KR20010101446A - 항암 예방접종용 항체의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암 질환에 대한 예방접종을 위해 인간 세포성 막 항원에 대한 항체를 사용하는 것에 관한 것이다.
Description
본 발명은 항암 예방접종용 약학조성물을 제조하기 위해, 인간 세포성 막 항원에 대한 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
하이브리도마 기술의 발견에 의해, 가장 분화된 항원에 대한 단일클론항체(MAB)를 생성할 수 있게 되었다. 모든 생물학적 문제에 일반적으로 적용될 수 있는 상기 기술은 암 연구에도 중요한 역할을 한다. 지난 20년간, 다수의 종양-관련 항원(TAA)에 대한 MAB가 제조되어왔다. TAA는 종양세포의 세포막위에서 우세하게 발현되어서 비-악성 조직으로부터 분화시키는 구조로 되어 있다. 따라서, 이들은 특정 MAB 또는 상기 MAB로부터 유도된 유도체에 기초한 진단용도 또는 치료용도를 위한 표적으로서 간주된다.
TAA에 대한 MAB의 직접적인 치료용도는 수동 면역요법에 기초하는데, 즉 MAB 또는 유도체가 적당량으로 암환자에게 체계적으로 가해지며, 유기체내 농도가 충분히 높을만큼의 치료적 효과를 가진다. 상기 제제의 생물학적 반감기는 그들의 구조에 따라 다르며, 몇시간 또는 수일에 다다른다. 따라서, 적용하는 것을 반복할 필요가 있다. 그러나, 이종 항체(xenogenic antibody)(예를 들어, 쥣과의 MAB)가 사용된다면, 이는 원치않는 면역반응을 일으켜서 가능한 치료적 효과를 경감시키고, 위험한 부작용(과민성 쇼크)을 초래할 수 있다. 그러므로, 상기 면역요법제는 제한된 시간동안만 투여될 수 있다.
암 면역요법을 위한 다른 접근법은 가장 분화된 종류의 암 백신이 사용되는 악성종양세포와 싸우기 위한, 암환자의 면역체계가 선택적으로 활성화하는데 기초한다. 상기 접근법에는 자가 또는 동종 종양세포에 의한 예방접종, 화학적으로 변형되거나, 또는 유전자기술조작에 의해 변형된 자가 또는 동종 종양세포에 의한 예방접종, 분리된 TAA 또는, 화학적 또는 유전자기술법을 사용하여 제조된 TAA, 이로부터 유도된 펩티드에 의한 예방접종 및, TAA에 대한 DNA 코딩 또는 그로부터 유도된 구조물에 의한 예방접종 등이 포함된다. 선택적인 방법은 암에 대한 예방접종을 하기 위해 항-유전형 항체를 사용하는 것에 기초한다. 적당한 항-유전형 항체는 면역학적으로 모의의 TAA일 수 있다. 이종 단백질(예를 들어, 쥣과의 항체, 염소 항체 등)로서, 이들은 자가구조물로서 낮은 정도로만 면역원성인 적당한 인간 종양항원에 비해 예방접종후 인간 체내에서 강한 면역반응을 유도한다. 그러므로, 항-유전형 항체는 종양 항원을 위한 면역원성 대체물로서 예방접종에 사용될 수 있다.
능동적인 특정 암 면역요법에서 항암 항체에 의한 수동 면역요법에 비해, 극소량의 적당한 백신은 몇달 또는 몇년동안 지속하고, 약해졌을때 반복되는 예방접종에 의해 유발될 수 있는 면역성을 유도하기에 충분하다. 그리고, 능동면역화로 인해 세포면역성 뿐만 아니라 인간면역성을 유도하여 유효하게 보호할 수 있게 된다.
요컨대, 지금까지 기술한 암에 대한 면역요법을 위해 항체 또는 그의 유도체를 사용하는 것은 기본적으로 아래의 2가지 원칙에 근거한다:
- TAA에 대한 항체 또는 그의 유도체에 의한 수동요법.
- TAA에 대한 특이성을 갖는 항체의 유전형에 대한 항체 또는 그의 유도체에 의한 능동 면역화(예방접종).
가장 분화된 TAA의 발견 및 지속적인 특징화 과정중에, 이들이 암세포와 연관된 중요한 기능을 한다는 것이 발견되었다. 이들은 퇴화된 세포들이, 증가된 접착력과 같이 악성 표현형의 특성을 나타낼 수 있도록 하여, 전이하는데 중요한 역할을 한다. 그러나, 상기 항원들은 특정 단계에서, 상기 세포들의 정상적인 기능에 대해 응답할 수 있는 정상세포위에서 발현될 수도 있다. 청구의 범위에 구애받지 않고, 상기 항원들의 일부 예는 하기에 나열된다:
- 뉴런 기원의 종양위에서 종종 발현되고, 호모필릭 접착(homophilic adhesion)에 영향을 미치는 N-CAM(뉴런 세포접착분자; Neuronal Cell Adhesion Molecule)(J. Cell Biol. 118 (1992), 937).
- 상피 기원의 종양 대부분위에서 발생하지만, 또한 상피조직의 태내 발달동안 중요한 역할을 하기도 하는 루이스 Y 탄수화물 항원. 루이스 Y 양성 암세포는 높은 전이성 전위를 갖기 때문에 폐암내 상기 항원의 발현은 바람직하지 않은 예후와 아주 밀접하게 연관되어 있다는 것을 알 수 있다(N. Engl. J. Med. 327 (1992), 14).
- 위장관의 상피종양상에서 종종 일어나고, 자가-부착 분자로서 확인된 CEA(태아성 암항원; Carcino Embryonic Antigen)(Cell 57 (1989), 327).
- 상피 기원의 거의 모든 종양위에서 발현되지만, 또한 대부분의 정상 상피위에서도 발생하는 Ep-CAM(상피세포 부착분자; Epithelial Cell Adhesion Molecule). 이는 자가-부착 분자인 것을 특징으로 하며, 범-상피 부착항원으로서 분류될 수 있다(J. Cell Biol. 125 (1994), 437).
본 발명을 이루는 기술적인 문제는 암 질병을 유효하게 예방하거나 또는 치료할 수 있는 추가의 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
상기 문제는 청구의 범위에서 특징으로 하는 구체예를 제공함으로써 해결된다.
따라서, 본 발명은 암에 대해 예방 및/또는 치료용 예방접종을 하기 위한 약학조성물을 제조하는데, 인간 세포성 막 항원에 대한 항체를 사용하는 것에 관한 것이다. 본 명세서에서, "세포성 막 항원"이란 용어는 세포의 세포막위에 존재하고 있는 구조체를 의미한다. 상기에는 특히, 수용체, 가령 트랜스페린 수용체, 또는 기타 분자, 가령 E 캐드헤린(cadherine) 또는 Ep-CAM이 포함된다.
