PL201533B1 - Zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciwko antygenowi błony komórkowej Ep-CAM - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy zastosowania przeciwcia la skierowanego przeciwko antygenowi b lony ko- mórkowej Ep-CAM do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do czynnej immunizacji przeciwko chorobom nowotworowym. PL PL PL PL

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201533 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 364747 ⁽¹³⁾ (22) Data zgłoszenia: 12.01.2000 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

12.01.2000, PCT/EP00/00174 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

20.07.2000, WO00/41722 PCT Gazette nr 29/00 (51) Int.Cl.

A61K 39/395 (2006.01) A61K 39/39 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) C07K 16/30 (2006.01) (54) Zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciwko antygenowi błony komórkowej Ep-CAM

(30) Pierwszeństwo: 13.01.1999,CH,51/99	(73) Uprawniony z patentu: IGENEON KREBS-IMMUNTHERAPIE FORSCHUNGS- UND ENTWICKLUNGS-AG, Wiedeń,AT
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	(72) Twórca(y) wynalazku:
13.12.2004 BUP 25/04	Helmut Eckert,Oberwil,CH Hans Loibner,Wien,AT
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2009 WUP 04/09	(74) Pełnomocnik: Kawczyńska Marta, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych

⁽⁵⁷⁾ Wynalazek dotyczy zastosowania przeciwciała skierowanego przeciwko antygenowi błony komórkowej Ep-CAM do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do czynnej immunizacji przeciwko chorobom nowotworowym.

PL 201 533 B1

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek odnosi się do zastosowania przeciwciała, które skierowane jest przeciwko antygenowi błony komórkowej Ep-CAM do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do immunizacji przeciwko nowotworowi.

Wraz z odkryciem technologii hybrydom możliwym stało się wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych (MAB) przeciwko różnorakim antygenom. Technologia ta może znaleźć zastosowanie w różnych dziedzinach biologii, odgrywa też istotną rolę w badaniach nad nowotworami.

Przez ostatnie dwadzieścia lat wytworzono MAB skierowane przeciwko wielu antygenom nowotworowym (TAA). TAA są strukturami, które są przeważnie ekspresjonowane w błonie komórkowej komórek nowotworowych i które pozwalają na odróżnianie od niezłośliwych tkanek. Dlatego też, są one uważane za cel dla diagnostycznych jak i terapeutycznych zastosowań na podstawie specyficznych MAB lub ich pochodnych otrzymanych z tych MAB.

Bezpośrednie zastosowania terapeutyczne MAB, które są bezpośrednio skierowane przeciwko TAA bazują na immunoterapii biernej tj. MAB lub pochodna jest układowo podawana pacjentom z nowotworem w odpowiedniej iloś ci i wywoł uje terapeutyczne skutki tylko tak dł ugo jak stężenie w organizmie jest wystarczająco wysokie. Biologiczny okres półtrwania takich czynników zależ y od ich struktury i waha się od kilku godzin do kilkunastu dni. Dlatego też ważne jest powtarzanie podawania. Jednakże jeśli zostaną użyte przeciwciała ksenogeniczne (np. mysie MAB) to doprowadzi to do niepotrzebnej reakcji immunologicznej, która może spowodować zniesienie możliwych skutków leczniczych a nawet szkodliwe skutki uboczne (wstrz ąs anafilaktyczny). Dlatego też, takie immunoterapie mogą być stosowane przez ograniczony okres czasu.

Inne podejście do immunoterapii raka bazuje na selektywnej aktywacji układu immunologicznego pacjentów z nowotworem w celu zwalczenia komórek złośliwych przy użyciu najbardziej zróżnicowanych rodzajów szczepionek nowotworowych. Szczepionkami tymi mogą być szczepionki z autologicznymi lub allogenicznymi komórkami nowotworowymi, szczepionki z autologicznymi lub allogenicznymi komórkami nowotworowymi, które zostały zmodyfikowane chemicznie lub przy zastosowaniu technik genetycznych, szczepionki z wyizolowanym TAA lub TAA, które zostały wyprodukowane przy użyciu metod chemicznych lub genetycznych wraz z białkami z nich otrzymanymi oraz, ostatnio również, szczepionki z DNA kodującym TAA lub struktury z nich otrzymane, itd. Alternatywna metoda bazuje na użyciu przeciwciał anty-idiotypowych w szczepionkach przeciwko nowotworom. Odpowiednie antyidiotypowe przeciwciała immunologicznie naśladują TAA. Białka ksenogeniczne (np. przeciwciała mysie, przeciwciała kozie itd.) indukują silną odpowiedź immunologiczną po zaszczepieniu u człowieka, w przeciwieństwie do odpowiednich ludzkich antygenów, które strukturalnie są często, tylko, w mniejszym stopniu immunogenne. Dlatego też przeciwciała antyidiotypowe mogą być użyte w szczepionkach jako immunologiczne zamienniki dla przeciwciał nowotworowych.

W przeciwień stwie do biernej immunoterapii z przeciwciał ami antynowotworowymi w aktywnej specyficznej immunoterapii nowotworowej nawet niewielka ilość odpowiedniej szczepionki jest w zasadzie wystarczająca do indukowania odporności, która trwa przez miesiące lub lata i która może być wzmocniona przez powtórne szczepienie w przypadku osłabienia. Co więcej aktywna immunizacja pozwala na indukowanie odporności komórkowej jak i humoralnej, których współdziałanie może doprowadzić do skutecznej ochrony.

Podsumowując zastosowanie przeciwciał lub ich pochodnych w immunoterapii przeciwko nowotworom, opisanej dotychczas, bazuje głównie na dwóch zasadach:

- terapia bierna z przeciwciał ami lub ich pochodnymi, które są skierowane przeciwko TAA

- immunizacja aktywna (szczepienie) przeciwciałami lub ich pochodnymi, które są skierowane przeciwko idiotypowi przeciwciał wykazujących specyficzność wobec TAA.

Przy odkryciu i późniejszej charakterystyce najbardziej zróżnicowanych TAA okazało się, iż odgrywają one istotną rolę jeśli chodzi o komórki nowotworowe. Umożliwiają one zdegenerowanym komórkom wykazać właściwości charakterystyczne dla fenotypu złośliwego, takie jak zwiększona zdolność do adhezji, która odgrywa istotną rolę w ustaleniu przerzutu nowotworu. Jednakże takie antygeny mogą być w pewnych stanach także ekspresjonowane na normalnych komórkach, gdzie są one odpowiedzialne za normalne funkcje tych komórek. Przykładami takich przeciwciał są:

-N-CAM (ang. Neuronal Cell Adhesion Molecue, cząsteczka adhezyjna komórki neuronowej), która często jest eksprymowana na guzach pochodzenia neuronowego i która powoduje adhezję homofilną (J. Cell Biol. 118 (1992), 937).

PL 201 533 B1

- antygen węglowodanowy Lewis Y, który pojawia się w większości guzów pochodzenia nabłonkowego, ale który również odgrywa istotną rolę podczas rozwoju płodowego tkanek nabłonkowych. Zostało wykazane, że ekspresja tego antygenu w nowotworze płuc jest silnie powiązana z niekorzystnym rokowaniem gdyż pozytywne komórki rakowe Lewis Y wykazują często wyższy potencjał przerzutu (N. Engl. J. Med. 327 (1992), 14).

- CEA (antygen karcynoembrionalny), który czę sto wykazują nowotwory nabł onkowe ukł adu pokarmowego i który został zidentyfikowany jako cząsteczka samoadhezyjna (Cell 57 (1989), 327).

- Ep-CAM (czą steczka adhezyjna komórki nabł onka (ang. epithelial cell adhesion molecule)), która jest eksprymowana w niemalże wszystkich nowotworach pochodzenia nabłonkowego, ale która pojawia się również w wielu normalnych komórkach nabłonka. Została ona scharakteryzowana jako cząsteczka samo-adhezyjna i może zatem być sklasyfikowana jako ogólnie-nabłonkowy antygen adhezyjny (J. Cell Biol. 125 (1994), 437).

Problemem technicznym leżącym u podstaw niniejszego wynalazku jest dostarczenie dalszych sposobów i metod, które pozwolą na skuteczną profilaktykę lub terapię chorób nowotworowych.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciwko antygenowi błony komórkowej Ep-CAM do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do czynnej immunizacji profilaktycznej i/lub terapeutycznej przeciwko nowotworowi.

Korzystnie przeciwciało jest pochodzenia zwierzęcego.

Korzystnie przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.

Korzystniej przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym pochodzenia zwierzęcego.

