ES2293751B1 - Composiciones terapeuticas que alteran la respuesta inmune (alt-014pc). - Google Patents

Abstract

Composiciones farmacéuticas que alteran la respuesta inmune por contener un agente de unión que se une al antígeno CA125 formando un complejo: agente de unión-antígeno, que es capaz de inducir en el hospedador la generación de nuevos inmunógenos. Estos inmunógenos pueden ser reconocidos por el sistema inmune, dando lugar a una respuesta antitumoral y/o destrucción celular. Dichas composiciones son especialmente útiles para prolongar la vida de un paciente de cáncer.

Description

Composiciones terapéuticas que alteran la respuesta inmune (ALT-014PC).

Campo técnico

La invención se refiere a procedimientos y composiciones que tienen un efecto terapéutico incrementado alterando la inmunogenicidad del componente activo sin disminuir la antigenicidad del componente activo. De forma típica, se obtiene un efecto terapéutico beneficioso de alterar el estado del sistema inmune y para algunas realizaciones de la invención, por ejemplo, inmunoterapia del cáncer, se induce, activa o incrementa la inmunogenicidad. La invención se refiere también a procedimientos y composiciones para estimular la respuesta inmune de un hospedador, en particular para el tratamiento del cáncer. Los procedimientos y composiciones conforme a la invención usan agentes de unión tales como anticuerpos para generar una respuesta inmune frente a un antígeno predeterminado.

Técnica anterior

En vertebrados, los mecanismos de la inmunidad natural y específica cooperan en un sistema de defensas del hospedador, el sistema inmune, para eliminar invasores extraños. La hipótesis de que el sistema inmune debe se capaz de reconocer tumores y así poder recuperarse en la lucha contra el cáncer ha sido una fuerza impulsora detrás de notables esfuerzos de muchos inmunólogos. Este enfoque es atractivo debido a la capacidad única del sistema inmune para destruir de forma específica células afectadas mientras que el tejido normal apenas se ve afectado. Por otro lado, la respuesta inmune inicial es conocida por dejar una memoria a largo plazo que sirve para proteger de la misma enfermedad en el futuro. Ningún tratamiento farmacológico para el cáncer puede reivindicar dicha especificidad o memoria.

Una estrategia inmunoterapéutica para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades y estados patológicos implica que uno o más componentes del sistema inmune desencadenen una cascada compleja de reacciones biológicas enfocadas a eliminar una molécula extraña del hospedador. Los vertebrados tienen dos clases amplias de respuestas inmunes: respuestas de anticuerpos o inmunidad humoral, y respuestas inmunes mediadas por células, o inmunidad celular.

La inmunidad humoral es proporcionada por linfocitos B que, después de la proliferación y diferenciación, producen anticuerpos (proteínas también conocidas como inmunoglobulinas) que circulan en la sangre y fluidos linfáticos. Estos anticuerpos se unen de forma específica al antígeno que los indujo. La unión por anticuerpos inactiva la sustancia extraña, por ejemplo, un virus, bloqueando la capacidad de la sustancia para unirse a receptores en una célula diana o atrayendo el complemento o los linfocitos citotóxicos que atacan el virus. La respuesta humoral defiende fundamentalmente contra las fases extracelular de infecciones bacterianas y víricas. En la inmunidad humoral, el suero solo puede transferir la respuesta y los efectores de la respuesta son moléculas de proteína, típicamente solubles, denominadas anticuerpos. Los linfocitos producen estos anticuerpos y por tanto determinan la especificidad de la inmunidad; es esta respuesta la que orquesta las ramas efectoras del sistema inmune. Las células y proteínas, tales como anticuerpos, que interaccionan con linfocitos desempeñan funciones críticas tanto en la presentación de antígeno como en la mediación de funciones inmunológicas.

Los linfocitos individuales responden a un grupo limitado de antígenos estructuralmente relacionados. Como se aprecia con más detalle más adelante, esta función se define estructuralmente por la presencia de receptores sobre la membrana de la superficie de linfocitos que son específicos para los sitios de unión (determinantes o epítopos) del antígeno.

Los linfocitos se diferencian entre sí no sólo en la especificidad de sus receptores, sino también en sus funciones. Una clase de linfocitos, los linfocitos B, son precursores de células secretoras de anticuerpos, y funcionan como mediadores de la respuesta inmune humoral.

Otra clase de linfocitos, los linfocitos T, expresan funciones reguladoras importantes y son mediadores de la respuesta inmune celular. La segunda clase de respuestas inmunes, inmunidad celular, implica la producción de células especializadas, por ejemplo, linfocitos T, que reaccionan con xenoantígenos sobre la superficie de otras células hospedadoras. La respuesta inmune celular es particularmente eficaz contra infecciones por hongos, parásitos, virus intracelulares, células cancerosas y otra materia extraña. De hecho, la mayoría de linfocitos T desempeña una función reguladora en la inmunidad, actuando bien potenciando o bien suprimiendo las respuestas de otros linfocitos. Estas células, denominadas linfocitos T auxiliares y linfocitos T supresores, respectivamente, se denominan de forma conjunta células reguladoras. Otros linfocitos T, denominados linfocitos T citotóxicos, destruyen, por ejemplo, células infectadas por virus o células tumorales. Tanto los linfocitos T citotóxicos como los linfocitos B están implicados directamente en la defensa contra la infección y se denominan conjuntamente células efectoras. Existe una serie de señales intercelulares importantes para la activación de las células T. En circunstancias normales un antígeno se degrada o es escindido formando fragmentos de antígeno o péptidos. La presentación de fragmentos de antígeno a los linfocitos T es la función principal de las moléculas MHC y las células que llevan a cabo esta función se denominan células presentadoras de antígeno (APC: que incluyen, aunque sin limitarse, células dendríticas, macrófagos y linfocitos B).

\newpage

El intervalo de tiempo de una respuesta inmune se subdivide en la fase cognitiva o de reconocimiento, durante la cual linfocitos específicos reconocen el xenoantígeno; la fase de activación, durante la cual linfocitos específicos responden al xenoantígeno; y la fase efectora, durante la cual los linfocitos activados por antígenos median en procesos requeridos para eliminar las células diana que portan los antígenos. Los linfocitos son células inmunes que están especializadas en mediar y dirigir respuestas inmunes específicas. Los linfocitos T y los linfocitos B se hacen morfológicamente distintos sólo después de que han sido estimulados por un antígeno.

La captura y procesado de un antígeno por APC es esencial para la inducción de una respuesta inmune específica. Las APC capturan antígenos a través de receptores específicos, tales como receptores Fc o receptores de manosa, o las APC fagocitan de forma no específica antígenos. La captura a través de receptores específicos es más eficiente; los antígenos pueden ser presentados mejor cuando están complejados con, por ejemplo, un anticuerpo. Dicho complejo puede formarse inyectando un anticuerpo a un antígeno circulante (por ejemplo, PSA o CA125) y los complejos inmunes pueden dirigirse a células dendríticas y macrófagos a través de los receptores Fc presentes en estas células. Sin embargo, el alto números de receptores Fc en neutrófilos puede limitar considerablemente este proceso.

La inmunoterapia se basa en el principio de inducir o activar el sistema inmune para reconocer y eliminar células indeseables, tales como células neoplásicas. Los elementos fundamentales en cualquier inmunoterapia son inducir o desencadenar el sistema inmune del hospedador para reconocer en primer lugar una molécula como una diana no deseada y, seguidamente inducir el sistema para iniciar una respuesta contra dicha molécula. En hospedadores sanos, el sistema inmune reconoce características de superficie de una molécula que no es un constituyente normal del hospedador (es decir, es "extraño" al hospedador). Una vez que se produce el reconocimiento, el hospedador deberá dirigir entonces una respuesta contra dicha molécula extraña particular.

Tanto los elementos de reconocimiento como de respuesta del sistema inmune implican una cascada altamente compleja de reacciones biológicas. En la mayoría de trastornos con base inmunológica, al menos una de las etapas en la fase de reconocimiento, o al menos una de las etapas en la fase de respuesta, se altera. Virtualmente, cualquier alteración en cualquiera de estas complejas vías conduce a una respuesta reducida o a la falta de respuesta alguna. La incapacidad del sistema inmune para destruir un tumor que crece se ha atribuido, entre otros factores, a la presencia de antígenos asociados al tumor (TAA) que inducen tolerancia inmunológica y/o inmunosupresión. Por ejemplo, en algunos tipos de cáncer, el propio cáncer engaña al hospedador para aceptar la célula cancerosa extraña como constituyente normal, alterando de este modo la fase de reconocimiento del sistema inmune. El enfoque inmunológico a la terapia del cáncer implica la modificación de la relación hospedador-tumor de modo que el sistema inmune es inducido o amplifica su respuesta a los TAA. Si tiene éxito, inducir o amplificar el sistema inmune puede conducir a la regresión del tumor, el rechazo al tumor y, en ocasiones, a la curación del tumor.

Antigenicidad e inmunogenicidad

Tal y como se usa en la presente memoria, si un agente de unión puede reconocer un antígeno, es decir, puede unirse a dicho antígeno, o interaccionar con el mismo, entonces se dice que el antígeno es antigénico. Si el sistema inmune también puede preparar una respuesta activa contra el antígeno, un complejo que contiene el antígeno, una porción del complejo, o el agente de unión propiamente dicho, se dice que es inmunógeno.

La definición convencional de un antígeno es una sustancia (tal como un anticuerpo o un antígeno) que puede provocar en un hospedador vertebrado la formación de un anticuerpo específico o la generación de una población específica de linfocitos reactivos con la sustancia. Sin embargo, como ocurre frecuentemente en ciencia, ahora se conoce que esta definición, aunque precisa no es completa. Por ejemplo, se sabe que algunos estados de enfermedad suprimen o inactivan la respuesta inmune del hospedador, y la sustancia que se habría esperado originara un anticuerpo o generara linfocitos específicos no lo hace. Así, no todos los antígenos pueden provocar una respuesta inmune humana.

De forma típica, la capacidad de los anticuerpos para unirse al antígeno se basa en estructuras altamente complementarias. Es decir, la forma del anticuerpo debe contener estructuras que sean el complemento de las estructuras del antígeno. La porción del antígeno a la que se une el anticuerpo se denomina "determinante antigénico" o "epítopo". Así, los antígenos son moléculas que soportan uno o más epítopos que pueden ser reconocidos por receptores específicos en un sistema inmune, una propiedad denominada antigenicidad.

Inmunogenicidad se refiere a la propiedad de estimular el sistema inmune para generar una respuesta específica. Así, todos los inmunógenos son antígenos, pero no al contrario. Aunque un sistema inmune puede reconocer un antígeno (por ejemplo, se une a un receptor de linfocitos T o B), no responde al antígeno a menos que el antígeno o un complejo que contenga el antígeno sea también inmunógeno.

Una respuesta inmune a un antígeno particular está enormemente influenciada por la estructura y actividad del propio antígeno, así como por multitud de otros factores. En algunos casos, el sistema inmune no puede generar una respuesta inmune a un antígeno particular, un estado que se denomina tolerancia.

A la hora de influir en determinar si un antígeno es inmunógeno o inmunotolerante, una característica importante del antígeno es el grado de diferencia entre el antígeno y moléculas similares en el hospedador. Los antígenos más inmunógenos son los que no tienen homólogos en el hospedador, es decir, los que son más "xenógenos". Otros factores que promueven la inmunogenicidad incluyen un mayor peso molecular, mayor complejidad molecular, el intervalo de dosis de antígeno apropiado, la vía de administración, la edad del hospedador y la composición genética del hospedador (incluyendo exposición a antígenos durante el desarrollo fetal).

Como se ha indicado antes, los antígenos pueden tener uno o más epítopos o sitios de unión que son reconocidos por receptores específicos del sistema inmune. Los epítopos pueden formarse por la estructura primaria de una molécula (denominado un epítopo secuencial), o pueden formarse por porciones de la molécula separadas de la estructura primaria que se yuxtaponen en la estructura secundaria o terciaria de la molécula (denominado un epítopo conformacional). Algunos epítopos, por ejemplo, los epítopos crípticos, están ocultos en la estructura tridimensional del antígeno nativo y se hacen inmunógenos solo después de que un cambio conformacional en el antígeno proporciona acceso al epítopo por los receptores específicos del sistema inmune. Algunos antígenos, por ejemplo, antígenos asociados a tumores como antígenos de cáncer de ovario o de cáncer de mama, tienen múltiples sitios de unión de anticuerpo. Estos antígenos se denominan antígenos "multiepitópicos".

Una característica y función importante de un reaccionante terapéutico general es la capacidad para iniciar el reconocimiento y respuesta a un antígeno, inducir una respuesta celular y humoral (cualquiera o ambas) frente al antígeno y aumentar la inmunogenicidad de una molécula sin afectar a su antigenicidad.

Los anticuerpos tienen tres categorías principales de determinantes específicos del antígeno -isotípico, alotípico e idiotípico- cada uno de los cuales se define por su posición en la molécula de anticuerpo. A efectos de la presente invención, nos centraremos solo en la categoría idiotípica.

Los determinantes idiotípicos o idiotopos, son marcadores para la región V de un anticuerpo, una región relativamente grande que puede incluir varios idiotopos, cada uno capaz de interaccionar con un anticuerpo diferente. El grupo de idiotopos expresado en una única región V de anticuerpo constituye el idiotipo del anticuerpo. Un anticuerpo (Ab1) cuyo sitio de combinación de antígeno (paratopo) interacciona con un determinante antigénico en otra región V de anticuerpo (idiotipo) se denomina anticuerpo antiidiotípico (Ab2). Así, un anticuerpo Ab2 incluye un sitio de unión a antígeno que también es un sitio de unión a anticuerpo. Una porción de dichos anticuerpos antiidiotípicos (es decir, Ab2_) definirá un epítopo en el paratopo del anticuerpo idiotípico, presentando así una imagen "interna" del epítopo identificada por el anticuerpo idiotípico sobre el antígeno asociado a un tumor. El fenómeno de producir un anticuerpo antiidiotípico que tiene una imagen interna del antígeno puede permitir el uso de anticuerpos para reemplazar el antígeno como inmunógeno. En la Figura 1 puede encontrarse una representación gráfica de estos tipos de anticuerpos y su interacción.

Para tumores que tienen antígenos, existen al menos cuatro teorías sobre por qué puede fallar la respuesta inmune en destruir un tumor: 1) no existen linfocitos B o linfocitos T citotóxicos (CTL) capaces de reconocer el tumor; 2) no existen células TH capaces de reconocer el tumor; 3) las células TS se activan antes que las células TH, evitando así la activación de los linfocitos B y CTL; y 4) los genes que regulan la proliferación del tumor pueden estar presentes desde el nacimiento, por lo que el hospedador no trata a los productos génicos como "extraños".

La "inmunoterapia pasiva" implica la administración de anticuerpos a un paciente. La terapia con anticuerpos se caracteriza convencionalmente como pasiva puesto que el paciente no es la fuente de anticuerpos. No obstante, el término pasiva es confuso debido a que el paciente puede producir anticuerpos secundarios antiidiotípicos que a su vez pueden provocar una respuesta inmune que cruzada con el antígeno original. La "inmunoterapia activa" es la administración de un antígeno, en forma de una vacuna a un paciente, de modo que se induce una respuesta inmune protectora. Para aliviar la inadecuación de la respuesta inmune específica al tumor se han usado también vacunas de células tumorales genéticamente modificadas transfectadas con genes que expresan citoquinas y moléculas coestimuladoras.

Si se inyecta un anticuerpo específico de un animal como un inmunógeno en un segundo animal adecuado, el anticuerpo inyectado provocará una respuesta inmune (por ejemplo, produce anticuerpos contra los anticuerpos inyectados - "antianticuerpos"). Algunos de estos antianticuerpos serán específicos para los epítopos característicos (idiotopos) del dominio variable de los anticuerpos inyectados (anticuerpos antiidiotípicos). Otros serán específicos para los epítopos de los dominios constantes de los anticuerpos inyectados y por ello son conocidos como anticuerpos antiisotípicos.

Las diversas interacciones basadas en determinantes idiotípicos, denominada red idiotípica, se basan en la inmunogenicidad de las regiones variables de moléculas de inmunoglobulinas (Ab1) que estimulan el sistema inmune generando anticuerpos antiidiotípicos (Ab2_), algunos de los cuales imitan epítopos antigénicos ("imagen interna") del antígeno original. La presencia de anticuerpos imagen interna (Ab2) en la circulación puede inducir a su vez la producción de anticuerpos anti-antiidiotípicos (Ab3), algunos de los cuales inducen estructuras que reaccionan con el antígeno original.

La teoría de la "red" afirma que los anticuerpos producidos inicialmente durante una respuesta inmune portarán nuevos epítopos característicos a los cuales no es tolerante el organismo y, por tanto, inducirá la producción de anticuerpos secundarios (Ab2) dirigidos contra los idiotipos de los anticuerpos primarios (Ab1). Estos anticuerpos secundarios tendrán igualmente un idiotipo que inducirá la producción de anticuerpos terciarios (Ab3) y así sucesivamente.

Ab1 \rightarrow Ab2 \rightarrow Ab3

En otras palabras, una forma de un anticuerpo antiidiotípico puede ser un antígeno sustituto.

De la teoría de la red se derivan dos aplicaciones terapéuticas: 1) administrar Ab1 que actúa como antígeno que induce la producción de Ab2 por el hospedador; y 2) administrar Ab2 que imita funcionalmente el antígeno tumoral.

El desarrollo de la teoría de la "red" condujo a los investigadores a sugerir la administración directa de anticuerpos antiidiotípicos producidos de forma exógena, es decir, anticuerpos producidos contra el idiotipo de un anticuerpo antitumoral. Dicha técnica se describe en la patente de Estados Unidos 5.053.224 (Koprowski, et al.). Koprowski asume que el cuerpo del paciente producirá anti-anticuerpos que no solo reconocerán estos anticuerpos antiidiotípicos, sino también el epítopo del tumor original.

Los anticuerpos antiidiotípicos convencionales se preparan por inmunización intraespecie o interespecie con un grupo de anticuerpos específicos del antígeno purificados o un anticuerpo monoclonal. El antisuero resultante se absorbe entonces de forma extensa contra moléculas similares con la misma región constante para eliminar anticuerpos con especificidades anti-C_{H}C_{L}. Véase, por ejemplo, Briles, et al.; "Idiotypic Antibodies", Immunochemical Techniques (New York, Academic; Colowich and Kaplan, eds; 1985). La producción de anticuerpos anti-ID contra autoidiotipos fue una de las primeras predicciones fundamentales de la teoría de la red [Rodkey, S., J. Exp. Med 130:712-719 (1974)].

Un anticuerpo monoclonal antiidiotípico (Ab2) ha mostrado que induce respuestas celulares antitumorales en animales y parece prolongar la supervivencia en pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Véase Durrant, L.G. et al., "Enhanced Cell-Mediated Tumor Killing in Patients Immunized with Human Monoclonal Anti-Idiotypic Antibody 105AD7", Cancer Research, 54:4837-4840 (1994). El uso de anticuerpos antiidiotípicos (Ab2) para inmunoterapia del cáncer también se revisa por Bhattacharya-Chatterje, et al; Cancer Immunol. Immunother. 38:75-82 (1994).

Los idiotopos en receptores linfoides pueden en algunos casos imitar a antígenos externos debido a la extensa diversidad del sistema inmune. Esta idea impulsó muchos intentos de usar la imagen interna de un xenoantígeno, imitado por los idiotipos de receptores T o B, para actuar como dianas para anticuerpos antiidiotípicos. De este modo, se ha propuesto que anticuerpos antiidiotípicos puedan inducir poblaciones de linfocitos T o B que puedan unirse a antígeno extrínseco (o soluble). Dichos anticuerpos antiidiotípicos se pueden usar como vacunas, muchas de las cuales se resumen en Greenspan, NS, and Bona, CA; The FASEB Journal, 7:437-444 (1992).

La capacidad para regular hacia niveles inferiores o superiores respuestas inmunes y controlar células inmunocompetentes potencialmente autorreactivas es vital para la función inmune normal y la supervivencia. Los mecanismos de regulación incluyen la inducción de falta de respuesta inducida por anergia clonal (a través de células presentadoras de antígeno inapropiadas), eliminación clonal/apóptosis periférica, citoquinas (por ejemplo, factor beta de crecimiento transformante (TGF-\beta) o IL-10), células "veto", linfocitos T citotóxicos autorreactivos y células supresoras T no específicas y específicas del antígeno. Al menos en teoría, cada uno de estos sistemas de regulación proporciona una base mecanística para la "intervención terapéutica".

Además de la inmunoterapia del cáncer, el control de la respuesta inflamatoria aguda y crónica anómalas también es uno de los retos más importantes en medicina. Ejemplos típicos de inflamación aguda y crónica incluyen atopía, urticaria, asma, anemia hemolítica autoinmune, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedades granulomatosas, tuberculosis y lepra.

Al igual que la respuesta inmune tumoral descrita antes, el objeto de la respuesta inflamatoria es la eliminación de agentes perjudiciales. Además, el tratamiento de enfermedad inflamatoria autoinmune se ve muchas veces complicado por factores autoinmunes que evitan que el hospedador elimine los agentes perjudiciales, conduciendo de este modo a una respuesta o estado inflamatorio persistente o crónico.

En la actualidad, se ha determinado que los sucesos esenciales en el desarrollo de la inflamación incluyen una respuesta celular que implica neutrófilos y macrófagos, específicamente el desplazamiento, activación y adhesión de neutrófilos al endotelio a través de la interacción de ligandos selectinas-hidratos de carbono (y puede incluir extravasación de neutrófilos).

