CZ302801B6

CZ302801B6 - Použití protilátky namírené proti antigenu bunecné membrány Ep-CAM pro výrobu farmaceutického prostredku

Info

Publication number: CZ302801B6
Application number: CZ20012581A
Authority: CZ
Inventors: Eckert@Helmut; Loibner@Hans
Original assignee: Igeneon Krebs-Immuntherapie Forschungs Und Entwicklungs-Ag
Priority date: 1999-01-13
Filing date: 2000-01-12
Publication date: 2011-11-16
Also published as: ATE219687T1; EP1230932A2; PL364747A1; ES2177509T3; AU768515B2; KR100771752B1; CN1344167A; JP4774551B2; PT1140168E; SI1140168T1; KR20010101446A; ATE286745T1; NO20013093L; EE200100366A; US8444974B2; US20070224202A1; EP1230932A3; HU226150B1; SI1230932T1; DK1140168T3

Abstract

Použití protilátky namírené proti antigenu bunecné membrány Ep-CAM pro výrobu farmaceutického prípravku k profylaktické nebo terapeutické vakcinaci proti nádorovým onemocnením, pricemž tento farmaceutický prípravek je k podávání s dávkou 0,01 až 4 mg protilátky. Prípadne je možno použít v kombinaci dve nebo více protilátek namírených proti ruzným epitopum membránového antigenu. Farmaceutický prípravek výhodne dále obsahuje alespon jedno vhodné vakcinacní adjuvans.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká použití protilátky namířené proti humánním antigenům buněčné membrány Ep-CAM pro výrobu farmaceutického přípravku k proťylaktické nebo terapeutické vakcinaci proti nádorovým onemocněním.

Dosavadní stav techniky

Od objevu technologie hybridomů je možné vytvářet monoklonální protilátky (MAB, „monoclonal antibodies“) proti nejrůznějším antigenům. Tato technologie, kterou lze obecně aplikovat na libovolný biologický problém, hraje také významnou úlohu ve výzkumu nádorových onemocnění (rakoviny). Během uplynulých dvaceti let byly připraveny MAB proti mnoha antigenům asociovaným s nádory (TAA, „tumor associated antigens“). TAA jsou struktury, které jsou exprimovány převážně na buněčné membráně nádorových buněk, a které tudíž umožňují diferenciaci maligní tkáně od ostatní tkáně. Tudíž jsou TAA považovány za cílové struktury z hlediska diagnostiky a případných terapeutických aplikací na základě specifických MAB nebo derivátů těchto protilátek.

Přímé terapeutické použití MAB, které jsou namířeny proti TAA, je založeno na pasivní imunoterapii, tzn. MAB nebo její derivát se u pacienta s nádorem aplikuje systémově v dostatečném množství, a léčebný účinek trvá jen tak dlouho, dokud je v těle dostatečně vysoká koncentrace. Biologický poločas takových léčivých přípravků je v závislosti na jejich struktuře, několik hodin až několik dnů. Podání přípravku se proto musí opakovat. Avšak když se použije xenogenní protilátka (např. myší MAB), vede to k nežádoucí imunitní reakci, která může vést k neutralizaci požadovaného léčebného účinku a k nebezpečným vedlejším účinkům (jako je např. anaíylaktický šok). Takže většina imunoterapeutických přípravků se může podávat pouze po omezenou dobu.

Další imunoterapeutický přístup pro léčení rakoviny je založen na selektivní aktivaci imunitního systému u pacientů s rakovinou, aby se usmrtily maligní buňky, kdy se užívá celá rada různých protinádorových vakcín. Tento přístup spočívá v tom, že se provádí vakcinace pomocí autologních nebo alogenních nádorových buněk, nebo pomocí autologních nebo alogenních nádorových buněk, které byly modifikovány chemicky nebo metodami genového inženýrství, nebo se provádí vakcinace pomocí izolovaných TAA nebo TAA, které byly připraveny chemicky nebo metodami genového inženýrství, nebo z nich odvozenými peptidy, a v poslední době také pomocí DNA kódujících TAA nebo z nich odvozené struktury. Alternativní metody vakcinace proti nádorovým onemocněním jsou založeny na použití anti-idiotypových protilátek. Vhodné anti—idiotypové protilátky imunologicky napodobují TAA. Jakožto xenogenní proteiny (např. myší nebo kozí protilátky) indukují po vakcinaci u člověka silnou imunitní reakci, na rozdíl od humánních nádorových antigenů, které lidský organismus rozpoznává jako vlastní a jsou zpravidla velmi málo imunogenní. Tudíž antiidiotypové protilátky mohou být použity pro vakcinaci jako imunogenní náhrada za nádorové antigeny.

Při aktivní imunoterapii, na rozdíl od pasivní imunoterapie pomocí protinádorových protilátek, jsou v principu pouze velmi malá množství vhodné vakcíny dostatečná k indukci imunity, která přetrvává měsíce a roky, a může být posílena novou vakcinaci, pokud zeslábne. Navíc aktivní imunoterapie dovoluje indukovat jak humorální tak i buněčnou imunitu, jejichž součinnost vede k účinné ochraně.

- 1 CZ 302801 B6

Lze tedy shrnout, že použití protilátek a jejich derivátů v protinádorové imunoterapii, jak bylo dosud v odborné literatuře popsáno, je v podstatě založeno na dvou principech, a sice:

a) pasivní terapie protilátkami namířenými proti TAA nebo deriváty těchto protilátek, a

b) aktivní imunizace (vakcinace) protilátkami nebo deriváty těchto protilátek, které jsou namířeny proti idiotypu protilátek majících specifitu proti TAA.

Při objevování, výzkumu a následné charakterizaci různých TAA se ukázalo, že mají důležitou funkci pokud jde o nádorové buňky. Umožňují degenerovaným buňkám, aby projevily vlastnosti maligního fenotypu, jako je např. zvýšená schopnost adheze, která je významná pro vznik metastáz. Avšak takové antigeny mohou být v určitých stadiích exprimovány na normálních buňkách, kde jsou zodpovědné za normální funkce těchto buněk. Bez nároku na úplnost jsou zde uvedeny příklady některých takových antigenů:

N-CAM (adhezivní molekula nervových buněk), který je často exprimován na nádorových buňkách nervového původu a ovlivňuje homofilní adhezi (viz J. Cell. Biol. 118, 1992, 937).

sacharidový antigen Lewis Y, vyskytující se na většině nádorů epiteliálního původu, hraje také významnou roli ve vývoji epitelových tkání u fétu. Bylo ukázáno, že exprese tohoto antigenů u plicních nádorů je asociována s nepříznivou prognózou, neboť Lewis Y pozitivní nádorové buňky mají zjevně vyšší potenciál tvořit metastázy (viz N. England J. Med. 327, 1992, 14).

- CEA (karcinoembryonální antigen), který se často vyskytuje na nádorech gastrointestinálního traktu epiteliálního původu a byl identifikován jako auto-adhezivní molekula (Cell 57, 1989, 327),

- Ep-CAM (adhezivní molekula epitelových buněk), který je exprimován téměř na všech nádorech epiteliálního původu, ale vyskytuje se také na velkém počtu normálních epitelů. Byl také charakterizován jako auto-adhezivní molekula (J. Cell Biol. 125, 1994, 437).

Technickým problémem, který řeší předkládaný vynález, je poskytnout další prostředky a způsoby, které dovolí účinnou profylaxi nebo terapii nádorových onemocnění. Řešení je popsáno v předkládaném vynálezu, přičemž tento vynález je definován připojenými patentovými nároky.

