NO329917B1 - Anvendelse av antistoffer for fremstilling av et farmasoytisk preparat mot cancer som uttrykker Ep-CAM - Google Patents
Anvendelse av antistoffer for fremstilling av et farmasoytisk preparat mot cancer som uttrykker Ep-CAM Download PDFInfo
- Publication number
- NO329917B1 NO329917B1 NO20013093A NO20013093A NO329917B1 NO 329917 B1 NO329917 B1 NO 329917B1 NO 20013093 A NO20013093 A NO 20013093A NO 20013093 A NO20013093 A NO 20013093A NO 329917 B1 NO329917 B1 NO 329917B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- antibody
- antibodies
- vaccination
- cam
- cells
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 60
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 41
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 title claims description 33
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 title claims description 33
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 8
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 78
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 21
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 14
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 11
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 claims 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 claims 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 26
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 82
- 102100028654 Sperm-associated antigen 11B Human genes 0.000 description 62
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 45
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 45
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 45
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 36
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 23
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 22
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 12
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 9
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 9
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 7
- -1 Lewis-Y carbohydrate Chemical class 0.000 description 6
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 102000012406 Carcinoembryonic Antigen Human genes 0.000 description 5
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 5
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 5
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- MXRIRQGCELJRSN-UHFFFAOYSA-N O.O.O.[Al] Chemical compound O.O.O.[Al] MXRIRQGCELJRSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 3
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 3
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032768 Complement receptor type 2 Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710190709 Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 2 Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000941929 Homo sapiens Complement receptor type 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100021852 Neuronal cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 101710130688 Neuronal cell adhesion molecule Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710100968 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100026145 Transitional endoplasmic reticulum ATPase Human genes 0.000 description 1
- 101710132062 Transitional endoplasmic reticulum ATPase Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- SRHNADOZAAWYLV-XLMUYGLTSA-N alpha-L-Fucp-(1->2)-beta-D-Galp-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](NC(C)=O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)O[C@H]2[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O2)O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O SRHNADOZAAWYLV-XLMUYGLTSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000003889 chemical engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 231100000050 cytotoxic potential Toxicity 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical class O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 101150047061 tag-72 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av antistoffer som er rettet mot humane cellemembranantigener for fremstilling av et farmasøytisk preparat for vaksinering mot cancer som uttrykker Ep-CAM.
Da hybridomteknologien ble oppfunnet ble det mulig å lage monoklonale antistoffer (MAB) mot høyst ulike antigener. Denne teknologi som vanligvis kan anvendes ved alle biologiske problemstillinger spiller også en viktig rolle i cancerforskning. I løpet av de siste 20 årene er MAB rettet mot et mangfold av tumorassosierte antigener (TAA) blitt produsert. TAA er strukturer som hovedsakelig uttrykkes på cellemembranen av tumorceller og som følgelig tillater differensiering fra ikke-malignt vev. Derfor anses de som mål for diagnostiske eller terapeutiske applikasjoner på bakgrunn av spesifikke MAB eller derivater avledet fira disse MAB.
Direkte terapeutiske applikasjoner av MAB som er rettet mot TAA baseres på passiv immunterapi, dvs. et MAB eller et derivat administreres systemisk til cancerpasienter i en egnet mengde og har en terapeutisk effekt bare så lenge konsentrasjonen i organismen er tilstrekkelig høy. Den biologiske halveringstid av slike stoffer avhenger av deres struktur og varierer fira bare noen få timer til flere dager. Det er derfor nødvendig å gjenta administreringen. Imidlertid, dersom xenogene antistoffer (f.esk. murine MAB) anvendes, fører dette til uønskede immunreaksjoner, som kan føre til nøytralisering av en mulig terapeutisk effekt og til farlige bivirkninger (anafylaktisk sjokk). Derfor kan slike immunterapier bare administreres for en begrenset tidsperiode.
En annen metode for immunterapi av cancer baseres på selektiv aktivering av immunsystemet hos cancerpasienter, for å bekjempe maligne celler der de fleste ulike typer cancervaksiner er anvendt. Disse omfatter vaksinering med autologe eller allogene tumorceller, vaksinering med autologe eller allogene tumorceller som er blitt modifisert kjemisk eller som er blitt modifisert ved genteknologiske teknikker, vaksinering med isolerte TAA eller TAA som er blitt fremstilt ved kjemiske eller genteknologiske metoder, med peptider avledet fra disse og nylig også vaksinering med DNA som koder for TAA eller strukturer avledet fira disse etc. En alternativ fremgangsmåte baseres på anvendelse av anti-idiotypiske antistoffer for vaksinering mot cancer. Egnede cancer-idiotypiske antistorffer kan immunologisk etterlikne et TAA. Som xenogene proteiner (for eksempel murine antistoffer, geit etc.) induserer de en sterk immunrespons hos menneske etter vaksinering - i motsetning til særegne humane tumorantigener, som strukturer tilhørende organismen selv, ofte er immunogene bare i en liten grad. Derfor kan anti-idiotypiske antistoffer anvendes ved vaksinering som en immunogen erstatning for et tumorantigen.
I motsetning til passiv immunterapi med antitumorantistoffer er ved aktiv spesifikk cancer immunterapi, er selv svært små mengder av en egnet vaksine i prinsippet tilstrekkelig for å indusere en immunitet som varer i måneder eller år og som kan forsterkes ved gjentagende vaksineringer dersom den svekkes. Videre tillater aktiv immunisering å indusere en humoral så vel som en cellulær immunitet der samspillet av disse kan føre til en effektiv beskyttelse.
Oppsummert er anvendelse av antistoffer eller deres derivater for immunterapi mot cancer som så langt er blitt beskrevet, essensielt basert på to prinsipper:
passiv terapi med antistoffer eller deres derivater som er rettet mot TAA.
aktiv immunisering (vaksinering) med antistoffer eller deres derivater som er rettet mot idiotypen antistoffet med en spesifisitet mot TAA.
I kjølevannet av oppdagelsen og den videre karakterisering av de mest varierte TAA, har det vist seg at de har viktige funksjoner i forhold til cancerceller. De muliggjør at degenererende celler viser egenskaper karakteristisk for den maligne fenotyp slik at en økt kapasitet av adhesjon, som spiller en viktig rolle ved etablering av metastaser. Imidlertid kan slike antigen, ved spesielle stadier, også uttrykkes på normale celler der de er ansvarlig for normale funksjoner av disse celler. Uten å kreve å være fullstendig, følger en liste over noen eksempler på slike antigener: N-CAM (nervecelleadhesjonsmolekyl), som ofte uttrykkes på tumorer av
neuronal opprinnelse og som medfører homofil adhesjon (J. Cell Biol. 118
(1992), 937.
Lewis-Y-karbohydratantigenet, som finnes på de fleste tumorer med epitel opprinnelse, men som også spiller en viktig rolle under fosterutviklingen av epitelvev. Det er blitt vist at ekspresjon av dette antigen i lungecancer er sterkt assosiert med ugunstig prognose siden Lewis-Y-positive cancerceller tydeligvis
har et høyere metastatisk potensial (N. Engl. J. Med. 327 (1992), 14).
CEA (karsino-embryonalt antigen), som ofte finnes på epiteliale tumorer i gastrointestinalkanalen og som er blitt identifisert som et selvadhesjonsmolekyl
(Cell 57 (1989), 327.
Ep-CAM (epitelcelleadhesjonsmolekyl), som uttrykkes på nesten alle tumorer med epitelopprinnelse, men som også finnes på et stort antall av normale epitel. Det har blittkarakterisertsom et selv-adhesjonsmolekyl og kan derfor klassifiseres som et pan-epitelialt adhesjonsantigen (J. Cell Biol. 125 (1994), 437).
W09856416 beskriver igangsetting av immunrespond mot tumorassosierte antigener (TAA) som for eksempel NDF, EGF, CEA og tyrosinase enzymet ved anvendelse av anti- p53 anti idiotypiske antistoffer eller CDR-fragementer derav. Dette er imidlertid forskjellig fra foreliggende oppfinnelse.
Leveugle, B. et al., PSA-dir. immunetherap, of pros, Prece. of the ann. meeting of the Am. Assoc. for cancer res., 1998.03, hele dok. Omhandler igangsetting av anti-tumor respons ved anvendelse av anti-prostata spesifikk antigen (SPA) antistoffer.
Det tekniske problem som er bakgrunn for foreliggende oppfinnelse er å frembringe ytterligere midler og fremgangsmåter som muliggjør en effektiv profylakse mot eller terapi av cancersykdommer.
Dette problem er blitt løst ved frembringelsen av utførelsesformene som karakteriseres i kravene.
Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av et antistoff som er rettet mot cellemembranantigenet Ep-CAM for fremstilling av et farmasøytisk preparat for profylaktisk og/eller terapeutisk vaksinering mot cancer som uttrykker Ep-CAM.
I denne sammenheng betyr betegnelsen "cellemembranantigener" strukturer som er til stede på cellemembranen til celler. Disse omfatter spesielt reseptorer, slik som transferrinreseptoren, eller andre molekyler slik som E caderin eller Ep-CAM.
I en foretrukket utførelsesform er et slikt cellemembranantigen et tumorassosiert antigen. I denne sammenheng betyr betegnelsen "tumorassosiert antigen" en struktur som i hovedsak presenteres av tumorceller og dermed muliggjør en differensiering fra ikke-malignt vev. Fortrinnsvis er et slikt tumorassosiert antigen lokalisert på eller i cellemembranen av en tumorcelle. Dette utelukker imidlertid ikke at slike antigener også finnes på ikke-degenererende celler. Tumorassosierte antigener kan for eksempel være polypeptider, i særdeleshet glykosylerte proteiner, eller glykosyleringsmønstre til polypeptider. Andre strukturer som kan representere et tumorassosiert antigen er for eksempel glykolipider. Disse omfatter for eksempel gangliosider, slik som GM2. Videre kan tumorassosierte antigener være representert ved endringer i sammensetningen av lipider på cellemembranen som kan være karakteristisk for cancerceller.
Eksempler på tumorassosierte antigener er N-CAM, lewis-Y-karbohydratantigenet, CEA og EP-CAM, som allerede er nevnt ovenfor. Ytterligere eksempler er sialyl Tn-karbohydrat, Globo-H-karbohydrat, gangliosider slik som GD2/GD3/GM2, prostataspesifikt antigen (PSA),CA 125, CA 19-9, CA 15-3, TAG-72, EGF-reseptor, Her2/Neu-reseptor, p97, CD20 og CD21. Monoklonale antistoffer rettet mot alle disse antigener er tilgjengelige. Videre er tumorassosierte antigener beskrevet for eksempel i DeVita et al. (red., "Biological Therapy of Cancer", 2. utgave, kapittel 3: Biology of Tumor Antigens, Lippincott Company, ISBN 0-397-51416-6 (1995)).
Betegnelsen "antistoff" angår antistoffer av alle mulige typer, i særdeleshet polyklonale eller monoklonale antistoffer eller også antistoffer fremstilt ved kjemiske, biokjemiske eller genteknologiske fremgangsmåter. Fremgangsmåter for å fremstille slike molekyler er kjent for fagpersoner innen teknikken. Fremstillingsmåten for antistoffet er ikke viktig. Bare dets bindingsspesifisitet for et relevant epitop av et cellemembranantigen er viktig. Fortrinnsvis anvendes monoklonale antistoffert, helst monoklonale antistoffer av dyreopprinnelse, i særdeleshet murin opprinnelse. Det er særlig foretrukket at det murine monoklonale antistoff HE2 anvendes, som kan produseres som beskrevet, eller et antistoff som har den samme klare bindingsspesifisitet som HE2. Innenfor betydningen av foreliggende oppfinnelse inkluderer betegnelsen "antistoff også fragmenter og derivater av antistoffer der disse fragmenter eller derivater gjenkjenner et TAA. Den terapeutisk effektive immunrespons som induseres ved vaksinering med egnede antistoffer rettet mot TAA bestemmes av bindingsregionen til disse antistoffer, det vil si deres idiotype. Derfor er det i prinsippet også mulig å anvende, i stedet for intakte antistoffer, fragmenter eller derivater av disse antistoffer for en vellykket vaksinering så lenge disse derivatene fortsatt inneholder idiotypen til det respektive utgangsantistoff. Som eksempler kan følgende : F(ab)'2-fragmenter, F(ab)'-fragmentert, Fv-fragmenter som produseres enten ved kjente biokjmiske fremgangsmåter (enzymatisk spalting) eller ved kjente fremgangsmåter innen molekylærbiologi. Ytterligere eksempler er derivater av antistoffer som kan fremstilles ifølge kjente kjemiske, biokjemiske eller genteknologiske fremgangsmåter. I denne sammenheng omfatter også betegnelsen "derivat" i særdeleshet produkter som kan fremstilles ved kjemisk binding av antistoffer (antistoffragementer) med molekyler som kan øke immunresponsen, slik som tetanustoksin, pseudomonas exotoksin, derivater av lipid A, GM-CSF, IL-2 eller ved kjemisk binding av antistoffer (antistoffragmentert) med lipider for en bedre inkorporering i en liposomformulering. Betegnelsen "derivat" inkluderer også fusjonsproteiner av antistoffer (antistoffragmenter) som er blitt fremstilt genteknologisk med polypeptider som kan øke immunresponsen slik som GM-CSF, IL-2, IL-12, C3d etc. Ifølge oppfinnelsen kan antistoffene selvfølgelig også anvendes i kombinasjon med hverandre. Dette betyr at to eller flere antistoffer som gjenkjenner ulike membranantigener eller ulike epitoper av det samme membranantigen kan administreres. De ulike antistoffer kan administreres samtidig (sammen eller atskilt) eller etterfølgende. Cancerceller uttrykker ofte flere TAA på samme tid mot hvilke egnede antistoffer for vaksinering enten er tilgjengelig eller kan fremstilles. For å oppnå en økt eller mulig synergistisk effekt av den induserte immunrespons og for å minimalisere den potensielle fare for utvelgelse av antigen-negative varianter og for å motvirke en mulig tumorcelleheterogenitet, kan det være fordelaktig å anvende en kombinasjon av to eller flere egnede antistoffer eller deres fragmenter eller derivater samtidig for vaksinering.
Innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse betyr "vaksinering" en aktiv immunisering, det vil si induksjon av en spesifikk immunrespons på grunn av administrering (for eksempel subkutan, intradermal, intramuskulær, muligens også oral, nasal) av små mengder av et antigen (en substans som gjenkjennes av det vaksinerte individ som fremmed og derfor immunogent) i en egnet immunogen formulering. Antigenet anvendes følgelig som en "trigger" for immunsystemet for å bygge opp en spesifikk respons mot antigenet. I prinsippet kan de nødvendige mengder av antigen være svært små (noen vaksiner inneholder bare ca. 5-10 ug antigen per vaksinasj onsdose).
Det er karakteristisk for en aktiv immunisering at dose- effektkurven avhenger, over et bredt område, bare i liten grad av mengden antigen som administreres. Dette betyr at immunresponsen er mer eller mindre identisk i et bredt område av doser. Som en konsekvens kan i tilfellet av vaksinering den ønskede effekt det vil si induksjon av en immunrespons allerede oppnås med svært små mengder antigen. Den kan imidlertid også oppnås på en sammenliknbar måte med vesentlig større mengder antigen. Det er imidlertid ønskelig vanligvis å anvende så liten dose som mulig, spesielt i lys av bivirkninger, materialkostnader etc, som er viktig når det gjelder vaksinering.
I betydningen ifølge foreliggende oppfinnelse kan en vaksinering i prinsippet enten utføres på en terapeutisk måte så vel som en profylaktisk måte (som er tilfellet ved alle antimikrobielle vaksiner). Dette betyr at vaksinering mot cancer ifølge foreliggende opprinnelse kan forstås som både en terapeutisk og en profylaktisk applikasjon. Følgelig kan det eventuelt være mulig å oppnå en profylaktisk beskyttelse mot utbrudd av en cancersykdom ved vaksinering av individer som ikke lider av cancer. Individer som kan få en slik profylaktisk vaksinering er individer som har en øket risiko for å utvikle en kreftsykdom, selv om denne applikasjon ikke begrenses til slike individer.
Anvendelsen ifølge foreliggende oppfinnelse atskiller seg vesentlig fira de grunnleggende muligheter for terapeutisk anvendelse av antistoffer, for behandling av kreft som så langt er kjent og tidligere beskrevet, og muliggjør en uventet effektiv behandling.