Las composiciones terapéuticas para el tratamiento de inflamación han incluido agentes que se unen a uno o más de los mediadores de inflamación. Por ejemplo, anticuerpos específicos para ligandos selectina-hidratos de carbono, e inhiben la unión del ligando selectina-hidrato de carbono, pueden ser dianas antiinflamatorias importantes para el desarrollo de composiciones terapéuticas para el tratamiento de inflamación.

Además de lo anterior, existen otros casos en los que puede ser útil un modo antiidiotípico de inducción de una respuesta. Si un epítopo dado de una proteína es discontinuo y se origina del plegamiento tridimensional, puede producirse un anticuerpo anti-Id que imite dicha estructura. Por otro lado, en la inmunización contra virus latentes y/o inmunosupresores, existe la posibilidad de los efectos perjudiciales bien conocidos no solucionables por el uso de virus atenuados (por ejemplo, paperas, sarampión, rubeola y VIH). El uso de inducción de antígenos anti-ID de inmunidad protectora evita estos efectos perjudiciales.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento y una composición para generar una respuesta inmune humoral y/o celular administrando un agente de unión que se une de forma específica a un antígeno soluble previamente seleccionado. Conforme a la invención, el complejo agente de unión-antígeno soluble altera el estado inmunogénico del hospedador generando nuevos inmunógenos que pueden ser reconocidos por el sistema inmune. Esto conduce a una respuesta celular y/o humoral. En una realización de la invención, la respuesta inmune comprende una respuesta antitumoral y/o destrucción celular.

La presente invención se refiere a un procedimiento general para el tratamiento de ciertas enfermedades y estados patológicos que incluye, aunque sin quedar limitado a, dirigir un antígeno predeterminado, preferiblemente un antígeno multiepitópico y/o preferiblemente soluble; administrar un agente de unión, preferiblemente un anticuerpo monoclonal e inducir una respuesta inmune general contra la enfermedad o estado patológico que genera el antígeno diana. En una realización preferida de la invención, el agente de unión o el complejo agente de unión-antígeno induce la producción de una respuesta humoral, como se evidencia en parte por la producción de anticuerpos anti-antígeno (por ejemplo, antitumorales o antiinflamatorios), Ab3 y/o Ab1c; y/o induce la producción de una respuesta celular, como se evidencia en parte por la producción de linfocitos T que son específicos para el agente de unión, el complejo agente de unión/antígeno y/o el antígeno.

La presente invención también incluye procedimientos y composiciones para alterar el estado inmunogénico del organismo hospedador. Al alterar el estado inmunogénico, las composiciones y procedimientos de la presente invención aumentan, disminuyen o mantienen el estado inmunogénico del hospedador. Un ejemplo de obtener un beneficio terapéutico aumentando la inmunogenicidad incluye, aunque sin estar limitado a los mismos, tratamientos para la artritis reumatoide. Un ejemplo de mantener la inmunogenicidad incluye, aunque sin quedar limitado a los mismos, tratamientos para el cáncer o algunas enfermedades infecciosas. Un ejemplo de disminuir la inmunogenicidad incluye, aunque sin estar limitado a los mismos, tratamientos suplementarios para pacientes que se han vuelto tolerantes a antígenos después de una respuesta inicial. En la realización más preferida de la invención, los procedimientos y composiciones no disminuyen la antigenicidad del componente activo en la composición terapéutica.

La presente invención también incluye procedimientos y composiciones para aumentar la respuesta general del hospedador a una enfermedad o estado patológico. Estos procedimientos y composiciones producen un beneficio terapéutico para el receptor.

La presente invención también es una composición terapéutica que comprende un agente activo, o un agente de unión, que se une específicamente a un antígeno soluble predeterminado, formando el agente de unión, tras la unión al antígeno, un complejo que es antigénico e inmunógeno.

Las composiciones y procedimientos de la presente invención pueden incluir también una o más etapas o sustancias que aumenten la inmunogenicidad general.

Las composiciones terapéuticas y procedimientos de la presente invención son adecuados para el tratamiento de cualquier enfermedad o cáncer que produzca un antígeno soluble, preferiblemente un antígeno multiepitópico.

La presente invención también incluye un procedimiento para diseñar nuevos agentes terapéuticos que comprende seleccionar un antígeno soluble, preferiblemente un antígeno que se ha determinado es multiepitópico; y seleccionar un agente de unión que se una de forma específica a dicho antígeno formando un complejo. Conforme a la invención, el agente de unión, el complejo agente de unión/antígeno y/o el antígeno conducen a la producción de una respuesta humoral y/o celular in vivo. En una realización preferida de la invención, el procedimiento para diseñar un nuevo agente terapéutico tiene como resultado un agente de unión o un complejo agente de unión/antígeno que induce la producción de una respuesta humoral, como se evidencia en parte por la producción de anticuerpos antitumorales o antiinflamatorios, Ab3 y/o Ab1c; y/o induce la producción de una respuesta celular, como se evidencia en parte por la producción
de linfocitos T que son específicos para el agente de unión, el complejo agente de unión/antígeno y/o el antígeno.

Aunque varios investigadores han demostrado que los anticuerpos específicos del antígeno pueden potenciar la respuesta inmune a los antígenos presentados en una forma de complejo, la presente invención es la primera en demostrar que la inyección de un anticuerpo contra un epítopo único puede inducir una respuesta inmune multiepitópica en pacientes con cáncer, con tal que el suero de los pacientes contenga el antígeno respectivo. La presente invención también demuestra que esta inyección de anticuerpos puede cambiar la respuesta inmune del paciente de una forma tal que su autoproteína CA125 puede ahora ser reconocida por el sistema inmune.

La estimulación de linfocitos T reactivos con epítopos subdominantes o crípticos de autoproteínas se ha sugerido como un factor importante en la inducción de inmunidad a un antígeno predeterminado, por ejemplo, un antígeno implicado en una enfermedad o estado patológico tal como cáncer o autoinmunidad. La presentación a un anticuerpo potenciada o alterada de un antígeno, tal como CA125, en un complejo de anticuerpo, por ejemplo, unido a MAb-B43.13, por linfocitos B (específicas del anticuerpo) o macrófagos o células dendríticas (ambas mediadas por el receptor F_{c}), puede tener como resultado la presentación al sistema inmune de diferentes péptidos a los obtenidos por presentación del antígeno solo. Esto puede conducir a una presencia suficiente de péptidos específicos del antígeno a partir de epítopos subdominantes o crípticos que puede a su vez estimular linfocitos T de baja afinidad que escapen a la eliminación clonal en el timo o a linfocitos T nuevamente estimulados que se supriman. La respuesta inmune inducida por la administración exógena de un anticuerpo a un autoantígeno circulante puede por tanto compararse con la observa en enfermedades autoinmunes. Esto puede explicar también porqué la presencia de complejos inmunes de antígeno con anticuerpos humanos autólogos no se relaciona con frecuencia con una supervivencia mejorada. Los linfocitos B humanos reconocen preferiblemente epítopos dominantes inmunes del antígeno, dando lugar a la presentación de epítopos contra los linfocitos T que se formaron durante el desarrollo embrionario. Por otro lado, anticuerpos murinos, reconocen epítopos inmunodominantes en ratones que no son necesariamente equivalentes a los epítopos inmunodominantes humanos.

La captura y procesado de un antígeno, por ejemplo, PSA, por linfocitos B también se puede producir a través de la interacción del Ab2 unido a la membrana con complejos antiantígeno/antígeno (por ejemplo, anti-PSA/PSA) y de una forma similar a través de la interacción de Ab3 unido a la membrana con el antígeno (complejado o no con el anticuerpo anti-PSA).

Aunque los solicitantes no pretenden vincularse a ninguna teoría particular de operatividad, se cree que la respuesta inmunológica observada conseguida por la presente invención puede atribuirse a una interacción entre un antígeno recién formado y el sistema inmune de un paciente humano. Como se ha indicado antes, una parte de la respuesta inmune incluye inducir la producción de anticuerpos anti(antiidiotipo) por el paciente. En este grupo de anticuerpos anti-(antiidiotipo) se encuentran los que son directamente complementarios con el paratopo de un anticuerpo antiidiotipo. Se cree además que el paratopo de un anticuerpo antiidiotipo presenta una imagen "interna" del epítopo de células tumorales identificado (es decir, unido de forma selectiva) por el anticuerpo idiotipo y, por tanto, los anticuerpos anti-(antiidiotipo) también se unirán al antígeno tumoral. En efecto, el presente procedimiento induce una respuesta inmunológica al primer antígeno, por ejemplo, un antígeno tumoral, presentando un segundo antígeno (el paratopo del anticuerpo antiidiotipo, que comparte homologías con el antígeno tumoral) a una parte de los anticuerpos resultantes del paciente.

La presente invención se refiere a alterar la inmunogenicidad de una forma que produce un efecto beneficioso o terapéuticamente deseable. Tal y como se usa en la presente memoria y se describe con más detalle más adelante, una respuesta inmune beneficiosa o deseable es aquella que produce un resultado terapéuticamente deseable. Una respuesta terapéutica beneficiosa incluirá de forma típica la activación del sistema inmune y/o uno o más de sus componentes, inducción del sistema inmune y/o uno o más de sus componentes y/o una respuesta inmune de las células T, y/o una respuesta inmune humoral y/o reducción en la masa del tumor, y/o aumento en el tiempo de supervivencia, y/o similares. Por ejemplo, para un cáncer tal como cáncer de ovario, una respuesta inmune beneficiosa o deseable incluye la producción de un anticuerpo que reaccione inmunológicamente con un antígeno de cáncer de ovario previamente no inmunorreactivo. En este ejemplo, se incrementa la respuesta inmune a un antígeno. En otro ejemplo, para un estado patológico tal como inflamación, una respuesta inmune beneficiosa o deseable incluye la producción de un anticuerpo que reaccione inmunológicamente con un antígeno previamente inmunorreactivo de modo que se hace no inmunorreactivo. En este ejemplo, se reduce la respuesta inmune. En trasplantes, el sistema inmune ataca al tejido del donante que dispara MHC conduciendo a un rechazo del injerto, en una enfermedad autoinmune ataca a tejidos normales y en alergia el sistema inmune es hipersensible a antígenos ambientales que en caso contrario serían inocuos. Se reconoce ahora que la terapia inmunosupresora puede ser apropiada para tratar cada uno de estos trastornos.

Descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación gráfica de los diferentes tipos de anticuerpos y su relación estructural entre sí y con un antígeno.

La Figura 2 muestra la producción de Ab2 como respuesta a la administración de una composición de la invención.

La Figura 3 muestra la producción de linfocitos B como respuesta a la administración de una composición de la invención. Cada población se estimuló in vitro durante 4 días con diferentes combinaciones de antígeno a 0,1 \mug o kU por ml (Barras huecas); 1 \mug o kU por ml (barras con líneas inclinadas a la derecha, //); o 10 \mug o kU por ml (barras con líneas inclinadas a la izquierda, \\).

La Figura 4 muestra que un complejo agente de unión/antígeno estimula una respuesta inmune. Se presentan los resultados obtenidos con diferentes combinaciones de antígeno a 0,1 \mug o kU por ml (Barras huecas); 1 \mug o kU por ml (barras con líneas inclinadas a la derecha, //); o 10 \mug o kU por ml (barras con líneas inclinadas a la izquierda, \\).

La Figura 5 muestra los resultados obtenidos inmunizando intravenosamente ratones BALB/c con B43.13 solo (\medbullet), B43.13 y CA125 (\ding{115}) o CA125 solo (x). Se ensayó el suero antes de la inmunización y 4, 7 y 10 semanas después de la inmunización, se midieron los títulos del anticuerpo anti-CA125 mediante ELISA. Los resultados se dan como anticuerpos anti-CA125 en \mug/ml.

La Figura 6 muestra la caracterización de anticuerpos anti-CA125 de pacientes a los que se inyectó MAb B43.13. Se ensayaron muestras positivas anti-CA125 para la inhibición de su unión a CA125 (fase sólida) por CA125, MAb B43.13 scFv, MAb-B27.1 F(ab') o MAb M11 F(ab'). En los estudios de inhibición se usó MAb-B43.13, F(ab') MAb-27.1 y F(ab') M11 de cadena sencilla para evitar la inhibición no específica de la porción Fc del anticuerpo y la reactividad cruzada debida a HAMA. Para que se considere significativa, la inhibición tiene que se al menos de 15%.

La Figura 7 muestra una respuesta humoral generada por un anticuerpo anti-MUC-1.

La Figura 8 muestra una respuesta humoral generada por una composición de la invención dirigida contra cáncer de mama.

La Figura 9 muestra que los agentes de unión Alt-3 y Alt-2 son eficaces en la citotoxicidad mediada por el complemento.

La Figura 10 muestra la reducción en volumen de un tumor gastrointestinal después de la administración de un anticuerpo anti-CA 19.9.

La Figura 11 muestra los resultados y características de un anticuerpo anti-CA 19 antiinflamatorio.

Descripción de la invención

La presente invención comprende un procedimiento y una composición para alterar la inmunogenicidad que origina la inducción o mediación de una respuesta inmune general.

La presente invención comprende un procedimiento para aumentar la inmunogenicidad de una composición administrada por selección de diana, por metodologías de activación y por sistemas de liberación que, combinados, inducen inmunidad celular o humoral, o ambas.

La presente invención implica el descubrimiento de que la unión de un agente de unión a un antígeno, tal como un antígeno asociado a un tumor multiepitópico, aumenta la inmunogenicidad del inmunógeno mientras que se mantiene su antigenicidad, y conduce a la generación de una respuesta humoral y/o celular al inmunógeno. Los procedimientos y composiciones de la presente invención median de forma típica una capacidad del hospedador para generar una respuesta inmune a un antígeno previamente no inmunógeno, es decir, un antígeno que no estimula el sistema inmune a generar una respuesta inmune del hospedador eficaz. De esta forma, el sistema inmune del hospedador puede reconocer e iniciar una respuesta inmune beneficiosa y preferiblemente eficaz frente a un antígeno previamente no
reconocido.

En ciertas realizaciones de la invención, el agente de unión es un agente de unión no marcado, más preferiblemente, un anticuerpo monoclonal y, lo más preferible, un anticuerpo monoclonal fotoactivado. El antígeno, definido con más detalle más adelante, es un antígeno inmunotolerante, preferiblemente un antígeno asociado a un tumor. En realizaciones preferidas, el anticuerpo fotoactivado es un anticuerpo intacto que tiene enlaces disulfuro rotos entre las cadenas pesada y ligera del anticuerpo.

Una composición y un procedimiento de la presente invención incluye administrar un agente de unión que se une de forma específica a un antígeno predeterminado para formar un complejo, siendo el complejo inmunógeno. En realizaciones preferidas de la invención, la inmunogenicidad es evidente en la producción y/o inducción de anticuerpos antiidiotípicos (Ab2), anti-antianticuerpos (Ab3), anticuerpos frente al complejo, anticuerpos frente al antígeno (Ab1c, que se usa indistintamente con Ab3'), proliferación de linfocitos citotóxicos tales como linfocitos T citotóxicos o células citotóxicas naturales (NK) y/o células T.

Una composición y un procedimiento de la presente invención incluye administrar una cantidad eficaz de un agente de unión que se une específicamente a un antígeno predeterminado, en la que el antígeno está presente preferiblemente in vivo en una alta cantidad, permitiendo al agente de unión unirse al antígeno, e inducir la producción de una respuesta inmune beneficiosa contra el antígeno.

La presente invención también incluye composiciones y procedimientos que tienen como resultado la inducción de una respuesta inmune beneficiosa, en particular en la que un experto en la técnica no esperaría encontrar una respuesta inmune específica para el antígeno, por ejemplo, antígenos asociados a tumores ("auto")antígenos.

Una composición adicional de la presente invención puede incluir también un antígeno modificado, en el que un antígeno soluble, preferiblemente multiepitópico se modifica por la unión a un agente de unión. Un procedimiento adicional de la presente invención puede incluir producir el antígeno modificado, y/o usar el antígeno modificado para conseguir un efecto terapéutico, por ejemplo, producir, inducir o inhibir una respuesta inmune contra el antígeno.

En una realización de la invención, los procedimientos y composiciones incluyen a todos los agentes de unión que se definen en la presente memoria antes, excluyendo, anticuerpos B43.13. Por ejemplo, un procedimiento y una composición de la invención pueden incluir una composición que comprende un agente de unión que está exento, o sustancialmente exento de anticuerpos B43.13.

La invención incluye además procedimientos y composiciones para tratar cáncer de ovario que comprenden un agente de unión que se une de forma específica a un antígeno del cáncer de ovario, tal como CA125, en el que dicho agente de unión no tiene en cuenta anticuerpos B43.13, siendo el complejo entre el agente de unión y el antígeno inmunógeno.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmune en un hospedador contra un antígeno in vivo multiepitópico, tal como un antígeno asociado a un tumor o un antígeno no asociado a un tumor, presente en el suero del hospedador, dicho antígeno preferiblemente no provoca una respuesta inmune eficaz en el hospedador, comprendiendo el procedimiento poner en contacto el antígeno con una composición que comprende un agente de unión que se une específicamente a un primer epítopo en el antígeno y dejar que el agente de unión forme una pareja agente de unión/antígeno en la que se provoca una respuesta inmune del hospedador contra un segundo epítopo en el antígeno. La presente invención implica poner en contacto un antígeno, preferiblemente un antígeno soluble, con una composición de la invención y hacer reaccionar un agente de unión en la composición con el antígeno. Conforme a la invención, la unión del antígeno con el agente de unión genera el reconocimiento del antígeno por el hospedador. A su vez, generar el reconocimiento del hospedador conduce a iniciar una respuesta inmune contra el antígeno.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmune contra un antígeno que no provoca una respuesta inmune eficaz en el hospedador, comprendiendo el procedimiento administrar al hospedador una baja dosis o una pequeña cantidad de un agente de unión que se une a un epítopo de una forma soluble del antígeno. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmune contra un antígeno que no provoca una respuesta inmune eficaz en el hospedador, comprendiendo el procedimiento administrar al hospedador un agente de unión que se une a un epítopo de una forma soluble del antígeno usando una baja dosis de agente de unión, preferiblemente una dosis que no produce ADCC y/o induce toxicidad mediada por el anticuerpo. En algunas realizaciones de la invención, baja dosis de agente de unión comprende de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 2 mg por kg de peso corporal del hospedador. En algunas realizaciones de la invención, el antígeno es un antígeno celular. El método estándar para medir la ADCC (citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo) es un análisis de liberación de ^{51}Cromo (^{51}Cr), en el cual las células diana muertas como resultado del efecto citotóxico liberan ^{51}Cr, considerándose que no hay ADCC si la Tisis específica es menor que 15%. La ADCC se valora incubando células tumorales marcadas con ^{51}Cr con un agente de unión conforme a la invención y añadiendo PBMC humanas recientes, seguido de incubación durante cuatro horas y medida de la tisis específica. Tal y como se usa en la presente memoria, toxicidad mediada por anticuerpo se refiere a toxicidad clínica, indicadores específicos de la cual incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, la bioquímica sérica anómala, función renal reducida y signos y síntomas de enfermedad sérica o anafilaxis.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento que comprende administrar por vía intravenosa al hospedador un agente de unión que se une a un epítopo de una forma soluble de un antígeno celular.

