KR960014441B1 - 알파 2-3 결합을 인지하는 단일클론성 항체 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

알파 2-3 결합을 인지하는 단일클론성 항체
제1도는 효소-표지 항체 기법에 따라서 측정된 항원 GD3와 GM3에 대한 본 발명의 단일클론성 항체의 특이성을 도시한다.
제2도와 3도는 본 발명의 단일클론성 항체에 대한 각종 강글리오시드의 항원 특이성을 도시한다.
제4도는 본 발명의 단일클론성 항체의 분류화에 사용된 도표를 도시한다.
본 발명은 신규한 하이브리도마, 그의 제조방법 및 그 하이브리도마에 의해 생성된 항-시알산-함유 당지질 단일클론성 항체에 관한 것이다.
지금까지 항혈청은 면역된 동물로부터 취한 혈청을 다양한 항원상에 흡착시킴으로써 제조된다. 그러나, 항혈청은 상이한 B세포로부터 기원된 다수의 항체분자를 함유하고(다중 클론성) 때로 다른 항체와의 교차반응을 유발한다. 그러므로, 우수한 특이성을 가지는 항혈청을 얻는 것은 어렵다.
그런 배경하에서 1975년에 쾰러가 항-양(sheep) 적혈구 항체를 생산하고 면역된 동물로부터 유도된 비장세포를 마우스 골수종 세포와 하이브리도마를 생성하기 위해 융합시킴으로써 생성되는 하이브리도마를 개발하였다. 단일세포로부터 기원된 하이브리도마인 클론은 그의 높은 증식력 때문에 그러한 하이브리도마 세포로부터 단리될 수 있다 (소위 클로닝). 그러한 클론된 하이브리도마에 의해 생성된 모든 항체는 동일하며, 항원에 대해 균일한 특이성을 가지므로 특이적 항원의 동일 부위를 인지한다. 더불어, 하이브리도마는 동결상태로, 예컨대 액체 질소중에 보관될 수 있다. 그러므로, 개별 항체의 안정한 공급이 확실하게 될 수 있다. 그러므로, 세포 융합기법에 따라서, 특이적 항원에 대해 고도로 특이적인 단일클론성 항체를 얻는 것이 가능하다.
항체는 거기에 고유한 항원으로서 언급되는 분자 또는 물질을 인지할 수 있으며 항원에 결합될 수 있는 단백질이다. 단일클론성 항체란 특이적 항원을 특이적으로 인지하는 부위를 가지는 항체를 의미하여, 다시말하면 그것은 단지 하나의 항원 결정기를 인지한다. 오늘날, 단일클론성 항체를 제조하는 각종 기법 및 그것을 생산할 수 있는 하이브리도마를 제조하는 각종 기법이 기술분야에 잘 공지되어 있다. 이 견지에서 존 지, 허렐에 의해 1983년에 편집된 최근의 출판물 단일클론성 하이브리도마 항체 : 기법 및 응용이 참고가 될 수있다.
포유류 세포의 당지질은 소위 스핑고당지질의 범주에 속하며 (a) 지방산이 산아미도-결합된 스핑고신이라 불리는 긴 아미노 알코올사슬로 구성되는 세라미드로서 언급되는 지질구조와 (b) 글리코시드 결합을 통해 구조에 결합된, 글루코스, 갈락토스, N-아세틸클루코사민, N-아세틸칼락토사민, 푸코스 및 시알산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 당의 각종 조합을 포함한다. 이들 중에서, 시알산 잔기를 운반하는 당지질이 강글리오시드라 불리운다.
이들 화합물중 대부분은 일반적으로 외세포막에 위치하며 최근의 연구조사로부터 강글리오시드가 인지 및 정보의 수용 및 반응, 수용체기능, 분화, 세포의 증식, 악성 변화, 또는 행동과 같이 기능에서 중요한 역할을하는 것으로 여겨진다.
이들 강글리오시드중에서, GD3강글리오시드가 신경세포의 분화된 항원으로서 알려져 있으며 나아가 사람 흑색종 세포의 암-관련 항원으로서 확인된다.
단일클론성 항체가 특이적 항원에 대해 높은 특이성을 가지기 때문에 그로써 만약 GD3강글리오시드에 특이적인 단일클론성 항체가 얻어진다면 상기 개시된 바와 같이 그것을 고감도로 검출할 수 있으며, 그러한 단일클론성 항체를 세포기능중의 당 사슬의 역할의 설명에 대해서 뿐만 아니라 암의 진단(암의 마커로서) 및 면역학적 치료에 응용하는 것이 기대된다.
