt, nicht aber durch P-Nitrophenol-β-D-GalNAc. Diese Ergebnisse zeigen, daß die durch Antikörper BM-8 definierte Epitopenstruktur eher eine durch die α-Konfiguration freigesetzte Struktur als eine durch die β-Konfiguration freigesetzte Struktur von GalNAc ist.

Reaktivität des monoklonalen Antikörpers BM-8 mit verschiedenen Zellinien

Die Antikörperaktivität von BM-8 zu verschiedenen Zellinien wurde wie von Fukushi et al. (Fukushi, Y. et al., J. Biol. Chem., 259: 4681-4685, 1984) beschrieben bestimmt, und die Reaktivität wurde als Prozentsatz der höchsten Reaktivität ausgedrückt, die bei squamösen menschlichen Lungenkarzinomzellen QG 56 auftritt. Die getesteten Zellinien waren menschliche Fibroblasten BRASCH, Erythroleukämie K 562, menschliches Eierstockkarzinom 78-2, Lungenkrebszellinie LU-65 (Hirohashi, S., et al. J. Natl. Cancer Inst., 69: 565-568, 1982), Magenkrebszellinien der MKN-Serie (Motayama, T. et al., Acta Med. Biol., 27: 49-63, 1979), Lungenkrebszellinien QG 56 und PC-9 (Oboshi, S. und Sekiguchi, M. [in Japanisch] Tampakushitsu- Kakusan-Koso (Protein-Nukleinsäure-Enzyme), 23: 697-711, 1978), menschliches Eierstockkarzinom SKOV 3 (Fogh, J. et al., J. Natl. Cancer Inst., 59: 221-226, 1977), Monozytenleukämiezellinie THP 1 (Tsuchiya, S. et al., Int. J. Cancer, 26: 171- 176, 1980), Darmkrebszellinie SW 403, menschliche Darmkrebszellinie HRT 10, menschliche Brustkarzinomzellinie BT 20, menschliche Sarkomzellen umgeformt durch SV-40 Virus VA-13, menschliche Fibrosarkomzellinie HT 1080, menschliche metastatische Pankreas-Adenokarzinomzellinie ASPC 1, menschliche Pankreas-Primäradenokarzinomzellinie BXPC 3, menschliche Hepatomzellinie HUH-7, menschliche Endometriumkrebszellinie ISHIKAWA, menschliche embryonale Lungenzellinie HEL 299, promyelogene Leukämiezellinie HL 60, menschliche Fibroblasten WI-38 und menschliche fetale Lungendiploidzellen IMR 90 (die letzten beiden wurden bei American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852, gekauft). Die Zellinien LU-65, PC-9, HL 60, K 562 und THP 1 wurden in Suspension in RPMI 1640 ergänzt mit 10% FCS gezüchtet. Alle anderen Zellinien wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-MEM ergänzt mit 10% FCS gezüchtet. Abgelöste Zellen wurden gewaschen und wieder in PBS suspendiert. Ungefähr 5 x 10&sup4; Zellen jeder Zellinie wurden pro Vertiefung in Falcon Microtest III-Platten gesät, welche mit 0,5 mg/ml Polylysin (Sigma Chemical Co.) in PBS durch Inkubieren bei Raumtemperatur (25ºC) über 18 Stunden (Fukushi et al., J. Biol. Chem., 259: 4681, 1984; J. Biol. Chem. 259: 10511, 1984) vorbeschichtet wurden. Die Platten wurden 5 Minuten lang bei 500 x g zentrifugiert, der Überstand wurde vorsichtig entfernt, und die Zellen wurden mit 0,1% Glutaraldehyd (Sigma Chemical, St. Louis, MO) in PBS eine Stunde lang bei Raumtemperatur fixiert. Die Platten wurden wieder 5 Minuten lang bei 500 x g zentrifugiert und vorsichtig zweimal mit PBS gewaschen. Die Platten wurden dann bei -70ºC bis zur Verwendung gelagert.
Die Bindung von BM-8 an verschiedene Zellinien wurde durch Festphasen-RIA wie folgt bestimmt. Die mit Zellen beschichteten Platten wurden mit 5% BSA in PBS 2 Stunden lang bei Raumtemperatur geblockt; dann wurden 100 ul BM-8 (2,5 ug) in PBS, pH 7,0, in die Vertiefungen gegeben und dort 2 Stunden lang bei 4ºC belassen. Die Platten wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und mit 50 ul Sekundärantikörper, Hase-Anti-Maus-IgG verdünnt 1:1000 mit 1% BSA in PBS, pH 7,0, bei Raumtemperatur 2 Stunden lang inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal mit PBS gewaschen, und es wurden ungefähr 10&sup5; cpm (50ul) IPA (¹²&sup5;I- markiertes Protein A) in PBS mit 1% BSA hinzugefügt, und nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Platten fünfmal mit PBS gewaschen, und die verbliebene Radioaktiviät in den Vertiefungen wurde in einem Szintillationszähler gezählt.
Die Ergebnisse der BM-8-Antikörperbindung an verschiedene Zellinien sind in Figur 3 dargestellt. Von den verschiedenen getesteten Linien zeigt die squamöse menschliche Karzinomzellinie QG 56 die höchste Reaktivität, und die menschlichen Fibroblasten Bresch und WI-38 zeigten überhaupt keine Reaktivität. Es ist wichtig, anzumerken, daß die Mehrheit der menschlichen Krebszellinien unterschiedlich starke Reaktivität zeigte.
Im besonderen zeigen die Ergebnisse klar, daß einige Zellinien (z.B. MKN 45, QG 56) eine starke Reaktiviät zeigten, während normale Fibroblasten (z.B. BRASCH und WI-38) und einige Tumorzellinien (z.B. HEL 299, IMR 90) keine Reaktivität zeigten.