바람직한 구체예에서, 상기 세포성 막 항원은 종양-관련 항원이다. 본 명세서에서, "종양-관련 항원"이란 용어는 종양세포에 의해 우선적으로 재현되어 비-악성종양 조직으로부터 분화시키는 구조체를 의미한다. 바람직하게는, 상기 종양-관련 항원은 종양세포의 세포막위 또는 세포막내에 위치되어 있다. 그러나, 상기는 상기 항원들이 또한 비-퇴화 세포상에서도 발생하는 가능성을 배제하지 않는다. 종양-관련 항원은 예를 들어, 폴리펩티드, 특히 글리코실화 단백질, 또는 글리코실화 유형의 폴리펩티드일 수 있다. 종양-관련 항원을 대표할 수 있는 다른 구조체들로는 예를 들어 글리코지질이 있다. 상기에는, 예를 들어 강글리오사이드, 가령 GM2가 포함된다. 그리고, 종양-관련 항원은 암세포의 특징인, 세포막의 지질 조정을 변화시킴으로써 재현될 수 있다.
종양-관련 항원의 예로는, N-CAM, 루이스 Y 탄수화물 항원, CEA 및 Ep-CAM이 있으며, 이는 이미 상기에 언급되었다. 추가의 예로는 Sialyl Tn 탄수화물, Globo H 탄수화물, 강글리오사이드, 가령 GD2/GD3/GM2, 전립선 특이항원(PSA), CA 125, CA 19-9, CA 15-3, TAG-72, EGF 수용체, Her2/Neu 수용체, p.97, CD20 및 CD21이 있다. 상기 모든 항원들에 대한 단일클론항체가 사용가능하다. 추가의 종양-관련 항원들은 DeVita 외 다수의 (Eds., "Biological Therapy of Cancer", 2. Edition, Chapter 3: Biology of Tumor Antigens, Lippincott Company, ISBN 0-397-51416-6(1995))에 기술되어 있다.
"항체"라는 용어는 모든 가능한 종류의 항체, 특히 다중클론 또는 단일클론항체, 또는 화학적, 생화학적 또는 유전자조작방법에 의해 제조된 항체를 의미한다. 상기 분자들을 제조하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 항체를 제조하는 방법은 중요하지 않다. 다만, 세포성 막 항원의 관련 에피토프에 대한 그의 결합특이성이 중요하다. 바람직하게는, 단일클론항체, 가장 바람직하게는 동물 기원, 특히 쥣과 기원의 단일클론항체가 사용된다. 공지된대로 제조될 수 있는 쥣과의 단일클론항체 HE-2, 또는 HE2와 같은 양호한 결합특이성을 갖는 항체가 사용되는 것이 특히 바람직하다. 본 발명의 범주내에서, "항체"라는 용어는 항체 단편 및유도체도 포함하며, 여기에서 상기 단편 또는 유도체는 TAA를 인지한다. TAA에 대한 적당한 항체에 의한 예방접종에 의해 유도된 치료적으로 유효한 면역반응은 상기 항체의 결합영역, 즉 그들의 유전형에 의해 결정된다. 따라서, 상기 유도체들이 각 개시-항체의 유전형을 포함하는한, 성공적인 예방접종을 위해 완전한 항체대신에, 상기 항체들의 단편 또는 유도체들을 사용할 수도 있다. 예를 들어, 공지된 생화학적 방법(효소적 제거법) 또는 분자생물학의 공지방법에 의해 제조될 수 있는 F(ab)'2단편, F(ab)' 단편, Fv 단편이 있으며, 여기에 제한되지는 않는다. 추가의 예로는 화학적, 생화학적 또는 유전자 조작법에 따라 제조될 수 있는 항체의 유도체가 있다. 본 명세서에서, "유도체"란 용어는 면역반응을 향상시킬 수 있는 분자, 가령 파상풍 톡소이드, 슈도모나스 엑소톡신, 지질 A의 유도체, GM-CSF, IL-2와 항체(항체 단편)와의 화학적 결합 또는, 리포좀 배합물로 보다 잘 혼입하기 위해 항체(항체 단편)와 지질과의 화학적 결합에 의해 제조될 수 있는 생성물을 의미한다. "유도체"라는 용어는 유전공학적으로 제조된 항체(항체 단편)와, 면역반응을 향상시킬 수 있는 폴리펩티드, 가령 GM-CSF, IL-2, IL-12, C3d 등과의 융합단백질을 의미한다. 본 발명에 따라, 항체는 서로 조합되어 가해질 수도 있다. 이는 다른 막 항원 또는 같은 막 항원의 다른 에피토프를 인지하는 둘 이상의 항체가 투여될 수 있다는 것을 의미한다. 다른 항체들은 (함께 또는 따로) 동시에 또는 계속해서 투여될 수 있다. 암세포는 예방접종에 적당한 항체가 사용가능하거나 또는 발생가능함과 동시에 종종 여러 TAA를 발현한다. 유도된 면역반응의 향상된, 또는가능한 상승효과를 얻고, 항원-음성 변이체를 선택하는 잠재적인 위험을 최소화시키고, 가능한 종양세포 이종성과 길항작용하기 위해, 예방접종을 위해 둘 이상의 적당한 항체 또는 그의 단편 또는 유도체를 동시에 조합하여 사용하는 것이 유리하다.
본 발명의 명세서에서, "예방접종"이란 용어는 능동면역법, 즉 적당한 면역원성 배합물내 소량의 항원(외부로부터 예방접종된 것에 의해 인지되어 면역원성인 물질)을 (예를 들어, 피하, 피내, 근육내, 가능하게 경구, 비내)투여함으로써 특이성 면역반응을 유도하는 것을 의미한다. 따라서, 항원은 항체에 대한 특이성 면역반응을 생성하기 위해 면역체계에서 "유발인자(trigger)"로서 사용된다. 본래, 항원의 요구량은 극히 소량일 수 있다(일부 백신은 예방접종 투여량당 항원 약 5-10㎍만 함유한다).
능동면역법의 특징은 광범위에 걸쳐서 투여량-영향 곡선이 투여된 항원의 양에 거의 의존하지 않는다는 점이다. 이는 면역반응이 광범위한 투여량의 범위에서 다소 동일하다는 것을 의미한다. 결과적으로, 예방접종의 경우에 면역반응을 유도하는 것과 같은 원하는 효과는 극소량의 항원에 의해 이미 얻어질 수 있다. 그러나, 실질적으로 다량의 항원을 사용한 종래의 방법에서도 얻어질 수 있다. 물론, 부작용, 재료비용 등을 감안할때 가능한한 적은 투여량을 사용하는 것이 바람직하며, 이것이 예방접종에 있어서 중요하다.
본 발명에 있어서, 예방접종은 (모든 항생백신의 경우와 같은)예방측면 뿐만 아니라 치료적 측면에서 실시될 수 있다. 이는 본 발명에 따른 항암 예방접종이치료적 및 예방적 용도 모두로서 이해될 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 암에 안 걸린 개인에게 예방접종함으로써 암 질환을 이겨낼 수 있는 예방적 보호를 이룰 수 있다. 상기 예방적 예방접종을 받을 수 있는 사람은 암 질환이 발병할 위험이 큰 사람이지만, 이런 사람들에게만 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 용도는 지금까지 알려져 있고, 이미 기재되어 있는 암을 치료하기 위해 항체를 치료적으로 사용할 수 있는 기본적인 가능성과 실질적으로 상이하며, 예기치 못하게 유효하게 치료한다.