Bindingsregionen til et antistoff mot et TAA kan representere et strukturelt komplementrært bilde til bindingsepitopet til det respektive TAA ifølge "nøkkelhull og nøkkel"-prinsippet. Dette betyr at et slikt antistoff har, i sin idiotype, en strukturell informasjon av epitopet til TAA mot hvilke det er rettet. Dersom en cancerpasient vaksineres med et egnet immunogent antistoff mot et TAA (det vil si for eksempel med et murint MAB mot et TAA), produseres følgelig antistoffer i pasienten som delvis er rettet mot ideotypen til antistoffet som anvendes som vaksine og som strukturelt kan etterlikne epitopen til TAA ifølge "nøkkelhull og nøkkel"-prinsippet. Dettye betyr at på grunn av en slik vaksinering kan på en måte løselige varianter av epitopen til TAA dannes hos cancerpasienten som kan være effektive som aktivt induserte autologe antistoffer for en lang tidsperiode og titeren kan forsterkes ved egnede intervaller ved gjentatte vaksineringer. I en foretrukket utførelsesform er det humane cellemembranantigenet en struktur som spiller en rolle i adhesjonsprosesser. I denne sammenheng er adhesjonsprosesser fortrinnsvis celle- celleinteraksjoner der ligander eller reseptorer på celleoverflaten er involvert. Følgelig er adhesjonsmolekyler ligander eller reseptorer på celleoverflaten som utfører funksjonen av celle- celle-interaksjon. En undergruppe av slike adhesjonsmolekyler er selv-adhesjonsmolekylene. Disse har den egenskap å være i stand til å binde til seg selv.
Den fysiologiske effekt av en immunrespons indusert ved vaksinering med et antistoff rettet mot et TAA avhenger naturlig av funksjonen til det respektive TAA. Dersom TAA for eksempel fungerer som en reseptor for adhesjon av tumorceller, i særdeleshet til en ligand på epitelceller i det vaskulære system (en slik egenskap er viktig for evnen til disseminerte tumorceller å komme ut fira det vaskulære system og sette seg ned i vev for å danne en metastase), denne adhesjonsevnen reduseres ved vaksinering med et egnet antistoff rettet mot dette TAA, siden induserte antistoffer, som vil konkurrere om interaksjonen mellom TAA og dens ligand da de etterlikner TAA i løselig form, vil i hovedsak være til stede i sirkulasjon og vev.
Generelt er det mulig ifølge forklaringene gitt ovenfor å oppnå ved vaksinering med egnede antistoffer mot TAA hvilken har en funksjon med hensyn på malignitet av
tumorceller, at den induserte immunrespons interfererer med funksjonen til TAA i dens interaksjon med sin ligand og hindrer eller forebygger denne interaksjon. Dette betyr at cancerceller ikke kan eller ikke tilstrekkelig uttrykker egenskaper som er viktige for den maligne fenotype, som gjør det mulig å senke eller stoppe utviklingen av sykdommen og å undertrykke utviklingen av metastaser, i særdeleshet i tidlig stadium.
I ytterligere en foretrukket utførelsesform er cellemembranantigenet i stand til selv-adhesjon, dvs. visse epitoper på antigenet er ansvarlig for den homofile binding til det samme antigen på en annen celle. Eksempler på slike antigener er blant annet N-CAM (neuronalt celleadhesjonsmolekyl), CEA (karsino amyonalt antigen) og Ep-CAM (epitelialt celleadhesjonsmolekyl). Antistoffer rettet mot epitoper på selv-adhesjonsantigener som er innblandet i denne funksjon kan som beskrevet ovenfor, inneholde en strukturell informasjon komplementær til et slikt epitop. Ved vaksinering med slike antistoffer er det følgelig mulig, som beskrevet ovenfor, å indusere dannelsen av antistoffer som har denne selv-adhesjonsegenskap i bindingsreaksjonen. Dette betyr at slike induserte antistoffer videre kan binde til selv-adhesjonsantiger siden reseptor og ligand i slike tilfeller er identiske. Følgelig er det mulig å indusere en immunrespons ved vaksinering av cancerpasienter med egnede antistoffer rettet mot selv-adhesjonsgener, der immunresponsen i sin tur direkte binder til tumorceller og dermed utløser ulike terapeutiske effekter. På den ene siden blokkeres evnen til selv-adhesjon, hvilket er viktig for maligne celler, og på den annen side, kan humane effektorfunksjoner slik som komplementavhengig lyse og/eller lyse forårsaket av aktivering av cytotoksiske effektorceller utløses ved binding av de induserte antistoffer til tumortcellene, hvilket fører til destruksjon av tumorcellene.
Ved alle de ovennevnte mekanismer og effekter kan dannelsen av nye metastaser undertrykkes og ved disseminering av sykdommen kan i det minste reduseres på grunn av vaksinering av cancerpasienter med egnede antistoffer mot TAA. I tidlige stadier av sykdommen, for eksempel etter en vellykket operasjon av en primærtumor (adjuvansstadiet), forhindres gjenværende disseminerte tumorceller fira å etablere seg selv som nye metastaser på grunn av en slik vaksinering. Dette muliggjør en forlenget tilbakefallsfri overlevelsesperiode og følgelig en forlenget levetid for slike pasienter. Det kan eventuelt være mulig å oppnå en livstidsbeskyttelse mot dannelse av metastaser på grunn av slike vaksineringer og tilleggsvaksineringer som utføres ved egnede intervaller. Av særlig interesse er vaksinering av cancerpasienter med egnede antistoffer rettet mot et selv-adhesjons TAA siden det i slike tilfeller, som beskrevet ovenfor, er mulig å oppnå en forhøyet terapeutisk effekt på grunn av et ytterligere direkte angrep av den induserte immunrespons på tumorcellene.
I en ytterligere foretrukket utførelsesform inneholder det farmasøytiske preparat fremstilt ifølge anvendelsen ifølge oppfinnelsen minst en adjuvans som vanligvis anvendes ved formulering av vaksiner i tillegg til antistoffet. Det er mulig å øke immunresponsen ved slike adjuvanser. Som eksempel på adjuvanser, kan de følgende listes: Aluminiumhydroksid (Alu -gel), derivater av lipopolysakkarider, Bacillus Calmette Guerin (BCG), liposompreparater, formuleringer med ytterligere antigener mot hvilket immunsystemet allerede produserer en sterk immunrespons, slik som for eksempel tetanuistoksid, pseudomonoas exotoksin eller bestanddeler av influensavirus, eventuelt i et liposompreparat, biologiske adjuvanser slik som granulocyttmakrofagstimulerende faktor (GM-CSF), interleukin 2 (IL-2) eller gammainterferon (IFN y).
Et farmasøytisk preparat kan fremstilles ifølge anvendelsen ifølge oppfinnelsen egnet for administrering for vaksinering i en dose på 0,01 til 4 mg antistoff, fortrinnsvis 0,5 mg.
Vaksineringen kan utføres ved en enkelt applisering av den ovennevnte dose. Imidlertid utføres fortrinnsvis vaksineringen ved gjentatte appliseringer. Antall gjentakelser er i området fra 1 til 12, helst i området fra 4 til 8 per år. Dosen kan forbli den samme eller den kan økes.
Tilleggsvaksineringer kan utføres ved regelmessige intervaller, i prinsippet hele livet. Egnede intervaller er i området fra 6 til 24 måneder og kan bestemmes ved å følge titeren av de induserte antistoffer (en tilleggsimmunisering bør utføres så snart titeren av de induserte antistoffer faller betydelig).
Administreringen av antistoffet kan utføres ifølge fremgangsmåter kjent for fagpersoner innen teknikken. Fortrinnsvis er det farmasøytiske preparat inneholdende antistoffet egnet for en subkutan, intradermal eller intramuskulær administrering.
Foreliggende oppfinnelse angår videre anvendelse av antistoffer som gjenkjenner et tumorassosiert antigen for vaksinering mot cancersykdommer
Foreliggende oppfinnelse anvendes for å behandle cancersykdommer ved vaksinering, der en eller flere antistoffer som gjenkjenner et TAA administreres til en mengde tilstrekkelig for vaksinering. For definisjonene og foretrukne utførelsesformer gjelder det samme som allerede er beskrevet ovenfor i forbindelse med anvendelse ifølge oppfinnelsen.
Anvendelse av antistoffer rettet mot TAA eller deres derivater eller fragmenter som vaksine skiller seg vesentlig fra kjente applikasjoner av slike anti-TAA-antisoffer for passiv immunterapi. Noen viktige fordeler for anvendelse ifølge oppfinnelsen sammenliknet med passiv antistoffimmunterapi oppsummeres som følger:
Antistoffer rettet mot TAA for passiv immunterapi av cancer:
høy dose (> 100 mg/intravenøs infusjon)
kort effekt på grunn av eliminering av det effektive stoff xenogene antistoffer uønsket på grunn av immunogenisitet varigheten av terapien er begrenset, i særdeleshet i tilfelle av xenogene antistoffer, på grunn av indukjson av en immunrespons og fare for anafylaktiske reaksjoner forårsaket ved dette i tilfellet av gjentatte administreringer.