Reinigung des monoklonalen Antikörpers BM-8

Der monoklonale Antikörper BM-8 wurde von Aszitesflüssigkeit durch Affinitätschromatographie auf einer Siliziumgel-Protein-A-Säule gereinigt. Der Antikörper wurde mit 3,0 M Natriumthiozyanat eluiert. Die gemäß dem Festphasen-Radioimmunassay bestimmten Fraktionen (1,0 ml) mit Aktivität gegen Tn-Antigen wurden gesammelt, gegen PBS dialysiert, und Protein wurde durch das Lesen von A&sub2;&sub8;&sub0; quantifiziert. Der Kulturenüberstand wurde zu einem Hundertstel seines Volumens durch Ultrafiltrierung mit Amicon-Konzentrationsgeräten (Amicon, Boston, MA) konzentriert. Der konzentrierte Überstand wurde auf einer Umkehrphasen-C18- Silicagelsäule gereinigt, und IGM- und TGG-Fraktionen wurden erhalten.

Antikörperabhängiger Zytotoxizitätsassay

Ein 4-stündiger &sup5;¹Cr-Freisetzungstest wurde verwendet, um die antikörperabhängige Zytotoxizität zu bestimmen, wie sie z.B. in Mischell & Shiigi, Ausgewählte Verfahren in der Zellulärimmunologie, W.H. Freeman & Co, San Francisco, 1980, beschrieben sind. Periphere Blutlymphozyten von zwei gesunden menschlichen Spendern wurden in Ficoll-Hypaque getrennt, um Effektorzellen zu schaffen. Die Verhältnisse zwischen Effektor- und Targetzellen betrugen 100:1, 50:1, 25:1 und 12,5:1.
Die Targetzellen waren die Zellinien K 562, LU-65, WI-38, BRASCH, MKN-45, SKOV 3, QG 56, REL 299, HUH 7 und BXPC 3; alle diese sind oben beschrieben. Die Targetzellen (10&sup6;) wurden durch Inkubieren in PBS mit 100 uCi von &sup5;¹Cr eine Stunde lang bei 37ºC markiert; danach wurden die Zellen dreimal gewaschen und wieder in RPMI-Medium suspendiert. Die markierten Targetzellen (5 x 10³) in 15 ul Medium wurden in die einzelnen Vertiefungen gegeben, und eine verschiedene Anzahl an Effektorzellen (5 x 10&sup5;, 2,5 x 10&sup5;, 1,25 x 10&sup5;, und 6,25 x 10&sup4;) pro Vertiefung wurde hinzugefügt. Die Mixturen wurden 4 Stunden lang inkubiert; danach wurden die Platten bei 500 x g. zentrifugiert. Die Überstände wurden entfernt, und die Radioaktivität wurde in 125-ul-Proben in einem Gammazähler gemessen. Pro Gruppe gab es drei Wiederholungsversuche; spontane Freisetzung wurde als das von den Targetzellen zum Medium freigesetzte cpm definiert, das weder Antikörpern noch Lymphozyten ausgesetzt ist, und die vollkommene Freisetzung wurde als Anzahl der Zählungen definiert, die von den Targetzellen freigesetzt wurden, verdünnt durch Zusatz von 2,0% Triton x-100 am Ende des Assays. Der Prozentsatz der Zytotoxizität wurde berechnet als:
experimentelle Freisetzung - spontane Freisetzung x 100 gesamte Freisetzung - spontane Freisetzung
Die von BM-8 hervorgerufene antikörperabhängige Zytotoxizität der verschiedenen Targetzellinien ist in Figur 4 dargestellt. Die menschliche Erythroleukämiezellinie K 562 und das sqamöse menschliche Lungenkarzinom LU-65 sind jene zwei Zellinien, die eine bemerkenswerte Suszeptibilität für die durch den BM-8-Antikörper hervorgerufene antikörperabhängige Zytotoxizität zeigten. Im Gegensatz dazu wiesen die menschlichen Fibroblasten BRASCH und WT-38 und die menschliche Erythroleukämie HEL 299 keine Suszeptibilität für BM-2- abhängige Zytotoxizität auf. Das squamöse menschliche Lungenkarzinom QG 56 und die menschliche Magenkrebszellinie MKN-45 hatten eine relativ geringe Suszeptibilität für die BM-8- antikörperabhängige Zytotoxizität, obwohl diese Zellinien die stärkste Bindungsaktivität zum selben Antikörper aufwiesen.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß der BM-8-Antikörper eine klare Aktivierung von zytotoxischen Zellen zeigt, die gegen einige Tumorzellen gerichtet sind. Die suszeptibilität von Tumorzellen für die antikörperabhängige Zytotoxizität schwankt jedoch sehr und hat keine quantitative Korrelation mit Antigenexpression.

