JPH1192400A - 動物及びヒトのムチンを用い、並びに合成炭水化物−担体結合物を用いた免疫による、ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体及びワクチン並びにそれらの製造法 - Google Patents
動物及びヒトのムチンを用い、並びに合成炭水化物−担体結合物を用いた免疫による、ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体及びワクチン並びにそれらの製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ムチン型糖蛋白質に対するIgGモノクローナ
ル抗体を用いる癌患者の受動免疫方法、ムチン型糖蛋白
質又は担体高分子に結合させた合成多糖類で能動免疫す
るワクチンの製造方法の提供 【解決手段】(a)Tn又はシアリルTnエピトープを
有する精製ムチン型糖蛋白質、ムチン型糖蛋白質の精製
された核構造又は担体分子にリンクした化学合成炭水化
物成分であって、ムチン型糖蛋白質に対する免疫反応を
誘導可能なものから成り、薬理的有効量の抗原、及び
(b)製薬的に受容できる担体、希釈剤又は賦形剤:を
含むワクチンを対象に投与して癌細胞に対する免疫反応
を誘導することから成る、ムチン型糖蛋白質の核構造を
発現する癌細胞の増殖及び複製を防ぐ方法。
ル抗体を用いる癌患者の受動免疫方法、ムチン型糖蛋白
質又は担体高分子に結合させた合成多糖類で能動免疫す
るワクチンの製造方法の提供 【解決手段】(a)Tn又はシアリルTnエピトープを
有する精製ムチン型糖蛋白質、ムチン型糖蛋白質の精製
された核構造又は担体分子にリンクした化学合成炭水化
物成分であって、ムチン型糖蛋白質に対する免疫反応を
誘導可能なものから成り、薬理的有効量の抗原、及び
(b)製薬的に受容できる担体、希釈剤又は賦形剤:を
含むワクチンを対象に投与して癌細胞に対する免疫反応
を誘導することから成る、ムチン型糖蛋白質の核構造を
発現する癌細胞の増殖及び複製を防ぐ方法。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明はヒト癌関連抗原に特
異的なモノクローナル抗体の製造方法並びにそれにより
製造されるハイブリドーマ及びモノクローナル抗体に関
する。より詳細には本発明は化学構造が明らかにされた
精製抗原を免疫原として用いるヒト癌関連抗原に対する
モノクローナル抗体の新規な製造方法に関し、該方法に
おいては目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞を化学構造の明らかにされたムチン型糖蛋白
質を用いて選択する。本方法は、従来のヒト癌関連抗原
に対するモノクローナル抗体の製造法に比較して、多く
の余分なステップを省くことができる。さらに本発明
は、新規な方法で製造されたハイブリドーマおよびその
ハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体にも
関する。上記本発明に係わるハイブリドーマは従来法に
より製造されたハイブリドーマと同様に質的に優れ、又
上記ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗
体も従来法により産生される抗体と同様に質的に優れ、
むしろ望ましくない交叉反応性を示さない点でより優れ
ていることが認められた。
異的なモノクローナル抗体の製造方法並びにそれにより
製造されるハイブリドーマ及びモノクローナル抗体に関
する。より詳細には本発明は化学構造が明らかにされた
精製抗原を免疫原として用いるヒト癌関連抗原に対する
モノクローナル抗体の新規な製造方法に関し、該方法に
おいては目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞を化学構造の明らかにされたムチン型糖蛋白
質を用いて選択する。本方法は、従来のヒト癌関連抗原
に対するモノクローナル抗体の製造法に比較して、多く
の余分なステップを省くことができる。さらに本発明
は、新規な方法で製造されたハイブリドーマおよびその
ハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体にも
関する。上記本発明に係わるハイブリドーマは従来法に
より製造されたハイブリドーマと同様に質的に優れ、又
上記ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗
体も従来法により産生される抗体と同様に質的に優れ、
むしろ望ましくない交叉反応性を示さない点でより優れ
ていることが認められた。
【0002】本発明はさらに、ムチン型糖蛋白質に対す
るIgGモノクローナル抗体で癌患者を受動免疫する方
法及びムチン型糖蛋白質又は担体高分子に結合させた合
成多糖類で能動免疫することに基づくワクチンの製造方
法にも関する。
るIgGモノクローナル抗体で癌患者を受動免疫する方
法及びムチン型糖蛋白質又は担体高分子に結合させた合
成多糖類で能動免疫することに基づくワクチンの製造方
法にも関する。
【0003】
【従来の技術】ヒト癌細胞での免疫による多数のモノク
ローナル抗体が、ヒト癌細胞ラインに対する正の反応性
及び正常組織や正常細胞ラインに対する負の反応性によ
り選択された。これらの抗体の多くは、ムチン型糖蛋白
質に対するものと同定され、多数のO−結合性オリゴ糖
類を有しジスルフィド結合のある非常に異質の高分子量
ポリペプチドとして特徴づけられる。O結合性オリゴ糖
類の大部分は二糖からなる核構造(Galβ1→3Ga
lNAcα1→O−Ser/Thr)を有し、これにシ
アル酸、フコース、N−アセチルグルコサミンのような
糖残基が結合して、ヒトでは非常に複雑な構造を形成す
る。これらのムチン型糖蛋白質は主に上皮細胞に存在
し、ゴプレット細胞から分泌されて粘液分泌物を形成す
る。
ローナル抗体が、ヒト癌細胞ラインに対する正の反応性
及び正常組織や正常細胞ラインに対する負の反応性によ
り選択された。これらの抗体の多くは、ムチン型糖蛋白
質に対するものと同定され、多数のO−結合性オリゴ糖
類を有しジスルフィド結合のある非常に異質の高分子量
ポリペプチドとして特徴づけられる。O結合性オリゴ糖
類の大部分は二糖からなる核構造(Galβ1→3Ga
lNAcα1→O−Ser/Thr)を有し、これにシ
アル酸、フコース、N−アセチルグルコサミンのような
糖残基が結合して、ヒトでは非常に複雑な構造を形成す
る。これらのムチン型糖蛋白質は主に上皮細胞に存在
し、ゴプレット細胞から分泌されて粘液分泌物を形成す
る。
【0004】腫瘍形質転換に関連して多くの糖鎖の合成
がブロックされる [Hakomori S.,Murakami W.T.,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,59,254-261(1968);Hakomori S.,Canc
er Res.,45,2405-2414(1985)]。多くのヒト癌では、ム
チン型糖蛋白質の炭水化物鎖の合成もまた強くブロック
され、その結果末梢構造の無い、即ち核構造の修飾は無
く、短い炭化水素鎖を有するムチン型糖蛋白質が、多く
形成される。これらの不完全なオリゴ糖鎖を有する糖蛋
白質のうちT,Tn,およびシアリル−Tnが同定され
ている。これらは正常組織に潜在形態で存在する全ての
ムチン型糖蛋白質の、一般的な核構造である [Springer
G.,Science,224,1198-1206,(1984);Hirohashi S.et a
1.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7039-7043,(1985)]。
がブロックされる [Hakomori S.,Murakami W.T.,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,59,254-261(1968);Hakomori S.,Canc
er Res.,45,2405-2414(1985)]。多くのヒト癌では、ム
チン型糖蛋白質の炭水化物鎖の合成もまた強くブロック
され、その結果末梢構造の無い、即ち核構造の修飾は無
く、短い炭化水素鎖を有するムチン型糖蛋白質が、多く
形成される。これらの不完全なオリゴ糖鎖を有する糖蛋
白質のうちT,Tn,およびシアリル−Tnが同定され
ている。これらは正常組織に潜在形態で存在する全ての
ムチン型糖蛋白質の、一般的な核構造である [Springer
G.,Science,224,1198-1206,(1984);Hirohashi S.et a
1.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7039-7043,(1985)]。
【0005】ヒト癌関違抗原に対するモノクローナル抗
体を製造する現行の方法では、免疫原として癌組織ホモ
ジネート又は癌細胞ラインを使用し、産生する抗体の特
異性を多数の癌細胞及び組織切片を用いて分析すること
によりハイブリドーマを選択する。
体を製造する現行の方法では、免疫原として癌組織ホモ
ジネート又は癌細胞ラインを使用し、産生する抗体の特
異性を多数の癌細胞及び組織切片を用いて分析すること
によりハイブリドーマを選択する。
【0006】例えば、糖蛋白質のセリン又はトレオニン
に結合するα−GalNac残基と血液型Aとの交叉反
応抗原性については、Uhlenbruckにより報告されてお
り、血液型A赤血球を優先的に凝集させる種々のGal
Nacレクチン(Helix pomatia,Soja hispeda及びSaro
thamnus sclparius)によって検出されるTn抗原に関
連がある。エピトープは、トランスメンブレン糖蛋白質
及びムチン型糖蛋白質中に存在するO−結合炭化水素鎖
の最深部にあるα−GalNAc残基に相当する。従っ
て、この抗原は正常細胞又は分泌物中では隠れており、
脱シアル化の後スミス分解すると現出する [Dahr.W.,et
al.,Vox Sang.,27,29-42 (1974)]。Tn抗原について
はSpringerらも報告しており、トムセン−フリーデレイ
ヒ(Thomsen-Friedenreich)抗原(T抗原)の前駆体に
関連し、Tn及びT抗原は乳癌[Springer C.F.,et al.
J.Natl.Cancer lnst.,54,335 (1975)]及び種々の他の
癌 [Springer G.F.,et al,Cancer 556,561-569 (198
5)]で発現する。しかし、この抗原が種々のタイプのヒ
ト癌で広く発生すること及び正常組織では分布が限定さ
れていることは、このエピトープに特異的なモノクロー
ナル抗原が最近になって確立されるまでは良く理解され
ていなかった[Hirohashi S.et al.Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,82,7039-7043,(1985)]。マウスにヒト肺偏平上
皮細胞癌Lu65を免疫した後、腫瘍に対し特異的に反
応し正常組織とは反応しないことにより選択し、IgM
抗体NCC−LU−35及びNCC−LU−81が最初
に確立された。これらの抗体はA抗原と交又反応性を有
し、Tn抗原に対するものと同定された[Hirohashi S.,
Murakami W.T.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7039-7043,
(1985)]。NCC−LU−35については血液型A抗原
との大きな交叉反応性が示され、NCC−LU−81に
ついては交叉反応性がより少ないことが示されたにもか
かわらず、これらの抗体により、特に血液型O及びBに
個体の腫瘍中でTn抗原を確認できる。これらの抗Tn
抗体の反応性が非A型腫瘍組織に高度に制限されること
が見出されたため [Hirohasi S.,et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,82,7039-7043,(1985)]、血液型Aと交叉反
応しないIgGクラスの抗Tn抗体の獲得が強く望まれ
ている。なぜならIgG抗体のみが腫瘍細胞で抗体依存
性の細胞障害効果を発揮できるからである[Young,W.
W.,Jr.and Hakomori.S.,Science,211,487-489(1981); H
oughton,A.N.,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,1242-
1246 (1985); Herberman,R.B.,et al,In:R.A.Reisfeld
and S.Sell(eds.),MonoclonalAntibodies and Cancer T
herapy,pp.193-203,AlanR,Liss,lnc.,New York,(1985);
and Herlyn,D.M.,et aI,Cancer Res.,40,717-721 (198
0)]。IgG抗体は、毒素、他の抗腫瘍剤及び治療の為
の放射性又は磁性マーカーとの結合物の調製並びに腫瘍
のイメージ化に対し、IgMよりも適当である。
に結合するα−GalNac残基と血液型Aとの交叉反
応抗原性については、Uhlenbruckにより報告されてお
り、血液型A赤血球を優先的に凝集させる種々のGal
Nacレクチン(Helix pomatia,Soja hispeda及びSaro
thamnus sclparius)によって検出されるTn抗原に関
連がある。エピトープは、トランスメンブレン糖蛋白質
及びムチン型糖蛋白質中に存在するO−結合炭化水素鎖
の最深部にあるα−GalNAc残基に相当する。従っ
て、この抗原は正常細胞又は分泌物中では隠れており、
脱シアル化の後スミス分解すると現出する [Dahr.W.,et
al.,Vox Sang.,27,29-42 (1974)]。Tn抗原について
はSpringerらも報告しており、トムセン−フリーデレイ
ヒ(Thomsen-Friedenreich)抗原(T抗原)の前駆体に
関連し、Tn及びT抗原は乳癌[Springer C.F.,et al.
J.Natl.Cancer lnst.,54,335 (1975)]及び種々の他の
癌 [Springer G.F.,et al,Cancer 556,561-569 (198
5)]で発現する。しかし、この抗原が種々のタイプのヒ
ト癌で広く発生すること及び正常組織では分布が限定さ
れていることは、このエピトープに特異的なモノクロー
ナル抗原が最近になって確立されるまでは良く理解され
ていなかった[Hirohashi S.et al.Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,82,7039-7043,(1985)]。マウスにヒト肺偏平上
皮細胞癌Lu65を免疫した後、腫瘍に対し特異的に反
応し正常組織とは反応しないことにより選択し、IgM
抗体NCC−LU−35及びNCC−LU−81が最初
に確立された。これらの抗体はA抗原と交又反応性を有
し、Tn抗原に対するものと同定された[Hirohashi S.,
Murakami W.T.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7039-7043,
(1985)]。NCC−LU−35については血液型A抗原
との大きな交叉反応性が示され、NCC−LU−81に
ついては交叉反応性がより少ないことが示されたにもか
かわらず、これらの抗体により、特に血液型O及びBに
個体の腫瘍中でTn抗原を確認できる。これらの抗Tn
抗体の反応性が非A型腫瘍組織に高度に制限されること
が見出されたため [Hirohasi S.,et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,82,7039-7043,(1985)]、血液型Aと交叉反
応しないIgGクラスの抗Tn抗体の獲得が強く望まれ
ている。なぜならIgG抗体のみが腫瘍細胞で抗体依存
性の細胞障害効果を発揮できるからである[Young,W.
W.,Jr.and Hakomori.S.,Science,211,487-489(1981); H
oughton,A.N.,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,1242-
1246 (1985); Herberman,R.B.,et al,In:R.A.Reisfeld
and S.Sell(eds.),MonoclonalAntibodies and Cancer T
herapy,pp.193-203,AlanR,Liss,lnc.,New York,(1985);
and Herlyn,D.M.,et aI,Cancer Res.,40,717-721 (198
0)]。IgG抗体は、毒素、他の抗腫瘍剤及び治療の為
の放射性又は磁性マーカーとの結合物の調製並びに腫瘍
のイメージ化に対し、IgMよりも適当である。
【0007】さらに、B72.3 [Nuti,M.,et al,J.ln
st.Cancer,29,539-545,(1982); Thor,A.,et al.,Cancer
Res.,46,850-857 (1986)] 及びMSL102 [Kurasaw
a,A.et al,ln: Tumor marler and their significance
in the management of breast cancer.(Eds,Dao,T.,Bro
die,A.,and Ip,C.) pp47-70, Alan R.Liss lnc.,N.Y.,
(1986)]の2個のモノクローナル抗体が、ヒト転移性乳
癌及び腸癌細胞ラインでの免疫により確立された。これ
らは種々のヒト癌に対して高度の特異性を示し、正常組
織に対する反応性は限定されている。
st.Cancer,29,539-545,(1982); Thor,A.,et al.,Cancer
Res.,46,850-857 (1986)] 及びMSL102 [Kurasaw
a,A.et al,ln: Tumor marler and their significance
in the management of breast cancer.(Eds,Dao,T.,Bro
die,A.,and Ip,C.) pp47-70, Alan R.Liss lnc.,N.Y.,
(1986)]の2個のモノクローナル抗体が、ヒト転移性乳
癌及び腸癌細胞ラインでの免疫により確立された。これ
らは種々のヒト癌に対して高度の特異性を示し、正常組
織に対する反応性は限定されている。
【0008】しかし、これらの現行の方法は多数のステ
ップを必要とし、従って非常に扱いにくく、時間もかか
る。
ップを必要とし、従って非常に扱いにくく、時間もかか
る。
【0009】従って、ヒト癌関連抗原に対するモノクロ
ーナル抗体を製造する為のより効率的な方法が望まれて
おり、同様に、正常な炭水化物配列及び構造を有する糖
蛋白質と好ましくない交叉反応を示さないモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマの単離も望まれてい
る。
ーナル抗体を製造する為のより効率的な方法が望まれて
おり、同様に、正常な炭水化物配列及び構造を有する糖
蛋白質と好ましくない交叉反応を示さないモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマの単離も望まれてい
る。
【0010】さらに、腫瘍増殖を抑制するための能動免
疫が、腫瘍免疫学において長い歴史を有している。実験
的腫瘍で幾つかの成果が得られたが、多くの試みは失敗
している。この原因の一つとして、使用した腫瘍抗原が
化学的にあまり明確でなく、そのため宿主に免疫反応を
起こして腫瘍増殖を抑制する能力が曖昧であったことが
挙げられる。最近、モノクローナル抗体によって確認さ
れた幾つかの腫瘍関連炭水化物抗原が、化学的によく特
徴付けられてきた。このような抗原を、腫瘍増殖を抑制
する為の免疫原として用いることが、今では可能であ
る。
疫が、腫瘍免疫学において長い歴史を有している。実験
的腫瘍で幾つかの成果が得られたが、多くの試みは失敗
している。この原因の一つとして、使用した腫瘍抗原が
化学的にあまり明確でなく、そのため宿主に免疫反応を
起こして腫瘍増殖を抑制する能力が曖昧であったことが
挙げられる。最近、モノクローナル抗体によって確認さ
れた幾つかの腫瘍関連炭水化物抗原が、化学的によく特
徴付けられてきた。このような抗原を、腫瘍増殖を抑制
する為の免疫原として用いることが、今では可能であ
る。
【0011】化学的に決められた癌関連糖蛋白質自体
は、腫瘍に対する生体内免疫反応を起こす目的で、癌患
者の能動免疫に単独で使用できる。T及びTn抗原を有
するルイス肺癌から単離された糖蛋白質、TCAが、癌
患者の免疫に用いられ、その結果、癌患者の33/71
に部分的又は完全な退行が見られた [Adachi.M.,et a
l.,Anticancer Research,4,1-4 (1984); Adachi,M,mer
al,Anticancer Research,発行予定]。
は、腫瘍に対する生体内免疫反応を起こす目的で、癌患
者の能動免疫に単独で使用できる。T及びTn抗原を有
するルイス肺癌から単離された糖蛋白質、TCAが、癌
患者の免疫に用いられ、その結果、癌患者の33/71
に部分的又は完全な退行が見られた [Adachi.M.,et a
l.,Anticancer Research,4,1-4 (1984); Adachi,M,mer
al,Anticancer Research,発行予定]。