Antistoffer rettet mot TAA for profylaktisk og/eller terapeutisk vaksinering mot cancer: lav dose (< 1 mg/vaksinering; subkutan, intradermal eller intramuskulær
i<n>jeksjon)
langvarig effekt av den direkte induserte immunrespons xenogene antistoffer ønskelig på grunn av at effekten er basert på
immunogenisitet
varighet av behandlingen er ubegrenset (tillegsvaksineringer er alltid mulig)
I det videre vil eksperimenter beskrives som viser at vaksineringen med et visst muse-MAB (HE2), som er rettet mot selv-adhesjons-TAA Ep-CAM, eller vaksinering med dets f(ab)'2-fragment direkte fører til induksjonen av antistoffer som selektivt bindes til humane tumorceller som uttrykker dette antigen. Dette viser, som et eksempel at en immunrespons som kan ha en terapeutisk effekt ved cancersykdommer induseres ved vaksinering med egnede antistoffer rettet mot et selv-adhesjons-TAA eller med deres derivater som, i det minst, omfatter ideotypen til utgangsantistoffet.
I denne hensikt ble det murine monoklonale antistoff HE2 fremstilt ifølge beskrevne standard fremgangsmåter for hybidomteknologi (se for eksempel H. Zola Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press, Inc. ISBN 0-8493-6476-0; 1988). Balb/c-mus ble immunisert med humane colorectale cancerceller ifølge standard protokoller. Miltcellene ble fusert med musemelanomlinjen P3X63Ag8 og hybridomer ble utvalgt som fremstiller antistoffer som selektivt bindes til de humane colorektale cancerceller men ikke til melanomceller. Til slutt ble en hybridom utvalgt som utskilte et IgG2a/kappa-antistoff. Dette antistoff (HE2) binder til Ep-CAM som kan vises for eksempel ved Western Blot analyser med membranpreparater fra KATO III magecancerceller ved anvendelse av et kjent anti-Ep-CAM-antistoff (KS 1-4) som en sammenlikning.
Aminosyresekvensen til de variable regioner til MAB HE2 er som følger:
Tung kjede:
Lett kjede:
Figurene viser:
Figur 1 viser inhibisjon av selv-adhesjonen til en småcellet lungecanserlinje
SW2 ved MAB HE2 in vitro
Figur 2 viser selv-adhesjon av den humane småcellede lungecanserlinjen SW2
uten påvirkning av MAB HE2 in vitro som en kontroll til eksperimentet vist i figur 1.
Figur 3 viser induksjon av en antistoffimmunrespons mot HE2 etter vaksinering av geiter med F(ab)'2-fragmentet til HE2 som bestemt i en
ELISA.
Figur 4 viser induksjon av en antistoffimmunrespons mot Ep-CAM-positive humane magecancerceller (Kato III) etter vaksinering av geiter med F(ab)'2-fragmentet til HE2 som bestemt i en celle-ELISA. Figur 5 viser fravær av en antistoffimmunrespons mot Ep-CAM-negative humane melanomceller (WM9) etter vaksinering av geiter med F(ab)'2-fragmentet av HE2 som bestemt i en celle-ELISA, som ble utført som en kontroll til eksperimentet vist i figur 4.
Figur 6 viser binding av en affinitetsrenset antistoffraksjon fra serum hos
geiter som ble vaksinert med f(ab)'2-fragmentet av HE2, til Ep-CAM-positive humane magecancerceller (Kato III) som bestemt i en celle-ELISA.
Figur 7 viser fravær av binding av en affinitetsrenset antistoffraksjon fra serum hos geiter som ble vaksinert med F(ab)'2-fragmentet av HW2, til Ep-CAM-negative humane melanomceller (WM9) som bestemt i en celle-ELISA, som ble utført som en kontroll til eksperimentet som ble vist i figur 6. Figur 8 viser induksjon av en antistoffgimmunrespons mot HE2 etter vaksinering av rhesus-aper med 0,5 mg HE2 adsorbert til aluminiumhydroksid som bestemt i en ELISA. Figur 9 viser induksjon av en antistoffimmunrespons mot Ep-CAM-positive humane magecanserceller (Kato III) etter vaksinering av rhesus-aper med 0,5 mg HE2 adsorbert til aluminiuhydroksid som bestemt i en celle-ELISA. Figur 10 viser induksjon av en antistoff immunrespons HE2 detektert i forbindelse med en toksisitetsstudie med rhesus-aper etter vaksinering av en gruppe rhesus-aper med 0,5 mg HE2 adsorbert til aluminiumhydroksid så vel som fravær av en immunrespons mot HE2 etter behandling av en annen gruppe rhesus-aper med en aluminiumhydroksidformulering uten antigen (placebo) som bestemt i en
ELISA.
Figur 11 viser eksempelvis induksjon av en antistoff immunrespons mot Ep-CAM-positive humane magecancerceller (Kato III) detektert i forbindelse med toksisitetsstudien av rhesus-aper med HE2 som bestemt i en celle-ELISA. Figur 12 viser induksjon av en antistoff immunrespons mot Ep-CAM-positive humane magecancerceller (Kato III) etter gjentatt vaksinering av en pasient som lider av tarmcancer med 0,5 mg HE2 adsorbert til aluminiumhydroksid, som bestemt i en celle-ELISA. Figur 13 viser induksjon av en serumcytotoksisitet mot Ep-CAM-positive humane magecanserceller (Kato III) etter gjentatt vaksinering av en pasient som lider av tarmcancer med 0,5 mg HE2 adsorbert til aluminiumhydroksid, som bestemt i et cellelyseeksperiment.
De følgende eksempler fungerer for ytterligere å illustrere oppfinnelsen men skal ikke begrense den: For å vise at det murine MAB HE2 binder til en epitop av selv-adhesjonsantigenet Ep-CAM, som er involvert i den homofile binding, ble påvirkningen av HE2 på evnen til selv-adhesjon av den humane cellelinje SW2 undersøkt. Denne småcellede lungekarsinomlinje har tendens til å danne celleklumper i in vitro kultur innen få timer etter enkeltsåing. Beskrivelsen av elementet kan finnes i eksempel 1. Slik det vises i figur 1 og 2 forhindres dannelsen av celleklumper i stor grad ved tilsetting av HE2. Dette viser at HE2 binder til en epitop av Ep-CAM som er involvert i den homofile binding av dette membranprotein.
For å være i stand til å undersøke den direkte humorale immunrespons ved vaksinering med f(ab)'2-fragmentet av det humane MAB HE2 ble geiter immunisert med dette fragment. Fragmentet ble tilberedt ifølge kjente og beskrevne fremgangsmåter ved spalting av HE2 med pepsin og deretter renset. Immuniseringen av geiter er beskrevet i eksempel 2.
Først ble immunserumet fra geit gjenvunnet og samlet og undersøkt i sammenlikning med et pre-serum, for immunglobuliner som er rettet mot MAB HE2 for å bestemme den totale immunrespons til de vaksinerte geiter. Denne undersøkelsen ble utført ved hjelp av en ELISA-analyse, og den eksperimentelle beskrivelse er gitt i eksempel 3. Resultatet fra dette eksperiment er vist i figur 3: geitene har, på grunn av vaksinering med f(ab)'2-fragmentet til MAB HE2, utviklet en sterk immunrespons overfor dette, mens ingen antistoffer mot HE2 ble funnet i pre-serumet.
Videre ble det undersøkt om det er mulig å påvise immunglobuliner i geiteimmunserum som binder til humane cancerceller som uttrykker det TAA mot hvilket MAB HE2 er rettet (Ep-CAM). I denne hensikt ble magecancerlinjen KATO III anvendt. Binding til en human cellelinje, som ikke uttrykker Ep-CAM (WM9-melanomceller) ble også undersøkt som en kontroll. Disse undersøkelser ble utført ved hjelp av en celle-ELISA-analyse og den eksperimentelle beskrivelsen er gitt i eksempel 4. Resultatene fra disse eksperimenter er vist i figurene 4 og 5: Geiteimmunserumet inneholder immunglobulinet som binder sterkt til Ep-CAM-positive KATO-celler, mens ingen binding kan påvises til Ep-CAM-negative WM9-celler. Pre-serumet inneholder ingen antistoffer som binder til disse celler. Dette svært overraskende resultat viser at antistoffer dannet ved vaksinering med HE2-f(ab)'2-fragmentet virkelig er i stand til å binde seg selv igjen til celler som uttrykker det TAA som gjenkjennes av HE2. Følgelig kan selv-adhesjonsfunksjonen til TAA overføres til antistoffene som ble dannet ved vaksinering med HE2, som tidligere beskrevet i detalj.
