SK286627B6

SK286627B6 - Použitie protilátok na vakcináciu proti nádorovýmochoreniam

Info

Publication number: SK286627B6
Application number: SK964-2001A
Authority: SK
Inventors: Helmut Eckert; Hans Loibner
Original assignee: Igeneon Krebs-Immuntherapie Forschungs- Und Entwicklungs-Ag
Priority date: 1999-01-13
Filing date: 2000-01-12
Publication date: 2009-02-05
Also published as: ATE219687T1; EP1230932A2; PL364747A1; ES2177509T3; CZ302801B6; AU768515B2; KR100771752B1; CN1344167A; JP4774551B2; PT1140168E; SI1140168T1; KR20010101446A; ATE286745T1; NO20013093L; EE200100366A; US8444974B2; US20070224202A1; EP1230932A3; HU226150B1; SI1230932T1

Abstract

Je opísané použitie protilátok, ktoré sú namierené proti humánnym antigénom bunkovej membrány, na výrobu farmaceutického prípravku na vakcináciu proti nádorovým ochoreniam.

Description

Oblasť techniky

Predpokladaný vynález sa týka použitia protilátok, ktoré sú namierené proti humánnym antigénom bunkovej membrány, na výrobu farmaceutického prípravku na vakcináciu proti nádorovým chorobám.

Doterajší stav techniky

Od objavu technológie hybridómov je možné vytvárať monoklonálne protilátky (MAB, „monoclonal antibodies“) proti najrôznejším antigénom. Táto technológia, ktorú možno všeobecne aplikovať na ľubovoľný biologický problém, má tiež významnú úlohu vo výskume nádorových ochorení (rakoviny). Počas uplynulých dvadsiatich rokov boli pripravené MAB proti mnohým antigénom asociovaným s nádormi (TAA, „tumor associated antigens“). TAA sú štruktúry, ktoré sú exprimované prevažne na bunkovej membráne nádorových buniek, a ktoré preto umožňujú diferenciáciu malígneho tkaniva od ostatného tkaniva. Preto sú TAA považované za cieľové štruktúry z hľadiska diagnostiky a prípadných terapeutických aplikácií na základe špecifických MAB alebo derivátov týchto protilátok.

Priame terapeutické použitie MAB, ktoré sú namierené proti TAA, je založené na pasívnej imunoterapii, t. j. MAB alebo jej derivát sa u pacienta s nádorom aplikuje systémovo v dostatočnom množstve, a liečebný účinok trvá len tak dlho, dokiaľ je v tele dostatočne vysoká koncentrácia. Biologický polčas takýchto liečivých prípravkov je v závislosti od ich štruktúry niekoľko hodín až niekoľko dní. Podanie prípravku sa preto musí opakovať. Ale keď sa použije xenogénna protilátka (napr. myšia MAB), vedie to k nežiaducej imunitnej reakcii, ktorá môže viesť k neutralizácii požadovaného liečebného účinku a k nebezpečným vedľajším účinkom (ako je napr. anafylaktický šok). Takže väčšina imunoterapeutických prípravkov sa môže podávať iba obmedzený čas.

Ďalší imunoterapeutický prístup pri liečení rakoviny je založený na selektívnej aktivácii imunitného systému u pacientov s rakovinou, aby sa usmrtili malígne bunky, kedy sa používa celý rad rôznych protinádorových vakcín. Tento prístup spočíva v tom, že sa uskutočňuje vakcinácia pomocou autológnych alebo alogénnych nádorových buniek, ktoré boli modifikované chemicky alebo metódami génového inžinierstva, alebo sa uskutočňuje vakcinácia pomocou izolovaných TAA alebo TAA, ktoré boli pripravené chemicky alebo metódami génového inžinierstva, alebo z nich odvodenými peptidmi, a v poslednej dobe tiež pomocou DNA kódujúcej TAA alebo z nej odvodených štruktúr. Alternatívne metódy vakcinácie proti nádorovým ochoreniam sú založené na použití anti-idiotypových protilátok. Vhodne anti-idiotypové protilátky imunologický napodobňujú TAA. Ako xenogénne proteíny (napr. myšie alebo kozie protilátky) indukujú po vakcinácii u človeka silnú imunitnú reakciu, na rozdiel od humánnych nádorových antigénov, ktoré ľudský organizmus rozpoznáva ako vlastné a sú spravidla veľmi málo imunogénne. Preto anti-idiotypové protilátky môžu byť použité na vakcináciu ako imunogénna náhrada za nádorové antigény.

Pri aktívnej imunoterapii, na rozdiel od pasívnej imunoterapie pomocou protinádorových protilátok, iba veľmi malé množstvá vhodnej vakcíny sú v princípe dostatočné na indukciu imunity, ktorá pretrváva mesiace a roky, a môže byť posilnená novou vakcináciou, pokiaľ zoslabne. Navyše aktívna imunoterapia dovoľuje indukovať tak humorálnu ako i bunkovú imunitu, ktorých súčinnosť vedie k účinnej ochrane.

Možno teda zhrnúť, že použitie protilátok a ich derivátov v protinádorovej imunoterapii, ako bolo dosiaľ v odbornej literatúre opísané, je v podstate založené na dvoch princípoch, a síce:

a) pasívna terapia protilátkami namierenými proti TAA alebo derivátmi týchto protilátok a

b) aktívna imunizácia (vakcinácia) protilátkami alebo derivátmi týchto protilátok, ktoré sú namierené proti idiotypu protilátok majúcich špecifitu proti TAA.

Pri objavovaní, výskume a následnej charakterizácii rôznych TAA sa ukázalo, že majú dôležitú funkciu pokiaľ ide o nádorové bunky. Umožňujú degenerovaným bunkám, aby prejavili vlastnosti malígneho fenotypu, ako je napr. zvýšená schopnosť adhézie, ktorá je významná pre vznik metastáz. Ale takéto antigény môžu byť v určitých štádiách exprimované na normálnych bunkách, kde sú zodpovedné za normálne funkcie týchto buniek. Bez nároku na úplnosť sú tu uvedené príklady niektorých takýchto antigénov:

- N-CAM (adhezivna molekula nervových buniek), ktorý je často exprimovaný na nádorových bunkách nervového pôvodu a ovplyvňuje homofilnú adhéziu (pozri J. Celí. Biol. 118, 1992, 937).

- Sacharidový antigén Lcwis Y, vyskytujúci sa na väčšine nádorov epiteliálneho pôvodu, má tiež významnú úlohu vo vývoji epitelových tkanív féta. Bolo ukázané, že expresia tohto antigénu pri pľúcnych nádoroch je asociovaná s nepriaznivou prognózou, lebo Lewis Y pozitívne nádorové bunky majú zjavne vyšší potenciál tvoriť metastázy (pozri N. England J. Med. 327, 1992, 14).

- CEA (karcinoembryonálny antigén), ktorý sa často vyskytuje na nádoroch gastrointestinálneho traktu epiteliálneho pôvodu a bol identifikovaný ako autoadhezívna molekula (Celí 57, 1989, 327).

- Ep-CAM (adhezivna molekula epitelových buniek), ktorý je exprimovaný takmer na všetkých nádoroch epiteliálneho pôvodu, ale vyskytuje sa tiež na veľkom počte normálnych epitelov. Bol tiež charakterizovaný ako autoadhezívna molekula (J. Celí. Biol. 125,1994, 437).

Technickým problémom, ktorý rieši predkladaný vynález, je poskytnúť ďalšie prostriedky a spôsoby, ktoré dovolia účinnú profylaxiu alebo terapiu nádorových ochorení. Riešenie je opísané v predkladanej prihláške a vynález je definovaný pripojenými patentovými nárokmi.