Podstata vynálezu

Podstatou předmětného vynálezu je použití protilátky namířené proti antigenů buněčné membrány Ep-CAM pro výrobu farmaceutického přípravku k profylaktické nebo terapeutické vakcinaci proti nádorovým onemocněním, přičemž tento farmaceutický přípravek je k podávání s dávkou 0,01 až 4 mg protilátky.

Ve výhodném provedení podle předmětného vynálezu uvedená protilátka pochází ze zvířete. Podle dalšího výhodného provedení je touto protilátkou monoklonální protilátka.

Výhodné je dále řešení, kdy protilátkou je myší monoklonální protilátka, přičemž variabilní úsek těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. I a variabilní úsek lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 2. Podle dalšího výhodného provedení má protilátka stejnou vazebnou specifitu jako protilátka definovaná výše v tomto odstavci.

Podle dalšího výhodného provedení podle předmětného vynálezu se použijí v kombinaci dvě nebo více protilátek namířených proti různým epitopům membránového antigenů.

Podle dalšího výhodného provedení podle předmětného vynálezu farmaceutický přípravek dále obsahuje alespoň jedno vhodné vakcinaění adjuvans.

Výhodně je tento farmaceutický přípravek podle předmětného vynálezu k podávání subkutánní, intradermální nebo intramuskulámí injekcí.

Vynález se tedy týká použití protilátek, které jsou namířeny proti humánním antigenům buněčné membrány, pro výrobu farmaceutického přípravku pro profylaktickou a/nebo terapeutickou vakcinaci proti nádorovým onemocněním. V tomto kontextu termín „antigeny buněčné membrány“ označuje struktury, které jsou přítomny na povrchu buněk, tedy na buněčné membráně. Patří sem zejména receptory, jako je například receptor transferrinu, a také další molekuly, jako je například Ε-cadherin nebo Ep-CAM. Ve výhodném provedení je antigen buněčné membrány antigen asociovaný s nádorem. V tomto kontextu termín „antigen asociovaný s nádorem“ označuje struktury, které jsou exprimovány převážně na buněčné membráně nádorových buněk a které tudíž umožňují diferenciaci maligní tkáně od ostatní tkáně. Výhodně je antigen asociovaný s nádorem lokalizovaným na membráně nebo v membráně nádorové buňky. To však nevylučuje možnost, že se takové antigeny nevyskytují na nedegenerovaných buňkách. Antigen asociovaný s nádorem může být například polypeptid, zejména glykosylovaný protein, nebo glykosylační profily polypeptidů. Další strukturou, která může také představovat antigen asociovaný s nádorem, jsou g lýko lipidy. Sem patří např. gangliosidy, jako je např. GM2. Kromě toho antigen asociovaný s nádorem může být také reprezentován změnami ve složení lipidů v buněčné membráně, které jsou pak charakteristické pro nádorové buňky.

K příkladům antigenů asociovaných s nádorem patří A-CAM, Lewis Y sacharidový antigen, CEA a Ep-CAM, které již byly zmíněny výše. Dalšími příklady jsou sacharidy Sialyl Tn, Globo H, gangliosidy jako je CD2/CD3/GM2, antigen specifický pro prostatu (PSA), CA125, CA 19—9, CA 15-3, TAG-72, receptor EGF, receptor Her2/neu, p97, CD20 a CD2L Monoklonální protilátky (MAB) proti všem těmto antigenům jsou dostupné. Další antigeny asociované s nádorem byly popsány např. v publikaci DeVita a kol. (Ed.) „Biological Therapy of Cancer“, 2. Vydání, 3. Kapitola: „Biology of Tumor Antigens“, Lippincot Company, ISBN 0-397-51416-6, 1995).

Termín „protilátka“ označuje protilátky všech možných typů, zejména polyklonální nebo monoklonální protilátky, ale také protilátky modifikované chemicky nebo metodami genového inženýrství. Metody přípravy takových molekul jsou odborníkovi známy. Způsob přípravy protilátky není sám o sobě podstatný. Důležitá je pouze vazebná specifita pro relevantní epitop antigenů buněčné membrány. Výhodné je použití monoklonálních protilátek, výhodně ze zvířat, a zejména myši. Zvláště výhodné je užití myší monoklonální protilátky HE-2, kterou lze připravit způsobem podle vynálezu, nebo protilátky, která má stejnou vazebnou specifitu jako HE-2. V kontextu předkládaného vynálezu termín „protilátka“ označuje také fragmenty a deriváty protilátky, pokud tyto fragmenty nebo deriváty rozeznávají TAA. Terapeuticky účinná imunitní reakce, která je vyvolána vakcinací vhodnými protilátkami proti TAA, je determinována vazebným úsekem těchto protilátek, tj. jejich idiotypem. Tudíž je v principu možné pro úspěšnou vakcinací užít místo intaktních protilátek také jejich fragmenty a deriváty, obsahující ídiotyp původní protilátky. K příkladům (aniž by na ně byl vynález omezen) patří fragmenty F(ab’)₂, F(ab’), Fv, které lze připravit buďto odborníkovi známými biochemickými metodami (enzymatické štěpení), nebo metodami genového inženýrství. Dalšími příklady jsou deriváty protilátek, které mohou být připraveny odborníkovi známými chemickými nebo biochemickými metodami nebo metodami genového inženýrství. Termín „derivát“ v kontextu předkládaného vynálezu označuje také produkty, které lze získat chemickou vazbou protilátek (protilátkových fragmentů) s molekulami, které zesilují imunitní reakci, jako je tetanový toxin, exotoxin z Pseudomonas, derivát lipidu A, GM-CSF, IL-2, nebo chemickým navázáním protilátek (protilátkových fragmentů) na lipidy, což vede k lepší inkorporaci do lipozomových přípravků. Termín „derivát“ zahrnuje také fuzní proteiny protilátek (protilátkových fragmentů), které byly připraveny odborníkovi známými metodami genového inženýrství, s polypeptidy, které zesilují imunitní reakci, jako je např. GSM-CSF,

-3 CZ 302801 B6

IL-2, IL-12, C3d apod. Podle vynálezu je možné aplikovat protilátky také ve vzájemných kombinacích. To znamená, že se mohou podávat např. dvě nebo tri protilátky, které rozpoznávají různé membránové antigeny nebo různé epitopy téhož membránového antigenu. Tyto různé protilátky se podávají současně (a to společně nebo odděleně) nebo postupně. Rakovinné buňky často exprimují současně několik TA A, proti kterým jsou protilátky již dostupné nebo mohou být připraveny, a ty se pak užijí k vakcinaci. K. dosažení zesíleného účinku nebo případně synergistického účinku při indukci imunitní reakce a pro minimalizaci potenciálního nebezpečí selekce antigenně-negativních variant, a aby bylo možné postihnout případnou heterogenitu nádorových buněk, je výhodné použít kombinaci alespoň dvou nebo více vhodných protilátek nebo jejich io fragmentů nebo derivátů pro simultánní vakcinaci.