TAA에 대한 항체의 결합영역은 "록 앤 키(lock and key)" 원칙에 따라 각 TAA의 결합 에피토프의 구조적 상보상을 나타낼 수 있다. 이는 상기 항체가 그의 유전형에 있어서, 표적에 대한 TAA의 에피토프의 구조적 정보를 갖는 것을 의미한다. 따라서, 암환자가 TAA에 대한 적당한 면역원성 항체(즉, 예를 들어 TAA에 대한 쥣과의 MAB)에 의해 예방접종을 받는다면, "록 앤 키" 원칙에 따라 TAA의 에피토프와 구조적으로 유사할 수 있는, 백신으로서 사용된 유전형 항체에 대한 항체가 환자의 몸에서 생성된다. 이는 상기 예방접종으로 인해, 말하자면 장시간동안 능동유도된 자가항체와, 반복 예방접종에 의해 적당한 간격으로 추가될 수 있는 역가로서 유효할 수 있는 TAA 에피토프의 가용성 변형체가 암환자안에서 발생한다는 것을 의미한다.
바람직한 구체예에서, 인간 세포성 막 항원은 부착과정에서 역할을 하는 구조체이다. 본 명세서에서, 부착과정은 세포-세포-상호작용이 바람직하며, 여기에서 세포표면상 리간드 또는 수용체가 포함된다. 따라서, 부착분자는 세포-세포-상호작용의 기능을 제공하는 세포표면상 리간드 또는 수용체이다. 상기 부착분자의 하위군은 자가-부착분자이다. 상기 분자들은 자신들을 결합할 수 있는 성질을 가지고 있다.
TAA에 대한 항체에 의한 예방접종에 의해 유도된 면역반응의 생리학적 효과는 자연적으로, 각 TAA의 기능에 따라 다르다. TAA가 예를 들어, 종양세포를 혈관계의 내피세포상의 리간드에 부착하기 위한 수용체의 기능(상기 성질은 파종성 종양세포가 혈관계로부터 나와, 조직에 정착시켜 전이를 형성하기 위한 능력에 중요함)을 가진다면, 가용형태의 TAA와 유사한 리간드와 TAA와의 상호작용을 위해 경쟁할 유도 항체들이 순환계 및 조직내에 영구적으로 존재할 것이기 때문에 상기 부착능력은 상기 TAA에 대한 적당한 항체에 의한 예방접종에 의해 경감된다.
요컨대, 본 명세서에 따라, 유도된 면역반응이 TAA와 그의 리간드와의 상호작용기능을 방해하고, 상기 상호작용을 저해 또는 방해하는, 악성 종양세포에 관한 기능을 하는 TAA에 대한 적당한 항체에 의해 예방접종함으로써 이룰 수 있다. 이는 암세포가 악성 표현형에 대해 중요한 특성을 충분히 발휘할 수 없어서, 또는 발휘하지 않아, 질병을 지연 또는 정지시킬 수 있고, 특히 초기에 전이 진행을 억제할 수 있게 한다는 것을 의미한다.
또다른 바람직한 구체예에서, 세포성 막 항원은 자가-부착할 수 있으며, 즉 항원의 특정 에피토프가 다른 세포상의 같은 항원에 대해 호모필릭 결합하기 위해 반응할 수 있다. 상기 항원의 예로는, N-CAM(뉴런세포부착분자), CEA(태아성 암항원) 및 Ep-CAM(상피세포부착분자)가 있다. 상기 기능에 관여하는 자가-부착항원의에피토프에 대한 항체는 상기 기술된 바와 같이, 상기 에피토프에 상보적인 구조정보를 포함할 수 있다. 상기 항체에 의한 예방접종에 의해, 결합반응에서 상기 자가-부착특성을 갖는 항체의 형성을 유도할 수 있다. 이는 상기 경우에 수용체와 리간드가 동일하기 때문에, 상기 유도된 항체가 자가-부착항원에 차례로 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 자가-부착 항원에 대한 적당한 항체에 의해 암환자에게 예방접종을 함으로써 면역반응을 유도시킬 수 있으며, 여기에서 상기 면역반응은 종양세포에 차례로 직접 결합함으로써 다양한 치료효과를 유발한다. 한편, 악성세포에게 중요한 자가-부착능력은 차단되는 한편, 보상-의존성 분해와 같은 인간 효과기 기능 및/또는 세포독성 효과기 세포의 활성화로 인한 분해가 종양세포와 유도항체의 결합에 의해 유발될 수 있어 종양세포를 파괴시킨다.
상기 모든 기작 및 효과에 의해, 새로운 전이 형성이 억제될 수 있으며, TAA에 대한 적당한 항체에 의해 암환자에게 예방접종함으로써 질병 파종이 적어도 지연될 수 있다. 질병 초기단계에, 예를 들어 일차종양이 성공적으로 동작한 후에(인접단계), 남은 파종된 종양세포가 상기 예방접종으로 인한 새로운 전이로서 자신들을 형성하는 것이 억제된다. 이는 무재발 생존기간을 늘려, 따라서 상기 환자의 전체 수명을 연장시킨다. 상기 예방접종으로 인한 전이형성에 대항하여 수명연장 보호를 얻고, 적당한 간격으로 실시되는 예방접종을 추가시킬 수 있다. 특히, 상기 경우 상기 기술된 바와같이 종양세포상 유도된 면역반응의 추가의 직접공격으로 인해 개선된 치료효과를 얻을 수 있기 때문에, 자가-부착 TAA에 대한 적당한 항체에 의해 암환자에게 예방접종하는 것이 중요하다.
또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 용도에 따라 제조된 약학조성물은 항체와 별개로 백신형성에 통상적으로 사용되는 적어도 하나의 보조제를 함유한다. 상기 보조제에 의해 면역반응을 향상시킬 수 있다. 보조제의 예로는: 수산화알루미늄(Alu 겔), 지질다당류 유도체, 칼메트 구에린 간균(BCG), 리포좀 제조물, 면역시스템이 강한 면역반응을 이미 형성한 추가의 항원을 리포좀 제조물내에 선택적으로 갖는 배합물, 가령 예를 들어 파상풍 톡소이드, 슈도모나스 외독소, 또는 인플루엔자 바이러스의 구성성분, 생물학적 보조제, 가령 과립구 대식구 집락자극인자(GM-CSF), 인터루킨 2(IL-2) 또는 감마 인터페론(IFNγ)이 열거될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 용도에 따라 제조된 약학조성물은 항체 0.01 내지 4㎎, 바람직하게는 0.5㎎의 투여량으로 예방접종을 위해 투여하는 것이 적당하다.
상기 예방접종은 상기 투여량의 단일용도에 의해 실시될 수 있다. 그러나, 예방접종은 반복되는 용도에 의해 실시되는 것이 바람직하다. 반복수는 1년에 1 내지 12회, 보다 바람직하게는 1년에 4회 내지 8회이다. 투여량은 같거나 또는 감소시킬 수 있다.
추가 예방접종은 원래 평생동안 일정한 간격으로 실시될 수 있다. 적당한 간격은 6 내지 24개월이며, 유도항체의 역가를 측정함으로써 결정될 수 있다(추가 예방접종은 유도항체의 역가가 많이 떨어질때마다 실시되어야 함).