En ciertas realizaciones, la respuesta inmune del hospedador comprende una respuesta inmune celular y humoral. En ciertas realizaciones, la respuesta inmune del hospedador comprende una respuesta inmune celular. En ciertas realizaciones, la respuesta inmune del hospedador comprende una respuesta inmune humoral. En ciertas realizaciones, el antígeno es un antígeno soluble. En ciertas realizaciones, el agente de unión es un anticuerpo. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal murino. En ciertas realizaciones, el anticuerpo no induce toxicidad mediada por el anticuerpo, por ejemplo, toxicidad de HAMA inducida isotípica, en el hospedador. En ciertas realizaciones, el antígeno está asociado con una enfermedad o estado patológico humano. En ciertas realizaciones, la enfermedad o estado patológico es cáncer. En ciertas realizaciones, el agente de unión está fotoactivado. En ciertas realizaciones, la respuesta humoral comprende anticuerpos antiidiotipo. En ciertas realizaciones, la cantidad de agente de unión es de al menos 0,1 \mug y, preferiblemente, hasta 2 mg, más preferiblemente, de 1 \mug a 200 \mug por kg de peso corporal del hospedador.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición terapéutica que comprende un agente de unión específico para un primer epítopo en un antígeno multiepitópico, que puede ser un antígeno asociado a un tumor o un antígeno no asociado a un tumor, presente en el suero del hospedador, no provocando preferiblemente dicho antígeno una respuesta inmune eficaz en el hospedador, uniéndose el agente de unión específicamente a un primer epítopo en el antígeno y formando una pareja agente de unión/antígeno en la que se provoca una respuesta inmune del hospedador contra un segundo epítopo en el antígeno. En realizaciones preferidas de la invención, el agente de unión es un anticuerpo, preferiblemente, un anticuerpo activado y, más preferiblemente, un anticuerpo fotoactivado.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición terapéutica que comprende una baja dosis de un agente de unión que se une a un antígeno, preferiblemente un antígeno soluble o celular, que no provoca una respuesta inmune eficaz en el hospedador, uniéndose el agente de unión específicamente al antígeno e induciendo una respuesta inmune contra el antígeno. Preferiblemente, la baja dosis de un agente de unión varía de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 2 mg por kg de peso corporal del hospedador.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición terapéutica para administración intravenosa que comprende un agente de unión que se une a una forma soluble de un antígeno celular que no provoca una respuesta inmune eficaz en el hospedador, uniéndose el agente de unión específicamente el antígeno e induciendo una respuesta inmune contra el antígeno. En una realización preferida de la invención, preferiblemente las composiciones administradas por vía intravenosa no incluyen adyuvante. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición terapéutica para administración subcutánea que comprende un agente de unión que se une a un epítopo de una forma soluble de un antígeno celular que no provoca una respuesta inmune en el hospedador, uniéndose el agente de unión específicamente al epítopo e induciendo una respuesta inmune contra la forma de la superficie celular del antígeno. Tal y como se usa en la presente memoria, una "forma soluble de un antígeno celular" se refiere a una forma circulante de un antígeno que también se expresa sobre una superficie celular. En una realización preferida de la invención, las composiciones administradas subcutáneamente incluyen preferiblemente un adyuvante.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento para prolongar la supervivencia en un paciente con cáncer. En ciertas realizaciones preferidas, el paciente es un paciente con cáncer de ovario. El procedimiento conforme a esta realización comprende identificar un paciente que tenga niveles de CA125 igual o inferiores a aproximadamente 35 unidades/ml y administrar al paciente un anticuerpo xenógeno específico para el antígeno CA125. En ciertas realizaciones preferidas el nivel de antígeno CA125 varía de aproximadamente 5 unidades/ml a aproximadamente 35 unidades/ml, más preferiblemente, de aproximadamente 9,5 unidades/ml a aproximadamente 35 unidades/ml. En ciertas realizaciones preferidas, el nivel de antígeno CA125 varía de aproximadamente 5 unidades/ml a aproximadamente 9,5 unidades/ml. En ciertas realizaciones preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo murino. En ciertas realizaciones preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En ciertas realizaciones preferidas, el anticuerpo es anticuerpo monoclonal murino B43.13. En ciertas realizaciones preferidas, el anticuerpo se administra a una baja dosis, lo más preferible, de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 2 mg por kg de peso corporal del paciente.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento para prolongar el tiempo hasta la recurrencia de la enfermedad en un paciente con cáncer después de un tratamiento inicial con quimioterapia y/o cirugía. En ciertas realizaciones preferidas, el paciente es un paciente con cáncer de ovario. El procedimiento conforme a esta realización comprende identificar un paciente que se ha sometido a un tratamiento inicial y tiene niveles de CA125 iguales o inferiores a 35 unidades/ml y administrar al paciente un anticuerpo xenógeno específico para el antígeno CA125. En ciertas realizaciones preferidas, el nivel de antígeno CA125 varía de aproximadamente 5 unidades/ml a aproximadamente 35 unidades/ml, más preferiblemente, de aproximadamente 9,5 unidades/ml a aproximadamente 35 unidades/ml. En ciertas realizaciones preferidas, el nivel de antígeno CA125 varía de aproximadamente 5 unidades/ml a aproximadamente 9,5 unidades/ml. En ciertas realizaciones preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo murino. En ciertas realizaciones preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En cierta realizaciones preferidas, el anticuerpo es anticuerpo monoclonal murino B43.13. En ciertas realizaciones preferidas, el anticuerpo se administra a una baja dosis, lo más preferible, de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 2 mg por kg de peso corporal del paciente. De forma sorprendente, más del 50% de tales pacientes responden a este tratamiento, con un tiempo medio de recurrencia de 18,9 meses entre pacientes con niveles de Ab2 de al menos 100 unidades, comparado con 7,4 meses entre pacientes con niveles de Ab2 inferiores a 100 unidades.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento para prolongar la supervivencia en un paciente con cáncer después del tratamiento inicial con quimioterapia y/o cirugía. En ciertas realizaciones preferidas, el paciente es un paciente con cáncer de ovario. El procedimiento conforme a esta realización comprende identificar un paciente que se ha sometido a un tratamiento inicial y tiene niveles de CA125 iguales o inferiores a aproximadamente 35 unidades/ml y administrar al paciente un anticuerpo xenógeno específico para el antígeno CA125. En ciertas realizaciones preferidas, el nivel de antígeno CA125 varía de aproximadamente 5 unidades/ml a aproximadamente 35 unidades/ml, más preferiblemente de aproximadamente 9,5 unidades/ml a aproximadamente 35 unidades/ml. En ciertas realizaciones preferidas el nivel de antígeno CA125 varía de aproximadamente 5 unidades/ml a aproximadamente 35 unidades/ml. En ciertas realizaciones preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo murino. En ciertas realizaciones preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En ciertas realizaciones preferidas, el anticuerpo es anticuerpo monoclonal murino B43.13. En ciertas realizaciones preferidas el anticuerpo se administra en una baja dosis, lo más preferiblemente, de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 2 mg por kg de peso corporal del paciente.

Los expertos en la técnica reconocerán que estas realizaciones pueden usarse solas o en cualquier combinación.

Conforme a la presente invención, sus autores creen que la interacción entre el antígeno y el agente de unión puede presentar de forma eficaz un epítopo previamente no expuesto o suprimido al sistema inmune del paciente para generar: 1) una respuesta humoral que tiene como resultado anticuerpos antitumorales humanos que pueden o no ser inhibidos por el anticuerpo inyectado, pero que indudablemente son inhibidos por un anticuerpo que se une a un epítopo diferente del epítopo reactivo con el agente de unión inyectado; y 2) una respuesta mediada por células que tiene como resultado la producción de linfocitos T específicos del antígeno.

Un experto en la técnica reconocerá que un aspecto de cualquier inmunoterapia basada en anticuerpos es la interacción entre el antígeno y el anticuerpo. Además, el éxito, eficacia y utilidad de que un suceso de unión implican de forma típica una amplia diversidad de factores a menudo interconectados. En general, estos factores incluyen, aunque no quedan limitados a los mismos, la capacidad de unión del agente de unión, la inmunogenicidad del agente de unión, la accesibilidad del antígeno, la accesibilidad del epítopo del antígeno, el grado de complementariedad entre el paratopo del agente de unión y el epítopo del antígeno, el efecto del suceso de unión en el complejo, la capacidad del complejo de inducir una respuesta inmune y el grado hasta el cual se activa la respuesta inmune. Se pretende que estos factores contribuyan a la determinación de un agente de unión y/o un antígeno predeterminado apropiado o deseable y a la naturaleza y eficacia de la respuesta inmune resultante.

La interrelación de estas diversas consideraciones, como se describe por la presente invención, puede conducir a remedios terapéuticos eficaces. En el caso de B43.13 y el tratamiento de cáncer de ovario, un ejemplo específico usado es demostrar el punto general sin limitar de este modo la invención, 843.13 es un anticuerpo murino, por lo que su heterogeneidad en un sistema humano contribuye a su inmunogenicidad. Además, CA125, el antígeno diana, es un antígeno soluble asociado a un tumor y, por tanto, accesible a un agente de unión. El suceso de unión entre B43.13 y CA125 es de una naturaleza tal que uno o más epítopos en el complejo quedan disponibles a componentes del sistema inmune, induciendo así una respuesta inmune donde anteriormente no la había (o era tan pequeña que no se obtenía beneficio terapéutico). Además, el suceso de unión creó acceso a un epítopo en el complejo que era adecuado para inducir respuestas tanto humorales como celulares, induciendo así una respuesta inmune general que, por sí misma, es una respuesta inmune beneficiosa. En lo referente a B43.13, todos estos elementos individuales contribuyen al reconocimiento del uso de B43.13 para inducir una cascada de respuestas inmunes que sea eficaz en el tratamiento del cáncer de ovario.

Como se ha indicado antes, los autores de la presente invención creen que un aspecto importante de inducir o mediar una respuesta celular o humoral radica en parte en aumentar la inmunogenicidad del complejo agente de unión-antígeno mientras que se mantiene su antigenicidad. Como se describe con más detalle más adelante en los ejemplos, aumentar la inmunogenicidad mientras que se mantiene la antigenicidad puede efectuarse por una o más de las siguientes formas:

1. Administrar una dosis de agente de unión que es baja comparada con la dosis para otras composiciones terapéuticas;

2. Formar un complejo agente de unión-antígeno in vivo o ex vivo;

3. Fotoactivar el agente de unión antes de la administración;

4. Administrar el agente de unión en una microesfera, liposoma, nanoesfera o micela;

5. Conjugar el agente de unión con un agente fotodinámico, tal como hipocrelina B; y

6. Conjugar el agente de unión con efectores inmunes.

En una realización preferida de la invención, se usa una composición que comprende un anticuerpo predeterminado que se une específicamente a un antígeno asociado a un tumor predeterminad que se usa para unir un antígeno soluble producido por el tumor. Una vez que se ha unido el antígeno soluble, el sistema inmune reconoce el antígeno como "xenógeno" y despliega una respuesta inmune contra el antígeno o contra el agente de unión unido al antígeno. Los antígenos que pueden ser inmunógenos son potencialmente útiles para inducir o activar una respuesta inmune, conduciendo a beneficios terapéuticos y posiblemente profilácticos.

Cualquier composición que incluya un agente de unión conforme a la invención se puede usar para iniciar una respuesta inmune in vivo. La composición puede incluir uno o más adyuvantes, uno o más vehículos, uno o más excipientes, uno o más estabilizadores, uno o más reaccionantes de visualización, uno o más efectores; uno o más agentes fotodinámicos; y/o solución salina fisiológicamente aceptable. Por lo general, los adyuvantes son sustancias mezcladas con un inmunógeno con el fin de provocar una respuesta inmune más acentuada. Vacunaciones control sin el adyuvante produjeron respuestas inmunes humorales. En una realización preferida de la invención, la composición que comprende un agente de unión no incluye adyuvante.

En una realización preferida de la invención, una composición adecuada incluye un agente de unión que se une a un antígeno soluble formando un complejo que por si mismo es antigénico e inmunógeno. En una realización más preferida de la invención, el complejo es un antígeno que induce un efecto terapéutico beneficioso o deseable.

La composición también puede incluir vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, solución salina, agua estéril, solución salina tamponada con fosfato y similares. Se pueden incluir en las composiciones de la presente invención otros agentes de tamponamiento, agentes dispersantes y sustancias no tóxicas inertes adecuadas para administración a un paciente. Las composiciones pueden ser soluciones adecuadas para administración y son de forma típica estériles y exentas de material en forma de partículas indeseado. Las composiciones pueden estar esterilizadas por técnicas de esterilización convencionales.

Conforme a la descripción de la presente invención, los procedimientos y composiciones producen tanto una respuesta humoral como celular. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que determinar que se ha generado dicha respuesta humoral y/o celular se demuestra fácilmente ensayando las estructuras asociadas con cada respuesta. Por ejemplo, la evidencia de la producción de una respuesta humoral incluye, aunque sin quedar limitada a la misma, la producción de Ab2 y Ab3. Igualmente, la evidencia de la producción de una respuesta celular incluye, aunque sin quedar limitada a la misma, la producción de células T2 y/o T3.

Agentes de unión

Los agentes de unión de la presente invención se unen a un antígeno de interés, y la pareja inmunógena resultante o complejo se puede usar para preparar o iniciar una respuesta inmune, de forma típica a otro epitopo en el complejo o una porción del complejo. El epitopo, que previamente no provocaba una respuesta inmune eficaz, tras ser reconocido por agentes del sistema inmune, inicia la cascada del sistema inmune que tiene como resultado una respuesta inmune beneficiosa, preferiblemente, una respuesta inmune eficaz tal como se usa en la presente memoria, una respuesta inmune eficaz del hospedador se refiere al alivio o eliminación de la enfermedad o estado patológico que produce el antígeno.

Un agente de unión (AU), tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un miembro de una pareja de unión, incluyendo una pareja inmunológica, por ejemplo, un resto de unión que puede unirse a un antígeno, preferiblemente un único epítopo expresado en el antígeno, tal como un antígeno tumoral predeterminado. En algunas realizaciones de la invención, el agente de unión, cuando se ha unido al antígeno, forma un complejo inmunógeno. Agentes de unión ejemplo incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos: anticuerpos monoclonales ("MAb"), preferiblemente anticuerpos IgG1; anticuerpos monoclonales quiméricos ("C-MAb"); anticuerpos humanizados; anticuerpos monoclonales modificados genéticamente ("G-MAb"); fragmentos de anticuerpos monoclonales (incluyendo aunque sin quedar limitados a los mismos "F(Ab)_{2}", "F(Ab)" y "Dab"); cadenas sencillas que representan la porción reactiva de anticuerpos monoclonales ("SC-MAb"); péptidos que se unen a antígenos; péptidos que se unen a tumores; una proteína, incluyendo proteínas receptoras; péptidos; polipéptidos; glucoproteínas; lipoproteinas; o similares, por ejemplo, factores de crecimiento; linfoquinas y citoquinas; enzimas, moduladores inmunes; hormonas, por ejemplo somatostatina; cualquiera de las anteriores unida a una molécula que media en una función efectora; y agentes que imitan o fragmentos de cualquiera de los anteriores. El agente de unión puede estar marcado o no
marcado.

Un agente de unión conforme a la invención es preferiblemente un anticuerpo monoclonal o policlonal. El anticuerpo incluye, aunque sin quedar limitado a los mismos, anticuerpos nativo o desnudo; y anticuerpos modificados, tales como anticuerpos activados, por ejemplo, anticuerpos activados químicamente o fotoactivados. Tal y como se usa en la presente memoria, nativo se refiere a un anticuerpo natural o normal; desnudo se refiere a la eliminación de un resto no nativo, por ejemplo, eliminación del marcador de un anticuerpo marcado. En una realización más preferida de la invención, el agente de unión es un anticuerpo Ab1 que induce la producción de una o más moléculas que comprenden una respuesta inmune, incluyendo, aunque sin quedar limitadas a una o más de las siguientes: moléculas asociadas con una respuesta celular (citoquinas, quimioquinas, linfocitos T citotóxicos (CTL) y células citotóxicas naturales (NK) y/o moléculas asociadas con una respuesta humoral [Ab3, Ab1c (algunas veces denominado Ab3')].

Los expertos en la técnica pueden preparar una diversidad de derivados de anticuerpos. Por ejemplo, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986) describe reemplazar los CDR de anticuerpo humano por los de un anticuerpo de ratón. Marx, Science 229: 455-456 (1985) describe anticuerpos quiméricos que tienen regiones variables de ratón y regiones constantes humanas. Rodwell, Nature 342: 99-100 (1989) describe elementos de reconocimiento de menor peso molecular derivados de información de CDR de anticuerpos. Clackson, Br.J. Rheumatol. 3052: 36-39 (1991) describe anticuerpos monoclonales modificados genéticamente, incluyendo derivados de fragmento Fv, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos con proteínas de fusión y anticuerpos de roedores humanizados. Reichman et al., Nature 332:325-329 (1988) describe un anticuerpo en el que se ha injertado regiones hipervariables de rata. Verhoeyen, et al., Science 239: 1534-1536 (1988) describe el injerto de un sitio de unión a antígeno de ratón en un anticuerpo humano. También se conocen en la técnica anticuerpos biespecíficos.

Son bien conocidos por los expertos en la técnica procedimientos para producir y obtener un anticuerpo. Un procedimiento de ejemplo incluye inmunizar cualquier animal capaz de desplegar una respuesta inmune utilizable frente a un antígeno, tal como un ratón, rata, cabra, oveja, conejo un otro animal experimental adecuado. En el caso de un anticuerpo monoclonal, las células productoras de anticuerpos del animal humanizado se pueden fusionar con células humanas o animales "inmortales" o "inmortalizadas" para obtener un hibridoma que produzca el anticuerpo. Si se desea, los genes que codifican una o más de las cadenas de inmunoglobulina se pueden clonar de modo que el anticuerpo se pueda producir en diferentes células del hospedador y, si se desea, los genes se pueden mutar de modo que se altera la secuencia y por ello las características inmunológicas del anticuerpo producido. Se pueden obtener fragmentos de agentes de unión por técnicas convencionales, tales como por digestión proteolítica del agente de unión usando pepsina, papaína o similares; o por técnicas de DNA recombinante en las que el DNA que codifica el fragmento deseado se clona y expresa en una diversidad de hospedadores. Irradiando cualquiera de las entidades anteriores, por ejemplo, por radiación ultravioleta, se mejorará la respuesta inmune al antígeno. En una realización preferida de la invención, no son requeridas funciones efectoras que medien CDC o ADCC. En la patente de Estados Unidos 4.471.057 (Koprowski), patente de Estados Unidos 5.075.218 (Jette, et al.), patente de Estados Unidos 5.506.343 (Kufe) y patente de Estados Unidos 5.683.674 (Taylor-Papadimitriou, et al), todas ellas incorporadas en la presente memoria como referencia, se describen diversos agentes de unión, anticuerpos, antígenos y procedimientos para preparar, aislar y usar los agentes de unión. Por otro lado, muchos de estos anticuerpos están disponibles de forma comercial de Centocor, Abbott Laboratories, Commissariat a L'Energie Atomique, Hoffman-LaRoche, Inc., Sorin Biomedica, y FujiRebio. Los agentes de unión preferidos de la presente invención, anticuerpos monoclonales murinos, se pueden producir conforme a técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica. La producción de hibridoma en roedores, en particular, en ratones, es un procedimiento bien establecido y preferido. Los hibridomas murinos estables proporcionan una fuente ilimitada de anticuerpos de selección o características predeterminadas. De forma típica, se puede preparar un anticuerpo monoclonal usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, aunque no quedan limitadas a las mismas, la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler and Milstein [Nature, 256:495-497 (1975)]; la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos [Kozbor, et al., Immunology Today, 4:72 (1983)]; y la técnica de transformación EBV [Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas. 77-96 (1985)].

De forma resumida, se puede producir un anticuerpo monoclonal de la invención inmunizando un animal, de forma típica, un ratón, con un inmunógeno, por ejemplo, un antígeno tal como CA125. La invención incluye, aunque no queda limitada al uso de un segmento de péptido que incluya un epítopo específico o secuencia de aminoácidos predeterminada. Estos péptidos se pueden sintetizar y conjugar opcionalmente con una proteína portadora, tal como hemocianina de lapa bocallave (KLH) y usar un inmunógeno.

El procedimiento que se sigue entonces es obtener células linfoides inmunizadas (por ejemplo, linfocitos de bazo) de animales inmunizados, fusionar las células linfoides con una célula inmortalizada (por ejemplo, un mieloma o heteromieloma) para producir células híbridas que se pueden propagar en cultivo indefinidamente, y luego rastrear las células híbridas para identificar las que producen anticuerpos monoclonales que reaccionan con el epítopo diana.

El hibridoma resultante se puede seleccionar por cualquiera de los numerosos ensayos, por ejemplo, por unión a Ab2, o por inhibición de la unión de Ab1 a células tumorales. Por ejemplo, el epítopo del sitio de unión o la secuencia de péptidos que contienen el epítopo se pueden sintetizar y/o inmovilizar en polietileno u otro soporte. El anticuerpo monoclonal apropiado se puede determinar entonces por su capacidad para unirse al péptido inmovilizado, como se detecta por ELISA usando un anticuerpo marcado (marcado por ejemplo, con peroxidasa).

Si se desea, se pueden humanizar anticuerpos murinos o de otros animales después de una serie de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, Reichmamz et al. [Nature, 322:323-327 (1988)] usó metodología de DNA recombinante para reemplazar las seis regiones hipervariables de los dominios variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo humano con las regiones hipervariables de los anticuerpos de roedores. Los anticuerpos humanos redimensionados tienen la afinidad de los anticuerpos originales debido a la presencia de las regiones hipervariables originales, pero tendrían todas las demás características de un anticuerpo humano.

Una de las técnicas más prometedoras para la inmunoterapia tumoral es el uso de fragmentos de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con dominios efectores para localizar y eliminar células tumorales. Se ha modificado genéticamente Fv de cadena sencilla (sc-Fv) como proteína de fusión recombinante que está compuesta por un dominio variable de cadena pesada (Vh) y de cadena ligera (VI) conectado por un engarce artificial y un dominio efector.

En algunas realizaciones preferidas, los agentes de unión conforme a la invención se activan, preferiblemente por técnicas químicas o fotodinámicas. Las técnicas químicas preferidas incluyen agentes reductores orgánicos, tales como ácido formamidina sulfónico, agentes reductores inorgánicos, ion mercurioso, ion estannoso, ion cianuro, cianoborohidruro sódico y borohidruro sódico, reaccionantes de intercambio de tiol, tales como ditiotreitol, mercaptoetanol y mercantoetanolamina, y agentes reductores de proteínas, tales como tioredoxina. El uso de estos agentes origina una reducción de algunos enlaces disulfuro en el agente de unión produciendo un agente de unión que tiene algunos grupos sulfhidrilo. La presencia de tales grupos puede cambiar la estructura terciaria del agente de unión. Dicho cambio estructural puede modular la inmunorreactividad del agente de unión. Dicha modulación puede conducir a una respuesta antiidiotípica y/ respuesta celular mejoradas en un individuo al que se le administra el agente de unión.

En algunas realizaciones preferidas, los agentes de unión conforme a la invención pueden acoplarse opcionalmente con agentes fotodinámicos. Preferiblemente, dicho acoplamiento es un enlace covalente o por asociación por liposomas. La asociación por liposomas se consigue preferiblemente mezclando el agente fotodinámico con un agente de unión en presencia de un reaccionante formador de liposomas. En ciertas realizaciones preferidas, el agente de unión conforme a la invención se une covalentemente al reaccionante formador de liposomas. Agentes fotodinámicos preferidos incluyen hipocrelinas, tal como hiprocrelina B, más preferiblemente, hiprocrelinas aminadas y derivados de hipocrelina.

En una realización de la invención, una composición adecuada para el tratamiento de un antígeno asociado a un tumor de ovario contiene un agente de unión que se une al antígeno CA125. Anticuerpos ejemplo que se unen a CA125 incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos B43.13. La presente invención también incluye el uso de cualquier agente de unión distinto de B43.13 que se una específicamente a CA125 y que tenga como resultado una respuesta inmune beneficiosa, por ejemplo, M11. Estos y otros anticuerpos ejemplo se describen en Nustad, et al, Tumor Biololy, 17:196-219 (1996) y Nap, et al, Tumor Biology, 17:325-331 (1996).

En otra realización de la invención, una composición adecuada para el tratamiento de cáncer gastrointestinal contiene un agente de unión que se une al antígeno CA 19.9. Anticuerpos ejemplo que se unen a CA 19.9 incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos, Alt-3, W25 (CIS Bio International), A3 (Shemyakin Inst. Biorg. Chem.) y NS116-NS-19.9 (Centocor), entre otros. Estos y otros anticuerpos ejemplo se describen en Tumor Biology, 19:390-420 (1998).

En otra realización más de la invención, una composición adecuada para el tratamiento de cáncer de mama contiene un agente de unión que se une al antígeno CA125. Anticuerpos ejemplo que se unen a CA125 incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos, SM-3, DF-3, DF3-P, Ma 552 y BC4E549. Estos y otros anticuerpos ejemplo se describen en Tumor Biology, 19:21-29 (1998).

En otra realización más de la invención, una composición adecuada para el tratamiento de cáncer de próstata contiene un agente de unión que se une al antígeno prostático específico (PSA). Un anticuerpo ejemplo que se una a PSA incluye, aunque sin quedar limitado al mismo, AR47.47.

En otra realización más de la invención, una composición adecuada para el tratamiento de inflamación contiene un agente de unión que se une al antígeno CA 19.9. Anticuerpos ejemplo que se unen a CA 19.9 y reducen la inflamación incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos, los anticuerpos Alt-3 y Alt-4.

Antígeno soluble

Un antígeno predeterminado puede ser cualquier antígeno humano o de mamífero de significación clínica. Conforme a la presente invención, el antígeno predeterminado o diana deberá ser capaz de unirse a un agente de unión. El antígeno incluye, aunque sin limitarse a, uno o más de los siguientes: soluble, circulante, que se desprende de la membrana o multi-epitópico.

En una realización preferida de la invención, el antígeno es un antígeno asociado a un tumor (TAA). En el caso de TAA, el cáncer puede incluir, aunque sin quedar limitado a, cáncer de pulmón, de colon, de recto, de mama, de ovario, de glándula prostática, de cabeza, de garganta, de huesos, del sistema inmune o de cualquier otra localización anatómica. Tumores ilustrativos y marcadores tumorales se enumeran en la patente de Estados Unidos 5.075.218.

Los procedimientos de la presente invención pueden implicar cualquier cáncer que produzca un TAA multiepitópico soluble. Tal y como se usa en la presente memoria, soluble se usa para describir cualquier antígeno que sea detectable en un fluido corporal, es decir, sangre, suero, fluido ascítico, saliva o similar. Conforme a la presente invención, los tumores preferidos son aquellos que: dispersan antígenos tumorales solubles, por ejemplo, antígenos dispersados en el torrente sanguíneo, al contrario de un antígeno de superficie o de un antígeno intracelular; presentan un antígeno asociado a un tumor multiepitópico y se pueden encontrar en una concentración en el fluido corporal del paciente mayor que la presente normalmente en controles sanos y dicho alto nivel significa presencia de la enfermedad, aunque no haya iniciado una respuesta inmune significativa. En una realización preferida, el antígeno predeterminado es un antígeno que no provoca una respuesta inmune eficaz en el hospedador, por ejemplo, no es eficaz para reducir la masa tumoral y/o no induce un beneficio terapéutico (incluso si se genera una respuesta inmune pequeña). Como es bien conocido por un experto en la técnica, un procedimiento para determinar si la concentración de TAA es mayor que en individuos sanos es comparar la concentración del paciente con la de un control sano. Si la concentración de TAA es mayor que la del control sano, entonces la concentración del paciente es predictiva de presencia o recurrencia de la enfermedad.

La invención también implica la producción de un antígeno modificado, de forma típica, produciendo el antígeno modificado in vivo. Tal y como se usa en la presente memoria, antígeno modificado se refiere a un primer antígeno, típicamente invisible al sistema inmune, que se une a un agente de unión, y el agente de unión-antígeno es un antígeno propiamente dicho (el "segundo" antígeno) que es inmunorreactivo con una o más moléculas del sistema inmune.

Tal y como se usa en la presente memoria, "enfermedad" se refiere al tratamiento, diagnóstico y/o paliación de cualquier enfermedad, trastorno, afección o estado patológico en mamíferos (incluyendo a seres humanos). "Enfermedad" incluye, aunque no queda limitada a, cáncer y sus metástasis, tal como cáncer de piel; crecimientos o tumores, y sus metástasis; tumores y células tumorales, tales como sarcomas y carcinomas, incluyendo tumores sólidos, tumores de transmisión hemática, y tumores encontrados en las vías nasales, la vejiga, el esófago o pulmón, incluyendo los bronquios; virus, incluyendo retrovirus y VIH; enfermedades infecciosas tales como hepatitis, incluyendo hepatitis crónica tal como hepatitis B; enfermedades bacterianas; enfermedades fúngicas; y estados patológicos o trastornos dermatológicos, tales como lesiones en la vulva, queloides, vitíligo, psoriasis, tumores benignos, endometriosis, esófago de Barett, Tinea capitis, y amiloidosis por líquenes; y trastornos autoinmunes, tales como artritis reumatoide. Antígenos multiepitópicos solubles ejemplo son los descritos antes e incluyen, aunque no quedan limitados a los mismos, CA125, CA 19.9, CA 15.3, mucina epitelial polimórfica (PEM), CEA y antígeno prostático específico.

Se apreciará que muchas de estas enfermedades y/o trastornos se caracterizan en parte por incluir síntomas o procesos biológicos implicados con inflamación. Muchos tipos de inflamación inmunológicamente mediada, incluyendo inflamación aguda y crónica, y muchos tipos de artritis, incluyendo artritis reumatoide, y muchos tipos de cáncer expresan todos o implican los mismos o similares ligandos de hidratos de carbono. Ligandos que por ejemplo incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos, SLe^{a} y SLe^{x}. Una realización de la invención incluye composiciones que incluyen en parte uno o más agentes de unión que se unen a un ligando de hidrato de carbono. Estas composiciones son eficaces contra cualquier enfermedad o estado patológico que implique el ligando de hidrato de carbono como parte de su vía metabólica incluyendo, aunque no limitándose a, artritis reumatoide, artritis inducida por colágeno, artritis adyuvante y artritis inducida por pristano. A efectos únicamente de este aspecto de la invención, una "respuesta inmune eficaz en el hospedador" se refiere a eliminar factores perjudiciales, eliminando de este modo una respuesta o estado patológico inflamatorio persistente o crónico.

Un alto nivel de antígeno, tal y como se usa en la presente memoria, es un término variable dependiente en parte del tipo de antígeno y/o del tipo de enfermedad o estado patológico, y/o de la fase de la enfermedad o estado patológico. Por ejemplo, un experto en la técnica reconocerá que un alto nivel puede significar que una mayoría de pacientes positivos a cáncer, por ejemplo, por encima del 50% o por encima de aproximadamente 80%, tiene una cierta cantidad de antígeno circulante. Por ejemplo, el actual conocimiento del curso del cáncer de ovario sugiere que el 80% o más de los pacientes que tienen más de 35 Unidades/ml de antígeno CA125 en su torrente sanguíneo tienen un alto riesgo estadísticamente significativo de desarrollar cáncer de ovario. Un alto nivel también puede definirse en términos de la cantidad suficiente para unir completamente o casi completamente la totalidad de una dosis predeterminada de agente de unión. Un alto nivel también puede definirse como una cantidad umbral de antígeno circulante que los expertos en la técnica reconocerán como un alto nivel. Un alto nivel también puede incluir la cantidad que es predictiva de enfermedad. Un alto nivel también puede incluir una cantidad o concentración de antígeno mayor que la normal para dicho paciente o para dicha enfermedad o estado patológico. Tratamiento eficaz está disponible para pacientes que tienen tan solo 5 unidades de CA125/ml.

Un procedimiento de una realización de la invención incluye determinar la cantidad de antígeno predeterminado en el paciente, por ejemplo, circulando en el paciente, y si la cantidad de antígeno es un alto nivel, a continuación administrar una composición que comprende un agente de unión conforme a la invención. Un procedimiento más preferido de la invención incluye determinar la cantidad de antígeno predeterminado circulante en el paciente y, si la cantidad es mayor que una cantidad predictiva de enfermedad, más preferiblemente, tres veces mayor, entonces administrar una composición que comprende un agente de unión conforme a la invención. Por ejemplo, un procedimiento de la invención incluye determinar la cantidad de CA125 circulante y, si la cantidad es mayor que aproximadamente 5 U/ml y, más preferiblemente mayor que aproximadamente 105 U/ml, entonces administrar una composición que comprende un agente de unión conforme a la invención, por ejemplo, que comprende B43.13. La composición administrada puede incluir una baja dosis de agente de unión.

Como se ha indicado en la sección de antecedentes, el posible efecto de inyectar un agente de unión tal como un anticuerpo puede ser extremadamente complejo y puede implicar típicamente mecanismos de acción característicos. Tal y como se usa en la presente memoria, Ab3 y Ab1c representan dos de tales mecanismos característicos que producen, a nivel individual y/o colectivo, un efecto beneficioso. En la vía del Ab3, un anticuerpo Ab1 que es capaz de unirse a un antígeno predeterminado puede inducir la producción de un anticuerpo antiidiotipo (Ab2) que imita a un epítopo del antígeno. El anticuerpo antiidiotipo puede inducir a su vez la producción de anticuerpos anti-antiidiotipo (Ab3) que pueden unirse al mismo epítopo en el antígeno que el anticuerpo Ab1. Evidencia de esta vía incluye un ensayo competitivo entre Ab1 y Ab3, puesto que el anticuerpo Ab1 y el anticuerpo Ab3 compiten por el mismo epítopo del antígeno.

En la vía de Ab1c, el anticuerpo Ab1 se une al antígeno formando un complejo. Este complejo es por sí mismo un antígeno, y algunas veces se describe en la memoria como "antígeno modificado" o segundo antígeno. El complejo puede inducir la producción de anticuerpo antiantígeno (Ab1c) que puede unirse a un epítopo diferente en el antígeno al que está unido por el anticuerpo Ab1. Evidencia de esta vía también incluye un ensayo competitivo, pero comparando el efecto inhibidor sobre Ab1 c por anticuerpos que se unen a diferentes epítopos en el antígeno o la ausencia de inhibición con Ab1.

Además de producir Ab3 y/o Ab1c, de forma típica asociado con una respuesta inmune humoral, las composiciones de la presente invención también pueden producir un beneficio terapéutico induciendo una respuesta inmune celular (inmunidad mediada por células), como en la sección de antecedentes. Tanto la respuesta celular como la humoral implican mecanismos indirectos para alterar la inmunogenicidad del hospedador.

Las composiciones de la presente invención pueden iniciar también mecanismos directos para destruir células indeseables tales como células cancerosas. Por ejemplo, en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), un anticuerpo Ab1, unido a través de su región Fab a un antígeno predeterminado, se puede unir al receptor Fc de un linfocito a través de la región Fc del anticuerpo Ab1. Dicha participación entre un anticuerpo y células del sistema inmune produce una función efectora que puede lisar células tumorales, agentes infecciosos y autocélulas. Otros mecanismos directos implican citotoxicidad mediada por el complemento (CDC), apóptosis, (neutralización de antígenos asociados a tumores inmunosupresores), inducción de citoquinas y/o quimioquinas, neutralización de moléculas inmunosupresoras y neutralización de moléculas antiadherentes, entre otras.

Tal y como se usa en la presente memoria, una técnica general para proporcionar un beneficio terapéutico implica una o más, o todas, de las siguientes: inmunidad celular y las moléculas implicadas en su producción; inmunidad humoral y las moléculas implicadas en su producción; inmunidad por ADCC y las moléculas implicadas en su producción; inmunidad por CDC y las moléculas implicadas en su producción; células citotóxicas naturales; y citoquinas y quimioquinas, y las moléculas y células implicadas en su producción. Un experto en la técnica reconocerá que una respuesta inmune beneficiosa (y por tanto que supere la inmunotolerancia) se puede determinar por una serie de vías. La activación de las diversas ramas del sistema inmune se puede determinar, por ejemplo, midiendo la respuesta inmune específica del antígeno antes y después del tratamiento o midiendo la reducción o alivio de la masa tumoral y/o el tamaño del tumor, o determinando un aumento en el período de supervivencia. Demostraciones específicas de la inducción de una respuesta inmune beneficiosa o proporcionar un beneficio terapéutico incluirían una o más de las siguientes:

1)

una respuesta humoral al anticuerpo administrado (Ab1), incluyendo la evidencia de HAMA y/o Ab2;

2)

una respuesta humoral al antígeno, incluyendo evidencia de la aparición de anticuerpos específicos para el antígeno para los mismos y/o diferentes epítopos en el antígeno que en el epítopo por el agente de unión (por ejemplo, Ab3 y/o Ab1 c);

3)

citotoxicidad dependiente del anticuerpo, incluyendo evidencia de que el suero después de la inyección con un título de anticuerpo específico para el antígeno media en la destrucción del tumor cuando el suero es células mononucleares de sangre periférica incubada y dianas celulares tumorales respecto al suero inicial antes de la inyección;

4)

citotoxicidad dependiente del complemento, incluyendo evidencia de que el suero después de la inyección combinado con plasma que contiene complemento destruye las dianas celulares tumorales con respecto al suero inicial antes de la inyección;

5)

actividad de células citotóxicas naturales, incluyendo mejorar la destrucción de células tumorales por células mononucleares de sangre periférica (que contienen células NK) en muestras de sangre después de la inyección tomadas antes de la aparición de una respuesta medible de anticuerpos a los TAA con respecto a células mononucleares de sangre periférica antes del tratamiento;

6)

citotoxicidad mejorada por el antígeno, incluyendo destrucción de células tumorales diana por células mononucleares de sangre periférica (en presencia de células tumorales positivas a TAA) con respecto a niveles previos a la administración; y

7)

inmunidad celular, incluyendo evidencia de proliferación de linfocitos T o tisis de células tumorales después de la inyección con respecto a antes de la inyección.

Además, la evidencia de una respuesta inmune beneficiosa puede incluir demostrar que el complejo agente de unión-antígeno origina una respuesta proliferativa de linfocitos T más vigorosa que la respuesta al agente de unión o al antígeno solos (en PBMC después del tratamiento frente a antes del tratamiento). Un experto en la técnica también reconocerá que su batería de evidencias demuestra que las composiciones y procedimientos de la presente invención inducen múltiples vías del sistema inmune diferentes y que estas diversas vías tienen una importancia relativa variable para un paciente particular, dependiendo de la constitución inmune específica del sujeto.

Potenciadores de inmunogenicidad 1. Baja dosis

Conforme a los procedimientos de la presente invención, se puede administrar una composición que comprende el agente de unión en una cantidad suficiente para reconocer y unir el antígeno, tal como un antígeno asociado a un tumor (TAA) predeterminado y, más preferiblemente, un antígeno multiepitópico soluble. En una realización preferida de la invención, la dosificación es suficiente para generar o provocar una respuesta inmune beneficiosa y preferiblemente eficaz contra el antígeno. Véase el Ejemplo 17. Una cantidad inmunológicamente o terapéuticamente eficaz o aceptable de agente de unión es una cantidad suficiente para unirse a un antígeno predeterminado in vivo o ex vivo, y puede provocar una respuesta inmune eficaz frente al antígeno. La respuesta puede inhibir o destruir células, por ejemplo, células tumorales, que portan y presentan un epítopo recientemente accesible, aliviando o eliminando de este modo la enfermedad o estado patológico que produce el antígeno. La respuesta inmune puede tomar la forma de una respuesta humoral, una respuesta mediada por células o ambas. En una realización preferida de la invención, la dosificación del anticuerpo
monoclonal es menor que la dosificación requerida para producir ADCC o CDC al agente de unión administrado.

La concentración o dosificación de la proteína en la composición puede variar ampliamente, por ejemplo, de menor de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 15 a 20% en peso. Como se ha indicado antes, la composición se administra en una cantidad suficiente para estimular una respuesta inmune contra el antígeno. Cantidades eficaces para este uso dependerán en parte de la intensidad de la enfermedad y del estado del sistema inmune del paciente. Por lo general, la composición incluirá de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 2 mg o más de agente proteico por kilogramo de peso corporal, más corrientemente dosificaciones de aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 200 \mug por kilogramo de peso corporal, reconocidas por los expertos en la técnica como que comprenden una baja dosis. Además, los expertos en la técnica reconocerán y podrán evaluar las diversas consideraciones que se pueden usar para determinar una dosis apropiada. La concentración será normalmente al menos 0,5%; se puede seleccionar cualquier cantidad basada principalmente en el volumen de fluido, viscosidad, antigenicidad y factores similares, conforme al modo particular de administración.

Un procedimiento y composición de una realización de la invención incluye una composición que comprende una baja dosis de agente de unión, refiriéndose baja dosis a una cantidad menor que aproximadamente 2 mg/kg, incluso más preferiblemente, de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 2 mg por kilogramo de peso corporal y en la que la administración de la composición que comprende una baja dosis de agente de unión induce una respuesta inmune beneficiosa.

2. Fotoactivación

Conforme a la presente invención, un anticuerpo puede estar fotoactivado. En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a preparar anticuerpos usando radiación UV de modo que la inmunogenicidad del anticuerpo completo se aumenta. Tal y como se usa en la presente memoria, aumentar la inmunogenicidad se refiere a aumentar el reconocimiento y/o respuesta de un anticuerpo antiidiotípico y/o antiisotípico. En una realización más preferida de la invención, el procedimiento aumenta la inmunogenicidad del inmunógeno sin alterar o afectar de forma adversa su antigenicidad.

Conforme a la presente invención, puede ser beneficioso generar una respuesta mejorada con el fin de producir un beneficio terapéutico. Por ejemplo, conforme a la presente invención, puede ser deseable administrar anticuerpos expuestos a radiación UV a un paciente con cáncer, con el fin específico de generar una respuesta inmune (es decir, producir anticuerpos antiidiotípicos) al anticuerpo expuesto a UV. Esta respuesta puede proporcionar una ventaja terapéutica a través de consecuencias humorales y celulares dirigidas a las células cancerosas. Conforme a un aspecto de la invención, la proteína expuesta a UV presenta una mayor inmunogenicidad y por tanto puede ser útil como agente terapéutico para una enfermedad.

Los procesos de alteración de proteínas de la presente invención originan una proteína modificada con potencial inmunogénico mejorado. Quizás se ha alterado el carácter hidrófobo/hidrófilo por ruptura de triptófano minoritaria en combinación con generación de sulfhidrilo para mejorar su reconocimiento/respuesta por las células inmunes. También es posible que la porción constante del anticuerpo tenga cambios específicos en aminoácidos fundamentales con reconocimiento de células presentadoras de antígenos mediado por Fc mejorado. Esto no está relacionado con cambios en el estado polimérico de la proteína, por lo que las formas agregadas (como se han observado para inmunoglobulinas humanas después de exposición a UV) se dirigen a células fagociíticas, puesto que el producto fotoactivado mantiene su estado monomérico. El grado final de presentación y respuesta del complejo anticuerpo/antígeno mejora típicamente como resultado de la fotoactivación, como se detecta por la respuesta HAMA de pacientes positivos a antígenos a los que se inyectó anticuerpo fotoactivado.

Procedimientos para fotoactivar un agente de unión son muy bien conocidos en la técnica e incluyen exponer el anticuerpo a radiación, siendo el anticuerpo alterado resultante capaz de generar una respuesta inmune cuando se administra a un animal que es típicamente capaz de generar una respuesta inmune a la forma nativa del anticuerpo.

En una realización preferida de la invención, el anticuerpo se expone a radiación ultravioleta. De forma típica, el anticuerpo se puede exponer a radiación ultravioleta a una longitud de onda de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 400 nm, de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 Julios/cm^{2}, de aproximadamente 1 a aproximadamente 180 minutos (más preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 minutos). Ensayos llevados cabo en estas condiciones muestran que el proceso tiene como resultado típicamente un anticuerpo intacto o completo que se ha activado. Estos ensayos sugieren que el procedimiento conforme a la invención genera sulfhidrilos entre las cadenas ligera y pesada del anticuerpo.

3. Sistema de liberación

Puesto que algunos agentes de unión tales como proteínas son por si mismos poco inmunógenos, se puede aumentar su inmunogenicidad por administración en adyuvantes inmunológicos y sistemas de liberación de antígenos. La inmunogenicidad de una composición específica también se puede incrementar u optimizar eligiendo la vía de administración. Por ejemplo, la inmunogenicidad de composiciones producidas conforme a la presente invención que incluyen un anticuerpo monoclonal se puede aumentar eligiendo un modo de liberación que aumente el contacto directo entre el agente de unión y el antígeno. La vía preferida es la intravenosa, más preferiblemente sin adyuvante. Una vía eficaz, pero menos preferida, es la subcutánea, más preferiblemente con adyuvante. Los expertos en la técnica estén habituados a las diversas vías disponibles y porqué se elige una vía con respecto a otra vía para un agente de unión particular.

Un experto en la técnica también reconocerá que para administrar una composición se pueden usar liposomas, nanoesferas, micelas o microesferas y que dicha composición puede aumentar la inmunogenicidad.

4. Fotosensibilizador

Las composiciones de la presente invención pueden incluir uno o más fotosensibilizadores. Fotosensibilizadores ejemplo incluyen, auque sin quedar limitados a los mismos, fluoresceína, derivados de hematoporfirina (por ejemplo, Photofrin®), derivados de porfirina y pigmentos perilenoquinoides. En una realización preferida de la invención, el fotosensibilizador comprende el uso de derivados de perilenoquinona (PQP) como agentes fotodinámicos y el uso de derivados de PQP en terapia inmunofotodinámica (IPT).

La invención también comprende un procedimiento para tratar una enfermedad administrando una cantidad terapéuticamente suficiente de al menos un derivado de PQP unido a un agente de unión y activar el conjugado, de forma típica fotoactivando el derivado de PQP. De forma típica, el derivado de PQP se puede activar exponiéndolo a una longitud de onda de luz predeterminada. La invención también incluye un procedimiento para tratar cáncer que se mejora en presencia de longitudes de onda de luz entre aproximadamente 400 nm y aproximadamente 850 nm. PQP adecuados incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos, los descritos en el documento de Estados Unidos nº de serie 08/782.048, incorporado en la presente memoria como referencia. En un realización preferida de la invención, el PQP es hiprocrelina B, moléculas derivadas de HB y composiciones que incluyen HB o uno o más de sus
derivados.

Las características deseadas para un sensibilizador de PDT comprenden al menos una o más de las siguientes características: buena absorción de luz en una longitud de onda que penetra en el tejido hasta una profundidad deseada (la absorción en el intervalo de 600 nm a 850 nm penetra en la piel muchos milímetros), compuesto sensible al pH - inactivo, menor actividad o actividad destruida a las características de pH de tejidos normales, pero activo o mayor actividad al pH de las células u organismos a tratar; compuesto aclarado del cuerpo rápidamente y si un compuesto se destina a tratar tumores sólidos debería tener la capacidad de funcionar tanto en presencia y/o ausencia de oxígeno para solucionar el problema de la hipoxia celular tumoral. El fotosensibilizador tendrá baja citotoxicidad sin radiación y excelente fotopotenciación de la lesión celular. El efecto tóxico de PDT puede estar mediado por necrosis, muerte celular apoptótica o por estasis de la vasculatura tumoral o lecho vascular.

5. Efectores

La presente invención incluye una composición que comprende un agente de unión unido a, o usado en combinación con uno o más efectores. Tal y como se usa en la presente memoria, efectores se refiere a una sustancia que afecta a la actividad del agente de unión sin unirse al sitio de unión del sustrato (o antígeno).

Un procedimiento conceptualmente directo para funcionalizar anticuerpos recombinantes comprende fusionar secuencialmente el gen del anticuerpo con el gen de una segunda proteína y expresar la proteína de fusión resultante como una única proteína. Segundas proteínas ejemplo incluyen aunque no quedan limitadas a:

a.

Un resto de amplificación de señal, tal como una secuencia mimética de biotina, que puede introducirse en el extremo terminal C de un agente de unión como marca de detección debido a la fuerte afinidad de estreptavidina-biotina;

b.

Liposomas: fusión de ciertas secuencias de aminoácidos (con cargas negativas en condiciones fisiológicas) con un agente de unión, tal como Fv-B43.13 de cadena sencilla. Por tanto, la proteína de fusión puede quedar atrapada fácilmente en los liposomas;

c.

Secuencias de citoquinas (por ejemplo, IL-2): IL-2 es una linfoquina sintetizada y secretada fundamentalmente por linfocitos T auxiliares que se han activado por estimulación del complejo de receptor de linfocitos T con complejos antígeno/MHC en las superficies de las células presentadoras de antígenos. La respuesta de los linfocitos T auxiliares a la activación es inducción de expresión de IL-2 y receptores de IL-2. IL-2 posee una diversidad de otras actividades que afectan al desarrollo y diferenciación de linfocitos B, a la formación de células LAK y al aumento de células NK y potenciación de su actividad citotóxica. Debido a la función central del sistema IL-2/receptor de IL-2 en la mediación de la respuesta inmune, es evidente que la manipulación de este sistema tiene importantes implicaciones terapéuticas. IL-2 ya ha demostrado ser prometedor como fármaco contra el cáncer por su capacidad para estimular la proliferación y actividades de células LAK y TIL que atacan a tumores.

d.

Toxina: inmunotoxinas realizadas atacando una toxina (por ejemplo extoxina de Pseudomonas y RNAsa bacteriana) al anticuerpo o fragmentos de anticuerpo para producir moléculas citotóxicas que destruyen de forma selectiva las células tumorales diana.

e.

Enzima: un sistema de tratamiento con enzima dirigida a un anticuerpo y profármaco es un procedimiento efector artificial particularmente atractivo. En esta técnica, se usa un anticuerpo para dirigir una enzima a un tumor y retenerla mientras el conjugado anticuerpo-enzima se depura de los tejidos normales. Se administra entonces un profármaco no tóxico, y se activa éste por la enzima produciendo un fármaco citotóxico en el sitio del tumor.

f.

Quelantes de radionúclidos: cualquier péptido que se una a un quelante de radionúclidos, por ejemplo, metalotioneína (MT). MT es una proteína ubicua, de bajo peso molecular, que se une a metales, que participa en el metabolismo y destoxificación de metales. Las formas de mamíferos de MT unen siete iones en conglomerados tetrahédricos metal-tiolato, incluyendo tecnecio y otro metales útiles para radiodiagnóstico dirigido o terapia.

g.

Un potenciador de fagocitosis, por ejemplo, tuftsina. Tuftsina es un tetrapéptido natural (Thr-Lys-Pro-Arg) que se encontró manifestaba varias actividades biológicas, incluyendo activación de monocitos/macrófagos y estimulación de fagocitosis. Tiene un amplio espectb de actividades inmunoadyuvantes que ejerce sobre las células fagocíticas, los leucocitos polimorfonucleares, los monocitos y los macrófagos. En estudios en animales y clínicos, la tuftsina ha presentado actividad antitumoral y antiinfecciosa sin toxicidad detectable.

La proteína de fusión scFv-tuftsina se definió como una proteína de fusión recombinante que está formada por el dominio de unión del anticuerpo scFv conectado con tuftsina por un engarce artificial. Esta proteína bifuncional se diseñó para conseguir una mayor inmunogenicidad antiidiotípica específica.

Procedimiento

En una realización de la invención, MAb B43.13 dirigido contra un primer epítopo en el antígeno multiepitópico CA125 induce una respuesta inmune contra CA125 a través de uno o más segundos epítopos en el antígeno CA125. En una realización preferida de la invención, cualquiera de los segundos epítopos son epítopos crípticos o previamente inaccesibles que se exponen o están disponibles para interactuar con un componente de la reacción del sistema inmune después de que MAb B43.13 se une al antígeno. Críptico o inaccesible se refiere a un epítopo o sitio de unión en el antígeno predeterminado que no activa o estimula el sistema inmune cuando el antígeno no está unido por un agente de unión conforme a la invención.

Tal y como se usa en la presente memoria "administrar" se refiere a cualquier acción que tenga como resultado exponer o poner en contacto una composición que contiene un agente de unión con una célula, células o tejido predeterminados, típicamente mamíferos. Tal y como se usa en la presente memoria, administrar se puede llevar a cabo in vivo, in vitro o ex vivo. Por ejemplo, se puede administrar una composición por inyección o mediante endoscopia. Administrar también incluye la aplicación directa a células de una composición conforme a la presente invención. Por ejemplo, durante el curso de la cirugía, se pueden exponer las células tumorales. Conforme con una realización de la invención, estas células expuestas (o tumores) se pueden exponer directamente a una composición de la presente invención, por ejemplo, lavando o irrigando el sitio de cirugía y/o las células.

Para enfermedades que se pueden caracterizar en parte por tener un antígeno asociado a un tumor que es multiepitópico, una realización de la presente invención implica poner en contacto un antígeno soluble con un reaccionante de unión (AU) que se une de forma específica a un único epítopo en el antígeno asociado a un tumor multiepitópico.

Conforme con un procedimiento de la invención, el agente de unión deberá ser capaz de unirse a un sitio o receptor de unión predeterminado y se puede administrar al paciente por cualquier vía inmunológicamente adecuada. Por ejemplo, el agente de unión se puede introducir en el paciente por una vía intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intratecal, intravesical, intradérmica, intramuscular o intralinfática. La composición puede estar en forma de solución, comprimido, aerosol o formulación multifásica. También se pueden usar como portador, vehículo o sistema de liberación liposomas, liposomas de circulación prolongada, inmunoliposomas, microesferas biodegradables, micelas o similares. Además, usando procedimientos ex vivo bien conocidos en la técnica, se puede extraer sangre o suero del paciente; opcionalmente, puede ser deseable purificar el antígeno en la sangre del paciente; se puede mezclar seguidamente la sangre o suero con una composición que incluye un agente de unión conforme a la invención; y a continuación se devuelve al paciente la sangre o suero tratados. El médico puede comparar las respuestas antiidiotipicas y antiisotípicas asociadas con estas vías diferentes para determinar la vía más eficaz de administración. La invención no queda limitada a ningún procedimiento particular de introducción del agente de unión en el paciente.

La administración puede realizarse una vez, más de una vez y durante un período prolongado. Puesto que las composiciones de esta invención se pueden usar para pacientes en un estado de enfermedad grave, es decir, mortal o potencialmente mortal, se pueden administrar si se considera deseable excesos de agente de unión. Procedimientos y protocolos reales para administrar composiciones farmacéuticas, incluyendo técnicas de dilución para inyecciones de la presentes composiciones, son bien conocidos o serán evidentes para los expertos en la técnica.

Algunos de estos procedimientos y protocolos se describen en Remingto'n Pharmaceutical Science, Mack Publishing Co. (1952).

Se puede administrar un agente de unión en combinación con otros agentes de unión, o se puede administrar en combinación con otros protocolos o agentes de tratamiento, por ejemplo, antineoplásicos.

La eficacia de las proteínas de la presente invención se puede controlar in vivo o in vitro. Las respuestas humorales se pueden controlar in vitro por inmunoensayos convencionales, en los que la actividad antitumoral de la respuesta se puede determinar por ensayos de citotoxicidad mediada por el complemento y/o de citotoxicidad celular dependientes del anticuerpo (ACDD). Las metodologías de ensayo son bien conocidas y se describen en Handbook of Experimental Immunology, Vol. 2, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1986). Se pueden dirigir otros ensayos para determinar el nivel de antígeno en el paciente o tejido. La inmunidad mediada por células se puede controlar in vivo por el desarrollo de reacciones de hipersensibilidad del tipo retrasado, u otros medios in vivo o in vitro conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, aunque sin quedar limitados al protocolo de reacción con ensayo cutáneo, ensayos de estimulación de linfocitos, medida de la toxicidad de los linfocitos de un sujeto a células tumorales usando un ensayo de citotoxicidad convencional, por un ensayo de dilución limitante, o midiendo niveles en plasma de citoquinas usando ensayos ELISA convencionales.

Determinar la eficacia de un pareja agente de unión específico-antígeno se puede llevar a cabo también controlando la destrucción de las células. Los expertos en la técnica reconocerán que existe una diversidad de mecanismos que demuestran la destrucción celular. Como se muestra en los ejemplos, la destrucción celular se puede demostrar mostrando que Ab3 media ADCC, que Ab1 y HAMA median CDC, que se producen células citotóxicas naturales (NK) y/o que se producen linfocitos T citotóxicos (CTL).

Ejemplos Ejemplo 1 Influencia en la inmunoterapia mediada por anticuerpo del antígeno circulante en inducir respuestas inmunes antitumorales específicas del antígeno

Este ejemplo demuestra el uso de anticuerpos monoclonales murinos específicos para el antígeno para inducir una respuesta inmune contra un antígeno asociado a un tumor inmunosupresor. La inyección de un anticuerpo contra un epítopo específico en un antígeno multiepitópico puede conducir a respuestas inmunes contra diversos epítopos diferentes en este antígeno.

En un intento de comprender el mecanismo de acción de MAb-B43.13, se estudiaron diversos parámetros inmunológicos en pacientes con cáncer de ovario a los que se inyectó este anticuerpo. Estos estudios demostraron claramente la activación de respuestas inmunes anticáncer humorales y celulares.

La generación de anticuerpos que se unen a CA125 se midió antes de la inyección de MAb-B43.13 y se relacionó con los niveles de CA125 previos a la inyección así como con los datos de supervivencia. La Tabla 1 muestra que la generación de anticuerpos anti-CA125 se relaciona con niveles previos a la inyección de CA125. El CA125 circulante afecta al desarrollo de anticuerpos anti-CA125 solo cuando los pacientes recibieron la inyección de MAb-B43.13. Si se comparan los anticuerpos anti-CA125 antes de la inyección de MAb-B43.13 entre pacientes con bajos o altos valores de CA125 (inferiores o superiores a 105 U/ml), no se encontró diferencia entre los dos grupos (Tabla 1). Se eligió como una cantidad significativa de CA125 una concentración mínima de 105 U/ml de CA125.

La destrucción, del tumor por medio de un mecanismo ADCC mediado por anticuerpo anti-CA125 o a través de CTL específicos de CA125, condujo a una mayor supervivencia en pacientes a los que se inyectó MAb-B43.13. Aunque elevados niveles de CA125 en suero han sugerido que es un mal indicador de pronóstico, parecen tener un efecto beneficioso en combinación con la inyección de anticuerpo anti-CA125 en tales pacientes. Por ejemplo, cuando los niveles de CA125 fueron mayores que 105 unidades/ml, la respuesta inmune contra CA125 aumentó en más del 20%, que a su vez aumentó la supervivencia media en los pacientes desde 39,1 meses a 54,5 meses (Tabla 1). Así, la inyección de un agente de unión a un paciente que contiene niveles elevados de antígeno soluble multiepitópico conduce a una respuesta humoral y celular específica del antígeno que a su vez conduce a la destrucción del tumor seguida de una supervivencia mejorada. Se obtuvieron resultados similares para niveles de CA125 de 5 a
9,5 U/ml.

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TABLA 1 Correlación entre los niveles séricos de CA125, la respuesta anti-CA125 (Abp') humano y la supervivencia en pacientes a los que se inyectó MAb-B43.13

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TABLA 2 Correlación entre niveles séricos de CA125 y niveles de anticuerpo en pacientes a los que se inyectó MAb-B43.13

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La Tabla 3 muestra la correlación entre los niveles de antígeno CA125 y la supervivencia de los pacientes. Se eligió corno nivel de corte un valor de 105 U/ml. Las poblaciones objeto de estudio (indicadas en la primera columna) corresponden a niveles inferiores o superiores a 105 U/ml, o aparición o ausencia de respuesta.

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TABLA 4

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Respuesta de pacientes que tienen niveles detectables o en la mediana de CA125

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En un intento por comprender el mecanismo subyacente de la formación de anticuerpos anti-CA125 por la inyección de MAb-B43.13 en pacientes con cáncer, se caracterizaron los anticuerpos anti-CA125 humanos presentes en sus sueros. Por ejemplo, si se generaban anticuerpos anti-CA125 de la forma sugerida por la red idiotípica, MAb-B43.13 generaría anticuerpos anti-MAb-B43.13, algunos de los cuales imitarían exactamente al antígeno CA125 (=Ab2). A su vez, estos pueden generar anticuerpos anti-CA125 (=Ab3). Los Ab3 generados por esta vía se unirán al mismo epítopo en CA125 que Ab1 (=B43.13) y por tanto competirán con la unión de MAb-B43.13 al antígeno.

Por otro lado, los anticuerpos generados a través del propio antígeno se unirán a diversos epítopos disponibles en el antígeno. Si los anticuerpos anti-CA125 eran generados de la forma sugerida por la presente invención, la vía seguiría Ab1 + antígeno soluble \rightarrow Ab1c. Siguiendo este esquema, MAb-B43.13 (Ab1) se unirá al antígeno sérico de CA125, que a su vez generará un anticuerpo anti-CA125 (Ab1c). Por otro lado, los anticuerpos Ab1c generados en esta vía se unirán y serán inhibidos por otros anticuerpos anti-CA125, tales como B27.1 o M11, debido, como se ha indicado antes, a que CA125 es multiepitópico y los epítopos B4.13, M11 y B27.1 son distintos. Además, Ab1c no se unirá a anticuerpos anti-MAb-B43.13.

El análisis de muestras de suero con títulos positivos anti-CA125 demostró que su unión a CA125 se podría inhibir no solo por anticuerpo MAb-B43.13 de cadena sencilla sino también por fragmentos F(ab') de otros anticuerpos anti-CA125, B27.1 y M11 que reconocen epítopos en CA125 que son diferentes de B43.13 (Tablas 2 y 3). Se consideró que sólo los sueros de dos pacientes contenían anticuerpos anti-CA125 que eran generados exclusivamente por inducción de idiotipo de MAb-B43.13 (=Ab3), es decir, anticuerpos anti-CA125 que podían ser inhibidos sólo y completamente con MAb-B43.13 y unirse a anticuerpo policlonal de conejo Ab2.

Así, si el suero de los pacientes contenía anticuerpos anti-CA125 que podían inhibirse solo por MAb-B43.13, éste se clasificaba como que contenía Ab3; los que podían inhibirse por MAb-B27.1 se clasificaban como Ab1c. En otras palabras, inyectar un agente de unión tal como un anticuerpo contra un epítopo único en un antígeno multiepitópico conduce a la generación de una respuesta humoral y celular contra un epítopo diferente en el antígeno.

La presencia de una respuesta anti-CA125 multiepitópica en suero de pacientes tratados con MAb-B43.13 con altos niveles de CA125 nos hace creer que, además de la inducción antiidiotipo, existen otros mecanismos para inducir una respuesta inmune contra antígenos asociados a tumores. En este escenario, el anticuerpo inyectado forma un complejo con el antígeno circulante in vivo. Este proceso puede causar varios efectos. La complejación del antígeno por anticuerpos puede facilitar la recaptación de CA125 por células presentadoras de antígeno profesionales (APC) y así hacer al antígeno más inmunogénico. El anticuerpo complejado -en nuestro caso de una fuente murina- también podría funcionar como adyuvante, añadir un componente extraño al autoantígeno CA125 que podría facilitar el reconocimiento por el sistema inmune. Los epítopos del antígeno se bloquean por el anticuerpo complejante y son protegidos de procesado o procesados a diferentes secuencias creando así nuevos péptidos para la unión a MHC. También es posible que tenga lugar un cambio conformacional en el antígeno tras la unión al anticuerpo, exponiendo de este modo nuevos epítopos al sistema inmune, incluyendo epítopos subdominantes o inmunodominantes.

Es interesante indicar que la formación del complejo entre CA125 y MAb-B43.13 solo se ha observado durante estudios farmacocinéticos, como se determina por la caída de los niveles circulantes de CA125 tras la inyección de MAb-B43.13. Cuando los pacientes recibieron más de una inyección y los pacientes desarrollaron altas cantidades de anticuerpos antiratón humanos (HAMA), el anticuerpo mostró un rápido aclaramiento en hígado y bazo, como se demostró en estudios inmunológicos de centelleo. Los complejos antígeno-anticuerpo, acumulados en centros linfoides como el bazo, son conocidos por ser presentados de forma muy eficaz a los linfocitos T por células presentadoras de antígenos, tales como linfocitos B, macrófagos o células dendríticas.

El aumento del procesado y presentación de antígeno por complejación inmune se ha demostrado en varios sistemas. La localización de toxoide del tétano en Fc_R complejado con IgG de antitoxoide tetánico tiene como resultado un aumento de 10 a 1000 veces en el procesado y presentación de este antígeno medido por activación de células T_{H}. Se observó un aumento similar en la inmunogenicidad con antígeno de la hepatitis B complejado con su anticuerpo correspondiente. Además se ha usado la presencia natural de anticuerpos contra epítopos de \beta-galactosilo para aumentar la inmunogenicidad de vacunas tumorales en antígenos asociados a tumores modificados con \beta-galactosilo.

Se observó que MAb-B43.13 tiene un efecto protector sobre su epítopo CA125 durante el procesado del antígeno por el sistema inmune. El epítopo MAb-B43.13 fue reconocido por casi todas las muestras de anticuerpo anti-CA125 de los pacientes (inhibición en el 78% de las muestras, Tablas 5 y 6, y Figura 6).

Los datos también indican que la región por la que el anticuerpo MAb-B43.13 se une a CA125 resulta igualmente protegida cuando MAb-B43.13 y CA125 están unidos, con lo que disminuye su degradación durante el procesamiento del MAb-B43.13 cuando es este el que actúa como antígeno y, como consecuencia, después de su disociación de CA125, esta zona de unión es presentada intacta por las células presentadoras de antígeno e induce contra ella potentes respuestas de anticuerpos antiidiotípicos, Ab2. Esto puede observarse en la figura 2, donde se muestra que en los ratones inmunizados con el complejo formado por CA125 y el anticuerpo MAb-B43.13 (en la figura B43.13 + CA125) se incrementa claramente la formación de anticuerpos antiidiotípicos (Ab2) con respecto a los ratones inmunizados sólo con el anticuerpo (B43.13) e incluso con respecto a los ratones inmunizados con el anticuerpo junto a la hemocianina de babosa, KLH, un portador conocido por aumentar la inmunogenicidad. Véase la Tabla 5 y la Figura 6 para un resumen y la Tabla 6 para los detalles de estos resultados. En esta tabla aparecen varias series de datos para determinados pacientes (concretamente pacientes nº 3, 4, 8, 9 y 11) debido a que se tomaron distintas muestras transcurridos los tiempos que se indican en la tercera columna, tras la administración del número de inyecciones indicado en la segunda columna. Los sueros de estos pacientes se analizaron para determinar la presencia de anticuerpos anti-CA125 humanos por su capacidad para unirse a CA125 [R. Madiyalakan et al., Hybridoma, 14:199-203 1995) y Schultes et al., Cancer Immunology and Immunotherapy 46:201-212 (1998)]. Se encontró que anticuerpos purificados de sueros de pacientes agrupados inhibían B43.13 en ensayos similares, pero no B27.1. La explicación de esta anomalía está todavía por determinar. No obstante, se ha confirmado usando anticuerpos M11 que B43.13 se une a un epítopo diferenciado y que tras la unión con B43.13, CA125 es reconocido de hecho por el sistema inmune.

TABLA 5

5

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Por tanto, la formación de complejo puede conducir a un anti-CA125 mejorado, así como a la formación de anticuerpo antiidiotípico. Manca et al., J. Immunol. 140:2893 (1988) y Ling et al., Immunology 62:7 (1987) han demostrado que los anticuerpos pueden conservar la secuencia de su epítopo durante el procesado de antígenos y se han usado anticuerpos para desplegar respuestas inmunes frente a epítopos menos inmunógenos de un antígeno.

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La presentación de antígenos mejorada de complejos antígeno-anticuerpo se atribuyó a la recaptación facilitada del antígeno a través del receptor Fc_ (macrófagos, células dendríticas) o Ig unido a la membrana (linfocitos B) en células presentadoras de antígenos profesionales (APC). El receptor Fc_RI y RIII en macrófagos y células dendríticas no une IgG_{I} murina, pero el Fc_RII humano, que media en la fagocitosis y pinocitosis de pequeños complejos inmunes, tiene una potente afinidad por este isotipo de IgG murina. Por consiguiente, se pueden relacionar diversas APC profesionales en la presentación preferente del complejo CA125-MAb-B43.13. Se han ensayado linfocitos B con dos especificidades. diferentes así como macrófagos como APC: linfocitos B específicos de CA125 (de ratones inmunizados con MAb-B43.13) y linfocitos B específicos de anti-MAb-B43.13 (de ratones inmunizados con MAb-B43.13). Como control sirven linfocitos B normales. Cuando la proliferación de linfocitos T específicos de CA125 se controló por la recaptación de [metil-^{3}H]-timidina, se observó una óptima estimulación en linfocitos B específicos de MAb-B43.13, cebados con el complejo CA125-MAb-B43.13 (Figura 3), seguido de la presentación de CA125 por linfocitos B específicos de CA125. La presentación mejorada de complejos inmunes por macrófagos y células dendríticas se ve mediada por la recaptación preferente a través Fc_R. La figura 4 confirma que CA125 es presentado más eficazmente por macrófagos, si se compleja con un anticuerpo específico para un antígeno.

La capacidad de MAb-B43.13 para aumentar la inmunogenicidad de CA125 se estudió en un modelo de ratón inmunizando un ratón con el complejo CA125-MAb-43.13, comparado con CA125 o MAb B43-13 sólo como inmunógeno. Cuando se analizó el suero de ratón para detectar los niveles de anticuerpo anti-CA125, el ratón al que se inyectó el complejo antígeno-anticuerpo tuvo los títulos mayores (véase la Figura 5). Esto apoya la observación de que la interacción del antígeno con un anticuerpo específico conduce a una mayor respuesta inmune humoral específica comparado con el anticuerpo o el antígeno solos.

Estos resultados indican claramente que cuando un anticuerpo contra un único epítopo (B43.13) se inyectó a un paciente, se genera una respuesta de anticuerpos contra el antígeno completo que reconoce diferentes epítopos presentes en el antígeno. En otras palabras, inyectar un agente de unión tal como un anticuerpo monoclonal a un antígeno multiepitópico soluble en un paciente que tiene un sistema inmune que funciona genera un anticuerpo frente al antígeno, en el que el anticuerpo generado es inhibido por anticuerpos para diferentes epítopos.

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Ejemplo 2

Igualmente, inyectar el agente de unión a pacientes con cáncer que tienen CA125 circulantes conduce a CTL específicos del antígeno. Se ensayaron Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) de ocho pacientes a los que se inyectó MAB-B43.13 para determinar la citotoxicidad contra células de tumor de ovario positivas a CA125 o negativas a CA125 en un ensayo de liberación de cromo. Los resultados se muestran en la Tabla 7. La especificidad de la tisis se confirmó por la capacidad de MAb-B43.13 para inhibir dicha lisis, así como la incapacidad para destruir células tumorales negativas a CA125. De los 8 pacientes que recibieron MAb-B43.13, se determinó que al menos cuatro pacientes (nº 5 a nº 8) tenían linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de CA125 en su sangre. La generación de CTL específicos para CA125 es probable que destruya las células de cáncer de ovario en los pacientes.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 7 Citotoxicidad en pacientes a los que se inyectó una vacuna que contenía MAb-B43.13

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Los resultados son la media de un experimento realizado por triplicado

Ejemplo 3 Inmunoterapia de carcinoma de ovario humano en un modelo animal

Con el fin de investigar la eficacia terapéutica, se ensayó MAb-B43.13 en un modelo de PBL humano-ratón SCID/BG. Se reconstituyeron ratones con PBL humanos (donantes normales) por inyección i.p. de 2 a 3x10^{7} PBL/
ratón. Se administró MAb-B43.13 a 100 \mug/ratón en PBS, en diferentes configuraciones experimentales. Un anticuerpo control de igual isotipo (MOPC21 o MAb-170) e inyección de PBS sirvieron como controles. Las células de cáncer de ovario NIH: OVCAR-Nu3 se inyectaron i.p. a 1x10^{6} células/ratón o s.c. a 4x10^{6} células/ratón. Los ratones Hu-PBL-SCID/BG se inmunizaron antes de la inyección de células tumorales o después de que se establecieran pequeños tumores (dos semanas después del trasplante). En otro experimento, se inyectó en ratones que tenían tumores (s.c.) MAb-B43.13 dos semanas después del trasplante del tumor, junto con PBL.

Las inyecciones de anticuerpo se repitieron dos veces en intervalos de dos semanas. La caracterización funcional y celular de suero y PBL de estos ratones demostró el injerto con éxito del sistema inmune humano en dichos ratones.

Los tres experimentos mostraron que el tratamiento con MAb-B43.13 podía: a) retrasar o prevenir el desarrollo de tumores; b) reducir el tamaño de pequeños tumores establecidos (inyección tumoral s.c.) o suprimir la producción de ascitis; c) retrasar el crecimiento del tumor cuando se inyecta antes de la implantación del tumor y d) prolongar la supervivencia del ratón (inyección tumoral i.p.).

Se identificaron linfocitos infiltrados en tumores humanos (TIL) en ratones usando citometría de flujo, que podría contribuir a la actividad antitumoral in vivo de MAb-B43.13. Al finalizar el estudio de tratamiento, los ratones supervivientes de los diferentes grupos de tratamiento se sacrificaron. Se obtuvieron lavados de sangre, bazo, tumor y peritoneo de la medida de inmunoglobulina humana, así como el análisis de citometría de flujo de PBL humanos en tejidos de ratón. Los tumores también se analizaron por inmunohistoquímica.

Ejemplo 5 Inducción de una red idiotípica a anticuerpos anti-MUC-1 en cáncer de mama

Proteínas MUC-1 (mucina epitelial polimórfica) expresada en epitelio maligno son infraglicosiladas, lo que conduce a la exposición de nuevos epítopos de linfocitos T y B. El antígeno CA15.3 es una glicoproteína que consiste en una proteína MUC-1 y un hidrato de carbono. Se inmunizaron ratones con CA15.3 para generar el clon murino anti-MUC-1, Alt-1. La especificidad de unión de Alt-1 al antígeno CA15.3 se caracterizó mediante ELISA, y la especificidad de unión de Alt-1 al transfectoma MUG-1 se caracterizó mediante análisis FAGS. La inyección de MAb-Alt-1 (Ab1) conjugado con KLH en ratones que tienen transfectoma MUC-1 dio como resultado la producción de anticuerpos antiidiotípicos (Ab2) (Figura 7) y anticuerpos anti- antiidiotípicos (Ab3) (Figura 8). Un mínimo de cuatro inyecciones en una dosis de 50 \mug/ratón originó una respuesta humoral medible. Los niveles de Ab2 y Ab3 alcanzaron su máximo después de seis inyecciones. El anticuerpo antiidiotípico (Ab2) competía con el antígeno nativo, CA 15.3. Estudios de proliferación de linfocitos T mostraron respuesta específica al anticuerpo inyectado y CA 15.3 indicando la presencia de linfocitos T específicos del idiotipo (T2) y linfocitos T específicos antiidiotipo (T3).

Además, se desarrolló un modelo de cáncer de mama usando un carcinoma de mama de ratón transfectado con gen MUC-1 humano, 413BCR. Se trataron grupos de ratones con Alt-1-KLH o con conjugado de inmunoglobulina humana y se comparó con control positivo apropiado (MUC-1 liposomal) y control negativo (inmunoglobulina murina). Se llevaron a cabo inmunizaciones dos veces antes o después de la implantación del tumor en intervalos semanales. Se midieron los volúmenes de los tumores semanalmente y se valoraron las velocidades de crecimiento.

Se observó una reducción significativa en el tumor en ratones tratados con conjugado Alt-1-IgG al comparar con los otros grupos.

Ejemplo 6

Se produjo una composición conforme a la invención contra CA 19.9 (SLe^{a}), un marcador excelente para cáncer de páncreas (87%), cáncer gástrico (68%) y cáncer colorrectal (50%). Se ha documentado que el ligando hidrato de carbono (SLe^{a}) constituye los restos hidrato de carbono de la familia de antígenos cancerigenoembriogénicos humanos [Anostario, et al; (1994)], MUC-1 pancreático humano [Ho, et al; (1995)] y CA 19.9 [Hamanaka, et al; Pancreas, 13:160-165 (1996)]. También se ha identificado SLe^{a} en melanoma humano [Ravindranath, et al, Cancer, 79:1686 (1997)] y cáncer colorrectal [Yamada, et al. (1997)]. Los expertos en la técnica reconocerán que una composición que contiene un agente de unión específico para SLe^{a} (o una o más moléculas de adhesión diferentes), tal como una composición que opcionalmente tiene uno o más agentes de unión distintos específicos para otros antígenos o moléculas, puede ser útil en el tratamiento de muchos otros cánceres, puesto que SLe^{a} se expresa en grandes cantidades en la superficie de muchos otros tumores [Srinivas, et al.; (1996)].

El agente de unión en la composición fue Alt-3, un anticuerpo monoclonal IgG3 que se une fuertemente a CA 19.9 y ha demostrado mediar en la destrucción de tumor a través de CDC in vitro.

Se incubaron con diferentes concentraciones de Alt-3, Alt-2, NS 1116, Alt-4 y mlgG3 no específica (20 \mug/ml a 0,0025 \mug/ml) aproximadamente 10^{4} SW 1116 marcados con cromo (2200 CPM). Los anticuerpos se incubaron durante 45 minutos a 4ºC. En los grupos de tratamiento incubados con HAMA, los anticuerpos se lavaron dos veces con medio y se incubaron con 1 \mug/ml de HAMA durante 45 minutos a 4ºC. Todas las placas se lavaron y se añadieron células efectoras (PBL humanos recién recogidos) o suero humano reciente (20% en medio) y se incubaron durante cuatro horas. Se calculó entonces el índice citotóxico (IC). Para analizar cada concentración se usó una prueba T emparejada.

Este experimento muestra que Alt-3 y Alt-2 son extremadamente eficaces en citotoxicidad mediada por el complemento (Figura 9). Dicha citotoxicidad aumenta en presencia de HAMA. El efecto antitumoral de Alt-3 también se analizó en ratones SCID/BG reconstituidos con PBL humanos. Este experimento muestra una reducción en el volumen de tumor como resultado del agente de unión y el complejo agente de unión/antígeno (Figura 10).

Ejemplo 7 Inmunoterapia dirigida por PSA de cáncer de próstata (Producción de AR47.47)

El antígeno prostático específico (PSA) representa una diana atractiva para la inmunoterapia del cáncer de próstata. Esta glicoproteína se sintetiza casi exclusivamente por la glándula prostática y se usa habitualmente para el diagnóstico y control de pacientes con cáncer de próstata. No obstante, puesto que el PSA es reconocido como autoantígeno, es esencial para la inmunoterapia eficaz desarrollar estrategias innovadoras capaces de disparar el sistema inmune e inducir una inmunidad protectora contra células que expresen PSA. Este ejemplo demuestra el uso de un anticuerpo para provocar una cascada antiidiotipo asociada con una respuesta inmune antitumoral específica del antígeno. Se ha producido en nuestro laboratorio un gran conjunto de anticuerpos monoclonales anti-PSA y estos anticuerpos se evaluaron para determinar su posible eficacia terapéutica contra cáncer de próstata. Los autores han demostrado que la inmunización de ratones con un anticuerpo anti-PSA seleccionado puede inducir una inmunidad específica contra el propio PSA. Estos resultados destacan por tanto el posible uso de anticuerpos anti-PSA para la inmunoterapia del cáncer de próstata.

Se produjeron clones de hibridomas que segregan anticuerpos anti-PSA por fusión de células de mieloma murino Sp2/O con los esplenocitos de un ratón Balb/c inmunizado con PSA humano. Un clon ejemplo, AR47.47, se une a un epítopo de PSA que corresponde a las secuencias de aminoácidos 139-163 de la molécula de PSA.

El primer criterio de selección usado para identificar el anticuerpo anti-PSA fue la capacidad de este anticuerpo para interaccionar con PSA circulante. Se encuentra PSA circulante tanto en una forma libre como complejada con antiproteasas tales como \alpha-antiquimiotripsina y \beta2-macroglobulina. Para rastrear los clones se usaron tres formas diferentes de PSA: PSA libre; PSA complejado con \alpha-antiquimiotripsina (PSA-ACT); y PSA libre no complejado con \alpha-antiquimiotripsina (PSA-nc). PSA corresponde a PSA purificado directamente de fluido seminal humano. Incubar conjuntamente PSA libre con ACT purificada origina la formación de PSA-ACT y PSA-nc. Se puede separar PSA-nc por cromatografía de afinidad. Se cree que PSA-nc puede representar la forma libre de PSA presente en la circulación. Complejar PSA con \beta-macroglobulina origina la encapsulación total de PSA. Como consecuencia, esta forma de PSA ya no es detectable por anticuerpos anti-PSA monoclonales. Por tanto no se usó esta forma de PSA en circulación para el rastreo.

PSA pertenece a la familia de calicreína y se encuentra un alto grado de homología estructural entre PSA y las calicreínas HK1 y HK2. Como segundo criterio de selección se usó la ausencia de reactividad cruzada del anticuerpo anti-PSA con calicreína aislada de plasma humano.

El clon del hibridoma AR47.17 respondió a los criterios descritos antes, se observó una fuerte inmunorreactividad con las tres formas de PSA usadas para el rastreo mientras que no se observó reactividad cruzada con calicreína plasmática humana. El clon del hibridoma AR47.17 se clonó dos veces por dilución limitante y el clon de segunda generación AR47.17R6R6 se eligió para los posteriores estudios. Se adaptó el clon AR47.47R6R6 a un medio convencional (RPMI FBS al 10%) y se formó un banco de células. Se verificó la ausencia de contaminación por micoplasma usando el ensayo de micoplasma de Boehringer Manheim. El clon AR47.47R6R6 se ha depositado en la American Type Culture Collection, y se ha asignado el número de acceso H-B 12526.

Se examinó la inmunización en ratones DBA con una composición de unión conforme a la invención (AR47.47) para determinar la inducción de una inmunidad a PSA específica mediante la red idiotípica (es decir, inducción de anticuerpos Ab3). Los anticuerpos anti-PSA (Ab3) se podían detectar en el suero de animales inmunizados con AR 47.47, se requirieron un mínimo de dos inyecciones de AR47.47 para la producción de Ab3. No se detectó reactividad hacia PSA por los grupos control (ratones inmunizados con un anticuerpo control de similar isotipo no relacionado con PSA y ratones que recibieron inyecciones de PBS).

AR 47.47 se dirige a un epítopo de PSA comprendido entre la secuencia 139-163 de la molécula de PSA. Los anticuerpos anti-PSA producidos por ratones inmunizados con AR 47.47 pueden interaccionar específicamente con el péptido de PSA 139-163, mostrando que al menos parte de los Ab3 producidos son idénticos en términos de especificidad a AR 47.47. Estos resultados demuestran que la inmunización con AR 47.47 puede inducir inmunidad anti- PSA específica en el hospedador.

Ejemplo 8 Inducción antiidiotípica de inmunidad a PSA en ratones

Se usaron ratones para determinar si la inmunización con anticuerpos anti-PSA puede inducir una inmunidad específica contra PSA mediante activación de la red idiotípica. El objeto de este experimento fue demostrar que la inmunización de ratones con anticuerpos anti-PS (Ab1) puede estimular el sistema inmune generando anticuerpos antiidiotípicos (Ab2=antígeno sustituto), y anticuerpos anti-antiidiotípicos (Ab3) capaces de reaccionar con el antígeno original.

Estos experimentos usaron un anticuerpo disponible de forma comercial como anticuerpo anti-PSA modelo
(RLSD09; ATCC HB-8525). El anticuerpo purificado se conjugó con Hemocianina de Lapa Bocallave (KLH) para potenciar su inmunogenicidad. Los anticuerpos anti-PSA conjugados con KLH fueron todavía capaces de unirse a PSA, indicando que el idiotipo de los anticuerpos no se enmascaró por el procedimiento de conjugación. Como control se usó anticuerpo B43.13, un anticuerpo monoclonal de ratón del mismo isotipo que el anticuerpo PSA (IgG1). El anticuerpo B43.13 se dirige específicamente contra el antígeno CA125 de tumor de ovario y no reacciona con PSA. Además, el análisis FACS verificó que el anticuerpo B43.13 no se une en la superficie celular de Line-1-PSA o P81 5-PSA.

Se subdividieron los ratones en tres grupos de cinco ratones cada uno. El primer grupo de ratones se inmunizó con anticuerpo anti-PSA conjugado con KLH. El segundo grupo de ratones se inmunizó con el anticuerpo B43.13 control conjugado con KLH. El tercer grupo de ratones recibió inyección de PBS. Las inyecciones se realizaron i.p. en intervalos de 10 días con adyuvante completo de Freund para la primera inyección y adyuvante incompleto de Freund para la segunda inyección.

Ab2 es un antígeno sustituto capaz de imitar el epítopo de PSA reconocido por el anticuerpo anti-PSA inyectado. Se estableció un ensayo de inhibición competitiva para medir el nivel sérico de Ab2. Este ensayo se realizó 5 días después de la segunda inyección. Se observó una inhibición después de la incubación en presencia de suero de ratón de ratones inmunizados con anticuerpo anti-PSA, pero no cuando se usó suero de ratones inmunizados con anticuerpo control o PBS. Estos resultados indican que la inmunización de ratones Balb/c y ratones DBA con anticuerpo anti-PSA puede inducir la formación de anticuerpos antiidiotípicos (Ab2) capaces de imitar a PSA.

Ejemplo 9 Efecto de inmunización anti-PSA en el desarrollo del tumor

Se usaron ratones Balb/c para determinar si la inmunización con anticuerpos anti-PSA puede proteger a los animales contra un posterior tumor provocado. Se dividieron ratones Balb/c en tres grupos de cinco ratones cada uno. El primer grupo se inmunizó con anticuerpo anti-PSA RLSD09 conjugado con KLH, el segundo grupo se inmunizó con anticuerpo B43 conjugado con KLH, el tercer grupo recibió inyecciones de PBS. Se administraron un total de 4 inyecciones a cada grupo usando 50 \mug de anticuerpos para cada inyección. Las células tumorales Line-1-PSA se inyectaron por vía intravenosa entre la tercera y la cuarta inyección. Diecinueve días después de la inoculación del tumor, se sacrificaron los ratones, se determinaron el número de focos de tumor en los pulmones y los niveles de Ab3 en el suero.

La masa tumoral en el grupo de ratones inmunizados con MAb anti-PSA fue considerablemente menor comparada con el grupo de ratones inmunizados con anticuerpo control. De particular interés es la demostración, en el grupo de ratones inmunizados con MAb anti-PSA, de una correlación negativa entre los niveles de Ab3 y el número de focos tumorales en los pulmones.

Ejemplo 10 Composición antiinflamatoria

Para ensayar la eficacia de una composición que contiene un agente de unión en el tratamiento de inflamación se llevó a cabo un experimento con doble enmascaramiento en 18 ratas Sprague Dawley (con un peso aproximado de 450 g) divididas en 3 grupos (8 ratas en cada grupo).

El primer grupo se vacunó con anticuerpo IgM conjugado con KLH específico para un ligando hidrato de carbono en leucocitos (250 \mug/rata, i.p.). El segundo grupo se vacunó con anticuerpo IgM conjugado con KLH sin unión al mismo ligando (250 \mug/rata, i.p.). El tercer grupo fue un grupo control y no recibió vacunación.

La inflamación se indujo por inyección de carragenano al 1% en NaCl al 0,9% (tipo IV), en la pata derecha de la rata (0,5 ml/rata). La observación del edema en la pata fue por medida de desplazamiento de agua y con calibre.

El efecto inhibidor de anticuerpo Alt-4 sobre la inflamación fue clínicamente diferente del grupo control y del grupo con anticuerpo IgM control (Figura 11).

Ejemplo 11 La fotoactivación aumenta la inmunogenicidad

Se usaron ratas Sprague-Dawley sanas normales. Los animales se agruparon al azar (4 por grupo) recibiendo cuatro dosis diferentes (5 \mug, 10 \mug, 25 \mug y 50 \mug) de MAB43.13. Se extrajeron muestras de sangre antes de iniciarse el programa de inyecciones. Cada rata recibió la dosis apropiada de MAb diluida en solución salina tamponada con fosfato 0,01 M intravenosamente. Un segundo grupo recibió 20 \mug de cada preparación de MA con o sin Adyuvante Incompleto de Freund (IFA). Se tomaron muestras de. sangre justo antes de la inyección de la dosis a 0, 21, 42, 63 y 77 días.

MAb-B43.13 es un IgG murino reactivo con CA125. Las preparaciones de anticuerpos consistían en MAb-B43.13 en forma nativa o en forma expuesta a UV (por ejemplo, fotoactivado). El MAb nativo se diluyó desde una concentración madre de 5 mg/ml con solución salina tamponada con fosfato 0,01M hasta dosis de 5, 10, 25 y 50 \mug/100 \mul. El MAb expuesto a UV se reconstituyó a partir de la forma liofilizada con solución salina tamponada con fosfato 0,01M (2,2 mg/0,47 ml) y se diluyó para obtener las mismas dosis que para el MAb nativo.

Se desarrolló un ensayo para medir la respuesta de anticuerpos antiratón de rata en el suero de los animales inyectados. Se midieron anticuerpos anti-ratón de rata antiisotípicos usando una placa ELISA revestida con un anticuerpo control del mismo isotipo, MOPC21. Las muestras se diluyeron 1/100, se dejaron reaccionar con el anticuerpo revestido, se lavaron y se detectó el anticuerpo unido usando IgG antirata de cabra conjugado con peroxidasa (H + L) con ABST como sustrato. Los valores desconocidos se sacaron de una curva patrón generada usando anticuerpo antiratón de rata comercial.

Los resultados del análisis antiratón de rata (RTAMA) de suero de los diversos grupos de ratas a las que se inyectó MAb-B43.13 nativo y expuesto a UV se muestran en las Tablas 8 y 9. La respuesta inmunológica a las preparaciones se expresa en términos del número de animales que responden en cada grupo, con el valor de discriminación numérico definido en las tablas. Este valor (media de todas las muestras antes de la inyección (blancos) + 3DE) garantiza que se mide una respuesta positiva verdadera y que es improbable que los resultados sean debidos a una variación en el ensayo. La tabulación de los animales que responden es probablemente más significativa dado que la fluctuación de la magnitud de respuesta puede ser muy grande y, por tanto, ocultar la interpretación.

TABLA 8 Respuesta de los animales* a inyección intravenosa de preparaciones de MAb-B43.13 nativo y expuesto a UV

9

100

Los datos tienden a confirmar que la respuesta a MAb-B43.13 expuesto a UV se produce antes (después tan solo de una inyección) como se muestra por el mayor número de animales que responden en todos los niveles de dosis en los grupos del día 21.

Por otro lado, en todos los períodos de tiempo restantes (y después de varias inyecciones), la respuesta proporcional de cada grupo al que se administró MAb-B43.13 expuesto a UV intravenoso es mayor. Se puede sugerir que la respuesta es más sostenida en el tiempo para MAb-B43.13 expuesto a UV puesto que el MAb-B43.13 nativo parece mostrar una tasa de respuesta reducida entre el día 23 y el día 77. Los valores reales de la mayor respuesta en el día 77 se muestran en la Tabla 8.

TABLA 9 Inducción total y de AB_{2} en ratas a las que se inyectó Mab-B43.13 nativo o expuesto a UV

10

Ejemplo 12 Modificación de proteínas como resultado de la exposición a UV

Las especies químicas finales presentes después de la fotoactivación son específicas para un conjunto dado de condiciones de exposición y la composición de la solución de la matriz (como se ha descrito antes). Para polipéptidos sencillos que contienen cualquiera de los tres aminoácidos primarios que absorben radiación UV (UV-B) (cisteína, triptófano, tirosina), las consecuencias de la exposición a UV pueden conducir a ruptura del enlace amida, ruptura de enlaces disulfuro, alteración de aminoácidos absorbentes y alteración de aminoácidos adyacentes o muy próximos. Estos cambios se llevan a cabo por fotoionización directa o fotoexcitación directa e indirectamente por formación de radicales a partir de otros constituyentes. La naturaleza y grado de estas modificaciones depende en gran medida de las reactividades químicas de las especies generadas y otras tendencias reactivas de los constituyentes o capacidades de estabilización/inactivación. Para este tamaño de molécula, ninguna alteración tiene como resultado generalmente cambios drásticos en la función biológica.

Estas mismas reacciones pueden tener lugar en proteínas mayores, sin embargo elementos de la estructura secundaria y terciaria presentan diferentes sustratos para la exposición a UV a pesar de tener secuencias de aminoácidos similares. Por tanto, la naturaleza hidrófoba/hidrófila y los aminoácidos próximos de secuencias de cadena distantes como resultado del plegado alteran el microentorno y, por tanto, influyen en el grado y naturaleza de la modificación, además de otros aspectos constituyentes explicados antes. Dado el predominio del perfil de absorción de triptófano en este ancho de banda de UV, se cree que es el sitio primario del proceso inicial de fotoactivación, pero la acción directa sobre cisteína y tirosina también es viable.

La modificación indirecta de aminoácidos, particularmente de las cisteínas, puede tener lugar cuando los electrones se activan en los sitios de absorción primaria de luz UV, tales como los residuos de triptófano. Tales electrones activados pueden transferir su energía a otros aminoácidos y posteriormente cambiar sus propiedades. Los principales cambios observados para proteínas mayores se centran en cambios químicos/bioquímicos medibles tales como determinación de absorción y fluorescencia de aminoácidos aromáticos que se relacionan con modificaciones globales. Se pueden detectar alteraciones en aminoácidos individuales en este grupo de proteínas en las que se puede determinar el contenido en sulfhidrilo como evidencia de la ruptura de disulfuro de la cisteína y/o en la que está implicada un aminoácido crítico para la función. Para proteínas más pequeñas se puede realizar una hidrólisis y cuantificación completa de aminoácidos. El principal aspecto para proteínas mayores funcionales, tales como enzimas, receptores o anticuerpos, por tanto no es la modificación de aminoácidos específicos sino las consecuencias de cualquier cambio sobre su función biológica y se han descrito invariablemente como pérdida de función enzimática, de reconocimiento del receptor o de unión al antígeno.

Ejemplo 13 El complejo anticuerpo/antígeno B43-13 expuesto a UV /CA125 produce mejor respuesta inmune celular específica de CA125 y mejor respuesta humoral

Se observó mejor respuesta inmune celular cuando el anticuerpo expuesto a UV se presentaba asociado con el antígeno de las células T. Así, se estimularon macrófagos aislados de cavidades peritoneales de ratón con B43.13 nativo o B43.13 expuesto a UV asociado con CA125 y se presentaron a linfocitos T de ratón específicos de CA125 aislados de un ratón al que se inyectó CA125. Los experimentos control incluyeron estimulación de los macrófagos sin el antígeno. Cuando se siguió la proliferación de linfocitos T controlados por recaptación de [^{3}H]-timidina se observó un índice de estimulación óptimo en macrófagos estimulados con complejo de B43.13 expuesto a UV-CA125. Los resultados se resumen en la Tabla 10 siguiente.

TABLA 10

11

Ejemplo 14 Condiciones de exposición a UV para estudios de inmunogenicidad mejorada

Una disposición experimental típica comprende una unidad de fotorreactor de ocho lámparas (típicamente espectro de 200 a 400 nm, 90% a 300 \pm 20 nm; 3-9 vatios/lámpara) dispuestas concéntricamente alrededor de un cilindro de aproximadamente 15 cm de diámetro con la electrónica apropiada asociada, apantallamiento, etc. En esta unidad de fotorreactor (RMR-600, Southern New England Ultraviolet Company), las muestras que se van a exponer se disponen en varias configuraciones: (1) como viales/tubos individuales de 1,5 ml (vidrio de borosilicato o cuarzo) situados en un carrusel de ocho unidades (aproximadamente 5 cm de diámetro) que se hace girar en la cámara a 1-5 rpm durante 0-180 minutos (de forma típica 30 minutos); (2) como 2 viales/tubos individuales (como antes) colocados en el centro de la fuente de exposición y expuestos durante intervalos de tiempo similares; o (3) como un serpentín de vidrio (como antes) (diámetro externo de aproximadamente 3 mm) que permite que la solución diana fluya a través de la unidad de fotorreactor durante varios intervalos de tiempo de aproximadamente 0-180 minutos, pero típicamente de 10-20 minutos. Esta última configuración permite exponer volúmenes considerables de solución diana de forma continua con fines de fabricación a gran escala.

En cualquiera de estas condiciones de exposición, se pueden exponer para determinar sus efectos sobre la inmunogenicidad de la proteína diana soluciones de proteína diana a 0,5-10 mg/ml (de forma típica 5 mg/ml) en una diversidad de soluciones tampón de baja molaridad benigna esperada (típicamente fosfato, pirofosfato o tartrato, pH 5,0-10).

Ejemplo 15

Se diseñaron tres derivados de scFv con extensiones adicionales en el extremo C-terminal y tuftsina humana (pDL-6 y pDL-11) o una secuencia control (pDL-10). Para construir los plásmidos pDL-6, pDL-10 y pDL-11, se usaron oligodesoxirribonucleótidos

(5'-GAATTCTGGAGGTGGTACCCAGCCTAGGTAGC-3',

5'-GAATTCAGCTGGAGGTGGTGGATGTGC-3', y

5'-GAATTCTGGAGGTGGTACCAAGCCTAGGTAGC-3 ')

que codifican las secuencias de aminoácidos N-SerGlyGlyGlyThrGlnProArg-C, N-SerAlaGlyGlyGlyGlyCysAla-C y N-SerGlyGlyGlyThrLysProArg-C, insertando fragmentos en sitios de EcoRi y EagI de pPIC-B43. Los DNA plásmidos se transformaron en células GS115 competentes por electroporación y se seleccionaron los transformantes resultantes en medio deficiente en histidina. Se aislaron todos los clones positivos, se cultivaron en medio de inducción y se analizaron para determinar la expresión de proteínas en SD S-PAGE, seguido por tinción en Commassie. Las proteínas scFv-tuftsina se produjeron en medio mínimo para simplificar el proceso de purificación de proteínas cadena abajo.

Con el fin de evaluar la respuesta antiidiotípica, se inmunizaron ratones BALB/c de seis a ocho semanas con scFv-tuftsina 50 \mug subcutáneamente (día 0). Dos semanas después, los ratones recibieron 25 \mug de scFv-tuftsina intraperitonealmente. El suero de los ratones se recogió el día 7, 14 y 21.

La producción de anticuerpo antiidiotípico se detectó por ensayo de inmunoabsorbente con enzimas ligadas (ELISA). Brevemente, se revistió con B43.13 quimérico una superficie sólida y luego se bloqueó con BSA al 3%/PBS. El B43.13 quimérico se incubó con muestras de suero durante 1 hora y luego se incubó con H+L-HRPO anti-ratón de cabra durante otra hora, seguido por tres lavados con Tween 20/PBS. Se desarrolló una reacción de color añadiendo 50 \mul de solución sustrato. Se leyó la absorbancia a 405 nm. Se aplicó el mismo procedimiento para detectar la producción de anticuerpo anti-antiidiotípico (Ab3), salvo que se revistió CA125 sobre una placa ELISA al principio.

Los datos muestran que es posible detectar Ab2 y Ab3 en las muestras de suero y esto indica que scFv-tuftsina retiene la inmunogenicidad idiotípica que podría desencadenar una respuesta inmune humoral en ratones. Los autores han encontrado que los ratones inmunizados con scFv-tuftsina comenzaron a mostrar una fuerte producción de anticuerpo antiidiotípico (Ab2) después del día 20 después de la primera inmunización. No obstante, la producción de anticuerpo anti-antiidiotípico (Ab3) apareció antes, llegando al máximo aproximadamente el día 15. Esto indica que la inducción de una respuesta de la red idiotípica podría ser una parte importante del mecanismo efector en terapia basada en MAb.

Ejemplo 16 Construcción y caracterización de anticuerpo de cadena simple

Se amplificaron por PCR las secuencias del dominio variable de MAb B43.13 usando cebadores específicos de la secuencia y se modificaron genéticamente en un vector de clonación con orientación scFv del V1-engarce-Vh. El fragmento de DNA que codifica scFv se subclonó entonces en el vector P. pastoris, pPIC-9 con señales de secreción aF, dando lugar al plásmido recombinante pPIC-B43.13. Se diseñó un derivado de pPIC-B43.13 con extensiones adicionales en el C-terminal que contenía una cisteína (pDL10) formando un puente disulfuro. Por tanto, la actividad de unión del antígeno se puede mejorar aumentando la avidez. Para construir plásmidos pDLIO se usaron oligodesoxirribonucleótidos de DNA (5'-GAATTCAGCTGGAGGTGGTGGATGTGC-3') que codifican las secuencias de aminoácidos N-SerAlaGlyGlyGlyGlyCysAla-C insertando fragmentos en sitios EcoRI y EagI de pPIC-B43.13.

El DNA plásmido se transformó en células GS115 competentes por electroporación y los transformantes resultantes se seleccionaron en medio deficiente en histidina. Después de rastrear para la integración en el loci correcto, (es decir, las colonias pueden crecer en una placa -his/+glicerol pero crecen lentamente en una placa -his/+metanol), se aislaron todos los clones positivos obtenidos, se cultivaron en medio de inducción y se analizaron para determinar la expresión de proteínas en SDS-PAGE seguido de tinción en Coomassie, como se ha descrito antes (Luo et al., 1997). Se sometieron a diálisis las muestras de proteínas contra PBS y se concentraron usando un filtro Centricon® 10 (Amicon, Danvers, MA).

La pureza de scFv-pDL10 se analizó en condiciones reductoras. Se determinó la especificidad de unión a CA125 usando un ELISA en el que se revistieron placas de pocillos de microvaloración con CA125, CA 15.3 (un antígeno de cáncer de mama humano) o CA 19.9 un antígeno de cáncer de colon humano). El anticuerpo de cadena sencilla unido se detectó por H y L antiratón de cabra marcada con peroxidasa (Southern Bio. Associ.). Durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados, se añadieron 50 \mul de solución sustrato de ABTS. La absorbancia se midió a 405 nm.

Se prepararon microesferas de poli(ácido láctico-coglicólico) que contenía Fv de cadena sencilla por una técnica de doble emulsión con algunas modificaciones (Uchida et al., 1994). Se usó scFv-pDL10 marcado con Na^{125}I como trazador para determinar la eficacia de la carga. De forma resumida, se mezcló scFv-pDL10 (1,5 mg) y Na^{125}I-scFv-pDL10 (0,4 \mug) en PBS con 500 \mul de cloroformo que contenía 100 mg de PLGA 50/50 (Lactel). La mezcla se sometió a ultrasonidos durante 15 s usando un sonicador homogeneizador (Heat System, New York). La emulsión resultante se añadió a 2 ml de poli(alcohol vinílico) al 9% (PVA, Aldrich, USA). Se continuó la emulsificación con ultrasonidos durante 1 minuto. La emulsión se traspasó a 9 ml de PVA al 9% y se agitó durante 2 horas para evaporar el cloroformo. Se recuperaron las microesferas por centrifugación (15 min, 15000 rpm) y se lavaron con agua destilada y liofilizaron durante al menos 24 horas.

Se usaron ratones hembra BALB/c de 6-8 semanas en todos los experimentos in vivo. Los grupos de inmunización incluían cinco grupos: 1) inmunizados con microesferas de PLGA, 2) inmunizados con scFv-pDL10, 3) inmunizados con scFv-pDL10 formulado en microesferas de PLGA, y otros dos grupos inmunizados con la mezcla de scFv-pDLIO formulado y GM-CSF o TNF-\alpha. Después de recoger las muestras de suero preinmune, los grupos de 4 ratones recibieron dos inmunizaciones subcutáneas el día 0 y el día 14, seguidas de dos inmunizaciones intraperitoneales el día 21 y el día 28. La dosis de inmunización fue de 10 mg de las microesferas para s.c. y de 5 mg para i.p.. Para los otros grupos que no recibieron microesferas, la dosis de scFv-pDL10 fue igual a la cantidad formulada. Las citoquinas se adquirieron de R & D Systems (USA) y se administraron a los ratones en una dosis de 0,1 \mug por día. Se obtuvieron muestras de sangre de la vena de la cola periódicamente en tubos Microtainer (Becton Dickinson, USA) y se congelaron a -80ºC hasta el ensayo.

Ejemplo 17 Dosis

Los expertos en la técnica reconocerán que la dosificación administrada puede variar ampliamente en base a una amplia gama de circunstancias diferentes. A continuación se proporciona una guía de dosificación preliminar.

El análisis retrospectivo de más de 100 pacientes a los que se ha inyectado hasta diez veces una dosis de 2 mg de MAb-B43.13 indicó que algunos de los pacientes experimentaron: a) un curso inusual de su enfermedad, caracterizado por tiempos de supervivencia inesperadamente largos; y b) ausencia de reacción adversa significativa o toxicidad.

Se llevaron a cabo estudios inmunológicos para comprender y evaluar el mecanismo in vivo de acción de MAb-B43.13. Estos estudios indicaron que el grado de inducción antiidiotípica en pacientes a los que se inyectó una dosis de 2 mg de MAb-B43.13 no estaba relacionado con el número de inyecciones o con el estadio clínico de su enfermedad. No obstante, la inducción antiidiotípica depende de los niveles de CA125 circulante presente en el suero del paciente. Otros experimentos demostraron que la inyección de MAb-B43.13 en pacientes con CA125 sérico medible conduce a la formación de complejos antígeno-anticuerpo, dando lugar a la presentación al epítopo del antígeno y a respuesta humoral y celular específica del antígeno frente al tumor.

Estos estudios indican que una dosis eficaz requiere solo anticuerpo suficiente para liberar de forma óptima y presentar todo el antígeno CA125 circulante posible al sistema inmune. Estudios in vitro indicaron que 1 ng de MAb-B43.13 puede unirse a 10 unidades de CA125. Suponiendo 40 ml de plasma por kg de peso corporal, la inyección de 2 mg de MAb-B43.13 en un paciente de 60 kg puede unir aproximadamente 8333 U/ml de CA125 en suero. Puesto que todos los pacientes con cáncer de ovario ensayados hasta la fecha han tenido bastante menos de 8333 U/ml de CA125 en su suero, una inyección de 2 mg de MAb-B43.13 es más que suficiente para inducir la respuesta inmune requerida. Los niveles de CA125 se consideraron significativamente elevados cuando la concentración de CA125 está por encima de tres veces el valor de discriminación (por ejemplo, 3 x 35 U/ml, o 105 U/ml). Además, en pacientes que han recibido MAb-B43.13 radiomarcado para la confirmación por inmunocentelleo de la enfermedad, los resultados de la visualización fueron excelentes a pesar del alto nivel sérico de CA125, sugiriendo que existe exceso de MAb-B43.13 para la recaptación específica del tumor.

Por otro lado, parece ser que varias inyecciones en intervalos seleccionados proporcionan beneficios óptimos en pacientes, puesto que CA125 se genera durante todo el curso de la enfermedad.

Finalmente, el análisis retrospectivo mostró que la dosis de 2 mg parece tener eficacia terapéutica; ninguno de los pacientes (>100) ha desarrollado efecto secundario grave o reacciones adversas. Si la respuesta HAMA total es un indicador de inducción antiidiotípica, una dosis de 2 mg genera niveles significativos de anticuerpos antiidiotípicos para producir el beneficio terapéutico deseado. Varias inyecciones de 2 mg de MAb-B43.13 en intervalos seleccionados parecen mantener los anticuerpos antiidiotípicos en el nivel terapéutico deseado sin causar toxicidad inducida por HAMA isotipica alguna.

Por tanto, un intervalo de dosis eficaces de una cantidad terapéuticamente aceptable de MAb-B43.13 incluye, aunque sin quedar limitada a las mismas, una dosis total de aproximadamente 2 mg o inferior.

Ejemplo 18 Terapia inmunofotodinámica

Está disponible un modelo de ratón inmune competente para el sistema MUC-1. Células del transfectante MUC-1 413 BCR forman tumores (subcutáneos o intravenosos) en ratones BALB/c o CB6F1. El modelo animal BALB/c se usó para ensayar HBBA-R2-SL, HBBA-R2 SIL con Alt-1 y un anticuerpo control (HBBA-R2 es un derivado de hiprocrelina B descrito en el documento PCT/US98/00235, incorporada en la presente memoria como referencia; SL = liposoma recubierto de una capa que lo hace invisible al sistema inmune "Stealth"; SIL = inmunoliposoma "Stealth"). El modelo tiene la ventaja de que se puede analizar el efecto espectador del sistema inmune. Se ha descrito que la ayuda del sistema inmune, especialmente de macrófagos, aumenta el sistema inmune para que supere a PDT y según sea necesario para obtener tasas de respuesta completa. Se inyectó a los ratones BABL/c 2-2,5x10^{6} células 413BCR en el costado derecho (s.c.).

Los tumores aparecieron después de 7 a 10 días. Cuando los tumores alcanzaron un diámetro de aproximadamente 5 mm, se inyectaron formulaciones de hipocrelina i.v. a 1 mg/kg. Dos horas después de la inyección de HBBA-R2, se llevó a cabo un tratamiento con luz a 40 J/cm^{2} (>600 nm). Se siguió midiendo el tamaño del tumor en los ratones. Cuando el tamaño del tumor alcanzó 4 veces el volumen previo al tratamiento, se sacrificaron los ratones. Los tumores se siguieron durante 2 meses y se calcularon las curvas de supervivencia, se representaron y compararon con el grupo de tratamiento tratado sólo con luz.

Para las composiciones de inmunoliposoma "Stealth", se usó el anticuerpo Alt-1, que se une a células 413BCR. Los tumores se midieron en días alternos en tres dimensiones. Cuando el tumor alcanzó cuatro veces el volumen del tratamiento previo se sacrificó el ratón. Los ratones tratados solo con luz o solo con fármaco se usaron como control.