Jeszcze korzystniej przeciwciało jest mysim przeciwciałem monoklonalnym, przy czym region zmienny łańcucha ciężkiego ma sekwencję aminokwasową jak pokazano na SEQ ID NO: 1, a region zmienny łańcucha lekkiego ma sekwencję aminokwasową jak pokazano na SEQ ID NO: 2.

Korzystnie stosowane są w połączeniu ze sobą dwa lub większa ilość przeciwciał, które są skierowane przeciwko różnym epitopom antygenu błonowego.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna dodatkowo zawiera także co najmniej jeden adiuwant szczepionkowy.

Korzystniej kompozycja farmaceutyczna dodatkowo zawiera także co najmniej jeden adiuwant szczepionkowy.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna jest odpowiednia do podawania przeciwciała w dawkowaniu w zakresie od 0,01 do 4 mg przeciwciała.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna jest odpowiednia do podawania poprzez wstrzyknięcie podskórne, śródskórne lub domięśniowe.

Zgodnie z wynalazkiem opracowano zastosowanie przeciwciał, które są skierowane przeciwko ludzkim antygenom błony komórkowej do wytwarzania farmaceutycznej kompozycji do profilaktycznego i/lub leczniczego szczepienia przeciwko nowotworowi. W tym kontekście termin antygeny błony komórkowej odnosi się do struktur, które są obecne na błonie komórkowej komórek. Obejmują one w szczególności receptory, takie jak receptor transferyny, lub inne cząsteczki, takie jak kadheryna E lub Ep-CAM.

Antygenem błony komórkowej może być antygen nowotworowy. W kontekście tym termin antygen nowotworowy oznacza strukturę, która jest przeważnie reprezentowana przez komórki nowotworowe a przez to pozwala na odróżnienie od tkanek niezłośliwych. Dogodnie taki antygen nowotworowy jest umiejscowiony na lub w błonie komórki nowotworowej. Oczywiście nie wyklucza to możliwości, że takie antygeny mogą także występować na niezdegenerowanych komórkach. Antygeny nowotworowe mogą być np. polipeptydami, w szczególności glikozylowanymi białkami, lub glikozylowanymi formami polipeptydów. Innymi strukturami, które mogą reprezentować antygeny nowotworowe są np. glikolipidy. Obejmują one np. gangliozydy, takie jak GM2. Co więcej antygeny nowotworowe mogą być reprezentowane przez zmiany w składzie lipidów błony komórkowej, które mogą być charakterystyczne dla komórek nowotworowych.

Przykładami antygenów nowotworowych są: N-CAM, antygen węglowodanowy Lewis Y, CEA i Ep-CAM, które został y wspomniane powyż ej. Innymi przykł adami są wę glowodan Sialyl TN, wę glowodan Globo H, gangliozydy takie jak: GD2/ GD3/ GM2, antygen specyficzny dla prostaty (ang. Prostate Specific Antigen (PSA)), CA 125, CA 19-9, CA 15-3, TAG-72, receptor EGF, receptor Her2/Neu, p 97, CD20 i CD21. Dostępne są przeciwciała monoklonalne przeciwko powyższym antygenom. Inne antygeny nowotworowe są opisane np. w DeVita i inni (Eds., Biological therapy of Cancer, wyd. 2, rozdz. 3 :Biology of Tumor Antigens, Lippincott Company, ISBN 0-397-51416-6 (1995)).

PL 201 533 B1

Termin przeciwciało odnosi się do wszelkiego rodzaju przeciwciał, w szczególności do poliklonalnych lub monoklonalnych przeciwciał a również do przeciwciał produkowanych chemicznie, biochemicznie lub przy użyciu metod genetycznych. Metody wytwarzania takich cząsteczek są dobrze znane osobom biegłym w dziedzinie. Sposób produkcji przeciwciał nie jest istotny. Ważne jest tylko specyficzność wiązania do odpowiedniego epitopu błony komórkowej antygenu. Korzystnie stosuje się przeciwciała monoklonalne, korzystniej przeciwciała monoklonalne pochodzenia zwierzęcego, a w szczególności pochodzące od myszy.

W szczególnoś ci preferowane do uż ycia jest monoklonalne przeciwciał o mysie HE-2, które może być wytwarzane jak to opisano lub przeciwciało, które posiada taką samą specyficzność wiążącą jak HE2. W ramach prezentowanego wynalazku termin przeciwciało obejmuje także fragmenty lub pochodne przeciwciał, które rozpoznają TAA. Terapeutycznie skuteczna odpowiedź immunologiczna, która indukowana jest przez szczepionkę z odpowiednimi przeciwciałami przeciwko TAA jest określona przez regiony wiążące tych przeciwciał, tj. przez ich idiotypy. Tak więc do pomyślnego szczepienia jest także możliwe, co do zasady, zastosowanie, zamiast całych przeciwciał, fragmentów lub pochodnych tych przeciwciał, pod warunkiem, że te pochodne będą posiadać idiotyp odpowiedniego startowego przeciwciała.

Dla przykładu, ale nie ograniczając się do nich, można wymienić: fragmenty F(ab)'2, fragmenty F (ab)', fragmenty Fv, które mogą być produkowane zarówno przy uż yciu znanych metod biochemicznych (trawienia enzymatycznego), jak również znanych metod biologii molekularnej. Innymi przykładami są pochodne przeciwciał, które mogą być wytwarzane przy użyciu znanych metod chemicznych, biochemicznych i genetycznych.

W kontekś cie tym termin pochodne w szczególności obejmuje produkty, które mogą być wytworzone przez chemiczne wiązanie przeciwciał (fragmentów przeciwciał) z cząsteczkami, które mogą wzmocnić odpowiedź immunologiczną, takimi jak: toksoid tężca, egzotoksyna Pseudomonas, pochodne Lipidu A, GM-CSF, IL-2 albo przez chemiczne wiązanie przeciwciał (fragmentów przeciwciał) z lipidami dla lepszego wprowadzenia do kompozycji liposomalnej.

Termin pochodne zawiera także białka fuzyjne przeciwciał (fragmentów przeciwciał), które zostały wytworzone przy pomocy metod inżynierii genetycznej, z polipeptydami, które mogą zwiększyć odpowiedź immunologiczną, takimi jak GM-CSF, IL-2, IL-12, C3d itd. Zgodnie z wynalazkiem przeciwciała mogą być stosowane we wzajemnym połączeniu. Co oznacza że, dwa lub więcej przeciwciała, które rozpoznają różne antygeny błonowe lub różne epitopy tego samego antygenu błonowego mogą być podane pacjentowi. Różne przeciwciała mogą być podane równocześnie (razem lub osobno) lub po sobie. Komórki nowotworowe często eksprymują kilka TAA w tym samym czasie, przeciwko którym odpowiednie do szczepienia przeciwciała są dostępne lub mogą być wytworzone. W celu uzyskania nasilonego lub ewentualnie synergistycznego efektu indukowanej odpowiedzi immunologicznej, a także aby zminimalizować potencjalne niebezpieczeństwo selekcji odmian antygenowo- negatywnych i aby przeciwdziałać możliwej heterogenności komórek nowotworowych zalecane może być zastosowanie do szczepienia kombinacji dwóch lub większej ilości odpowiednich przeciwciał lub ich fragmentów lub pochodnych równocześnie.

W kontekś cie niniejszego wynalazku termin szczepienie oznacza aktywną immunizację , tj. indukcję specyficznej odpowiedzi immunologicznej w wyniku podania (np. podskórnie, doskórnie, domięśniowo, możliwie także doustnie, przez nos) małej ilości antygenu (substancji, która jest rozpoznawana przez zaszczepioną osobę jako obca a przez to immunogenna) w odpowiedniej kompozycji immunogennej. Antygen jest więc użyty jako wyzwalacz dla układu immunologicznego w celu wytworzenia specyficznej odpowiedzi immunologicznej przeciwko antygenowi. W zasadzie, wymagane ilości antygenu mogą być bardzo małe (niektóre szczepionki zawierają tylko około 5-10 μg antygenu na dawkę szczepienia).

W aktywnej immunizacji charakterystyczna jest krzywa efektu od dawki która, w szerokim zakresie, zależy w niewielkim stopniu od ilości podanego antygenu. Oznacza to, iż odpowiedź immunologiczna jest mniej więcej identyczna w szerokim zakresie dawek. W konsekwencji czego, w przypadku szczepienia, pożądany efekt, tj. indukcja odpowiedzi immunologicznej, może być osiągnięty bardzo niewielkimi ilościami antygenu. Jednakże może być on także osiągnięty w porównywalny sposób przy pomocy znacząco większej ilości antygenu. Oczywiście pożądane jest stosowanie jak najmniejszej możliwej dawki, mając na uwadze w szczególności efekty uboczne, koszty materiałów itp., które są ważne w przypadku szczepienia.