V kontextu předkládaného vynálezu termín „vakcinace“ znamená aktivní imunizaci, tj. indukci specifické imunitní reakce v důsledku podání (např. subkutánním, intradermálním, intramuskulámím, případně i perorálním nebo nazálním způsobem) malého množství antigenu (tj. látky, kte15 rá je rozpoznána vakcinovaným jedincem jako cizorodá a tudíž je imunogenní) ve vhodném imunogenním přípravku. Antigen je tedy využit jako „spouštěč“ imunitního systému, aby vyvolal specifickou imunitní reakci systému proti antigenu. V principu potřebné množství antigenu může být velmi malé (některé vakcíny obsahují 5 až 10 μg antigenu v jedné dávce vakcíny).

Je vlastností aktivní imunizace, že křivky dávka-účinek jsou v širokém rozsahu jen velmi málo závislé na množství podaného antigenu. To znamená, že imunitní reakce je více méně identická v širokém rozpětí dávek. V důsledku toho v případě vakcinace požadovaný účinek, tj. indukce imunitní reakce, může být dosažen již pomocí velmi malého množství antigenu. Avšak srovnatelný účinek je dosažen také pomocí podstatně většího množství antigenu. Je samozřejmě žádoucí užít tak malé dávky jak je to možné, zejména kvůli vedlejším účinkům, a také vzhledem k ceně vakcíny atd„ což jsou důležité aspekty vakcinace.

Podle předkládaného vynálezu se vakcinace provádí buďto s léčebným cílem nebo s profýlaktickým cílem (jak je tomu u všech dosud užívaných antimikrobiálních vakcín). To znamená, že vak30 c i nací proti nádorovým onemocněním se podle vynálezu rozumí jak terapeutická tak i proíýlaktická aplikace vakcíny. Takže by případně bylo možné dosáhnout profylaktické ochrany proti vypuknutí rakovinného onemocnění vakcinaci jedince, který dosud rakovinou netrpí. K jedincům, u kterých by se proťylaktická vakcinace aplikovala, patří jedinci se zvýšeným rizikem rakoviny, avšak aplikace vakcíny není omezena pouze na tyto jedince.

Použití podle předkládaného vynálezu se podstatně liší od použití při základních terapeutických aplikacích protilátek k léčení rakoviny, které byly dosud známy a publikovány, a umožňuje neočekávaně účinné léčení.

Vazebný úsek protilátky proti TA A reprezentuje strukturně komplementární obraz vazebného epitopu příslušného TA A podle principu „zámku a klíče“. To znamená, že taková protilátka má ve svém idioty pu strukturní informaci epitopu TA A, proti kterému je namířena. Takže když je pacient s rakovinou očkován vhodnou imunogenní protilátkou proti TA A (např. myší MAB proti TAA), v pacientovi se vytvářejí protilátky, které jsou zčásti namířeny proti idiotypu protilátky použité jako vakcína a které strukturně napodobují epitop TAA podle principu „zámku a klíče“. To znamená, že v důsledku této vakcinace se u pacienta s rakovinou vytvářejí rozpustné varianty epitopu TAA, které mohou působit tak, že aktivně indukují autologní protilátky po dlouhé období, a titr těchto protilátek může být zvýšen opakováním vakcinace ve vhodných intervalech.

Ve výhodném provedení vynálezu je humánní antigen buněčné membrány struktura, která hraje roli v procesu adheze. V tomto kontextu procesy buněčné adheze jsou především interakce typu bunka-buňka. kterých se účastní ligandy a receptory na buněčném povrchu. Takže adhezivní molekuly jsou ligandy nebo receptory na buněčném povrchu, které se účastní v interakcích buňka-buňka. Podskupinu těchto adhezívních molekul tvoří auto-adhezivní molekuly. Tyto auto55 adhezivní molekuly mají schopnost vázat se samy na sebe.

-4 CZ 302801 B6

Fyziologické účinky imunitní reakce indukované vakcinací protilátkami namířenými proti TAA samozřejmě závisejí na funkci příslušných TAA. Jestliže TAA např. působí jako receptor umožňující adhezi nádorové buňky, zejména k ligandu na endotelové buňce cévního systému (tato schopnost je zásadní pro šíření nádorových buněk, kdy buňky vystupují z cévního systému, usazují se v tkáních a vytvářejí metastázy), pak schopnost adhezeje snížena vakcinací vhodnou protilátkou namířenou proti odpovídajícímu TAA, neboť indukované protilátky, které kompetují v interakci TAA s příslušným ligandem, jelikož v rozpustné formě napodobují TAA, jsou trvale přítomné v krevním oběhu a tkáních.

Obecně řečeno je možné, vzhledem k vysvětlení uvedenému výše, vakcinací vhodnou protilátkou proti TAA, který má funkci související s malignitou nádorové buňky, dosáhnout toho, že indukovaná imunitní reakce interferuje s TAA v interakci s jeho ligandem a tuto interakci narušuje nebo jí zabraňuje. To znamená, že nádorové buňky nemohou vůbec nebo nemohou dostatečně exprimovat vlastnosti, které jsou významné pro maligní fenotyp, což umožňuje zpomalit nebo zastavit rozvinutí nemoci a potlačit vývoj metastáz, zejména v časných stadiích.

V dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu je antigen buněčné membrány schopen auto-adheze, tj. jisté epitopy antigenu jsou zodpovědné za homofilní vazbu na stejný antigen na jiné buňce. K příkladům takových antigenů, kromě jiných, patří N-CAM (adhezivní molekula nervových buněk), CEA (karcinoembryonální antigen) a Ep-CAM (adhezivní molekula epitelových buněk). Protilátky namířené proti epitopům auto-adhezivních antigenů, které se podílejí na těchto funkcích, mohou obsahovat, jak již bylo popsáno výše, strukturní informaci komplementární k takovému epitopu. Vakcinací pomocí těchto protilátek je možné indukovat tvorbu protilátek, které mají auto-adhezivní schopnost ve vazebné reakci. To znamená, že tyto indukované protilátky se mohou vázat k auto- adheznímu antigenu, neboť v takovém případě ligand a receptor jsou identické. Takže je možné u pacientů s nádorovým onemocněním indukovat imunitní reakci vakcinací vhodnými protilátkami namířenými proti auto-adhezivním antigenům, kdy se takto indukované protilátky přímo vážou na nádorové buňky a tím vyvolávají různé terapeutické účinky. Na jedné straně schopnost auto-adheze, která je důležitá pro maligní buňky, je blokována, a na druhé straně, humánní efektorové funkce, jako je např. lýze závislá na komplementu a/nebo lýze v důsledku aktivace cytotoxických efektorových buněk, mohou být vyvolány navázáním indukované protilátky na nádorové buňky, což pak vede k destrukci nádorových buněk.

U pacientů s nádorovým onemocněním vakcinací užitím vhodných protilátek proti TAA může být pomocí všech výše uvedených mechanismů a účinků potlačeno vytváření nových metastáz a šíření nádorového onemocnění tak může být alespoň zpomaleno. V časném stadiu nemoci, např. po úspěšné operaci primárního nádoru (adjuvantní stadium), vakcinace zabrání tomu, aby se zbylé rozptýlené nádorové buňky usadily ve tkáních a založily metastázy. To umožňuje prodloužit dobu přežití bez relapsu nemoci a tudíž celkovou dobu života pacientů s nádorovým onemocněním. Případně by bylo možné dosáhnout vakcinací a opakovanou zesilovací vakcinací ve vhodných intervalech i celoživotní ochrany proti vytváření metastáz. Z tohoto hlediska se jeví jako zvláště zajímavé vakcinace pacientů s nádorovým onemocněním užitím protilátek namířených proti auto-adhezním TAA, neboť v takovém případě je možné dosáhnout zesíleného terapeutického účinku v důsledku dodatečného přímého napadení nádorových buněk indukovanou imunitní reakcí.