For å bevise at antistoffene fremstilt i geitene på bakgrunn av vaksinering med f(ab)'2-fragmentet til HE2 og som er rettet mot idiotypen til dette MAB virkelig er disse som binder til KATO-cellene, ble den anti-idiotypiske andel av disse induserte antistoffer spesielt renset fira geiteimmunserumet ved hjelp av en serie av immunaffinitetskromatografier som i prinsippet er beskrevet (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81 (1984), 216). Rekkefølgen på rensetrinnene er igjen oppsummert i eksempel 5.
Disse affinitetsrensede geiteantistoffer ble igjen testet for deres binding til Ep-CAM-positive KATO-celler så vel som til Ep-CAM-negative WM9-celler. Den eksperimentelle beskrivelse finnes i eksempel 6. Resultatet fira disse eksperimenter vises i figurene 6 og 7: geite-IgG som er rettet mot ideotypen til HE2, binder sterkt til Ep-CAM-positive KATO-celler, mens uspesifikk geit IgG nesten ikke binder. Bindingen av affinitetsrensede spesifikke geite-IgG til Ep-CAM-negative WM9-celler er imidlertid ikke forskjellig fra den for uspesifikk geit-IgG. Følgelig er det vist at fraksjonen av antistoffer som direkte fremstilles på bakgrunn av vaksineringen med f(ab)'2-fragmentet til HE2 og som er rettet mot idiotypen til dette antistoff, inneholder antistoffene som binder til cancercellene som uttrykker TAA gjenkjen av HE2. Med dette eksperiment er det også endelig vist at antistoffene mot Ep-CAM-positive celler indusert ved vaksinering med HE2 ikke er et resultat av en dobbeltautolog idiotypisk nettverkskaskade slik det er postulert i flere artikler (se for eksempel Cancer Immunol. Immunother. 42 (1996), 81-87) for slike anti-idiotypiske antistoffer (Ab3) kunne over hodet ikke renses ved affinitetskromatografi på en Abl (= HE2)-kolonne siden, ifølge det idiotypiske nettverk, kan de ikke bindes til Abl men bare til Ab2.
I lys av de ovenfor beskrevne resultater fra immunisering av geiter med f(ab)'2-fragmentet til HE2 ble vaksineringsstudier også utført med rhesus-aper for å bekrefte de immunologiske resultater i en art nær beslektet med menneske. I disse eksperimenter ble hele det murine MAB HE2 brukt som immunogen. Det var antatt at den murine Fe-del som et stort xenogent protein også ville øke immunresponsen mot idiotypen (bærereffekt). For å unngå mulige lokale bivirkninger ble aluminiumhydroksid anvendt som en mild adjuvans. Tillagingen av formuleringer for disse
vaksinasjonseksperimenter er beskrevet i eksempel 7.
Formuleringen beskrevet i eksempel 7 ble injisert subkutant på ryggen av fire rhesus-aper (0,5 mg HE2 = 0,5 ml per vaksinasjon, administrert to ganger, med et intervall på fire uker). For gjenvinning av serum ble blod tatt ved flere tidspunkt.
Først ble immunresponsen mot HE2 bestemt i ELISA. Den eksperimentelle beskrivelse finnes i eksempel 8. Som vist i figur 8 kan betydelige titere av antistoffer mot HE2 allerede måles på dag 29.
Det ble videre undersøkt om antistoffene indusert ved vaksinering binder til KATO III-celler. For disse undersøkelser ble en celle-ELISA anvendt. Den eksperimentelle beskrivelse finnes i eksempel 9. Som vist i figur 9 er antistoffer som binder til Ep-CAM-positive KATO III-tumorceller allerede indusert på dag 29 hos alle dyr.
Videre ble fire dyr vaksinert med HE2 adsorbert til aluminiumhydroksid i forbindelse med en toksisitetsstudie med rhesus-aper. Fire andre rhesus-aper fikk aluminiumhydroksid som en placebo. Tillaging av formuleringene er beskrevet i eksemplene 10 og 11. Rhesus-apene ble injisert subkutant på ryggen fire ganger med 0,5 ml av den respektive formulering (effektivt middel eller placebo), dagene 1,15,29 og 57). For gjenvinning av serum ble blod tatt før studiestart og ved ulike tidspunkt i løpet av behandlingen.
Igjen ble immunresponsen mot HE2 først bestemt i en ELISA. Den eksperimentelle beskrivelsen finnes i eksempel 8. Som vist i figur 10 utviklet alle fire rhesus-aper i HE2-gruppen en betydelig humoral immunrespons mot HE2 allerede etter en vaksinering som ble ytterligere forhøyet ved den andre vaksinering, mens rhesus-aper i placebogruppen ikke viste noen økning i titer av antistoff mot HE2.
Disse funn ble ytterligere bekreftet ved immunaffinitetsrensing av sera fra dag 43 fra rehsus-apene i HE2-gruppen. Den eksperimentelle beskrivelsen finnes i eksempel 12. Som vist i den følgende tabell utviklet alle fire apene en sterk IgG-immunrespons mot HE2 (sekundær immunrespons) i deres serum på dag 43, mens IgM-delen er sammenliknbar med den i pre-sera.
Induksjonen av antistoffer mot Ep-CAM-positive KATO III-celler ble også undersøkt. Igjen ble også en celle-ELISA anvendt for disse undersøkelser. Den eksperimentelle beskrivelse finnes i eksempel 9. Som vist eksempelvis i figur 11 utviklet rhesus-apene i HE2-gruppen antistoffer mot KATO III-celler allerede på dag 29.
I lys av de ovenfor beskrevne resultater fra vaksinering av geiter og rhesus-aper ble en pasient som lider av tarmkreft med metastaser (Dukes D) deretter vaksinert med MAB HE2 adsorbert til aluminiumhydroksid i et anekdotisk tilfelle. Tilberedningen av formuleringen er beskrevet i eksempel 7. Pasienten ble injisert fire ganger (dag 1, 50, 78,114) subkutant i de øvre ekstremiteter med 0,5 ml av denne formulering (tilsvarer 0,5 mg HE2). Blod ble tatt for gjenvinning av serum før hver vaksinering og på dag 128. Først ble det undersøkt om antistoffer ble indusert ved vaksinering som bindes til KATO III-celler. Celle-ELISA ble igjen anvendt ved disse undersøkelser. Den eksperimentelle beskrivelse finnes i eksempel 8. Resultatene fra disse eksperimenter vises i figur 12. Høye titre av antistoffer som binder til KATO III-celler induseres tydeligvis hos disse pasienter på grunn av vaksineringen.
Det ble videre undersøkt om antistoffene indusert ved vaksinering med HE2 medierte en cytotoksisk effekt mot KATO III-cancerceller ex vivo. I denne hensikt ble KATO III-celler inkubert med pre- og immunsera fra denne kreftpasient for å vise en komplementavhengig lyse mediert av de induserte antistoffer. Den eksperimentelle beskrivelse finnes i eksempel 13.
Resultatene er vist i figur 13. Antistoffene indusert ved vaksinering HE2 er tydeligvis i stand til å ødelegge Ep-CAM-positive KATO III-celler via komplementavhengig lyse i autologt pasientserum.
De ovenfor beskrevne eksperimenter viser for eksempel at vaksinering med egnede antistoffer mot et selv-adhesjons-TAA, slik som Ep-CAM, eller deres derivater med samme idiotyp som det respektive utgangsantistoff, utløser en humoral immunrespons som selektivt binder til tumorceller som uttrykker dette selv-adhesjons TAA. De induserte antistoffer kan vise et cytotoksisk potensial mot slike tumorceller. En vaksinering med slike antistoffer kan derfor føre til en terapeutisk effekt i cancersykdommer.
Eksempler
Anvendte materialer:
mikrotiterplater: Immuno Plate F96 MaxiSorp (Nunc) for ELISA
Cell Culture Cluster (Costar; kat.nr. 3598) for celle-
ELISA
cellellinjer: SW2: human småcellet lungekarsinomlinje, Ep-CAM-
positive KATO III: human magekreftcellelinje, Ep-CAM-positive (ATCC HTB 103)
WM 9: human melanomcellellinje, Ep-CAM-negative
Koblingsbuffer: 0,1 M NaHC03
0,5 M NaCl
pH-verdi 8,0
RensebufferA: PBSdef
0,2 M NaCl
pH-verdi 7,2
Rensebuffer B: 0,1 M glysin/HCl
0,2 M NaCl
pH-verdi 2,9
Medium A: RPMI 1640 + 2 g/l NaHC03
100 U/ml pencillinG
100 g/ml streptomycinsulfat 4 mM glutamin
10 % føtalt kalveserum (varmeinaktivert)
Bindingsbuffer: 15 mM Na2C03
35 mM NaHCOa
3 mM NaN3
pH-verdi: 9,6
PBS-defisit: 138 mM NaCl
l,5mMKH2P04
2,7 mM KC1
6,5mMNa2HP04
pH-verdi: 7,2
Fikseringsløsning: 0,1 % glutardialdehyd i fysiologisk NaCl-løsning.