따라서, 사람 흑색종 세포의 암관련 항원으로 확인된 GD3강글리오시드상의 특이적인 항원 결정기에 특이적 단일클론성 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 제공하는 것이 본 발명의 기본 목적이다.
본 발명의 다른 목적은 그러한 하이브리도마의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 GD3강글리오시드상의 특이적 항원 결정기에 대해 특이성을 나타내는 단일클론성 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 전술한 결점을 제거하기 위해 다양한 연구를 수행하여 세포융합 기법에서, 정제된 GD3강글리오시드가 소정 단일클론성 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 생성하기 위한 항원으로서 사용되는 것을 발견하였고 그로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 알파 2→3 결합을 가지는 N-아세틸뉴라민산 잔기를 운반하는 시알산-함유당지질에 특이적인 단일클론성 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마가 제공된다. 본 발명의 다른 측면에 따라서, (i) 항원으로서, 알파 2→3 결합을 가지는 N-아세틸뉴라민산 잔기를 운반하는 시알산-함유 당지질로 동물을 면역시킴으로써 얻어진 B세포(B임파구)와 (ii) 골수종 세포를 융합시키는 것을 포함하는, 상기와 같은 단일클론성 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또다른 측면에 따라서, 에피토프로서 알파 2→3 결합을 가지는 N-아세틸뉴라민산 잔기를 운반하는 시알산-함유 당지질에 특이적이며, 전술한 하이브리도마에 의해 생성되는 단일클론성 항체가 또한 제공된다. 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 하이브리도마는 쾰러와 밀스타인의 방법(Nature 1975 참조)에 따라 항원으로 면역된 동물로부터 얻어진 B세포(B임파구)를 융합시킴으로써 생성될 수 있다. 여기에서 사용된 항원은 예를 들어 알파 2→3 결합을 가지는 N-아세틸뉴라민산 잔기를 함유하는 강글리오시드류이고, 알파 2→3 결합을 가지는 N-아세틸뉴라민산 잔기를 함유하는 당지질이 바람직한 강글리오시드이다. 그의 특정 실례는 다음과 같다 :
Figure kpo00001
본 발명의 하이브리도마에 의해 생성되는 단일클론성 항체는 알파 2→3를 가지는 N-아세틸뉴라민산을 에피토프 또는 항원 결정기로서 인지하고 그들과 특이적으로 반응한다. 그러므로, 하이브리도마에 의해 생성된 단일클론성 항체는 알파 2→3 결합을 가지는 N-아세틸뉴라미닐 잔기를 운반하는 시알산 함유 당지질, 특히 GD3와 GM3강글리오시드와의 특히 높은 반응성을 보인다. 더불어, 단일클론성 항체는 그러한 특이성을 공급원 동물의 종류에 무관하게 어떠한 시알산 함유 당지질에 대해서도 똑같이 나타낸다.
항원, 전술한 시알산 함유 당지질로 면역될 동물은 어떤 종류의 동물이라도 좋다. 그의 구체적인 실례로는 토끼, 사람, 마우스 및 쥐를 들 수 있고, 바람직하게는 마우스이며 보다 바람직하게는 Balb/c 마우스이다.
본 발명의 단일클론성 항체를 생산하는 B세포(B임파구)는 비장세포로부터 유도되는 것이 바람직하다. 다른한편으로, 본 발명에 사용된 골수종 세포도 또한 사람, 마우스, 쥐 및 토끼같은 어떠한 동물로부터 유도된것일 수 있고 마우스로부터 유도된 것이 바람직하며 Balb/c 마우스로부터 유도된 골수종 세포(X63-Ag8.653)가 보다 바람직하다. 이들 골수종 세포는 현저히 높은 중식력을 나타내므로 그것을 B세포와 융합시킴으로써 생성된 하이브리도마는 본 발명의 단일클론성 항체를 계속 생산할 수 있다.
본 발명의 하이브리도마는 이하 상세히 설명될 방법에 의해 제조될 수 있다.