PL 201 533 B1

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem szczepienie może być przeprowadzone w celu terapeutycznym jaki i profilaktycznym (jak w przypadku wszystkich szczepionek antydrobnoustrojowych). Oznacza to, iż szczepienie przeciwnowotworowe zgodne z niniejszym wynalazkiem może mieć zastosowanie zarówno profilaktyczne jak i terapeutyczne. W związku z tym można otrzymać opcjonalnie profilaktyczne zabezpieczenie przed wystąpieniem choroby nowotworowej przez szczepienie osobnika, który nie ma nowotworu. Osobami, którym mogą być podane takie szczepionki są osoby, które wykazują wyższe ryzyko rozwoju choroby nowotworowej, chociaż takie zastosowanie nie jest ograniczone tylko do takich osób.

Zastosowanie według niniejszego wynalazku różni się zasadniczo od innych podstawowych możliwych terapeutycznych zastosowań przeciwciał w leczeniu nowotworu przy pomocy metod znanych dotychczas i opisanych wcześniej, i pozwala na nieoczekiwanie skuteczne leczenie.

Region wiążący przeciwciała przeciwko TAA może przedstawiać strukturalnie komplementarny obraz epitopu wiążącego odpowiedniego TAA zgodnie z zasadą zamka i klucza. Oznacza to, że takie przeciwciało w swym idiotypie posiada strukturalną informację o epitopie TAA, przeciwko któremu jest skierowane. Tak więc jeśli pacjent jest zaszczepiony odpowiednim immunogennym przeciwciałem przeciwko TAA (tj. np. mysim MAB przeciwko TAA), są u pacjenta wytwarzane przeciwciała, które częściowo są skierowane przeciwko idiotypowi przeciwciała użytego jako szczepionka i które mogą strukturalnie naśladować epitop TAA zgodnie z zasadą klucza i zamka. Oznacza to, że z powodu takiego szczepienia u pacjentów z nowotworem są wytwarzane rozpuszczalne odmiany epitopu TAA, które mogą być skuteczne jako aktywne indukowane przeciwciała autologiczne przez długi okres czasu i miano, których może być zwiększane w odpowiednich odstępach czasowych przez ponowne szczepienia.

W zalecanym wykonaniu ludzki antygen błony komórkowej jest strukturą, która odgrywa rolę w procesach adhezji. W kontekś cie tym procesy adhezji są dogodnie oddział ywaniami komórkakomórka, gdzie są wykorzystywane ligandy lub receptory na powierzchni komórki. Zatem, cząsteczkami adhezyjnymi są ligandy lub receptory na powierzchni komórki, które pełnią funkcję w oddziaływaniach komórka-komórka. Podgrupą takich cząsteczek adhezyjnych są cząsteczki samo-adhezyjne. Posiadają one zdolność do wzajemnego wiązania się.

Fizjologiczny skutek odpowiedzi immunologicznej indukowanej przez szczepienia przeciwciałami przeciwko TAA zależy od funkcji odpowiednich TAA. Jeśli np. TAA pełnią funkcję receptora adhezji komórek nowotworowych, w szczególności liganda na komórkach nabłonkowych układu naczyniowego (taka właściwość jest ważna do zdolności rozpowszechniania się komórek nowotworowych na zewnątrz układu naczyniowego i osiadania w tkankach w celu wytworzenia przerzutu), to zdolność adhezji jest redukowana przez szczepienie odpowiednim przeciwciałem przeciwko temu TAA, ponieważ indukuje przeciwciała, które będą współzawodniczyć o oddziaływanie TAA z jego ligandem, gdyż udają one TAA w jego formie rozpuszczalnej, przez co będą stale obecne w krążeniu i tkankach.

Ogólnie uważa się, iż możliwe jest, zgodnie z wyjaśnieniem podanym powyżej, spowodowanie przez szczepienie odpowiednimi przeciwciałami przeciwko TAA, które wpływają na złośliwość komórek nowotworowych, że indukowana odpowiedź immunologiczna będzie zaburzać funkcję TAA w oddziaływaniu z jego ligandami i utrudniać lub zapobiegać temu oddziaływaniu. Oznacza to, że komórki nowotworowe nie mogą lub nie wystarczająco wyrażają właściwości, które są istotne dla fenotypu złośliwego, co stwarza możliwość zwolnienia lub zatrzymania rozwoju choroby i stłumienia rozwoju przerzutów, w szczególności w początkowym stadium.

W innym zalecanym wykonaniu antygen bł ony komórkowej jest zdolny do samo-adhezji, tj. pewne epitopy antygenu są odpowiedzialne za homofilne wiązanie do tego samego antygenu na innej komórce. Przykładami takich antygenów są, między innymi, N-CAM (cząsteczka adhezji komórki neuronowej, ang. Neuronal Cellular Adhesion Molecule), CEA (antygen karcynoembrionalny, ang. Carcino Embryonic Antigen) oraz Ep-CAM (cząsteczka adhezyjna komórki nabłonkowej, ang. Epithelial Cell Adhesion Molecule).

Przeciwciała skierowane przeciwko epitopom samo-adhezyjnych C antygenów, które są zaangażowane w tę funkcję, mogą jak to opisano powyżej, zawierać strukturalną informację komplementarną do takiego epitopu. Przez zaszczepienie takimi przeciwciałami jest możliwe, jak to opisano powyżej, indukowanie tworzenia przeciwciał, które mają zdolność samo-adhezji w reakcji wiązania. Oznacza to, iż takie indukowane przeciwciała, mogą, po kolei, wiązać się do samo-adhezyjnego antygenu, ponieważ w takim przypadku receptor oraz ligand są identyczne. Tak więc możliwe jest indukowanie odpowiedzi immunologicznej poprzez szczepienie pacjentów z nowotworem przy użyciu odpowiednich przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom samo-adhezyjnym, przy czym wspomniana

PL 201 533 B1 odpowiedź immunologiczna bezpośrednio wiąże komórki nowotworowe a przez to wyzwala różne skutki terapeutyczne. Z jednej strony zdolność do samo-adhezji, która jest istotna dla komórek złośliwych, jest blokowana, z drugiej strony, funkcje ludzkiego efektora takie jak liza zależna od dopełniacza i/lub liza spowodowana aktywacją efektorowych komórek cytotoksycznych może być wyzwolona przez wiązanie indukowanych przeciwciał do komórek nowotworowych, co doprowadza do zniszczenia komórek nowotworowych.

Dzięki zastosowaniu szczepienia pacjentów z nowotworem odpowiednimi przeciwciałami przeciwko TAA poprzez wszystkie powyżej wspomniane mechanizmy i efekty może być stłumione tworzenie nowych przerzutów a rozwój choroby może być co najmniej zwolniony. W początkowych stadiach choroby, np. po pomyślnej operacji pierwotnego guza (efekt adiuwantu), pozostałe rozsiane komórki nowotworowe są zabezpieczone przed możliwością wytworzenia przerzutów z powodu takich szczepionek. Pozwala to na wydłużenie okresu wolnego od nawrotów a więc długości życia takich pacjentów. Ewentualnie można uzyskać ochronę na całe życie przeciwko tworzeniu przerzutów dzięki szczepionkom oraz szczepionkom wzmacniającym, które są wykonywane w odpowiednich przedziałach czasowych. W szczególności dotyczy to szczepień pacjentów z nowotworem, odpowiednimi przeciwciałami skierowanymi przeciwko samo-adhezyjnym TAA, ponieważ w tych przypadkach, jak to opisano powyżej, można otrzymać nasilony efekt terapeutyczny dzięki dodatkowemu bezpośredniemu atakowi indukowanej odpowiedzi immunologicznej na komórki nowotworowe.

W kolejnych zalecanych wykonaniach kompozycja farmaceutyczna wytworzona zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku zawiera oprócz przeciwciał co najmniej jeden adiuwant powszechnie używany w kompozycjach szczepionek. Dzięki takim adiuwantom można wzmacniać odpowiedź immunologiczną. Przykładami adiuwantów są, bez ograniczania się jedynie do nich: wodorotlenek glinu (Alu żel), pochodne lipopolisacharydów, Bacillus Calmette Guerin (BCG), preparaty liposomowe, kompozycje z dodatkowymi antygenami, przeciwko którym układ immunologiczny wytworzył już silną odpowiedź immunologiczną, taki jak np. toksoid tężca, egzotoksyna Pseudomonas, lub składniki wirusa grypy ewentualnie w preparacie liposomowym, adiuwanty biologiczne takie jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (Granulocyte Macrophage Stimulating Factor (GM-CSF)), interleukina 2 (IL-2) lub interferon gamma (IFNy).