Vaskebuffer A: 2 % NaCl
0,2 %triton X-100
i PBS-defisit
Vaskebuffer B: 0,05 % Tween 20 i PBS-defisit
Blokkeringsbuffer A: 5 % føtalt kalveserum (varmeinaktivert)
i PBS-defisit
Blokkeringsbuffer B: 1 % bovint serumalbumin
0,1 % NaN3
i PBS-defisit
Fortynningsbuffer A: 2 % føtalt kalveserum (varmeinaktivert)
i PBS-defisit
Fortynningsbuffer B: PBS-defisit
Fargebuffer: 24,3 mM sitronsyre
51,4mMNa2HP04
pH-verdi: 5,0
Substrat: 40 mg o-fenylendiamindihydroklorid
100 ml fargebuffer
20 ul H202(30 %)
Stoppløsning:
4 N H2S04
Eksempel 1:
In vitro dyrkede SW2-celler sentrifugeres og pelleten suspenderes i medium A og justeres til 7xl0<4>celler/ml. I kammeret til en LabTek blandes enten = 0,1 ml PBS-def med 0,3 ml cellesuspensjon eller 0,1 ml PBS-def blandes med 40ug HE2 og deretter med 0,3 ml cellesuspensjon (sluttkonsentrasjon av HE2 100 ug/ml). Rett før cellesuspensjonen tilsettes som den siste bestanddel separeres cellene med pipetten. Umiddelbart etter blanding fotograferes de respektive cellesuspensjoner i invertmikroskopet (forstørrelse 100 ganger). Deretter dyrkes cellesuspensjonen i 4 timer ved 37 °C / 5 % C02og fotograferes deretter igjen.
Eksempel 2:
To geiter vaksineres intradermalt på flere steder med 1,5 mg f(ab)'2-fragment i 3 ml PBS-defisit sammen med 3 ml Freund's fullstendige adjuvans (Difco). På dag 8 gis en første tilleggsvaksinering som på dag i, imidlertid med Freund's ufullstendige adjuvans (Difco). På dag 29 gis en annen tilleggsvaksinering på samme måte. Imidlertid tilsettes ingen adjuvans. Blod tas før vaksinasjonsstart og på dag 54 for gjenvinning av serum for analyse av den utviklede immunrespons.
Eksempel 3:
100 ul alikvoter av MAB HE2 (løsning med 10 ug/ml i bindingsbuffer) innkuberes i brønnene til en mikrotiterplate i 1 time ved 37° C. Etter vasking av platen med vaskebuffer A seks ganger ble 200 (il blokkeringsbuffer A tilsatt til hver brønn og platen inkubert i 30 minutter ved 37° C. Etter vasking av platen som beskrevet ovenfor inkuberes 100 (il alikvoter av geitesera som skal testes i fortynning fra 1:100 til 1:1 000 000 i fortynningsbuffer A i 1 time ved 37° C. Etter vasking av platen som beskrevet ovenfor tilsettes 100 (il peroksidasekonjugert kanin anti-geit-Ig-antistoff (Zymed) til hver brønn en fortynning på 1:1000 i fortynningsbuffer A og inkuberes i 30 minutter ved 37° C. Platen vaskes med vaskebuffer A fire ganger og to ganger med fargebuffer. Bindingen av antistoffet påvises ved tilsetting av 100 (il spesifikt substrat til hvert brønn og fargereaksjonen stoppes etter ca. 10 minutter ved tilsetting av 50 (il stoppløsning. Evalueringen utføres ved måling av den optiske tetthet (OD) ved 490 nm (bølgelengde av referansemålingene er 620 nm).
Eksempel 4:
Brønnene i en mikrotiterplate ble innkubert ved +4° C over natten ved 100 (il av en cellesuspensjon av cellelinjen som skal testes ved en konsentrasjon på 2x10<6>celle/ml i medium A. Etter at supernatanten var suget av ble platene innkubert med 50 ml fikseringsløsning per brønn i 5 minutter ved romtemperatur. Etter at supernatanten var suget av ble 200 (il blokkeringsbuffer B tilsatt til hver brønn og platen ble innkubert i 1 time ved 37 °C. Etter vasking to ganger med 200 (il vaskebuffer B innkuberes 100 (il alikvoter av geitesera som skal testes i 1 time ved 37° C ved fortynninger på 1:10 til 1:100 000 i fortynningsbuffer A. Etter vasking av platen to ganger med 100 (il iskald vaskebuffer B tilsettes 100 (il peroksidasekonjugert kanin anti-geit-Ig-antistoff (Zymed) ved en fortynning på 1:1000 i fortynningsbuffer A i 45 minutter ved 37° C. Platen vaskes tre ganger med 100 (il iskald vaskebuffer B. Bindingen av antistoff påvises ved tilsetting av 100 (il spesifikt substrat per brønn og fargereaksjonen stoppes etter ca. 10 minutter ved tilsetting av 50 (il stoppløsning. Evalueringen utføres ved måling av optisk tetthet (OD) ved 490 nm (bølgelengden ved referansemålinger er 620 nm).
Eksempel 5:
Rensingen er prinsipielt beskrevet i Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:216, 1984 og oppsummeres som følger: i et første trinn utføres en rensing av totalt IgG inneholdt i geiteserumet ifølge kjente fremgangsmåter på en DEAE-anionebyttekolonne. Deretter bindes geiteantistoffene som er rettet mot konstante regioner av f(ab)'2-fragmentet av HE2 til en immunaffinitetskolonne (CH-Sepharose 4B, Pharmacia) til hvilken urelevante muse-IgG2a var koblet, mens fraksjonen av anti-idiotypiske geiteantistoffer ikke bindes til denne kolonne. I et siste bindes derfor det som strømmer gjennom denne immunaffinitetskromatografien til en immunaffinitetskolonne (CH-Sepharose 4B, Pharmacia) til hvilket HE2 ble koblet. Fraksjonen som spesifikt bindes til denne kolonne eluderes med en buffer pH 2,8 (0,1 M glysin/HCl) og nøytraliseres. Geit-IgG-fraksjonen oppnådd på denne måten er rettet mot idiotypen av HE2.
Eksempel 6:
Denne celle-ELISA er hovedsakelig utført på samme måte som beskrevet i eksempel 4. I stedet for serumfortynninger anvendes konsentrasjoner på 100 ug/ml til 0,031 ug/ml av henholdsvis immunaffinitetsrenset geit-IgG og det uspesifikke rensede geit-IgG.
Eksempel 7:
0,83 ml av en suspensjon av Alu-Gel (Alu-Gel S av Serva, 2 % suspensjon, kvalitetsgrad: adjuvans for tilberedning av vaksiner) ristes forsiktig i en time ved romtemperatur under sterile betingelser med 0,5 ml av en løsning av 10 mg/ml HE2 i PBS pH 5,5 sammen med 3,67 ml PBS-def. (sluttkonsentrasjon av HE2: 1 mg/ml; Alu-Gel S: 0,33 %). Suspensjonen fylles deretter sterilt i injeksjonsampuller av alikvoter på 0,5 ml.
Eksempel 8:
Denne ELISA utføres i hovedsak på samme måte som beskrevet i eksempel 3 med unntak av at et peroksidasekonjugert geit-antihumant-Ig-antistoff (Zymed) anvendes for påvisning av de bundne rhesus-ape-antistoffer. Med dette reagens kan rhesus-ape-antistoffene påvises på samme måte som humane antistoffer siden sekvenshomologien i de konstante regioner av humane antistoffer og rhesus-ape-antistoffer er ca. 98 %.
Eksempel 9:
Denne celle-ELISA utføres i hovedsak på samme måte som beskrevet i eksempel 4 med unntak av at et peroksidasekonjugert geit-antihumant-Ig-antistoff (Zymed) anvendes for påvisning av rhesus-ape-antistoffer (eller humane antistoffer) som bindes til cellene. Et peroksidasekonjugert geit-antimus-Ig-antistoff (Zymed) anvendes for påvisning av det murine HE2 som en kontroll.