무엇보다도 먼저, 마우스를 면역시키기 위하여 GD3강글리오 시드를 복강내, 피하 또는 정맥내, 바람직하게는 정맥내 주사한다. 이 면역감작에서, 불완전 보조제 또는 완전 보조제의 어느 하나가 보조제로서 즉, 면역학적 증강제로서 사용될 수 있으며 그의 구체적인 실례로는 오일, 유화제, 죽은 투베르큘바실러스, 죽은 살모넬라 및 그의 혼합물이 있고, 복강내 또는 피하주사 및 정맥내 주사에 대해서는 죽은 살모넬라 미네소타
Figure kpo00002
가 바람직하다. 이들 항원 및 보조제는 인산 완충식염수 용액과 같은 근사하게 생리적으로 수용가능한 조성을 가지는 용액형태로 사용되는 것이 바람직하다.
이 면역감작에서, 자체-성분으로 면역될 동물을 감작시키는 것이 어렵다는 것이 주지되어야 하며 그로써 기본적으로 항원물질이 얻어지는 것과 표현형 발생적으로 먼 동물을 선택하는 것이 바람직하다. 그러나, 면역감작은 또한 그러한 어려움을 피하기 위하여 시험관내 수행될 수 있다.
그런 다음, B세포와 골수종 세포가 함께 융합된다. 세포융합제로서, 폴리에틸렌글리콜과 HVJ가 사용될 수 있으며, 폴리에틸렌글리콜 6000이 바람직하다. 더불어, 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 채로 남아있는 골수종 세포로부터 쉽게 단리하기 위하여 배양배지로서 HAT 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
그 후, 생성되는 하이브리도마 세포에 대해 소정의 단일 클론된 하이브리도마를 단리하기 위하여 메틸셀룰로스 기법, 연(soft)아가로스기법 또는 제한회석기법 같은 클로닝 조작을 행한다.
그로써 생성된 단일클론성 항체 생성 하이브리도마의 항체 역가는 고향체 역가를 나타내는 하이브리도마를 선택하기 위하여 통상의 방식으로 조사될 수 있다. 하이브리도마는 그렇게 선택된 후 보관된다.
본 발명의 하이브리도마에 의해 생성된 단일클론성 항체는 사람 또는 동물의 암조직에서 자연적으로 발생하는 당지질 항원의 검출에 사용될 수 있다. 그러므로, 단일클론성 항체는 예컨대 암관련 강글리오시드의 검출에 통상 채택되는ELISA 및 RIA측정법에 사용될 수 있다. 더우기, 본 발명의 단일클론성 항체는 거기에 결합할 수 있는 항원의 정제를 위한 친화성 크로마토그래피에 사용될 수 있다. 만약 단일클론성 항체가 방사성 동위원소로 표지된다면 그것은 종양으로 고생하는 환자를 치료하기 위해 다량으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 종양을 검출하거나 그의 정확한 위치를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 또한 암세포에 대한 그의 독성을 증가시키기 위한 어떠한 화학요법제와도 연결될 수 있다. 본 발명의 단일클론성 항체는 사람 및 마우스같은 동물과 같이 항원을 가지는 종을 치료 또는 진단하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 단일클론성 항체는 신결세포의 기본연구에 적용될 수 있을 것으로 기대되며 다양한 임상목적으로 사용될 수 있다.
본 발명을 다음의 비-제한적 작용의 실시예를 참고로 하여 보다 상세히 설명하기로 한다.
실시예
(A) 항원의 제조
(1) GD3및 GM3강글리오시드의 추출 및 정제
돼지의 부신을 차가운 아세톤중에서 균등화 및 건조시킨후, 건조된 생서물을 클로로포름-메탄올로 통상의 방식으로 추출하였다. 그 결과의 샘플을 알칼리로 처리한 다음 DEAE-세파덱스, A-25 음이온 교환수지와 이아트로비드 컬럼을 활용하여 GD3강글리오시드를 정제하였다.
헤파린으로 처리한 개의 혈청을 원심분리함으로써 GM3강글리오시드를 제조하고, 그 결과 형성된 침전물을 인산완충식염수(PBS(-))로 3회 세척하여 동결건조한 후 생성물을 클로로포름-메탄올로 추출하였다. 상기와 동일한 방식으로 그의 정제를 수행하였다.
강글리오시드 GD1a,GD1b및 GQ1b는 디아트론 컴패니, 리미티드로부터 구할 수 있었고; 강글리오시드 Gal-Cer 및 Clc-Cer는 시그마 컴패니로부터 구하였으며 GT1b와 GM2는 후나고시 컴패니로부터 구하였고 이들을 더이상 정제하지 않고 사용하였다.