항체 투여는 당업자에게 공지된 방법에 따라 실시될 수 있다. 바람직하게는, 항체를 함유하는 약학조성물이 피하, 피내 또는 근육내 투여에 적당하다.
본 발명은 또한, TAA를 인지하는 하나 이상의 항체가 예방접종에 충분한 양으로 환자에게 투여되는, 예방접종에 의해 암질병을 치료하는 방법 뿐만 아니라, 암질병에 대한 예방접종하는데 종양-관련 항원을 인지하는 항체를 사용하는 것에 관한 것이다. 정의 및 바람직한 구체예에 대해, 본 발명에 따른 용도와 연관되어 상기에 이미 기술된 바와 같이 이해된다.
TAA에 대한 항체 또는 그의 유도체 또는 단편을 백신으로서 사용하는 것은 수동면역요법을 위한 상기 항-TAA 항체의 알려진 용도와 실질적으로 다르다. 수동 항체면역요법에 비교되는 본 발명에 따른 용도의 실질적인 잇점은 하기에 요약되어 있다:
암의 수동 면역요법을 위한 TAA에 대한 항체:
- 높은 투여량(≥100㎎/정맥내주입)
- 유효제 제거에 의한 단기 효과
- 면역원성으로 인해 바람직하지 않은 이종항체
- 반복사용으로 인해 야기된 아나필락시성 반응의 위험과 면역반응의 유도로 인해, 이종항체의 경우에 특히 제한되는 치료지속
암에 대한 예방 및/또는 치료용 예방접종을 위한 TAA에 대한 항체:
- 낮은 투여량(＜1㎎/예방접종; 피하, 피내 또는 근육내 주사)
- 직접 유도된 면역반응의 긴 지속효과
- 효과가 면역원성에 기초되어 있기 때문에 바람직한 이종 항체
- 제한된 치료지속(추가 예방접종은 항상 가능함)
하기에서는, 자가-부착 TAA Ep-CAM에 대한 특정 쥣과의 MAB(HE2)에 의한 예방접종 또는 그의 F(ab)'2단편에 의한 예방접종으로 인해 상기 항원을 발현하는 인간 종양세포상에 선택적으로 결합하는 항체를 직접 유도시킨다는 것을 나타내는 실험이 기술될 것이다. 이는 암질병에 치료효과를 가질 수 있는 면역반응이 자가-부착 TAA에 대한 적당한 항체에 의한 예방접종 또는 유전형 개시항체를 적어도 포함하는 그의 유도체에 의한 예방접종에 의해 유도된다는 것을 보여주며, 여기에 제한되지는 않는다.
상기 목적을 위해, 쥣과의 단일클론항체 HE2는 하이브리도마 기술학의 기본과정에 따라 발생되었다(예를 들어, H. Zola. Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press, Inc. ISBN 0-8493-6476-0; 1988 참조). Balb/c 마우스를 표준 프로토콜에 따라 인간 결장직장암 세포에 의해 면역화하였다. 비장세포를 흑색종주 P3X63Ag8과 융합시키고, 인간 결장직장암세포에 선택적으로 결합하나 흑색종 세포에는 결합하지 않는 항체를 생성하는 히브리도마를 선택하였다. 마지막으로, IgG2a/kappa 항체를 분비하는 히브리도마를 선택하였다. 대조적으로 공지된 항-Ep-CAM 항체(KS1-4)를 사용하여 KATO Ⅲ 위암세포로부터의 막 제조물에 의해 실시한 웨스턴 블롯 분석에서 나타난 바와 같이, 상기 항체(HE2)는 Ep-CAM에 결합한다.
MAB HE2의 가변영역의 아미노산서열은 하기와 같다:
H 쇄:
QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARDGPWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 1)
L 쇄:
NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 2)
도면에 대한 설명은:
도 1은 시험관내에서 소형 세포 폐암주 SW2가 MAB HE2에 의해 자가-부착이 억제되는 것을 도시하며,
도 2는 도 1에 도시된 실험에 대한 대조군으로서, 시험관내에서 MAB HE2의 영향없이 인간 소형세포 폐암주 SW2가 자가-부착하는 것을 도시하고,
도 3은 ELISA에서 측정된 바와 같이, HE2의 F(ab)'2단편에 의해 염소를 예방접종한 후에 HE2에 대한 항체 면역반응이 유도되는 것을 도시하며,
도 4는 세포-ELISA에서 측정된 바와 같이, HE2의 F(ab)'2단편에 의해 염소를 예방접종한 후에 Ep-CAM 양성 인간 위암세포(Kato Ⅲ)에 대한 항체 면역반응이 유도되는 것을 도시하며,
도 5는 도 4에 도시된 실험예에 대한 대조군으로서 실시된 것이며, 세포-ELISA에서 측정된 바와 같이 HE2의 F(ab)'2단편에 의해 염소를 예방접종한 후에Ep-CAM 음성 인간 흑색종 세포(WM9)에 대한 항체 면역반응이 부재함을 도시하고,
도 6은 세포-ELISA에서 측정된 바와 같이, Ep-CAM 양성 인간 위암세포(Kato Ⅲ)에 대한, HE2의 F(ab)'2단편에 의해 예방접종된 염소의 혈청으로부터의 친화정제된 항체 프랙션의 결합을 도시하며,
도 7은 도 6에 도시된 실험예에 대한 대조군으로서 실시된 것이며, 세포-ELISA에서 측정된 바와 같이 HE2의 F(ab)'2단편에 의해 예방접종된 염소로부터의 친화도 정제된 혈청의 항체프랙션이 Ep-CAM 음성 인간 흑색종 세포(WM9)에 결합하지 않는 것을 도시하고,
도 8은 ELISA에서 측정되는 바와 같이, 수산화알루미늄에 흡착된 HE2 0.5㎎에 의해 붉은털 원숭이를 예방접종한후 HE2에 대한 항체면역반응이 유도되는 것을 도시하며,
도 9는 세포-ELISA에서 측정되는 바와 같이, 수산화알루미늄에 흡착된 HE2 0.5㎎에 의해 붉은털 원숭이를 예방접종한후 Ep-CAM 양성 인간 위암세포(Kato Ⅲ)에 대한 항체면역반응이 유도되는 것을 도시하고,
도 10은 ELISA에서 측정되는 바와 같이, 항원(위약)없이 수산화알루미늄 배합물에 의해 다른 붉은털 원숭이 그룹에 처리한후에, HE2에 대한 면역반응이 부재한 것 뿐만 아니라 수산화알루미늄에 흡착된 HE2 0.5㎎에 의해 붉은털 원숭이 그룹에 예방접종한후 붉은털 원숭이에 의한 독성연구와 연관된, HE2에 대한 항체면역반응이 유도된 것을 도시하며,
도 11은 세포-ELISA에서 측정되는 바와 같이, HE2에 의한 붉은털 원숭이의 독성연구와 연관된 Ep-CAM 양성 인간 위암세포(Kato Ⅲ)에 대한 항체면역반응이 유도되는 것을 도시하고,
도 12는 세포-ELISA에서 측정되는 바와 같이, 수산화알루미늄에 흡착된 HE2 0.5㎎에 의해 소장암환자에게 예방접종을 반복한후에 Ep-CAM 양성 인간 위암세포(Kato Ⅲ)에 대한 항체면역반응이 유도되는 것을 도시하고,
도 13은 세포분해실험에서 측정되는 바와 같이, 수산화알루미늄에 흡착된 HE2 0.5㎎에 의해 소장암환자에게 예방접종을 반복한후에 Ep-CAM 양성 인간 위암세포(Kato Ⅲ)에 대한 혈청 세포독성이 유도되는 것을 도시한다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하지만, 이에 제한되지는 않는다:
호모필릭 결합에 관여하는 자가-부착 항원 Ep-CAM의 에피토프에 쥣과의 MAB HE2가 결합하는 것을 나타내기 위해, 인간 세포주 SW2의 자가-부착능력에 HE2가 미치는 영향을 조사하였다. 상기 소형 세포 폐암종주는 단일파종을 진행한후 수시간내에 시험관내 배양액내에서 세포 클러스터가 형성하는 경향이 있다. 이 실험예는 실시예 1에 설명되어 있다. 도 1 및 도 2에서 입증된 바와 같이, 세포 클러스터의 형성은 HE2 첨가에 의해 상당히 방해된다. 이는 상기 막 단백질의 호모필릭 결합에 관여하는 Ep-CAM의 에피토프에 HE2가 결합한다는 것을 증명해준다.
쥣과의 MAB HE2의 F(ab)'2단편에 의한 예방접종에 대한 직접적인 인간 면역반응을 조사가능하게 하기위해, 염소들을 상기 단편으로 면역화하였다. 상기 단편은 펩신에 의해 HE2를 제거함으로써 공지 및 기술된 방법에 따라 제조하고, 정제하였다. 염소의 면역화는 실시예 2에 기술되어 있다.
먼저, 예방접종된 염소의 전체 면역반응을 측정하기 위해, MAB HE2에 대한 면역글로불린에 대해서 예비-혈청과 비교하는데 있어서 회수 및 수집된 염소 면역혈청을 조사하였다. 상기 조사는 ELISA 분석에 의해 실시되었으며, 실험예는 실시예 3에 기술되어 있다. 상기 실험결과는 도 3에 도시되어 있다: 염소는 MAB HE2의 F(ab)'2단편에 의한 예방접종으로 인해 그에 대한 강한 면역반응을 생성시킨 반면, 예비혈청에서는 HE2에 대한 어떤 항체도 찾아볼 수가 없었다.
하기에서는, MAB HE2가 대응하는 (Ep-CAM)에 대한 TAA를 발현하는 인간 암세포에 결합하는, 면역글로불린을 염소 면역혈청에서 검출할 수 있는지를 연구하였다. 상기 목적을 위해, 위암세포주 KATO Ⅲ을 사용하였다. 또한, Ep-CAM(WM9 흑색종세포)를 발현하지 않는 인간 세포주에 결합하는 것은 대조군으로서 시험하였다. 상기 연구는 세포-ELISA 분석에 의해 실시되었으며, 이 실험과정은 실시예 4에 기술되어 있다. 상기 실험결과는 도 4 및 도 5에 도시되어 있으며: 염소 면역혈청은 Ep-CAM 양성 KATO 세포에 강하게 결합하는 면역글로불린을 함유하는 반면, Ep-CAM 음성 WM9 세포상에서는 어떤 결합도 검출될 수 없었다. 예비-혈청은 상기 세포에 결합하는 항체를 함유하고 있지 않다. 상기 결과는 HE2-F(ab)'2단편에 의한 예방접종에 의해 발생된 항체가 HE2에 의해 인지되는 TAA를 발현하는 세포에 다시 결합할 수 있다는 것을 보여준다. 결과적으로, 자가-부착하는 TAA의 기능은 이미 상술한 바와 같이, HE2에 의한 예방접종에 의해 발생된 항체로 전이될 수 있다.
HE2의 F(ab)'2단편에 의한 예방접종으로 인해 염소체내에서 생성되고, 상기 MAB의 유전형에 대한 항체가 KATO 세포에 결합하는 항체라는 것을 증명하기 위해, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 216)에 기술된 바와 같이 면역친화도 크로마토그래프의 순서에 의해 상기 유도항체의 항-개별특이부를 염소 면역혈청으로부터 특이적으로 정제하였다. 정제단계순서는 실시예 5에 다시 요약되어 있다.
상기 친화도 정제된 염소항체는 Ep-CAM 음성 WM9 세포에 뿐만 아니라 Ep-CAM 양성 KATO 세포에 결합하는 것에 대해 다시 시험하였다. 이 실험은 실시예 6에 기술되어 있다. 상기 실험의 결과는 도 6 및 도 7에 도시되어 있으며: 유전형 HE2에 대한 염소 IgG가 Ep-CAM 양성 KATO 세포에 강하게 결합하는 반면, 비특이적 염소 IgG는 거의 결합하지 않는다. 그러나, Ep-CAM 음성 WM9 세포에 대한 친화도 정제된 특이적 염소 IgG의 결합은 비특이적 염소 IgG에 대한 결합과 다르지 않다. 따라서, HE2의 F(ab)'2단편에 의한 예방접종에 의해 직접 생성되고, 상기 항체의 유전형에 대한 항체의 프랙션은 HE2에 의해 인지되는 TAA를 발현하는 암세포에 결합하는 항체를 함유한다는 것이 입증된다. 상기 실험예에 의해, HE2에 의한 예방접종에 의해 유도된 Ep-CAM 양성세포에 대한 항체가 여러 문헌(Cancer Immunol. Immunother. 42 (1996), 81-87 참조)에 개시되었던 바와 같이 이중 자가 유전형 망 캐스케이드의 결과가 아니라는 것을 알 수 있는데, 그 이유는 유전형 망에 따라 이들이 Ab1 뿐만 아니라 Ab2에 결합할 수 없기 때문에 Ab1(=HE2) 컬럼상 친화도 크로마토그래피에 의해 전혀 정제될 수 없었기 때문이다.
HE2의 F(ab)'2단편에 의해 염소를 면역화한 결과의 관점에서, 인간과 밀접하게 관련되어 있는 종에서 면역결과를 확인하기 위해 붉은털 원숭이에 의해 예방접종 연구도 실시하였다. 상기 실험예에 대해, 완전한 쥣과의 MAB HE2가 면역원으로서 사용되었다. 큰 이종 단백질로서 쥣과의 Fc부는 또한, 유전형에 대한 면역반응을 향상시킨다고 가정하였다(운반체 효과). 가능한 국소 부작용을 피하기 위해, 수산화 알루미늄을 독하지 않은 보조제로서 사용하였다. 상기 예방접종 실험예를 위한 배합물의 제조예는 실시예 7에 기술되어 있다.
실시예 7에 기술되어 있는 배합물을 붉은털 원숭이 4마리의 등에 피하주사하였다(HE2 0.5㎎ = 예방접종마다 0.5㎖, 4주 간격으로 2회 투여함). 혈청을 추출하기 위해, 여러 시간지점에 걸쳐 혈액을 채취하였다.
먼저, HE2에 대한 면역반응은 ELISA로 측정하였다. 실험예는 실시예 8에 기술되어 있다. 도 8에 도시된 바와 같이, HE2에 대한 항체의 상당한 역가가 29일째에 이미 측정될 수 있다.