Podstata vynálezu

Vynález sa týka použitia protilátok, ktoré sú namierené proti humánnym antigénom bunkovej membrány, na výrobu farmaceutického prípravku pre profylaktickú a/alebo terapeutickú vakcináciu proti nádorovým ochoreniam. V tomto kontexte termín „antigény bunkovej membrány“ označuje štruktúry, ktoré sú prítomné na povrchu buniek, teda na bunkovej membráne. Patria sem najmä receptory, ako je napr. receptor transferínu, a tiež ďalšie molekuly, ako je napr. E-cadherín alebo Ep-CAM. Vo výhodnom uskutočnení je antigén bunkovej membrány antigén asociovaný s nádorom. V tomto kontexte termín „antigén asociovaný s nádorom“ označuje štruktúry, ktoré sú exprimované prevažne na bunkovej membráne nádorových buniek, a ktoré preto umožňujú diferenciáciu malígneho tkaniva od ostatného tkaniva. Výhodne je antigén asociovaný s nádorom lokalizovaný na membráne alebo v membráne nádorovej bunky. To však nevylučuje možnosť, že sa takéto antigény nevyskytujú na nedegenerovaných bunkách. Antigén asociovaný s nádorom môže byť napr. polypeptid, najmä glykozylovaný proteín, alebo glykozylačné profily polypeptidov. Ďalšou štruktúrou, ktorá môže tiež predstavovať antigén asociovaný s nádorom, sú glykolipidy. Sem patria napr. gangliozidy, ako je napr. GM2. Okrem toho antigén asociovaný s nádorom môže byť tiež reprezentovaný zmenami v zložení lipidov v bunkovej membráne, ktoré sú potom charakteristické pre nádorové bunky.

K príkladom antigénov asociovaných s nádorom patria A-CAM, Lewis Y sacharidový antigén, CEA a Ep-CAM, ktoré už boli spomínané. Ďalšími príkladmi sú sacharidy Sialyl Tn, Globo H, gangliozidy, ako je CD2/CD3/GM2, antigén špecifický pre prostatu (PSA), CA125, CA 19-9, CA 15-3, TAG-72, receptor EGF, receptor Her2/neu, p97, CD20 a CD21. Monoklonálne protilátky (MAB) proti všetkým týmto antigénom sú dostupné. Ďalšie antigény asociované s nádorom boli opísané napr. v publikácii DeVita a kol. (Ed.) „Biological Therapy of Cancer“, 2. Vydanie, 3. Kapitola: „Biology of Tumor Antigens“, Lippincot Company, ISBN 0-397-51416-6, 1995).

Termín „protilátka“ označuje protilátky všetkých možných typov, najmä polyklonálne alebo monoklonálne protilátky, ale tiež protilátky modifikované chemicky alebo metódami génového inžinierstva. Metódy prípravy takýchto molekúl sú odborníkovi známe. Spôsob prípravy protilátky nie je podstatný. Dôležitá je iba väzbová špecifita pre relevantný epitop antigénu bunkovej membrány. Výhodné je použitie monoklonálnych protilátok, výhodne zo zvierat, a najmä myší. Zvlášť výhodné je použitie myšej monoklonálnej protilátky HE-2, ktorú možno pripraviť spôsobom podľa vynálezu, alebo protilátky, ktorá má rovnakú väzbovú špecifitu ako HE-2. V kontexte predkladaného vynálezu termín „protilátka“ označuje tiež fragmenty a deriváty protilátky, pokiaľ tieto fragmenty alebo deriváty rozoznávajú TAA. Terapeuticky účinná imunitná reakcia, ktorá je vyvolávaná vakcináciou vhodnými protilátkami proti TAA, je determinovaná väzbovým úsekom týchto protilátok, t. j. ich idiotypom. Preto je v princípe možné na úspešnú vakcináciu použiť miesto intaktných protilátok tiež ich fragmenty a deriváty, obsahujúce idiotyp pôvodnej protilátky. K príkladom (bez toho aby na ne bol vynález obmedzený) patria fragmenty F(ab')₂, F(ab'), Fv, ktoré možno pripraviť buď odborníkovi známymi biochemickými metódami (enzymatické štiepenie), alebo metódami génového inžinierstva. Ďalšími príkladmi sú deriváty protilátok, ktoré môžu byť pripravené odborníkovi známymi chemickými alebo biochemickými metódami alebo metódami génového inžinierstva. Termín „derivát“ v kontexte predkladaného vynálezu označuje tiež produkty, ktoré možno získať chemickou väzbou protilátok (protilátkových fragmentov) s molekulami, ktoré zosilňujú imunitnú reakciu, ako je tetanový toxín, exotoxín z Pseudomonas, derivát lipidu A, GM-CSF, IL-2, alebo chemickým naviazaním protilátok (protilátkových fragmentov) na lipidy, čo vedie k lepšej mkorporácii do lipozómových prípravkov. Termín „derivát“ zahŕňa tiež fuzne proteíny protilátok (protilátkových fragmentov), ktoré boli pripravené odborníkovi známymi metódami génového inžinierstva, s polypeptidmi, ktoré zosilňujú imunitnú reakciu, ako je napr. GSM-CSF, IL-2, IL-12, C3d a pod. Podľa vynálezu je možné aplikovať protilátky tiež vo vzájomných kombináciách. To znamená, že sa môžu podávať napr. dve alebo tri protilátky, ktoré rozpoznávajú rôzne membránové antigény alebo rôzne epitopy toho istého membránového antigénu. Tieto rôzne protilátky sa podávajú súčasne (a to spoločne alebo oddelene) alebo postupne. Rakovinové bunky často exprimujú súčasne niekoľko TAA, proti ktorým sú protilátky už dostupné alebo môžu byť pripravené, a tie sa potom použijú pri vakcinácii. Na dosiahnutie zosilneného účinku alebo prípadne synergistického účinku pri indukcii imunitnej reakcie a na minimalizáciu potenciálneho nebezpečia selekcie antigénne-negatívnych variantov, a aby bolo možné postihnúť prípadnú heterogenitu nádorových buniek, je výhodné použiť kombináciu aspoň dvoch alebo viac vhodných protilátok alebo ich fragmentov, alebo derivátov na simultánnu vakcináciu.

V kontexte predkladaného vynálezu termín „vakcinácia“ znamená aktívnu imunizáciu, t. j. indukciu špecifickej imunitnej reakcie v dôsledku podania (napr. subkutánnym, intradermálnym, intramuskulámym, prípadne i perorálnym alebo nazálnym spôsobom) malého množstva antigénu (t. j. látky, ktorá je rozpoznaná vakcinovaným j edincom ako cudzorodá, a preto j e imunogénna) vo vhodnom imunogénnom prípravku. Antigén je teda využitý ako „spúšťač“ imunitného systému, aby vyvolal špecifickú imunitnú reakciu systému proti antigénu. V princípe potrebné množstvo antigénu môže byť veľmi malé (niektoré vakcíny obsahujú 5 až 10 pg antigénu v jednej dávke vakcíny).

Je vlastnosťou aktívnej imunizácie, že krivky dávka - účinok sú v širokom rozsahu len veľmi málo závislé od množstva podaného antigénu. To znamená, že imunitná reakcia je viac menej identická v širokom rozpätí dávok. V dôsledku toho v prípade vakcinácie požadovaný účinok, t. j. indukcia imunitnej reakcie, môže byť dosiahnutý už pomocou veľmi malého množstva antigénu. Ale porovnateľný účinok je dosiahnutý tiež pomocou podstatne väčšieho množstva antigénu. Je samozrejme žiaduce použiť tak malé dávky, ako je to možné, najmä kvôli vedľajším účinkom, a tiež vzhľadom na cenu vakcíny atď., čo sú dôležité aspekty vakcinácie.