V dalším výhodném provedení vynálezu farmaceutický přípravek připravený podle vynálezu obsahuje kromě protilátky alespoň jedno adjuvans obecně užívané pro formulaci vakcín. Pomocí adjuvans je možné zesílit imunitní reakci. K příkladům adjuvans, aniž by však byl výčet omezující, patří např. hydroxid hlinitý (Alu-gel), deriváty lipopolysacharidů, Bacillus Calmette Guerin (BCG), lipozomové preparáty, formulace s dalším antigenem, proti kterému jíž dříve byla vyvolána silná imunitní reakce organismu, jako je např. tetanový toxin, exotoxin z Pseudomonas nebo některé složky chřipkového viru, volitelně formulované s lipozomy, biologická adjuvans jako je

- 5 CZ 302801 B6 např. faktor stimulující granulocyty makrofágy (GM-GSF), interleukín 2 (IL-2) nebo interferon gama (IFNy).

V jiném výhodném provedení farmaceutický přípravek připravený podle vynálezu je vhodný pro vakcinaci, kdy se podává v dávkách 0,01 až 4 mg protilátky, výhodně 0,5 mg protilátky.

Vakcinace se může provést jediným podáním výše uvedené dávky. Avšak výhodně se provádí opakovaným podáváním. Počet opakování je 1 až 12 za rok, výhodněji 4 až 8 za rok. Dávky zůstávají stálé nebo se snižují.

Podpůrná vakcinace (druhá a další) se provádí v pravidelných intervalech a v principu se může provádět doživotně. Vhodné intervaly jsou 6 až 24 měsíců a mohou být stanoveny na základě monitorování titru indukovaných protilátek (podpůrná vakcinace by měla být provedena jakmile titr indukovaných protilátek významně poklesne).

Podávání protilátek lze provádět způsoby, které jsou odborníkům známy. Výhodně jsou farmaceutické přípravky obsahující protilátky vhodné pro subkutánní, intradermální nebo intramuskulární podávání.

Předkládaný vynález se dále týká použití protilátek, které rozpoznávají antigen asociovaný s nádorem, pro vakcinaci proti nádorovému onemocnění a také léčení nádorového onemocnění vakcinací, kdy se pacientovi podává jedna nebo více protilátek rozpoznávajících TAA v množství dostatečném pro vakcinaci. Pro vlastní definici a výhodné provedení platí co bylo již uvedeno pro použití podle vynálezu.

Použití protilátek namířených proti TAA nebo jejich derivátů nebo fragmentů jakožto vakcíny se podstatně liší od známých použití takových anti-TAA protilátek pro pasivní imunoterapii. Některé podstatné výhody použití podle vynálezu ve srovnání s pasivní imunoterapii protilátkami jsou shrnuty dále:

Protilátky namířené proti TAA pro pasivní imunoterapii nádorových onemocnění:

- vysoké dávky (vyšší než 100 mg/intravenózní infúze)

- krátkodobý účinek vzhledem k eliminaci aktivní látky xenogenní protilátky jsou nežádoucí vzhledem k imunogenicitě trvání terapie je omezené, zvláště v případě xenogenních protilátek, vzhledem k indukci imunitní reakce a nebezpečí anaťylaktické reakce způsobené v případě opakovaných podání.

Protilátky namířené proti TAA pro proťylaktickou a/nebo terapeutickou vakcinaci proti nádorovým onemocněním:

nízké dávky (nižší než 1 mg/vakcinace, subkutánní, intradermální nebo intramuskulámí injekce) dlouhotrvající účinek přímo indukované imunitní reakce - xenogenní protilátky jsou žádoucí, neboť účinek je založen na imunogenicitě trvání léčení je neomezené (podpůrná vakcinace je vždy možná).

V následující části budou popsány pokusy, které ukazují, že vakcinace myší ΜΑΒ (HE2), která je namířena proti auto-adheznímu TAA Ep-CAM, nebo vakcinace s příslušným fragmentem F(ab’) vede přímo k indukci protilátek, které se selektivně váží na humánní nádorové buňky exprimující tento antigen. To ukazuje, avšak jen jako neomezující příklad, že imunitní reakce s terapeutickým

-6CZ 302801 B6 účinkem na nádorové onemocnění může být indukována vakcinací vhodnými protilátkami namířenými proti auto-adhezním TAA nebo deriváty těchto protilátek, které obsahují alespoň idiotyp výchozí protilátky.

Pro tento účel byla připravena myší monoklonální protilátka HE2 standardním postupem hybridomové technologie (viz H. Zola, „Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques“ CRC Press lne., ISBN 0-8493-6467-0, 1988). Myši Balb/c byly imunizovány buňkami humánního kolorektálního karcinomu standardním postupem. Buňky sleziny byly fúzovány s myší melanomovou linií P3X63Ag8 a byly selektovány hybridomy produkující protilátky, které selektivně váží humánní buňky kolorektálního karcinomu, ale neváží melanomové buňky. Nakonec byly selektovány hybridomy secemující protilátku IgG2a/kappa. Tato protilátka (HE2) se váže na EpCAM, jak lze ukázat např. pomocí Western blotu s preparátem membrán z humánních buněk KATO III karcinomu žaludku užitím známé protilátky anti-Ep-CAM (KS 1-4) pro srovnání. Aminokyselinové sekvence variabilních úseků ΜΑΒ HE2 jsou následující:

Těžký řetězec (sekvence id. č. 1):

QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNE KFKGKATLTADKS S STAYMQLS SLTS DDSAVYFCARDGPWEAYWGQGTLVTVSA

Lehký řetězec (sekvence id. č. 2):

NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENWTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRF

TGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIK

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje inhibici auto-adheze buněk malobuněčného karcinomu plic SW2 monoklonální protilátkou HE2 in vitro.

Obr. 2 ukazuje auto-adhezi buněk malobuněčného karcinomu plic SW2 bez vlivu monoklonální protilátky HE2 in vitro jako kontrolu k experimentu ukázaném na obr. 1,

Obr. 3 ukazuje indukci proti látkové imunitní reakce proti HE2 po vakcinaci koz F(ab’)₂ fragmentem protilátky HE2 stanovenou užitím ELIS A testu.

Obr. 4 ukazuje indukci proti látkové imunitní reakce proti Ep-CAM pozitivním humánním buňkám karcinomu žaludku (Kato III) po vakcinaci koz F(ab’)₂ fragmentem protilátky HE2 stanovenou užitím ELISA testu.

Obr. 5 ukazuje nepřítomnost proti látkové imunitní reakce proti Ep-CAM negativním humánním melanomovýrn buňkám (WM9) po vakcinaci koz F(ab’)2 fragmentem protilátky HE2 stanovenou užitím buněčného ELISA testu, který byl proveden jako kontrolní test k experimentu popsanému na obr. 4.

Obr. 6 ukazuje vazbu afinítně purifikované protilátkové frakce ze séra koz, které byly vakcinovány F(ab’)₂ fragmentem protilátky HE2, na Ep-CAM pozitivní humánní buňky karcinomu žaludku (Kato III) stanovenou užitím buněčného ELISA testu.

Obr. 7 ukazuje nepřítomnost vazby afinítně purifikované protilátkové frakce ze séra koz, které byly vakcinovány F(ab’)₂ fragmentem protilátky HE2, na Ep-CAM negativní humánní melano-7CZ 302801 B6 inové buňky (WM9), jak bylo stanoveno buněčným ELISA testem, který byl proveden jako kontrola k experimentu ukázaném na obr. 6.