【0012】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
癌関連ムチン型糖蛋白質抗原に対するモノクローナル抗
体の確立及び新規な製造方法を提供することにある。本
方法は、従来法に必要な幾つかの余分なステップを回避
し、しかも従来法によるものと同程度の優れた品質を有
するハイブリドーマを与えるものである。
癌関連ムチン型糖蛋白質抗原に対するモノクローナル抗
体の確立及び新規な製造方法を提供することにある。本
方法は、従来法に必要な幾つかの余分なステップを回避
し、しかも従来法によるものと同程度の優れた品質を有
するハイブリドーマを与えるものである。
【0013】本発明の目的は、特別な癌関連抗原に対す
るモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを提供
することにもある。
るモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを提供
することにもある。
【0014】本発明の目的はさらに、モノクローナル抗
体が正常の炭水化物構造を持つ糖蛋白質と望ましくない
交叉反応を示さないという点で、従来法による抗体と少
なくとも質的に同等かむしろより優れたモノクローナル
抗体を提供することにある。
体が正常の炭水化物構造を持つ糖蛋白質と望ましくない
交叉反応を示さないという点で、従来法による抗体と少
なくとも質的に同等かむしろより優れたモノクローナル
抗体を提供することにある。
【0015】さらなる本発明の目的は、ワクチンの開発
方法、即ち、癌細胞により発現される抗原に特異的な抗
体又は他の免疫反応を誘導できる糖蛋白質又は合成オリ
ゴ糖付加ポリマー複合体を、動物又はヒトに投与するこ
とにより癌細胞の増殖及び複製を防ぐ方法を提供するこ
とにある。
方法、即ち、癌細胞により発現される抗原に特異的な抗
体又は他の免疫反応を誘導できる糖蛋白質又は合成オリ
ゴ糖付加ポリマー複合体を、動物又はヒトに投与するこ
とにより癌細胞の増殖及び複製を防ぐ方法を提供するこ
とにある。
【0016】本発明の他の目的は、ムチン型糖蛋白質の
核構造に関連する炭水化物に対する抗体であり、癌細胞
により発現される抗原に特異的であるものを使用する、
癌の治療方法を提供することにある。
核構造に関連する炭水化物に対する抗体であり、癌細胞
により発現される抗原に特異的であるものを使用する、
癌の治療方法を提供することにある。
【0017】
【課題を解決するための手段】本発明は、(1)ムチン
型糖蛋白質の核構造で宿主を免疫する;(2)免疫され
た宿主から得た脾細胞をミエローマ細胞と融合させハイ
ブリドーマ細胞を形成する;(3)ハイブリドーマ細胞
を選択培地で培養する;(4)ステップ(3)で生き残
ったハイブリドーマ細胞からムチン型糖蛋白質の核構造
と結合する抗体を分泌するものを選択する;(5)ステ
ップ(4)で選択したハイブリドーマ細胞をクローニン
グする;(6)クローニングしたハイブリドーマ細胞を
培養する;及び(7)抗体を回収する;の各ステップを
含む、ヒト癌関連ムチン型糖蛋白質抗原に結合するモノ
クローナル抗体の製造方法に係わるものである。
型糖蛋白質の核構造で宿主を免疫する;(2)免疫され
た宿主から得た脾細胞をミエローマ細胞と融合させハイ
ブリドーマ細胞を形成する;(3)ハイブリドーマ細胞
を選択培地で培養する;(4)ステップ(3)で生き残
ったハイブリドーマ細胞からムチン型糖蛋白質の核構造
と結合する抗体を分泌するものを選択する;(5)ステ
ップ(4)で選択したハイブリドーマ細胞をクローニン
グする;(6)クローニングしたハイブリドーマ細胞を
培養する;及び(7)抗体を回収する;の各ステップを
含む、ヒト癌関連ムチン型糖蛋白質抗原に結合するモノ
クローナル抗体の製造方法に係わるものである。
【0018】本発明は、以下の確認された性質を持つモ
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをも提供す
る: (1)IgG2aイソタイプ (2)Tn抗原と反応する (3)N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)に
特異性を有し、N−アセチルグルコサミン(GlcNA
c)、ガラクトース(Gal)又はグルコース(Gl
c)には特異性を有しない (4)α−N−アセチルガラクトサミン(α−GalN
Ac)に対しエピトープ特異性を有し、β−N−アセチ
ルガラクトサミンに対してはエピトープ特異性を有さな
い、及び (5)血液型Aとは交叉反応しない。
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをも提供す
る: (1)IgG2aイソタイプ (2)Tn抗原と反応する (3)N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)に
特異性を有し、N−アセチルグルコサミン(GlcNA
c)、ガラクトース(Gal)又はグルコース(Gl
c)には特異性を有しない (4)α−N−アセチルガラクトサミン(α−GalN
Ac)に対しエピトープ特異性を有し、β−N−アセチ
ルガラクトサミンに対してはエピトープ特異性を有さな
い、及び (5)血液型Aとは交叉反応しない。
【0019】本発明は、以下の確認された性質を持つモ
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをも提供す
る: (1)IgMイソタイプ (2)シアリルTn抗原と反応し、T又はTn抗原とは
反応しない、及び (3)NeuAcα2→6GalNAcα1→O−Se
r/Thrに対しエピトープ特異性を有し、NeuAc
α2→6GalNAcβ1→O−Ser/Thrに対し
エピトープ特異性を有さない。
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをも提供す
る: (1)IgMイソタイプ (2)シアリルTn抗原と反応し、T又はTn抗原とは
反応しない、及び (3)NeuAcα2→6GalNAcα1→O−Se
r/Thrに対しエピトープ特異性を有し、NeuAc
α2→6GalNAcβ1→O−Ser/Thrに対し
エピトープ特異性を有さない。
【0020】本発明は、以下の確認された性質を持つモ
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをも提供す
る: (1)IgG1イソタイプ (2)シアリルTn抗原と反応しT又はTn抗原とは反
応しない (3)NeuAcα2→6GalNAcα1→O−Se
r/Thrに対しエピトープ特異性を有し、NeuAc
α2→6GalNAcβ1→O−Ser/Thrに対し
エピトープ特異性を有さない、及び (4)Fab又は(Fab)2フラグメントに容易に分
解できる。
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをも提供す
る: (1)IgG1イソタイプ (2)シアリルTn抗原と反応しT又はTn抗原とは反
応しない (3)NeuAcα2→6GalNAcα1→O−Se
r/Thrに対しエピトープ特異性を有し、NeuAc
α2→6GalNAcβ1→O−Ser/Thrに対し
エピトープ特異性を有さない、及び (4)Fab又は(Fab)2フラグメントに容易に分
解できる。
【0021】もう一つの態様では、本発明は上記の確認
されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル
抗体を提供する。本抗体は、ムチン型糖蛋白質の核構
造、即ち、Tn及びシアリルTn構造を発現する癌を有
する患者の受動免疫のために特に有用である。
されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル
抗体を提供する。本抗体は、ムチン型糖蛋白質の核構
造、即ち、Tn及びシアリルTn構造を発現する癌を有
する患者の受動免疫のために特に有用である。
【0022】もう一つの態様に於いて本発明は、ワクチ
ンを対象に投与して癌細胞に対する免疫反応を誘導する
ことによる、ムチン型糖蛋白質の核構造を発現する癌細
胞の増殖及び複製を防ぐ方法を提供する。上記ワクチン
は、 (a)Tn又はシアリルTnエピトープを有する精製ム
チン型糖蛋白質、精製されたムチン型糖蛋白質の核構
造、又はムチン型糖蛋白質に対する免疫反応を誘導可能
な、担体分子にリンクされた化学合成炭水化物成分を含
む薬理的有効量の抗原 (b)製薬的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤、 を含有する。
ンを対象に投与して癌細胞に対する免疫反応を誘導する
ことによる、ムチン型糖蛋白質の核構造を発現する癌細
胞の増殖及び複製を防ぐ方法を提供する。上記ワクチン
は、 (a)Tn又はシアリルTnエピトープを有する精製ム
チン型糖蛋白質、精製されたムチン型糖蛋白質の核構
造、又はムチン型糖蛋白質に対する免疫反応を誘導可能
な、担体分子にリンクされた化学合成炭水化物成分を含
む薬理的有効量の抗原 (b)製薬的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤、 を含有する。
【0023】本発明は、化学的に同定された糖蛋白質、
即ち、Tn及びシアリルTnを有するウシ又はヒツジの
下顎ムチン(BSM,OSM)を免疫原として使用し、
腫瘍をチャレンジ後、シンジェニック(syngenic)マウ
スのTA3HAマウス腫瘍の増殖を防ぎ、腫瘍をチャレ
ンジしたマウスの生存を増大することを開示する。Tn
及びシアリルTn決定基は多種類のヒト癌で高度に発現
するため[HirohashiS.,et al.,(1985) Proc Natl Acad
Sci USA,82,7039-7043; Takahashi HK,et aI(1988) Ca
ncer Res,48,4361-4367; Kjeldsen T.et al.,Cancer Re
s,48,2214-2220,(1988); Kurosaka A.,J Biol.Chem.,26
3,8724-8726]、BSM,OSM又はこれら決定基を有
する任意の他のムチン型糖蛋白質による能動免疫はヒト
癌の増殖を防ぐワクチンを提供するうえで有用であると
期待される。
即ち、Tn及びシアリルTnを有するウシ又はヒツジの
下顎ムチン(BSM,OSM)を免疫原として使用し、
腫瘍をチャレンジ後、シンジェニック(syngenic)マウ
スのTA3HAマウス腫瘍の増殖を防ぎ、腫瘍をチャレ
ンジしたマウスの生存を増大することを開示する。Tn
及びシアリルTn決定基は多種類のヒト癌で高度に発現
するため[HirohashiS.,et al.,(1985) Proc Natl Acad
Sci USA,82,7039-7043; Takahashi HK,et aI(1988) Ca
ncer Res,48,4361-4367; Kjeldsen T.et al.,Cancer Re
s,48,2214-2220,(1988); Kurosaka A.,J Biol.Chem.,26
3,8724-8726]、BSM,OSM又はこれら決定基を有
する任意の他のムチン型糖蛋白質による能動免疫はヒト
癌の増殖を防ぐワクチンを提供するうえで有用であると
期待される。
【0024】本発明はさらに、(a)ムチン型糖蛋白質
の精製された核構造に対して作られた抗癌抗体の薬理的
有効量、及び(b)製薬上受容できる担体、希釈剤又は
賦形剤を含有する薬剤を対象に投与することから成る、
癌細胞がムチン型糖蛋白質の核構造を発現する癌の治療
法をも提供する。
の精製された核構造に対して作られた抗癌抗体の薬理的
有効量、及び(b)製薬上受容できる担体、希釈剤又は
賦形剤を含有する薬剤を対象に投与することから成る、
癌細胞がムチン型糖蛋白質の核構造を発現する癌の治療
法をも提供する。
【0025】
【発明の実施の形態】本明細書に於いて下記の用語は以
下の意味を有する。
下の意味を有する。
【0026】ムチン型グリコプロテイン……セリン又は
トレオニン残基に高度にO−リンクしたグリコシレーシ
ョンを高度に有する高分子量蛋白質(Mr>106)。
ムチン型糖蛋白質はS−S結合によりさらに重合し、こ
れは上皮分泌物の主成分である。 ムチン型糖蛋白質の
核構造……ムチン糖蛋白質の蛋白質部分に直接結合し
た、末梢の置換の無い塩基性炭水化物構造。最も高頻度
で主要なこのような構造はT抗原に等しい(下記参
照)。以下の核構造T、Tn、及びシアリルTnは全て
種によらず(種々の動物及びヒト)全ての型のムチン糖
蛋白質に共通する。
トレオニン残基に高度にO−リンクしたグリコシレーシ
ョンを高度に有する高分子量蛋白質(Mr>106)。
ムチン型糖蛋白質はS−S結合によりさらに重合し、こ
れは上皮分泌物の主成分である。 ムチン型糖蛋白質の
核構造……ムチン糖蛋白質の蛋白質部分に直接結合し
た、末梢の置換の無い塩基性炭水化物構造。最も高頻度
で主要なこのような構造はT抗原に等しい(下記参
照)。以下の核構造T、Tn、及びシアリルTnは全て
種によらず(種々の動物及びヒト)全ての型のムチン糖
蛋白質に共通する。
【0027】T抗原……Galβ1→3GalNAcの
如き構造をとるGal及びGalNAc各1モルずつか
ら成る二糖。還元末端GalNAcはポリペプチド鎖の
セリン又はトレオニン残基のヒドロキシル基にα−結合
している。
如き構造をとるGal及びGalNAc各1モルずつか
ら成る二糖。還元末端GalNAcはポリペプチド鎖の
セリン又はトレオニン残基のヒドロキシル基にα−結合
している。
【0028】Tn抗原……その最も内部にあるα−Ga
lNAc残基が、ポリペプチド鎖のセリン又はトレオニ
ン残基のヒドロキシル基に直接結合している抗原。α−
GalNAcは血液型A抗原の一部であるため、多くの
抗Tn抗体はA抗原と交叉反応する。
lNAc残基が、ポリペプチド鎖のセリン又はトレオニ
ン残基のヒドロキシル基に直接結合している抗原。α−
GalNAcは血液型A抗原の一部であるため、多くの
抗Tn抗体はA抗原と交叉反応する。
【0029】シアリルTn抗原……Tn抗原のα−Ga
lNAc残基の6位のヒドロキシル基がシアル酸で置換
されている、即ち、ポリペプチド鎖のセリン又はトレオ
ニン残基のヒドロキシル基にNeuAcα2→6Gal
NAcがα結合している抗原。
lNAc残基の6位のヒドロキシル基がシアル酸で置換
されている、即ち、ポリペプチド鎖のセリン又はトレオ
ニン残基のヒドロキシル基にNeuAcα2→6Gal
NAcがα結合している抗原。
【0030】T抗原、Tn抗原及びシアリルTn抗原の
構造を下記表1に示す。
構造を下記表1に示す。
【0031】
【表1】
【0032】本発明は、ヒト癌関連ムチン型糖蛋白質抗
原に対するモノクローナル抗体を製造する新規な方法を
提供する。この新規な方法において重要な2つの点は、
(l)本方法で用いられる免疫原は、構造が化学的に明
らかにされた精製又は合成抗原である点、及び(2)ハ
イブリドーマの選択は化学構造が明らかにされた同じ免
疫原を使用して行われることである。
原に対するモノクローナル抗体を製造する新規な方法を
提供する。この新規な方法において重要な2つの点は、
(l)本方法で用いられる免疫原は、構造が化学的に明
らかにされた精製又は合成抗原である点、及び(2)ハ
イブリドーマの選択は化学構造が明らかにされた同じ免
疫原を使用して行われることである。
【0033】免疫原の調製 本発明に従えば、抗体を得るために使用する免疫原は、
上記に明らかにしたムチン型糖蛋白質の核構造である。
即ち、どの様なムチン型糖蛋白質の核構造も、その糖蛋
白質が免疫原性を発揮するに十分な大きさの分子量を有
し且つ全重量の50%以上がグリコシル化されているム
チンと同程度まで、グリコシル化されている限り使用可
能である。
上記に明らかにしたムチン型糖蛋白質の核構造である。
即ち、どの様なムチン型糖蛋白質の核構造も、その糖蛋
白質が免疫原性を発揮するに十分な大きさの分子量を有
し且つ全重量の50%以上がグリコシル化されているム
チンと同程度まで、グリコシル化されている限り使用可
能である。
【0034】本発明の免疫原として有用なムチン型糖蛋
白質の核構造の例には、T抗原、Tn抗原、シアリルT
n抗原、及びこれらの抗原を含む動物性ムチンが含まれ
る。Galβ1→3[GlcNAcβ1→4]GalN
Ac、GlcNAcβ1→4GalNAc及びGalβ
1→3[Galβ1→4GlcNAcβ1→4]Gal
NAcの様な他の核構造も使用できる。特に好ましい免
疫原はT抗原、Tn抗原、およびシアリルTn抗原、並
びにこれら抗原を含む動物性ムチンである。
白質の核構造の例には、T抗原、Tn抗原、シアリルT
n抗原、及びこれらの抗原を含む動物性ムチンが含まれ
る。Galβ1→3[GlcNAcβ1→4]GalN
Ac、GlcNAcβ1→4GalNAc及びGalβ
1→3[Galβ1→4GlcNAcβ1→4]Gal
NAcの様な他の核構造も使用できる。特に好ましい免
疫原はT抗原、Tn抗原、およびシアリルTn抗原、並
びにこれら抗原を含む動物性ムチンである。
【0035】免疫原は、ムチン型糖蛋白質を酵素的又は
化学的に修飾して核構造を露出させ、又は核構造をその
中に有するムチンを単離することにより得られる。これ
らのムチンは幾つかの動物種に存在する。
化学的に修飾して核構造を露出させ、又は核構造をその
中に有するムチンを単離することにより得られる。これ
らのムチンは幾つかの動物種に存在する。
【0036】種々のムチン型糖蛋白質の核構造を露出さ
せるために使用可能な酵素的修飾のタイプの例には、末
端に位置するα2→3シアリル残基のインフルエンザウ
イルスシアリダーゼによる除去、又はクロストリジウム
ペルフリンゲンズ(Clostridium perfringense)シアリ
ダーゼによる全シアル酸残基の総除去が含まれる。酵素
的修飾にはさらに、β−ガラクトシダーゼ(好ましくは
Charonia lampasからのもの)、α−フコシダーゼ及び
N−アセチルヘキサミニダーゼを用いた処理が含まれ得
る。ムチン糖蛋白質の酵素的加水分解はヒロハシ(Hiro
hashi)らにより記載されている[Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,82,7039-7043(1985)]。
せるために使用可能な酵素的修飾のタイプの例には、末
端に位置するα2→3シアリル残基のインフルエンザウ
イルスシアリダーゼによる除去、又はクロストリジウム
ペルフリンゲンズ(Clostridium perfringense)シアリ
ダーゼによる全シアル酸残基の総除去が含まれる。酵素
的修飾にはさらに、β−ガラクトシダーゼ(好ましくは
Charonia lampasからのもの)、α−フコシダーゼ及び
N−アセチルヘキサミニダーゼを用いた処理が含まれ得
る。ムチン糖蛋白質の酵素的加水分解はヒロハシ(Hiro
hashi)らにより記載されている[Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,82,7039-7043(1985)]。
【0037】ムチン型糖蛋白質の核構造を露出させるた
めに使用可能な化学的反応の例には、過ヨウ素酸塩酸化
及びこれに続く硼化水素ナトリウムを用いた還元及び弱
酸処理が含まれる。この方法はスミス分解[Spiro,G.,M
ethods EnzymoI.,28,3-43 (1972)]と呼ばれる。この化
学的処理により、シアル酸以外の炭水化物残基の非還元
末端が除去され、シアル酸は上記の様にシアリダーゼ処
理により除去できる。
めに使用可能な化学的反応の例には、過ヨウ素酸塩酸化
及びこれに続く硼化水素ナトリウムを用いた還元及び弱
酸処理が含まれる。この方法はスミス分解[Spiro,G.,M
ethods EnzymoI.,28,3-43 (1972)]と呼ばれる。この化
学的処理により、シアル酸以外の炭水化物残基の非還元
末端が除去され、シアル酸は上記の様にシアリダーゼ処
理により除去できる。
【0038】動物から単離され、免疫原として使用でき
るムチンの例には、90%の炭水化物鎖がシアリルTn
抗原から成るヒツジ下顎腺ムチン(OSM)及び50%
の炭水化物鎖がシアリルTn抗原から成り30%の炭水
化物鎖がTn抗原及び他の確認されていない残基から成
るウシ下顎ムチンが含まれる。動物種のムチン糖蛋白質
の構造が全て明らかにされている訳ではない。しかし、
ヒツジ胃ムチンにすでに見出されているトリヘキソサミ
ン核(GlcNAcβ1→4[GlcNAcβ1→3]
GalNAc) [HounselI,E.et al.,Biochem.Biophys.
Res.Commun.,92,1143-1159 (1979)]のような新規な構
造は幾つかのヒト癌ムチンの核構造に存在すると考えら
れ、この場合にはこれらも本発明で用いることができ
る。種々の動物種のムチン核構造の系統的な理解は不完
全であるが、ムチン核構造が知られると、当業者は本発
明にそれらが有用であるかを容易に決めることができる
であろう。
るムチンの例には、90%の炭水化物鎖がシアリルTn
抗原から成るヒツジ下顎腺ムチン(OSM)及び50%
の炭水化物鎖がシアリルTn抗原から成り30%の炭水
化物鎖がTn抗原及び他の確認されていない残基から成
るウシ下顎ムチンが含まれる。動物種のムチン糖蛋白質
の構造が全て明らかにされている訳ではない。しかし、
ヒツジ胃ムチンにすでに見出されているトリヘキソサミ
ン核(GlcNAcβ1→4[GlcNAcβ1→3]
GalNAc) [HounselI,E.et al.,Biochem.Biophys.