이들 강글리오시드 당지질을 클로로포름-메탄올 (1:1(부피/부피)) 또는 에탄올중에 녹여서 -20oC에서 보관하였다.
(2) 동물
생후 6주된 6마리 암컷 Balb/c 마우스를 통상조건하에서 사육시킨후 실험에 사용하였다.
(3) 항원용액의 제조
돼지의 부신으로부터 추출된 후 정제된 강글리오시드 GD3과 아세트산으로 (중량비율=1 : 4) 및 디에틸에테르로 처리한 살모넬라 미네소타 R595를 PBS(-) 중에서 혼합함으로써 GD3강글리오시드의 농도는 100㎍/㎖이었고 결과용액을 항원용액으로서 사용하였다.
(4) 배양배지
배양배지 : 니수이(Nissui) RPMI 1640 (일본국, 도오꼬오도의 니시세이야꾸로부터 구입가능함)을 배양배지로 사용하였다. 사용에 앞서 배지에 카나마이신 술페이트와 우태아혈청(GBS)을 넣어 최종농도가 각각 50㎍/㎖과 10%가 되도록 하였다. HAT 배지 : 0.0388g의 티미딘과 0.1361g의 히포크산틴을 가열하에 100㎖의 증류수에 녹이고 그 결과의 용액(a)을 소정 용액 보다 100배 높은 농도를 가지는 원(stock) 용액으로서 -20oC에 보관하였다. 마찬가지로, 0.0176g의 아미노프테린을 소량의 1N 수산화나트륨 수용액을 첨가함으로써 100㎖의 증류수에 녹인 후 이것을 RPMI 1640 배양배지로 10배 회석하여 그 결과의 용액(b)을 소정용액 보다 100배 높은 농도를 가지는 원용액으로서 빛을 차단하면서 -20oC에 보관하였다. HAT 배지를 이들 두가지 용액의 1/100 부피씩을 사용바로 전에 10% FBS RPMI 1640 배지에 첨가함으로써 제조하였다.
또한, HT 배지를 히포크산틴과 티미딘을 함유하는 원용액(a)의 1/100 부피를 동일한 10% FBS RPMI 1640 배지에 단순히 첨가함으로써 제조하였다.
(5) 어버이 세포
세포 융합을 위한 어버이 세포로서 Balb/c 마우스로부터 유도된 골수종 세포(C63-Ag8-6.5.3세포)를 사용하였다. 이들 세포를 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지중에서 6-티오구 아닌을 배지에 첨가하여 그의 최종 농도가 3㎍/㎖이 되도록 함으로써 돌연변이체 생성을 저해하면서 하위배양하였다.
(B) 하이브리도마의 제조
(1) 면역감작의 방법.
생후 6주된 암컷 Balb/c 마우스를 다음의 면역원 용액을 다음의 면역감작 일정(주사량은 강글리오시드의 양으로 표현하였다)에 따라서 : 처음에는 5㎍, 시작후 제4일에는 10㎍, 제7일에는 15㎍, 제12일에는 20㎍ 및 제79일에는 20㎍을 정맥내 주사함으로써 면역시켰다. 최종 면역감작 3일후, 마우스를 희생시켜 그의 비장세포를 꺼내어 개별적인 비장세포 현탁액을 만들어서 그것을 계속해서 세포융합에 사용하였다.
면역원 용액 : 돼지의 부신으로부터 추출되고 정제된 GD3강글리오시드 100㎍과 보조제로서 400㎍의 살모넬라 미네소타 R595를 1㎖의 PBS(-)(CA++와 Mg++가 없음) 중에서 혼합한 후 형성되는 용액을 적절히 희석하여 면역원 용액으로서 사용하였다.
(2) 세포융합
상기 얻어지 비장세포의 마우스 골수종 세포와의 융합을 쾰러와 밀스타인의 방법에 따라 수행하였다. 보다 구체적으로 1×108의 비장 임파구를 배양배지중에서 50% 폴리에틸렌 글리콜(PEG 6000)의 존재하에 2×107골수종 세포와 융합시켰다.
(3) 하이브리도마의 선택 및 배양
세포 융합후에 형성된 세포를 HAT배지(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘)중에서 5% CO2의 존지하에 37oC에서 배양하였다. 그렇게 제조된 하이브리도마를 1987년 4월 8일에 아메리칸타입 컬춰콜렉션(ATCC)에 승인번호 ATCC HB 9475하에 기탁하였다.