Podľa predkladaného vynálezu sa vakcinácia uskutočňuje buď s liečebným cieľom, alebo s profylaktickým cieľom (ako je to pri všetkých dosiaľ užívaných antimikrobiálnych vakcín). To znamená, že vakcináciou proti nádorovým ochoreniam sa podľa vynálezu rozumie tak terapeutická ako i profylaktická aplikácia vakcíny. Takže by prípadne bolo možné dosiahnuť profylaktickú ochranu proti vypuknutiu rakovinového ochorenia vakcináciou jedinca, ktorý dosiaľ rakovinou netrpí. K jedincom, na ktorých by sa profylaktická vakcinácia aplikovala, patria jedinci so zvýšeným rizikom rakoviny, ale aplikácia vakcíny nie je obmedzená iba na tieto jedince.

Použitie podľa predkladaného vynálezu sa podstatne líši od použitia pri základných terapeutických aplikáciách protilátok na liečenie rakoviny, ktoré boli dosiaľ známe a publikované, a umožňujú neočakávane účinné liečenie.

Väzbový úsek protilátky proti TAA reprezentuje štruktúrne komplementárny obraz väzbového epitopu príslušného TAA podľa princípu „zámku a kľúča“. To znamená, že takáto protilátka má vo svojom idiotype štruktúrnu informáciu epitopu TAA, proti ktorému je namierená. Takže keď je pacient s rakovinou očkovaný vhodnou imunogénnou protilátkou proti TAA (napr. myšou MAB proti TAA), v pacientovi sa vytvárajú protilátky, ktoré sú sčasti namierené proti idiotypu protilátky použitej ako vakcína, a ktoré štruktúrne napodobňujú epitop TAA podľa princípu „zámku a kľúča“. To znamená, že v dôsledku tejto vakcinácie sa u pacienta s rakovinou vytvárajú rozpustné varianty epitopu TAA, ktoré môžu pôsobiť tak, že aktívne indukujú autológne protilátky v priebehu dlhého obdobia, a titer týchto protilátok môže byť zvýšený opakovaním vakcinácie vo vhodných intervaloch.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je humánny antigén bunkovej membrány štruktúra, ktorá má úlohu v adhéznych procesoch. V tomto kontexte procesy bunkovej adhézie sú predovšetkým interakcie typu bunka-bunka, ktorých sa zúčastňujú ligandy a receptory na bunkovom povrchu. Takže adhezívne molekuly sú ligandy alebo receptory na bunkovom povrchu, ktoré sa zúčastňujú interakcií bunka-bunka. Podskupinu týchto adhezívnych molekúl tvoria auto-adhezívne molekuly. Tieto auto-adhezívne majú schopnosť viazať sa samy na seba.

Fyziologické účinky imunitnej reakcie indukovanej vakcináciou protilátkami namierenými proti TAA samozrejme závisia od funkcii príslušných TAA. Ak TAA napr. pôsobí ako receptor umožňujúci adhéziu nádorovej bunky, najmä k ligandu na endotelovej bunke cievneho systému (táto schopnosť je zásadná pre šírenie nádorových buniek, kedy bunky vystupujú z cievneho systému, usadzujú sa v tkanivách a vytvárajú metastázy), potom schopnosť adhézie je znížená vakcináciou vhodnou protilátkou namierenou proti zodpovedajúcemu TAA, lebo indukované protilátky, ktoré kompetujú v interakcii TAA s príslušným ligandom, pretože v rozpustnej forme napodobňujú TAA, sú trvalo prítomné v krvnom obehu a tkanivách.

Všeobecne povedané je možné, vzhľadom na uvedené vysvetlenie , vakcináciou vhodnou protilátkou proti TAA, ktorý má funkciu súvisiacu s malignitou nádorovej bunky, dosiahnuť to, že indukovaná imunitná reakcia interferuje s TAA v interakcii s jeho ligandom a túto interakciu narúša alebo jej bráni. To znamená, že nádorové bunky nemôžu vôbec alebo nemôžu dostatočne exprimovať vlastnosti, ktoré sú významné pre malígny fenotyp, čo umožňuje spomaliť alebo zastaviť rozvinutie choroby a potlačiť vývoj metastáz, najmä v raných štádiách.

V ďalšom výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu je antigén bunkovej membrány schopný autoadhézie, t. j. isté epitopy antigénu sú zodpovedné za homofilnú väzbu na rovnaký antigén na inej bunke. K príkladom takýchto antigénov, okrem iných, patrí N-CAM (adhezívna molekula nervových buniek), CEA (karcinoembryonálny antigén) a Ep-CAM (adhezívna molekula epitelových buniek). Protilátky namierené proti epitopom auto-adhezívnych antigénov, ktoré sa podieľajú na týchto funkciách, môžu obsahovať, ako už bolo opísané, štruktúrnu informáciu komplementárnu k takémuto epitopu. Vakcináciou pomocou týchto protilátok je možné indukovať tvorbu protilátok, ktoré majú auto-adhezívnu schopnosť vo väzbovej reakcii. To znamená, že tieto indukované protilátky sa môžu viazať k auto-adhéznemu antigénu, lebo v takom prípade ligand a receptor sú identické. Takže je možné u pacientov s nádorovým ochorením indukovať imunitnú reakciu vakcináciou vhodnými protilátkami namierenými proti auto-adhezívnym antigénom, keď sa takto indukované protilátky priamo viažu na nádorové bunky a tým vyvolávajú rôzne terapeutické účinky. Na jednej strane schopnosť auto-adhézie, ktorá je dôležitá pre malígne bunky, je blokovaná, a na druhej strane, humánne efektorové funkcie, ako je napr. lýza závislá od komplementu a/alebo lýza v dôsledku aktivácie cytotoxických efektorových buniek, môžu byť vyvolané naviazaním indukovanej protilátky na nádorové bunky, čo potom vedie k deštrukcii nádorových buniek.

U pacientov s nádorovým ochorením vakcináciou použitím vhodných protilátok proti TAA môže byť pomocou všetkých uvedených mechanizmov a účinkov potlačené vytváranie nových metastáz a šírenie nádorového ochorenia tak môže byť aspoň spomalené. V skorom štádiu choroby, napr. po úspešnej operácii primárneho nádoru (adjuvantné štádium), vakcinácia zabráni tomu, aby sa zvyšné rozptýlené nádorové bunky usadili v tkanivách a založili metastázy. To umožňuje predĺžiť dobu prežitia bez relapsu choroby a preto celkovú dobu života pacientov s nádorovým ochorením. Prípadne by bolo možné dosiahnuť vakcináciou a opakovanou zosilňovacou vakcináciou vo vhodných intervaloch i celoživotnú ochranu proti vytváraniu metastáz. Z tohto hľadiska sa javí ako zvlášť zaujímavá vakcinácia pacientov s nádorovým ochorením použitím protilátok namierených proti auto-adhéznym TAA, lebo v takom prípade je možné dosiahnuť zosilnený terapeutický účinok v dôsledku dodatočného priameho napadnutia nádorových buniek indukovanou imunitnou reakciou.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu farmaceutický prípravok pripravený podľa vynálezu obsahuje okrem protilátky aspoň jedno adjuvans všeobecne používané na formuláciu vakcín. Pomocou adjuvans je možné zosilniť imunitnú reakciu. K príkladom adjuvans, bez toho, aby však bol počet obmedzujúci, patria napr. hydroxid hlinitý (Alu-gel), deriváty lipopolysacharidov, Bacillus Calmette Guerin (BCG), lipozómové preparáty, formulácie s ďalším antigénom, proti ktorému už skôr bola vyvolaná silná imunitná reakcia organizmu, ako je napr. tetanový toxín, exotoxín z Pseudomonas alebo niektoré zložky chrípkového vírusu, voliteľne formulované s lipozómami, biologické adjuvans, ako je napr. faktor stimulujúci granulocyty makrofágov (GM-CSF), interleukín 2 (IL-2) alebo interferón gama (IFNy).