Immunhistologie verschiedener Gewebeabschnitte

Die immunhistologische Färbungsfähigkeit des monoklonalen Antikörpers BM-8 wurde wie folgt bestimmt.
Sowohl gefrorene als auch paraffineingebettete Gewebe durch chirurgische Eingriffe gewonnen. Die Gewebe wurden in OCT-Präparat (ein in der Immunhistologie weit verbreitetes patentiertes Präparat, hergestellt von Tissue-Tek II Division, Miles Laboratories, Naperville, Illinois) eingebettet, in trockenem Eis-Azeton gefroren und in einer Revco-Kühlkammer bei -80ºC bis zur Verwendung gelagert. Gefrorene Abschnitte (4-5 um dick) wurden mit einem Kryostat präpariert, auf Objektivglas 30 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet, 10 Minuten bei 4ºC in Azeton fixiert und bei 4ºC mit PBS gewaschen. Gewebeabschnitte (5-7 um dick) wurden auch von formalinfixierten, paraffineingebetteten Proben nach herkömmlichen Verfahren präpariert. Die Abschnitte wurden 5 Minuten lang bei 4ºC deparaffiniert, in klassiertem Ethanol dehydriert und bei 4ºC mit PBS gewaschen. Sowohl die gefrorenen Abschnitte als auch die paraffineingebetteten Abschnitte wurden dann mit 100%-igem Methanol, das 0,03% Wasserstoffperoxid enthält, 30 Minuten lang bei Raumtemperatur behandelt, um die endogene Peroxidase zu blocken. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Abschnitte geblockt, d.h. die endogene Peroxidase wurde inaktiviert, durch 30-minütige Inkubation mit gewöhnlichem Pferdeserum bei Raumtemperatur. Danach wurden die Abschnitte dreimal mit PBS gewaschen, mit Primärantikörperlösung (BM-8 Kulturenüberstand; Antikörperkonzentration, 50 ug/ml) über Nacht bei 4ºC in einer Feuchtkammer inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Abschnitte mit dem biotinylierten zweiten Antikörper, 1:100 verdünnt (biotinyliertes Pferde-Anti-Maus-IGG, Vector Lab, Inc., Burlingame, CA), eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer Feuchtkammer inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Abschnitte mit einer 1:100 pro Volumen verdünnten Lösung von vorgeformtem avidin-biotinyliertem Peroxidasekomplex (Vector Lab, Inc., Burlingame, CA) eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer Feuchtkammer inkubiert. Nach dreimaligem Spülen mit PBS und 50 mM Tris/HCl-Puffer (pH 7,6) wurden die Abschnitte in 50 mM Tris/HCI-Puffer, pH 7,6, mit 0,05% 3-3'- Diaminobenzidin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 0,03% Hydrogenperoxidase 10 Minuten lang inkubiert, gefolgt von Gegenfärbung in Hematoxylin. Die Abschnitte wurden dann in klassiertem Ethanol, Xylen dehydriert und montiert.
Das Vorkommen positiver Färbung in verschiedenen Krebsarten und normalen Geweben durch den monoklonalen Antikörper BM-8 wird in Tabelle 1 zusammengefaßt. TABELLE 1. Verteilung von Tn-Antigen definiert durch den Antikörper BM-8 in verschiedenen menschlichen Krebsarten und normalem Gewebe. Gewebe Positiv Negativ Prozent Magen 7(1)a Darm Cb N 2(2)c Lunge Brust Melanom Eierstock GESAMT a Anzahl der gefrorenen Proben in Klammern b C = Krebs, N = normales Gewebe c nur Becherzellen sind positiv