W innym zalecanym wykonaniu kompozycja farmaceutyczna wytworzona zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest odpowiednia do podania do szczepienia w dawce od 0,01 do 4 mg przeciwciała, korzystnie 0,5 mg.

Szczepienie może być przeprowadzone przez pojedyncze podanie powyżej wspomnianej dawki. Jednakże zalecane szczepienie jest przeprowadzane przez podawanie powtarzane. Ilość powtórek waha się od 1 do 12 na rok, korzystniej od 4 do 8 na rok. Dawka może pozostać ta sama lub może zostać zmniejszona.

Szczepienia wzmacniające mogą być przeprowadzane w regularnych odstępach czasu, w zasadzie przez całe życie. Odpowiednie przedziały czasowe wahają się od 6 do 24 miesięcy i mogą być określone przez monitorowanie miana indukowanych przeciwciał (szczepienia wzmacniające powinny być przeprowadzone od razu po znaczącym spadku miana indukowanych przeciwciał).

Podawanie przeciwciała może być przeprowadzone zgodnie z metodami znanymi osobom biegłym w dziedzinie. Korzystnie jeśli kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało jest odpowiednia do podawania doskórnego, podskórnego, domięśniowego.

Kompozycja farmaceutyczna wytworzona zgodnie z zastosowaniem według wynalazku znajduje zastosowanie w szczepieniu przeciwko chorobom nowotworowym jak również w leczeniu chorób nowotworowych przez szczepienie, gdzie jedno lub większa ilość przeciwciał, które rozpoznają TAA jest podawana pacjentowi w ilości odpowiedniej do szczepienia. Definicje oraz preferowane wykonania wynalazku są zgodne z powyższym opisem odnośnie zastosowania według niniejszego wynalazku.

Zastosowanie przeciwciał przeciwko TAA lub ich pochodnych lub fragmentów jako szczepionek zasadniczo różni się od znanych zastosowań takich anty-TAA przeciwciał w immunoterapii biernej. Niektóre zasadnicze zalety zastosowania według wynalazku w porównaniu do immunoterapii biernej zostały przedstawione poniżej:

Przeciwciała skierowane przeciwko TAA dla biernej immunoterapii nowotworu:

- wysoka dawka (> 100 mg/ wlew dożylny)

- krótki efekt spowodowany eliminacją czynników aktywnych

- przeciwciała ksenogeniczne niepożądane z powodu immunogenności

PL 201 533 B1

- ograniczony czas immunoterapii, w szczególności w przypadku przeciwciał ksenogenicznych, z powodu indukcji odpowiedzi immunologicznej i niebezpieczeństwa reakcji anafilaktycznych powodowanych w przypadku powtarzanego podawania.

Przeciwciała skierowane przeciwko TAA do profilaktycznego i/lub terapeutycznego szczepienia przeciwko nowotworowi:

- mał a dawka (<1 mg/ szczepienie: zastrzyk podskórny, doskórny lub domięśniowy)

- dł ugotrwał y efekt bezpoś rednio indukowanej odpowiedzi immunologicznej

- przeciwciała ksenogeniczne pożądane ponieważ skutek bazuje na immunogenności

- nieograniczone trwanie leczenia (szczepionki wzmacniające są zawsze możliwe do wykonania)

Poniżej zostaną opisane eksperymenty, które pokazują, że szczepienia pewnym mysim MAB (HE2), który jest skierowany przeciwko samo-adhezyjnym TAA Ep-CAM, lub szczepienie jego fragmentami F(ab)'2 bezpośrednio prowadzą do indukcji przeciwciał, które selektywnie wiążą się na ludzkich komórkach nowotworowych eksprymujących ten antygen. Przykład ten pokazuje, ale nie ograniczając się jedynie do niego, iż odpowiedź immunologiczna, która może wywierać efekt terapeutyczny przy chorobach nowotworowych, jest indukowana przez szczepienie odpowiednimi przeciwciałami skierowanymi bezpośrednio przeciwko samo-adhezyjnym TAA lub ich pochodnym, co najmniej zawierającymi idiotyp początkowego przeciwciała.

W tym celu wytworzono monoklonalne przeciwciał o mysie HE2 zgodnie z opisanymi wcześ niej standardowymi procedurami techniki hybrydoma (zobacz, np. H.Zola. Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press, Inc. ISBN 0-8493-6476-0;1988). Myszy Balb/c zostały immunizowane ludzkimi komórkami nowotworu jelita grubego zgodnie ze standardowym postępowaniem. Komórki śledziony zostały poddane fuzji z mysią linią czerniaka P3X63Ag8 a hybrydomy były selekcjonowane na podstawie produkcji przeciwciał, które selektywnie wiążą się do ludzkich komórek raka jelita grubego, ale nie do komórek czerniaka. Ostatecznie selekcjonowano hybrydy wydzielające przeciwciała IgG2a/kappa. Przeciwciała te (HE2) wiążą się do Ep-CAM co może być pokazane na przykład za pomocą analizy Western Blot przy użyciu komórek KATO III raka żołądka stosując znane przeciwciała anty-Ep-CAM (KS1-4) jako porównanie.

Sekwencje aminokwasowe zmiennych regionów MAB HE2 wyglądają następująco:

Łańcuch ciężki:

QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEK FKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARDGPWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 1)

Łańcuch lekki:

NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENWTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFT GSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 2)

Figury przedstawiają:

Figura 1 pokazuje inhibicję samo-adhezji linii komórek drobnokomórkowego raka płuc SW2 przez MAB HE2 in vitro.

Figura 2 pokazuje samo-adhezje linii ludzkich komórek drobnokomórkowego raka płuc SW2 bez wpływu MAB HE2 in vitro jako kontrolę do eksperymentu pokazanego na Figurze 1.

Figura 3 pokazuje indukcję odpowiedzi immunologicznej w postaci przeciwciał przeciw HE2 po szczepieniu kóz fragmentami F(ab)'2 HE2 jak określono w teście ELISA.

Figura 4 pokazuje indukcję odpowiedzi immunologicznej w postaci przeciwciał przeciwko EpCAM pozytywnym ludzkim komórkom raka żołądka (Kato III) po szczepieniu kóz fragmentami F(ab)'2 HE2 jak określono w teście cell-ELISA.

Figura 5 pokazuje brak odpowiedzi immunologicznej w postaci przeciwciał przeciwko Ep-CAM negatywnym komórkom ludzkiego czerniaka (WM9) po szczepieniu kóz fragmentami F(ab)'2 HE2 jak oznaczono w teście E1ISA, który został przeprowadzony jako kontrola do eksperymentu pokazanego na Figurze 4.

Figura 6 pokazuje wiązanie oczyszczonej przez powinowactwo frakcji przeciwciał otrzymanych z surowicy kóz, które były szczepione fragmentami F(ab)'2 HE2, do Ep-CAM pozytywnych ludzkich komórek raka żołądka (Kato III) jak określono to w teście cell- ELISA.

Figura 7 pokazuje brak wiązania oczyszczonej przez powinowactwo frakcji przeciwciał z surowicy kóz, które szczepiono fragmentem F(ab)'2 HE2, do Ep-CAM negatywnych ludzkich komórek czerniaka (WM9) jak to określono w teście cell-ELISA, który został przeprowadzony jako kontrola eksperymentu pokazanego na Figurze 6.

PL 201 533 B1

Figura 8 pokazuje indukcję odpowiedzi immunologicznej w postaci przeciwciał przeciwko HE2 po zaszczepieniu małp rezus 0,5 mg HE2 adsorbowanym na wodorotlenku glinu jako to określono przy pomocy testu ELISA.

Figura 9 pokazuje indukcję odpowiedzi immunologicznej w postaci przeciwciał przeciwko Ep-CAM pozytywnym ludzkim komórkom raka żołądka (Kato III) po zaszczepieniu małp rezus 0,5 mg HE2 adsorbowanymi na wodorotlenku glinu jak to określono w teście cell-ELISA.