V inom výhodnom uskutočnení farmaceutický prípravok pripravený podľa vynálezu je vhodný na vakcináciu, kedy sa podáva v dávkach 0,01 až 4 mg protilátky, výhodne 0,5 mg protilátky.

Vakcinácia sa môže uskutočňovať jediným podaním uvedenej dávky. Ale výhodne sa uskutočňuje opakovaným podávaním. Počet opakovaní je 1 až 12 za rok, výhodnejšie 4 až 8 za rok. Dávky zostávajú stále alebo sa znižujú.

Podporná vakcinácia (druhá a ďalšia) sa uskutočňuje v pravidelných intervaloch a v princípe sa môže uskutočňovať doživotne. Vhodné intervaly sú 6 až 24 mesiacov a môžu byť stanovené na základe monitorovania titra indukovaných protilátok (podporná vakcinácia by mala byť uskutočňovaná, len čo titer indukovaných protilátok významne poklesne).

Podávanie protilátok možno uskutočňovať spôsobmi, ktoré sú odborníkom známe. Výhodne sú farmaceutické prípravky obsahujúce protilátky vhodné na subkutánne, intradermálne alebo intramuskuláme podávanie.

Predkladaný vynález sa ďalšej týka použitia protilátok, ktoré rozpoznávajú antigén asociovaný s nádorom, na vakcináciu proti nádorovému ochoreniu a tiež liečenie nádorového ochorenia vakcináciou, keď sa pacientovi podáva jedna alebo viac protilátok rozpoznávajúcich TAA v množstve dostatočnom na vakcináciu. Pre vlastnú definíciu a výhodné uskutočnenie platí, čo bolo už uvedené pre použitie podľa vynálezu.

Použitie protilátok namierených proti TAA alebo ich derivátom, alebo fragmentom ako vakcíny sa podstatne líšia od známych použití takýchto anti-TAA protilátok na pasívnu imunoterapiu. Niektoré podstatné výhody použitia podľa vynálezu v porovnaní s pasívnou imunoterapiou protilátkami sú zhrnuté ďalej:

Protilátky namierené proti TAA na pasívnu imunoterapiu nádorových ochorení:

- vysoké dávky (vyššie ako 100 mg/intravenózna infúzia),

- krátkodobý účinok vzhľadom na elimináciu aktívnej látky,

- xenogénne protilátky sú nežiaduce vzhľadom na imonogenicitu,

- trvanie terapie je obmedzené, zvlášť v prípade xenogénnych protilátok, vzhľadom na indukciu imunitnej reakcie a nebezpečie anaťylaktickej reakcie spôsobenej v prípade opakovaných podaní.

Protilátky namierené proti TAA na profylaktickú a/alebo terapeutickú vakcináciu proti nádorovým ochoreniam:

- nízke dávky (nižšie ako 1 mg/vakcinácia, subkutánne, intradermálne alebo intramuskuláme injekcie),

- dlhotrvajúci účinok priamo indukovanej imunitnej reakcie,

- xenogénne protilátky sú žiaduce, lebo účinok je založený na imunogenicite,

- trvanie liečenia je neobmedzené (podporná vakcinácia je vždy možná).

V nasledujúcej časti budú opísané pokusy, ktoré ukazujú, že vakcinácia myšou MAB (HE2), ktorá je namierená proti auto-adhéznemu TAA Ep-CAM, alebo vakcinácia s príslušným fragmentom F(ab') vedie priamo k indukcii protilátok, ktoré sa selektívne viažu na humánne nádorové bunky exprimujúce tento antigén.

To dokazuje, ale len ako neobmedzujúci príklad, že imunitná reakcia s terapeutickým účinkom na nádorové ochorenie môže byť indukovaná vakcináciou vhodnými protilátkami namierenými proti auto-adhéznym TA A alebo derivátmi týchto protilátok, ktoré obsahujú aspoň idiotyp východiskovej protilátky.

Na tento účel bola pripravená myšia monoklonálna protilátka HE2 štandardným postupom hybridómovej technológie (pozri H. Zola, „Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques“ CRC Press Inc., ISBN 08493-6467-0, 1988). Myši Balb/c boli imunizované bunkami humánneho kolorektálneho karcinómu štandardným postupom. Bunky sleziny boli fúzované s myšou melanómovou líniou P3X63Ag8 a boli selektované hybridómami produkujúcimi protilátky, ktoré selektívne viažu humánne bunky kolorektálneho karcinómu, ale neviažu melanómové bunky. Nakoniec boli selektované hybridómy secemujúce protilátku IgG2a/kappa. Táto protilátka (HE2) sa viaže na Ep-CAM, ako možno ukázať napr. pomocou Westem blotu s preparátom membrán z humánnych buniek KATO III karcinómu žalúdka použitím známej protilátky anti-Ep-CAM (KS 1-4) na porovnanie.

Aminokyselinové sekvencie variabilných úsekov MAB HE2 sú nasledujúce:

Ťažký reťazec (sekvencia id. č. 1): QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARDGPWFAYWGQGTLVTVSA

Ľahký reťazec (sekvencia id. č. 2): NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSG SATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIK

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje inhibíciu auto-adhézie buniek malobunkového karcinómu pľúc SW2 monoklonálnou protilátkou HE2 in vitro.

Obr. 2 ukazuje auto-adhéziu buniek malobunkového karcinómu pľúc SW2 bez vplyvu monoklonálnej protilátky HE2 in vitro ako kontrolu k experimentu ukázanom na obr. 1.

Obr. 3 ukazuje indukciu protilátkovej imunitnej reakcie proti HE2 po vakcinácii kôz F(ab')2 fragmentom protilátky HE2 stanovenú použitím ELISA testu.

Obr. 4 ukazuje indukciu protilátkovej imunitnej reakcie proti Ep-CAM pozitívnym humánnym bunkám karcinómu žalúdka (Kato III) po vakcinácii kôz F(ab')₂ fragmentom protilátky HE2 stanovenú použitím ELISA testu.

Obr. 5 ukazuje neprítomnosť protilátkovej imunitnej reakcie proti Ep-CAM negatívnym humánnym melanómovým bunkám (WM9) po vakcinácii kôz F(ab')₂ fragmentom protilátky HE2 stanovenú použitím bunkového ELISA testu, ktorý bol uskutočnený ako kontrolný test k experimentu opísanému na obr. 4.

Obr. 6 ukazuje väzbu afinitne purifikovanej protilátkovej frakcie zo séra kôz, ktoré boli vakcínované Fjab'k fragmentom protilátky HE2, na Ep-CAM pozitívne humánne bunky karcinómu žalúdka (Kato III) stanovenú použitím bunkového ELISA testu.

Obr. 7 ukazuje neprítomnosť väzby afinitne purifikovanej protilátkovej frakcie zo séra kôz, ktoré boli vakcínované F(ab')₂ fragmentom protilátky HE2, na Ep-CAM negatívne humánne melanómové bunky (WM9), ako bolo stanovené bunkovým ELISA testom, ktorý bol uskutočnený ako kontrola k experimentu ukázanom na obr. 6.

Obr. 8 ukazuje indukciu protilátkovej imunitnej reakcie proti HE2 po vakcinácii makakov „rhesus“ 0,5 mg HE2 adsorbovanými na hydroxid hlinitý, stanovenú pomocou ELISA testu.

Obr. 9 ukazuje indukciu protilátkovej imunitnej reakcie proti Ep-CAM pozitívnym humánnym bunkám karcinómu žalúdka (Kato III) po vakcinácii makakov „rhesus“ 0,5 mg HE2 adsorbovanými na hydroxid hlinitý, ako bolo stanovené pomocou ELISA testu.

Obr. 10 ukazuje indukciu protilátkovej imunitnej reakcie proti HE2 detekovanú v spojení so štúdiou toxicity pri makakoch „rhesus“ po vakcinácii jednej skupiny makakov 0,5 mg HE2 adsorbované na hydroxid hlinitý, a súčasne ukazuje neprítomnosť protilátkovej imunitnej reakcie proti HE2 po podaní preparátu hydroxidu hlinitého bez protilátky (placebo), stanovené ELISA testom.

Obr. 11 ukazuje príklad indukcie protilátkovej imunitnej reakcie proti Ep-CAM pozitívnym humánnym bunkám karcinómu žalúdka (Kato III) detekovanú v spojení so štúdiom toxicity pri makakoch „rhesus“ po vakcinácii HE2, stanovenej ELISA testom.

Obr. 12 ukazuje príklad indukcie protilátkovej imunitnej reakcie proti Ep-CAM pozitívnym humánnym bunkám karcinómu žalúdka (Kato III) po opakovanej vakcinácii pacientov trpiacich karcinómom čriev 0,5 mg HE2 adsorbovanými na hydroxid hlinitý, ako bolo stanovené ELISA testom.

Obr. 13 ukazuje indukciu sérovej toxicity proti Ep-CAM pozitívnym humánnym bunkám karcinómu žalúdka (Kato III) po opakovanej vakcinácii pacientov trpiacich intestinálnym karcinómom 0,5 mg HE2 adsorbovanými na hydroxid hlinitý, ako bolo stanovené v experimente bunkovej lýzy.

Na ďalšiu ilustráciu slúžia následne uvedené príklady, ktoré však vynález nijako neobmedzujú.

Aby bolo možné ukázať, že myšia ΜΑΒ HE2 sa viaže na epitop auto-adhézneho antigénu Ep-CAM, ktorý sa účastní homofilnej väzby, bol skúmaný účinok HE2 na schopnosť auto-adhézie humánnej bunkovej línie SW2. Tieto bunky malobunkového pľúcneho karcinómu majú tendenciu vytvárať bunkové zhluky („clusters“) v kultúrach in vitro niekoľko hodín po vysiatí. Opis takéhoto experimentuje uvedený v príklade 1. Ako je zrejmé z obr. 1 a 2, vytváraniu bunkových zhlukov sa do veľkej miery zabráni pridaním HE2. To dokazuje, že HE2 sa viaže na epitop Ep-CAM, ktorý sa zúčastňuje homofilnej väzby tohto membránového proteínu.

Aby bolo možné skúmať priamu humorálnu imunitnú reakciu na vakcináciu F(ab')₂ fragmentom myšej ΜΑΒ HE2, boli týmto fragmentom imunizované kozy. Potrebný protilátkový fragment bol pripravený štiepením HE2 pepsínom a purifikáciou postupom, ktorýje odborníkom známy. Imunizácia kôz je opísaná v príklade 2.

Najprv bolo vyšetrené na imunoglobulíny namierené proti ΜΑΒ HE2 imunosérum odobraté z kôz a porovnané s pre-sérom, aby bolo možné stanoviť celkovú imunitnú reakciu vakcinovaných kôz. Toto vyšetrenie bolo uskutočnené ELISA testom, ktorého opis je uvedený v príklade 3. Výsledky tohto experimentu sú ukázané na obrázku 3: pri kozách sa v dôsledku vakcinácie F(ab')₂ fragmentom ΜΑΒ HE2 vyvinula silná imunitná reakcia, zatiaľ čo v pre-sére neboli nájdené žiadne protilátky proti HE2.

Ďalej sa skúmalo, či je možné v kozom imunosére detekovať imunoglobulíny, ktoré sa viažu na humánne rakovinové bunky exprimujúce TAA, proti ktorým je ΜΑΒ HE2 namierená (Ep-CAM). Na tento účel bola užitá línia buniek karcinómu žalúdka (Kato III). Ako kontrola bola testovaná väzba na bunky humánnej bunkovej línie, ktorá neexprimuje Ep-CAM (melanómové bunky WM9). Toto vyšetrenie bolo uskutočnenie bunkovým ELISA testom, ktorého opis je uvedený v príklade 4. Výsledky tohto experimentu sú ukázané na obrázku 4 a 5: kozie imunosérum obsahuje imunoglobulíny, ktoré sa silne viažu na Ep-CAM pozitívne KATO-bunky, zatiaľ čo k žiadnej väzbe nedochádza s Ep-CAM negatívnymi bunkami WM9. Pre-sérum neobsahuje žiadne protilátky, ktoré by sa viazali na tieto bunky. Tieto veľmi prekvapujúce výsledky ukazujú, že protilátky vytvorené po vakcinácii F(ab')₂ fragmentom HE2 sú skutočne schopné viazať sa na bunky exprimujúce TAA rozpoznávané HE2. Preto ftinkcia autoadhézie TAA bola prenesená na protilátky, ktoré sa vytvorili po vakcinácii HE2, ako bolo podrobne opísané.

Na dokázanie toho, že protilátky tvorené v kozách po vakcinácii F(ab')₂ fragmentom protilátky HE2 namierenej proti idiotypu MAB sú skutočne tie, ktoré sa viažu na bunky KATO, anti-idiotypový úsek týchto indukovaných protilátok bol špecificky purifikovaný z kozieho imunoséra sledom imunoafinitných chromatografií, v podstate ako bolo opísané v Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, 216. Sled purifikačných krokov je prehľadne opísaný v príklade 5.

Tieto afinitne purifikované kozie protilátky boli znovu testované na ich schopnosť väzby na Ep-CAM pozitívne KATO bunky a Ep-CAM negatívne bunky WM9. Opis týchto pokusov je uvedený v príklade 6. Výsledky pokusov sú ukázané na obr. 6 a 7: kozí IgG namierený proti idiotypu HE2 sa viaže silne na Ep-CAM pozitívne KATO bunky, zatiaľ čo nešpecifický kozí IgG sa viaže len veľmi slabo. Väzba afinitne purifikovaného kozieho IgG na Ep-CAM negatívne bunky WM9 sa však nelíši od nešpecifického kozieho IgG. To dokazuje, že frakcia protilátok, ktoré sa vyvinuli ako dôsledok vakcinácie F(ab')₂ fragmentom HE2, a ktoré sú namierené proti idiotypu tejto protilátky, obsahuje protilátky, ktoré sa viažu na rakovinové bunky exprimujúce TAA rozpoznávané HE2. Týmto pokusom bolo tiež presvedčivo dokázané, že tieto protilátky proti EpCAM pozitívnym bunkám indukované vakcináciou HE2 nie sú výsledkom kaskády dvojitej autológnej idiotypovej siete, ako bolo predpokladané v niektorých publikáciách (pozri napr. Cancer Immunol. Immunother. 42, 1996, 81-87), keďže anti-idiotypové protilátky (Ab3) vôbec nemôžu byť purifikované afinitnou chromatografiou na Abl (= HE2) kolóne, lebo podľa idiotypovej siete nemôžu viazať Abl, ale len Ab2.

Vzhľadom na opísané výsledky imunizácie kôz F(ab')₂ fragmentom protilátky HE2 boli uskutočnené také vakcinačné štúdie s makakmi „rhesus“, aby boli imunologické výsledky potvrdené na biologickom druhu, ktorý je blízko príbuzný človeku. Pn týchto pokusoch bola ako imunogén použitá kompletná myšia monoklonálna protilátka HE2. Predpokladalo sa, že úsek Fc myšej protilátky ako veľký xenogénny protein by mohol zosilniť imunitnú reakciu proti idiotypu (nosičový efekt). Aby sa zabránilo možným lokálnym vedľajším účinkom, bol použitý hydroxid hlinitý ako mierne adjuvans. Príprava prípravkov pre tieto vakcinačné experimenty je opísaná v príklade 7.

Prípravok podľa príkladu 7 bol injikovaný subkutánne do chrbtov makakov „rhesus“ (0,5 mg HE2 = 0,5 ml na jednu vakcináciu, podané dvakrát v intervale štyroch týždňov). V priebehu pokusu bola niekoľkokrát odobratá krv na získanie séra.

Najskôr bola pomocou ELISA testu stanovená imunitná reakcia na HE2. Opis pokusu je uvedený v príklade 8. Ako je ukázané na obr. 8, významný titer protilátok proti HE2 bol detekovaný už 29. deň.

Ďalej sa skúmalo, či sú vakcináciou indukované protilátky, ktoré sa viažu na bunky KATO III. Pre tieto testy bola použitá ELISA. Opis pokusu je uvedený v príklade 9. Ako ukazuje obr. 9, protilátky viažuce sa na Ep-CAM pozitívne KATO III nádorové bunky boli pri zvieratách indukované už 29. deň.

Následne boli 4 zvieratá vakcinované HE2 adsorbovanou na hydroxid hlinitý na štúdium toxicity pri makakoch „rhesus“. 4 ďalšie zvieratá dostali samotný hydroxid hlinitý ako placebo. Príprava použitých prípravkov je opísaná v príkladoch 10 a 11. Makaky boli injikované subkutánne do chrbta štyrikrát dávkou 0,5 ml prípravku (buď účinná látka, alebo placebo) (1., 15., 29. a 57. deň). Na získanie séra bola odobratá krv pred začiatkom štúdie a v rôznych okamihoch v priebehu štúdie.

Imunitná reakcia na HE2 bola najskôr stanovená pomocou ELISA. Opis experimentu je uvedený v príklade 8. Ako ukazuje obr, 10, pri všetkých štyroch makakoch zo skupiny HE2 sa vyvinula významná humorálna imunitná reakcia proti HE2 už po jednej vakcinácii a bola ďalej zosilnená po druhej vakcinácii, zatiaľ čo pri makakoch zo skupiny, ktorá dostala placebo, nedošlo k žiadnemu zvýšeniu titra protilátok proti HE2.

Tieto zistenia byli ďalej potvrdené imunoafmitnou purifikáciou séra makakov zo skupiny HE2 43. deň. Opis týchto pokusov je v príklade 12. Ako ukazuje nasledujúca tabuľka, pri všetkých štyroch makakoch sa vyvinula silná IgG imunitná reakcia proti HE2 (sekundárna imunitná reakcia) v sére 43. deň, zatiaľ čo frakcia IgM je porovnateľná s IgM frakciou pre-séra.

Makak	Deň	pg/ml IgM	pg/ml IgG
9206m	-14	7,7	2,8
	43	16,3	135,2
9599m	-14	17,9	2,5
	43	25,4	449,3
8415f	-14	16,0	3,2
	43	22,5	159,9
9139f	-14	5,3	5,0
	43	10,3	69,8

Boli skúmané tiež indukcie protilátok proti Ep-CAM pozitívnym bunkám KATO III. Na tieto testy bola použitá opäť ELISA. Opis experimentu je uvedený v príklade 9. Ako ukazuje obr. 11, makaky zo skupiny HE2 už 29. deň tvorili protilátky proti bunkám Kato III.

Vzhľadom na uvedené výsledky vakcinácie kôz a makakov „rhesus“ bol tiež pacient trpiaci rakovinou čreva s metastázami (Dukes D) vakcinovaný ΜΑΒ HE2 adsorbovanou na hydroxid hlinitý. Príprava podávaného prípravku je opísaná v príklade 7. V súhrne bol pacient injikovaný štyrikrát (L, 50., 78. a 114. deň) do paže s 0,5 ml prípravku podľa príkladu 7 (čo zodpovedalo 0,5 mg HE2). Pred každou vakcináciou a potom 128. deň bola odobratá krv a získané z nej sérum. Najskôr sa skúmalo, či boli vakcináciou indukované protilátky, ktoré sa viažu na bunky KATO III. Pre tieto testy bola použitá bunková ELISA. Opis experimentu je uvedený v príklade 9. Výsledky experimentov sú ukázané na obr. 12. Vysoký titer protilátok viažucich sa na bunky KATO III bol u tohto pacienta s rakovinou zjavne indukovaný vakcináciou.

Ďalej bolo skúmané, či protilátky indukované vakcináciou s HE2 sprostredkovávajú cytotoxický účinok in vivo proti rakovinovým bunkám KATO III. Na tento účel boli bunky KATO III inkubované s pre-sérom a imunosérom z pacienta s rakovinou, aby bolo možné demonštrovať od komplementu závislú lýzu sprostredkovanú indukovanými protilátkami. Opis experimentuje uvedený v príklade 13. Výsledky sú ukázané na obr. 13. Protilátky indukované vakcináciou HE2 sú zjavne schopné deštrukcie Ep-CAM pozitívnych buniek KATO III prostredníctvom lýzy závislej od komplementu v sére autológneho pacienta.

Spomínané experimenty sú príkladom toho, že vakcinácia vhodnými protilátkami proti auto-adhezívnemu TAA, ako je napr. Ep-CAM, lebo ich deriváty s rovnakým idiotypom, ako má východisková protilátka, spúšťajú humorálnu imunitnú reakciu, ktorá je selektívne viazaná na nádorové bunky exprimujúce autoadhezívny TAA. Indukované protilátky majú cytotoxický potenciál proti takýmto nádorovým bunkám. Vakcinácia takýmito protilátkami v prípade rakoviny potom vedie k terapeutickému účinku.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Použitý materiál

Mikrotitračné doštičky:

ImmunoPlate F96 Maxisorp (NUNC) pre test ELISA,

Celí Culture Cluster (Costar, katalóg, č.3598) pre test bunková ELISA.

Bunková línia:

SW2: humánny malobunkový pľúcny karcinóm Ep-Cam pozitívny,

KATO III: humánny karcinóm žalúdka, Ep-CAM pozitívny (ATCC HTB103),

WM9: humánny melanóm, Ep-CAM negatívny.

Kondenzačný pufor: 0,1 M NaHCO₃

0,5 M NaCl

	pH 8,0
Purifikačný pufor A:	PBS def. 0,2 M NaCl pH 7,2
Purifikačný pufor B:	0,1 M glycín/HCl 0,2 M NaCl pH 2,9
Médium A:	RPMI 1640 + 2 g/lNaHCO₃ 100 U/ml penicilín G 100 pg/ml streptomycínsulfát 4 mM glutamín 10 % teľacie fetálne sérum, tepelne inaktivované
Väzbový pufor:	15mMNa₂CO₃ 35 mM NaHCO₃ 3 mM NaN₃ pH 9,6
PBS-def:	138 mM NaCl 1.5 mMKH₂PO₄ 2,7 mM KC1 6.5 mM Na₂HPO₄pH 7,2
Fixačný roztok: Premývací pufor A:	0,1 % glutaraldehyd vo fyziologickom roztoku 2 % NaCl 0,2 % Triton X-100 v PBS-def
Premývací pufor B:	0,05 % Tween 20 v PBS-def
Blokovací pufor A:	5 % teľacie fetálne sérum, tepelne inaktivované v PBS-def
Blokovací pufor B:	1 % hovädzí sérový albumín 0,1 %NaN₃ v PBS-def
Riediaci pufor A:	2 % teľacie fetálne sérum, tepelne inaktivované v PBS-def
Riediaci pufor B:	PBS-def
Farbiaci pufor:	24,3 mM kyselina citrónová 51,4mMNa₂HPO₄ pH 5,0
Substrát:	40 mg o-fenyléndiamíndihydrochlorid 100 ml farbiaci pufor 20 μΐ H₂O₂ (30%)
Zastavovací roztok:	4 N H₂SO₄

Príklad 1

SW2 bunky kultivované in vitro boli centriíugované a peleta bola resuspendovaná v médiu A na 7 x 10⁴buniek/ml. V komôrkach LabTek bolo zmiešané buď 0,1 ml PBS-def s 0,3 ml bunkovej suspenzie alebo 0,1 ml PBS-def so 40 pg HE2 a potom s 0,3 ml suspenzie (výsledná koncentrácia HE2 je 100 pg/ml). Tesne pred pridaním bunkovej suspenzie ako poslednej zložky boli bunky pipetou separované. Bezprostredne po zmiešaní bola bunková suspenzia vyfotografovaná v inverznom mikroskope (zväčšenie lOOx). Potom boli bunkové suspenzie kultivované 4 hodiny pri 37 °C/5 % CO₂ a potom znovu vyfotografované.

Príklad 2

Dve kozy boli vakcinované intradermálne na niekoľkých miestach 1,5 mg fragmentu F(ab')₂ v 3 ml PBSdef s 3 ml Freundovho úplného adjuvans (Difco). 8. deň bola uskutočnená prvá podporná vakcinácia rovnaká ako pôvodná vakcinácia 1. deň, ale v neúplnom Freundovom adjuvans (Difco). 29. deň bola uskutočnená druhá podporná vakcinácia rovnakým spôsobom, ale bez adjuvans. Pred začatím vakcinácie a potom 54. deň bola odobratá krv na získanie séra na analýzu vývoja imunitnej reakcie.

Príklad 3

100 μΐ alikvóty MAB HE2 (roztok 10 mg/ml vo väzbovom pufri) boli inkubované v jamkách mikrotitračnéj doštičky 1 hodinu pri 37 °C. Po vypláchnutí doštičky premývacím pufrom A šesťkrát, bolo pridané do každej jamky 200 μΐ blokovacieho pufra A a doštička bola inkubovaná 30 minút pri 37 °C. Po premytí doštičky rovnako ako bolo opísané, boli inkubované 100 μΐ alikvóty testovaného kozieho séra v riedeniach od 1 : 100 až 1 ; 1000000 v riediacom pufri A 1 hodinu pri 37 °C. Po rovnakom premytí doštičky ako bolo opísané, bolo do každej jamky pridaných 100 μΐ protilátky králičej anti-kozej Ig konjugovanej s peroxidázou (Zymed) v riedení 1 : 1000 v riediacom pufri A a inkubované 30 minút pri 37 °C. Doštička potom bola premytá premývacím pufrom A štyrikrát a potom dvakrát farbiacim pufrom. Naviazanie protilátky bolo detekované pridaním 100 μΐ špecifického substrátu do každej jamky a farebná reakcia bola zastavená po 10 minútach pridaním 50 μΐ zastavovacieho roztoku. Vyhodnotenie bolo uskutočnené meraním optickej denzity (OD) pri 490 nm (vlnová dĺžka pre referenčné meranie je 620 nm).

Príklad 4

Mikrotitračné doštičky boli inkubované pri 4 °C cez noc so 100 μΐ testovanej bunkovej suspenzie v každej jamke s koncentráciou 2 x 10⁶ buniek/ml v médiu A. Po odsatí supematantu boli doštičky inkubované s 50 μΐ fixačného roztoku v každej jamke 5 minút pri teplote miestnosti, Po odsatí supematantu bolo do každej jamky pridané 200 μΐ blokovacieho pufra B a doštička bola inkubovaná 1 hodinu pri 37 °C. Po dvojitom premytí 200 μΐ premývacieho pufra B boli 100 μΐ alikvóty testovaného kozieho séra inkubované 1 hodinu pri 37 °C v riedeniach 1 : 10 až 1 : 100 000 v riediacom pufri B. Po dvojitom premytí 100 μΐ ľadovo vychladeného premývacieho pufra B bolo pridané do každej jamky pridané 100 μΐ protilátky králičej anti-kozej Ig konjugovanej s peroxidázou (Zymed) v riedení 1 : 1000 v riediacom pufri A a inkubované 45 minút pri 37 °C. Doštička potom bola premytá trikrát 100 μΐ ľadovo vychladeného premývacieho pufra B. Naviazanie protilátky bolo detekované pridaním 100 μΐ špecifického substrátu do každej jamky a farebná reakcia bola zastavená po 10 minútach pridaním 50 μΐ zastavovacieho roztoku. Vyhodnotenie bolo uskutočnené meraním optickej denzity (OD) pri 490 nm (vlnová dĺžka pre referenčné meranie je 620 nm).

Príklad 5

Použitá purifikácia bola v podstate opísaná v Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,216, 1984 a možno ju stručne zhrnúť nasledovne: v prvom kroku bola uskutočnená purifikácia celkového IgG obsiahnutého v kozom sére na ionomeničovej kolóne DEAE spôsobom, ktorý je odborníkovi známy. Potom boli kozie protilátky namierené proti konštantným úsekom F(ab')₂ fragmentu protilátky HE2 naviazané na imunoafmitnú kolónu (CH-Sepharose 4B, Pharmacia), na ktorú bol konjugovaný irelevantný myší IgG2a, zatiaľ čo frakcia antiidiotypových kozích protilátok sa neviaže na túto kolónu. Takže v poslednom kroku roztok prejdený uvedenou imunoafmitnou kolónou bol vyviazaný imunoafinitnou kolónou (CH-Sepharose 4B, Pharmacia), na ktorú bola konjugovaná HE2. Frakcia špecificky naviazaná na túto kolónu bola eluovaná pufrom s pH 2,8 (0,1 M glycín/HCl) a neutralizovaná. Frakcia kozieho IgG takto získaná je namierená proti idiotypu IIE2.

Príklad 6

Bunkový ELISA test sa v zásade uskutočňuje rovnakým spôsobom ako bol opísaný v príklade 4. Miesto riedenia séra však boli použité imunoafinitne purifikovaný kozí IgG a nešpecifický purifikovaný kozí IgG v koncentráciách 100 μg/ml až 0,031 pg/ml.

Príklad 7

0,83 ml suspenzie Alu-Gel (Alu-Gel S, Serva, 2 % suspenzie, stupeň čistoty: adjuvans na prípravu vakcín) bola jemne trepaná 1 hodinu pri teplote miestnosti za sterilných podmienok s 0,5 ml roztoku HE2 v PBS s koncentráciou 10 mg/ml a pH 5,5 spoločne s 3,67 ml PBS-def. (výsledná koncentrácia HE2: 1 mg/ml, AluGel S:0,33 %). Potom bola suspenzia sterilné naplnená po 0,5 ml alikvótoch do injekčných fľaštičiek.

Príklad 8

Táto ELISA bola v zásade uskutočnená rovnako ako v príklade 3, s výnimkou toho, že na detekciu naviazaných protilátok makakov bol použitý kozí anti-humánny Ig (Zymed) konjugovaný s peroxidázou. S týmto reagens boli protilátky pri makakoch detekované rovnakým spôsobom, ako sa detekujú ľudské protilátky, lebo sekvenčná homológia konštantných úsekov protilátok človeka a makaka je približne 98 %.

Príklad 9

Táto bunková ELISA bola v zásade uskutočnená rovnako ako v príklade 4, s výnimkou toho, že pre detekciu na bunky naviazaných protilátok makakov (alebo humánnych protilátok) bol použitý kozí antihumánny Ig (Zymed) konjugovaný s peroxidázou. Ako kontrola bol použitý kozí anti-myší Ig (Zymed) konjugovaný s peroxidázou na detekciu myšej HE2.