Die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich, daß das antikörper-BM-8-definierende Tn-Antigen ein hohes Auftreten positiver Färbung bei Magen-, Darm-, Lungen- und Brustkrebs aufwies. Ein geringes Auftreten positiver Färbung bei normalem Darm und normaler Brust wird auch gezeigt, obwohl die Intensität der Färbung sehr gering war.

BEISPIEL 2

Herstellung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper zum Sialyl-Tn-Antigen

Schafsunterkiefermuzin (OSM) wurde als Quelle des Sialyl-Tn-Antigens verwendet. Ungefähr 90% der Kohlenhydratkette auf OSM besteht aus dem Sialyl-Tn-Antigen. OSM wurde aus den Schafsunterkieferdrüsen durch herkömmliche Verfahren isoliert. (Tettamanti, G. und Pigman, W. Arch. Biochem. Biophys., 124: 45-50, 1968).
Kurz gesagt wurde ein wässriger Extrakt aus Unterkieferdrüsen bei saurem pH (z.B. 3,5) ausgefällt. Dies wird ein Muzinklumpen genannt. Der Muzinklumpen wurde zentrifugiert, in Wasser gelöst, der pH-Wert auf neutral eingestellt, und eine Fraktionsethanolausfällung in Natriumazetat durchgeführt.
Das dermaßen isolierte OSM wurde in gleicher Weise wie für die Immunogenkomposition verwendet.

Immunisierung und Nachweis monoklonaler Antikörper

Balb/b-Mäuse wurde wie im Beispiel 1 beschrieben immunisiert.
Die Milzzellen wurden entfernt und Splenozyten mit Mausmyelom-SP-2-Zellen durch herkömmliche Verfahren wie im Beispiel 1 beschrieben verschmolzen.
Auf selektiven Medien gezüchtete Hybridomae wurden für monoklonale Antikörperreaktivität mit dem oben beschriebenen OSM, desialyliertem OSM, Rinderunterkiefermuzin (BSM) (ungefähr 50% der Kohlehydratketten von BSM bestehen aus Sialyl-Tn- Antigen) und Glykophorin A durch Verfahren ausgesondert, welche denen entsprechen, die im Beispiel 1 beschrieben wurden. Rinderunterkiefermuzin (BSM) und Glykophorin A wurden bei der Fa. Sigma Chemical in St. Louis, Missouri, gekauft. OSM wurde desialyliert durch Behandlung mit 0,1 Einheit/ml Neurominodase von Clostridium Perfringens Typ X (Sigma) unter Verwendung herkömmlicher Verfahren. (Magnani, J.L. et al., J. Biol. Chem., 257: 14365, 1982 und Fukushi et al., J. Biol. Chem.,259: 10511, 1984)
Ungefähr 22 Hybridomae wurden gefunden, die monoklonale Antikörper abschieden, welche eine positive Reaktion mit OSM zeigten.
Diese Hybridomae wurden maßstäblich vergrößert, und die Reaktivität der monoklonalen Antikörper wurde mit OSM, desialyliertem OSM, BSM und Glykophorin A nochmals überprüft.
Zwei Hybridomae, die monoklonale Antikörper abschieden, welche starke Reaktivität mit OSM, aber schwache Reaktivität mit BSM und keine Reaktivität mit Glykophorin A oder sialidasebehandeltem OSM zeigten, wurden nochmals geklont und für weitere Studien verwendet.
Die davon hergestellten Hybridomae und monoklonalen Antikörper wurden BM-3 und BM-4 genannt.