그리고, KATO Ⅲ 세포에 결합하는 항체가 예방접종에 의해 유도되는지의 여부를 조사하였다. 상기 시험을 위해, 세포-ELISA를 사용하였다. 실험예는 실시예 9에 기술되어 있다. 도 9에 도시된 바와 같이, Ep-CAM 양성 KATO Ⅲ 종양세포에 결합하는 항체는 모든 동물내에서 29일째에 이미 유도된다.
하기에서, 붉은털 원숭이에 의한 독성연구와 연관하여, 알루미늄에 흡착하는HE2에 의해 4마리의 동물들을 예방접종하였다. 다른 4마리의 붉은털 원숭이에게는 위약으로서 수산화 알루미늄을 주입하였다. 배합물의 제조예는 실시예 10 및 11에 기술되어 있다. 전체적으로, 붉은털 원숭이는 각 배합물(유효제 또는 위약) 0.5㎖로 등에 4회 피하주사되었다(1일, 15일, 29일 및 57일). 혈청추출을 위해, 연구시작하기전, 그리고 처리하는동안 다른 횟수로 혈액을 채취하였다.
다시, HE2에 대한 면역반응을 ELISA로 먼저 측정하였다. 실험예는 실시예 8에 기술되어 있다. 도 10에 도시된 바와 같이, 1차 예방접종후 이미 2차 예방접종에 의해 추가로 향상된 HE2 군의 붉은털 원숭이 4마리 모두에게서 HE2에 대한 상당한 인간 면역반응이 일어난 반면, 위액군의 붉은털 원숭이는 HE2에 대한 항체의 역가가 증가하지 않는다.
상기 발견은 HE2군의 붉은털 원숭이의 43일째 혈청을 면역친화 정제함으로써 추가로 확인되었다. 실험예는 실시예 12에 기술되어 있다. 하기 표에 나타난 바와 같이, 모든 4마리 원숭이들은 43일째에 그의 혈청내에서 HE2에 대한 강한 IgG 면역반응(2차 면역반응)을 일으킨 반면, IgM부는 전-혈청과 대조가능하다.
| 원숭이 | 일 | ㎍/㎖ IgM 대응 | ㎍/㎖ IgG 대응 |
| 9206m | -14 | 7.7 | 2.8 |
| 43 | 16.3 | 135.2 | |
| 9599m | -14 | 17.9 | 2.5 |
| 43 | 25.4 | 449.3 | |
| 8415f | -14 | 16.0 | 3.2 |
| 43 | 22.5 | 159.9 | |
| 9139f | -14 | 5.3 | 5.0 |
| 43 | 10.3 | 69.8 |
또한, Ep-CAM 양성 KATO Ⅲ 세포에 대한 항체의 유도를 조사하였다. 다시,세포-ELISA를 상기 시험을 위해 사용하였다. 실험예는 실시예 9에 기술되어 있다. 도 11에 도시된 바와 같이, HE2군의 붉은털 원숭이는 29일째에 이미 KATO Ⅲ 세포에 대한 항체를 생성하였다.
염소 및 붉은털 원숭이의 예방접종결과에 관해, 일례로 전이에 의해 소장암에 걸린 환자(Dukes D)가 MAB HE2에 의해 예방접종되고, 수산화 알루미늄을 흡수하였다. 배합물의 제조예는 실시예 7에 기술되어 있다. 전체적으로, 환자는 (HE2 0.5㎎에 대응하는) 상기 배합물 0.5㎖에 의해 상한까지 4회(1일, 50일, 78일, 114일) 피하주사되었다. 각 예방접종전 및 128일째에 혈청을 추출하기 위해 혈액을 채취하였다. 먼저, KATO Ⅲ 세포에 결합하는 항체가 예방접종에 의해 유도되었는지의 유무를 조사하였다. 세포-ELISA를 상기 시험을 위해 다시 사용하였다. 실험예는 실시예 9에 기술되어 있다. 상기 실험결과는 도 12에 도시되어 있다. KATO Ⅲ 세포에 결합하는 높은 역가의 항체는 예방접종으로 인해 상기 암환자내에서 명백하게 유도된다.
생체외 KATO Ⅲ 암세포에 대한 세포독성 효과를 매개하는 HE2에 의한 예방접종에 의해 항체가 유도되는지의 여부를 추가로 조사하였다. 상기 목적을 위해, 유도항체에 의해 매개되는 상보-의존성 분해를 입증하기 위해 KATO Ⅲ 세포는 상기 암환자의 면역혈청 및 전혈청과 함께 배양하였다. 실험예는 실시예 13에 기술되어 있다.
결과는 도 13에 도시되어 있다. HE2에 의한 예방접종에 의해 유도된 항체는 자가면역 환자혈청내에서 상보-의존성 분해를 통해 Ep-CAM 양성 KATO Ⅲ 세포를 파괴할 수 있다.
상기 실험예는 자가-부착 TAA에 대한 적당한 항체, 가령 Ep-CAM, 또는 각 출발항체와 같은 유전형을 갖는 그의 유도체에 의한 예방접종이 상기 자가-부착 TAA를 발현하는 종양세포상에 선택적으로 결합하는 인간 면역반응을 유발한다는 것을 보여준다. 유도항체는 상기 종양세포에 대한 세포독성 잠재력을 나타낸다. 따라서, 상기 항체에 의한 예방접종은 암질병에 치료효과를 야기할 수 있다.
사용된 재료:
미량역가판: ELISA용 면역플레이트(Immuno Plate) F96 MaxiSorp (Nunc)
세포-ELISA용 세포배양 클러스터(Cell Culture Cluster)(Costar; Cat.Nr. 3598)
세포주: SW2: 인간 소세포 폐암종주, Ep-CAM 양성
KATO Ⅲ: 인간 위장암세포주, Ep-CAM 양성(ATCC HTB 103)
WM9: 인간 흑색종 세포주, Ep-CAM 음성
결합 버퍼: 0.1M NaHCO3
0.5M NaCl
pH값 8.0
정제 버퍼 A:PBS def
0.2M NaCl
pH값 7.2
정제 버퍼 B:0.1M 글리신/HCl
0.2M NaCl
pH값 2.9
배지 A: RPMI 1640 + 2g/ℓ NaHCO3
100U/㎖ 페니실린 G
100㎍/㎖ 스트렙토마이신 설페이트
4mM 글루타민
10% 소태아혈청(열 불활성화)
결합 버퍼: 15mM Na2CO3
35mM NaHCO3
3mM NaN3
pH값: 9.6
PBS 결핍: 138mM NaCl
1.5mM KH2PO4
2.7mM KCl
6.5mM Na2HPO4
pH값: 7.2
고정액: 생리학적 NaCl 용액내 0.1% 글루타르디알데히드
세척 버퍼 A:2% NaCl
0.2% Triton X-100
PBS 결핍
세척 버퍼 B:0.05% Tween 20(PBS 결핍)
차단 버퍼 A:5% 소태아혈청(열 불활성화)
PBS 결핍
차단 버퍼 B:1% 소혈청 알부민
0.1% NaN3
PBS 결핍
희석 버퍼 A:2% 소태아혈청(열 불활성화)
PBS 결핍
희석 버퍼 B:PBS 결핍
염색 버퍼: 24.3mM 시트르산
51.4mM Na2HPO4
pH값: 5.0
기질: o-페닐렌 디아민 디히드로클로리드 40㎎
100㎖ 염색버퍼
20㎕ H2O2(30%)
정지액: 4N H2SO4
실시예 1:
시험관내 배양된 SW2 세포들을 원심분리하고, 펠릿을 배지 A에 현탁시키고, 7×104세포/㎖로 조정한다. LabTek 챔버내에서 0.1㎖ PBS def를 세포현탁액 0.3㎖와 혼합하거나, 또는 0.1㎖ PBS def를 HE2 40㎍과 혼합한후, 세포 현탁액 0.3㎖와 혼합한다(HE2의 최종 농도 100㎍/㎖). 세포현탁액을 최종 성분으로서 첨가하기 바로전에, 세포를 피펫으로 분리시킨다. 혼합후 바로, 도립 현미경(배율 100배)으로 각 세포 현탁액을 촬영한다. 계속해서, 세포현탁액을 37℃/5% CO2에서 4시간동안 배양하고, 다시 촬영한다.