Obr. 8 ukazuje indukci proti látkové imunitní reakce proti HE2 po vakcinaci makaků „rhesus“ 0,5 mg HE2 adsorbovanými na hydroxid hlinitý, stanovenou pomocí ELISA testu.

Obr. 9 ukazuje indukci proti látkové imunitní reakce proti Ep-CAM pozitivním humánním buňkám karcinomu žaludku (Kato III) po vakcinaci makaků „rhesus“ 0,5 mg HE2 adsorbovanými na hydroxid hlinitý, jak bylo stanoveno pomocí ELISA testu.

Obr. 10 ukazuje indukci protilátkové imunitní reakce proti HE2 detekovanou ve spojení se studií toxicity u makaků „rhesus“ po vakcinaci jedné skupiny makaků 0,5 mg HE2 adsorbované na hydroxid hlinitý, a současně ukazuje nepřítomnost protilátkové imunitní reakce proti HE2 po podání preparátu hydroxidu hlinitého bez protilátky (placebo), stanovené ELISA testem.

Obr. 11 ukazuje příklad indukce protilátkové imunitní reakce proti Ep-CAM pozitivním humánním buňkám karcinomu žaludku (Kato III) detekovanou ve spojení se studií toxicity u makaků „rhesus“ po vakcinaci HE2, stanovené ELISA testem.

Obr. 12 ukazuje příklad indukce protilátkové imunitní reakce proti Ep-CAM pozitivním humánním buňkám karcinomu žaludku (Kato III) po opakované vakcinaci pacientů trpících karcinomem střev 0,5 mg HE2 adsorbovanými na hydroxid hlinitý, jak bylo stanoveno ELISA testem.

Obr. 13 ukazuje indukci sérové toxicity proti Ep-CAM pozitivním humánním buňkám karcinomu žaludku (Kato III) po opakované vakcinaci pacientů trpících intestinálním karcinomem 0,5 mg HE2 adsorbovanými na hydroxid hlinitý, jak bylo stanoveno v experimentu buněčné lýze. Pro další ilustraci slouží následně uvedené příklady, které však vynález nijak neomezují.

Aby bylo možné ukázat, že myší ΜΑΒ HE2 se váže na epitop auto-adhezního antigenu EpCAM, který se účastní homoli lni vazby, byl zkoumán účinek HE2 na schopnost auto-adheze humánní buněčné linie SW2. Tyto buňky malobuněčného plicního karcinomu mají tendenci vytvářet buněčné shluky („clusters“) v kulturách in vitro několik hodin po vysetí. Popis takového experimentuje uveden v příkladu 1. Jak je patrné z obr. 1 a 2, vytváření buněčných shluků se do velké míry zabrání přidáním HE2. To prokazuje, že HE2 se váže na epitop Ep-CAM, který se účastní homofilní vazby tohoto membránového proteinu.

Aby bylo možné zkoumat přímou humorální imunitní reakci na vakcinaci F(ab’)₂ fragmentem myší protilátky HE2, byly tímto fragmentem imunizovány kozy. Potřebný protilátkový fragment byl připraven štěpením HE2 pepsi nem a purífíkací postupem, který je odborníkům známý. Imunizace koz je popsána v příkladu 2.

Nejprve bylo vyšetřeno na imunoglobuliny namířené proti ΜΑΒ HE2 imunosérum odebrané z koz a srovnáno s pre-sérem, aby bylo možné stanovit celkovou imunitní reakci vakcinovaných koz. Toto vyšetření bylo provedeno ELISA testem, jehož popis je uveden v příkladu 3. Výsledky tohoto experimentu jsou ukázány na obrázku 3: u koz se v důsledku vakcinace F(ab’)₂ fragmentem ΜΑΒ HE2 vyvinula silná imunitní reakce, zatímco v pre-séru nebyly nalezeny žádné protilátky proti HE2.

Dále bylo zkoumáno, zdaje možné v kozím imunoséru detekovat imunoglobuliny, které se váží a humánní rakovinné buňky exprimující TAA, proti kterým je ΜΑΒ HE2 namířena (Ep-CAM). Pro tento účel byla užita linie buněk karcinomu žaludku (Kato III). Jako kontrola byla testována vazba na buňky humánní buněčné linie, která neexprimuje Ep-CAM (melanomové buňky WM9). Toto vyšetření bylo provedeno buněčným ELISA testem, jehož popis je uveden v příkladu 4. Výsledky tohoto experimentu jsou ukázány na obrázku 4 a 5: kozí imunosérum obsahuje

-8CZ 302801 B6 imunoglobuliny, které se silně váží na Ep-CAM pozitivní KATO-buňky, zatímco k žádné vazbě nedochází s Ep-CAM negativními buňkami WM9. Pre-sérum neobsahuje žádné protilátky, které by se vázaly k těmto buňkám. Tyto velmi překvapující výsledky ukazují, že protilátky vytvořené po vakcinaci F(ab’)₂ fragmentem HE2 jsou skutečně schopné vázat se na buňky exprimující TAA rozpoznávané HE2. Tudíž funkce auto-adheze TAA byla přenesena na protilátky, které se vytvořily po vakcinaci HE2, jak bylo výše podrobně popsáno.

Pro dokázání toho, že protilátky tvořené v kozách po vakcinaci F(ab')₂ fragmentem protilátky HE2 namířené proti idiotypu MAB jsou skutečně ty, které se váží na buňky KATO, anti-idiotyio pový úsek těchto indukovaných protilátek byl specificky purifikován z kozího imunoséra sledem imunoafinitních chromatografii, v podstatě jak bylo popsáno v Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81,

1984, 216. Sled purifikačních krokuje přehledně popsán v příkladu 5.

Tyto afinitně purifikované kozí protilátky byly znovu testovány na jejich schopnost vazby na Ep15 CAM pozitivní KATO buňky a Ep-CAM negativní buňky WM9. Popis těchto pokusuje uveden v příkladu 6. Výsledky pokusů jsou ukázány na obr. 6 a 7: kozí IgG namířený proti idiotypu HE2, se váže silně na Ep-CAM pozitivní KATO buňky, zatímco nespecifický kozí IgG se váže jen velmi slabě. Vazba afinitně purifikovaného kozího IgG na Ep-CAM negativní buňky WM9 se však neliší od nespecifického kozího IgG. To dokazuje, že frakce protilátek, které se vyvinuly jako za důsledek vakcinace F(ab’)2 fragmentem HE2 a které jsou namířeny proti idiotypu této protilátky, obsahuje protilátky, které se váží na rakovinné buňky exprimující TAA rozpoznávané HE2. Tímto pokusem bylo také přesvědčivě dokázáno, že tyto protilátky proti Ep-CAM pozitivním buňkám indukované vakcinaci HE2 nejsou výsledkem kaskády dvojitě autologní idiotypové sítě, jak bylo předpokládáno v některých publikacích (viz např. Cancer Immunol. Immunother. 42,

1996, 81 - 87), jelikož anti-idiotypové protilátky (Ab3) vůbec nemohou být purifikovány afinitní chromatografii na Abl (= HE2) koloně, neboť podle idiotypové sítě nemohou vázat Abl, ale jen Ab2.