Bestimmung der Antikörper-Isotypen

Die Antikörper-Isotypen wurden durch Festphasen- Radioimmunassay wie im Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, daß der BM-3-Antikörper vom IgM-Isotyp ist, und daß der BM-4-Antikörper vom IgG&sub1;-Isotyp ist.

Bestimmung der Antikörperspezifität

Die Spezifität von BM-3 und BM-4 wurde bestimmt durch i) die Reaktivität mit nativem OSM verglichen mit der Reaktivität mit Sialyladase-behandeltem OSM; und ii) durch Hemmung der Antikörperbindung mit verschiedenen Monosacchariden und Disacchariden. Jeder der Vorgänge wird unten beschrieben.

Reaktivität mit nativem und sialidasebehandeltem OSM

Um die Natur des/der Antigens(e), ausgedrückt durch OSM, zu bestimmen, wurde natives OSM und sialidasebehandeltes OSM mit Anti-Tn (vorhanden in der Aszitesflüssigkeit vom monoklonalen Antikörper CA3239) und mit Anti-Tn, welches im Kulturenüberstand des monoklonalen Antikörpers HH8 vorhanden ist (Clausen, H. et al., In: Glykokonjugate, Berichte vom IX. Internationalen Symposium, Lille, Frankreich, S. F49, 1987), zur Reaktion gebracht.
Die Bestimmung wurde durch Festphasen-Radioimmunassay durchgeführt. OSM und sialidase-behandeltes OSM wurden auf eine Platte mit 96 Vertiefungen durch Inkubation bei Raumtemperatur über 18 Stunden beschichtet, mit 1% BSA 2 Stunden lang geblockt, gefolgt von dreimaligem Waschen mit BSA. Primärantikörper (Anti-Tn oder Anti-T HH8 Antikörper) wurde hinzugefügt und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang zur Reaktion gebracht, gefolgt von Waschen mit PBS. Der an das Festphasen- OSM oder das sialidase-behandelte OSM gebundene Antikörper wurde durch einen Sekundärantikörper und ¹²&sup5;I-markiertes Protein A quantifiziert. Das Verfahren wurde in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben (Hirohashi, et al., supra, Fukushi et al., JBC, 259: 4681, 1984; JBC, 259: 10511, 1984; Young et al., J. Exp. Med., 150: 1008, 1979).
Die Ergebnisse zeigten, daß das native OSM eine schwache Reaktivität mit Anti-Tn von CA3239 aufwies; die Reaktivität wurde jedoch nach Sialidasebehandlung enorm gesteigert. Desweiteren wurde keine Reaktivität mit Anti-T von HH8 beobachtet, weder vor noch nach einer Behandlung mit Sialidase.
Diese Reaktivitäten zeigen, daß OSM nicht das T- oder Tn-Antigen ausdrückt, sondern sehr stark das Sialyl-Tn-Antigen ausdrückt.
Die Spezifitäten der monoklonalen Antikörper BM-3 und BM-4 wurden durch Reagieren mit nativem OSM und mit sialidasebehandeltem OSM charakterisiert. Natives OSM enthält Sialyl2-> 6GalNAcα1T0-Ser/Thr als die wichtigste Kohlehydratgruppe, und BM-3 und BM-4 reagierte damit, was darauf hindeutet, daß sowohl BM-3 als auch BM-4 das Sialyl-Tn-Antigen erkennen. Desweiteren verschwand die Reaktivität von BM-3 und BM-4 vollständig bei der Sialidasebehandlung des OSM, bei welcher alle Sialyl-Tn-Gruppen in Tn-Rückstände umgewandelt werden, was darauf hinweist, daß BM-3 und BM-4 nicht mit dem T-Antigen reagieren. Die Behandlung von Sialidase mit OSM wurde auf einer Festphase, adsorbiert auf einer Plastikoberfläche, durchgeführt. Das Verfahren wurde kürzlich von Hirohashi et al. (supra) beschrieben.
Die Ergebnisse für BM-3 sind in Figur 5 dargestellt, wo das Diagramm A die Reaktivität von BM-3 mit OSM bei verschiedenen Konzentrationen des BM-3-Überstands und das Diagramm B die Reaktivität von BM-3 mit verschiedenen Konzentrationen von OSM zeigt. Die geschlossenen Kreise zeigen die Reaktivität mit nativem OSM, und die offenen Kreise zeigen die Reaktivität mit Neuriminidase-(oder Sialidase-)behandeltem OSM.
Die Ergebnisse zeigen, daß der monoklonale Antikörper BM-3 eine Reaktivität mit nativem OSM aufweist, und die Reaktivität wird nach Sialidasebehandlung enorm verringert.
Daher ist der monoklonale Antikörper BM-3 spezifisch auf das Sialyl-Tn-Antigen.
Dasselbe wurde für den monoklönalen Antikörper BM-4 herausgefunden.