Eksempel 10:
3,5 ml av en løsning av HE2 (10 mg/ml i PBS-def. pH = 5,5) blandes under sterile betingelser med 0,35 ml av en vandig timerosalløsning (10 mg/ml; Sigma) så vel som med 27,25 ml fysiologisk saltløsning og tilsettes tyil 3,9 ml av en aluminiumhydroksidsyspensjon (3 % i vann; alhydrogel, Duperfos Biosector, Danmark) under forsiktig risting. 0,6 ml av suspensjonen oppnådd på denne måten fylles deretter på depyrogenerte glassrør under sterile betingelser som forsegles med en gummipropp med en aluminumshette.
Eksempel 11
Placeboformuleringen tilberedes på samme måte som beskrevet i eksempel 10 med unntak av at 0,35 ml fysiologisk NaCl-løsning anvendes i stedet for antistoffløsningen og 3,5 ml PBS-def pH = 5,5 i stedet for timerosalløsning.
Eksempel 12:
1 g CH-sfarose 4B (Pharmacia) suspenders i 30 ml 1 mM HC1 i 15 minutter. Gelen vaskes deretter på et filter av sintret glass AG3 med 1 liter 1 mM HC1 og deretter med 200 ml koplingsbuffer. 10 mg HE2 8 stamløsning 10 mg/ml) dialyseres mot ca. 0,5 liter koplingsbuffer. Denne løsning blandes med gelsuspensjonen i en forseglet container. Et forhold mellom gel: buffer på 1:2 fører til en suspensjon egnet for koblingen. Denne suspensjon omrøres i 5,5 timer ved romtemperatur. Deretter fjernes overskudd av liganden ved vasking med 3 x 30 ml koplingsbuffer. Gjenværende reaktive grupper blokkeres ved 1 times innkubering ved romtemperatur med 1 M etanolamin. Gelen ristes deretter i 1 time ved romtemperatur med0,l M Tris-HCl-buffer pH = 8. Til slutt vaskes gelen med 3 omganger buffere med forskjellig pH. Hver omgang består av 0,1 M natriumacetatbuffer pH 4 med 0,5 M NaCl og deretter 0,1 M Tris-HCl-buffer pH 8 med 0,5 M NaCl. Gelen oppbevares ved 4° C.
Immunaffinitetrensingen av antistoffraksjonen rettet mot HE2 fra serumet til rhesus-apene utføres ifølge følgende instruksjoner: immunaffinitetsrensingen utføres på FPLC-systemet (Pharmacia). 1 ml gel oppnådd ifølge de ovennevnte instruksjoner fylles på en Pharmacia HR5/5-kolonne. 0,5 ml serum fortynnes 1:10 med rensebuffer A. Denne løsning pumpes over kolonnen ved en hastighet på 1 ml ml/minutt og vaskes med rensebuffer A inntil UV-grunnlinjen i reaktoren igjen oppnås (280 nm). Bundne immunglobuliner eluderes deretter med rensebuffer B og fraksjonen nøytraliseres umiddelbart etter dessorpsjon med 0,5 M Na2HP04og 0,02 % NaN3tilsettes. 50 ul av antistoffraksjonen renset på denne måten analyseres på en størrelsesfraksjoneringskolonne (SEC, Zorbax 250 GF) og IgG-porsjonen og IgM-porsjonen kvantifiseres. For SEC anvendes 220 mM fosfatbuffer pH7 + 10 % acetonitril som et elueringsmiddel. Humant IgG og humant IgM fungerer som standard for SEC som hver ble kromatografert ved ulike konsentrasjoner for å etablere en standard kalibreringskurve (maksimalt areal versus konsentrasjon). Beregningen av IgG- ig IgM-konsentrasjonene i de affinitetsrensede antistoffraksjoner fra rhesus-aper ble utført ved lineær regresjon ved anvendelse av standardkurver. Konsentrasjonene er antydet som (ig/ml av det anvendte apeserum.
Eksempel 13
Dagen før testen utføres, overføres KATO III-celler til frisk medium A og oppbevares ved 37 °C/5 % C02i en cellekulturflaske. Neste dag merkes cellene først med<51>krom. 5xl0<6->celler innkuberes i 800 ul medium A ved 37 °C/5 % C02med 100 uCi Na2<51>Cr04. Deretter vaskes cellene med medium A og justeres til en tetthet på 2,5xl0<5->celler/ml. 100 ul alikvoter av denne cellesuspensjon pipetteres over i brønner av en mikrotiterplate. 100 (il alikvoter fra pasientsera som skal testes tilsettes og inkuberes i 3 timer ved 37 °C/5 % C02(sera lagres ved -80 °C og tines bare en gang for denne analyse for å unngå å ødelegge komplementaktiviteten). Supernatantene gjenfinnes ved anvendelse av en "Skatron-Harvesting-Press" og måles i en gammateller. Som et resultat oppnås verdiene for "eksperimentell frigivelse". For bestemmelse av "total frigivelse" behandles cellene som beskrevet ovenfor der serum erstattes av en løsning av 2 % SDS, 50 mM Na2C03og 10 mM EDTA. Verdiene for "spontan frigivelse" oppnås ved å erstatte serum med medium A. Resultatyet beregnes som følger:
Testen utføres 3 ganger og gjennomsnittsverdi og standard avvik for enkeltresultater er antydet.
Claims (9)
1.
Anvendelse av et antistoff som er rettet mot cellemembranantigenet Ep-CAM for fremstilling av et farmasøytisk preparat for profylaktisk og/eller terapeutisk vaksinering mot cancer som uttrykker Ep-CAM.
2.
Anvendelse ifølge krav 1, der antistoffet er av dyreopprinnelse.
3.
Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, der antistoffet er et monoklonalt antistoff.
4.
Anvendelse ifølge krav 3, der antistoffet er et murint monoklonalt antistoff der den variable region i den tunge kjede har aminosyresekvensen vist i SEQ ID No: 1 og der den variable region i den lette kjede har aminosyresekvensen vist i SEQ ID No: 2.
5.
Anvendelse av et av kravene 1 til 3, der antistoffet har den samme klare bindingsspesifisitet som antistoffet definert i krav 4.
6.
Anvendelse ifølge et av kravene 1 til 5, der to eller flere antistoffer som er rettet mot ulike epitoper av membranantigenet anvendes i kombinasjon med hverandre.
7.
Anvendelse ifølge et av kravene 1 til 6, der det farmasøytiske preparat ytterligere omfatter minst en vaksineadjuvans.
8.
Anvendelse ifølge et av kravene 1 til 7, der det farmasøytiske preparat er egnet for administrering av antistoffet ved en dose i området på 0,01 til 4 mg antistoff.
9.