Vzhledem kvýše popsaným výsledkům imunizace koz F(ab’)₂ fragmentem protilátky HE2 byly jo provedeny také vakcinační studie s makaky „rhesus“, aby byly imunologické výsledky potvrzeny na biologickém druhu, který je blízce příbuzný člověku. Pro tyto pokusy byla jako imunogen použita kompletní myší monoklonální protilátka HE2. Předpokládalo se, že úsek Fc myší protilátky jakožto velký xenogenní protein by mohl zesílit imunitní reakci proti idiotypu (nosičovy efekt).

Aby se zabránilo možným lokálním vedlejším účinkům, byl použit hydroxid hlinitý jako mírné adjuvans. Příprava přípravků pro tyto vakcinační experimenty je popsána v příkladu 7.

Přípravek podle příkladu 7 byl injikován subkutánně do hřbetů makaků „rhesus*¹ (0,5 mg HE2 = 0,5 ml na jednu vakcinaci, podáno dvakrát v intervalu čtyř týdnů). V průběhu pokusu byla několikrát odebrána krev pro získání séra.

Nejdřív byla pomocí ELIS A testu stanovena imunitní reakce na HE2. Popis pokusu je uveden v příkladu 8. Jak je ukázáno na obr. 8, významný titr protilátek proti HE2 byl detekován již 29. den.

Dále se zkoumalo, zda jsou vakcinaci indukovány protilátky, které se váží na buňky KATO III. Pro tyto testy byla užita ELIS A. Popis pokusu je uveden v příkladu 9. Jak ukazuje obr. 9, protilátky vážící se na Ep-CAM pozitivní KATO III nádorové buňky byly u zvířat indukovány již 29. den.

Následně byla 4 zvířata vakcinována HE2 adsorbovanou na hydroxid hlinitý pro studii toxicity s makaky „rhesus“. 4 další zvířata dostala samotný hydroxid hlinitý jako placebo. Příprava použitých přípravků je popsána v příkladech 10 a 11. Makakové byli injikováni subkutánně do hřbetu čtyřikrát dávkou 0,5 ml přípravku (buďto účinná látka nebo placebo) (L, 15., 29. a 57. den). Pro získání séra byla odebrána krev před začátkem studie a v různých okamžicích v průběhu studie.

-9 CZ 302801 B6

Imunitní reakce na HE2 byla nejdříve stanovena pomocí ELISA. Popis experimentuje uveden v příkladu 8. Jak ukazuje obr. 10, u všech čtyř makaků ze skupiny HE2 se vyvinula významná humorální imunitní reakce proti HE2 již po jedné vakcinaci a byla dále zesílena po druhé vakcinaci, zatímco u makaků ze skupiny, která dostala placebo, nedošlo k žádnému zvýšení titru protilátek proti HE2.

Tato zjištění byla dále potvrzena imunoafinitní purifikací séra makaků ze skupiny HE2 43. den. Popis těchto pokusů je v příkladu 12. Jak ukazuje následující tabulka, u všech čtyř makaků se vyvinula silná IgG imunitní reakce proti HE2 (sekundární imunitní reakce) v séru 43. den, zatímco frakce IgM je srovnatelná s IgM frakcí pre-séra.

Makak	Den	pg/ml IgM	pg/ml IgG
9206m	-14	7,7	2,8
	43	16,3	135,2
9599m	-14	17,9	2,5
	43	25,4	449,3
8415f	-14	16,0	3,2
	43	22,5	159,9
9139f	-14	5,3	5,0
	43	10,3	69,8

Byla zkoumána také indukce protilátek proti Ep-CAM pozitivním buňkám KATO III. Pro tyto testy byla užita opět ELISA. Popis experimentuje uveden v příkladu 9. Jak ukazuje obr. 11, makakové ze skupiny HE2 již 29. den tvořili protilátky proti buňkám Kato III.

Vzhledem k výše uvedeným výsledkům vakcinace koz a makaků „rhesus“ byl také pacient trpící rakovinou střeva s metastázami (Dukes D) vakcinován ΜΑΒ HE2 adsorbovanou na hydroxid hlinitý. Příprava podávaného přípravku je popsána v příkladu 7. V souhrnu byl pacient injikován čtyřikrát (L, 50., 78. a 114. den) do paže s 0,5 ml přípravku podle příkladu 7 (což odpovídalo 0,5 mg HE2). Před každou vakcinaci a pak 128. den byla odebrána krev a získáno z ní sérum. Nejdříve se zkoumalo, zda byly vakcinaci indukovány protilátky, které se váží na buňky KATO III. Pro tyto testy byla použita buněčná ELISA. Popis experimentuje uveden v příkladu 9. Výsledky experimentů jsou ukázány na obr. 12. Vysoký titr protilátek vázajících se na buňky KATO III byl u tohoto pacienta s rakovinou zjevně indukován vakcinaci.

Dále bylo zkoumáno, zda protilátky indukované vakcinaci s HE2 zprostředkovávají cytotoxický účinek in vivo proti rakovinným buňkám KATO III. Pro tento účel byly buňky KATO III inkubovány s pre-sérem a imunosérem z pacienta s rakovinou, aby bylo možné demonstrovat na komplementu závislou lýzi zprostředkovanou indukovanými protilátkami. Popis experimentuje uveden v příkladu 13. Výsledky jsou ukázány na obr. 13. Protilátky indukované vakcinaci HE2 jsou zjevně schopné destrukce Ep-CAM pozitivních buněk KATO III prostřednictvím lýze závislé na komplementu v séru autologního pacienta.

Výše zmíněné experimenty jsou příklady toho, že vakcinace vhodnými protilátkami proti autoadhezivnímu TAA, jako je např. Ep- CAM. nebo jejich deriváty se stejným idiotypem jako má výchozí protilátka, spouštějí humorální imunitní reakci, která je selektivně vázaná na nádorové buňky exprimující autoadhezivnímu TAA. Indukované protilátky vykazují cytotoxický potenciál proti takovým nádorovým buňkám. Vakcinace takovými protilátkami v případě rakoviny pak vede k terapeutickému účinku.

- 10CZ 302801 B6

Příklady provedení vynálezu

Použitý materiál

Mikrotitrační destičky:

ImunoPlate F96 Maxisorp (NUNC) pro test ELISA,

Cell Culture Cluster (Costar, katalog, č. 3598) pro test buněčná ELISA.

Buněčné linie:

SW2: humánní malobuněčný plicní karcinom, Ep-CAM pozitivní,

KATO III: humánní karcinom žaludku, Ep-CAM pozitivní (ATCC HTB103), WM9: humánní melanom, Ep-CAM negativní.