Figura 10 pokazuje indukcję odpowiedzi immunologicznej w postaci przeciwciał przeciwko HE2 oznaczonych w połączeniu z badaniami toksyczności z małpami rezus po zaszczepieniu jednej grupy małp rezus 0,5 mg HE2 adsorbowanymi na wodorotlenku glinu jak również brak odpowiedzi immunologicznej przeciwko HE2 po leczeniu innej grupy małp rezus przy pomocy wodorotlenku glinu bez antygenu (placebo) jak to określono w teście cell-ELISA.

Figura 11 pokazuje przykładowo indukcję odpowiedzi immunologicznej w postaci przeciwciał przeciwko Ep-CAM pozytywnym ludzkim komórkom raka żołądka (Kato III) oznaczonych w związku z badaniami toksycznoś ci u mał p rezus z HE2 jak to okreś lono przy pomocy testu ELISA.

Figura 12 pokazuje indukcję odpowiedzi immunologicznej w postaci przeciwciał przeciwko EpCAM pozytywnym ludzkim komórkom raka żołądka (Kato III) po powtórzonym szczepieniu u pacjenta cierpiącego na raka jelita przy pomocy 0,5 mg HE2 adsorbowanego na wodorotlenku glinu jak określono to przy użyciu testu ELISA.

Figura 13 pokazuje indukcję cytotoksyczności w surowicy przeciwko Ep-CAM pozytywnym ludzkim komórkom raka żołądka (Kato III) po powtórnym szczepieniu pacjenta cierpiącego na raka jelit przy pomocy 0,5 mg HE2 adsorbowanego na wodorotlenku glinu jak to określono za pomocą eksperymentu lizy komórki.

Następujące poniżej przykłady służą jako ilustracja wynalazku, ale nie mają na celu jego ograniczania.

Aby pokazać, że mysie MAB HE2 wiąże się do epitopu samo-adhezyjnego antygenu Ep-CAM, który bierze udział w wiązaniu homofilnym badano wpływ HE2 na zdolność samo-adhezji linii ludzkich komórek SW2. Ta linia komórek drobnokomórkowego raka płuc miała utworzyć komórkowe klastry w hodowli in vitro po kilku godzinach od wcześniejszego posiania. Opis eksperymentu moż e być odnaleziony w przykładzie 1. Jak widać to na figurze 1 i 2, tworzenie dużych rozmiarów klastrów komórek jest uniemożliwione przez dodatek HE2. Fakt ten udowadnia, że HE2 wiąże się do epitopu Ep-CAM, który bierze udział w homofilnym wiązaniu tego białka błonowego.

W celu sprawdzenia bezpoś redniej immunologicznej odpowiedzi humoralnej na szczepienie fragmentem F(ab)'2 mysiego MAB HE2, kozy zostały immunizowane tym fragmentem. Fragment ten został przygotowany zgodnie z metodami, które są znane i opisane przy trawieniu HE2 pepsyną i następnie oczyszczony. Immunizacja kóz jest opisana w przykładzie 2.

Po pierwsze kozia immunosurowica, która została odzyskana oraz złożona, była badana w porównaniu z surowicą sprzed immunizacji dla immunoglobulin, które są skierowane bezpośrednio przeciwko MAB HE2 w celu określenia całkowitej odpowiedzi immunologicznej szczepionych kóz. Badania te były prowadzone przy pomocy testu ELISA, których eksperymentalny opis został zamieszczony w przykładzie 3. Wynik tego eksperymentu jest pokazany na Figurze 3: kozy, z powodu zaszczepienia fragmentem F(ab)'2 MAB HE2, wytworzyły silną odpowiedź immunologiczną, podczas gdy w surowicy sprzed immunizacji nie odnaleziono żadnych przeciwciał przeciwko HE2.

Następnie badano czy możliwe jest wykrycie immunoglobulin immunosurowicy koziej, które wiążą się do ludzkich komórek rakowych, które eksprymują TAA przeciwko którym skierowane jest MAB HE2 (Ep-CAM). W tym celu użyto linii komórkowej Kato III raka żołądka. Jako kontrolę testowano wiązania ludzkiej linii komórkowej, które nie eksprymują Ep-CAM (komórki czerniaka WM9).

Badania te były przeprowadzone przy pomocy testów ELISA, których opis został przedstawiony w przykł adzie 4. Wyniki są pokazane na figurze 4 i 5, immunosurowica kozia zawiera immunoglobuliny, które mocno wiążą się do Ep-CAM pozytywnych komórek KATO, podczas gdy nie można wykryć wiązania do Ep-CAM negatywnych komórek WM9. Surowica sprzed immunizacji nie zawiera przeciwciał, które wiążą się do tych komórek.

Ten bardzo zaskakujący wynik pokazuje, że przeciwciała wytworzone przez szczepionkę z fragmentami HE2-F(ab)'2 są naprawdę zdolne do wiązania się do komórek, które eksprymują TAA rozpoznawane przez HE2. W konsekwencji czego funkcja TAA do samo-adhezji powinna być przeniesiona na przeciwciała, które zostały wytworzone przez szczepienie HE2, jak to opisano wcześniej szczegółowo.

PL 201 533 B1

Aby udowodnić, że przeciwciała produkowane u kóz z powodu szczepienia fragmentem F(ab)'2 HE2 są skierowane przeciwko idiotypowi tego MAB są naprawdę tymi, które wiążą się do komórek KATO, to anty-idiotypowa część tych indukowanych przeciwciał została specyficznie oczyszczona z immunosurowicy kóz z pomocą sekwencji chromatografii powinowactwa jak to opisano (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 216). Sekwencja etapów oczyszczania jest podsumowana w przykładzie 5.

Oczyszczone przez powinowactwo przeciwciała zostały ponownie zbadane na ich wiązanie z Ep-CAM pozytywnymi komórkami KATO jak również z Ep-CAM negatywnymi komórkami WM9. Opis eksperymentu jest podany w przykładzie 6. Wynik tego eksperymentu jest podany na figurze 6 i 7: kozia IgG, która jest skierowana przeciwko idiotypowi HE2, łączy się z Ep-CAM pozytywnymi komórkami KATO, podczas gdy niespecyficzna kozia IgG wiąże się z trudnością. Jednakże wiązanie oczyszczonej przez powinowactwo specyficznej koziej IgG do Ep-CAM negatywnych komórek WM9 nie różni się od wiązania niespecyficznej koziej IgG. Tak więc udowodniono, że frakcje przeciwciał, które powstały bezpośrednio z powodu szczepienia fragmentem F(ab)'2 HE2 i które są skierowane przeciwko idiotypowi tego przeciwciała, zawierają przeciwciała, które wiążą się do komórek nowotworowych, które eksprymują TAA rozpoznawane przez HE2.

Przy pomocy tego eksperymentu jest także niezbicie pokazane, że przeciwciała przeciwko Ep-CAM pozytywnym komórkom indukowanym przez szczepienie HE2 nie są wynikiem podwójnie autologicznej idiotypowej sieci kaskadowej jak twierdzono w kilku publikacjach (zobacz np. Cancer Immunol. Immunother. 42 (1996), 81-87), gdyż takie anty-idiotypowe przeciwciała (Ab3) nie mogą w ogóle być oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa na kolumnie Ab1 (=HE2) ponieważ zgodnie z idiotypową siecią nie mogą one wiązać do Ab1 ale tylko do Ab2.

Zważywszy na powyżej opisane wyniki immunizacji kóz fragmentem F(ab)'2 HE2, badania szczepionki zostały także przeprowadzone na małpach rezus w celu potwierdzenia immunologicznych wyników na gatunkach blisko spokrewnionych z człowiekiem. Do tych eksperymentów użyto całkowity mysi MAB HE2 jako immunogen. Założono, że część mysiego Fc jako dużego ksenogenicznego białka także może zwiększyć odpowiedź immunologiczną przeciwko idiotypowi (efekt nośnika). W celu uniknięcia ewentualnych miejscowych efektów ubocznych, użyto wodorotlenku glinu jako łagodnego adiuwanta. Przygotowanie kompozycji dla tej szczepionki zostało przeprowadzone w eksperymencie opisanym w przykładzie 7.

Kompozycja opisana w przykładzie 7 została wstrzyknięta podskórnie w plecy czterech małp rezus (0,5 mg HE2= 0,5 ml na szczepionkę, podawano dwa razy w przedziałach cztero tygodniowych). Dla odzyskania surowicy krew była pobierana kilka razy.

Na początku odpowiedź immunologiczna przeciwko HE2 była określona na teście ELISA. Opis eksperymentu jest podany w przykładzie 8. Jak pokazano na figurze 8, znaczące miana przeciwciał przeciwko HE2 można zmierzyć już w 29 dniu.