Anvendelse ifølge et av kravene 1 til 8, der det farmasøytiske preparat er egnet for administrering ved subkutan, intradermal eller intramuskulær injeksjon.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CH5199 | 1999-01-13 | ||
PCT/EP2000/000174 WO2000041722A1 (de) | 1999-01-13 | 2000-01-12 | Verwendung von antikörpern zur vakzinierung gegen krebs |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20013093D0 NO20013093D0 (no) | 2001-06-21 |
NO20013093L NO20013093L (no) | 2001-09-10 |
NO329917B1 true NO329917B1 (no) | 2011-01-24 |
Family
ID=4178206
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20013093A NO329917B1 (no) | 1999-01-13 | 2001-06-21 | Anvendelse av antistoffer for fremstilling av et farmasoytisk preparat mot cancer som uttrykker Ep-CAM |
Country Status (28)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US7691372B2 (no) |
EP (2) | EP1230932B1 (no) |
JP (1) | JP4774551B2 (no) |
KR (1) | KR100771752B1 (no) |
CN (1) | CN1188169C (no) |
AT (2) | ATE219687T1 (no) |
AU (1) | AU768515B2 (no) |
CA (1) | CA2360382C (no) |
CZ (1) | CZ302801B6 (no) |
DE (2) | DE50000243D1 (no) |
DK (2) | DK1230932T3 (no) |
EE (1) | EE05474B1 (no) |
ES (2) | ES2177509T3 (no) |
HK (1) | HK1044487B (no) |
HR (1) | HRP20010526A2 (no) |
HU (1) | HU226150B1 (no) |
ID (1) | ID30223A (no) |
IL (2) | IL144265A0 (no) |
IS (1) | IS5998A (no) |
MX (1) | MXPA01007148A (no) |
NO (1) | NO329917B1 (no) |
NZ (1) | NZ512722A (no) |
PL (1) | PL201533B1 (no) |
PT (2) | PT1230932E (no) |
SI (2) | SI1140168T1 (no) |
SK (1) | SK286627B6 (no) |
TR (1) | TR200102034T2 (no) |
WO (1) | WO2000041722A1 (no) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TR200102034T2 (tr) * | 1999-01-13 | 2001-11-21 | Igeneon Krebs-Immuntherapie Forschungs-Und Entwicklungs-Ag | Anti kanser aşılaması için antikorların kullanılması |
AT410172B (de) | 2000-03-21 | 2003-02-25 | Igeneon Gmbh | Verfahren zur herstellung einer vakzineformulierung |
AT502293B1 (de) * | 2002-05-15 | 2008-03-15 | Igeneon Krebs Immuntherapie | Immunogener, monoklonaler antikörper |
AT500647A1 (de) * | 2002-05-21 | 2006-02-15 | Igeneon Krebs Immuntherapie | Verwendung eines impfstoffes |
AT500650B1 (de) * | 2003-04-17 | 2009-11-15 | Altropus Gmbh | Immunogener rekombinanter antikörper |
AT500651B9 (de) * | 2003-05-27 | 2010-04-15 | Altropus Gmbh | Aktiv immunisierender antikörper |
WO2006005367A1 (en) | 2004-07-14 | 2006-01-19 | Igeneon Krebs-Immuntherapie Forschungs-Und Entwicklungs-Ag | N-glycosylated antibody |
ATE483473T1 (de) * | 2004-07-20 | 2010-10-15 | Altropus Gmbh | Verwendung von antikörpern in einer sehr geringen dosis zur impfung gegen krebs |
WO2006116423A2 (en) * | 2005-04-26 | 2006-11-02 | Eisai Co., Ltd | Compositions and methods for cancer immunotherapy |
EP1762575A1 (en) * | 2005-09-12 | 2007-03-14 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy |
AT504231A1 (de) | 2006-10-03 | 2008-04-15 | Hans Dr Loibner | Prädiktive parameter |
EP2356992B1 (en) | 2007-12-07 | 2017-08-16 | N.V. Nutricia | Bifidobactrium for dust mite allergy |
WO2010096941A1 (en) | 2009-02-24 | 2010-09-02 | Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc | Methods for identifying immunobinders of cell-surface antigens |
US8887373B2 (en) | 2012-02-24 | 2014-11-18 | Covidien Lp | Vessel sealing instrument with reduced thermal spread and method of manufacture therefor |
US20140276968A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Ethicon, Inc. | Applicator systems for surgical fasteners |
US10196458B2 (en) * | 2013-07-26 | 2019-02-05 | The Regents Of The University Of California | Anti-immunoglobulin E antibodies and methods of using thereof |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1341281C (en) * | 1986-07-09 | 2001-08-07 | Hubert J.P. Schoemaker | Immunotherapy of tumor with monoclonal antibody against the 17-1a antigen |
US5270202A (en) | 1989-11-03 | 1993-12-14 | Syamal Raychaudhuri | Anti-idiotypic antibodies to human melanoma-associated proteoglycan antigen |
US5965132A (en) * | 1992-03-05 | 1999-10-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors |
US5798100A (en) * | 1994-07-06 | 1998-08-25 | Immunomedics, Inc. | Multi-stage cascade boosting vaccine |
WO1997005597A1 (en) * | 1995-07-31 | 1997-02-13 | Litton Systems Canada Limited | Flat panel pixel array incorporating photoconductive switches |
EP0857176A1 (en) * | 1995-10-25 | 1998-08-12 | Centocor B.V. | HUMAN EPITHELIAL ANTIGEN Ep-CAM DERIVED PEPTIDES AND THEIR USE |
US6235280B1 (en) | 1996-04-12 | 2001-05-22 | Malaya Chatterjee | Methods of delaying development of CEA-associated tumors using anti-idiotype antibody 3H1 |
IL121041A0 (en) * | 1997-06-09 | 1997-11-20 | Yeda Res & Dev | Immunogenic compositions for induction of anti-tumor immunity |
US6274143B1 (en) * | 1997-06-13 | 2001-08-14 | Malaya Chatterjee | Methods of delaying development of HMFG-associated tumors using anti-idiotype antibody 11D10 |
AU768002B2 (en) * | 1998-06-15 | 2003-11-27 | Oncoquest Inc. | Immunotherapeutic composition and method for the treatment of prostate cancer |
TR200102034T2 (tr) * | 1999-01-13 | 2001-11-21 | Igeneon Krebs-Immuntherapie Forschungs-Und Entwicklungs-Ag | Anti kanser aşılaması için antikorların kullanılması |
US6632431B2 (en) | 2000-05-16 | 2003-10-14 | New York University | Anti-idiotypic antibody against FimH adhesion of uropathogenic type I-fimbriated Escherichia coli, compositions containing same and method for using same |
-
2000
- 2000-01-12 TR TR2001/02034T patent/TR200102034T2/xx unknown
- 2000-01-12 AT AT00906191T patent/ATE219687T1/de active
- 2000-01-12 DK DK02005394T patent/DK1230932T3/da active
- 2000-01-12 JP JP2000593332A patent/JP4774551B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-12 ES ES00906191T patent/ES2177509T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-12 HU HU0200527A patent/HU226150B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-01-12 SI SI200030015T patent/SI1140168T1/xx unknown
- 2000-01-12 KR KR1020017008697A patent/KR100771752B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-01-12 CA CA2360382A patent/CA2360382C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-12 DK DK00906191T patent/DK1140168T3/da active
- 2000-01-12 CN CNB008027641A patent/CN1188169C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-12 SI SI200030594T patent/SI1230932T1/xx unknown
- 2000-01-12 PT PT02005394T patent/PT1230932E/pt unknown
- 2000-01-12 ES ES02005394T patent/ES2236375T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-12 AU AU27964/00A patent/AU768515B2/en not_active Ceased
- 2000-01-12 EP EP02005394A patent/EP1230932B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-12 ID IDW00200101396A patent/ID30223A/id unknown
- 2000-01-12 PL PL364747A patent/PL201533B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-01-12 IL IL14426500A patent/IL144265A0/xx active IP Right Grant
- 2000-01-12 AT AT02005394T patent/ATE286745T1/de active
- 2000-01-12 CZ CZ20012581A patent/CZ302801B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-01-12 PT PT00906191T patent/PT1140168E/pt unknown
- 2000-01-12 NZ NZ512722A patent/NZ512722A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-01-12 EP EP00906191A patent/EP1140168B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-12 DE DE50000243T patent/DE50000243D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-12 EE EEP200100366A patent/EE05474B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-01-12 WO PCT/EP2000/000174 patent/WO2000041722A1/de active IP Right Grant
- 2000-01-12 MX MXPA01007148A patent/MXPA01007148A/es not_active IP Right Cessation
- 2000-01-12 SK SK964-2001A patent/SK286627B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-01-12 DE DE50009240T patent/DE50009240D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-06-21 NO NO20013093A patent/NO329917B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-07-10 IS IS5998A patent/IS5998A/is unknown
- 2001-07-11 IL IL144265A patent/IL144265A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-07-12 HR HR20010526A patent/HRP20010526A2/hr not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-08-23 HK HK02106215.4A patent/HK1044487B/zh not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-10-10 US US11/548,269 patent/US7691372B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-09-18 US US12/562,886 patent/US20100233178A1/en not_active Abandoned
-
2011
- 2011-08-12 US US13/209,285 patent/US8444974B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8444974B2 (en) | Use of antibodies for the vaccination against cancer | |
JP2004534741A (ja) | 癌に対する抗体 | |
NO321511B1 (no) | Sammensetning for rekonformering av multi-epitopiske antigener for a initiere en immunrespons og anvendelse av sammensetningen til fremstilling av et legemiddel | |
AU780853B2 (en) | Use of anti-idiotypical antibodies as vaccines against cancer | |
AU2005306186B2 (en) | Immunotherapeutic formulations with Interleukin-2-neutralising capacity | |
US20080241177A1 (en) | Idiotypic vaccine | |
US20060018901A1 (en) | Use of antibodies in a very low dose for the vaccination against cancer | |
US10092635B2 (en) | Tumor vaccines and methods of use thereof | |
US20040265318A1 (en) | Use of antibodies for the vaccination against cancer | |
JP2004532261A (ja) | ポリクローナル免疫グロブリンの使用 | |
Dakappagari | Evaluation of chimeric B-cell epitope vaccines of HER-2: application to cancer patients | |
JP2001055341A (ja) | 免疫応答を惹起するための、多数エピトープ含有抗原の再構成法および組成物 | |
AU2004213066A1 (en) | Idiotypic vaccine |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |