NO321511B1 - Sammensetning for rekonformering av multi-epitopiske antigener for a initiere en immunrespons og anvendelse av sammensetningen til fremstilling av et legemiddel - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår sammensetning for initiering og/eller forbedring av en immunrespons in vivo og anvendelse av sammensetningen for fremstilling av et legemiddel.

Alle vertebrater har et immunsystem. Vertebratenes evne til å beskytte seg mot infeksiøse mikrober, toksiner, viruser og andre fremmede makromolekyler blir kalt immunitet. Immuniteten er meget spesifikk og slik spesifisitet er en fundamental egenskap til immunresponser. Mange av responsene til immunsystemet initierer destruksjon og eliminering av invaderende organismer og et hvert toksisk molekyl fremstilt av dem. Fordi egenskapene til disse immunreaksjoner i seg selv er destruktive er det viktig at responsen er presist begrenset til de fremmede molekyler og ikke til vertens egne molekyler. Denne evnen til å skille mellom fremmede molekyler og egne molekyler er et annet fundamentalt trekk hos immunsystemet.

Fagområdet skiller mellom naturlig og akvirert eller spesifikk immunitet. Naturlig immunitet består av forsvarsmekanismer som er aktive før eksponering til mikrober eller fremmede makromolekyler ikke blir forsterket av slik eksponering og skiller ikke mellom de fleste stoffer som er fremmede for kroppen. Effektorer til naturlig immunitet er fysiske barrierer så som hud eller slimmembraner, fagocyttiske celler så som makrofager eller neutrofiler, en klasse av lymfocytter kalt naturlige drepeceller og komplementsystemet. Komplement er et serumproteinkompleks som er destruktiv til visse bakterielle og andre celler sensitivisert av spesifikke, komplementflkserende antistoffer; dets aktivitet blir utvirket av en serie av interaksjoner som resulterer i proteolyttiske spaltinger og som kan følge en eller annen av minst to ruter.

Hos vertebrater samarbeider mekanismene i naturlige og spesifikk immunitet i et system av vertsforsvarsmidler, immunsystemet, for å eliminere fremmede inntrengere. I tillegg til mikrober, kreftceller, parasitter og virusinfiserte celler, gjenkjenner immunsystemet og eliminerer også celler eller vev transplantert inn i en person fra et genetisk forskjellig individ av samme art (allograft) eller fra en annen art (xenograft).

Akvirert eller spesifikk immunitet omfatter forsvarsmekanismer som er indusert eller stimulert av eksponering til fremmede stoffer. Hendelsene med hvilke mekanismene for spesifikk immunitet blir engasjert i forsvaret mot fremmede stoffer blir kalt immunrespons. Vertebrater har to brede klasser av immunresponser: antistoffresponser eller humoral immunitet og celle-medierte immunresponser, eller cellulær immunitet. Humoral immunitet er tilveiebrakt av B-lymfocytter, som etter proliferasjon og differensiering fremstiller antistoffer (proteiner også kjent som immunglobuliner) som sirkulerer i blodet og lymfatisk væske. Disse antistoffer bindes spesifikt til antigenet som induserte dem. Binding av antistoff inaktiverer det fremmede stoffet, for eksempel en virus ved å blokkere stoffets evne til å bindes til reseptorer på en målcelle. Den humorale responsen forsvarer først og fremst mot den ekstracellulære fase av bakterielle og virale infeksjoner. I humoral immunitet kan serum alene overføre responsen og effektorene til responsen er oppløselig i proteinmolekyler kalt antistoffer.

Den andre klasse av immunresponser, cellulær immunitet involverer produksjon av spesialiserte celler, for eksempel T-lymfocytter, som reagerer med fremmede antigener på overflaten av andre vertsceller. Den cellulære immunresponsen er spesielt effektiv mot sopper, parasitter, intracellulære virale infeksjoner, kreftceller og andre fremmedstoffer. Faktum er at hovedmengden av T-lymfocytter spiller en regulatorisk rolle ved immunitet, og virker enten ved å øke eller undertrykke responsen til andre hvite blodceller. Disse cellene kalt hjelpe-T-celler eller supressor-T-celler er kollektivt referert til som regulatoriske celler. Andre T-lymfocytter, kalt cytotoksiske T-celler dreper virusinfiserte celler. Både cytotoksiske T-celler og B-lymfocytter er involvert direkte i forsvaret mot infeksjon og blir kollektivt referert til som effektorceller.

Tidsforløpet til en immunrespons blir oppdelt i den kognitive eller gjenkjenn-elsesfase, under hvilke de spesifikke lymfocytter gjenkjenner det fremmede antigen; aktiveringsfase under hvilken spesifikke lymfocytter responderer til det fremmede antigen; og effektorfasen under hvilket antigenaktiverte lymfocytter medierer prosessen som er nødvendig for å eliminere antigenet. Lymfocytter er immunceller som er spesialisert til å mediere og styre spesifikke immunresponser. T-celler og B-celler blir morfologisk adskillelsesbare bare etter at de er blitt stimulert av et antigen.

Immunsystemet har utviklet seg slik at det er i stand til å gjenkjenne overflatetrekk til makromolekyler som ikke er normale bestanddeler av verten. Som beskrevet ovenfor kalles et fremmedmolekyl som er gjenkjent av immunsystemet (det vil si bundet av antistoffet), uten hensyn til om det i seg selv kan utløse en respons, et «antigen», og den porsjonen av antigenet som antistoffet bindes til kalles den

«antigene determinant» eller «epitop». Noen antigener, for eksempel tumorassosierte antigener så som ovariekreft eller brystkreftantigener har multiple antistoffbindeseter. Disse antigenene blir kalt «multi-epittopiske» antigener. Når antigenet er et polypeptid er det vanlig å klassifisere epitopene som lineære (det vil si en sammensatt sekvens av aminosyrer gjentatt langs polypeptidkjeden) eller ikke-lineære (det vil si sammensatt av aminosyrer brakt i nærhet som et resultat av foldinger av polypeptidkjeden). Ikke-lineære epitoper blir også kalt «konformasjonelle» fordi de hever seg gjennom foldingen til polypeptidkjeden som en spesiell konformasjon, det vil si en klar tredimensjonal fasong. Få grunn av den

meget spesifikke natur til antistoff-antigenbindingen er et primært middel til å adskilte antigener, eller adskille epitoper på samme antigen, de antistoffbindende egenskaper.

For å overkomme den uendelige variasjon av epitoper som finnes, inneholder immunsystemet til et pattedyrindivid et ekstremt stort repertoar av lymfocytter, cirka 2 x IO<12>. Hver lymfocyttklon av repertoaret inneholder overflatereseptorer som er spesifikke for en epitop. Det er estimert at det i pattedyrimmunsystemet kan adskille minst IO<8> adskilte antigendeterminanter. Til og med en enkel antigendeterminant vil generelt aktivere mange kloner, hvorav hver produserer et antigenbindende sete med sin egen karakteristiske affinitet for determinanten. Antigener som stimulerer produksjon av hundrede av typer av antistoffer, hvert laget av en forskjellig B-celleklon er kalt å fremstille en polyklonal respons. Når bare noen kloner responderer kalles responsen polyklonal; når den totale respons er gjort av en enkelt B-celle eller T-celle alene kalles responsen monoklonal. Responsen til de fleste antigener er polyklonale.

En initiell eller primær immunrespons til et fremmed antigen forhøyer evnen til immunsystemet til igjen å respondere mot det antigenet. Dette trekk ved den spesifikke immunitet er kalt immunologisk hukommelse, eller en sekundær immunrespons. Sekundære immunresponser er ofte mer effektive enn primære responser.

Den konvensjonelle definisjon av et antigen er et stoff som kan utløse i en vertebrat vert dannelse av et spesifikt antistoff eller dannelse av en spesifikk populasjon av lymfocytter som reagerer med stoffet. Som det ofte skjer i vitenskapen er det imidlertid nå kjent at denne definisjonen, skjønt nøyaktig ikke er fullstendig. For eksempel er det nå kjent at noen sykdomstilstander undertrykker eller inaktivierer vertsimmunresponsen. Under disse betingelser utløser et tumorantigen ikke et antistoff eller dannelsen av spesifikke lymfocytter. Således er ikke alle antigener i stand til å utløse en human immunrespons.

Mangelen ved definisjonen sentreres på et todelt aspekt av immunresponsen, det første trinn i immunresponsen er gjenkjennelse av nærværet til en fremmed enhet; det andre trinn er et komplekst utvalg eller kaskade av reaksjoner, det vil si responsen. I tumorantigen-eksemplet gitt ovenfor kan immunsystemet gjenkjenne nærværet av et fremmed antigen men det kan ikke respondere. 1 et annet eksempel synes en mangel på immunsystemet evne til å adskille mellom selv og ikke-selv å være opprinnelsen av mange autoimmune sykdommer. Igjen er dette en mangel på gjenkjennelse ikke respons.

Som brukt heri er derfor et antigen som kan gjenkjennes av immunsystemet sagt å være antigenisk. Hvis immunsystemet også kan reise an aktiv respons mot antigenet er det sagt å være immunogenisk. Antigener som er immunogene er vanligvis makromolekyler (så som proteiner, nukleinsyrer, karbohydrater og lipider) på minst5000 Daltons molekylvekt. Mindre ikke-immune molekyler, for eksempel haptener og små antigenmolekyler kan stimulere en immunrespons hvis det er assosiert med et bæremolekyl av tilstrekkelig størrelse.

Antistoffene, effektorene til humoral immunitet, blir sekrert av plasmaceller, og er blant de mest vanlig komponenter i blodet. Plasmaceller er modne endetrinnsceller som synes å ha et relativt kort livsløp. De blir produsert når et antigen kommer inn i det humane immunsystem og, i en kompleks serie av celleinteraksjoner, aktiveres B-lymfocytter. B-lymfocytter proliferes deretter og differensieres til å danne plasmaceller. Hver B-lymfocytt er programmert av sitt DNA til å produsere et antistoffmolekyl med en enkel spesifitet.

B-lymfocytter lager to spesielle former av dette molekyl, et som forblir forankret på den ytre overflaten til cellemembranen som en membranreseptor, typisk til å binde antigen til B-cellen og en som blir sekrert.

Antistoffer også kjent som immunglobuliner er proteiner. De har to prinsipielle funksjoner. Det første er å gjenkjenne (binde) fremmede antigener. Det andre er å mobilisere andre elementer av immunsystemet til å ødelegge den fremmede enhet.

Antigengjenkjennende strukturer i et antistoff er variable domener og er ansvarlig for antigenbinding. Immunsystem-mobiliserende strukturer, en andre funksjon til antistoffer, er konstante domener; disse regioner blir ladet med forskjellige effektorfunksjoner: stimulering av B-celler til å undergå proliferasjon og differensiering, aktivering av komplementcellelysesystemet, opsonisering, tiltrekking av makrofager til å fordøye inntrengeren, etc. Antistoffer med forskjellige isotyper har forskjellige konstante domener og har derfor forskjellige effektorfunksjoner. De best studerte isotyper er IgG og IgM.

Antistoffet selv er et oligomert molekyl, klassifisert i henhold til sin struktur i en klasse (for eksempel IgG) og en subklasse (for eksempel IgGl). IgG molekylene er den viktigste komponent av den humorale immunrespons og er sammensatt av to tunge (lange) og to lette (korte) kjeder, sammenholdt av disulfidbindinger i en «Y»-konfigurasjon. Molekylet har to variable regioner (på armene til «Y»). Regionene blir kalt slik fordi antistoffer av en spesiell subklasse, produsert av et spesielt individ gir respons til forskjellige antigener, vil være forskjellige i den variable region men ikke i de konstante regioner. De variable regionene i seg selv blir sammensatt av både et relativt ikke-varierende rammeverk og av hypervariable løkker, som gir antistoffet dets spesifisitet for en spesiell epitop. Et antistoff binder til en epitop i et antigen som et resultat av molekylært komplementaritet. Delene av antistoffene som deltar direkte i interaksjonen kalles «antigenbindende sete», eller «paratop». Antigenene bundet av et spesielt antistoff blir kalt dets «tilhørende antigener».

Et antistoff i et dyr vil bli sett på som et fremmed antigen av immunsystemet til et annet dyr, og vil derfor utløse en immunrespons. Noen av de resulterende antistoffer vil være spesifikke for de unike epitoper (idiotype) til den variable region av det immuniserende antistoffet og blir derfor kalt anti-idiotypiske antistoffer. Disse har ofte immunologiske egenskaper Hk de til et antigen som tilhører det immuniserende antistoffet. Anti-isotypiske antistoffer, binder på den annen side epitoper i den konstante region av det immuniserende antigen.

Som bemerket ovenfor er cellene som regulerer cellemediert immunitet en klasse av lymfocytter kalt T-lymfocytter. De kommer i utgangspunktet fra samme stamcelle som B-lymfocytter men følger imidlertid en meget forskjellig utviklingsvei hvori tymus spiller en viktig rolle. T-lymfocyttene uttrykker også antigen-spesifikke overflatereseptorer skjønt den måten de gjenkjenner antigenet på er heller forskjellig fra den til B-celler. T-celler eksisterer i to funksjonelle kategorier: de med en spesifikk effektorfunksjon (cytotoksiske T-lymfocytter eller «CTL») og de med regulatoriske funksjon. Regulatoriske T-celler er nødvendig for utvikling av plasmaceller fra

B-celler. T-hjelpeceller (TH) produserer en antigen-spesifikk oppregulering av immunresponsen. Immunresponsen kan også gjennomgå aktiv antigenspesifikk nedregulering. Mange beviser fra undersøkelser med dyr og vevskultur beskriver nærvær av en suppressor-T-cellepopulasjon (TS) som tilveiebringer denne inhibitoriske regulering.

Lymfocyttene i et individ responderer spesifikt til fremmede antigener men er vanligvis ikke responderende til de potensielle antigene stoffene som er native for individet. Immunologisk ikke-responderbarhet kalles toleranse. Selvtoleranse blir innført på et tidlig utviklingsmessig trinn når potensielle cellegjenkjennende lymfocytter kommer i kontakt med selvantigener og blir forhindret til å utvikle seg til et trinn hvor de er i stand til å respondere positivt til selvantigenet.

Immunsystemet har to cytokin-medierte regulatoriske ruter som bestemmer om responsen til antigenutfordring prinsipielt vil være en cellulær respons (TH 1-ruten) eller prinsipielt en humoral respons (TH2-ruten). Den cellulære rute blir karakterisert av T-hjelpecelleproduksjon av interleukin-2 (IL-2) eller interferon-y. Denne ruten medierer den forsinkede type hypersensitivitet (DTH) respons, dannelsen av cytotoksiske T-celler og makrofagaktivering. TH2-responsen promoterer produksjon av et utvalg av cytokiner ved T-celler, så som interleukin-4

(IL-4) og interleukin-10 (IL-10). Denne responsen blir identifisert ved produksjon av spesifikke antistoffer med høyt titer.

Tendensen for at enten cellemediert eller humoral immunrespons skal predominere er ment å være en konsekvens av kryssregulering. Således ville TH 1-celler inhibere utløsning av TH2-responser, for eksempel ved sekresjon av interferon-y. I motsatt fall TH2-celler kunne inhibere dannelsen av TH 1-responser ved å produsere cytokiner så som IL-4 og IL-10.

TH2-responser kan faktisk forverre utvikling av visse sykdommer. Det er velkjent på området at injeksjoner av små mengder av immuniserende antigener vil fortrinnsvis utløse forsinket type hypersensitivitetsre sponser, noe som indiserer cellemediert immunitet, mens vaksinasjon med større mengder av antigen vil resultere i mer uttalt humoral immunrespons som reflektert ved høyt antistofftiter. Det er imidlertid vanskelig å unngå en høy IgG-respons og å oppnå en høy og forlenget cellulær respons ved denne metode og avhengig av antigenet, kan små doser være utilstrekkelig til å utløse en tilstrekkelig nyttig sterk CMI-respons.

Normalt fortsetter en immunrespons mot effektormekanismer som er kjennetegnet av både B- og T-lymfocytter. Imidlertid i forløpet til de fleste immunresponser antar B- eller T-lymfocytter en dominerende rolle med mindre viktig deltakelse av de respektive andre typer av lymfocytter. Immunresponser hvis effektormekanismer hovedsakelig blir mediert gjennom B-celler og antistoffer er humorale immunresponser. De responser hvor T-celler medierer gir mere viktige effektorfunksjoner er cellemedierte eller cellulære immunresponser.

Som bemerket ovenfor er cellene som regulerer humoral immunitet en klasse av lymfocytter kalt B-celler. Hver klon av B-lymfocytter uttrykker membran-immunglobuliner (membran lg, overflatebundet antistoffmolekyler) som virker som antigenreseptorer som har en unik epitop for en B-lymfocyttklon. Disse membran Ig-molekyler er den eneste kilden til B-cellespesifisitet. Antigener som inneholder en epitop komplementær til membran lg vil bindes til antigenreseptoren. Slike antigener blir også kalt sammenhørende antigener til antistoffet. Binding til antigenreseptoren (membran lg) vil resultere i differensiering og klonal proliferasjon av B-lymfocytten. Noe av avkommet vil differensiere til modne plasmaceller som er spesialisert på syntese av antistoffer som tilsvarer epitopspesifisiteten til membran lg med hvilke

B-lymfocytten initielt hadde bundet antigenet.

Binding av et antigen til et antistoff er reversibelt. Den blir mediert av summen av mange relativt svake ikke-kovalente krefter, inkludert hydrofobe og hydrogenbindinger, van der Waalske krefter og ioniske interaksjoner. Disse svake kreftene er effektive bare når antigenmolekylet er nært nok til å tillate noen av sine atomer å passe inn i komplementære fordypninger på overflaten av antistoffet. Komplementærregionen til en firekjedet antistoff enhet er to identiske antigenbindende seter; den korresponderende region på antigenet er en antigendeterminant. Mange antigenmakromolekyler har mange forskjellige antigene determinanter.

I mange år har levende svekkede vaksiner blitt brukt til å indusere immunitet mot virale infeksjoner så som influensa og polio. Disse preparater inneholder levende virion som forårsaker milde, subkliniske infeksjoner hos det vaksinerte individ. I løpet av en slik infeksjon vil virale vektorer trenge inn i visse vertsceller og kode for syntese av virus-spesifikke proteiner. Disse endogent produserte antigenproteiner blir prosessert til mindre peptider og presentert i sammenhengen med MHC klasse I og II antigener, for derved å rekruttere TH 1-celler og utløse cellemediert immunresponser.

Tumorceller uttrykker visse celleoverflateantigener («tumor-assosierte antigener»). Tumor-assosierte antigener er antigener som er tilstede i serum og vev hos kreftpasienter. Mange slike antigener blir også uttrykt i embryonisk vev og i små nivåer i vev og serum hos friske individer. Mange av de vevsassosierte antigener er glykoproteiner, glykolipider eller mukopolysakkarider. De fleste tumorantigener blir fremstilt av differensierte celler. De blir produsert i mye større mengder av tumorceller enn av differensierte normalceller. Det humane immunsystem gjenkjenner tumorantigenene som native antigener og svarer ikke («selvtoleranse»). Mekanismene som fører til selvtoleranse er bare delvis forstått, men det er nå klart at det er den som i stor grad blir etablert under utvikling av immunsystemet. Hvis umodne B-celler eller T-celler blir stimulert gjennom sine antigen-spesifikke reseptorer på et kritisk trinn (for eksempel like etter at deres reseptorer på celleoverflaten uttrykkes men før de blir modne), blir de indusert til å dø i steden for å bli aktivert. Dette trinn skjer i benmargen for B-celler og i tymus for T-celler. Toleranse vil således induseres for selv-angtigener uttrykt i disse omgivelser, men ikke til de som ikke uttrykkes. Det er nå blitt vist at normale individer har modne B-celler som er i stand til å gjenkjenne noen selvantigener men at disse B-celler ikke er aktivert. De egnede T-hjelpeceller (TH) synes å mangle.

For tumorer som har antigener er det minst 4 teorier for hvordan immunresponsen kan mislykkes i å ødelegge en tumor: 1) det er ingen B-celler eller cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) som er i stand til å gjenkjenne tumoren; 2) det er ingen TH-celler som er i stand til å gjenkjenne tumoren; 3) TS-celler blir aktivert før TH-celler, og forhindrer således B-celle og CTL-aktivering; og 4) genene som regulerer tumorproliferasjon kan være til stede før fødsel, slik at verten ikke behandler genproduktene som «fremmede».

EKSISTERENDE LØSNINGER

Der hvor tumor-antigener finnes med tilstrekkelig selektivitet på en tumor (det vil si tumor-antigenene er fraværende fra eller tilstede bare i små mengder på de normale cellulære motpartene) kan tumor-antigenene tjene som et mulig mål for et immunterapeutisk middel.

Mange av disse selektive tumoran ti gener er av natur karbohydrat eller glykoprotein (mucin). For eksempel uttrykker de fleste adenokarcinomceller i høy grad å sekretere muciner. Dette skyldes delvis defekter i glykosylering i kreftceller. Karcinomcelleoverflatemuciner kan fysisk blokkere immune effektormekanismer fra å nå tumorcelleoverflaten og derfor tumorantigenet. Det vil si verten mislykkes i å gjenkjenne tumorantigenet.

I mange sykdommer kan de forårsakende patogener eller toksiner (for eksempel influensa, polio og rabies-virus, pneumokokkbakterier; difteri og tetanustoksiner) bli effektivt målrettet og nøytralisert i den ekstracellulære væske ved mekanismer for humoral immunitet gjennom antistoffer som bindes til patogenene eller toksinene og derved føre til deres inaktivering eller destruksjon. I disse tilfeller er vaksinasjon med preparater som utløser er humoral immunrespons, tilsynelatende mediert av TH2-celler, generelt tilstrekkelig til beskyttelse. På den annen side er det for mange intracellære infeksjoner, for resitasjon fra virale infeksjoner og for målrettet dreping av kreftceller den cellemedierte immunitet som beskytter organismen mot angriperne.

Tre klasser av immunterapi er for tiden under undersøkelse: 1) passiv immunterapi;

2) aktiv immunterapi med antigener; og 3) aktiv immunterapi med antistoffer. Uheldigvis har hver blitt møtt med begrenset suksess. Immunterapi er imidlertid foretrukket over antiproliferative kjemoterapeutiske midler så som pyrimidin og purinanaloger, i visse trinn av kreft. Analogene konkurrerer med pyrimidin og purin som bygningsblokker brukt under en celles vekstsyklus. Analogene er ineffektive når vekst ikke cyklerer eller hviler. Hovedparten av mikrometastatiske celler synes å være

ikke-cyklerende eller hvilende. Den cytotoksiske virkning av immunterapi virker uavhengig av cellesyklus.

«Passiv immunterapi» omfatter administrering av antistoffer til pasient.

Antistoffterapi er konvensjonelt karakterisert som passiv siden pasienten ikke er kilden til antistoffene. Imidlertid kan betegnelsen passiv være villedende fordi pasienten kan produsere anti-idiotypiske sekundære antistoffer som i sin tur kan utløse en immunrespons som er kryssreaktiv med det originale antigen. «Aktiv immunterapi» er administreringen av et antigen, i form av en vaksine, til en pasient slik at det utløses en beskyttende immunrespons. Genetisk modifiserte tumorcel le vaksiner transfektert med gener som uttrykker cytokiner og samstimulerende molekyler er også blitt brukt for å avhjelpe utilstrekkeligheten til den tumorspesifikke immunrespons.

I. Passiv immunterapi ( med antistoffer)

Et tumorantigen kan tjene som et reaktivt sete til hvilket antistoffer kan bindes. Tallrike antistoffer er blitt dannet mot tumorantigener.

Konvensjonelle effektormetoder inkluderer komplementavhengig cytolyse («CDC»), antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet («ADCC») og fagocytose (utklarerering av det retikuloendoteliale system etter målcellene er belagt med immunglobulin).

En relativt stor mengde av antistoffer nødvendig til å initiere CDC, ADCC og opsonisering. Videre er kilder for humane antistoffer begrenset til folk som allerede lider av tumoren av interesse, det er uetisk å innføre en sykdom i en person bare for å initiere produksjon av antistoffer som kan høstes. Som et resultat av disse vanskeligheter har antistoffer av ikke-human opprinnelse, så som muse-antistoffer blitt brukt.

Administrering til mennesker av muse-antistoffer kan, fordi de blir gjenkjent som «fremmede», fremtvinge en human antimus-antistoffrespons («HAMA») rettet mot musespesifikke og museisotypspesifikke deler av det primære antistoffmolekylet. Denne immunreaksjonen skjer på grunn av forskjeller i de primære aminosyresekvenser i de konstante regioner av immunglobuliner hos mus og mennesker. Både IgG og IgM underklasser av HAMA er blitt detektert. IgG responsen kommer til syne senere, lever lenger enn den typiske IgM responsen og er mer motstandsdyktig til fjerning ved plasmaferese.

Imidlertid vil HAMA klinisk: 1) øke risikoen for anafylaktisk eller serumsykdoms-lignende reaksjoner til påfølgende administrering av museantistoffer; 2) kan inteferere med den immunterapeutiske virkning av påfølgende injiserte museantistoffer ved kompleksering med antistoffene, øke avklaringen fra kroppen, redusere tumorlokalisering, øke opptaket i lever og milt, og/eller gjemme tumoren fra terapeutiske midler; og 3) inteferere med immunodiagnostiske midler og derved forhindre overvåking av sykdommens utvikling og behandlingens kurs.

Forskjellige kliniske prøver har brukt antistoffer som terapeutiske midler mot faste tumorer. Ikke noe fast responsmønster eller forbedret overlevelse har enda blitt registrert. I kontrast har antistoffterapi oftere indusert fullstendige og langvarige remisjoner i B-celle eller T-celle lymfom eller leukemier. Forklaringer på mislykketheten ved fast tumor inkluderer antigenheterogenitet og utilstrekkelig tilgjengelighet for epitelceller til de injiserte antistoffer så vel som sekundære effektormolekyler så som komplement- eller effektorceller.

Som et eksempel på passiv immunitet ble mus monoklonalt antistoff 17-1A (isotyp IgG2a) brukt til å målsøke minimal restsykdom i pasienter med Dukes stadium C kolorektal cancer som hadde gjennomgått kurerende kirurgi og var fri for manifest residual tumor. Skjønt behandlingen forbedret overlevelsen og førte til reduserte tilbakefallsrater, var resultatene mindre gunstige enn behandling med kjemoterapi alene eller i kombinasjon med stråling.

Det er viktig å notere seg at målantigenet for 17-IA ikke adskilles fra membranen og er ikke detekterbar i serum. Se Rietmttller et al, «Randomized trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Duke's C colerectal carcinoma», Lancet, 343:1177-83 (1994).

II. Aktiv spesifikk immunterapi ( «ASI) med tumoranti<g>ener

ASI er definert som immunisering med et definert antigen, presentert på en egnet måte, for aktivt å indusere immunrespons spesifikt til det antigen. I forbindelse med kreft, forsøker ASI å stimulere en human immunrespons både humoral og cellemediert for å angripe tumorantigenet.

Den humorale respons og de konvensjonelle effektormetoder til CDC, ADSS og fagocytose (avklaring ved det retikuloendoteliale system etter at målcellen er belagt med immunoglobuliner) ble diskutert ovenfor.

Over de siste 5 år har betydelig fremskritt blitt gjort med karakterisering av det molekylære kompleks gjenkjent av den spesifikke antigenreseptor til T lymfocytter. Krystallstrukturer av klasse I viktige histokompatibilitetskompleks («MHC») molekyler viste ikke bare en mulig peptidsbindingsfure men også det aktuelle nærvær av et peptid i denne fure. Etter fagocytose blir proteiner syntetisert i cellene tilsynelatende gradert til peptider ved cellulære enzymer, transportert inn i endoplasmatiske retikulum og der, kombinert med den tunge kjede til klasse I MHC-molekyler. Slike peptid-MHC komplekser blir stabilisert ved tilsetting av P2-mikroglobulin og transportert til celleoverflaten hvor de kan gjenkjennes av reseptoren til CTL. I teori kan et antigenpeptid avledes fra ethvert intracellulært protein spesifikt uttrykt av tumorceller. Se for eksempel Van Der Bruggen, Pierre, «The Long-Standing Quest for Tumor Rejection Antigens» Clinical Immunology and Immunopathelogy, 71; 3:248-252 (1994).

III. Aktiv spesifikk immunterapi med antistoffer

Hvis et spesifikt antistoff fra et dyr blir injisert som et immunogen i et egnet annet dyr vil det injiserte antistoff utløse en immunrespons (for eksempel produserte antistoffer mot de injiserte antistoffer «anti-antistoffer»). Noen av disse anti-antistoffer vil være spesifikke for de unike epitoper (idiotoper) til det variable domene i de injiserte antistoffer. Disse epitoper er kjent kollektivt som idiotypen til det primære antistoff; de sekundære (anti-)antistoffer som bindes til disse epitoper kjent som anti-idiotypiske antistoffer. Summen av alle idiotyper tilstede på den variable porsjonen av et hvert antistoff blir referert til som dets idiotype. Idiotyper er serologisk definert siden injeksjon av et primært antistoff som binder en epitop av antigenet kan indusere produksjon av anti-idiotypiske antistoffer. Når binding mellom det primære antistoff og et anti-idiotypisk antistoff blir inhibert av antigenet til hvilke det primære antistoff er rettet, er idiotypene latert til bindingsetet eller epitopen. Andre sekundære antistoffer vil være spesifikke for epitopene til de konstante domener av de injiserte antistoffer og følgelig vil være kjent som anti-isotypiske antistoffer. Som brukt heri er anti-idiotype, anti-idiotype antistoff, epitop eller epitopisk brukt på den måte som er gjenkjennelig på fagområdet.

«Nettverks»-teorien angir at antistoffet produsert initielt under en immunrespons vil bære unike nye epitoper til hvilke organismer ikke er tolerant, og vil derfor utløse produksjon av sekundære antistoffer (Ab2) rettet mot idiotypene til de primære antistoffene (Abl). Disse sekundære antistoffer vil på samme måte ha en idiotyp som vil indusere produksjon av tertiære antistoffer (Ab3) og så videre.

Nettverksteorien foreslå også at noen av disse sekundære antistoffer (Ab2) vil ha et bindingssete som er komplementet til komplementet til det opprinnelige antigen og vil således redusere det «indre bildet» av det originale antigen. Med andre ord kan et anti-idiotypisk antistoff være et surrogatantigen.

En tradisjonell tilnærming til cancerimmunterapi har vært å administrere antitumor antistoffer det vil si antistoffer som gjenkjenner en epitop på en tumorcelle, til pasienter. Utviklingen av nettverksteorien førte imidlertid forskerne til å foreslå den direkte administrering av eksogent produserte anti-idiotype antistoffer, det vil si antistoffer produsert mot idiotypen til en antitumor-antistoff. En slik tilnærming er beskrevet i US-patent 5,053,224 (Koprowski, et al.). Koprowski antar at pasientens kropp vil produsere anti-antistoffer som ikke bare vil gjenkjenne disse anti-idiotype antistoffer men også den opprinnelige tumorepitop.

Det er fire hovedtyper av anti-idiotype antistoffer. Alfa-typen binder en epitop fjernt fra paratopen til det primære antistoff. Beta-typen er en viss paratop som alltid kopierer epitopen til det opprinnelige antigen. Gamma-typen binder nær nok til paratopen av det primære antistoff til å inteferere med antigenbindingen. Epsilon-typen gjenkjenner en idiotypisk determinant som kopierer et konstant domene i antigenstrukturen. Videre kan anti-isotypiske antistoffer være tungkjede-spesifikke eller lettkjede-spesifikke.

To terapeutiske anvendelser kom fra nettverksteorien: 1) å administrere Abl som virker som et antigeninduserende Aab2 produksjon ved verten; og 2) å administrere Ab2 som funksjonelt imiterer tumorantigenet.

Aktiv immunisering av ovariekreftpasienter med gjentatte intravenøse anvendelser av F(Ab')2 fragmentet av det monoklonale antistoff OC125 ble rapportert å indusere bemerkelsesverdige anti-idiotypiske antistoff (Ab2)-responser i noen av pasientene. Preliminære resultater antydet at pasienter med høye Ab2-serumkonsentrasjoner hadde bedre overlevelsesgrad sammenlignet med de hvor lave eller ingen Ab2-serumnivåer ble registrert. Se Wagner, U. et al., «Clinical Course of Patients with Ovarian Carcinomas After Induction of Anti-idiotypic Antibodies Against a Tumor-Associated Antigen,» Tumor Diagnostic & Therapie, 11:1-4,(1990).

Et humant anti-idiotypisk monoklonalt antistoff (Ab2) er blitt vist å indusere antitumor cellulære responser hos dyr og synes å forlenge overlevelsen i pasienter med metastatisk kolorektal kreft. Se Durrant, L.G.et al., «Enhanced Cell-Mediated Tumor Killing in Patients Immunized with Human Monoclonal Anti-idiotypic Antibody 105AD7», Cancer Research, 54:4837-4840 (1994). Anvendelse av anti-idiotypiske antistoffer (Ab2) for immunterapi i forbindelse med kreft er også gjennomgått av Bhattacharya-Chatterje, et al; Cancer Immunol.Immunother. 38:75-82(1994).

WO 94/27437 beskriver et anti-idiotypisk antistoff som reagerer med et anti-CA125 antistoff. EP 0288082 beskriver et tumorspesifikt assay for CA 125 antigen. US 5 013 547 beskriver et legemiddel-protein konjugat for et anti-CA125 antistoff. Ingen av disse referansene lærer den foreliggende oppfinnelse eller anvendelse av sammensetningen.

Det er derfor en hensikt å tilveiebringe terapeutiske sammensetninger uten overnevnte ulemper, som frembringer en effektiv vertsimmunrespons. Denne hensikt er oppfylt med foreliggende oppfinnelse, kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Vaksiner er preparater administrert til dyr eller mennesker for å påvirke profylaksen, kurere eller lette sykdomstilstanden gjennom induksjon av spesifikk immunitet. Profylaktiske vaksiner er gitt til friske individer med den hensikt å preparere eller prime immunsystemet til mer effektivt forsvar mot infeksjoner i fremtiden. I tilfelle av en infeksjon eller infisering kan immunsystemet til et vaksinert individ mobilisere en sekundær immunrespons og kan hurtigere gjenkjenne og eliminere de respektive patogener. Terapeutiske vaksiner blir gitt til syke individer med den hensikt å stimulere eller modellere immunsystemet som seg selv enten har mobilisert en utilstrekkelig effektiv immunrespons eller har totalt mislykket i å repondere. Ved konstruksjon av profylaktiske eller terapeutiske vaksiner er det viktig å velge preparater som vil utløse den immunrespons som er mest i stand til enten å tilveiebringe førstelinjebeskyttelse eller å effektuere rask restitusjon.

Det første trinn i initiering av en immunrespons er dannelse av vertsgjenkjennelse av tumorantigenet som et fremmed antigen. For eksempel, skjønt CA 125 ekspresjon er assosiert med ovariekreft mislykkes pasientens immunsystem i å gjenkjenne det som fremmed. Den foreliggende opprinnelse omfatter å kontakte et oppløselig antigen med en sammensetning av oppfinnelsen og å omsette et bindingsmiddel i sammensetningen med det oppløselige antigen. I henhold til oppfinnelsen skaper binding av antigenet med bindingsmidlet vertsgjenkjennelse av antigenet. I neste omgang fører vertsgjenkjennelse til initiering av en immunrespons mot antigenet.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter den oppdagelsen at å binde et bindingsmiddel til en forutbestemt epitop til et multiepitopisk kreftassosiert antigen forandrer antigenet på en måte slik at vertsimmunsystemet kan gjenkjenne og initiere en immunrespons til et tidligere ikke-gjenkjent antigen. I en utforming av oppfinnelsen bindes bindingsmidlet til et oppløselig tumorassosiert antigen, og tillater vertsimmunsystemet å danne en respons mot antigenet. For eksempel som illustrert i foreliggende oppfinnelse er B43.13 et antistoffbindende middel som bindes spesifikt til ovariecancerantigen CA 125 på 43.13 epitopen. Når B43.13 bindes til CA125 antigenet blir enten konformasjonen av antigenet forandret eller antigenet blir prosessert og/eller levert forskjellig slik at det blir gjenkjent av vertens immunsystem. Andre eksempler inkluderer men er ikke begrenset til bindingsmiddel som bindes spesifikt til CA 19.9, et gastrointestinalt antigen assosiert med gastrointestinal kreft; og til et bindingsmiddel som bindes spesifikt ti! CA15.3, et antigen assosiert med brystkreft.

I henhold til foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en terapeutisk sammensetning som omfatter bindingsmidlet B43.13, hvori bindingsmidlet brødes selektivt til et forutbestemt oppløselig antigen og hvori slike bindingsmidler resulterer i presentasjon av en forskjellig epitop på antigenet, hvor nevnte forskjellige epitop resulterer i en immunrespons som inhiberer eller dreper cellene som produserte antigenet.

I en foretrukket utforming av oppfinnelsen blir en sammensetning som omfatter et forutbestemt antistoff som spesifikt bindes til et forutbestemt tumorassosiert antigen brukt til å binde et oppløselig antigen produsert av tumoren. Når det oppløselig antigen er bundet gjenkjenner immunsystemet antigenet som «fremmed» og mobiliserer en immunrespons mot antigenet eller mot bindingsmidlet bundet til antigenet. Antigenet som kan gjøres immunogent er potensielt nyttige for å indusere eller aktivere en immunrespons som fører til terapeutiske og mulig profylaktige fordeler.

For sykdommer som delvis kan karakteriseres ved å ha et tumorassosiert antigen som er multiepitopisk involverer den foreliggende oppfinnelse å bringe et oppløselig antigen i berøring med et bindingsreagens som spesifikt bindes til en enkelt epitop på det multiepitope tumorassosierte antigen.

Bindingsmidlet kan rettes mot ethvert antigen av klinisk betydning men fortrinnsvis er det rettet mot et tumorassosiert antigen (TAA). I tilfelle av TAA kan kreften inkludere men er ikke begrenset til lunge, kolon, rektum, bryst, ovarie, prostatakjertel, hode, hals, ben, immunsystem eller en hver annen anatomisk lokalisering. Personen kan være et menneske eller dyr. Illustrerende tumorer og tumormarkører er opplistet i US-patent 5,075,218.

Anvendelsen til å fremstille et legemiddel i henhold til foreliggende oppfinnelse omfatter behandling av enhver kreft som produserer et oppløselig multiepitopisk TAA. Som brukt heri benyttes oppløselig for å beskrive et hvert antigen som er detekterbart i en kroppsvæske, det vil si blod, serum, ascites, spytt eller lignende. I henhold til foreliggende oppfinnelse er de foretrukne tumorer de som gir oppløselig tumorantigener, for eksempel tumorantigener utskilt i blodstrømmen, i motsetning til et overflateantigen eller et intracellulært antigen; utviser et multiepitopisk tumorassosiert antigen, fortrinnsvis av karbohydrat- eller glykoprotein (for eksempel mucin) natur; og kan finnes i en konsentrasjon i pasientens kroppsvæske mer enn det som normalt er til stede hos friske kontroller og slik at et høyt nivå betyr en dårlig prognose for pasienten, men ennå ikke har initiert en immunrespons. Som velkjent for en med kunnskap på området er en metode til å bedømme om konsentrasjonen av TAA er større enn detekterbar for gjenoppståelse av sykdommen å sammenligne pasientens konsentrasjon med den til en frisk kontrollperson. Hvis konsentrasjonen av TAA er høyere enn hos den friske kontrollen er pasientens konsentrasjon detekterbar for en dårlig prognose med hensyn på sykdommen.

Et bindingsmiddel (BA) som brukt heri betegner et medlem av et immunologisk par, for eksempel en bindingsdel som er i stand til å bindes til en enkel epitop uttrykt på tumorantigenet. Eksemplet på bindingsmidler inkluderer men er ikke begrenset til; monoklonale antistoffer («MAb»); kimeriske monoklonale antistoffer («C-Mab»); genetisk konstruerte monoklonale antistoffer («G-Mab»); fragmenter av monoklonale antistoffer (inkludert men ikke begrenset til «F(Ab)2», «F(Ab)» og «Dab»); enkle kjeder som representerer den reaktive del av monoklonale antistoffer («SC-MAb»); tumorbindende peptider; enhver av de ovenstående festet til et molekyl som medierer en effektorfunksjon; og kopier av enhver av de ovenstående. Antistoffer kan være et polyklonalt antistoff eller monoklonalt antistoff. Når subjektet er et menneske kan antistoffet oppnås ved å immunisere et hvert dyr som er i stand til å mobilisere en brukbar immunrespons til antigenet, så som mus, rotter, geit, sau, kanin eller andre egnede eksperimentdyr. I tilfelle av et monoklonalt antistoff kan antistoffproduserende celler fra det immuniserte dyr fusjoneres med «udødelige» eller «udødeliggjorte» humane eller dyreceller for å oppnå et hybridom som produserer antistoff. Hvis det er ønsket kan genene som koder for en eller flere av immunglobulinene klones slik at antistoffet kan produseres i forskjellige vertsceller, og dersom ønsket kan genene muteres slik at sekvensen forandres og følgelig de immunologiske egenskaper til det produserte antistoff. Fragmentet eller fragmenter av bindingsmiddel kan oppnås ved konvensjonelle teknikker, så som ved proteolyttisk fordøyelse av bindingsmidlet ved å bruke pepsin, papain eller lignende; eller ved rekombinante DNA-teknikker hvori DNA som koder for det ønskede fragment blir klonet og uttrykt i et utvalg av verter. Bestråling av en hver av de foregående enheter, for eksempel ved ultrafiolett lys vil øke immunresponsen til et multiepitopisk antigen under lignende betingelser. I en foretrukket utforming av oppfinnelsen er ikke effektorfunksjoner som medierer CDC eller ADCC nødvendig.

I en utforming av oppfinnelsen inneholder en egnet sammensetning for ovarie-tumorassosiert antigen et bindemiddel som bindes til CA125-antigenet. I en annen utforming av oppfinnelsen inneholder en egnet sammensetning for gastrointestinal kreft et bindemiddel som bindes til CA19.9-antigen. Enda en annen utforming av oppfinnelsen inneholder en egnet sammensetning for brystkreft bindemiddel som bindes til CA15.3-antigen. Forskjellige bindingsmidler, antistoffer, antigener og fremgangsmåter til å fremstille, isolere og bruke antistoffene er beskrevet i US-patent 4,471,057 (Koprowski) og US-patent 5,075,218 (Jette et al.), begge inkorporert heri som referanse. Videre er mange av disse antistoffene kommersielt tilgjengelig fra Centocor, Abbott Laboratories, Commissariat a L'Energie Atomique, Hoffman-LaRoche, Inc., Sorin Biomedica og FujiRebio.

Enhver sammensetning som inkluderer et bindemiddel i henhold til oppfinnelsen kan anvendes for å initiere en in vivo immunrespons. Sammensetningen kan inkludere en eller flere adjuvantia, en eller flere bærere, en eller flere eksipienter, en eller er flere stabilisatorer, en eller flere billeddannende reagenser og/eller fysiologisk akseptabel saltoppløsning. Generelt er adjuvantia stoffer som blandes med et immunogen for å utløse et mer markert immunrespons. Kontrollvaksinering uten adjuvansen resulterte i humoral immunresponser. Sammensetningen kan også inkludere farmasøytiske akseptable bærere. Farmasøytiske akseptable bærere inkluderer men er ikke begrenset til saltoppløsning, sterilt vann, fosfatbufret saltoppløsning og lignende. Andre buffermidler, dispergeringsmidler og inerte ikke-toksiske stoffer egnet for levering til en pasient kan inkluderes i sammensetningen i henhold til foreliggende oppfinnelse. Sammensetningen kan være oppløsninger egnet for administrering og er typisk sterile og fri for uønsket partikkelstoff. Sammensetningen kan steriliseres ved konvensjonelle sterilisasjonsteknikker.

I henhold til oppfinnelsen må bindemidlet bringes i berøring og binde det tumorassosierte antigen, må administreres til pasienten ved enhver immunologisk egnet rute. For eksempel kan bindemidlet innført i pasienten ved intravenøse, subkutane, intraperitonale, intradermale, intramuskulære eller intralymfatiske ruter, i oppløsning, tablett eller aerosolform. Liposomer, biodegraderbare mikrosfærer, miceller eller lignende kan også brukes som en bærer, vehikel eller leveringssystem. Videre kan ved å bruke ex vivo fremgangsmåter velkjent på området blod eller serum fra pasienten fjernes fra pasienten, eventuelt kan det være ønsket å rense antigenet i pasientens blod; blodet eller serumet kan deretter blandes med en sammensetning som inkluderer et bindemiddel i henhold til oppfinnelsen; og det behandlede blod eller serum returneres til pasienten. Klinikeren kan sammenligne de anti-idiotypiske og anti-isotypiske responser assosiert med disse forskjellige ruter til å bestemme den mest effektive administrasjonsrute. Oppfinnelsen skal ikke begrenses til noen spesiell metode til å innføre bindemidlet i pasienten.

I henhold til foreliggende oppfinnelse presenterer BA-antigenet interaksjonen effektivt i gjenværende epitoper til pasientens immunsystem for å danne : 1) en humoral respons som resulterer i humane anti-tumorantistoffer som kan eller som kan ikke være undertrykkbare av det injiserte antistoff men er definitivt undertrykkbar av et antistoff som bindes til en epitop forskjellig fra epitopen som reagerer med det injiserte BA; og 2) en cellemediert respons som resulterer i produksjon av antigen-spesifikke cytotoksiske T-celler.

Bindemidlene omfattet i foreliggende oppfinnelse finner det multiepitopiske tumorantigen av interesse og det resulterende immunogene par kan anvendes til å prime eller å initiere en immunrespons til en annen epitop på antigenet. Som angitt i mer detalj et annet sted i foreliggende beskrivelse er det ment at bindingshendelsen mellom bindemidlet og det multiepitopiske antigen forandrer konformasjonen til antigenet tilstrekkelig til å tilveiebringe adgang til en annen tidligere ugjenkjennbar epitop på antigenet. Et tidligere ugjenkjennbar epitop initierer, når det blir gjenkjent av midler i immunsystemet, immunsystemkaskaden som resulterer i en immunrespons for hele antigenet.

I henhold til en utforming av oppfinnelsen blir en kreftpasient med kroppsvæske som har endogene oppløselige multiepitoper på antigenet behandlet ved å injisere et eksogent bindemiddel rettet på en enkel epitop til det endogene oppløselige antigen. Etter binding restruktureres antistoffet eller blir prosessert og/eller levert forskjellig slik at det tillates at en forskjellig epitop på antigenet presenteres for pasientens immunsystem. Ved presentasjonen initieres pasientens immunsystem og utvikler en humoral, cellulær eller kombinert humoral/cellulær respons som fører til tumordreping og/eller stase. Bevis på den foreliggende oppfinnelses vellykkethet er vist i eksemplene som forbedrede overlevelsestider.

Uten at hensikten er å bli bundet derved er det ment at virkningsmekanisme for fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse involverer en konformasjonell forandring av det oppløselige antigen bundet av et bindemiddel i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Det er videre ment at binding av antigenet med et bindemiddel rettet mot den første epitop på antigenet forandrer konformasjonen til antigenet tilstrekkelig til å presentere eller aktivere en andre epitop. Det er mot denne andre epitop at pasientens immunsystem kan respondere. Alternativt kan bindemiddel-antigeninteraksjon føre til differensiell metabolsk prosessering eller levering til immunsystemet på en slik måte at det aktiverer en annen epitop.

DOSERING

I henhold til fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse omfatter en sammensetning et bindemiddel som kan administreres i en mengde tilstrekkelig til å gjenkjenne og binde det forutbestemte tumorassosierte antigen. I en foretrukket utforming av oppfinnelsen er dosen tilstrekkelig til å danne eller utløse en immunrespons mot TAA. En immunologisk eller terapeutisk effektiv eller akseptabel mengde av bindemidlet er en mengde tilstrekkelig til å binde et forutbestemt antigen in vivo eller ex vivo, og er i stand til å utløse en immunrespons til antigenet. Responsen inhiberer eller dreper tumorceller som bærer og presenterer en epitop med en nylig tilgang, for derved å utslette eller eliminere sykdommen eller lidelsen som produserer antigenet. Immunresponsen kan ta form av en humoral respons, en cellemediert respons eller begge. Den foretrukne utførelse av oppfinnelsen er dosen til det monoklonale antistoff mindre enn dosen som er nødvendig for å utløse ADCC eller CDC.

Konsentrasjonen eller dosen av bindingsmidlet eller aktivt middel i sammensetningen kan i stor grad variere, for eksempel fra mindre enn cirka 0,01% til cirka 15 til 20 vektprosent. Som angitt ovenfor administreres sammensetningen i en mengde som er tilstrekkelig til å stimulere en immunrespons mot antigenet. Mengder som er effektive til denne anvendelse vil delvis avhenge av hvor alvorlig sykdommen er og i status til pasientens immunsystem. Generelt vil sammensetningen inkludere cirka 0,1 ug til cirka 2 mg eller mer av bindemidlet per kilo kroppsvekt, mer vanlige doser på cirka 1 ug til cirka 2 mg eller mer av bindemidlet per kilo kroppsvekt, mer vanlige doser på cirka ljug til cirka 200ug per kilo kroppsvekt. Konsentrasjonen vil vanligvis være minst 0,5%; en hver mengde kan selekteres primært basert på væskevolum, viskositet, antigenisitet, etc. i henhold til den spesielle administrasjonsmåten.

Administrasjon kan skje mer enn en gang, fortrinnsvis tre ganger over en forlenget periode. I det sammensetningene i henhold til oppfinnelsen kan brukes for pasienter med en alvorlig sykdomstilstand, det vil si livstruende eller potensielt livstruende kan overskudd av bindemiddel administreres hvis ønskelig. Aktuelle fremgangsmåter og protokoller for administrering av farmasøytiske sammensetninger, inkludert fortynningsteknikker for injeksjon av foreliggende sammensetninger er velkjente eller vil være kjent med en med kunnskap på området. Noen av disse metoder og protokoller er beskrevet i Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Co. (19S2).

Et bindemiddel kan administreres i kombinasjon med andre bindemidler, eller kan administreres i kombinasjon med andre behandlingsprotokoller eller midler, for eksempel kjemoterapeutiske midler.

Effektiviteten til bindemidlene i henhold til foreliggende oppfinnelse kan overvåkes in vitro eller in vivo. Humorale responser kan overvåkes in vitro ved konvensjonelle immunoassayer, hvor tumoraktiviteten til responsen kan bestemmes av assayer for komplementmediert cellulært cytotoksisitet og/eller antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC). Assaymetodene er velkjente og er beskrevet i Haandbook of Excperimental Immunology, Vol. 2, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1986). Andre assayer kan settes på og bestemme nivå av antigenet i pasienten eller vev. Cellemediert immunitet kan overvåkes in vivo ved utvikling av forsinket type hypersensitivitetsreaksjoner, eller andre in vivo eller in vitro midler kjent for de med kunnskap på området, inkludert men ikke begrenset til hudtestreaksjonsprotokoller, lymfocyttstimuleringsassayer, måling av toksisiteten av et individs lymfocytter til tumorceller ved å bruke en standard radioaktiv release assay, ved et begrenset fortynningsassay eller ved å måle plasmanivåer av IL-2 ved å bruke standard ELISA assayer.

EKSEMPLER

Eksempel 1 Eksperimentell verifikasjon av dannelse av antistoffrespons mot multiple epitoper tilstede i et antigen ved å injisere et antistoff mot en enkel epitop Kreftantigen CA 125 som er uttrykt på mer en 80% av epitelial ovariekreft, blir brukt som et eksempel for å demonstrere den foreliggende oppfinnelse.

CA 125 har multiple epitoper gjenkjent av forskjellige antistoffer så som OC125, Mil, B43.13, B27.1 blant andre. I den foreliggende oppfinnelse ble MAb-B43.13 brukt for å danne en CA125 spesifikk immunrespons som inkluderte gjenkjennelse av B27.1 epitopen.

Metode: 86 pasienter med ovariecancer med aktiv sykdom ble testet for nærvær av antistoffer mot CA 125. Ingen av pasientene hadde antistoffer mot CA125 før injeksjonen av MAb-B43.13. Pasientene ble injisert med 2mg av MAb-B43.13 ved varierende tidsintervall, se for eksempel tabell 1 for noen av pasientene). Sera fra disse pasienter ble analysert for nærvær av humane anti-CA125 antistoffer ved hjelp av deres evne til å bindes til CA125

[R. Madiyalakan et al, Hybridoma, 14:199-203 (1995)]. Slike anti-CA125 antistoffer ble videre klassifisert til å være mot B43.13 epitopen eller B27.1 epitopen ved deres evne til å inhibere de tilsvarende antistoffer. Rasjonalen for klassifikasjonen kommer fra det faktum at anti-CA125 antistoffer i disse pasienter ville ha blitt dannet på en av følgende to måter:

1) Hvis anti-CA125 antistoffet ble dannet på den måten foreslått av nettverksteorien beskrevet ovenfor, ville ruten følge ABl-> Ab2 Ab3.1 henhold til dette skjema ville MAb-B43.13 (Abl) danne en anti-idiotyp mot MAb-B43.13 (Ab2) som i sin omgang ville danne en anti-anti-idiotyp mot MAb-B43.13 (Ab3; eller anti-CA125 antistoff). Videre ville Ab3 antistoffer dannet på denne måte binde og bli inhibert bare av MAb-B43.13, fordi B43.13 epitopen er den eneste epitop tilstede. 2) Hvis anti-CA125 antistoffer ble dannet på en måte foreslått ved foreliggende oppfinnelse, ville ruten følge Abl + oppløselige antigen Ab3'. I henhold til dette skjema ville MAb-B43.13 (Abl) binde CA 125 serumantigen, som i sin tur ville danne et anti-CA125 antistoff (Ab3'). Videre ville Ab3<*> antistoffer dannet på denne måte binde og bli inhibert av B27.1 antistoffer, fordi som angitt ovenfor CA125 er multiepitopisk og B43.13 og B27.1 epitoper er adskilte; i tillegg vil ikke Ab3' bindes til anti- MAb-B43.13 antistoffer.

Således hvis pasientens serum inneholdt anti-Cal25 antistoffer som var inhiberbare bare av MAb-B43.13 ble den klassifisert som å inneholde Ab3; de inhiberbare av MAb-B27.1 ble klassifisert som Ab3\

Resultater

14 pasienter utviklet et anti-CA125 antistoffer i sine sera (tabell 1) i respons til MAb-B43.13-injeksjon. 10 av disse 14 pasienter hadde Ab3' mens bare 2 pasienter hadde Ab3 antistoffer i sine sera. 2 pasienter hadde også begge antistoffene. Nærvær av Ab3 i deres sera ble også konfirmert ved evnen til disse antistoffer'å bindes til det rensede kanin-anti- MAb-B43.13 antistoff. Det var 2 pasienter (nr. 2 og nr 7) som hadde anti-CA125 antistoffer men som ikke var inhiberbare av MAb-B43.13 eller MAb-B27.1, noe som derved foreslår at de kan ha antistoffer mot CA 125 som gjenkjenner andre epitoper enn B43.13 eller B27.1.

Disse resultatene angir klart at når et antistoff mot en enkel epitop (B43.13) ble injisert i en pasient blir det dannet en antistoffrespons mot hele antigenet som gjenkjenner forskjellige epitoper som er tilstede i antigenet. Nærvær av Ab3 i noen pasienter kunne forklares av den mest sannsynlige nærvær av overskudd B43.13 epitop i CA 125 som skyldes utilstrekkelig binding av antistoffet til den epitop eller idiotypinduksjon gjennom rute I. Ikke desto mindre synes den dominerende mekanisme til responsen å være gjennom rute II. Med andre ord danner injeksjon av et monoklonalt antistoff til det et oppløselig multiepitopisk antigen i en pasient som har et funksjonerende immunsystem et antistoff til antigenet, hvor det dannede antistoff blir inhibert av antistoffer til forskjellige epitoper.

Eksempel 2

I farmasøytiske studier ble blodprøver analysert med hensyn på CA125-nivåer før og etter utvalgte intervall etter MAb-B43.13 injeksjon. I pasienter med forhøyet CA125-nivåer før injeksjon kunne det sees et signifikant fall i sirkulerende CA 125-nivåer øyeblikkelig etter MAb-B43.13 injeksjon (tabell 2). Dette demonstrerte klart at ved innføring i kroppen virker bindingsmidlet og fjerner det sirkulerende CA125.

Videre presenteres antigen kompleksert med antistoff effektivt til immunsystemet og danner bedre antigen-spesifikk humoral og cellulær respons. Dette ble demonstrert av de følgende eksperimenter vist i eksempel 3 og 4.

Eksempel 3.

Balb/c mus ble immunisert enten med 10ug MAb-B43.13 i PBS, i.v.; 10000 enheter av CA125 i PBS, i.v.; eller 10ug MAb-B43.13 og 10000 enheter CA125 i PBS, i.v., hver tredje uke med totalt 3 injeksjoner. Forholdet B43.13/CA125 injeksjon var lik det observert i pasienter med forhøyet CA125-nivåer basert på farmakokinetiske data gitt i tabell 2. Når musesera ble analysert med hensyn på anti-CA125-antistoffnivåer hadde musene injisert med antigen-antistoffkomplekset den høyeste titer. Anti-idiotyp induksjon i disse balb/c mus er vist grafisk i figur 1. Dette understøtter observasjonen at bindingsmiddel-antigen interaksjon fører til bedre antigen-spesifikk humoral immunrespons sammenlignet med bindingsmiddel eller antigen alene.

Eksempel 4.

På samme måte ble bedre cellulær immunrespons observert når bindemidlet ble presentert i assosiasjon med antigenet til T-cellene. Således ble makrofager isolert fra peritonealhulene hos mus stimulert med MAb-B43.13 alene; CA 125 alene, et MAb-B43.13-CA125-kompleks; eller kontroll MAb-CA125 og presentert for CA125-spesifikke muse T-celler (isolert fra mus injisert med CA 125). Når proliferasjonen til T-celler som overvåket ved

[<3>H]-Thymidin opptak ble fulgt, ble det observert optimal stimuleringsindeks i makrofager stimulert med antistoff-antigen kompleks (figur 2).

Eksempel 5.

Konklusjonen i eksempel 1 ble videre understøttet ved at det ble funnet en korrelasjon mellom serum CA125-nivåer hos pasienter injisert med MAb-B43.13 og human anti-CA125 antistoffdannelse. Funnene er vist i tabell 3 og understøtter den konklusjonen at antigenet skulle være til stede i steden for interaksjon med bindemidlet; slik interaksjon fører en antigen-spesifikk humoral respons.

Eksempel 6.

Rollen til serumantigen for å indusere multiepitopisk antistoffrespons som en konsekvens av en antistoffinjeksjon ble videre konfirmert i kaninundersøkelser. Kaniner som ikke har noe serum CA 125 produserte anti-CA125 antistoffer som ikke var inhiberbare ved B27.1 når de ble injisert med MAb-B43.13.1 motsetning produserte pasienter med ovariekreft, med høyt serumantigen CA125-nivåer, anti-CA125-antistoffer som er inhiberbare med B27.1 i respons til MAb-B43.13 injeksjon.

Eksempel 7. Eksperimentell verifikasjon av induksjon av antigen-spesifikk antitumorrespons ved antistoffinjeksjon

Human anti-CA125 antistoff forårsaker tumorcellelyse ved antistoffavhengig

cellulær cytotoksisitet («ADCC»). Skjønt det injiserte MAb-B43.13 ikke i seg selv forårsaker en ADCC og/eller komplementavhengig cytolyse («CDC») mediert lyse av ovarietumorceller, fører dannelsen av anti-CA125 antistoffer i pasienter injisert med MAb-B43.13 til tumorcellelyse (se figur 3). Dette ble undersøkt i et

<51>kromfrigjøringsassay ved inkubasjon av merkede ovarietumorceller med

effektorceller, og sera fra 6 pasienter injisert med MAb-B43.13. Dette understøttet konklusjonen at injeksjon av et bindemiddel fører til dets interaksjon med antigenet, med et spesifikt humoral respons som resulterer i anti-CA125 antistoffer som forårsaker tumorcellelyse gjennom ADCC. Disse resultatene demonstrerer klart dannelse av antigen-spesifikk anti-tumorrespons etter injeksjon av antistoffer.

Eksempel 8. Dannelse av CA125-spesifikk cytotoksiske T-lymfocytter i pasienter injisert med MAb-B43.13.

Lignende injeksjon av bindemiddel til cancerpasienter som inneholder CA125 fører til antigen-spesifikke CTL. Perifert blod mononukleære celler (PBMC) fra 8 pasienter injisert med MAb-B43.13 ble testet for cytotoksisitet mot CA125 positive eller CA125 negative ovarietumorceller i et kromfrigjøringsassay. Resultatene er vist i tabell 4. Spesifisiteten til lyse ble konfirmert ved evnen til MAb-B43.13 til å inhibere slik lyse, så vel som den manglende evne til å drepe CA 125 negative tumorceller. Av de 8 pasienter som mottok MAb-B43.13 ble minst 4 pasienter (nr. 5-8) bestemt å ha CA 125-spesifikke cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) i sitt blod. Dannelsen av CA125-spesifikke CTL er i stand til å drepe ovarietumorceller i pasienter.

Resultater er gjennomsnitt av et eksperiment utført i triplikat.

Eksempel 9.

Tumordreping enten gjennom en anti-CA125 antistoff-mediert ADCC mekanisme eller gjennom CAl25-spesifikk CTL, fører til øket overlevelse hos pasienter injisert med MAb-B43.13. Skjønt høye nivåer av serum CA125 er blitt foreslått å være en dårlig prognostisk indikator synes de å ha en gunstig effekt i kombinasjon med injeksjon av anti-CA125 antistoffer i slike pasienter. For eksempel når CA125-nivåer var mer enn 100 enheter/ml, øket immunrespons mot CA125 med mer enn 20% som i sin tur øket median overlevelse i de pasienter fra 39,1 måned til 54,5 måned (tabell 5). Således første injeksjon av et bindemiddel til en pasient som hadde eleverte nivåer av multiepitopisk oppløselig antigen til antigen-spesifikk humoral og cellulær respons som i sin tur førte til tumordreping etterfulgt av forbedret overlevelse.

Eksempel 10.

En pankreatisk kreftpasient diagnostisert med metastatisk sykdom ble gjentatte ganger injisert med en sammensetning som inkluderer et anti-CA19.9 antistoff. Pasienten mottok ingen annen behandling og overlevde i 22 måneder etter den originale diagnose (19 måneder etter kirurgi og injeksjon). Dette til sammenligning med eksisterende vurdering av overlevelsesperiode på 6 måneders overlevelse etter initiell diagnose.

Eksempel 11.

De med kunnskap på området erkjenner at den administrerte dose kan variere i stor grad basert på et utstrakt sett av forskjellige omstendigheter. Det følgende tilveiebringer preliminære doseretningslinjer.

Retrospektiv analyse av mer enn 100 pasienter som var blitt injisert opptil 10 ganger med en 2mg dose av MAb-B43.13 angir at noen av disse pasientene erfarte: a) en uvanlig sykdomsutvikling, karakterisert ved uventet lange overlevelsestider, og b) ingen signifikant nedbrytende reaksjon eller toksisitet.

Immunologiske undersøkelser ble utført for å forstå og evaluere in vivo virkningsmekanismen til MAb-B43.13. Disse undersøkelsene indikerte at utstrekningen av anti-idiotypisk induksjon i pasienter injisert med 2mg dose av MAb-B43.13 ikke var relatert til antall injeksjon eller sykdommens kliniske trinn. Den anti-idiotypiske induksjon var imidlertid avhengig av nivåene til det sirkulerende CA125 tilstede i pasientens sera. Ytterligere eksperimenter demonstrerte at injeksjon av MAb-B43.13 i pasienter med målbart serum CA 125 førte til dannelsen av antigen-antistoffkomplekser, som resulterte i antigenepitop-presentasjon og antigen-spesifikk humoral og cellulær respons til tumoren.

Disse undersøkelsene indikerer at en effektiv dose krever bare nok antistoff til optimalt å levere og presentere alle mulige sirkulerende CA125-antigen til immunsystemet. In vitro undersøkelser indikerer at Ing av MAb-B43.13 kan binde 10 enheter av CA 125. Hvis man antar 40 ml plasma per kg kroppsvekt kan injeksjon av 2mg MAb-B43.13 i en 60kg pasient binde ca. 8333 U/ml CA 125 serum. Siden alle pasientene med ovariekreft testet opp til dags dato hadde mye mindre enn 8333 U/ml CA125 i sitt serum, er en injeksjon på 2mg MAb-B43.13 mer enn tilstrekkelig for å indusere den nødvendige immunrespons. I tillegg fikk pasienter som mottok radiomerket MAb-B43.13 for immunoscintografisk konfirmasjon av sykdommen var resultatene fra billeddannelsen utmerkede på tross av høy serum CA125, noe som foreslår at det er et overskudd av MAb-B43.13 for spesifikk tumoropptak.

Videre synes flertall av injeksjoner med utvalgte intervaller å tilveiebringe optimal fordel for pasientene, siden CA125 blir dannet gjennom sykdomstiden.

Til slutt viste den retrospektive analyse av 2mg dose synes å ha terapeutisk virkningsgrad; ingen av pasientene (flere enn 100} har utviklet noen alvorlige bivirkninger eller uønskede reaksjoner. Hvis den totale HAMA-respons er en indikasjon på anti-idiotypisk induksjon danner en 2mg dose signifikante nivåer av anti-idiotypiske antistoffer for å produsere den ønskede terapeutiske fordel. Et flertall av injeksjonene på 2mg MAb-B43.13 på utvalgte intervaller synes å opprettholde de anti-idiotypiske antistoffene på det ønskede terapeutiske nivå uten å forårsake noen isotypisk HAMA-indusert toksisitet.

Et område av effektive doser eller en terapeutisk akseptabel mengde av MAb-B43.13 inkluderer derfor, men er ikke begrenset til 2mg.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser de gunstige resultatene oppnådd etter immunisering av mus med en sammensetning i henhold til foreliggende oppfinnelse, sammenlignet med andre sammensetninger. Figur 2 viser overlegen makrofagstimulering forårsaket av en sammensetning i henhold til foreliggende oppfinnelse, sammenlignet med andre sammensetninger. Figur 3 viser tumorcellelyse forårsaket ved å administrere en sammensetning i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Industriell anvendbarhet

Sammensetningene som omfatter et bindemiddel i henhold til foreliggende oppfinnelse er særlig nyttig i sammensetninger som inneholder en immunogen eller terapeutisk mengde av minst ett av bindemidlene i henhold til oppfinnelsen. En immunogen eller terapeutisk mengde er en mengde som stimulerer en immunrespons av humoral, cellulær eller kombinert humoral og cellulær karakter i verten. Vertens immunrespons omfatter øket aktivitet mot en epitop på en tumorassosiert antigen som er forskjellig fra epitopen til hvilken bindingsmidlet bindes. Sammensetningen i henhold til foreliggende oppfinnelse blir administrert som antitumorvaksiner til personer med risiko for utvikling av malignitet, eller til personer som viser en diagnose som er malign. Disse sammensetningene kan brukes til å fremstille farmasøytiske sammensetninger som utløser en immunrespons.

Claims (8)

1. Terapeutisk sammensetning som omfatter en effektiv mengde av et bindingsmiddel som er spesifikt for en første epitop på et multiepitopisk in vivo antigen som er tilstede i vertens serum hvor antigenet ikke utløser en effektiv vertsimmunrespons, karakterisert ved at bindingsmiddelet som er tilstede i sammensetningen er det monoklonale antistoffet B43.13, som spesifikt bindes til en første epitop på antigenet og danner et bindingsmiddel/antigenpar, hvorved en effektiv vertsimmunrespons blir utløst mot et andre epitop på antigenet.

2. Terapeutisk sammensetning som angitt i krav 1, karakterisert ved at B43.13 er tilstede i sammensetningen i en mengde fra 0,1 ug til 2 mg per kg vertskroppsvekt, fortrinnsvis fra lug til 200 ug per kg vertskroppsvekt.

3. Terapeutisk sammensetning som angitt i ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at antigenet er CA 125, fortrinnsvis hvori nivået av CA125 i vertens serum er større enn 100 U/ml.

4. Terapeutisk sammensetning som angitt i ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at bindingsmiddelet er blitt eksponert for bestråling, fortrinnsvis ultrafiolett bestråling.

5. Terapeutisk sammensetning som angitt i ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at sammensetningen ytterligere omfatter en eller flere adjuvantia, en eller flere bærere, en eller flere eksipienter, en eller flere stabilisatorer, en eller flere billeddannende reagenser, en eller flere farmasøytisk akseptable bærere og/eller fysiologisk akseptabel saltoppløsning.

6. Anvendelse av den terapeutiske sammensetningen som angitt i ethvert av de foregående krav, til fremstilling av et legemiddel for behandling av kreft hos mennesker.

7. Terapeutisk sammensetning som angitt i ethvert av kravene 1-5, karakterisert ved at den er tilpasset administrering til verten ved enhver immunologisk egnet rute, fortrinnsvis intravenøs, subkutan, intraperitoneal, intradermal, intramuskulær og/eller intralymfatisk rute.

8. Terapeutisk sammensetning som angitt i ethvert av kravene 1-5 og 7, karakterisert ved at sammensetningen skal administreres i form av en løsning, tablett og/eller aerosol.