Los inmunoliposomas con Alt-1 mostraron una curación completa en presencia de radiación. HBBA-R2-SIL [Alt-1] también mostró una supervivencia mejorada en la oscuridad, comparada con los ratones tratados sólo con luz. Estos resultados sugieren un efecto terapéutico de Alt-1 en este modelo y subrayan la importancia de terapia combinada usando vacuna de PDT y anticuerpos. Para todas las formulaciones ensayadas, los inmunoliposomas específicos del tumor mostraron el mejor efecto terapéutico. Esto también se ve reflejado cuando los volúmenes de tumor se usaron para comparación. La razón de las enormes diferencias entre SL y SIL no se comprenden todavía. Los datos sugieren que los inmunoliposomas podrían causar una respuesta inmune en ratones BALB/c que puede ayudar a destruir el tumor. A partir de los datos de biodistribución conocemos que la recaptación de HBBA-R2 en el tumor es ligeramente superior con SIL al compararla con SL.

Ejemplo 19

El anticuerpo monoclonal Alt-4 es un candidato para el desarrollo de un compuesto contra el cáncer gastrointestinal. MAb-Alt4 se une al antígeno tumoral CA 19.9, un antígeno de Sialilo Lewis^{a} que ahora se reconoce generalmente como uno de los marcadores asociados a tumores más importantes para el cáncer gastrointestinal. Una técnica de quimerización de anticuerpos es construir anticuerpo humano-ratón, que está formado por una región variable de ratón y una región constante humana, usando tecnología de DNA recombinante. La mayoría de los informes demuestran que el anticuerpo quimérico puede retener la misma actividad de unión específica hacia el antígeno que su anticuerpo de ratón original, pero evita la respuesta anticuerpo antiratón humano (HAMA) con aplicaciones in vivo.

Estrategias experimentales

Aislamiento de cDNA de genes-V: Se llevaron acabo experimentos de RT-PCR para aislar genes variables de anticuerpos usando cebadores específicos. Los cDNA se clonaron entonces en el vector de clonación pBluscript para el secuenciamiento de DNA.

Construcción de anticuerpos quiméricos: Se obtuvieron clones quiméricos de PAH-18.4H8PCRII#8 y
PAG-18.4L20PCRII#19 ligando PAG4622-18.4LPCRII y PAH46.6-18.4HPCRII como vectores de expresión y se obtuvieron insertos de PBKS-18.4L20PCRI1#14 y PBKS-18.4HPCRII#19. Los clones quiméricos se usaron para la transfección de células SP2/0. Para obtener el procedimiento más eficaz para cotransfectar estas células se usó DNA del plásmido control pSV-\beta gal para obtener las condiciones óptimas para la transfección en células.

Transfección: Ambos procedimientos de transfección mostraron una buena eficacia de transfección. Lipofectamina causa que algunas células mueran pero la mayoría (80%) de las células que quedan vivas se transfectan. En los procedimientos de electroporación, la eficacia de transfección de células fue mayor y las células que se transfectaron se reprodujeron en colonias que contenían el nuevo plásmido control. Después de establecer las condiciones óptimas para la transfección de células SP2/0 se realizó la cotransfección de células SP2/0 con PAH-18.4 y PAG-18.4.

Procedimiento con lipofectamina: Se usaron 2 \mug de cada DNA plásmido. Se siguió el mismo protocolo que se ha citado antes. 24 horas después de la transfección, se recogieron las células de placas de 6 pocillos y se sembraron en placas de 96 pocillos con una densidad celular de 1,0 X10^{4} células/pocillo.

Después de incubar durante una noche a 37ºC se añadió medio de selección a cada pocillo en una relación 1:1. El medio de selección incluye 1 \mug/\mul de ácido micofenólico e histodinal 5 mM, pH 7,5 que se ajustó usando NaOH. El medio de selección se cambió cada 3 días y las células estuvieron en el medio de selección durante 12 días.

Procedimiento de electroporación: Se usaron 20 \mug de cada DNA plásmido. Para la transfección se usó el mismo procedimiento que se ha citado antes. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos después de la electroporación con una densidad de 1 x 10^{4} células/pocillo. 24 horas después de la transfección se añadió a las células medio de selección. Las células se mantuvieron en medio de selección durante 12 días y se cambió el medio cada 3 días.

Para determinar si la transfección se había producido se usó sobrenadante de células transfectadas para ensayar por ELISA la producción de proteína quimérica deseada. Se usó CA 19.9 para revestir las placas y se bloquearon por BSA al 3%. Para anticuerpos primarios se usó sobrenadante del cultivo tisular y para anticuerpos secundarios se usó (Fab'2) IgG (H +L) antihumano de conejo. El ensayo ELISA dio resultados positivos para la producción de producto deseado.

Ejemplo 20 Verificación experimental de la generación de la respuesta de anticuerpos contra varios epítopos presentes en un antígeno inyectando un anticuerpo contra un único epítopo

Como ejemplo para demostrar la presente invención se usa antígeno canceroso CA125, que se expresa en más del 80% de los cánceres de ovario epiteliales.

CA125 tiene varios epítopos reconocidos por diferentes anticuerpos tales como OC125, MI 1, B43.13, B27.1, entre otros. En la presente invención se usó MAb-B43.13 para generar una respuesta inmune específica de CA125 que incluye reconocimiento del epítopo B27.1.

Procedimiento

Se evaluaron 86 pacientes con cáncer de ovario con enfermedad activa para determinar la presencia de anticuerpos contra CA125. Ninguno de los pacientes tenía anticuerpos contra CA125 antes de la inyección de MAb-B43.13. Se inyectó a los pacientes 2 mg de MAb-B43.13 en diferentes intervalos de tiempo (por ejemplo, véase la Tabla 5 para algunos de los pacientes). Se analizaron los sueros de estos pacientes para determinar la presencia de anticuerpos anti-CA125 humanos por su capacidad para unirse a CA125 [R. Madiyalakan et al., Hybridoma, 14:199-203 (1995)]. Dichos anticuerpos anti-CA125 se clasificaron además por ir contra el epítopo B43.13 o el epítopo B27.1 por su capacidad para inhibir los anticuerpos correspondientes. La justificación de la clasificación viene del hecho de que los anticuerpos anti-CA125 de estos pacientes se habrían generado por cualquiera de las dos vías siguientes:

1) Si los anticuerpos anti-CA125 se generaron de la forma sugerida por la teoría de la red indicada antes, la vía seguiría Ab1 \rightarrow Ab2 \rightarrow Ab3. Siguiendo este esquema, MAb-B43.13 (Ab1) generaría un antiidiotipo contra MAb-B43.13 (Ab2), el cual a su vez generará un anti-antiidiotipo contra MAb-B43.13 (Ab3; o anticuerpo anti-CA125). Por otro lado, los anticuerpos Ab3 generados por esta vía se unirían y son inhibidos solo por MAb-B43.13, debido a que el epítopo B43.13 es el único epítopo presente.

2) Si los anticuerpos anti-CA125 se generaron de una forma sugerida por la presente invención, la vía seguiría Ab1 + antígeno soluble \rightarrow Ab3'. Siguiendo este esquema, MAb-B43.13 (Ab1) se uniría al antígeno sérico CA125, que a su vez generará un anticuerpo anti-CA125 (Ab3'). Además, los anticuerpos Ab3' generados por esta vía se unirían y son inhibidos por anticuerpos B27.1 debido, como se ha indicado antes, a que CA125 es multiepitópico y los epítopos B43.13 y B27.1 son distintos; además, Ab3' no se unirá a anticuerpos anti-MAb-B43.13.

Así, si los sueros de los pacientes contenían anticuerpos anti-CA125 que podían inhibirse únicamente por MAb-B43.12, se clasificaban por contener Ab3; los que podían inhibirse por MAb-B27.1 se clasificaban como Ab3'.

Resultados

Catorce pacientes desarrollaron anticuerpos anti-CA125 en sus sueros (Tabla 1) como respuesta a la inyección de MAb-B43.13. De estos 14 pacientes, 10 tuvieron Ab3' mientras que solo dos pacientes tuvieron anticuerpos Ab3 en su suero. Dos pacientes tuvieron también ambos anticuerpos. La presencia de Ab3 en sus suerostambién se confirmó por la capacidad de estos anticuerpos para unirse al anticuerpo anti-MAb-B43.13 de conejo purificado. Hubo dos pacientes (nº 2 y nº 7) que tuvieron anticuerpos anti-CA125 pero no podían inhibirse por MAb-B43.13 o MAb-B27.1, sugiriendo por tanto que éstos podían tener anticuerpos contra CA125, que reconocían epítopos distintos a B43.13 o B27.1.

Estos resultados indican claramente que cuando se inyectó un anticuerpo contra un único epítopo (B43.13) a un paciente, se genera una respuesta de anticuerpos contra el antígeno completo que reconoce diferentes epítopos presentes en el antígeno. La presencia de Ab3 en algunos pacientes se podía explicar por la posible presencia de exceso de epítopo B43.13 en el CA125 debido a una unión insuficiente del anticuerpo a dicho epítopo o inducción idiotípica por la Vía I. No obstante, el mecanismo predominante de la respuesta parece ser por la Vía II. En otras palabras, la inyección de un anticuerpo monoclonal frente a un antígeno multiepitópico soluble en un paciente que tiene un sistema inmune que funciona genera un anticuerpo frente al antígeno, en el que el anticuerpo generado es inhibido por anticuerpos frente a diferentes epítopos.

Ejemplo 21

En estudios farmacéuticos, se analizaron muestras de sangre para determinar los niveles de CA125 antes y a intervalos seleccionados después de la inyección de MAb-B43.13. En pacientes con niveles de CA125 elevados antes de la inyección, se pudo apreciar una caída significativa de los niveles circulantes de CA125 inmediatamente después de la inyección de MAb-B43.13 (Tabla 11). Esto demuestra claramente que el agente de unión, tras la introducción en el cuerpo, interacciona y elimina el CA125 circulante.

TABLA 11 Eliminación de CA125 después de la inyección de MAb-B43.13 Nº de paciente (Los niveles de CA125 se dan en U/ml)

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Por otro lado, el antígeno complejado con anticuerpo se presenta de forma eficaz al sistema inmune y genera una mejor respuesta humoral y celular específica del antígeno. Esto se demostró por los siguientes experimentos mostrados en los Ejemplos 22 y 23.

Ejemplo 22

Se inmunizaron ratones Balb/c con 10 \mug de MAb-B43.13 en PBS, i.v.; 10.000 unidades de CA125 en PBS, i.v.; o 10 \mug de MAb-B43.13 y 10.000 unidades de CA125 en PBS, i.v., cada tres semanas para un total de 3 inyecciones. La relación en la inyección de B43.13/CA125 fue similar a la observada en pacientes con niveles elevados de CA125 como se determina en base a los datos farmacocinéticos dados en la Tabla 10. Cuando se analizó el suero de un ratón para determinar los niveles de anticuerpo anti-CA125, el ratón al que se inyectó el complejo antígeno-anticuerpo tenía un título más alto. Esto respalda la observación de que la interacción agente de unión - antígeno conduce a una mejor respuesta inmune humoral específica del antígeno comparada con el agente de unión y el antígeno solos.

Ejemplo 23

Igualmente, se observó una mejor respuesta inmune celular cuando el agente de unión se presentó asociado con el antígeno a las células T. Así, se estimularon macrófagos aislados de cavidades peritoneales de ratón con MAb-B43.13 solo; CA125 solo, un complejo MAb-B43.13-CA125; o MAb-CA125 control y se presentaron a linfocitos T de ratón específicos para CA125 (aisladas de ratones a los que se inyectó CA125). Cuando se evaluó la proliferación de linfocitos T controlada por recaptación de [^{3}H]-timidina, se observó un índice de estimulación óptimo en macrófagos estimulados con complejo anticuerpo-antígeno (Figura 4).

Ejemplo 24

Se confirmó posteriormente en estudios en conejos la función del antígeno sérico en la inducción de una respuesta de anticuerpos multiepitópicos como consecuencia de una inyección de anticuerpos. Conejos que no contenían CA125 en suero, cuando se les inyecta MAb B43.13, produjeron anticuerpos anti-CA125 que no podían inhibirse por B27.1. Por el contrario, pacientes con cáncer de ovario con altos niveles de antígeno CA125 en suero producen anticuerpos anti-CA125 que pueden inhibirse por B27.1 como respuesta a inyección de MAb-B43.13.

Ejemplo 25 Verificación experimental de la inducción de respuesta antitumoral específica del antígeno por inyección de anticuerpo

Los anticuerpos anti-CA125 humanos causan Tisis de células tumorales a través de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos ("ADCC"). Aunque MAb-B43.13 inyectado no causa por sí mismo una ADCC y/o tisis mediada por citolisis dependiente del complemento ("DCD") de células de tumor de ovario, la generación de anticuerpos anti-CA125 en pacientes a los que se inyectó MAb-B43.13, conduce a tisis de células tumorales (datos no mostrados). Esto se estudió en un ensayo de liberación de ^{51}Cromo incubando las células de tumor de ovario marcadas con células efectoras, y suero de seis pacientes a los que se inyectó MAb-B43.13. Esto apoya la conclusión de que la inyección de un agente de unión conduce a su interacción con el antígeno, dando lugar a una respuesta humoral específica en anticuerpos anti-CA125 que causan tisis en células tumorales a través de ADCC. Los resultados demuestran claramente la generación de respuesta antitumoral específica del antígeno después de la inyección del anticuerpo.

Ejemplo 26

Destruir un tumor bien mediante un mecanismo ADCC mediado por anticuerpo anti-CA125 o a través de CTL específicos de CA125, conduce a un aumento en la supervivencia en pacientes a los que se inyectó MAb-B43.13. Aunque se ha sugerido que altos niveles de CA125 en suero es un mal indicador del pronóstico, parecen tener un efecto beneficioso en combinación con la inyección de anticuerpo anti-CA125 en dichos pacientes. Por ejemplo, cuando los niveles de CA125 fueron mayores que 100 unidades/ml, la respuesta inmune contra CA125 aumentó en más de un 20%, lo que a su vez aumenta la supervivencia media en los pacientes desde 39,1 meses a 54,5 meses (Tabla 12). Así, la inyección de un agente de unión a un paciente que contiene niveles elevados de antígeno soluble multiepitópico conduce respuesta humoral y celular específica del antígeno, lo cual conduce a su vez a la destrucción del tumor mediante una supervivencia mejorada.

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TABLA 12 Correlación entre niveles de CA125 en suero, la respuesta (Ab_{I}') anti-CA125 humano y la supervivencia en pacientes a los que se inyectó MAb-B43.13

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Ejemplo 27

Se inyectó en un paciente con cáncer de páncreas con enfermedad metastásica de forma repetida una composición que incluía anticuerpo anti-CA 19.9. El paciente no recibió otro tratamiento y sobrevivió 22 meses después del diagnóstico original (19 meses después de la cirugía y la inyección). Esto se compara con el período estimado de supervivencia habitual de seis meses después del diagnóstico inicial.

Aunque se ha descrito la presente invención con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo, se interpretará que la invención es susceptible a diversas modificaciones y formas alternativas, y no queda limitada a realizaciones específicas descritas. Se comprenderá que estas realizaciones específicas no pretenden limitar la invención y la intención es cubrir todas las modificaciones, equivalentes y alternativas que entran dentro del espíritu y alcance de la invención.

Ejemplo 28 Gestión del período de espera y observación después del tratamiento primario

También se han valorado los efectos del anticuerpo monoclonal murino B43.13 (comercializado como OvaRex®) en prolongar el tiempo hasta la recurrencia de la enfermedad y la supervivencia durante el período de espera y observación después del tratamiento inicial con cirugía y/o quimioterapia. Se espera la recurrencia del cáncer de ovario después del tratamiento primario con éxito sea de aproximadamente 12 meses (tiempo mediano). El programa de desarrollo clínico con OvaRex® para valorar el tratamiento de pacientes que comienzan a completar el tratamiento de quimioterapia a base de platino primario incluye dos estudios aleatorizados en curso que implican 444 pacientes previstos.

El primer estudio, un ensayo controlado con placebo con doble enmascaramiento que evalúa el tiempo hasta la recurrencia de la enfermedad, la seguridad, supervivencia y calidad de vida relacionada con la salud después del tratamiento con éxito previo para la enfermedad en fase III/IV, incluye un total de 345 pacientes, todos los cuales tienen niveles de CA125 menores que 35 unidades/ml. El análisis provisional de los datos de 252 pacientes que han recibido OvaRex® muestra que más del 50% de pacientes responden al tratamiento y corroboran los datos previos que demuestran el perfil de seguridad benigno del fármaco. Resulta interesante que los niveles de CA125 mayores que 5 unidades/ml se asocian a un riesgo significativo de recurrencia prematura. En base a una valoración independiente de los datos preliminares, el tratamiento activo con OvaRex® parece reducir el riesgo coherente con una comprensión del mecanismo del tratamiento. Se ha observado una respuesta clínica más fuerte a OvaRex® entre pacientes que despliegan respuesta inmunes específicas al fármaco. Por ejemplo, en un grupo de datos provisional, el tiempo mediano hasta la recurrencia es de 18,9 meses entre pacientes con niveles de Ab_{2} de al menos 100 unidades, comparados con 7,4 meses entre pacientes con niveles de Ab_{2} menores que 100 unidades. Resulta de interés observar que se inducen respuestas inmunes clínicamente significativas en la cara del antígeno tumoral circulante reducida al finalizar la quimioterapia primaria en este programa, pero que el modelo de respuesta inmune es consistente con la observada en estudios en enfermedad avanzada. Estos resultados sugieren que CA125 no necesita estar en circulación a niveles especialmente altos para que OvaRex® efectúe una respuesta inmune clínicamente beneficiosa, no obstante, pueden ser preferibles en la dosificación inicial niveles de al menos 5 unidades/ml.

Para valorar adicionalmente la relación entre el número de dosis, el programa de dosificación y la respuesta inmune inducida, se incluyeron pacientes con niveles de CA125 menores que 35 unidades/ml que siguieron un tratamiento primario con éxito para la enfermedad en fase III/IV en un estudio aleatorizado de 102 pacientes. El protocolo valorará cómo influye el número de dosis en la respuesta inmune y correlacionará tanto el número de dosis como parámetros de la respuesta inmune, incluyendo HAMA, Ab_{2}, anti-CA125 e inmunidad por linfocitos T con los resultados clínicos.

Los datos obtenidos hasta la fecha con respecto a los efectos de OvaRex® administrado para el cáncer de ovario recurrente o durante la fase de espera y observación de la enfermedad después de cirugía y/o quimioterapia muestran que OvaRex® prolonga la supervivencia y aumenta el tiempo hasta la recurrencia en pacientes con cáncer de ovario. Estos beneficios clínicos se asocian de forma reproducible con la inducción de respuestas de linfocitos T específicos del tumor (demostrado claramente en estudios de enfermedad recurrente en preparación) y la producción de marcadores humorales convencionales tales como HAMA y Ab_{2} (Noujaim et al., en prensa). Usado para tratar más de 500 pacientes hasta ahora, OvaRex® ha demostrado tener un perfil de seguridad benigno, en particular en el contexto de las quimioterapias usadas en la actualidad.

CA125, el marcador del cáncer de ovario al que se une OvaRex®, está presente en el 97% de los pacientes con cáncer de ovario avanzado pero también se encuentra en otros tipos de cáncer. Por tanto, CA125 puede ser médicamente relevante para varios tipos de tumores.

Claims (17)

1. Uso de un anticuerpo xenotípico o un fragmento suyo que se une al antígeno, específico para un antígeno CA125, para fabricar un medicamento para tratar el cáncer en un paciente que se ha identificado que tiene niveles detectables de antígeno CA125 en suero iguales o inferiores a 35 unidades/ml.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que el paciente es un paciente con cáncer de ovario.

3. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el nivel de antígeno CA125 es de 5 unidades/ml a 35 unidades/ml.

4. El uso según la reivindicación 3, en el que el nivel de antígeno CA125 es de 9,5 unidades/ml a 35 unidades/ml.

5. El uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el anticuerpo es un anticuerpo murino.

6. El uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

7. El uso según la reivindicación 6, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal murino B43.13

8. El uso según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho paciente ha tenido un tratamiento inicial con quimioterapia y/o cirugía.

9. Una composición terapéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento suyo que se une al antígeno, específico para el antígeno CA125, para su uso en el tratamiento de un paciente de cáncer que tiene niveles detectables de CA125 en suero iguales o inferiores a 35 unidades/ml.

10. La composición terapéutica de la reivindicación 9, en la que anticuerpo o un fragmento suyo que se une al antígeno excluye el B43.13.

11. La composición terapéutica de las reivindicaciones 9 ó 10, en la que el anticuerpo o un fragmento suyo que se une al antígeno es un anticuerpo xenotípico o un fragmento suyo que se une al antígeno específico para el antígeno CA125.

12. La composición terapéutica de las reivindicaciones 9-11, en la que el paciente de cáncer es un paciente de cáncer de ovario.

13. La composición terapéutica de las reivindicaciones 9-12, en la que el nivel de antígeno CA125 es de 5 unidades/ml a 35 unidades/ml.

14. La composición terapéutica de la reivindicación 13, en la que el nivel de antígeno CA125 es de 9,5 unidades/ml a 35 unidades/ml.

15. La composición terapéutica de la reivindicación II, en la que el anticuerpo xenotípico es un anticuerpo murino.

16. La composición terapéutica de la reivindicación 11, en la que el anticuerpo xenotípico es un anticuerpo monoclonal murino B43.13.

17. La composición terapéutica de las reivindicaciones 9-16, en la que dicho anticuerpo o un fragmento suyo que se une al antígeno, en la composición no está radiomarcado.