(C) 단일클론성 항체의 강글리오시드와의 반응성 평가
(1)96웰의 평탄한 바닥의 플레이트(Falcon Co., Ltd. 로부터 구할 수 있다)를 실험에 사용하기 전에 에탄올로 사전처리 하였다. GD3강글리오시드의 농도를 20㎍/㎖(최적 농도)로 조정하기 위하여 에탄올로 회석하여 놓은 항원용액(면역원 용액)의 50㎕ 씩을 피펫으로 플레이트의 웰의 용매를 증발제거시킨 다음 1% 오브알부민 PBS(-) 용액의 200㎕ 씩을 웰에 넣고 30분동안 실온에서 방치하였다. 용액을 제거하기 위해 플레이트를 거꾸로하여 흔들어준 후 일차 항체로서 하이브리도마 배양배지의 상징액의 50㎕ 씩을 첨가하고 플레이트를 1.5시간동안 실온에서 방치하였다. 마찬가지로, 일차 항체를 웰로부터 제거한 후, 웰을 150㎕의 PBS(-)용액을 첨가하여 3회 세척하고 1%의 오브알부민 PBS(-) 용액의 100㎕ 씩을 첨가한 후 30분동안 실온에서 방치하였다. 이 용액을 제거후에, 1% 오브알부민 PBS(-) 용액으로 최적농도로 회석한 2차 항체의 50㎕ 씩을 첨가하고 1.5시간동안 실온에서 방치하였다. 일차 항체의 경우에서와 같이, 웰을 PBS(-) 용액으로 3회 세척하고 반응용액의 100㎕ 씩을 반응을 유발하기 위해 어두운 곳에서 첨가하였다. 반응용액은 시트르산-인산완충액(pH=5)에 농도가 각각 0.4㎎/㎖과 0.01%가 되도록 -페닐렌디아민과 과산화수소를 용해시킴으로써 제조하였다. 8N 황산용액 30㎕ 씩을 첨가함으로써 반응을 중지시킨 후 생성물을 비색계로 500㎚에서 조사하였다. 2차 항체로서는, 양고추냉이 과산화효소(HRP)로 표시된 염소 항-마우스 IgG, IgM 및 IgA항체를 사용하였다.
얻어진 결과를 제1도에 도시하고 그중 검은 동그라미는 강글리오시드 GM3을 나타내고 하얀 동그라미는 강글리오시드 GD3을 나타낸다.
제1도에 도시된 결과로부터 알 수 있는바, 강글리오시드 GD3와 GM3은 본 발명의 단일클론성 항체와 고감도의 항원-항체반응을 유발한다. 그로써, 두가지 강글리오시드GD3와 GM3은 발명의 단일클론성 항체에 대한 항원 결정기를 운반한다. 이점에서, 강글리오시드 GD3은 강글리오시드 GM3의 그것보다 더 높은 단일클론성항체와의 반응을 나타낸다. 그러므로, 강글리오시드 GD3가 본 발명의 단일클론성 항체에 대해 보다 높은 특이성을 가지는 에피토프 또는 항원 결정기를 가진다는 것을 알 수 있다.
(2) TLC 면역염색 기법
실리카겔 얇은 층 크로마토그래피 (TLC(폴리그램 SIL G)) 플레이트를 적절한 크기로 잘라서 클로로포름-메탄올(1 : 1(부피/부피))중의 당지질 용액의 작은 방울로 점을 찍었다. 목적에 따라, 플레이트를 클로로포름 메탄올-물(60/40/10;부피/부피), 클로로포름 메탄올 0.5% CaCl2용액 (55/45/10;부피/부피)) 또는 클로로포름 메탄올-2.5N NH4OH 용액(60/40/9;부피/부피)) 같은 전개용액으로 전개시킨 후 1% 오브알부민-1% 폴리비닐 피롤리돈(K-30) PBS(-) 용액중에서 4oC에서 밤새 방치하였다. 그런 다음에, 2시간동안 실온에서 일차 항체 용액중에 침지시킨 채로 흔들어 주었다. PBS(-)로 충분히 세척한 후, 1% 오브알부민-1% 폴리비닐피롤리돈(K-30) PBS(-)용액중에 실온에서 30분동안 침지하였다. 거기에서 플레이트를 꺼내어 2시간동안 3% 폴리비닐피롤리돈(K-30) PBS(-)용액으로 최적농도로 회석한 2차 항체중에 흔들면서 침지한 후, PBS(-)로 충분히 세척하고 거기에 반응용액을 첨가하였다. 반응용액은 4㎎의 4-클로로-1-나프톨을 1㎖의 메탄올중에녹이고, 50㎜ole의 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 200㎜ol의 NaCl 및 5㎖의 완충액(pH=7.4)을 첨가한 후 과산화수소를 농도가 0.01%가 되도록 첨가함으로써 제조하였다. 플레이트를 물로 세척함으로써 반응을 중지시킨 후 공기-건조시켰다.