Hemmung der BM-3-Antikörperreaktivität durch Mono- und Di- saccharide

Monosaccharidlösungen wurden doppelt verdünnt ausgehend von einer Startkonzentration von 500 mM in einer Reihe von Vertiefungen auf Platten mit 96 Vertiefungen. Jeder Monosaccharidlösung wurde BM-3- oder BM-4-Antikörper hinzugefügt (10-50 ng/Vertiefung), und die Lösung wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Reihe von Plastikvertiefungen auf den Platten mit 96 Vertiefungen wurde mit OSM wie zuvor beschrieben vorbeschichtet (Inkubation von OSM in Salzlösung bei Raumtemperatur über Nacht) und mit BSA vorgewaschen. Die Reaktionsmixtur von Monosaccharid oder Oligosaccharid mit Antikörper wurde auf die OSM-beschichtete Platte übertragen, 2 Stunden lang inkubiert, gefolgt von Waschen mit BSA und Erkennung von Antikörperbindung durch Sekundärantikörper und ¹²&sup5;I-markiertes Protein A, wie zuvor beschrieben. Der Grad der Hemmung wurde verglichen mit dem Antikörper ohne Mischung mit Monosacchariden oder Disacchariden und als % Kontrollreaktivität ausgedrückt.
Die Ergebnisse für BM-3 sind in Figur 6 dargestellt, wobei Diagramm A die Hemmung von BM-3 mit den Monosacchariden Fucose (offene Kreise), Galaktose (offene Quadrate), Glukose (geschlossene Dreiecke), N-Acetylglukosamine (offene Dreiecke), N-Acetylgalaktosamine (geschlossene Quadrate) und N-Acetylneuraminsäure (geschlossene Kreise) und Diagramm B die Hemmung von BM-3 mit den Disacchariden NeuAcαT6GalNAcα1TSerin (geschlossene Quadrate) und Laktose (geschlossene Kreise) darstellt.
Die Ergebnisse zeigen, daß nur die Monosaccharide GalNAc und NeuAc fähig waren, die Bindung von Bm-3 an OSM und BSM zu hemmen, wohingegen die anderen Monosaccharide, L-Fucose, D-Galaktose, D-Glukose und D-N-Acetylglukosamin, nicht fähig waren, die Reaktivität zu hemmen. Die Hemmungsaktivität von NeuAc war stärker als jene von GalNAc. Das Disaccharid NeuAcα2T6GalNAcα1T0-Serin hemmte ebenfalls die Reaktivität von BM-3, wobei dessen anomerisches Isomer, NeuAcaα2T6GalNAcβ1- > 0-Propyl und Laktose keine Hemmungsaktivität zeigten.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die vom BM-3-Antikörper erkannte Hapten-Struktur NeuAcα2T6GalNAcα1T0-Ser/Thr ist, was exakt der Sialyl-Tn-Struktur entspricht.
Die selben Ergebnisse wurden für BM-4 erhalten.