Kondenzační pufr:	0,lMNaHCO₃ 0,5MNaCl pH 8,0
PurifikaČní pufr A:	PBS def. 0,2M NaCl pH 7,2
Purifikační pufr B:	0,lM glycin/HCl 0,2M NaCl pH 2,9
Médium A:	RPMI 1640 + 2 g/1 NaHCO₃ 100 U/ml penicilín G 100 gg/ml streptomycínsulfát 4mM glutamin 10% telecí fetální sérum, tepelně inaktivované
Vazebný pufr:	15mM Na₂CO₃ 35mM NaHCO₃ 3mM NaN, pH 9,6
PBS—def.:	138mM NaCl l,5mM KH₂PO₄ 2,7mM KC1 6,5mM Na₂HPO₄pH 7,2
Fixační roztok:	0,1% glutaraldehyd ve fyziologickém roztoku

-IICZ 302801 B6

Promývací pufr A:

Promývací pufr B: Blokovací pufr A:

Blokovací pufr B:

Ředicí pufr A:

Ředicí pufr B: Barvicí pufr:

Substrát:

Zastavovací roztok:

2% NaCI

0,2% Triton X-100 v PBS-def

0,05% Tween 20 v PBS-def

5% telecí fetální sérum, tepelně inaktivované v PBS-def

1% hovězí sérový albumin 0,l%NaN₃v PBS-def

2% telecí fetální sérum, tepelně inaktivované v PBS-def

PBS-def

24,3mM kyselina citrónová 51,4mM Na₂HPO₄pH 5,0 mg o-fenylendiamindihydrochlorid 100 ml barvicí pufr 20 μΐ H₂O₂ (30%)

4N H₂SO₄

Příklad 1

SW2 buňky kultivované in vitro byly centrifugovány a pelet byl resuspendován v médiu A na 7 x 10⁴ buněk/ml. V komůrkách LabTek bylo smíchání buďto 0,1 ml PBS-def s 0,3 ml buněčné suspenze nebo 0,1 ml PBS-def se 40 gg HE2 a pak s 0,3 ml suspenze (výsledná koncentrace HE2 je 100 pg/ml). Těsně před přidáním buněčné suspenze jakožto poslední složky byly buňky pipetou separovány. Bezprostředně po smíchání byla buněčná suspenze vyfotografována v inverzním mikroskopu (zvětšení lOOx). Pak byly buněčné suspenze kultivovány 4 hodiny ve 37 °C/5% CO₂a pak znovu vyfotografovány.

Příklad 2

Dvě kozy byly vakcinovány intradermálně na několika místech 1,5 mg fragmentu F(ab’)₂ ve 3 ml PBS-def se 3 ml Freundova úplného adjuvans (Difco). 8. den byla provedena první podpůrná vakcinace stejná jako původní vakcinace 1. den, ale v neúplném Freundově adjuvans (Difco). 29. den byla provedena druhá podpůrná vakcinace stejným způsobem, avšak bez adjuvans. Před zahájením vakcinace a pak 54. den byla odebrána krev pro získání séra na analýzu vývoje imunitní reakce.

- 12CZ 302801 B6

Příklad 3

ΙΟΟμΙ alikvoty ΜΑΒ HE2 (roztok lOmg/ml ve vazebném pufru) byly inkubovány v jamkách mikrotitrační destičky 1 hodinu při 37 °C. Po vypláchnutí destičky promývacím pufrem A šestkrát, bylo přidáno do každé jamky 200 μΐ blokovacího pufru A a destička byla inkubována 30 minut ve 37 °C. Po promytí destičky stejně jak bylo popsáno výše byly inkubovány 100μ1 alikvoty testovaného kozího séra v ředěních od 1:100 až 1:1 000 000 v ředicím pufru A 1 hodinu ve 37 °C. Po stejném promytí destičky jak bylo popsáno výše bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ protilátky králičí anti-kozí Ig konjugované s peroxidázou (Zymed) v ředění 1:1000 v ředicím pufru A a inkubováno 30 minut ve 37 °C, Destička pak byla promyta promývacím pufrem A čtyřikrát a pak dvakrát barvicím pufrem. Navázání protilátky bylo detekováno přidáním 100 μΐ specifického substrátu do každé jamky a barevná reakce byla zastavena po 10 minutách přidáním 50 μΐ zastavovacího roztoku. Vyhodnocení bylo provedeno měřením optické denzity (OD) při 490 nm (vlnová délka pro referenční měření je 620 nm).

Příklad 4

Mikrotitrační destičky byly inkubovány ve 4 °C přes noc se 100 μΐ testované buněčné suspenze v každé jamce o koncentraci 2 x 10⁶ buněk/ml v médiu A. Po odsátí supematantu byly destičky inkubovány s 50 μΐ fixačního roztoku v každé jamce 5 minut při teplotě místnosti. Po odsátí supematantu bylo do každé jamky přidáno 200 μΐ blokovacího pufru B a destička byla inkubována 1 hodinu ve 37 °C. Po dvojím promytí 200 μΐ promývacího pufru B byly 100μΙ alikvoty testovaného kozího séra inkubovány 1 hodinu ve 37 °C v ředěních 1:10 až 1:100 000 v ředicím pufru B. Po dvojím promytí 100 μΐ ledově vychlazeného promývacího pufru B bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ protilátky králičí anti-kozí íg konjugované s peroxidázou (Zymed) v ředění 1:1000 v ředicím pufru A a inkubováno 45 minut ve 37 °C. Destička pak byla promyta třikrát 100 μΐ ledově vychlazeného promývacího pufru B. Navázání protilátky bylo detekováno přidáním 100 μΐ specifického substrátu do každé jamky a barevná reakce byla zastavena po 10 minutách přidáním 50 μΐ zastavovacího roztoku. Vyhodnocení bylo provedeno měřením optické denzity (OD) při 490 nm (vlnová délka pro referenční měření je 620 nm).

Příklad 5

Použitá purifikace byla v podstatě popsána v Proč, Nati. Acad. Sci. USA 81, 216, 1984 a lze ji stručně shrnout následovně: v prvním kroku byla provedena purifikace celkového IgG obsaženého v kozím séru na iontoměničové koloně DEAE způsobem, který je odborníkovi znám. Pak byly kozí protilátky namířené proti konstantním úsekům F(ab’)₂ fragmentu protilátky HE2 navázány na imunoafinitní kolonu (CH-Sepharose 4B, Pharmacia), na kterou byl konjugován irelevantní myší IgG2a, zatímco frakce anti-idiotypových kozích protilátek se neváže na tuto kolonu. Takže v posledním kroku roztok prošlý uvedenou imunoafinitní kolonou byl vyvázán imunoafinitní kolonou (CH-Sepharose 4B, Pharmacia), na kterou byla konjugována HE2. Frakce specificky navázaná na tuto kolonu byla eluována pufrem spH2,8 (0,lM glycin/HCl) a neutralizována. Frakce kozího IgG takto získaná je namířena proti idiotypu HE2.

Příklad 6

Buněčný ELIS A test se v zásadě provádí stejným způsobem jak byl popsán v příkladu 4. Místo ředění séra však byly použity imunoafinitně purifikovaný kozí IgG a nespecificky purifikovaný kozí IgG v koncentracích 100 μg/ml až 0,031 μg/ml.

- 13CZ 302801 B6

Příklad 7

0,83 ml suspenze Alu-Gel (Alu-Gel S, Serva, 2% suspenze, stupeň čistoty: adjuvans pro přípravu vakcín) byla jemně třepána 1 hodinu při teplotě místnosti za sterilních podmínek s 0,5 ml roztoku HE2 v PBS o koncentraci 10 mg/ml a pH 5,5 společně s 3,67 ml PBS-def, (výsledná koncentrace HE2: 1 mg/ml, Alu-Gel S:0,33 %). Pak byla suspenze sterilně naplněna po 0,5ml alikvotech do injekčních lahviček.

io Příklad 8

Tato ELISA byla v zásadě provedena stejně jako v příkladu 3, s výjimkou toho, že pro detekcí navázaných protilátek makaků byl užit kozí anti-humánní Ig (Zymed) konjugovaný s peroxidázou. S tímto reagens byly protilátky u makaků detekovány stejným způsobem jako se detekují i5 lidské protilátky, neboť sekvenční homologie konstantních úseků protilátek člověka a makaka je přibližně 98 %.