Res.Commun.,92,1143-1159 (1979)]のような新規な構
造は幾つかのヒト癌ムチンの核構造に存在すると考えら
れ、この場合にはこれらも本発明で用いることができ
る。種々の動物種のムチン核構造の系統的な理解は不完
全であるが、ムチン核構造が知られると、当業者は本発
明にそれらが有用であるかを容易に決めることができる
であろう。
【0039】さらに、種々の動物種での系統的な適用に
より、免疫原として共通の構造が見出されるだろう。こ
の様な構造を明らかにする方法には、硼化水素存在下で
のアルカリ加水分解(β−エリミネーション)、メチレ
ーション分析及び遊離した各オリゴ糖のマススペクトロ
メトリーが含まれる。これらの方法は最近刊行された本
に編纂されている [Hakomori,S.,and Kannagi,R.(198
6).In:Handbook of Experimental Immunology,Vol.I,Bl
ackwell Scientific Publications,Oxford.pp.9.1-9.3
9]。
より、免疫原として共通の構造が見出されるだろう。こ
の様な構造を明らかにする方法には、硼化水素存在下で
のアルカリ加水分解(β−エリミネーション)、メチレ
ーション分析及び遊離した各オリゴ糖のマススペクトロ
メトリーが含まれる。これらの方法は最近刊行された本
に編纂されている [Hakomori,S.,and Kannagi,R.(198
6).In:Handbook of Experimental Immunology,Vol.I,Bl
ackwell Scientific Publications,Oxford.pp.9.1-9.3
9]。
【0040】免疫原は常法に従い単離し精製する。
【0041】例えば、酵素的又は化学的に修飾して核構
造を生ずるムチン型糖蛋白質はセファロース4B又はセ
ファクリル200Sによるゲル濾過により単離される。
造を生ずるムチン型糖蛋白質はセファロース4B又はセ
ファクリル200Sによるゲル濾過により単離される。
【0042】次いで、単離された糖蛋白質を上記方法で
酵素的又は化学的に修飾して核構造を露出させ、核構造
を免疫原としての使用のために以下の様にして精製す
る。修飾されたムチンはセファロース4B又はセファク
リル200Sによるゲル濾過により分離できる。合成分
子濾過カラムの高圧クロマトグラフィ(fast liquid ch
romatography; Pharmacia製)もまた酵素的及び化学的
に修飾されたムチンの分離に有用である。しかし、修飾
されたムチンは免疫原としては精製する必要はない。少
量の非修飾ムチンの存在は本発明に従う免疫原としての
使用に有害ではないであろう。さらに、適当な注意の下
に、修飾は通常定量的に行われる。
酵素的又は化学的に修飾して核構造を露出させ、核構造
を免疫原としての使用のために以下の様にして精製す
る。修飾されたムチンはセファロース4B又はセファク
リル200Sによるゲル濾過により分離できる。合成分
子濾過カラムの高圧クロマトグラフィ(fast liquid ch
romatography; Pharmacia製)もまた酵素的及び化学的
に修飾されたムチンの分離に有用である。しかし、修飾
されたムチンは免疫原としては精製する必要はない。少
量の非修飾ムチンの存在は本発明に従う免疫原としての
使用に有害ではないであろう。さらに、適当な注意の下
に、修飾は通常定量的に行われる。
【0043】動物種に由来し、すでに核構造の形態にあ
る糖蛋白質を含むムチンは、常法により得られる。例え
ば上記のようにセファロース4B、セファクリル200
によるゲル濾過又はFPLCにより得る。
る糖蛋白質を含むムチンは、常法により得られる。例え
ば上記のようにセファロース4B、セファクリル200
によるゲル濾過又はFPLCにより得る。
【0044】このようにして動物から得たムチンは、免
疫原としての使用のため、適常のゲル濾過又はFPLC
の様な上記と同様の方法で更に精製することができる。
しかし、免疫原の純度は本質的ではない。
疫原としての使用のため、適常のゲル濾過又はFPLC
の様な上記と同様の方法で更に精製することができる。
しかし、免疫原の純度は本質的ではない。
【0045】上記のように、特に好ましい抗原はT抗
原、Tn抗原及びシアリルTn抗原である。
原、Tn抗原及びシアリルTn抗原である。
【0046】T抗原は下記の核構造を有するオリゴ糖を
有する種々の糖蛋白質をシアリダーゼ処理することによ
り [Hirohashi et aI., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,70
39-7043 (1985)]調製できる。
有する種々の糖蛋白質をシアリダーゼ処理することによ
り [Hirohashi et aI., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,70
39-7043 (1985)]調製できる。
【0047】
【化1】
【0048】この様な糖蛋白質の典型例は、ウシ下顎腺
ムチン及びヒト赤血球グリコホリンである。ウシ下顎腺
ムチンはニシザワ(Nisizawa.K.)及びピグマン(Pigma
n.W.)の記載した方法により[Arch.0ral BioI.,1,161
(1959)]ウシ下顎腺から得ることができる。ヒツジ下顎
腺ムチンは既に記載のある同様の方法[Tettamanti,G.,
and Pigman,W.,Arch,Biochem.Biophys.,124,45-50(196
8)]により調製できる。
ムチン及びヒト赤血球グリコホリンである。ウシ下顎腺
ムチンはニシザワ(Nisizawa.K.)及びピグマン(Pigma
n.W.)の記載した方法により[Arch.0ral BioI.,1,161
(1959)]ウシ下顎腺から得ることができる。ヒツジ下顎
腺ムチンは既に記載のある同様の方法[Tettamanti,G.,
and Pigman,W.,Arch,Biochem.Biophys.,124,45-50(196
8)]により調製できる。
【0049】ヒト赤血球糖蛋白質はヒト赤血球膜から、
Marchesi,V.T.及びAndrews,E.
D.が最初に記載した方法[Science,174,1247-1248 (1
971)]により得ることができる。
Marchesi,V.T.及びAndrews,E.
D.が最初に記載した方法[Science,174,1247-1248 (1
971)]により得ることができる。
【0050】ウシ下顎腺ムチン及びヒト赤血球グリコホ
リンはピーナッツレクチンに対する強い反応性により特
徴付けられる。しかし、上記構造を有する他のタイプの
糖蛋白質も、T抗原を得るために用いることができる。
リンはピーナッツレクチンに対する強い反応性により特
徴付けられる。しかし、上記構造を有する他のタイプの
糖蛋白質も、T抗原を得るために用いることができる。
【0051】糖蛋白質が上記構造を有するかどうかは、
ピーナッツレクチンカラムを用いたアフィニティークロ
マトグラフィー [Carter.W.G.,and Sharon,N.,Arch.Bio
chem.Biophys.,180,570-582 (1977)]又は抗T抗体(Ch
emBiomed,Edmonston,Alberta,Canadaから購入可能)を
用いた糖蛋白質のイムノブロッティングにより測定でき
る。
ピーナッツレクチンカラムを用いたアフィニティークロ
マトグラフィー [Carter.W.G.,and Sharon,N.,Arch.Bio
chem.Biophys.,180,570-582 (1977)]又は抗T抗体(Ch
emBiomed,Edmonston,Alberta,Canadaから購入可能)を
用いた糖蛋白質のイムノブロッティングにより測定でき
る。
【0052】ヒツジ下顎腺ムチンはシアリダーゼ処理な
しにT抗原の核を含む。したがって、これを修飾なしに
T抗原免疫原として用いるこどができる。ヒツジ下顎腺
ムチンはヒツジ下顎腺から、先に記載した方法 [Teetam
anti and Pigman上記参照]で直接抽出及び精製するほ
かは、さらに精製をすることなく得られる。
しにT抗原の核を含む。したがって、これを修飾なしに
T抗原免疫原として用いるこどができる。ヒツジ下顎腺
ムチンはヒツジ下顎腺から、先に記載した方法 [Teetam
anti and Pigman上記参照]で直接抽出及び精製するほ
かは、さらに精製をすることなく得られる。
【0053】Tn抗原は、種々のタイプの糖蛋白質か
ら、エキソグリコシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼで
順次処理して得られる。しかし、β−ガラクトシダーゼ
はα−GalNAcに結合したβ1→3ガラクトシル構
造を切断可能でなければならない。
ら、エキソグリコシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼで
順次処理して得られる。しかし、β−ガラクトシダーゼ
はα−GalNAcに結合したβ1→3ガラクトシル構
造を切断可能でなければならない。
【0054】適当なエキソグリコシダーゼ及びβ−ガラ
クトシダーゼの例には、クロストリジウム ペルフリン
ゲンズ(Clostridium perfringens)(Sigma Chemical
Co.,St.Louis,MO製)由来のシアリダーゼ及びカロニア
ランパス(Caronia lampas)(Seikagaku Kogyo,Tokyo,
日本製)のβ−ガラクトシダーゼが含まれる [Hirohash
i et al.,上記参照]。
クトシダーゼの例には、クロストリジウム ペルフリン
ゲンズ(Clostridium perfringens)(Sigma Chemical
Co.,St.Louis,MO製)由来のシアリダーゼ及びカロニア
ランパス(Caronia lampas)(Seikagaku Kogyo,Tokyo,
日本製)のβ−ガラクトシダーゼが含まれる [Hirohash
i et al.,上記参照]。
【0055】エキソグリコシダーゼ及びβ−ガラクトシ
ダーゼによる順次処理は以下のように行う。0.02%
の適当なデタージェントを含む適当な緩衝液によるムチ
ンの安定な溶液を酵素と混合し、37℃で数時間〜18
時間インキュベートする。0.02〜0.05%のトリ
トンX−100又はNP40を含む50mMの酢酸緩衝
液pH4.5〜5.0がしばしば用いられる。
ダーゼによる順次処理は以下のように行う。0.02%
の適当なデタージェントを含む適当な緩衝液によるムチ
ンの安定な溶液を酵素と混合し、37℃で数時間〜18
時間インキュベートする。0.02〜0.05%のトリ
トンX−100又はNP40を含む50mMの酢酸緩衝
液pH4.5〜5.0がしばしば用いられる。
【0056】次に、この様に処理した糖蛋白質を免疫原
として用いるために、上記の適当なカラムでゲル濾過す
ることにより精製する。修飾されないムチンの存在はイ
ンビボでの修飾ムチンの免疫反応に影響しないため、免
疫原の精製は必須ではない。
として用いるために、上記の適当なカラムでゲル濾過す
ることにより精製する。修飾されないムチンの存在はイ
ンビボでの修飾ムチンの免疫反応に影響しないため、免
疫原の精製は必須ではない。
【0057】更に、ヒツジ下顎腺ムチンのような幾つか
の動物ムチンは天然型に多量のTn抗原を含む。従っ
て、天然ヒツジ下顎ムチンはTn免疫反応を引き起こす
優秀な免疫原である。
の動物ムチンは天然型に多量のTn抗原を含む。従っ
て、天然ヒツジ下顎ムチンはTn免疫反応を引き起こす
優秀な免疫原である。
【0058】ヒツジ下顎線ムチンは上記のようにして得
られる。
られる。
【0059】他の効果的なTn免疫原はヒト偏平上皮細
胞癌細胞ラインLU−65から分泌される天然Tn糖蛋
白質である。この細胞は懸濁液として培養され、既使用
(spent)培地は凍結乾燥して体積を初めの1/50ま
で減小させる。次いで濃縮既使用培地を0.01%ナト
リウムアジドを含むリン酸緩衝生理食塩液に4℃で十分
に透析する。次に、透析した物質をセファロース4Bに
かけ、ゲル濾過する。ポイドポリュームをプールし、さ
らに濃縮し、セファクリル200で再度クロマトグラフ
を行う(第1図参照)。ボイドボリュームの糖蛋白質分
画を免疫原として用いる。ヒト偏平上皮肺癌細胞ライン
QG56及びヒトヘパトーマ細胞ラインHUH−7(第
5図参照)のように抗Tn抗体に高反応性を示す細胞ラ
インの既使用培地も又、Tn抗原の調製に使用できる。
胞癌細胞ラインLU−65から分泌される天然Tn糖蛋
白質である。この細胞は懸濁液として培養され、既使用
(spent)培地は凍結乾燥して体積を初めの1/50ま
で減小させる。次いで濃縮既使用培地を0.01%ナト
リウムアジドを含むリン酸緩衝生理食塩液に4℃で十分
に透析する。次に、透析した物質をセファロース4Bに
かけ、ゲル濾過する。ポイドポリュームをプールし、さ
らに濃縮し、セファクリル200で再度クロマトグラフ
を行う(第1図参照)。ボイドボリュームの糖蛋白質分
画を免疫原として用いる。ヒト偏平上皮肺癌細胞ライン
QG56及びヒトヘパトーマ細胞ラインHUH−7(第
5図参照)のように抗Tn抗体に高反応性を示す細胞ラ
インの既使用培地も又、Tn抗原の調製に使用できる。
【0060】シアリルTn抗原の分布は、どちらかとい
えば限られている。しかし、本発明に有用なシアリルT
n抗原の一つの供給源は、偏平上皮肺癌細胞ラインQG
56及びLU−65の培養上清である [Hirohashi S.,e
t al.,Proc.NatI.Acad.Sci.USA,82,7039-7043 (198
5)]。
えば限られている。しかし、本発明に有用なシアリルT
n抗原の一つの供給源は、偏平上皮肺癌細胞ラインQG
56及びLU−65の培養上清である [Hirohashi S.,e
t al.,Proc.NatI.Acad.Sci.USA,82,7039-7043 (198
5)]。
【0061】第二の供給源はまた、高密度のシアリルT
nを含むヒツジ下顎腺ムチンである。
nを含むヒツジ下顎腺ムチンである。
【0062】培養上清から本発明の免疫原として有用な
形でシアリルTnを得るために、上記の種々の細胞ライ
ンを既知の方法に従い培養する。培養上清は、Tn抗原
についての上記記載と同様の方法で処理しシアリルTn
抗原を得る。ただし、シアリル結合は不安定なので、全
ての工程は限られた時間内及び低温(4℃)で行わなけ
ればならない。培養上清からムチンを調製する典型例は
下記の実施例1に記す。
形でシアリルTnを得るために、上記の種々の細胞ライ
ンを既知の方法に従い培養する。培養上清は、Tn抗原
についての上記記載と同様の方法で処理しシアリルTn
抗原を得る。ただし、シアリル結合は不安定なので、全
ての工程は限られた時間内及び低温(4℃)で行わなけ
ればならない。培養上清からムチンを調製する典型例は
下記の実施例1に記す。
【0063】ヒツジ下顎腺ムチンはヒツジ下顎腺から
得、Tettamanti及びPigmanらの方法
(上記参照)により精製する。
得、Tettamanti及びPigmanらの方法
(上記参照)により精製する。
【0064】炭水化物エピトープT、Tn及びシアリル
Tnは、第12図及び第13図にお湯帯に示した様に化
学的に合成でき、またTamの記載の様に [Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,85,5409-5413 (1988)]t−ブトキシカル
ボニル−β−アラニンユニットに基く高度に分岐した合
成担体分子又はポリリジン、ヒト血清アルブミンの様な
合成又は天然の担体に共有結合することができる。炭水
化物エピトープTnの化学合成の詳細な記載は実施例4
に明らかにする。シアリルTnの合成はシアリル残基を
酵素的に又は化学的に付加することにより容易に行うこ
とができる。
Tnは、第12図及び第13図にお湯帯に示した様に化
学的に合成でき、またTamの記載の様に [Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,85,5409-5413 (1988)]t−ブトキシカル
ボニル−β−アラニンユニットに基く高度に分岐した合
成担体分子又はポリリジン、ヒト血清アルブミンの様な
合成又は天然の担体に共有結合することができる。炭水
化物エピトープTnの化学合成の詳細な記載は実施例4
に明らかにする。シアリルTnの合成はシアリル残基を
酵素的に又は化学的に付加することにより容易に行うこ
とができる。
【0065】免疫の方法 上記記載のように調製した免疫原を免疫のため以下のよ
うに処理する。
うに処理する。
【0066】糖蛋白質抗原(例えば4.0mg)を蒸留
水(例えば4m1)に溶解し、適当な量の酸処理サルモ
ネラミネソタ(Salmonella minnesota)(例えば16m
g)と完全に混合し、凍結乾燥する。乾燥した混合物を
適当な容量(例えば4.0ml)の適当なキャリアー
(例えば140mM NaClを含む20mMリン酸緩
衝液pH7.0)に懸濁し、そのうち約100μl(即
ちムチン100μg及びバクテリア400μg)を静脈
内投与した。
水(例えば4m1)に溶解し、適当な量の酸処理サルモ
ネラミネソタ(Salmonella minnesota)(例えば16m
g)と完全に混合し、凍結乾燥する。乾燥した混合物を
適当な容量(例えば4.0ml)の適当なキャリアー
(例えば140mM NaClを含む20mMリン酸緩
衝液pH7.0)に懸濁し、そのうち約100μl(即
ちムチン100μg及びバクテリア400μg)を静脈
内投与した。
【0067】免疫スケジュールはムチン抗原の型によら
ず、ほぼ同様である。免疫はバクテリアへの吸着の代わ
りに完全フロイントアジュバントと共に行うこともで
き、ムチン及びサルモネラミネソタ(Salmonella minne
sota)の量比は変化できる。既に記載されているように
[Yang,W.W.,et al.,J.Exp.Med.,150,1008-1019 (197
9)]、サルモネラミネソタを酢酸処理した時、最も良い
結果が得られている。
ず、ほぼ同様である。免疫はバクテリアへの吸着の代わ
りに完全フロイントアジュバントと共に行うこともで
き、ムチン及びサルモネラミネソタ(Salmonella minne
sota)の量比は変化できる。既に記載されているように
[Yang,W.W.,et al.,J.Exp.Med.,150,1008-1019 (197
9)]、サルモネラミネソタを酢酸処理した時、最も良い
結果が得られている。
【0068】免疫に使用する宿主としては、任意の系統
のマウスやラット、又はその脾細胞がハイブリドーマの
調製に適当な、即ち、安定なハイブリドーマを確立する
ためのHAT感受性ミエローマ細胞ラインとの細胞融合
に感受性を有する、他の種類の動物が可能である。
のマウスやラット、又はその脾細胞がハイブリドーマの
調製に適当な、即ち、安定なハイブリドーマを確立する
ためのHAT感受性ミエローマ細胞ラインとの細胞融合
に感受性を有する、他の種類の動物が可能である。
【0069】免疫スケジュールは宿主動物のムチン免疫
に対する感受性に依存するが上記方法はマウスに適当で
ある。他の条件も又適用できる。適当な免疫スケジュー
ルは当業者が決定できる。
に対する感受性に依存するが上記方法はマウスに適当で
ある。他の条件も又適用できる。適当な免疫スケジュー
ルは当業者が決定できる。
【0070】例えば、Balb/cマウスに適当な免疫
スケジュールとしては、調製した免疫原を尾静脈から週
1回、5週間静脈内投与し、次いで1か月放置した後、
調製免疫原でプーストする。宿主に投与する免疫原製剤
の量はムチンの分子量、炭水化物エピトープの露出度、
及びムチン型糖蛋白質に関連するエピトープの特殊性と
密度に依存する。マウスに投与する糖蛋白質の範囲は、
生理食塩水100μlに懸濁したサルモネラミネソタ3
0〜50μgをコートされた3〜5μgであり、体重1
00〜150gの各マウス個体に静脈内投与する。
スケジュールとしては、調製した免疫原を尾静脈から週
1回、5週間静脈内投与し、次いで1か月放置した後、
調製免疫原でプーストする。宿主に投与する免疫原製剤
の量はムチンの分子量、炭水化物エピトープの露出度、