Następnie zbadano czy przez szczepienie indukowane są przeciwciała, które wiążą się z komórkami KATO III. W testach tych użyto testu cell-ELISA. Opis eksperymentu jest podany w przykładzie 9. Jak pokazano na figurze 9, przeciwciała, które łączą się z Ep-CAM pozytywnymi komórkami nowotworowymi Kato III są już indukowane w dniu 29 u wszystkich zwierząt.

Następnie cztery zwierzęta zaszczepiono HE2 adsorbowanym na wodorotlenku glinu i badano toksyczność u małp rezus. Cztery inne małpy otrzymały wodorotlenek glinu jako placebo. Przygotowanie kompozycji jest opisane w przykładzie 10 i 11. W sumie małpy rezus były szczepione podskórnie w plecy cztery razy 0,5 ml odpowiedniej kompozycji (czynnik aktywny lub placebo) (dni 1,15,29 i 57). Dla odzyskania surowicy krew została pobrana przed badaniami w różnych czasach podczas leczenia.

Ponownie odpowiedź immunologiczna przeciwko HE2 była z początku określona przy użyciu testu ELISA. Opis eksperymentu jest podany w przykładzie 8. Jak pokazano na figurze 10, wszystkie cztery małpy rezus grupy HE2 wytworzyły znaczącą humoralną odpowiedź immunologiczną przeciwko HE2 już po pierwszym szczepieniu, która była następnie podnoszona przez drugie szczepienie, podczas gdy małpy rezus grupy placebo nie pokazały żadnego wzrostu w mianie przeciwciał przeciwko HE2.

Badania te były następnie potwierdzone przez oczyszczanie immunopowinowacyjne surowic z dnia 43 małp rezus grupy HE2. Opis eksperymentu jest przedstawiony w przykładzie 12. Jak pokazano w następującej tabeli wszystkie cztery małpy wytworzyły silną odpowiedź immunologiczną IgG przeciwko HE2 (drugorzędna odpowiedź immunologiczna) w ich surowicy w dniu 43, podczas gdy ilość IgM jest porównywalna do tej z surowicy sprzed immunizacji.

PL 201 533 B1

małpa	dzień	μg/ml IgM przeciwnych	μg/ml IgM przeciwnych
9206m	-14	7,7	2,8
	43	16,3	135,2
9599m	-14	17,9	2,5
	43	25,4	449,3
8415f	-14	16,0	3,2
	43	22,5	159,9
9139f	-14	5,3	5,0
	43	10,3	69,8

Sprawdzono również indukcję przeciwciał przeciwko Ep-CAM pozytywnym komórkom Kato III. Ponownie użyto testu ELISA. Opis eksperymentu jest podany w przykładzie 9. Jak pokazano przykładowo na figurze 11 małpy rezus grupy HE2 wytworzyły przeciwciała przeciwko komórkom Kato III już w dniu 29.

Zważywszy na wyżej opisane wyniki szczepienia kóz i małp rezus, zaszczepiono pacjenta cierpiącego na raka jelita z przerzutami (Dukes D) MAB HE2, adsorbowanymi do wodorotlenku glinu. Przygotowanie kompozycji jest opisane w przykładzie 7. Ostatecznie pacjent był szczepiony cztery razy (dzień 1,50,78,114) podskórnie w górne kończyny 0,5 ml powyższej kompozycji (odpowiadającej 0,5 mg HE2). Krew została pobrana do odzyskania surowicy przed każdym szczepieniem i w dniu 128. Najpierw zbadano czy przez szczepienie indukowane są przeciwciała, które łączą się z komórkami KATO III. Następnie zastosowano test cell-ELISA. Opis eksperymentu jest podany w przykładzie 9. Wyniki tych eksperymentów są pokazane na figurze 12. Szczepienie to indukuje u tego pacjenta z rakiem oczywiście wysokie miano przeciwciał, które łączą się z komórkami KATO III.

Co więcej badano czy przeciwciała indukowane przez szczepienie HE2 pośredniczą w efekcie cytotoksycznym przeciwko KATO III komórkom rakowym ex vivo. W tym celu komórki KATO III zostały inkubowane z surowicą sprzed szczepienia i immunosurowicą wspomnianego pacjenta z nowotworem, w celu przedstawienia zależnej od dopełniacza lizy pośredniczonej indukowanymi przeciwciałami. Opis eksperymentu jest podany w przykładzie 13.

Wyniki są pokazane na figurze 13. Przeciwciała indukowane przez szczepionkę HE2 są często zdolne do zniszczenia Ep-CAM pozytywnych komórek KATO III przez zależną od dopełniacza lizę autologicznej surowicy pacjenta.

Wyżej opisane eksperymenty pokazują, że szczepienie z odpowiednimi przeciwciałami przeciwko samo-adhezyjnym TAA, takim jak Ep-CAM, lub przeciwko ich pochodnym z tym samym idiotypem jak odpowiednie przeciwciała początkowe, wyzwala humoralną odpowiedź immunologiczną, która selektywnie łączy komórki nowotworowe, które eksprymują samo-adhezyjne TAA. Indukowane przeciwciała mogą wykazywać potencjalną cytotoksyczność przeciwko takim komórkom nowotworowym. Szczepienie takimi przeciwciałami może zatem doprowadzać do terapeutycznych skutków w chorobach nowotworowych.

P r z y k ł a d y

Użyte materiały:

Płytki do mikromiareczkowania: Immuno Plate F96 MaxiSorp (Nunc) for ELISA, Cell Culture Cluster (Costar; Cat. Nr. 3598) do testu cell-ELISA.

linie komórek:

SW2 linia ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc, Ep-CAM pozytywna;

KATO III: ludzka linia komórek raka żołądka, Ep-CAM pozytywna (ATCC HTB 103);

WM 9: ludzka linia komórek czerniaka, Ep-CAM negatywna

Bufor sprzęgający: 0,1 M NaHCO3

0,5 M NaCl pH 8

Bufor oczyszczający A: PBS niepełny 0,2 M NaCl pH 7,2

Bufor oczyszczający B: 0,1 M glicyny/ HCl 0,2M NaCl pH 2,9

PL 201 533 B1

Podłoże A:

Bufor wiążący:

Niepełny PBS:

RPMI 1640 + 2g/l NaHCO3

100 U/ml penicyliny G

100 μg/ ml siarczanu streptomycyny 4 mM glutaminy 10% płodowa surowica cielęca (dezaktywowana cieplnie) mM Na2CO3 35 mM NaHCO3

Roztwór utrwalający: Bufor myjący A:

Bufor myjący B: Bufor blokujący A:

Bufor blokujący B: Bufor rozcieńczający A:

Bufor rozcieńczający B: Bufor barwiący:

mM NaN3 pH 9,6

138 mM NaCl

1.5 mM KH2PO4

2,7 mM KCl

6.5 mM NaHPO4 pH 7,2

0,1 glutardialdehydu w fizjologicznym roztworze NaCl

2% NaCl

0,2% Triton X-100 w niepełnym PBS

0,05% Tween 20 w niepełnym PBS 5% płodowa surowica cielęca (dezaktywowana cieplnie) w niepełnym PBS

1% albumina surowicy wołowej 0,1% NaN3 w niepełnym PBS 2% płodowa surowica cielęca (dezaktywowana cieplnie) w niepełnym PBS niepe łny PBS

24.3 mM kwas cytrynowy

51.4 mM Na2HPO4 pH 5 mg o-fenylenodiaminodihydrochlorku 100 ml buforu barwiącego

4N H2SO4

Substrat:

Roztwór kończący:

P r z y k ł a d 1:

Komórki SW2 hodowane in vitro zostały odwirowane, a osad rozpuszczono w podłożu A i ustalono stężenie do 7x 10⁴ komórek/ml. W studzienkach LabTek zmieszano 0,1 ml niepełnego PBS z 0,3 ml roztworu komórek lub 0,1 ml niepełnego PBS zmieszano z 40 μg HE2 a następnie z 0,3 ml roztworu komórek (końcowe stężenie HE2 to 100 μg/ ml). Bezpośrednio przed dodaniem zawiesiny komórek jako ostatniego składnika, komórki były oddzielane pipetą. Bezpośrednio po zmieszaniu odpowiednie roztwory zawiesin są fotografowane na odwróconym mikroskopie (powiększenie 100 krotne). Następnie zawiesiny komórkowe są hodowane przez 4 godziny w temp. 37°C/ 5% CO2 a następnie fotografowane powtórnie.