Příklad 9

Tato buněčná ELISA byla v zásadě provedena stejně jako v příkladu 4, s výjimkou toho, že pro detekci na buňky navázaných protilátek makaků (nebo humánních protilátek) byl užit kozí antihumánní Ig (Zymed) konjugovaný s peroxidázou. Jako kontrola byl užit kozí anti-myší Ig (Zymed) konjugovaný s peroxidázou pro detekci myší HE2.

Příklad 10

3,5 ml roztoku HE2 (10 mg/ml v PBS-def., pH 5,5) bylo smícháno ve sterilních podmínkách 30 s 0,35 ml vodného roztoku thimerosalu (10 mg/ml, Sigma) a s 27,25 ml fyziologického roztoku a bylo přidáno k 3,9 ml suspenze hydroxidu hlinitého (3% ve vodě, Alhydrogel, Superfos Biosector, Dánsko) za jemného třepání. 0,6 ml suspenze získané tímto způsobem pak bylo za sterilních podmínek naplněno do apyrogenních skleněných zkumavek, které byly uzavřeny gumovou zátkou s hliníkovou Čepičkou.

Příklad 11

Placebo přípravek byl připraven stejným způsobem jako v příkladu 10, s výjimkou toho, že místo 40 roztoku protilátky bylo užito 0,35 ml fyziologického roztoku NaCI a místo roztoku thimerosalu bylo užito 0,35 ml PBS-def pH 5,5.

Příklad 12 g CH-Sepharose 4B (Pharmacia) bylo resuspendováno ve 30 ml 1M HC1 po 15 minut. Gel byl pak promyt na fritě AG3 užitím 1 1 lmM HC1 a pak 200 ml kondenzačního pufru. 10 mg HE2 (zásobní roztok 10 mg/ml) bylo dialyzováno proti 0,5 1 kondenzačního pufru. Roztok byl pak smíchán s gelovou suspenzí v uzavřené nádobě. Při poměru gel·.rozpouštědlo 1:2 vznikla suspen50 ze vhodná pro kondenzaci. Suspenze byla třepána 5,5 hodiny při teplotě místnosti. Pak byl nadbytek ligandu odstraněn promytím 3 x 30 ml kondenzačního pufru. Zbylé reakční skupiny byly blokovány 1 hodinovou inkubací s 1M ethanolaminem při teplotě místnosti. Gel byl pak při teplotě místnosti třepán 1 hodinu s 0,lM Tris-HCI pufrem s pH 8. Nakonec byl gel ve třech cyklech promyt pufrem s měnícím se pH. Každý cyklus se skládal zOJM acetátového pufru s pH 4 s 0,5M NaCI, poté 0,1M Tris-HCI, pH 8,0 s 0,5M NaCI, Gel byl udržován na 4 °C.

- 14CZ 302801 B6

Imunoafinitní purifikace frakce protilátek namířených proti HE2 ze séra makaků „rhesus“ se prováděla následujícím postupem: Imunoafinitní purifikace byla provedena na FPLC systému (Pharmacia). 1 ml gelu získaného výše popsaným postupem byl nanesen na kolonu Pharmacia HR5/5. 0,5 ml séra bylo naředěno 1:10 purifikačním pufrem A. Roztok byl pumpován přes kolonu při průtoku 1 ml/minuta a pak byla kolona promývána purifikačním pufrem A dokud detektor neindikoval opět dosažení základní UV linie (280 nm). Navázané imunoglobuliny pak byly eluovány purifikačním pufrem B a frakce byla po desorpci bezprostředně neutralizována přidáním 0,5M Na₂HPO₄ a 0,02% NaN₃. 50 μΐ protilátkové frakce izolované tímto způsobem bylo analyzováno na dělicí koloně (SEC, Žorbax 250 GF) a byly kvantifikovány podíly IgG a IgM. Na SEC koloně byl užit jako eluent 220mM fosfátový pufr s pH 7 + 10% acetonitril. Humánní IgG a IgM byly použity jako standardy na SEC a byly chromatografovány v několika koncentracích pro stanovení kalibračních křivek (plocha pod vrcholem proti koncentraci). Výpočty koncentrací IgG a IgM ve frakci afinitně purifikovaných protilátek z makaků „rhesus“ byly provedeny lineární regresí na základě kalibračních křivek. Koncentrace jsou pak uvedeny v pg/ml séra makaků.

Příklad 13

Den před provedením testů byly buňky KATO III přeneseny do čerstvého média A a udržovány při 37 °C a 5% CO₂ v kultivačních lahvích. Následující den byly buňky nejdříve označeny pomocí ⁵¹Cr. 5x10⁶ buněk bylo inkubováno v 800 μΐ média A při 37 °C a 5% CO2 ještě s 100 pCi Na2^5lCrO4. Pak byly buňky propláchnuty médiem A a koncentrace byla upravena na 2,5x10⁵buněk/ml. 100μ1 alikvoty této suspenze byly pipeto vány do jamek mikrotitrační destičky. Pak bylo přidáno 100 μΐ testovaného séra z pacientů a inkubovalo se 3 hodiny při 37 °C a 5% CO₂(séra byla uložena při -80 °C a byla rozmražena pouze jedenkrát pro tento test, aby se zabránilo ztrátě aktivity komplementu). Supematanty byly získány pomocí lisu Skatron a pak byly změřeny na gama-počítači. Byla tak získána hodnota „experimentálního výdeje“. Pro stanovení hodnoty „celkového výdeje“ byly buňky ošetřeny stejně jak bylo popsáno, avšak sérum bylo nahrazeno roztokem 2% SDS, 50mM Na₂CO₃ a lOmM EDTA. Hodnoty „spontánního výdeje“ byly získány tak, že se sérum nahradilo médiem A. Výsledek byl vypočten následovně:

% lýze = 100 x (experimentální výdej - spontánní výdej)/(celkový výdej - spontánní výdej).

Test byl proveden celkem 3x a jednotlivé výsledky jsou uvedeny jako průměrné hodnoty a směrodatná odchylka.

SEZNAM SEKVENCÍ <160>2 < 170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1

-15CZ 302801 B6

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Leu Ile Glu Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Gly Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110

Thr Val Ser Ala 115 <210>2 <211> 107 <212>PRT <213> Mus musculus <400> 2

Claims

1. Použití protilátky namířené proti antigenu buněčné membrány Ep-CAM pro výrobu farmato ceutického přípravku k profylaktické nebo terapeutické vakcinací proti nádorovým onemocněním, přičemž tento farmaceutický přípravek je k podávání s dávkou 0,01 až 4 mg protilátky.

2. Použití podle nároku 1, při kterém protilátka pochází ze zvířete.

15

3. Použití podle nároku 1 nebo 2, při kterém je protilátkou monoklonální protilátka.

4. Použití podle nároku 3, při kterém je protilátkou myší monoklonální protilátka, přičemž variabilní úsek těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 a variabilní úsek lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekven20 ce id. č. 2.

5. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, při kterém má protilátka stejnou vazebnou spécifitu jako protilátka definovaná v nároku 4.

25

6. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, při kterém se užijí v kombinaci dvě nebo více protilátek namířených proti různým epitopům membránového antigenu.

- 17CZ 302801 B6

7. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, při kterém farmaceutický přípravek dále obsa huje alespoň jedno vhodné vakcinační adjuvans.

5 8. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, při kterém farmaceutický přípravek je k podává ní subkutánní, intradermální nebo intramuskulámí injekcí.