Príklad 10

3,5 ml roztoku HE2 (10 mg/ml v PBS-def., pH 5,5) bolo zmiešané v sterilných podmienkach s 0,35 ml vodného roztoku thimerosalu (10 mg/ml, Sigma) a s 27,25 ml fyziologického roztoku a pridalo sa k 3,9 ml suspenzie hydroxidu hlinitého (3 % vo vode, Alhydrogel, Superfos Biosector, Dánsko) za jemného trepania. 0,6 ml suspenzie získanej týmto spôsobom potom bolo za sterilných podmienok naplnených do apyrogénnych sklenených skúmaviek, ktoré boli uzavreté gumovou zátkou s hliníkovou čiapočkou.

Príklad 11

Placebo prípravok bol pripravený rovnakým spôsobom ako v príklade 10, s výnimkou toho, že miesto roztoku protilátky sa použilo 0,35 ml fyziologického roztoku NaCl a miesto roztoku thimerosalu sa použilo 0,35 ml PBS-def pH 5,5.

Príklad 12 g CH-Sepharose 4B (Pharmacia) sa resuspendoval v 30 ml IM HC1 15 minút. Gél bol potom premytý na frite AG3 použitím 1 1 1 mM HC1 a potom 200 ml kondenzačného pufra. 10 mg HE2 (zásobný roztok 10 mg/ml) bolo dialyzované proti 0,5 1 kondenzačného pufra. Roztok bol potom zmiešaný s gélovou suspenziou v uzavretej nádobe. Pri pomere gél: rozpúšťadlo 1 : 2 vznikla suspenzia vhodná na kondenzáciu. Suspenzia sa trepala 5,5 hodiny pri teplote miestnosti. Potom bol nadbytok ligandu odstránený premytím 3 x 30 ml kondenzačného pufra. Zvyšné reakčné skupiny boli blokované 1 hodinovou inkubáciou s 1 M etanolamínom pri teplote miestnosti. Gél bol potom pri teplote miestnosti trepaný 1 hodinu s 0,1 M Tris-HCl pufrom s pH 8. Nakoniec bol gél v troch cykloch premytý pufrom s meniacim sa pH. Každý cyklus sa skladal z 0,1 M acetátového pufra s pH 4 s 0,5 M NaCl, potom 0,lM Tris-HCl, pH 8,0 s 0,5M NaCl. Gél bol udržovaný na 4 °C.

Imunoafinitná purifikácia frakcie protilátok namierených proti HE2 zo séra makakov „rhesus“ sa uskutočňovala nasledujúcim postupom: Imunoafinitná purifikácia bola uskutočnená na FPLC systéme (Pharmacia). 1 ml gélu získaného opísaným postupom bol nanesený na kolónu Pharmacia HR5/5. 0,5 ml séra bolo nariedené 1:10 purifikačným pufrom A. Roztok bol pumpovaný cez kolónu pri prietoku 1 ml/minúta a potom bola kolóna premývaná purifikačným pufrom A, dokiaľ detektor neindikoval opäť dosiahnutie základnej UV línie (280 nm). Naviazané imunoglobulíny potom boli eluované purifikačným pufrom B a frakcia bola po desorpcii bezprostredne neutralizovaná pridaním 0,5 M Na₂HPO₄ a 0,02 % NaN₃. 50 μΐ protilátkovej frakcie izolovanej týmto spôsobom bolo analyzované v deliacej kolóne (SEC, Zorbax 250 GF) a boli kvantifikované podiely IgG a IgM. Na SEC kolóne bol použitý ako eluent 220 mM fosfátový pufor s pH 7 + 10 % acetonitril. Humánne IgG a IgM boli použité ako štandardy na SEC a boli chromatografované v niekoľkých koncentráciách na stanovenie kalibračných kriviek (plocha pod vrcholom proti koncentrácii). Výpočty koncentrácií IgG a IgM vo frakcii afinitne purifikovaných protilátok z makakov „rhesus“ boli uskutočnené lineárnou regresiou na základe kalibračných kriviek. Koncentrácie sú potom uvedené v pg/ml séra makakov.

Príklad 13

Deň pred uskutočnením testov boli bunky KATO III prenesené do čerstvého média A a udržované pri 37 °C a 5 % CO₂ v kultivačných fľašiach. Nasledujúci deň boli bunky najskôr označené pomocou ⁵¹Cr. 5 x x 10⁶ buniek bolo inkubovaných v 800 μΐ média A pri 37 °C a 5 % CO2 ešte s 100 pCi Na2^5lCrO4. Potom boli bunky prepláchnuté médiom A a koncentrácia bola upravená na 2,5 x 10⁵ buniek/ml. 100 μΐ alikvóty tejto suspenzie bolo pipetovaných do jamiek mikrotitračnej doštičky. Potom bolo pridaných 100 μΐ testovaného séra z pacientov a inkubovalo sa 3 hodiny pri 37 °C a 5 % CO₂ (séra boli uložené pri - 80 °C a boli rozmrazené iba jedenkrát pre tento test, aby sa zabránilo strate aktivity komplementu). Supernatanty boli získané pomocou lisu Skatron a potom boli zmerané na gama-počítači. Bola tak získaná hodnota „experimentálneho výdaja“. Na stanovenie hodnoty „celkového výdaja“ boli bunky ošetrené rovnako ako bolo opísané, ale sérum bolo nahradené roztokom 2 % SDS, 50 mM Na₂CO₃ a 10 mM EDTA. Hodnoty „spontánneho výdaja“ boli získané tak, že sa sérum nahradilo médiom A. Výsledok bol vypočítaný nasledovne:

(experimentálny výdaj - spontánny výdaj) % lýzy =-----------------------------------------x 100 (celkový výdaj - spontánny výdaj)

Test bol uskutočnený celkom 3 x a jednotlivé výsledky sú uvedené ako priemerné hodnoty a smerodajná odchýlka.

II

ZOZNAM SEKVENCII <160>2 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Leu íle Glu Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp íle

40 45

Gly Val íle Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Gly Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110

Thr Val Ser Ala

115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2

Asn íle Val Met Thr Gin Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr 20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Gin Ser Pro Lys Leu Leu íle 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr íle Ser Ser Val Gin Ala 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gin Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys

100 105

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie protilátky namierenej proti antigénu bunkovej membrány Ep-CAM na výrobu farmaceutického prípravku na profylaktickú alebo terapeutickú vakcináciu proti nádorovým ochoreniam.
2. Použitie podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že protilátka pochádza zo zvieraťa.
3. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúce sa tým, že protilátka je monoklonálna protilátka.
4. Použitie podľa nároku 3, vyznačujúce sa tým, že protilátka je myšia monoklonálna protilátka, pričom variabilný úsek ťažkého reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú tu ako sekvencia id. č. 1 a variabilný úsek ľahkého reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú tu ako sekvencia id. č. 2.
5. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúce sa tým, že protilátka má rovnakú väzbovú špecifitu ako protilátka definovaná v nároku 4.
6. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, vyznačujúce sa tým, že sa použijú v 5 kombinácii dve alebo viac protilátok namierených proti rôznym epitopom membránového antigénu.
7. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúce sa tým, že farmaceutický prípravok ďalej obsahuje aspoň jedno vhodné vakcinačné adjuvans.
8. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúce sa tým, že farmaceutický prípravok je vhodný na podávanie protilátky v dávke 0,01 až 4 mg protilátky.
10 9. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, vyznačujúce sa tým, že farmaceutický prípravok je vhodný na podávanie subkutánnou, intradermálnou alebo intramuskulárnou injekciou.