실시예 2:
염소 2마리를 Freund's Complete Adjuvant(Difco) 3㎖와 함께 3㎖ PBS 부족한 F(ab)'2단편 1.5㎎에 의해 여러 곳에 피하 예방접종한다. 8일째에, 1일째의 제1 촉진제 예방접종을 Freund's Incomplete Adjuvant(Difco)로 제공한다. 29일째에, 제2 촉진제 예방접종을 같은 방법으로 제공한다. 그러나, 보조제는 첨가하지 않는다. 일어나는 면역반응을 분석하기 위한 혈청을 채취하기 위해 예방접종을 시작하기 전, 그리고 54일째에 혈액을 채취한다.
실시예 3:
MAB HE2의 100㎕ 분취량(결합버퍼내 10㎍/㎖ 용액)을 37℃에서 1시간동안 미량역가 플레이트의 웰내에서 배양한다. 세척버퍼 A에 의해 상기 플레이트를 6회세척한후, 차단버퍼 A 200㎕를 각 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 37℃에서 30분동안 배양한다. 상기와 같이 플레이트를 세척한후, 시험되는 염소 혈청 100㎕ 분취량을 37℃에서 1시간동안 희석버퍼내에서 1:100 내지 1:1,000,000 희석 배양한다. 상기와 같이 플레이트를 세척한후, 퍼옥시다아제-결합된 토끼 항-염소-Ig 항체(Zymed)를 희석버퍼 A내에서 1:1000의 희석비율로 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분동안 배양한다. 상기 플레이트를 세척 버퍼 A로 4회 세척하고, 염색 버퍼로 2회 세척한다. 항체결합은 각 웰에 특이기질 100㎕를 첨가함으로써 검출되며, 염색반응은 정지액 50㎕를 첨가하고 약 10분후 정지한다. 평가는 490㎚에서 광학밀도(OD)를 측정함으로써 실시한다(참고측정파장은 620㎚임).
실시예 4:
2×106세포/㎖ 배지 A의 농도로 시험되는 세포주의 세포현탁액 100㎕와 함께 미량역가 플레이트의 웰을 4℃에서 밤새 배양하였다. 상층액을 따라내 버린후, 플레이트를 실온에서 5분동안 웰당 고정액 50㎕와 함께 배양한다. 상층액을 따라내 버린후, 차단버퍼 B 200㎕를 각 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 37℃에서 1시간동안 배양한다. 세척버퍼 B 200㎕에 의해 2회 세척한후, 시험되는 염소 혈청 100㎕ 분취량을 희석버퍼 B내에서 1:10 내지 1:100,000의 희석비율로 37℃에서 1시간동안 배양한다. 빙냉된 세척버퍼 B 100㎕에 의해 플레이트를 2회 세척한후, 퍼옥시다아제-결합된 토끼 항-염소-Ig 항체(Zymed) 100㎕를 1:1000의 희석비율로 희석버퍼 A내에 첨가하고, 37℃에서 45분동안 배양한다. 플레이트를 빙냉 세척버퍼B 100㎕에 의해 3회 세척한다. 항체결합은 웰당 특이 기질 100㎕를 첨가함으로써 검출되며, 염색반응은 정지액 50㎕를 첨가함으로써 약 10분후에 정지된다. 평가는 490㎚에서 광학밀도(OD)를 측정함으로써 실시된다(참고측정파장은 620㎚임).
실시예 5:
정제는 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:216, 1984에 기술되어 있으며, 하기와 같이 요약되어 있다: 제1 단계에서, 염소혈청에 함유된 전체 IgG의 정제는 DEAE 음이온 교환 컬럼으로 공지방법에 따라 실시한다. 계속해서, 불규칙 쥣과의 IgG2a가 결합된 면역친화도 컬럼(CH-세파로스 4B, Pharmacia)에 HE2의 F(ab)'2 단편의 일정영역에 대한 염소 항체를 결합시키고, 반면 항-유전형 염소 항체의 프랙션을 상기 컬럼에 결합하지 않는다. 그러므로, 마지막 단계에서 HE2가 결합된 면역친화도 컬럼(CH-세파로스 4B, Pharmacia)에 상기 면역친화도 크로마토그래피의 플로우-스루(flow-through)결합시킨다. 상기 컬럼에 특이적으로 결합된 프랙션을 pH 2.8의 버퍼(0.1M 글리신/HCl)로 용출시키고, 중화한다. 상기 방법으로 얻은 염소 IgG 프랙션은 HE2의 유전형에 대한 것이다.
실시예 6:
상기 세포-ELISA는 기본적으로 실시예 4에 기술된 바와 같은 방법으로 실시한다. 혈청 희석액 대신에, 면역친화도-정제된 염소 IgG 및 비특이적 정제된 염소 IgG 100㎍/㎖ 내지 0.031㎍/㎖ 농축액 각각을 사용한다.
실시예 7:
Alu-Gel 현탁액(Serva제 Alu-Gel S, 2% 현탁액, 품질: 백신제조용 보조제)0.83㎖를 멸균조건하에 실온에서 1시간동안 pH 5.5의 PBS내 HE2 10㎎/㎖ 및 PBS def. 3.67㎖의 용액 0.5㎖와 함께 조심스럽게 교반한다(HE2의 최종농도: 1㎎/㎖; Alu-Gel S: 0.33%). 그후, 상기 현탁액을 0.5㎖의 분취량으로 주입 바이알내에 멸균하면서 채운다.
실시예 8:
결합된 붉은털 원숭이 항체를 검출하기 위해 퍼옥시다아제-결합된 염소-항-인간-Ig 항체(Zymed)가 사용된 것 외에는 상기 ELISA는 기본적으로 실시예 3에 기술된 방법과 같은 방법으로 실시된다. 인간항체와 붉은털 원숭이 항체의 불변부위의 서열상동성이 약 98%이기 때문에, 상기 제제에 의해 붉은털 원숭이 항체는 인간 항체와 같은 방법으로 검출될 수 있다.