Immunhistologie verschiedener Gewebeabschnitte

Die immunhistologische Färbungsfähigkeit der monoklonalen Antikörper BM-3 und BM-4 wurde wie zuvor beschrieben bestimmt (Fukushi et al., J. Exp. Med., 159: 506, 1984). Kurz gesagt wurden Proben zur Erkennung von Antigenen in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Monoklonale Antikörper wurden auf die deparaffinierten Gewebeabschnitte aufgetragen und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Erkennung von gebundenen monoklonalen Antikörpern wurde mit Biotinyl-Anti-Maus-IgG + IgM und einem Biotinyl-Peroxidase-Komplex (Vectastain-ABC-Satz, Vector Laboratories Inc.) durchgeführt. Die Enzymaktivität wurde mit 0,05 M Tris enthaltend 0,02% Deaminobenzidin-Tetrahydrochlorid und 0,005% Wasserstoffperoxid gezeigt. Diese Verfahren werden in verschiedenen Wasserstoffperoxiden ausgearbeitet. Diese Verfahren werden in verschiedenen Monographien ausführlich behandelt, zum Beispiel in "Immunenzymatisches Verfahren" von K. Watanabe und P. K. Nakane (Interdisziplinäre Veröffentlichungen, Toshima, Tokio, 1985)
Das typische immunhistologische Bild mit Peroxidasefärbung ist in den Figuren 7 und 8 dargestellt.
Figur 7 zeigt die Immunperoxidasefärbung von formal infixierten, paraffineingebetteten malignen Tumoren mit monoklonalem BM-3-Antikörper. Die Figur zeigt, daß der monoklonale BM- 3-Antikörper mit einem Lungenadenokarzinom reagiert, nicht aber mit normaler Lunge, die nicht gefärbt ist (Diagramm A) Desweiteren reagiert der monoklonale BM-3-Antikörper mit leicht differenziertem Darmadenokarzinom, aber nicht mit umgebenden normalen Zellen und Stroma, die nicht gefärbt sind (Diagramm B). Der monoklonale BM-3-Antikörper reagiert auch in heterologer Weise mit Krebszellen von mukösem Magenkarzinom (Diagramm C) und mit Azinus-Lungenadenokarzinom, aber nicht mit normalem Lungengewebe, welches nicht gefärbt ist (Diagramm D).
Figur 8 zeigt die Immunperoxidasefärbung von formalinfixierten, paraffineingebetteten malignen Tumoren mit Hilfe von monoklonalem BM-4-Antikörper. Die Figur zeigt, daß der monoklonale BM-4-Antikörper mit einem Lungenadenokarzinom (Diagramm A), mit mukösem Magenkarzinom (Diagramm B) und mit leicht differenziertem Darmadenokarzinom reagiert, nicht aber mit normalen Darmzellen oder Stroma (Diagramm C).
Das Vorkommen positiver Färbung bei verschiedenen Krebsarten und normalem Gewebe von den monoklonalen Antikörpern BM-3 und BM-4 verglichen mit anderen Anti-Sialyl-Tn-Antikörpern (B72.3, NCC-LU-35, und NCC-LU-81) wird auch in Tabelle 2 unten gezeigt. Da das Vorkommen positiver Färbung von normalem Gewebe durch BM-3 und BM-4 sehr eingeschränkt ist, wurden positive Zahlen mit normalem Gewebe weggelassen. TABELLE 2. Immunhistochemische Reaktivität der monoklonalen Antikörper BM-3, BM-4, B72.3, NCC-Lu-35 und NCC-Lu-81 mit Gewebeabschnitten von verschiedenen menschlichen Krebsarten. Krebsart Invertierung komparativ Lunge Leber Magen Darm Brust Pankreas
Obwohl beide monoklonalen Antikörper BM-3 und BM-4 gegen Sialyl-Tn gerichtet sind, war das Vorkommen positiver Färbung beim monoklonalen BM-4-Antikörper wesentlich höher. Im Gegensatz zu BM-8 zeigten beide Antikörper ein viel geringeres Vorkommen positiver Färbung von normalem Gewebe.
Die Hybridomzellinien BM-8, BM-3 und BM-4 wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 21. Oktober 1988 bzw. am 2. März 1988 bzw. am 2 März 1988 hinterlegt und erhielten die Deponienummern HB-9873, HB-9653 und HB- 9654.
Die Hinterlegungen wurden gemäß den Bestimmungen des Budapest-Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke des Patentanmeldeverfahrens durchgeführt.

Claims

1. Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften abscheidet:

(1) IgM-Isotyp;

(2) reagiert mit Sialyl-Tn-Antigen und nicht mit T-Antigen, und

(3) epitopische Spezifizitat zu NeuAcα2- 6GalNAcaα1- O- Ser/Thr und nicht zu NeuAcα2-6GalNAcβ1- O-Ser/Thr.

2. Hybridom gemäß Anspruch 1, bei dem der monoklonale Antikörper alle der kennzeichnenden Eigenschaften von BM-3, abgeschieden durch Hybridom BM-3 (ATCC- Hinterlegungsnummer HB-9653), aufweist.

3. Hybridom gemäß Anspruch 2, bei dem der monoklonale Antikörper BM-3, abgeschieden durch Hybridom BM-3 (ATCC- Hinterlegungsnummer HB-9653), ist.

4. Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften abscheidet:

(l) IgG&sub1;-Isotyp,

(2) reagiert mit Sialyl-Tn-Antigen und nicht mit T- oder Tn-Antigen, und

(3) epitopische Spezifizität zu NeuAcα2- 6GalNAcα1- O- Ser/Thr und nicht zu NeuAcα2- 6GalNAcβ1- O-Ser/Thr, und

(4) ist leicht in Fab- oder (Fab)&sub2;-Fragmente umwandelbar.

5. Hybridom gemäß Anspruch 4, bei dem der monoklonale Antikörper alle der kennzeichnenden Eigenschaften von BM-4, abgeschieden durch Hybridom BM-4 (ATCC- Hinterlegungsnummer HB-9654), aufweist.

6. Hybridom gemäß Anspruch 5, bei dem der monoklonale Antikörper BM-4, abgeschieden durch Hybridom BM-4 (ATCC- Hinterlegungsnummer HB-9654), ist.

7. Monoklonaler Antikörper mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften:

(1) IgM-Isotyp,

(2) reagiert mit Sialyl-Tn-Antigen und nicht mit T-Antigen, und

(3) epitopische Spezifizität zu NeuAcα2- 6GalNAcα1- O- Ser/Thr und nicht zu NeuAcα2-6GalNAcβ1- O-Ser/Thr.

8. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 7, wobei der monoklonale Antikörper alle der kennzeichnenden Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers BM-3, abgeschieden durch Hybridom BM-3 (ATCC- Hinterlegungsnummer HB-9653), aufweist.

9. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 8, wobei der monoklonale Antikörper BM-3, abgeschieden durch Hybridom BM-3 (ATCC-Hinterlegungsnummer HB 9653), ist.

10. Monoklonaler Antikörper mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften:

(1) IgG&sub1;-Isotyp,

(2) reagiert mit Sialyl-Tn-Antigen und nicht mit T- oder Tn-Antigen, und

(4) ist leicht in Fab- oder (Fab)&sub2;-Fragmente umwandelbar.

11. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 10, bei dem der monoklonale Antikörper alle der kennzeichnenden Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers BM-4, abgeschieden durch Hybridom BM-4 (ATCC- Hinterlegungsnummer HB-9654), aufweist.

12. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 11, bei dem der monoklonale Antikörper BM-4, abgeschieden durch Hybridom BM-4 (ATCC-Hinterlegungsnummer HB-9654), ist.

13. Antikörper gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12 zur Verwendung als Medikament oder Heilmittel.

14. Verwendung eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12 bei der Herstellung eines Medikaments oder Heilmittels zur Verhinderung des Wachstums und der Replikation von Krebszellen, welche die Kernstruktur eines Glycoproteins des Muzin-Typs exprimieren.