及びムチン型糖蛋白質に関連するエピトープの特殊性と
密度に依存する。マウスに投与する糖蛋白質の範囲は、
生理食塩水100μlに懸濁したサルモネラミネソタ3
0〜50μgをコートされた3〜5μgであり、体重1
00〜150gの各マウス個体に静脈内投与する。
【0071】完全フロイントアジュバントを用いる時
は、500μlの生理食塩水中の約20μgの糖蛋白質
を500μlの完全フロイントアジュバントと共に乳化
し、約200μlを複数の部位に皮下投与する(約50
μl/サイト)。サルモネラミネソタをコートされ、又
は完全フロイントアジュバントと混合した、同様の量の
抗原が、ラット、ハムスター又はモルモットの様な他の
宿主に使用され、数倍量の抗原が、ウサギの様な他の宿
主に使用される。動物の体重に比例して抗原量を増加さ
せる必要は無い。
は、500μlの生理食塩水中の約20μgの糖蛋白質
を500μlの完全フロイントアジュバントと共に乳化
し、約200μlを複数の部位に皮下投与する(約50
μl/サイト)。サルモネラミネソタをコートされ、又
は完全フロイントアジュバントと混合した、同様の量の
抗原が、ラット、ハムスター又はモルモットの様な他の
宿主に使用され、数倍量の抗原が、ウサギの様な他の宿
主に使用される。動物の体重に比例して抗原量を増加さ
せる必要は無い。
【0072】免疫は、十分な抗体が全血清から検出され
るまで繰り返す。宿主の脾細胞を取出し、脾細胞をHA
T感受性ミエローマ細胞とよく確立された技術により融
合する [Kohler,G.AND Milstein,C.,Nature,256,495-49
7 (1975) and Young,W.W.etal(上記参照)]。HAT
感受性ミエローマ細胞としては、例えばNS−1、SP
−1又はSP−2が可能であるが、任意の種類のHAT
感受性ミエローマ細胞を用いることができる。場合によ
り、宿主血清中に抗体が検出されなくても、宿主脾細胞
とミエローマ細胞との融合の後ハイブリドーマを確立で
きる。従って、細胞融合の前に抗体を検出することは必
須ではない。融合は、通常ヤングらの記載のように(上
記)、ポリエチレングリコール中で行われる。
るまで繰り返す。宿主の脾細胞を取出し、脾細胞をHA
T感受性ミエローマ細胞とよく確立された技術により融
合する [Kohler,G.AND Milstein,C.,Nature,256,495-49
7 (1975) and Young,W.W.etal(上記参照)]。HAT
感受性ミエローマ細胞としては、例えばNS−1、SP
−1又はSP−2が可能であるが、任意の種類のHAT
感受性ミエローマ細胞を用いることができる。場合によ
り、宿主血清中に抗体が検出されなくても、宿主脾細胞
とミエローマ細胞との融合の後ハイブリドーマを確立で
きる。従って、細胞融合の前に抗体を検出することは必
須ではない。融合は、通常ヤングらの記載のように(上
記)、ポリエチレングリコール中で行われる。
【0073】本発明で使用する好ましいミエローマ細胞
ラインはSP−2である。
ラインはSP−2である。
【0074】融合細胞は96ウェルプレートで、ミニク
ローンが形成されるまで培養する。多くの増殖する生存
融合細胞を得るためには、最終ブースター投与の48〜
72時間後に脾細胞を用い、よく分化したミエローマ細
泡と融合させることが重要である。インキュベーター中
の湿度及びCO2濃度は、融合細胞の培養初期の段階に
注意深く制御しなくてはならない。
ローンが形成されるまで培養する。多くの増殖する生存
融合細胞を得るためには、最終ブースター投与の48〜
72時間後に脾細胞を用い、よく分化したミエローマ細
泡と融合させることが重要である。インキュベーター中
の湿度及びCO2濃度は、融合細胞の培養初期の段階に
注意深く制御しなくてはならない。
【0075】支持細胞(feeder celI)は、本発明の方
法に従って融合細胞を増殖させるためには必須ではな
い。当業者は適当な培養条件を容易に決定できる。
法に従って融合細胞を増殖させるためには必須ではな
い。当業者は適当な培養条件を容易に決定できる。
【0076】適当な培養時間の後、免疫に使用した糖蛋
白質の核構造と反応する抗体を分泌するハイブリドーマ
を、限界希釈法によりクローニング及びサブクローニン
グする。即ち、新たな培養体当り1個以下の細胞しか期
待されない点まで希釈した後、ウェルにプレーティング
する。
白質の核構造と反応する抗体を分泌するハイブリドーマ
を、限界希釈法によりクローニング及びサブクローニン
グする。即ち、新たな培養体当り1個以下の細胞しか期
待されない点まで希釈した後、ウェルにプレーティング
する。
【0077】一般に、96ウェルプレートの各ウェル
を、糖蛋白質のPBS溶液と共にインキュベートするこ
とにより、免疫原として使用した核構造を含むムチン糖
蛋白質でコートする。即ち、5〜10μg/50μl/
ウェルを加え、一晩インキュベートする。糖蛋白質溶液
を除去し、洗浄し、さらにウシ血清アルブミン(10μ
g/50μl/ウェル)と共にインキュベートし、抗体
のスクリーニングに使用する前にプレートをブロックす
る。この方法はヒロハシらにより記載されている(上記
参照)。
を、糖蛋白質のPBS溶液と共にインキュベートするこ
とにより、免疫原として使用した核構造を含むムチン糖
蛋白質でコートする。即ち、5〜10μg/50μl/
ウェルを加え、一晩インキュベートする。糖蛋白質溶液
を除去し、洗浄し、さらにウシ血清アルブミン(10μ
g/50μl/ウェル)と共にインキュベートし、抗体
のスクリーニングに使用する前にプレートをブロックす
る。この方法はヒロハシらにより記載されている(上記
参照)。
【0078】特別の抗原と反応する抗体を分泌するハイ
ブリドーマを、以下のようにしてスクリーニングした。
抗原でコートしたウェルに結合した抗体は、最初にヤン
グらが記載したように(上記参照)、通常、二次抗体
(抗マウスIgM及びIgGヤギ又はウサギ抗体)の後
125Iラベル化プロテインAにより検出する。本方法は
市販のELISAアッセイより感受性が良いが、ELI
SAも使用可能である。ELISA法は市販の自動リー
ダー及びELISAキットの使用により便利に行われ
る。
ブリドーマを、以下のようにしてスクリーニングした。
抗原でコートしたウェルに結合した抗体は、最初にヤン
グらが記載したように(上記参照)、通常、二次抗体
(抗マウスIgM及びIgGヤギ又はウサギ抗体)の後
125Iラベル化プロテインAにより検出する。本方法は
市販のELISAアッセイより感受性が良いが、ELI
SAも使用可能である。ELISA法は市販の自動リー
ダー及びELISAキットの使用により便利に行われ
る。
【0079】このようにして、本発明の方法に従い単離
されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル
抗体は、ハイブリドーマ細胞培養体の大バッチを増殖さ
せ上清から抗体を精製することにより、又はハイブリド
ーマラインをマウスに投与し腹腔液の生成を刺激するこ
とにより、多量に製造できる。両方法は技術的によく知
られている。本発明に従ってモノクローナル抗体を多量
に製造する方法はヤングらにより記載されている(上記
参照)。
されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル
抗体は、ハイブリドーマ細胞培養体の大バッチを増殖さ
せ上清から抗体を精製することにより、又はハイブリド
ーマラインをマウスに投与し腹腔液の生成を刺激するこ
とにより、多量に製造できる。両方法は技術的によく知
られている。本発明に従ってモノクローナル抗体を多量
に製造する方法はヤングらにより記載されている(上記
参照)。
【0080】本発明に従い単離されたハイブリドーマは
懸濁培養の大バッチで増殖させ、又は、より簡便には、
細胞がパックされ高密度に成育し、その中で抗体が培地
中に拡散することができるファイバーグラスコンテナー
中で、増殖させることができる。モノクローナル抗体
は、例えばプロテインAを用いるアフィニティー単離、
逆相アルキル化シリカゲルによる高圧液体クロマトグラ
フィー又は合成ポリスチレンゲル濾過カラムの様な知ら
れた方法により精製できる。
懸濁培養の大バッチで増殖させ、又は、より簡便には、
細胞がパックされ高密度に成育し、その中で抗体が培地
中に拡散することができるファイバーグラスコンテナー
中で、増殖させることができる。モノクローナル抗体
は、例えばプロテインAを用いるアフィニティー単離、
逆相アルキル化シリカゲルによる高圧液体クロマトグラ
フィー又は合成ポリスチレンゲル濾過カラムの様な知ら
れた方法により精製できる。
【0081】上記方法に従えば、モノクローナル抗体を
分泌するハイブリドーマは、常法により製造された抗体
と比べて、少なくとも質的に同等の優れた抗体を製造で
き、むしろ、本発明のモノクローナル抗体は、完全なグ
リコシル化構造を持つ正常糖配列を有する正常糖蛋白質
と好ましくない交叉反応をしない点で、公知のヒト癌関
連抗原に特異的なモノクローナル抗体よりも優れてい
る。本発明の方法に従って分離された3種の好ましいモ
ノクローナル抗体は、BM−8、BM−3及びBM−4
である。これらモノクローナル抗体を分泌する、ハイブ
リドーマBM−8、BM−3及びBM−4と名付けられ
たハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション、ロックビル、メリーランドに寄託され
ており、各々のATCC寄託番号は、HB−9873、
HB−9653及びHB−9654である。本発明に従
うモノクローナル抗体BM−8はハイブリドーマBM−
8により分泌され、以下の確認された性質を有する。
分泌するハイブリドーマは、常法により製造された抗体
と比べて、少なくとも質的に同等の優れた抗体を製造で
き、むしろ、本発明のモノクローナル抗体は、完全なグ
リコシル化構造を持つ正常糖配列を有する正常糖蛋白質
と好ましくない交叉反応をしない点で、公知のヒト癌関
連抗原に特異的なモノクローナル抗体よりも優れてい
る。本発明の方法に従って分離された3種の好ましいモ
ノクローナル抗体は、BM−8、BM−3及びBM−4
である。これらモノクローナル抗体を分泌する、ハイブ
リドーマBM−8、BM−3及びBM−4と名付けられ
たハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション、ロックビル、メリーランドに寄託され
ており、各々のATCC寄託番号は、HB−9873、
HB−9653及びHB−9654である。本発明に従
うモノクローナル抗体BM−8はハイブリドーマBM−
8により分泌され、以下の確認された性質を有する。
【0082】(1)IgG2aイソタイプであり、(2〉
Tn抗原と反応し、(3)GalNAcに特異的であ
り、GlcNAc、Gal又はGlcには特異的でな
く、(4)α−GalNAcにエピトープ特異性を有
し、β−GalNAcにはエピトープ特異性を有さず、
且つ(5)血液型Aとは交叉反応しない。
Tn抗原と反応し、(3)GalNAcに特異的であ
り、GlcNAc、Gal又はGlcには特異的でな
く、(4)α−GalNAcにエピトープ特異性を有
し、β−GalNAcにはエピトープ特異性を有さず、
且つ(5)血液型Aとは交叉反応しない。
【0083】更に、モノクローナル抗体BM−8は、第
3図に示し、下記の実施例1に記載したように、種々の
細胞ラインと結合する。モノクローナル抗体BM−8
は、正常ヒト線維芽細胞BRASCH及びWI−38又
は腫瘍細胞ラインHEL−299及びIMR−90とは
反応しない。
3図に示し、下記の実施例1に記載したように、種々の
細胞ラインと結合する。モノクローナル抗体BM−8
は、正常ヒト線維芽細胞BRASCH及びWI−38又
は腫瘍細胞ラインHEL−299及びIMR−90とは
反応しない。
【0084】モノクローナル抗体BM−8は、第4図に
示し、下記実施例1に記載したように、種々の腫瘍細胞
に対するサイトトキシック細胞の活性化を示す。特に、
ヒト赤白血病細胞ラインK562及びヒト偏平上皮細胞
肺癌LU−65は、モノクローナル抗体BM−8により
誘導される抗体依存性細胞障害(antibody-dependentcy
totoxicity)に顕著な感受性を示し、ヒト線維芽細胞B
RASCH及びWI−38並びにヒト赤白血病細胞ライ
ンHEL299はBM−8依存性細胞障害に感受性を持
たない。
示し、下記実施例1に記載したように、種々の腫瘍細胞
に対するサイトトキシック細胞の活性化を示す。特に、
ヒト赤白血病細胞ラインK562及びヒト偏平上皮細胞
肺癌LU−65は、モノクローナル抗体BM−8により
誘導される抗体依存性細胞障害(antibody-dependentcy
totoxicity)に顕著な感受性を示し、ヒト線維芽細胞B
RASCH及びWI−38並びにヒト赤白血病細胞ライ
ンHEL299はBM−8依存性細胞障害に感受性を持
たない。
【0085】Tn抗原に対するIgMモノクローナル抗
体を分泌する2個のハイブリドーマNCC−LU−35
及び−81は、既に確立されている。これらの抗体は肺
偏平上皮細胞癌LU−65により免疫した後、得られる
[Hirohashi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7029-
7043 (1985)]。抗体B−M−8の細胞増殖の阻害及び
細胞障害の性質は、本抗体を明確にNCC−LU−35
及び−81由来の抗体と区別する。
体を分泌する2個のハイブリドーマNCC−LU−35
及び−81は、既に確立されている。これらの抗体は肺
偏平上皮細胞癌LU−65により免疫した後、得られる
[Hirohashi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7029-
7043 (1985)]。抗体B−M−8の細胞増殖の阻害及び
細胞障害の性質は、本抗体を明確にNCC−LU−35
及び−81由来の抗体と区別する。
【0086】本発明のモノクローナル抗体BM−3はハ
イブリドーマBM−3から分泌され、以下の確認された
性質を有する: (1)IgMイソタイプであり、(2)シアリルTn抗
原と反応し、T抗原とは反応せず、及び(3)Neu
Acα2→6GalNAcα1→O−Ser/Thrに
対しエピトープ特異性を有し、NeuAcα2→6Ga
lNAcβ1→O−Ser/Thrにはエピトープ特異
性を有さない。
イブリドーマBM−3から分泌され、以下の確認された
性質を有する: (1)IgMイソタイプであり、(2)シアリルTn抗
原と反応し、T抗原とは反応せず、及び(3)Neu
Acα2→6GalNAcα1→O−Ser/Thrに
対しエピトープ特異性を有し、NeuAcα2→6Ga
lNAcβ1→O−Ser/Thrにはエピトープ特異
性を有さない。
【0087】本発明のモノクローナル抗体BM−4はハ
イブリドーマBM−4から分泌され、以下の確認された
性質を有する: (1)IgG1イソタイプであり、(2)シアリルTn
抗原と反応し、T抗原又はTn抗原とは反応せず、
(3)NeuAcα2→6GalNAcα1→O−Se
r/Thrに対しエピトープ特異性を有し、NeuAc
α2→6GalNAcβ1→O−Ser/Thrにはエ
ピトープ特異性を有さず、及び(4)容易にFab又は
(Fab)2フラグメントに分解される。
イブリドーマBM−4から分泌され、以下の確認された
性質を有する: (1)IgG1イソタイプであり、(2)シアリルTn
抗原と反応し、T抗原又はTn抗原とは反応せず、
(3)NeuAcα2→6GalNAcα1→O−Se
r/Thrに対しエピトープ特異性を有し、NeuAc
α2→6GalNAcβ1→O−Ser/Thrにはエ
ピトープ特異性を有さず、及び(4)容易にFab又は
(Fab)2フラグメントに分解される。
【0088】抗体イソタイプの確認 本発明に方法に従い単離されたモノクローナル抗体のイ
ソタイプは、Cappel Laboratriesのような種々の業者か
ら購入できるイソタイプ特異的抗マウス抗体に対する抗
体を用いた、固相ラジオイムノアッセイの様な通常の方
法により確認できる。
ソタイプは、Cappel Laboratriesのような種々の業者か
ら購入できるイソタイプ特異的抗マウス抗体に対する抗
体を用いた、固相ラジオイムノアッセイの様な通常の方
法により確認できる。
【0089】抗体の特異性の確認 本発明に従い単離された抗体の特異性は、天然の及び酵
素的又は化学的に処理したムチン型糖蛋白質に対する
(1)競合結合アッセイ、(2)阻害アッセイ、(3〉
結合アッセイを含む多くの方法で確認できる。
素的又は化学的に処理したムチン型糖蛋白質に対する
(1)競合結合アッセイ、(2)阻害アッセイ、(3〉
結合アッセイを含む多くの方法で確認できる。
【0090】競合結合アッセイ 本アッセイは固相ラジオイムノアッセイ(RIA)競合
アッセイである。本アッセイは、本発明の方法に従い分
離されたモノクローナル抗体の使用及び本発明の方法に
従い分離されたモノクローナル抗体が有すると推定され
るのと同じ抗原特異性を有すると知られている他のモノ
クローナル抗体1種以上の使用を含む。さらに2種のモ
ノクローナル抗体は、異なるイソタイプを有し、又は共
に存在した時に二次抗体に別々に認識され得るような異
なる種由来のものでなければならない。
アッセイである。本アッセイは、本発明の方法に従い分
離されたモノクローナル抗体の使用及び本発明の方法に
従い分離されたモノクローナル抗体が有すると推定され
るのと同じ抗原特異性を有すると知られている他のモノ
クローナル抗体1種以上の使用を含む。さらに2種のモ
ノクローナル抗体は、異なるイソタイプを有し、又は共
に存在した時に二次抗体に別々に認識され得るような異
なる種由来のものでなければならない。
【0091】このアッセイにおいて、既知の特異性を有
する各モノクローナル抗体について、2つのインキュベ
ーションを行う。即ち、1つのインキュベーションは、
2つのモノクローナル抗体のうちlつを一定量で用い、
チャレンジするモノクローナル抗体を順次増加して用い
て行う。他のインキュベーションでは、2つのモノクロ
ーナル抗体の役割を入れ替える。即ち、最初のインキュ
ベーションで一定量用いた抗体を、二回目のインキュベ
ーションでは順次増加して用い、最初のインキュベーシ
ョンで順次増加して用いた抗体を、二回目のインキュベ
ーションでは一定量用いる。
する各モノクローナル抗体について、2つのインキュベ
ーションを行う。即ち、1つのインキュベーションは、
2つのモノクローナル抗体のうちlつを一定量で用い、
チャレンジするモノクローナル抗体を順次増加して用い
て行う。他のインキュベーションでは、2つのモノクロ
ーナル抗体の役割を入れ替える。即ち、最初のインキュ
ベーションで一定量用いた抗体を、二回目のインキュベ
ーションでは順次増加して用い、最初のインキュベーシ
ョンで順次増加して用いた抗体を、二回目のインキュベ
ーションでは一定量用いる。
【0092】各インキュベーションでは、2つの抗体は
最初に混合され、次いで抗体の混合物を調べたい抗原と
共にインキュベートする。簡単に述べると、順次希釈し
た(約12希釈で十分である)1つの抗体(約1.5μ
g〜60ng)を、100μlの適当な緩衝液中、例え
ばPBS中の約1.5μgの他の抗体に加える。次に、
2種のモノクローナル抗体の役割を入れ替えた反応を行
う。各混合物の量を同じ緩衝液、例えばPBSで200
μlに調整し、そのうち約100μlの2種の抗体の混
合液を、予め調べたい抗原でコートし(約5μg/ウェ
ル)、PBS中の1%BSAでブロックしたアッセイプ
レート中で、一晩4℃でインキュベートする。インキュ
ベーションの後、プレートを適当な回数、例えば3回、
適当な緩衝液、例えばPBSで洗浄し、チャレンジ後抗
原に結合したままのモノクローナル抗体の量を、種又は
サブクラス特異的抗体(例えばマウスIgMに対しては
抗マウスIgM、マウスIgG3に対しては抗マウスI
gG3)と反応させた後、適当にラベルしたプローブと
反応させて測定する。
最初に混合され、次いで抗体の混合物を調べたい抗原と
共にインキュベートする。簡単に述べると、順次希釈し
た(約12希釈で十分である)1つの抗体(約1.5μ
g〜60ng)を、100μlの適当な緩衝液中、例え
ばPBS中の約1.5μgの他の抗体に加える。次に、