실시예 9:
세포에 결합된 붉은털 원숭이 항체(또는 인간 항체)를 검출하기 위해 퍼옥시다아제-결합된 염소-항-인간-Ig 항체(Zymed)가 사용된 것 외에는 상기 세포-ELISA는 기본적으로 실시예 4에 기술된 방법과 같은 방법으로 실시된다. 퍼옥시다아제-결합된 염소-항-마우스-IgG 항체(Zymed)는 쥣과의 HE2를 검출하기 위해 대조군으로서 사용된다.
실시예 10:
HE2 용액(PBS def. 10㎎/㎖ pH=5.5) 3.5㎖를 생리식염액 27.25㎖ 뿐만 아니라 수성 치메로살 용액(10㎎/㎖; Sigma) 0.35㎖와 함께 멸균조건하에 혼합하고, 조심스럽게 교반하면서 수산화알루미늄 현탁액(물 3%; Alhydrogel, SuperfosBiosector, Denmark) 3.9㎖에 첨가한다. 알루미늄 캡을 구비한 고무 플러그에 의해 밀봉한 탈피로겐화(depyrogenated)된 유리관에 상기 방법으로 얻은 현탁액 0.6㎖를 멸균조건하에 채운다.
실시예 11:
항체용액대신에 생리적 NaCl 용액 0.35㎖를 사용하고, 치메로살 용액 대신에 pH=5.5의 PBS 3.5㎖를 사용한 것 외에는 위약 배합물을 실시예 10에 기술된 방법과 같은 방법으로 제조한다.
실시예 12:
CH-세파로스 4B(Pharmacia) 1g을 1mM HCl 30㎖내에 15분동안 현탁시킨다. 그후, 소결유리 AG3의 필터상에서 1mM HCl 1ℓ와 결합 버퍼 200㎖에 의해 순서대로 겔을 세척한다. HE2 10㎎(저장용액 10㎎/㎖)을 결합버퍼 약 0.5ℓ에 대해 투석한다. 상기 용액을 밀봉용기내에서 겔현탁액과 혼합한다. 1:2의 겔:버퍼 비율은 결합하기에 적당한 현탁액을 형성한다. 상기 현탁액을 실온에서 5.5시간동안 교반한다. 계속해서, 과량의 리간드는 결합버퍼 3×30㎖로 세척함으로써 제거한다. 남은 반응기는 1M 에탄올 아민과 함께 실온에서 1시간 배양함으로써 차단된다. 그후, 상기 겔은 pH=8의 0.1M Tris-HCl 버퍼와 함께 실온에서 1시간 교반된다. 마지막으로, 상기 겔을 pH를 변경시키면서 버퍼 3주기에 의해 세척한다. 각 주기는 0.5M NaCl 함유 pH 4의 0.1M 아세트산나트륨 버퍼, 및 0.5M NaCl 함유 pH 8의 0.1M Tris-HCl 버퍼로 구성된다. 겔은 4℃에서 보관한다
붉은털 원숭이 혈청으로부터 HE2에 대한 항체 프랙션을 면역친화도 정제하는것은 하기에 따라 실시한다: 면역친화도 정제는 FPLC 시스템(Pharmacia)상에서 실시한다. 상기에 따라 얻은 겔 1㎖를 Pharmacia HR5/5 컬럼에 채운다. 혈청 0.5㎖를 정제 버퍼 A에 의해 1:10으로 희석한다. 상기 용액을 1㎖/분의 속도로 컬럼상으로 펌프시키고, 검출기의 UV 기준선이 다시 (280㎚)에 도달할때까지 정제 버퍼 A에 의해 세척한다. 그후, 결합된 면역글로불린을 정제 버퍼 B에 의해 용출시키고, 0.5M Na2HPO4에 의한 흡착후 프랙션을 바로 중화하고, 0.02% NaN3을 첨가한다. 상기 방법으로 정제된 항체 프랙션 50㎕을 크기분별 컬럼(SEC, Zorbax 250 GF)상에서 분석하고, IgG와 IgM의 일부를 정량화한다. SEC를 위해, pH 7의 220mM 인산완충액과 10% 아세토니트릴을 용출액으로서 사용한다. 인간 IgG 및 인간 IgM은 표준보정곡선(피크면적대 농도)를 이루기 위해 여러 농도에서 각 크로마토그래프한 SEC에 대한 스탠다드로서 제공한다. 붉은털 원숭이의 친화도 정제된 항체프랙션내 IgG 및 IgM 농도계산은 스탠다드 곡선을 사용하여 선형 감소에 의해 실시되었다. 농도는 사용된 원숭이 혈청의 ㎍/㎖로서 계산된다.
실시예 13:
시험을 실시하기 하루전에, KATO Ⅲ 세포를 새로운 배지 A에 옮기고, 세포배양 플라스크내 37℃/5% CO2에서 유지한다. 다음날, 상기 세포를51크롬에 의해 먼저 표시한다. 5×106세포를 37℃/5% CO2에서 100μCi Na2 51CrO4와 함께 배지 A 800㎕내에서 배양한다. 이후에, 상기 세포를 배지 A로 세척하고, 2.5×105세포/㎖의 밀도로 조정한다. 상기 세포현탁액 100㎕ 분취량을 미량적정판의 웰에 피펫시킨다. 시험되는 환자 혈청의 100㎕ 분취량을 첨가하고, 37℃/5% CO2에서 3시간동안 배양한다(상보물의 활성에 해를 끼치지 않기 위해 상기 혈청은 80℃에서 저장하고, 상기 분석을 위해 한번만 융해시킨다). Skatron-Harvesting-Press를 사용하여 상층액을 채취하고, 감마-계수기로 측정한다. 결과적으로, "실험방출"값을 얻는다. "전체 방출"을 측정하기 위해, 세포를 상기와 같이 처리하며, 여기에서 혈청은 2% SDS, 50mM Na2CO3및 10mM EDTA 용액으로 대체시킨다. "자발 방출"값은 혈청을 배지 A로 대체시킴으로써 얻어진다. 결과는 하기와 같이 계산된다:
실험은 3회 실시되며, 단일 결과의 평균값과 표준편차는 지시되어 있다.
Claims (14)
- 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 예방접종용 약학조성물을 제조하는데, 인간 세포성 막 항원에 대한 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 항체의 용도.
- 제 1 항에 있어서,상기 세포성 막 항원은 종양-관련 항원인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,상기 세포성 막 항원은 부착과정에서 기능하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 세포성 막 항원은 상피세포의 항원인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 세포성 막 항원은 자가-부착이 가능한 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 5 항에 있어서,상기 세포성 막 항원은 Ep-CAM, N-CAM 또는 CEA인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 항체는 동물기원의 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 항체는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 8 항에 있어서,상기 항체는 쥣과의 단일클론항체 HE2인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 항체는 항체 HE2와 같은 미세한 결합특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,다른 세포성 막 항원 또는 세포성 막 항원의 다른 에피토프에 대한 둘 이상의 항체가 서로 조합하여 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 약학조성물은 적어도 하나의 백신 보조제도 또한 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 약학조성물은 항체 0.01 내지 4㎎ 범위의 투여량으로 항체를 투여하기에 적당한 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 약학조성물은 피하, 피내 또는 근육내 주사에 의해 투여하기에 적당한 것을 특징으로 하는 용도.
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