P r z y k ł a d 2:

Każdą kozę zaszczepiono doskórnie w kilku miejscach 1,5 mg fragmentów F(ab)'2 w 3 ml niepełnego PBS wraz z 3 ml kompletnego adiuwanta Freunda (ang. Freund's Complete Adjuvant (Difco)). W dniu 8 podano pierwszą szczepionkę wzmacniającą tak jak w dniu 1, jednakże z niekompletnym adiuwantem Freunda Incomplete Adjuvant (Difco). W dniu 29 podano drugą szczepionkę wzmacniającą w taki sam sposób. Jednakże nie podano adiuwanta. Krew pobrano przed pierwszą szczepionką oraz w 54 dniu w celu wzmocnienia surowicy tak, aby zbadać rozwój odpowiedzi immunologicznej.

P r z y k ł a d 3:

100 μl porcje MAB HE2 (roztwór 10 μg/ml w roztworze wiążącym) były inkubowane w studzienkach płytki do mikromiareczkowania przez 1 godzinę w temp. 37°C. Po przemyciu płytki buforem myjącym A sześć razy, dodano 200 μl buforu blokującego A do każdej ze studzienek a płytkę inkubowano przez 30 minut w 37°C. Po przemyciu płytki jak wyżej, 100 μl porcje do badań surowic kozich inku12

PL 201 533 B1 bowano w roztworach o rozcieńczeniach od 1:100 do 1:1000 000 w buforze rozcieńczającym A przez 1 godzinę w 37°C. Po przemyciu płytek jak to opisano powyżej, 100 μl skoniugowanej peroksydazy z króliczym przeciwciałem przeciwko koziej Ig (Zymed) zostało dodane do każdej studzienki w stężeniu 1:1000 w roztworze rozcieńczającym A i inkubowane przez 30 minut w 37°C. Płytki następnie zmyto buforem myjącym A 4 razy i dwa razy buforem barwiącym. Wiązanie przeciwciał wykryto przez dodanie 100 μl specyficznego substratu do każdej studzienki a reakcja barwienia została zatrzymana po około 10 minutach przez dodanie 50 μl roztworu kończącego. Ocena jest przeprowadzana przez zmierzenie gęstości optycznej (OD) przy 490 nm (długość fali pomiaru referencyjnego wynosi 620 nm).

P r z y k ł a d 4:

Studzienki płytki do mikromiareczkowania inkubowano w temp. +4°C przez noc ze 100 μl zawiesiny komórkowej linii komórek, które mają zostać poddane badaniu w stężeniu 2x10⁶ komórek/ ml w podłożu A. Po odessaniu supernatantu płytki inkubowano z 50 μl roztworu utrwalającego na studzienkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po odessaniu supernatantu dodano 200 μl buforu blokującego B do każdej studzienki, a płytkę inkubowano przez 1 godzinę w 37°C w roztworze od 1:10 do 1:100 000 buforu rozcieńczającego B. Po dwukrotnym przemyciu płytek 200 μl buforu myjącego B, inkubowano 100 μl porcje koziej surowicy do zbadania, przez 1 godzinę, w 37°C, w buforze rozcieńczającym B o stężeniu od 1:10 do 1 :100 000. Po umyciu płytek dwukrotnie, 100 μl chłodzonego lodem buforu myjącego B, 100 μl koniugatu peroksydazy z przeciwciałem króliczym przeciwko koziej Ig (Zymed) dodano do buforu rozcieńczającego A o stężeniu 1:1000 i inkubowano przez 45 minut w temp. 37°C. Płytkę zmyto trzy razy 100 μl chłodzonego lodem buforu myjącego B. Wiązanie przeciwciał wykryto przez dodanie 100 μl specyficznego substratu do każdej studzienki, a reakcja barwienia została zatrzymana po około 10 minutach przez dodanie 50 μl roztworu kończącego. Ocena jest przeprowadzana przez zmierzenie gęstości optycznej (OD) przy 490 nm (długość fali pomiaru referencyjnego wynosi 620 nm).

P r z y k ł a d 5

Oczyszczanie jest opisane w Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:216, 1984 i podsumowane następująco: w pierwszym etapie oczyszczanie całości IgG zawartej w surowicy koziej jest przeprowadzone zgodnie ze znanymi metodami, przy użyciu anionowej kolumny wymiennej DEAE. Następnie przeciwciała kozie, które są skierowane przeciwko stałym regionom F(ab)'2 HE2 dodano do kolumny immunopowinowactwa (CH-Sepharose 4B, Pharmacia) na której była związana nieistotna mysia IgG2a, podczas gdy frakcja anty-idotypowa kozich przeciwciał nie łączyła się z kolumną. Zatem w ostatnim kroku eluat chromatografii immunopowinowactwa jest dodawany do kolumny immunopowinowactwa (CHSepharose 4B, Pharmacia) na której związano HE2. Frakcja specyficznie związana na tej kolumnie jest wymywana buforem o pH 2,8 (0,1 M glicyna/HCl) i zobojętniana. Kozia frakcja IgG uzyskana w ten sposób jest skierowana przeciwko idiotypowi HE2.

P r z y k ł a d 6

Test cell-ELISA zasadniczo przeprowadzono w ten sam sposób jak to opisano w przykładzie 4. Zamiast rozcieńczeń surowicy użyto odpowiednio kozią IgG oczyszczoną za pomocą immunopowinowactwa oraz niespecyficzną oczyszczoną kozią IgG o stężeniach od 100 μg/ml do 0,031 μg/ml odpowiednio.

P r z y k ł a d 7

Ostrożnie wstrząsano 0,83 ml roztworu Alu-Gel (Alu-Gel S Serva, 2% roztwór, o jakości: adiuwant do przygotowywania szczepionek) przez 1 godzinę w pokojowej temperaturze w warunkach sterylnych z 0,5 ml roztworu 10 mg/ml HE2 w PBS o pH 5,5 wraz z 3,67 ml niepełnego PBS (końcowe stężenie HE2: 1 mg/ml; Alu-Gel S: 0,33%). Następnie zawiesina została przelana do fiolek do wstrzyknięć w porcjach po 0,5 ml.

P r z y k ł a d 8

Test ELISA przeprowadzono w zasadzie w ten sam sposób jak to opisano w przykładzie 3 z wyjątkiem tego, że do wykrycia związanych przeciwciał małpy rezus użyto koniugatu peroksydazy z przeciwciałem kozim przeciwko ludzkiej Ig (Zymed). Przy użyciu tego reagentu przeciwciała małpy rezus mogą być wykrywane w ten sam sposób jak ludzkie przeciwciała, ponieważ homologia sekwencji stałych regionów ludzkich przeciwciał i przeciwciał małp rezus wynosi około 98%.

P r z y k ł a d 9

Test cell-ELISA przeprowadzono w ten sam sposób jak to opisano w przykładzie 4 z wyjątkiem tego, że do wykrycia przeciwciał małpy rezus (lub ludzkich przeciwciał), które są połączone z komórkami został użyty koniugat peroksydazy z przeciwciałem kozim przeciwko ludzkiej Ig (Zymed). Koniugat peroksydazy i przeciwciała koziego przeciwko mysiej IgG (Zymed) został użyty do wykrycia mysiego HE2 jako próba kontrolna.

PL 201 533 B1

P r z y k ł a d 10

3,5 ml roztworu HE2 (10 mg/ml w niepełnym PBS, pH=5,5) zostało zmieszane w warunkach sterylnych z 0,35 ml wodnego roztworu thimerosal (10 mg/ml; Sigma), jak również z 27,25 ml soli fizjologicznej i dodane do 3,9 ml roztworu wodorotlenku glinu (3% w wodzie, Alhydrogel, Superfos Biosector, Denmark) w warunkach spokojnego wstrząsania. 0,6 ml roztworu uzyskanego w ten sposób, jest następnie wtłaczane do szklanych probówek pozbawionych pirogenów w warunkach sterylnych, które są zamykane gumowym korkiem z aluminiową nakrętką.

P r z y k ł a d 11

Kompozycja placebo była przygotowana w ten sam sposób jak opisano w przykładzie 10 z wyjątkiem tego, że sól fizjologiczna NaCl była użyta zamiast roztworu przeciwciał a 3,5 ml niepełnego PBS o pH=5,5 użyto zamiast roztworu thimerosal.

P r z y k ł a d 12:

g CH-Sepharose 4B (Parmacia) zawieszano w 30 ml 1 mM HCl przez 15 minut. Nastę pnie ż el przemyto na filtrze ze spiekanego szkła AG3 jednym litrem 1 mM HCl a następnie 200 ml buforu sprzęgającego. 10 mg HE2 (stężenie wyjściowe 10 mg/ml) było dializowane z około 0,5 litra buforu sprzęgającego. Roztwór ten następnie zmieszano z roztworem żelu w oznaczonym naczyniu. Stosunek żel: bufor wynosi 1:2 i dostarcza roztworu zdolnego do sprzęgania. Roztwór był wstrząsany przez 5,5 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie nadmiar ligandu jest usuwany przez trzykrotne przemycie 30 ml buforu sprzęgającego. Pozostałe grupy reaktywne zablokowano przez 1 godzinną inkubację w temperaturze pokojowej z 1 M etanoloaminą. Żel następnie wstrząsano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 0,1 M buforem Tris-HCl o pH 8. Ostatecznie ż el przemyto trzykrotnymi cyklami buforów o zmiennym pH. Każdy cykl składał się z 0,1 M buforu z octanem sodu o pH 4 z 0,5 M NaCl, a następnie 0,1 M buforu tris-HCl o pH 8 z 0,5 M NaCl. Żel przechowywano w 4°C.

Oczyszczanie na podstawie immunopowinowactwa frakcji przeciwciał skierowanych przeciwko HE2 z surowicy małp rezus przeprowadzono zgodnie z poniższą instrukcją: oczyszczanie na podstawie immunopowinowactwa przeprowadzono na FPLC (Pharmacia). 1 ml żelu uzyskanego zgodnie z powyższą instrukcją wlano do kolumny Pharmacia HR5/5. 0,5 ml surowicy rozcieńczono w stosunku jak 1:10 przy pomocy buforu oczyszczającego A. Roztwór ten przepompowano przez kolumnę z szybkością 1 ml/ minutę i przemywano buforem oczyszczającym A dopóki detektor nie osiągnął ponownie linii bazowej UV (280 nm). Związane immunoglobuliny były następnie eluowane buforem oczyszczającym B, frakcja była natychmiast po desorpcji zobojętniana 0,5 M Na2HPO4 a następnie dodano NaN3. 50 μΐ frakcji przeciwciał otrzymanej w ten sposób analizowano na kolumnie do frakcjonowania ze względu na wielkość (SEC, Zorbax 250 GF) i policzono ilości IgG i IgM. Dla SEC jako eluent został użyty 220 mM bufor fosforanowy o pH 7 wraz z 10% acetonitrylem. Ludzka IgG i ludzka IgM służyły jako wzorce dla SEC, poprzez poddanie ich chromatografii w kilku stężeniach w celu wyznaczenia krzywej kalibracji (powierzchnia piku od stężenia). Obliczenie stężenia IgG i IgM we frakcjach przeciwciał od małp rezus oczyszczonych na zasadzie powinowactwa zostało przeprowadzone przy użyciu regresji liniowej stosując krzywe wzorcowe. Stężenia są przedstawione jako μg/ ml użytej surowicy małp.

P r z y k ł a d 13

Na dzień przed przeprowadzeniem testu komórki Kato III przeniesiono do świeżego podłoża A i trzymano w 37°C/ 5% CO2 w kolbie do hodowli komórkowej. Następnie komórki przemyto podłożem A i doprowadzono do stężenia 2,5 x 10⁵ komórek/ ml. 100 μl porcje roztworu komórek przeniesiono pipetą do studzienek płytki do mikromiareczkowania. 100 μl porcje surowicy pacjenta do badania dodano i inkubowano przez 3 godziny w 37°C/ 5% CO2 (surowicę przechowywano w 80°C i rozmrożono tylko raz do tych badań tak aby nie dopuścić do uszkodzenia aktywności dopełniacza). Supernatanty odzyskano przy użyciu Skatron-Harvesting-Press i mierzono za pomocą gamma- licznika. W wyniku czego uzyskano wartości dla eksperymentalnego uwalniania. W celu określenia całkowitego uwalniania, komórki traktowano jak to opisano powyżej, przy czym surowicę zastąpiono roztworem 2% SDS, 50 mM Na2CO3 i 10 mM EDTA. Wartości spontanicznego uwalniania uzyskano przez zamianę surowicy przez podłoże A. Wyniki przeliczano w następujący sposób:

eksperymentalne uwalnianie - spontaniczne uwalnianie % lizy = --------------------------------------------------------------------------całkowite uwalnianie - spontaniczne uwalnianie

Eksperyment przeprowadzono 3 razy a następnie przedstawiono wartości średnie oraz standardowe odchylenia pojedynczych wyników.

PL 201 533 B1

Wykaz sekwencji <110> IGENEON KREBS-IMMUNTHERAPIE FORSCHUNGS- UND ENTWICKLUNGS-AG <120> Zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciwko antygenowi błony komórkowej Ep-CAM <130> D 2923 PCT <140>

<141>

<160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> i <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1

Gin 1

Val

Gin

Leu

Gin 5

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Leu

Val

Arg

Pro

Gly 15

Thr

Ser

Val

Lys

Val 20

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser 25

Gly

Tyr

Ala

Phe

Thr 30

Asn

Tyr

Leu

Ile

Glu 35

Trp

Val

Lys

Gin

Arg 40

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Ile

Gly

Val 50

Ile

Asn

Pro

Gly

Ser 55

Gly

Gly

Thr

Asn

Tyr 60

Asn

Glu

Lys

Phe

Lys 65

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu 70

Thr

Ala

Asp

Lys

Ser 75

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr 80

Met

Gin

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Thr

Ser

Asp

Asp 90

Ser

Ala

Val

Tyr

Phe 95

Cys

Ala

Arg

Asp

Gly 100

Pro

Trp

Phe

Ala

Tyr 105

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr 110

Leu

val

Thr Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus

PL 201 533 B1 <400> 2

Asn 1

Ile

Val

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Lys

Ser 10

Met

Ser

Met

Ser

Val 15

Gly

Glu

Arg

Val

Thr 20

Leu

Thr

Cys

Lys

Ala 25

Ser

Glu

Asn

Val

Val 30

Thr

Tyr

Val

Ser

Trp 35

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro 40

Glu

Gin

Ser

Pro

Lys 45

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly 50

Ala

Ser

Asn

Arg

Tyr 55

Thr

Gly

Val

Pro

Asp 60

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser 65

Gly

Ser

Ala

Thr

Asp 70

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 75

Ser

Ser

Val

Gin

Ala Θ0

Glu

Asp

Leu

Ala

Asp 85

Tyr

His

Cys

Gly

Gin 90

Gly

Tyr

Ser

Tyr

Pro 95

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gly 100

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu 105

Ile

Lys

Zastrzeżenia patentowe

Claims (14)

1. Zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciwko antygenowi błony komórkowej Ep-CAM do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do czynnej immunizacji profilaktycznej i/lub terapeutycznej przeciwko nowotworowi.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest pochodzenia zwierzęcego.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.

4. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.

5. Zastosowanie wedł ug zastrz. 4, znamienne tym, ż e przeciwciał o jest mysim przeciwciał em monoklonalnym, przy czym region zmienny łańcucha ciężkiego ma sekwencję aminokwasową jak pokazano na SEQ ID NO:1, a region zmienny łańcucha lekkiego ma sekwencję aminokwasową jak pokazano na SEQ ID NO:2.

6. Zastosowanie wedł ug zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 5, znamienne tym, ż e stosowane są w połączeniu ze sobą dwa lub większa ilość przeciwciał, które są skierowane przeciwko różnym epitopom antygenu błonowego.

7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna dodatkowo zawiera także co najmniej jeden adiuwant szczepionkowy.

8. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, ż e kompozycja farmaceutyczna dodatkowo zawiera także co najmniej jeden adiuwant szczepionkowy.

9. Zastosowanie wedł ug zastrz. 1, znamienne tym, ż e kompozycja farmaceutyczna jest odpowiednia do podawania przeciwciała w dawkowaniu w zakresie od 0,01 do 4 mg przeciwciała.

10. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest odpowiednia do podawania przeciwciała w dawkowaniu w zakresie od 0,01 do 4 mg przeciwciała.

11. Zastosowanie według zastrz. 7 albo 8, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest odpowiednia do podawania przeciwciała w dawkowaniu w zakresie od 0,01 do 4 mg przeciwciała.

12. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest odpowiednia do podawania poprzez wstrzyknięcie podskórne, śródskórne lub domięśniowe.

13. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest odpowiednia do podawania poprzez wstrzyknięcie podskórne, śródskórne lub domięśniowe.

14. Zastosowanie według zastrz. 7 albo 8 albo 9, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest odpowiednia do podawania poprzez wstrzyknięcie podskórne, śródskórne lub domięśniowe.