2種のモノクローナル抗体の役割を入れ替えた反応を行
う。各混合物の量を同じ緩衝液、例えばPBSで200
μlに調整し、そのうち約100μlの2種の抗体の混
合液を、予め調べたい抗原でコートし(約5μg/ウェ
ル)、PBS中の1%BSAでブロックしたアッセイプ
レート中で、一晩4℃でインキュベートする。インキュ
ベーションの後、プレートを適当な回数、例えば3回、
適当な緩衝液、例えばPBSで洗浄し、チャレンジ後抗
原に結合したままのモノクローナル抗体の量を、種又は
サブクラス特異的抗体(例えばマウスIgMに対しては
抗マウスIgM、マウスIgG3に対しては抗マウスI
gG3)と反応させた後、適当にラベルしたプローブと
反応させて測定する。
【0093】種又はサブクラス特異的抗体との反応に適
当な反応時間は、約2時間であり、適当な反応温度は室
温即ち22〜25℃である。
当な反応時間は、約2時間であり、適当な反応温度は室
温即ち22〜25℃である。
【0094】反応の後、プレートを適当な回数、例えば
3回、適当な緩衝液、例えばPBSで洗浄し、適当にラ
ベルしたプローブを加える。適当なプローブの1つの例
は、125Iラベル化プロテインAである。例えば1.3
時間室温、即ち22〜25℃での適当なインキュベーシ
ョンの後、プレートを例えば5回、例えばPBSのよう
な適当な緩衝液で再度洗浄し、使用したラベルの種類に
従いプローブの量を定量する。例えば、125Iラベル化
プローブはガンマーカウンターでカウントする。
3回、適当な緩衝液、例えばPBSで洗浄し、適当にラ
ベルしたプローブを加える。適当なプローブの1つの例
は、125Iラベル化プロテインAである。例えば1.3
時間室温、即ち22〜25℃での適当なインキュベーシ
ョンの後、プレートを例えば5回、例えばPBSのよう
な適当な緩衝液で再度洗浄し、使用したラベルの種類に
従いプローブの量を定量する。例えば、125Iラベル化
プローブはガンマーカウンターでカウントする。
【0095】本発明の方法に従って単離されたモノクロ
ーナル抗体の特定の抗原に対する結合が、既知の特異性
を有するモノクローナル抗体により競合的に阻害された
場合には、本発明の方法に従い単離されたモノクローナ
ル抗体はその特定の抗原に特異性を持つと考えられる。
ーナル抗体の特定の抗原に対する結合が、既知の特異性
を有するモノクローナル抗体により競合的に阻害された
場合には、本発明の方法に従い単離されたモノクローナ
ル抗体はその特定の抗原に特異性を持つと考えられる。
【0096】本アッセイが、通常抗マウスIgG+Ig
Mである二次抗体を、省いて行うことができることは、
当業者に明らかである。
Mである二次抗体を、省いて行うことができることは、
当業者に明らかである。
【0097】阻害アッセイ 本発明の方法に従い分離された抗体は糖蛋白質の核構造
に対するものであるので、特異性は、そのモノクローナ
ル抗体が対すると仮定される抗原への結合能に対する、
種々の単糖及び二糖の阻害能をアッセイすることにより
確認できる。
に対するものであるので、特異性は、そのモノクローナ
ル抗体が対すると仮定される抗原への結合能に対する、
種々の単糖及び二糖の阻害能をアッセイすることにより
確認できる。
【0098】アッセイはモノクローナル抗体を種々の単
糖又は二糖とインキュベートすることにより行われる。
モノクローナル抗体と糖との適当なモル比は約1:5か
ら約1:100で、適当な緩衝液はPBSである。イン
キュベーションはモノクローナル抗体が糖と反応するの
に十分な時間及び温度で、例えば、室温付近で1時間行
う。インキュベーションの後、モノクローナル抗体/糖
の混合物の部分を取出し、モノクローナル抗体が特異性
を有すると仮定される抗原と、上記と類似の方法でイン
キュベートする。即ち、予めPBSの様な適当な緩衝液
中で、抗原でコートしBSAでブロックしたウェルに、
混合物の部分を加える。抗原との適当なインキュベーシ
ョン条件は、4℃一晩である。
糖又は二糖とインキュベートすることにより行われる。
モノクローナル抗体と糖との適当なモル比は約1:5か
ら約1:100で、適当な緩衝液はPBSである。イン
キュベーションはモノクローナル抗体が糖と反応するの
に十分な時間及び温度で、例えば、室温付近で1時間行
う。インキュベーションの後、モノクローナル抗体/糖
の混合物の部分を取出し、モノクローナル抗体が特異性
を有すると仮定される抗原と、上記と類似の方法でイン
キュベートする。即ち、予めPBSの様な適当な緩衝液
中で、抗原でコートしBSAでブロックしたウェルに、
混合物の部分を加える。抗原との適当なインキュベーシ
ョン条件は、4℃一晩である。
【0099】次いで、抗原に対するモノクローナル抗体
の結合に対する種々の糖の阻害効果を、上記固相RIA
により確認した。
の結合に対する種々の糖の阻害効果を、上記固相RIA
により確認した。
【0100】当業者は、阻害実験に使用する適当な糖を
容易に決めることができる。
容易に決めることができる。
【0101】例えば、Tn抗原に特異性を有すると仮定
されるモノクローナル抗体については、GalNAc、
GlcNAc、Gal及びGlcの単糖が使用できる。
もしもモノクローナル抗体が実際Tn抗原に特異的なら
ば、モノクローナル抗体の抗原に対する結合はGalN
Acに阻害され、他の3つの糖には阻害されない。更
に、Tn抗原に特異的なモノクローナル抗体について
は、抗体が特異性を有するGalNAcの実際のエピト
ープは、p−ニトロフェニル−α−D−GalNAc、
p−ニトロフェニル−β−D−GalNAc、並びにα
−誘導体の混合物及びβ−p−ニトロフェニル誘導体の
混合物を用いた阻害アッセイを行うことにより確認でき
る。
されるモノクローナル抗体については、GalNAc、
GlcNAc、Gal及びGlcの単糖が使用できる。
もしもモノクローナル抗体が実際Tn抗原に特異的なら
ば、モノクローナル抗体の抗原に対する結合はGalN
Acに阻害され、他の3つの糖には阻害されない。更
に、Tn抗原に特異的なモノクローナル抗体について
は、抗体が特異性を有するGalNAcの実際のエピト
ープは、p−ニトロフェニル−α−D−GalNAc、
p−ニトロフェニル−β−D−GalNAc、並びにα
−誘導体の混合物及びβ−p−ニトロフェニル誘導体の
混合物を用いた阻害アッセイを行うことにより確認でき
る。
【0102】もしも、モノクローナル抗体がTn抗原に
特異的ならば、モノクローナル抗体のTn抗原に対する
結合は、α−p−ニトロフェニル誘導体に阻害され、β
−p−ニトロフェニル誘導体には阻害されない。さら
に、完全ではないある程度の阻害が、α−p−ニトロフ
ェニル誘導体及びβ−p−ニトロフェニル誘導体混合物
で見られる。
特異的ならば、モノクローナル抗体のTn抗原に対する
結合は、α−p−ニトロフェニル誘導体に阻害され、β
−p−ニトロフェニル誘導体には阻害されない。さら
に、完全ではないある程度の阻害が、α−p−ニトロフ
ェニル誘導体及びβ−p−ニトロフェニル誘導体混合物
で見られる。
【0103】さらなる例として、もしもモノクローナル
抗体がシアリルTn抗原に特異性を有するならば、Ga
lNAc及びNeuAc、L−フコース、D−ガラクト
ース、D−グルコース及びD−N−アセチルグルコサミ
ンの様な単糖を用いて阻害アッセイを行うことができ
る。
抗体がシアリルTn抗原に特異性を有するならば、Ga
lNAc及びNeuAc、L−フコース、D−ガラクト
ース、D−グルコース及びD−N−アセチルグルコサミ
ンの様な単糖を用いて阻害アッセイを行うことができ
る。
【0104】抗体がシアリルTn抗原に特異的であれ
ば、抗体の抗原に対する結合はGalNAc及びNeu
Acにより阻害されるが他の単糖には阻害されない。
ば、抗体の抗原に対する結合はGalNAc及びNeu
Acにより阻害されるが他の単糖には阻害されない。
【0105】同様に、二糖NeuAcα2→6GalN
Acα1→O−セリンはシアリルTn抗原に特異的なモ
ノクローナル抗体の反応を阻害するが、ラクトースは阻
害活性を持たない。しかし、Tn抗原に対するモノクロ
ーナル抗体はNeuAcα2→6GalNAcβ1→O
構造と交叉反応可能であり、従って、この構造のO−プ
ロピル誘導体には軽度に阻害される。
Acα1→O−セリンはシアリルTn抗原に特異的なモ
ノクローナル抗体の反応を阻害するが、ラクトースは阻
害活性を持たない。しかし、Tn抗原に対するモノクロ
ーナル抗体はNeuAcα2→6GalNAcβ1→O
構造と交叉反応可能であり、従って、この構造のO−プ
ロピル誘導体には軽度に阻害される。
【0106】処理又は非処理のムチン型糖蛋白質に対す
る結合 本アッセイは、種々のムチンに対するある種の酵素的及
び/又は化学的処理が抗原構造を露出又は消失させると
いうという事実に基く。本アッセイは以下の様に行う。
ムチン型糖蛋白質で96ウェルのプラスティックプレー
トを、一晩10μg/50μlPBS/ウェルでインキ
ュベートすることによりコートする。プラスティック表
面に吸収させる糖蛋白質は、各々シアリダーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、並びにα−N−アセチルガラクトサミ
ニダーゼにより処理されたもの又はその未処理のもので
ある。次いで、この様な処理又は未処理の固相糖蛋白質
に対する抗体の結合を比較する。抗体BM−3により確
認されるシアリルTn活性は、プラスティック表面に吸
収されたヒツジ下顎腺ムチンの様なシアリルTn抗原を
シアリダーゼで処理すると、BM−8により確認される
Tn活性に変換できる。T又はTn活性を持たないヒト
赤血球グリコホリンAは、プラスティック表面に吸収さ
せ、シアリダーゼで処理するか(T抗原に変換する)、
又はシアリダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼで順次処理
すると(Tn抗原に変換する)、T又はTn抗原に変換
できる。このような方法はヒロハシらにより記載されて
いる(上記参照)。
る結合 本アッセイは、種々のムチンに対するある種の酵素的及
び/又は化学的処理が抗原構造を露出又は消失させると
いうという事実に基く。本アッセイは以下の様に行う。
ムチン型糖蛋白質で96ウェルのプラスティックプレー
トを、一晩10μg/50μlPBS/ウェルでインキ
ュベートすることによりコートする。プラスティック表
面に吸収させる糖蛋白質は、各々シアリダーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、並びにα−N−アセチルガラクトサミ
ニダーゼにより処理されたもの又はその未処理のもので
ある。次いで、この様な処理又は未処理の固相糖蛋白質
に対する抗体の結合を比較する。抗体BM−3により確
認されるシアリルTn活性は、プラスティック表面に吸
収されたヒツジ下顎腺ムチンの様なシアリルTn抗原を
シアリダーゼで処理すると、BM−8により確認される
Tn活性に変換できる。T又はTn活性を持たないヒト
赤血球グリコホリンAは、プラスティック表面に吸収さ
せ、シアリダーゼで処理するか(T抗原に変換する)、
又はシアリダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼで順次処理
すると(Tn抗原に変換する)、T又はTn抗原に変換
できる。このような方法はヒロハシらにより記載されて
いる(上記参照)。
【0107】当業者は本アッセイに使用される適当なム
チン型糖蛋白質並びに酵素的及び化学的処理を容易に決
めることができる。
チン型糖蛋白質並びに酵素的及び化学的処理を容易に決
めることができる。
【0108】例えば、モノクローナル抗体がシアリルT
n抗原に特異的であるならば、種々の酵素的分解の前及
び後にOSMに対する抗体の反応性を比較することがで
きる。具体的に言うと、天然OSMの約90%の炭水化
物鎖はシアリルTn抗原である。しかし、この抗原はシ
アリダーゼを用いた酵素的処理により分解される。この
ように、シアリルTn抗原に特異的なモノクローナル抗
体は、天然OSMと反応するがシアリダーゼ処理OSM
とは反応しない。
n抗原に特異的であるならば、種々の酵素的分解の前及
び後にOSMに対する抗体の反応性を比較することがで
きる。具体的に言うと、天然OSMの約90%の炭水化
物鎖はシアリルTn抗原である。しかし、この抗原はシ
アリダーゼを用いた酵素的処理により分解される。この
ように、シアリルTn抗原に特異的なモノクローナル抗
体は、天然OSMと反応するがシアリダーゼ処理OSM
とは反応しない。
【0109】加えて、本発明者らは、グリコホリンAが
その天然型ではT、Tn又はシアリルTn抗原を含まな
いことを発見した。しかし、脱シアル化したグリコホリ
ンAはT抗原を露出するが、Tn抗原を露出しない。従
って、T抗原と結合するモノクローナル抗体はシアル化
グリコホリンAとは反応するが天然グリコホリンAとは
反応しない。さらに、グリコホリン抗体及びそのシアリ
ル化誘導体はシアリルTn抗原に対するモノクローナル
抗体の検出に使用できる。グリコホリンAのシアリルT
n抗原を露出させる変換は困難である。天然グリコホリ
ンAを、シアリル2→3Galを分解するがシアリル2
→6GalNAcは分解しないインフルエンザウイルス
のシアリダーゼ又は二ューキャッスル病ウイルスのシア
リダーゼで処理するならば、核構造はGalβ1→3
[NeuAcα1→6]GalNAcを含むであろう。
この構造は、β−ガラクトシダーゼによるGal残基の
脱離により、さらにシアリルTn抗原に変換できる。し
かし、NeuAcα2→6結合構造が隣接した場所に存
在するときβ−ガラクトシダーゼは能率的に脱離しない
ため、これは実際は非常に難しい。
その天然型ではT、Tn又はシアリルTn抗原を含まな
いことを発見した。しかし、脱シアル化したグリコホリ
ンAはT抗原を露出するが、Tn抗原を露出しない。従
って、T抗原と結合するモノクローナル抗体はシアル化
グリコホリンAとは反応するが天然グリコホリンAとは
反応しない。さらに、グリコホリン抗体及びそのシアリ
ル化誘導体はシアリルTn抗原に対するモノクローナル
抗体の検出に使用できる。グリコホリンAのシアリルT
n抗原を露出させる変換は困難である。天然グリコホリ
ンAを、シアリル2→3Galを分解するがシアリル2
→6GalNAcは分解しないインフルエンザウイルス
のシアリダーゼ又は二ューキャッスル病ウイルスのシア
リダーゼで処理するならば、核構造はGalβ1→3
[NeuAcα1→6]GalNAcを含むであろう。
この構造は、β−ガラクトシダーゼによるGal残基の
脱離により、さらにシアリルTn抗原に変換できる。し
かし、NeuAcα2→6結合構造が隣接した場所に存
在するときβ−ガラクトシダーゼは能率的に脱離しない
ため、これは実際は非常に難しい。
【0110】本発明まで、T、Tn又はシアリルTn抗
原に対するモノクローナル抗体は意図して作られてはい
なかった。むしろ、それらは常法により選択された、即
ち、腫瘍細胞又は組織に対する優先的反応に基く多くの
ハイブリドーマのなかに含まれる。
原に対するモノクローナル抗体は意図して作られてはい
なかった。むしろ、それらは常法により選択された、即
ち、腫瘍細胞又は組織に対する優先的反応に基く多くの
ハイブリドーマのなかに含まれる。
【0111】本発明に従えば、このようなモノクローナ
ル抗体が意図的に作成できる。
ル抗体が意図的に作成できる。
【0112】癌細胞の増殖及び複製を防ぐ方法、並びに
癌の治療方法 本発明は、癌紬胞の増殖及び複製を防ぐ方法並びに癌の
治療方法をも提供する。
癌の治療方法 本発明は、癌紬胞の増殖及び複製を防ぐ方法並びに癌の
治療方法をも提供する。
【0113】より詳しくは、本発明は、(a〉精製ムチ
ン型糖蛋白質、ムチン型糖蛋白質の精製核構造、又はム
チン型糖蛋白質に対する免疫反応を誘導可能な、担体分
子に結合している化学合成された炭水化物抗原決定基を
含む抗原の薬理的有効量、及び(b)製薬的に受容でき
る担体、希釈剤又は賦形剤を含有するワクチンを対象に
投与することにより抗癌細胞免疫反応を誘導することか
らなる、ムチン型糖蛋白質の核構造を発現する癌細胞の
増殖および複製を防ぐ方法を提供する。
ン型糖蛋白質、ムチン型糖蛋白質の精製核構造、又はム
チン型糖蛋白質に対する免疫反応を誘導可能な、担体分
子に結合している化学合成された炭水化物抗原決定基を
含む抗原の薬理的有効量、及び(b)製薬的に受容でき
る担体、希釈剤又は賦形剤を含有するワクチンを対象に
投与することにより抗癌細胞免疫反応を誘導することか
らなる、ムチン型糖蛋白質の核構造を発現する癌細胞の
増殖および複製を防ぐ方法を提供する。
【0114】抗原は、抗癌細胞免疫反応を誘導できるも
のであり、Tn又はシアリルTnエピトープを有する精
製ムチン型糖蛋白質、ムチン型糖蛋白質の精製核構造、
並びに上記のように担体分子に結合した化学合成炭水化
物の抗原決定基が含まれる。抗癌細胞免疫反応は、ムチ
ン型糖蛋白質又は化学合成された炭水化物の抗原決定基
に対する抗体の産生であり、又サイトトキシックキラー
T細胞、アノマラスキラー細胞(AK細胞)及び抗体依
存性細胞障害細胞等の誘導の様な種々の他のタイプの免
疫応答の誘導であり得る。
のであり、Tn又はシアリルTnエピトープを有する精
製ムチン型糖蛋白質、ムチン型糖蛋白質の精製核構造、
並びに上記のように担体分子に結合した化学合成炭水化
物の抗原決定基が含まれる。抗癌細胞免疫反応は、ムチ
ン型糖蛋白質又は化学合成された炭水化物の抗原決定基
に対する抗体の産生であり、又サイトトキシックキラー
T細胞、アノマラスキラー細胞(AK細胞)及び抗体依
存性細胞障害細胞等の誘導の様な種々の他のタイプの免
疫応答の誘導であり得る。
【0115】好ましい抗原は、天然の供給源から精製し
たものであるか、化学合成したものかによらず、T抗
原、Tn抗原及びシアリルTn抗原であり、Tn抗原と
シアリルTn抗原が特に好ましい。
たものであるか、化学合成したものかによらず、T抗
原、Tn抗原及びシアリルTn抗原であり、Tn抗原と
シアリルTn抗原が特に好ましい。
【0116】Tn又はシアリルTnエピトープを有する
精製ムチン型糖蛋白質を含む抗原としては、ウシ又はヒ
ツジ下顎ムチンが好ましい。
精製ムチン型糖蛋白質を含む抗原としては、ウシ又はヒ
ツジ下顎ムチンが好ましい。
【0117】抗原がハイブリドーマの調製に適当な脾細
胞でその抗体を誘導可能な抗癌細胞抗体の例は、上記B
M−8、BY−3及びBM−4である。
胞でその抗体を誘導可能な抗癌細胞抗体の例は、上記B
M−8、BY−3及びBM−4である。
【0118】当業者は、投与量並びに適当な製薬的に受
容できる担体:希釈剤及び賦形剤を容易に決めることが
できる。上記のように、本発明は、(a)ムチン型糖蛋
白質の精製された核構造に対して産生される、薬理的有
効量の抗癌抗体、及び(b)製薬的に受容できる担体、
希釈剤又は賦形剤を含有する薬剤を対象に投与すること
から成る、癌細胞がムチン型糖蛋白質の核構造を発現す
る癌の治療法をも供袷する。
容できる担体:希釈剤及び賦形剤を容易に決めることが
できる。上記のように、本発明は、(a)ムチン型糖蛋
白質の精製された核構造に対して産生される、薬理的有
効量の抗癌抗体、及び(b)製薬的に受容できる担体、
希釈剤又は賦形剤を含有する薬剤を対象に投与すること
から成る、癌細胞がムチン型糖蛋白質の核構造を発現す
る癌の治療法をも供袷する。
【0119】抗原は、上記の様なムチン型糖蛋白質の精
製された核構造であればよく、T抗原、Tn抗原および
シアリルTn抗原が含まれ、特にTn抗原及びシアリル
Tn抗原が好ましい。
製された核構造であればよく、T抗原、Tn抗原および
シアリルTn抗原が含まれ、特にTn抗原及びシアリル
Tn抗原が好ましい。
【0120】抗癌抗体は上記のように製造され単離され
る。
る。
【0121】好ましい抗癌抗体にはBM−8、BM−3
及びBM−4が含まれる。
及びBM−4が含まれる。
【0122】当業者は投与量並びに適当な薬理的に許容
できる担体、希釈剤及び賦形剤を容易に決めることがで
きる。
できる担体、希釈剤及び賦形剤を容易に決めることがで
きる。
【0123】
【実施例】以下に本発明を、特定の実施例を挙げて説明
する。しかし、本発明は実施例に制限されて解釈される
ものではない。実施例に於て、他に特に記述しない限
り、全てのパーセント、割合等は重量による。
する。しかし、本発明は実施例に制限されて解釈される
ものではない。実施例に於て、他に特に記述しない限
り、全てのパーセント、割合等は重量による。
【0124】モノクローナル抗体BM−8の精製 モノクローナル抗体BM−8は腹腔液からシリカゲル−
プロテインAカラムのアフィニティークロマトグラフィ
ーにより精製した。抗体は3.0Mチオシアン酸ナトリ
ウムを用いて溶離した。Tn抗原に対する活性を持つ分
画(各1.0ml)は固相ラジオイムノアッセイにより
確認してプールし、PBSに対して透析し、蛋白質量を
A280を読みとることにより定量した。培養上清はアミ
コン(Amicon)濃縮装置(Amicon,Boston,MA製)を用
いた限外濾過により1/100容量まで濃縮した。濃縮
した上清を逆相C18シリカゲル カラムで精製し、I
gM及びIgG分画を得た。
プロテインAカラムのアフィニティークロマトグラフィ
ーにより精製した。抗体は3.0Mチオシアン酸ナトリ
ウムを用いて溶離した。Tn抗原に対する活性を持つ分
画(各1.0ml)は固相ラジオイムノアッセイにより
確認してプールし、PBSに対して透析し、蛋白質量を
A280を読みとることにより定量した。培養上清はアミ
コン(Amicon)濃縮装置(Amicon,Boston,MA製)を用
いた限外濾過により1/100容量まで濃縮した。濃縮
した上清を逆相C18シリカゲル カラムで精製し、I
gM及びIgG分画を得た。
【0125】抗体依存性細胞障害作用(antibody-depen
dent cytotoxicity)の測定 抗体依存性細胞障害作用の測定には4時間51Cr遊離試
験を用いた。この方法は、例えばMischell及びShiigiに
より報告されている[Selected Methods in Cellular l
mmunology,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,(198
0)]。2人の健常人から得た末梢血リンパ球をフィコー
ル−ハイパック(Ficoll-Hypaque)により分離してエフ
ェクター細胞を得た。ターゲット細胞に対するエフェク
ター細胞の割合は100:1、50:1、25:1及び
12.5:1とした。
dent cytotoxicity)の測定 抗体依存性細胞障害作用の測定には4時間51Cr遊離試
験を用いた。この方法は、例えばMischell及びShiigiに
より報告されている[Selected Methods in Cellular l
mmunology,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,(198
0)]。2人の健常人から得た末梢血リンパ球をフィコー
ル−ハイパック(Ficoll-Hypaque)により分離してエフ
ェクター細胞を得た。ターゲット細胞に対するエフェク
ター細胞の割合は100:1、50:1、25:1及び
12.5:1とした。
【0126】ターゲット細胞は細胞ラインK562、L
U−65、WI−38、BRASCH、MKN−45、
SKOV3、QG56、HEL299、HUH7及びB
XPC3であり、これらは全て上記文献に記載されてい
る。ターゲット細胞(106個)を100μCiの51C
rと共にPBS中で37℃で1時間インキュベートする
ことによりラベルした後、細胞を3回洗浄し、RPMI
培地に再懸濁した。15μ1の培地中のラベルされたタ
ーゲット細胞(5×103個)を各ウェルに入れ、エフ
ェクター細胞を種々の個数(5×105、2.5×1
05、1.25×105及び6.25×104個/ウェ
ル)加えた。混合物を4時間インキュベートした後、プ
レートを500×gで遠心した。上清を分離し、125
μlの試料中の放射活性をガンマーカウンターで測定し
た。グループ当り3回実験を行い、自発遊離量は抗体及
びリンパ球に触れないターゲット細胞から培地に遊離し
たcpmとし、全遊離量は測定の終りに2.0%のトリ
トンX−100を加えて溶解したターゲット細胞から遊
離したカウント数とした。細胞障害性%は下記式から算
出した。
U−65、WI−38、BRASCH、MKN−45、
SKOV3、QG56、HEL299、HUH7及びB
XPC3であり、これらは全て上記文献に記載されてい
る。ターゲット細胞(106個)を100μCiの51C
rと共にPBS中で37℃で1時間インキュベートする
ことによりラベルした後、細胞を3回洗浄し、RPMI
培地に再懸濁した。15μ1の培地中のラベルされたタ
ーゲット細胞(5×103個)を各ウェルに入れ、エフ
ェクター細胞を種々の個数(5×105、2.5×1
05、1.25×105及び6.25×104個/ウェ
ル)加えた。混合物を4時間インキュベートした後、プ
レートを500×gで遠心した。上清を分離し、125
μlの試料中の放射活性をガンマーカウンターで測定し
た。グループ当り3回実験を行い、自発遊離量は抗体及
びリンパ球に触れないターゲット細胞から培地に遊離し
たcpmとし、全遊離量は測定の終りに2.0%のトリ
トンX−100を加えて溶解したターゲット細胞から遊
離したカウント数とした。細胞障害性%は下記式から算
出した。
【0127】
【数1】
【0128】BM−8により誘導された種々のターゲッ
ト細胞ラインに対する抗体依存性細胞障害作用を第4図
に示す。ヒト赤白血病細胞ラインK562及びヒト偏平
上皮細胞肺癌LU−65はBM−8抗体により誘導され
た抗体依存性細胞障害に注目すべき感受性を示した。対
照的にヒト線維芽細胞BRASCH、WI−38、及び
ヒト赤白血病細胞HEL299はBM−8依存性細胞障
害に感受性を示さなかった。ヒト偏平上皮細胞肺癌QG
56及びヒト胃癌細胞ラインMKN−45はBM−8抗
体に対し最も強い結合活性を示したにもかかわらず、B
M−8抗体依存性紬胞障害には低い感受性を有した。
ト細胞ラインに対する抗体依存性細胞障害作用を第4図
に示す。ヒト赤白血病細胞ラインK562及びヒト偏平
上皮細胞肺癌LU−65はBM−8抗体により誘導され
た抗体依存性細胞障害に注目すべき感受性を示した。対
照的にヒト線維芽細胞BRASCH、WI−38、及び
ヒト赤白血病細胞HEL299はBM−8依存性細胞障
害に感受性を示さなかった。ヒト偏平上皮細胞肺癌QG
56及びヒト胃癌細胞ラインMKN−45はBM−8抗
体に対し最も強い結合活性を示したにもかかわらず、B
M−8抗体依存性紬胞障害には低い感受性を有した。
【0129】これらの結果から、BM−8抗体は幾つか
の腫瘍細胞に対するサイトトキシック細胞の明確な活性
化を示した。しかし、各腫瘍細胞の抗体依存性細胞障害
に対する感受性は大きく異なり、抗原発現との定量的相
関性は無かった。
の腫瘍細胞に対するサイトトキシック細胞の明確な活性
化を示した。しかし、各腫瘍細胞の抗体依存性細胞障害
に対する感受性は大きく異なり、抗原発現との定量的相
関性は無かった。
【0130】種々の組織切片の免疫組織学 モノクローナル抗体BM−8の免疫組織学的染色能を以
下のように測定した。凍結及びパラフィン包埋組織は共
に外科手術により得た。組織はOCT化合物(免疫組織
学では広く使用されている特許された化合物、Tissue−
TekII Division,Miles Laboratories,Naperville,Illin
ois製)中に包埋し、ドライアイス−アセトン中で凍結
し、使用までレブコ(Revco)冷凍庫で−80℃で保存
した。凍結切片(4〜5μm厚)は低温層を用いて調製
し、対物ガラス上で室温で30分乾燥し、アセトン中で
4℃で10分固定し、4℃のPBSで洗浄した。組織切
片(5〜7μm厚)は、常法に従いホルマリン固定しパ
ラフィン包埋した標本から調製した。切片はキシレン中
で4℃で5分間脱パラフィンし、段階的エタノールで脱
水し、4℃のPBSで洗浄した。次いで凍結切片及びパ
ラフィン包埋切片を両者共、0.03%の過酸化水素水
を含む100%メタノールで室温で30分間処理するこ
とにより、内因性ペロキシデースをブロックした。PB
Sで3回洗浄後、切片をブロックし、即ち正常ウマ血清
と共に室温で30分インキュベートして内因性ペロキシ
デースを不活性化した。次いで切片をPBSで3回洗浄
し、一次抗体溶液(BM−8培養上清;抗体濃度=50
μg/m1)と共にモイストチャンバー中で4℃で一晩
インキュベートした。PBSで3回洗浄後、切片を1:
100希釈のビオチン化二次抗体(ビオチン化ウマ抗マ
ウスIgG、VectorLab,Inc.,BurIingame,CA製)と共に
室温で1時間モイスト チャンバー中でインキュベート
した。PBSで3回洗浄後、切片を予め作成したアビジ
ン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体(Vector Lab,I
nc.,Burlingame,CA製)の容量比1:100の希釈溶液
と共に室温で1時間モイスト チャンバー中でインキュ
ベートした。PBS及び50mM Tris/HCl緩
衝液(pH7.6)で3回リンスの後、切片を0.05
% 3−3’ジアミノベンジジン(Sigma Chemical C
o.,St.Louis,M0製)を含む50mM Tris/HCl
緩衝液(pH7.6)及び0.03%過酸化水素水中で
10分インキュベートした後、へマトキシリンで対比染
色した。次いで切片を段階的エタノール、キシレンで脱
水し、封入した。
下のように測定した。凍結及びパラフィン包埋組織は共
に外科手術により得た。組織はOCT化合物(免疫組織
学では広く使用されている特許された化合物、Tissue−
TekII Division,Miles Laboratories,Naperville,Illin
ois製)中に包埋し、ドライアイス−アセトン中で凍結
し、使用までレブコ(Revco)冷凍庫で−80℃で保存
した。凍結切片(4〜5μm厚)は低温層を用いて調製
し、対物ガラス上で室温で30分乾燥し、アセトン中で
4℃で10分固定し、4℃のPBSで洗浄した。組織切
片(5〜7μm厚)は、常法に従いホルマリン固定しパ
ラフィン包埋した標本から調製した。切片はキシレン中
で4℃で5分間脱パラフィンし、段階的エタノールで脱
水し、4℃のPBSで洗浄した。次いで凍結切片及びパ
ラフィン包埋切片を両者共、0.03%の過酸化水素水
を含む100%メタノールで室温で30分間処理するこ
とにより、内因性ペロキシデースをブロックした。PB
Sで3回洗浄後、切片をブロックし、即ち正常ウマ血清
と共に室温で30分インキュベートして内因性ペロキシ
デースを不活性化した。次いで切片をPBSで3回洗浄
し、一次抗体溶液(BM−8培養上清;抗体濃度=50
μg/m1)と共にモイストチャンバー中で4℃で一晩
インキュベートした。PBSで3回洗浄後、切片を1:
100希釈のビオチン化二次抗体(ビオチン化ウマ抗マ
ウスIgG、VectorLab,Inc.,BurIingame,CA製)と共に
室温で1時間モイスト チャンバー中でインキュベート
した。PBSで3回洗浄後、切片を予め作成したアビジ
ン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体(Vector Lab,I
nc.,Burlingame,CA製)の容量比1:100の希釈溶液
と共に室温で1時間モイスト チャンバー中でインキュ
ベートした。PBS及び50mM Tris/HCl緩
衝液(pH7.6)で3回リンスの後、切片を0.05
% 3−3’ジアミノベンジジン(Sigma Chemical C
o.,St.Louis,M0製)を含む50mM Tris/HCl
緩衝液(pH7.6)及び0.03%過酸化水素水中で
10分インキュベートした後、へマトキシリンで対比染
色した。次いで切片を段階的エタノール、キシレンで脱
水し、封入した。
【0131】モノクローナル抗体BM−8による種々の
癌及び正常組織の染色陽性の発生を表2に要約する。
癌及び正常組織の染色陽性の発生を表2に要約する。
【0132】
【表2】
【0133】表2に示した結果から、BM−8抗体によ
り測定したTn抗原は胃、結腸、肺、及び乳癌で染色陽
性の高い発生を示した。正常結腸及び正常乳房における
染色陽性の低い発生も、染色強度が低いながら示され
た。
り測定したTn抗原は胃、結腸、肺、及び乳癌で染色陽
性の高い発生を示した。正常結腸及び正常乳房における
染色陽性の低い発生も、染色強度が低いながら示され
た。
【0134】実施例2 シアリルTn抗原に対するモノクローナル抗体の製造及
び特徴付け シアリルTn抗原の供給源としてヒツジ下顎腺ムチン
(OSM)を用いた。OSMの約90%の炭水化物鎖は
シアリルTn抗原から成る。
び特徴付け シアリルTn抗原の供給源としてヒツジ下顎腺ムチン
(OSM)を用いた。OSMの約90%の炭水化物鎖は
シアリルTn抗原から成る。
【0135】OSMはヒツジ下顎腺から常法により単離
した[Tettamanti,G.,and Pigman,W.Arch.Biochem.Biop
hys.,124,45-50 (1968)]。簡単には、下顎腺の水性抽
出物を酸性pH(例えば3.5)で沈殿させた。これを
ムチン クロットと呼ぶ。ムチン クロットを遠心し、
水に溶解し、pHを中性に合わせ、酢酸ナトリウム中で
分別エタノール沈殿を行った。
した[Tettamanti,G.,and Pigman,W.Arch.Biochem.Biop
hys.,124,45-50 (1968)]。簡単には、下顎腺の水性抽
出物を酸性pH(例えば3.5)で沈殿させた。これを
ムチン クロットと呼ぶ。ムチン クロットを遠心し、
水に溶解し、pHを中性に合わせ、酢酸ナトリウム中で
分別エタノール沈殿を行った。
【0136】このように単離したOSMを免疫原の組成
として用いた。
として用いた。
【0137】免疫及びモノクローナル坑体の確立 Balb/bマウスを実施例1の記載に従い免疫した。
【0138】実施例1に記載の常法により脾臓の細胞を
取出し、脾細胞をマウス ミエローマSP−2細胞と融
合した。
取出し、脾細胞をマウス ミエローマSP−2細胞と融
合した。
【0139】選択培地で増殖したハイブリドーマを実施
例1の記載と類似の方法で、上記OSM、脱シアル化O
SM、ウシ下顎ムチン(BSM)(BSMの約50%の
炭水化物鎖はシアリルTn抗原から成る)、及びグリコ
ホリンAに対するモノクローナル抗体の反応性によりス
クリーニングした。ウシ下顎腺ムチン(BSM)及びグ
リコホリンAはシグマ ケミカル カンパニー[Sigma
Chemical Campany,St.Louis,Missouri]から購入した。
OSMは、常法に従い0.1ユニット/mlのクロスト
リジウム ペルフリンゲンズ(Clostridium Perfringen
s)タイプX由来のノイラミニダーゼ(Sigma製)で処理
し脱シアル化した[Magnani.J.L.et al.,J.Biol.Chem.,
257,14365(1982); Fukushi et al.,J.Biol.Chem.259,10
511(1984)]。
例1の記載と類似の方法で、上記OSM、脱シアル化O
SM、ウシ下顎ムチン(BSM)(BSMの約50%の
炭水化物鎖はシアリルTn抗原から成る)、及びグリコ
ホリンAに対するモノクローナル抗体の反応性によりス
クリーニングした。ウシ下顎腺ムチン(BSM)及びグ
リコホリンAはシグマ ケミカル カンパニー[Sigma
Chemical Campany,St.Louis,Missouri]から購入した。
OSMは、常法に従い0.1ユニット/mlのクロスト
リジウム ペルフリンゲンズ(Clostridium Perfringen
s)タイプX由来のノイラミニダーゼ(Sigma製)で処理
し脱シアル化した[Magnani.J.L.et al.,J.Biol.Chem.,
257,14365(1982); Fukushi et al.,J.Biol.Chem.259,10
511(1984)]。
【0140】OSMに反応陽性のモノクローナル抗体を
分泌する約22個のハイブリドーマが見出だされた。
分泌する約22個のハイブリドーマが見出だされた。
【0141】これらハイブリドーマをスケール アップ
し、モノクローナル抗体のOSM、脱シアル化OSM、
BSM、及びグリコホリンAに対する反応性を再検査し
た。
し、モノクローナル抗体のOSM、脱シアル化OSM、
BSM、及びグリコホリンAに対する反応性を再検査し
た。
【0142】OSMに対し強い反応性を示し、BSMに
対しては弱い反応性を示し、グリコホリンA又はシアリ
ダーゼ処理OSMに対しては反応しないモノクローナル
抗体を分泌する2個のハイブリドーマを再クローニング
し、続く実験に用いた。
対しては弱い反応性を示し、グリコホリンA又はシアリ
ダーゼ処理OSMに対しては反応しないモノクローナル
抗体を分泌する2個のハイブリドーマを再クローニング
し、続く実験に用いた。
【0143】ハイブリドーマ及びこれから産生されるモ
ノクローナル抗体をBM−3及びBM−4と呼ぶ。
ノクローナル抗体をBM−3及びBM−4と呼ぶ。
【0144】抗体イソタイプの確認 抗体イソタイプは実施例1に従い固相ラジオイムノアッ
セイにより決定した。結果は抗体BM−3はIgMイソ
タイプであり、抗体BM−4はIgG1イソタイプであ
ることを示した。
セイにより決定した。結果は抗体BM−3はIgMイソ
タイプであり、抗体BM−4はIgG1イソタイプであ
ることを示した。
【0145】抗体の特異性の確認 BM−3及びBM−4の特異性をi)シアリダーゼ処理
OSMと比較した天然OSMに対する反応性、及びii)
種々の単糖及び二糖による抗体結合の阻害により測定し
た。各方法を以下に示す。
OSMと比較した天然OSMに対する反応性、及びii)
種々の単糖及び二糖による抗体結合の阻害により測定し
た。各方法を以下に示す。
【0146】天然及びシアリダーゼ処理OSMに対する
反応性 OSMの表現する抗原の性質を調べるため、天然OSM
及びシアリダーゼ処理OSMを抗Tn(モノクローナル
抗体CA3239由来の腹腔液中に存在)及び抗T(モ
ノクローナル抗体HH8の培養上清中に存在)と反応さ
せた[Clausen,H.et al.In:Glycoconjugates,Proceedin
gs of the IXth International Symposium,Lille,Franc
e,p,F49(1987)]。
反応性 OSMの表現する抗原の性質を調べるため、天然OSM
及びシアリダーゼ処理OSMを抗Tn(モノクローナル
抗体CA3239由来の腹腔液中に存在)及び抗T(モ
ノクローナル抗体HH8の培養上清中に存在)と反応さ
せた[Clausen,H.et al.In:Glycoconjugates,Proceedin
gs of the IXth International Symposium,Lille,Franc
e,p,F49(1987)]。
【0147】測定は固相ラジオイムノアッセイを用いて
行った。室温で18時間インキュベートすることにより
OSM及びシアリダーゼ処理OSMで96ウェル プレ
ートをコートし、1%BSAで2時間ブロックした後、
BSAで3回洗浄した。一次抗体(抗Tn又は抗T H
H8抗体)を加え室温で2時間反応させた後、PBSで
洗浄した。固相OSM又はシアリダーゼ処理OSMに結
合した抗体を二次抗体及び125Iラベル化プロテインA
で定量した。本方法は多くの刊行物に記載されている
[Hirohashi,et al.(上記参照),Fukushi et al,JBC.2
569,4681(1984);JBC.259,10511(1984);Young et al.,J.
Exp.Med.,150,1008(1979)]。
行った。室温で18時間インキュベートすることにより
OSM及びシアリダーゼ処理OSMで96ウェル プレ
ートをコートし、1%BSAで2時間ブロックした後、
BSAで3回洗浄した。一次抗体(抗Tn又は抗T H
H8抗体)を加え室温で2時間反応させた後、PBSで
洗浄した。固相OSM又はシアリダーゼ処理OSMに結
合した抗体を二次抗体及び125Iラベル化プロテインA
で定量した。本方法は多くの刊行物に記載されている
[Hirohashi,et al.(上記参照),Fukushi et al,JBC.2
569,4681(1984);JBC.259,10511(1984);Young et al.,J.
Exp.Med.,150,1008(1979)]。
【0148】結果から天然OSMはCA3239由来の
抗Tnに弱い反応性を示したが、シアリダーゼ処理の後
反応性は大きく増大した。さらに、HH8由来の抗Tに
対しては、シアリダーゼ処理の前及び後で反応性は見ら
れなかった。
抗Tnに弱い反応性を示したが、シアリダーゼ処理の後
反応性は大きく増大した。さらに、HH8由来の抗Tに
対しては、シアリダーゼ処理の前及び後で反応性は見ら
れなかった。
【0149】これらの反応性は、OSMはT又はTn抗
原を発現しないがシアリルTn抗原を強く発現すること
を示唆する。
原を発現しないがシアリルTn抗原を強く発現すること
を示唆する。
【0150】モノクローナル抗体BM−3及びBM−4
は天然OSMとの反応及びシアリダーゼ処理OSMとの
反応により特徴づけられる。天然OSMはシアリル2→
6Ga1NAcα1→O−Ser/Thrを主な炭水化
物グループとして含み、BM−3及びBM−4はこれと
反応する。このことからBM−3及びBM−4は共にシ
アリルTn抗原を認識することが示唆される。さらにB
M−3及びBM−4の反応性は、OSMのシアリダーゼ
処理により完全に消失した。この処理でシアリルTnグ
ループは全てTn残基に変換されており、このことから
BM−3及びBM−4はT抗原とは反応しないことが示
唆される。OSMのシアリダーゼ処理はプラスティック
表面に吸着した固相上で行った。本方法はヒロハシ(Hi
rohasi)らにより既に報告されている(上記参照)。
は天然OSMとの反応及びシアリダーゼ処理OSMとの
反応により特徴づけられる。天然OSMはシアリル2→
6Ga1NAcα1→O−Ser/Thrを主な炭水化
物グループとして含み、BM−3及びBM−4はこれと
反応する。このことからBM−3及びBM−4は共にシ
アリルTn抗原を認識することが示唆される。さらにB
M−3及びBM−4の反応性は、OSMのシアリダーゼ
処理により完全に消失した。この処理でシアリルTnグ
ループは全てTn残基に変換されており、このことから
BM−3及びBM−4はT抗原とは反応しないことが示
唆される。OSMのシアリダーゼ処理はプラスティック
表面に吸着した固相上で行った。本方法はヒロハシ(Hi
rohasi)らにより既に報告されている(上記参照)。
【0151】BM−3についての結果を第5図に示す。
パネルAは種々の濃度のBM−3上清におけるBM−3
のOSMに対する反応性を示し、パネルBは種々の濃度
のOSMに対するBM−3の反応性を示す。黒丸は天然
OSMに対する反応性を示し、白丸はノイラミニダーゼ
(又はシアリダーゼ)で処理されたOSMに対する反応
性を示す。
パネルAは種々の濃度のBM−3上清におけるBM−3
のOSMに対する反応性を示し、パネルBは種々の濃度
のOSMに対するBM−3の反応性を示す。黒丸は天然
OSMに対する反応性を示し、白丸はノイラミニダーゼ
(又はシアリダーゼ)で処理されたOSMに対する反応
性を示す。
【0152】結果は、モノクローナル抗体BM−3は天
然OSMに対する反応性を有し、この反応性はシアリダ
ーゼ処理の後大きく減少することを示す。
然OSMに対する反応性を有し、この反応性はシアリダ
ーゼ処理の後大きく減少することを示す。
【0153】この様にモノクローナル抗体BM−3はシ
アリル−Tn抗原に特異的である。モノクローナル抗体
BM−4についても同様のことが見出された。
アリル−Tn抗原に特異的である。モノクローナル抗体
BM−4についても同様のことが見出された。
【0154】BM−3抗体の反応性の単糖及び二糖によ
る阻害 単糖溶液を、96ウェル プレートの一連のウェル中で
初めの濃度500mMから2倍希釈した。各々の単糖溶
液をBM−3又はBM−4抗体に加え(10〜50ng
/ウェル)、溶液を室温で1時間インキュベートした。
96ウェルプレートの一連のプラスティック ウェル
は、上記方法でOSMでプレコートし(室温で一晩、生
理食塩水溶解のOSMのインキュベーション)、BSA
でプレウォッシュした。単糖又は多糖と抗体との反応混
合液をOSMでコートしたプレート上に移し、2時間イ
ンキュベートした後、BSAで洗浄し、上記方法により
二次抗体及び125IラベルしたプロテインAで抗体の結
合を検出した。阻害の程度は、単糖又は二糖と混合しな
い抗体と比較し、コントロールの反応性に対する%で表
した。
る阻害 単糖溶液を、96ウェル プレートの一連のウェル中で
初めの濃度500mMから2倍希釈した。各々の単糖溶
液をBM−3又はBM−4抗体に加え(10〜50ng
/ウェル)、溶液を室温で1時間インキュベートした。
96ウェルプレートの一連のプラスティック ウェル
は、上記方法でOSMでプレコートし(室温で一晩、生
理食塩水溶解のOSMのインキュベーション)、BSA
でプレウォッシュした。単糖又は多糖と抗体との反応混
合液をOSMでコートしたプレート上に移し、2時間イ
ンキュベートした後、BSAで洗浄し、上記方法により
二次抗体及び125IラベルしたプロテインAで抗体の結
合を検出した。阻害の程度は、単糖又は二糖と混合しな
い抗体と比較し、コントロールの反応性に対する%で表
した。
【0155】BM−3についての結果を第6図に示す。
パネルAは単糖のフコース(白丸)、ガラクトース(白
四角)、グルコース(黒三角)、N−アセチルグルコサ
ミン(白三角)、N−アセチルガラクトサミン(黒四
角)、N−アセチルノイラミン酸(黒丸)によるBM−
3の阻害を示し、パネルBは二糖NeuAcα2→6G
alNAcα1→セリン(黒四角)及びラクトース(黒
丸)によるBM−3の阻害を示す。
パネルAは単糖のフコース(白丸)、ガラクトース(白
四角)、グルコース(黒三角)、N−アセチルグルコサ
ミン(白三角)、N−アセチルガラクトサミン(黒四
角)、N−アセチルノイラミン酸(黒丸)によるBM−
3の阻害を示し、パネルBは二糖NeuAcα2→6G
alNAcα1→セリン(黒四角)及びラクトース(黒
丸)によるBM−3の阻害を示す。
【0156】結果は単糖のGalNAc及びNeuAc
のみがBM−3のOSM及びBSMに対する結合を阻害
することができ、一方他の単糖L−フコース、D−ガラ
クトース、D−グルコース及びD−N−アセチルグルコ
サミンは反応を阻害できなかった。NeuAcの阻害活
性はGalNacよりも強かった。二糖NeuAcα2
→6GalNAcα1→O−セリンも又BM−3の反応
を阻害したが、そのアノメリック アイソマー、Neu
Acα2→6GalNAcβ1→0−プロピル、及びラ
クトースは阻害活性を有さなかった。
のみがBM−3のOSM及びBSMに対する結合を阻害
することができ、一方他の単糖L−フコース、D−ガラ
クトース、D−グルコース及びD−N−アセチルグルコ
サミンは反応を阻害できなかった。NeuAcの阻害活
性はGalNacよりも強かった。二糖NeuAcα2
→6GalNAcα1→O−セリンも又BM−3の反応
を阻害したが、そのアノメリック アイソマー、Neu
Acα2→6GalNAcβ1→0−プロピル、及びラ
クトースは阻害活性を有さなかった。
【0157】これらの結果はBM−3抗体により認識さ
れるハプテン構造はNeuAcα2→6GalNAcα
1→O−Ser/Thr、即ち正確にシアリルTn構造
であることを示唆する。
れるハプテン構造はNeuAcα2→6GalNAcα
1→O−Ser/Thr、即ち正確にシアリルTn構造
であることを示唆する。
【0158】同様の結果がBM−4について得られた。
【0159】種々の組織切片の免疫組織学 モノクローナル抗体BM−3及びBM−4の免疫組織学
的染色能を既に記載された方法に従って(Fukushi et a
l.,J.Exp.Med.,159,506(1984)]調べた。簡単には、抗
原検出のため標本をホルマリンで固定し、パラフィンに
包埋した。モノクローナル抗体を脱パラフィンした組織
切片に加え4℃で一晩インキュベートした。結合したモ
ノクローナル抗体の検出はビオチニル抗マウスIgG+
IgM及びビオチニル−ペルオキシダーゼ複合体を用い
て行った(vactastain ABC kit;Vector Laboratories I
nc.製)。酵素活性は0.02%のデアミノベンジジン
テトラヒドロクロリド及び0.005%の過酸化水素水
を含む0.05Mトリスにより測定した。この方法は種
々の過酸化水素水について行われる。これらの方法は種
々のモノグラフ、例えばK.Watanab及びP.K.Nakane著“I
mmunoenzymatic Method”(Interdisciplinary Publicat
ions,Toshima,Tokyo,(1985))に詳しく述べられてい
る。
的染色能を既に記載された方法に従って(Fukushi et a
l.,J.Exp.Med.,159,506(1984)]調べた。簡単には、抗
原検出のため標本をホルマリンで固定し、パラフィンに
包埋した。モノクローナル抗体を脱パラフィンした組織
切片に加え4℃で一晩インキュベートした。結合したモ
ノクローナル抗体の検出はビオチニル抗マウスIgG+
IgM及びビオチニル−ペルオキシダーゼ複合体を用い
て行った(vactastain ABC kit;Vector Laboratories I
nc.製)。酵素活性は0.02%のデアミノベンジジン
テトラヒドロクロリド及び0.005%の過酸化水素水
を含む0.05Mトリスにより測定した。この方法は種
々の過酸化水素水について行われる。これらの方法は種
々のモノグラフ、例えばK.Watanab及びP.K.Nakane著“I
mmunoenzymatic Method”(Interdisciplinary Publicat
ions,Toshima,Tokyo,(1985))に詳しく述べられてい
る。
【0160】ペルオキシダーゼ染色した典型的な免疫組
織学像を第7図及び第8図に示す。
織学像を第7図及び第8図に示す。
【0161】第7図はBM−3抗体を用いた、ホルマリ
ン固定、パラフィン包埋の悪性腫瘍のイムノペルオキシ
ダーゼ染色を示す。第7図は、BM−3モノクローナル
抗体は肺腺癌と反応するが、正常肺とは反応せずこれら
は染色されない(パネルA)ことを示す。さらにBM−
3モノクローナル抗体は適度に分化した結腸腺癌と反応
するが、周囲の正常細胞及びストロマとは反応せず、こ
れらは染色されない(パネルB)。BM−3モノクロー
ナル抗体は粘性胃カルシノーマ癌細胞(パネルC)及び
細葉肺腺癌とも不均一に反応するが、正常肺組織とは反
応せずこれらは染色されない(パネルD)。
ン固定、パラフィン包埋の悪性腫瘍のイムノペルオキシ
ダーゼ染色を示す。第7図は、BM−3モノクローナル
抗体は肺腺癌と反応するが、正常肺とは反応せずこれら
は染色されない(パネルA)ことを示す。さらにBM−
3モノクローナル抗体は適度に分化した結腸腺癌と反応
するが、周囲の正常細胞及びストロマとは反応せず、こ
れらは染色されない(パネルB)。BM−3モノクロー
ナル抗体は粘性胃カルシノーマ癌細胞(パネルC)及び
細葉肺腺癌とも不均一に反応するが、正常肺組織とは反
応せずこれらは染色されない(パネルD)。
【0162】第8図はBM−4モノクローナル抗体を用
いたホルマリン固定、パラフィン包埋悪性腫瘍のイムノ
ペルオキシダーゼ染色を示す。第8図は、BM−4モノ
クローナル抗体は肺腺癌(パネルA)、粘性胃癌(パネ
ルB)、及び適度に分化した結腸腺癌と反応するが、正
常結腸細胞又はストロマとは反応しない(パネルC)こ
とを示す。
いたホルマリン固定、パラフィン包埋悪性腫瘍のイムノ
ペルオキシダーゼ染色を示す。第8図は、BM−4モノ
クローナル抗体は肺腺癌(パネルA)、粘性胃癌(パネ
ルB)、及び適度に分化した結腸腺癌と反応するが、正
常結腸細胞又はストロマとは反応しない(パネルC)こ
とを示す。
【0163】種々の癌及び正常組織のモノクローナル抗
体BM−3及びBM−4による染色陽性の発生を他の抗
シアリルTn抗体(B72.3、NCC−LU−35、
及びNCC−LU−81)と比較し、下記表3に示す。
正常組織のBM−3及びBM−4による染色陽性の発生
は非常に限られているため、正常組織の陽性の図は省略
した。
体BM−3及びBM−4による染色陽性の発生を他の抗
シアリルTn抗体(B72.3、NCC−LU−35、
及びNCC−LU−81)と比較し、下記表3に示す。
正常組織のBM−3及びBM−4による染色陽性の発生
は非常に限られているため、正常組織の陽性の図は省略
した。
【0164】
【表3】
【0165】モノクローナル抗体BM−3及びBM−4
は共にシアリルTnに対するものであるが染色陽性の発
生はモノクローナル抗体BM−4を用いた方がずっと高
かった。BM−8と比較して、両抗体はずっと低い正常
組織の染色陽性の発生を示した。
は共にシアリルTnに対するものであるが染色陽性の発
生はモノクローナル抗体BM−4を用いた方がずっと高
かった。BM−8と比較して、両抗体はずっと低い正常
組織の染色陽性の発生を示した。
【0166】実施例3 Tnエピトープを含むムチン糖蛋白質を用いた免疫によ
るマウスにおける先天性腫瘍増殖の阻害 Tn抗原を含むウシ下顎ムチン(BSM)はヒルらの方
法に従い精製した[Hill H.D.,et al.,J.Biol.Chem.25
2,3791-3798(1977)]。ウシ下顎腺を0.01MNaC
l中でホモジナイズした。上清をpH4.7に合わせ、
沈殿を除いた。上清をスルホプロピル−セファデックス
C−25カラムにかけ、モノクローナル抗体により検出
したTn及びシアリルTn抗原を含む分画を1つにし
た。
るマウスにおける先天性腫瘍増殖の阻害 Tn抗原を含むウシ下顎ムチン(BSM)はヒルらの方
法に従い精製した[Hill H.D.,et al.,J.Biol.Chem.25
2,3791-3798(1977)]。ウシ下顎腺を0.01MNaC
l中でホモジナイズした。上清をpH4.7に合わせ、
沈殿を除いた。上清をスルホプロピル−セファデックス
C−25カラムにかけ、モノクローナル抗体により検出
したTn及びシアリルTn抗原を含む分画を1つにし
た。
【0167】ムチンを、アセチルトリメチルアンモニウ
ム ブロマイドの添加及び遠心により沈殿させた。沈殿
を4.5M CaCl2に再溶解し、無水エタノールに
溶解して60%濃度にした。沈殿を捨て、上清を75%
エタノールにした。27,000gで30分間遠心する
ことによりムチンを集めた。沈殿を1M NaClに懸
濁し、10mMリン酸ナトリウム、pH6.8に透析し
た。ムチンはヒドロキシルアパタイト カラムにかけ、
Tn及びシアリルTn活性を含む分画を集めた。ムチン
をノイラミニダーゼ(クロストリジウム ペリフリンゲ
ンズ(Clostridium perfringens)由来)で処理し(N
−BSM)、セファロースCL−4Bカラムにかけた。
Tn活性を含む分画をプールし、透析し、凍結乾燥し
た。雌性CAF1マウスをPBS、フロイント アジュ
バント(FA)、又は完全FAアジュバントに乳化した
N−BSM(20μg)で腹腔内投与(i.p.)によ
り免疫した。1週間後、マウスをPBS、不完全FA、
又は不完全PAに乳化したN−BSM(40μg)で
i.p.より再免疫した。二回目の免疫の10日後、マ
ウスに先天性乳腫瘍TA3HA細胞(104細胞、皮下
投与)をチャレンジし、腫瘍サイズ、マウスの生存、及
び抗体の産生をマウスでモニターした。結果を第9図及
び第11図に示す。第9図に於いて、実線はFAのみで
免疫したグループを表し、破線はN−BSMで免疫した
マウスを表わす。第9図は、コントロールFAグループ
のマウスは腫瘍チャレンジの14日後には全て死亡した
が、一方BSMで免疫したグループではチャレンジの1
9日後に3/7のマウスが生存していたことを示す。
ム ブロマイドの添加及び遠心により沈殿させた。沈殿
を4.5M CaCl2に再溶解し、無水エタノールに
溶解して60%濃度にした。沈殿を捨て、上清を75%
エタノールにした。27,000gで30分間遠心する
ことによりムチンを集めた。沈殿を1M NaClに懸
濁し、10mMリン酸ナトリウム、pH6.8に透析し
た。ムチンはヒドロキシルアパタイト カラムにかけ、
Tn及びシアリルTn活性を含む分画を集めた。ムチン
をノイラミニダーゼ(クロストリジウム ペリフリンゲ
ンズ(Clostridium perfringens)由来)で処理し(N
−BSM)、セファロースCL−4Bカラムにかけた。
Tn活性を含む分画をプールし、透析し、凍結乾燥し
た。雌性CAF1マウスをPBS、フロイント アジュ
バント(FA)、又は完全FAアジュバントに乳化した
N−BSM(20μg)で腹腔内投与(i.p.)によ
り免疫した。1週間後、マウスをPBS、不完全FA、
又は不完全PAに乳化したN−BSM(40μg)で
i.p.より再免疫した。二回目の免疫の10日後、マ
ウスに先天性乳腫瘍TA3HA細胞(104細胞、皮下
投与)をチャレンジし、腫瘍サイズ、マウスの生存、及
び抗体の産生をマウスでモニターした。結果を第9図及
び第11図に示す。第9図に於いて、実線はFAのみで
免疫したグループを表し、破線はN−BSMで免疫した
マウスを表わす。第9図は、コントロールFAグループ
のマウスは腫瘍チャレンジの14日後には全て死亡した
が、一方BSMで免疫したグループではチャレンジの1
9日後に3/7のマウスが生存していたことを示す。
【0168】第10図に示したように、BSM免疫グル
ープは血清中に高力価のTn及びシアリルTn特異的抗
体を有したが、一方Tエピトープ(ノイラミニダーゼ処
理グリコホリンA)に対する抗体は検出されなかった。
第10図において、白四角はN−BSM(Tn)に対す
る抗体の力価を表し、白三角はヒツジ下顎腺ムチン(O
SM)に対する抗体の力価を表し、黒四角はノイラミニ
グーゼ処理グリコホリンA(T)に対する抗体の力価を
表す。PBS又はFAで免疫した動物に於いてはTn抗
原に対する抗体は検出されなかった。第11図は腫瘍サ
イズに対するN−BSM免疫の効果を示す。白四角はF
Aで免疫したマウスを、+印はフロイント アジュバン
ト中のN−BSMで免疫したマウスを示す。腫瘍はPB
S及びBSM免疫のマウス共に増殖するが、腫瘍増殖の
速度は、PBS免疫グループと比較してBSM免疫グル
ープでは遅かった。
ープは血清中に高力価のTn及びシアリルTn特異的抗
体を有したが、一方Tエピトープ(ノイラミニダーゼ処
理グリコホリンA)に対する抗体は検出されなかった。
第10図において、白四角はN−BSM(Tn)に対す
る抗体の力価を表し、白三角はヒツジ下顎腺ムチン(O
SM)に対する抗体の力価を表し、黒四角はノイラミニ
グーゼ処理グリコホリンA(T)に対する抗体の力価を
表す。PBS又はFAで免疫した動物に於いてはTn抗
原に対する抗体は検出されなかった。第11図は腫瘍サ
イズに対するN−BSM免疫の効果を示す。白四角はF
Aで免疫したマウスを、+印はフロイント アジュバン
ト中のN−BSMで免疫したマウスを示す。腫瘍はPB
S及びBSM免疫のマウス共に増殖するが、腫瘍増殖の
速度は、PBS免疫グループと比較してBSM免疫グル
ープでは遅かった。
【0169】実施例4 キャリアー蛋白質に結合したTn及びシアリルTn抗原
の化学合成 多価抗原システムの製造方法の基本的考え方を第12図
スキームIに要約する。多くの抗原を樹状アームとして
担う核マトリックスとして、リジルリジンを用いること
が、第12図スキームIの提案の必須部分となってい
る。3個のアミノ酸グループを反応末端として使用可能
なリジルリジンに連続して結合させることにより、3n
個のTn抗原残基が生成する。続いて、これらの残基を
化学的又は酵素的シアル化によりシアリルTn(Neu
Acα2→6Ga1NAcα1→R)に変換する。化学
的シアル化に含まれる多くのステップを避けるため、C
MP−NeuAc(シチジン−モノホスホ−シアル酸)
及び2→6シアリルトランスフェラーゼを用いた酵素的
シアル化が好ましい。これらの結合物はキャリアー蛋白
質に結合後、免疫抗原として用いることができる。t−
プトキシカルボニル(Boc)β−Ala−O−CH2
−Panレジン及びリジン核を用いた多価抗原ペプチド
システム(MAP)の合成は既に記載されている[Ta
m JP,Proc NatlAcad Sci USA.85,5409-5413,(1988)]。
の化学合成 多価抗原システムの製造方法の基本的考え方を第12図
スキームIに要約する。多くの抗原を樹状アームとして
担う核マトリックスとして、リジルリジンを用いること
が、第12図スキームIの提案の必須部分となってい
る。3個のアミノ酸グループを反応末端として使用可能
なリジルリジンに連続して結合させることにより、3n
個のTn抗原残基が生成する。続いて、これらの残基を
化学的又は酵素的シアル化によりシアリルTn(Neu
Acα2→6Ga1NAcα1→R)に変換する。化学
的シアル化に含まれる多くのステップを避けるため、C
MP−NeuAc(シチジン−モノホスホ−シアル酸)
及び2→6シアリルトランスフェラーゼを用いた酵素的
シアル化が好ましい。これらの結合物はキャリアー蛋白
質に結合後、免疫抗原として用いることができる。t−
プトキシカルボニル(Boc)β−Ala−O−CH2
−Panレジン及びリジン核を用いた多価抗原ペプチド
システム(MAP)の合成は既に記載されている[Ta
m JP,Proc NatlAcad Sci USA.85,5409-5413,(1988)]。
【0170】三価の結合体の合成はTn抗原のN−ヒド
ロキシサクシニミル誘導体をリジルリジンとカップルさ
せることにより行われる。全反応のシークエンスを第1
3図スキームIIに示す。抗原1は刊行物記載の方法で
[Paulsen H and Holek J-P Carbohydr.Res.,109,89-l0
7(1982);Grundler G. and Schmidt RR,Liebigs Ann.Che
m.,1826-1847(1984)]合成した。高度にチャージされた
結合物の発生を与えるアミノグループのカチオン性の性
質を除くため、セリンのアミノ グループはメタノール
溶解の無水酢酸を用いた選択的N−アセチル化により修
飾する必要がある。得られる化合物2を、縮合剤として
ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で、そのN−
ヒドロキシサクシニミド誘導体に変換する。3と4(Ba
chem Bioscience Inc.,Philadelphia,PA)とのカップリ
ング反応は、3の4.5M過剰量を用いて行い、3価の
結合物5を得る。H2Oを用いたP2カラムクロマトグ
ラフィによる精製の後、さらに4又はキャリアー蛋白質
にカップルさせるため、結合物5をその活性エステル6
に変換する。
ロキシサクシニミル誘導体をリジルリジンとカップルさ
せることにより行われる。全反応のシークエンスを第1
3図スキームIIに示す。抗原1は刊行物記載の方法で
[Paulsen H and Holek J-P Carbohydr.Res.,109,89-l0
7(1982);Grundler G. and Schmidt RR,Liebigs Ann.Che
m.,1826-1847(1984)]合成した。高度にチャージされた
結合物の発生を与えるアミノグループのカチオン性の性
質を除くため、セリンのアミノ グループはメタノール
溶解の無水酢酸を用いた選択的N−アセチル化により修
飾する必要がある。得られる化合物2を、縮合剤として
ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で、そのN−
ヒドロキシサクシニミド誘導体に変換する。3と4(Ba
chem Bioscience Inc.,Philadelphia,PA)とのカップリ
ング反応は、3の4.5M過剰量を用いて行い、3価の
結合物5を得る。H2Oを用いたP2カラムクロマトグ
ラフィによる精製の後、さらに4又はキャリアー蛋白質
にカップルさせるため、結合物5をその活性エステル6
に変換する。
【0171】本発明を詳細に且つその特定の態様を参照
に説明してきたが、本発明の精神及び範囲から離れるこ
となく種々の変更を成し得ることは当業者に明らかであ
る。
に説明してきたが、本発明の精神及び範囲から離れるこ
となく種々の変更を成し得ることは当業者に明らかであ
る。
【0172】寄託について ハイブリドーマ細胞ラインBM−8、BM−3、及びB
M−4はアメリカンタイプ カルチャー コレクション
(American Type Culture Collection,Rockville,Maryl
and)に1988年10月21日、1988年3月2日
及び1988年3月2日に夫々寄託され、夫々寄託番号
HB−9873、HB−9653及びHB−9654を
有する。
M−4はアメリカンタイプ カルチャー コレクション
(American Type Culture Collection,Rockville,Maryl
and)に1988年10月21日、1988年3月2日
及び1988年3月2日に夫々寄託され、夫々寄託番号
HB−9873、HB−9653及びHB−9654を
有する。
【0173】寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的
承認に関するブタペスト条約に従って成された。
承認に関するブタペスト条約に従って成された。
【0174】本発明にアメリカ合衆国特許を付与するこ
とに対し、全ての接触の制限は変更なしに除かれる。
とに対し、全ての接触の制限は変更なしに除かれる。
【第1図】第1図A及びBは、ヒト偏平上皮細胞癌LU
−65の培養上清中に存在する糖蛋白質のTn活性を示
すゲル濾過パターンを表わす。 第1A図:LU−65細胞上清中の全糖蛋白質の、セフ
ァロースCL−4Bによるゲル濾過パターン及び実施例
1に記載の方法でアッセイしたTn活性。縦軸は抗Tn
抗体NCC−LU−81の結合を示し、横軸は分画N
o.を示す。実線で示した分画(分画7−15)を更に
セファクリルS200で精製した(下記参照)。 第1B図:第1A図の7−15分画中のTn活性の、セ
ファクリルS200によるゲル濾過パターン。左の縦軸
は280nmに於けるUV吸収を示し、右の縦軸はTn
抗体の結合活性を示す。横軸は分画No.及び溶出液の
全容積を示す。○はTn抗体活性を表わし、●は280
nmでの吸光度により示された蛋白質濃度を表わす。
−65の培養上清中に存在する糖蛋白質のTn活性を示
すゲル濾過パターンを表わす。 第1A図:LU−65細胞上清中の全糖蛋白質の、セフ
ァロースCL−4Bによるゲル濾過パターン及び実施例
1に記載の方法でアッセイしたTn活性。縦軸は抗Tn
抗体NCC−LU−81の結合を示し、横軸は分画N
o.を示す。実線で示した分画(分画7−15)を更に
セファクリルS200で精製した(下記参照)。 第1B図:第1A図の7−15分画中のTn活性の、セ
ファクリルS200によるゲル濾過パターン。左の縦軸
は280nmに於けるUV吸収を示し、右の縦軸はTn
抗体の結合活性を示す。横軸は分画No.及び溶出液の
全容積を示す。○はTn抗体活性を表わし、●は280
nmでの吸光度により示された蛋白質濃度を表わす。
【第2図】第2図A、B、およびCは、固相Tn抗原に
対するBM−8抗体の結合の、単糖による又はグリコシ
ドによる阻害を測定するアッセイの結果を示すグラフで
ある。縦軸は抗体結合活性を示し、横軸はmMで表わし
た糖の濃度を示す。 第2A図:抗体の結合の単糖による阻害。■はBM−8
結合のGlcNAc又はGlcによる阻害を表し、●は
BM−8結合のGalNAcによる阻害を表し、□はB
M−8結合のGalによる阻害を表す。 第2B図:固相Tn抗原へのBM−8抗体の結合の、p
−ニトロフェニル−α又はβ−GalNAcによる阻
害。●はp−ニトロフェニル−α−GalNAcによる
阻害を示し、△はp−ニトロフェニル−β−GalNA
cによる阻害を示し、□はGalNAc(α及びβの混
合物)を表し、■はGlcNAcを表す。 第2C図:固相Tn抗原へのBM−8抗体の結合の、p
−ニトロフェニル−α又はβ−GlcNAcによる阻
害。○はp−ニトロフェニル−α−GalNAcを表
し、▲はGalNAc(α及びβの混合物)を表し、△
はp−ニトロフェニル−β−GalNAcを表し、□は
GlcNAcを表す。
対するBM−8抗体の結合の、単糖による又はグリコシ
ドによる阻害を測定するアッセイの結果を示すグラフで
ある。縦軸は抗体結合活性を示し、横軸はmMで表わし
た糖の濃度を示す。 第2A図:抗体の結合の単糖による阻害。■はBM−8
結合のGlcNAc又はGlcによる阻害を表し、●は
BM−8結合のGalNAcによる阻害を表し、□はB
M−8結合のGalによる阻害を表す。 第2B図:固相Tn抗原へのBM−8抗体の結合の、p
−ニトロフェニル−α又はβ−GalNAcによる阻
害。●はp−ニトロフェニル−α−GalNAcによる
阻害を示し、△はp−ニトロフェニル−β−GalNA
cによる阻害を示し、□はGalNAc(α及びβの混
合物)を表し、■はGlcNAcを表す。 第2C図:固相Tn抗原へのBM−8抗体の結合の、p
−ニトロフェニル−α又はβ−GlcNAcによる阻
害。○はp−ニトロフェニル−α−GalNAcを表
し、▲はGalNAc(α及びβの混合物)を表し、△
はp−ニトロフェニル−β−GalNAcを表し、□は
GlcNAcを表す。
【第3図】第3図は、種々の細胞ラインに対するBM−
8抗体の結合能を示す。各棒グラフは各細胞ラインを示
す。抗体の結合はQG−56(100%)に対するパー
セントで表わされている。
8抗体の結合能を示す。各棒グラフは各細胞ラインを示
す。抗体の結合はQG−56(100%)に対するパー
セントで表わされている。
【第4図】第4図はBM−8抗体に引き起される、種々
の細胞ラインの抗体依存性細胞障害(antibody-depende
nt cytotoxicity)を示すグラフである。4個のパネル
は、エフェクターを標的細胞に対し種々の割合とした時
に生じる腫瘍細胞の溶解を示す。
の細胞ラインの抗体依存性細胞障害(antibody-depende
nt cytotoxicity)を示すグラフである。4個のパネル
は、エフェクターを標的細胞に対し種々の割合とした時
に生じる腫瘍細胞の溶解を示す。
【第5図】第5図A及びBは、モノクローナル抗体BM
−3の固相OSMに対する反応性を示す。 第5A図:種々の濃度のBM−3上清に於ける、OSM
に対するBM−3の反応性。 第5B図:種々の濃度のOSMに対するBM−3の反応
性。天然のOSMに対する反応性は●で示し、ノイラミ
ニダーゼ処理OSMに対する反応性は○で示す。
−3の固相OSMに対する反応性を示す。 第5A図:種々の濃度のBM−3上清に於ける、OSM
に対するBM−3の反応性。 第5B図:種々の濃度のOSMに対するBM−3の反応
性。天然のOSMに対する反応性は●で示し、ノイラミ
ニダーゼ処理OSMに対する反応性は○で示す。
【第6図】第6図の2つのグラフは、種々の糖を用いた
ときの、OSMに対するBM−3の反応性を示す。 第6A図:BM−3に対する単糖類:フコース(○)、
ガラクトース(□)、グルコース(▲)、N−アセチル
グルコサミン(△)、N−アセチルガラクトサミン
(■)及びN−アセチルノイラミン酸(●)の阻害作
用。 第6B図:BM−3に対する二糖 NeuAcα2→6
GalNAcα1→セリン(■)及びラクトース(●)
の阻害作用。
ときの、OSMに対するBM−3の反応性を示す。 第6A図:BM−3に対する単糖類:フコース(○)、
ガラクトース(□)、グルコース(▲)、N−アセチル
グルコサミン(△)、N−アセチルガラクトサミン
(■)及びN−アセチルノイラミン酸(●)の阻害作
用。 第6B図:BM−3に対する二糖 NeuAcα2→6
GalNAcα1→セリン(■)及びラクトース(●)
の阻害作用。
【第7図】第7図は、BM−3モノクローナル抗体を用
いた、ホルマリン固定しパラフィン包埋した悪性腫瘍の
イムノペルオキシダーゼ染色を示す。 第7A図:肺腺癌に対するBM−3の反応性(×9
0)。一方正常肺は染色されない。 第7B図:適度に分化した結腸腺癌の染色。周囲の正常
細胞及びストロマ(stroma)は反応しない。 第7C図:BM−3による癌紬胞の不均一な染色を示す
粘性(mucinous)胃癌(×90)。 第7D図:BM−3による細葉肺腺癌の染色。正常肺組
織は染色されない。
いた、ホルマリン固定しパラフィン包埋した悪性腫瘍の
イムノペルオキシダーゼ染色を示す。 第7A図:肺腺癌に対するBM−3の反応性(×9
0)。一方正常肺は染色されない。 第7B図:適度に分化した結腸腺癌の染色。周囲の正常
細胞及びストロマ(stroma)は反応しない。 第7C図:BM−3による癌紬胞の不均一な染色を示す
粘性(mucinous)胃癌(×90)。 第7D図:BM−3による細葉肺腺癌の染色。正常肺組
織は染色されない。
【第8図】第8図は、BM−4モノクローナル抗体を用
いた、ホルマリン固定しパラフィン包埋した悪性腫瘍イ
ムノペルオキシダーゼ染色を示す。 第8A図:肺腺癌に対するBM−4の反応性(×4
0)。 第8B図:BM−4による粘性胃癌の染色(×90)。 第8C図:適度に分化した結腸腺癌に対するBM−4の
反応性(×90)。正常結腸細胞及びストロマは反応し
ない。
いた、ホルマリン固定しパラフィン包埋した悪性腫瘍イ
ムノペルオキシダーゼ染色を示す。 第8A図:肺腺癌に対するBM−4の反応性(×4
0)。 第8B図:BM−4による粘性胃癌の染色(×90)。 第8C図:適度に分化した結腸腺癌に対するBM−4の
反応性(×90)。正常結腸細胞及びストロマは反応し
ない。
【第9図】第9図は、肝臓TA3HA細胞をチャレンジ
されたマウスの生存に対するノイラミニダーゼ処理BS
M(N−BSM)の効果を示す。実線はフロイント ア
ジュバント(FA)のみで免疫されたマウスを表わし、
破線はN−BSMで免疫されたマウスを表わす。
されたマウスの生存に対するノイラミニダーゼ処理BS
M(N−BSM)の効果を示す。実線はフロイント ア
ジュバント(FA)のみで免疫されたマウスを表わし、
破線はN−BSMで免疫されたマウスを表わす。
【第10図】第10図はマウス血清中の抗Tn、抗シア
リル−Tn又は抗T抗体の力価に対するN−BSM免疫
の効果を示す。□はN−BSM(Tn)に対する抗体の
力価を表わし、△はOSM(シアリル−Tn)に対する
抗体の力価を表わし、■はノイラミニダーゼ処理された
グリコホリンA(T)を表わす。
リル−Tn又は抗T抗体の力価に対するN−BSM免疫
の効果を示す。□はN−BSM(Tn)に対する抗体の
力価を表わし、△はOSM(シアリル−Tn)に対する
抗体の力価を表わし、■はノイラミニダーゼ処理された
グリコホリンA(T)を表わす。
【第11図】第11図は、腫瘍サイズに対するN−BS
M免疫の効果を示す。□はFAで免疫されたマウスを示
し、+印はフロイント アジュバントと共にN−BSM
で免疫されたマウスを示す。
M免疫の効果を示す。□はFAで免疫されたマウスを示
し、+印はフロイント アジュバントと共にN−BSM
で免疫されたマウスを示す。
【第12図】第12図は、実施例4に記載の炭水化物エ
ピトープTnの化学合成を図示したものである。シアリ
ル−Tnの合成は、シアリル残基を酵素的又は化学的に
付加することによって容易に行うことができる。
ピトープTnの化学合成を図示したものである。シアリ
ル−Tnの合成は、シアリル残基を酵素的又は化学的に
付加することによって容易に行うことができる。
【第13図】第13図は、実施例4に記載の炭水化物エ
ピトープTnの化学合成を図示したものである。シアリ
ル−Tnの合成は、シアリル残基を酵素的又は化学的に
付加することによって容易に行うことができる。
ピトープTnの化学合成を図示したものである。シアリ
ル−Tnの合成は、シアリル残基を酵素的又は化学的に
付加することによって容易に行うことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 ジェルドソン トマス ジェイ アメリカ合衆国 98119 ワシントン シ アトル、エリオット アベニュー ウェス ト201 ザ バイオメンブレン インステ ィテュート内 (72)発明者 クローゼン ヘンリック アメリカ合衆国 98119 ワシントン シ アトル、エリオット アベニュー ウェス ト201 ザ バイオメンブレン インステ ィテュート内 (72)発明者 シンガイ アニル アメリカ合衆国 98119 ワシントン シ アトル、エリオット アベニュー ウェス ト201 ザ バイオメンブレン インステ ィテュート内 (72)発明者 トヨクニ タツシ アメリカ合衆国 98119 ワシントン シ アトル、エリオット アベニュー ウェス ト201 ザ バイオメンブレン インステ ィテュート内 (72)発明者 タカハシ ヘリオ アメリカ合衆国 98119 ワシントン シ アトル、エリオット アベニュー ウェス ト201 ザ バイオメンブレン インステ ィテュート内 (72)発明者 ハコモリ センイチロー アメリカ合衆国 98119 ワシントン シ アトル、エリオット アベニュー ウェス ト201 ザ バイオメンブレン インステ ィテュート内
Claims (13)
- 【請求項1】(a)Tn又はシアリルTnエピトープを
有する精製ムチン型糖蛋白質、ムチン型糖蛋白質の精製
された核構造又は担体分子にリンクした化学合成炭水化
物成分であって、ムチン型糖蛋白質に対する免疫反応を
誘導可能なものから成り、薬理的有効量の抗原、及び
(b)製薬的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤:を
含むワクチンを対象に投与して癌細胞に対する免疫反応
を誘導することから成る、ムチン型糖蛋白質の核構造を
発現する癌細胞の増殖及び複製を防ぐ方法。 - 【請求項2】Tn又はシアリルTnエピトープを有する
精製ムチン型糖蛋白質が、シンジェニックマウスに於い
てマウス腫瘍TA3HAの増殖を阻害する能力のある、
請求項2記載の方法。 - 【請求項3】Tn又はシアリルTnエピトープを有する
精製ムチン型糖蛋白質がウシ下顎ムチン又はヒツジ下顎
ムチンである請求項2記載の方法。 - 【請求項4】ムチン型糖蛋白質の精製した核構造が、T
抗原、Tn抗原、シアリルTn抗原、又は上記抗原を含
む動物ムチンを含有する請求項1記載の方法。 - 【請求項5】ムチン型糖蛋白質の精製した核構造が、T
n抗原、又はシアリルTn抗原を含有する請求項4記載
の方法。 - 【請求項6】化学的に合成された炭水化物成分がTn又
はシアリルTnエピトープを含有する請求項1記載の方
法。 - 【請求項7】癌細胞に対する抗体が、ATCC寄託番号
HB−9873のハイブリドーマBM−8が産生する抗
Tn抗体BM−8、ATCC寄託番号HB−9653の
ハイブリドーマBM−3が産生する抗シアリルTn抗体
BM−3、及びATCC寄託番号HB−9654のハイ
ブリドーマBM−4が産生する抗シアリルTn抗体BM
−4からなる群より選ばれるものものである請求項1記
載の方法。 - 【請求項8】対象がヒトである請求項1乃至7のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項9】(a)ムチン型糖蛋白質の精製された核構
造に対して作られた抗癌抗体の薬理的有効量、及び
(b)製薬的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を含
有する薬剤を対象に投与することから成る、その中の癌
細胞がムチン型糖蛋白質の核構造を発現する癌の治療
法。 - 【請求項10】ムチン型糖蛋白質の精製された核構造が
T抗原、Tn抗原、シアリルTn抗原、又は上記抗原を
含む動物ムチンである、請求項9記載の方法。 - 【請求項11】ムチン型糖蛋白質の精製された核構造が
Tn抗原又はシアリルTn抗原を含有する請求項10記
載の方法。 - 【請求項12】癌細胞に対する抗体が、ATCC寄託番
号HB−9873のハイブリドーマBM−8が産生する
抗Tn抗体BM−8、ATCC寄託番号HB−9653
のハイブリドーマBM−3が産生する抗シアリルTn抗
体BM−3及びATCC寄託番号HB−9654のハイ
ブリドーマBM−4が産生する抗シアリルTn抗体BM
−4からなる群より選ばれるものである請求項9記載の
方法。 - 【請求項13】対象がヒトである請求項9乃至12のい
ずれかに記載の方法。
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US317492 | 1989-03-01 |
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JP1504002A Division JP2849683B2 (ja) | 1988-03-11 | 1989-03-10 | 「動物及びヒトのムチンを用い、並びに合成炭水化物−担体結合物を用いた免疫による、ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体」 |
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Publication Number | Publication Date |
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JPH1192400A true JPH1192400A (ja) | 1999-04-06 |
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ID=26863475
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JP1504002A Expired - Lifetime JP2849683B2 (ja) | 1988-03-11 | 1989-03-10 | 「動物及びヒトのムチンを用い、並びに合成炭水化物−担体結合物を用いた免疫による、ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体」 |
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JP1504002A Expired - Lifetime JP2849683B2 (ja) | 1988-03-11 | 1989-03-10 | 「動物及びヒトのムチンを用い、並びに合成炭水化物−担体結合物を用いた免疫による、ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体」 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111630069A (zh) * | 2017-10-13 | 2020-09-04 | 勃林格殷格翰国际有限公司 | 针对Thomsen-nouvelle(Tn)抗原的人抗体 |
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---|---|---|---|---|
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CZ96893A3 (en) * | 1990-11-23 | 1993-12-15 | Gen Hospital Corp | Inhibition of adhesive protein cells and their carbohydrates interaction |
US5876716A (en) * | 1991-01-24 | 1999-03-02 | Bay Development Corporation Sa | Method of using an antibody to the TN antigen for the inhibition of HIV infection |
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US5527891A (en) * | 1994-03-09 | 1996-06-18 | Biomira, Inc. | Stereodirected process for synthesis of α-N-acetylgalactosaminides |
US6548643B1 (en) * | 1994-11-16 | 2003-04-15 | Austin Research Institute | Antigen carbohydrate compounds and their use in immunotherapy |
US8021667B2 (en) | 1994-11-16 | 2011-09-20 | Macfarlane Burnet Institute For Medical Research And Public Health Ltd | Compositions for immunotherapy and uses thereof |
WO1999016455A1 (en) | 1997-09-29 | 1999-04-08 | The Austin Research Institute | Mannose receptor bearing cell line and antigen composition |
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- 1989-03-10 CA CA000593376A patent/CA1340587C/en not_active Expired - Fee Related
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1998
- 1998-07-07 JP JP10205777A patent/JP3066741B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN111630069A (zh) * | 2017-10-13 | 2020-09-04 | 勃林格殷格翰国际有限公司 | 针对Thomsen-nouvelle(Tn)抗原的人抗体 |
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CN111630069B (zh) * | 2017-10-13 | 2024-05-31 | 勃林格殷格翰国际有限公司 | 针对Thomsen-nouvelle(Tn)抗原的人抗体 |
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