(3) 본 발명의 단일클론성 항체에 특이적인 에피토프의 확인 TLC 염색기법(오르시놀 염색)(A) 및 TLC 면역염색기법(B)에 의해 얻어진 각종 당지질의 정성시험 및 면역반응의 결과를 제2도에 도시한다. 제2도에 도시된 결과로부터 레인 5의 강글리오시드 GD3이 본 발명의 단일클론성 항체에 특이적인 항원 결정기를 가짐을 알 수 있다.
더우기, 레인 3의 강글리오시드 GD3에 작용하는 콜레라균 (Vibrio cholera) 시알리다제에 의해 생성된 CDH(Gal-Glc-Cer)는 TLC 면역염색시에 검출되지 않았다. 이것은 Gal-Glc-Cer(CDH) 구조가 본 발명의 단일클론성 항체에 대한 항원 결정기가 아님을 명백하게 보여준다. 더불어, TLC 면역염색의 레인 3에 나타나는 밴드는 전술한 시알리다제에 의해 영향을 받지 않는 강글리오시드 GD3을 가리킨다. 제2도에서, 레인 1의 CMH는 Gal-Cer 및 Gal-Cer를 나타내고 레인 4의 CTH는 Gal-Gal-Glc-Cer를 나타낸다.
그로써, 이들 구조가 이들이 TLC 면역염색기법에 의해 염색되지 않으므로 본 발명의 단일클론성 항체에 대한 항원 결정기가 아님을 알 수 있다.
상기에서 알 수 있는바, 발명의 단일클론성 항체에 대한 항원 결정기는 N-아세틸뉴라민산 잔기이다.
제2도의 각 레인은 다음과 같다 :
(1) 레인 1 : CMH(Gal-Cer, Glc-Cer 사람 뇌) 1㎍
(2) 레인 2 : CDH(GD3에 작용하는 콜레라균 시알리다제) 1㎍
(3) 레인 3 : CDH 1㎍
(4) 레인 4 : CDH (화학합성 생성물) 1㎍
(5) 레인 5 : GD31㎍
마찬가지로, TLC 면역염색에 의하여 N-아세틸뉴라민산 잔기를 가지는 다양한 강글리오시드를 염색함으로써 얻어진 결과를 아래의 표 I에 요약한다.
Figure kpo00003
(4) 본 발명의 단일클론성 항체에 대한 에피토프 또는 항원결정기의 확인
제2도에서와 같이, 제3도는 TLC 염색기법(A)과 TLC 면역염색기법(B)에 의해 얻어진 각종 당지질의 정성시험 및 면역반응의 결과를 도시한다. 제3도에서, 레인 2와 3은 자연적으로 발생하는 강글리오시드, 다시말하면, 알파 2→3 결합을 가지는 N-아세틸뉴라민산의 결과를 가리킨다. 이들 레인 알파 2→3 결합을 가지는 N-아세틸뉴라민산이 본 발명의 단일클론성 항체에 대해 강력한 특이성을 가진다는 것을 분명히 나타낸다. 더불어, 레인 4와 5는 화학적으로 합성된 N-아세틸뉴라민산 유도체의 결과를 나타낸다. 이들 결과는 합성된 강글리오시드가 본 발명의 단일클론성 항체에 대해 특이성을 갖지 않음을 가리킨다.
두가지, 본 관찰과 (3)항에서 얻어진 것들을 함께 고려해 볼때에, 본 발명의 단일클론성 항체가 그의 에피토프 또는 항원 결정기로서 N-아세틸뉴라민산의 알파 2→3 결합을 인지한다고 결론지을 수 있다.
제3도의 레인을 아래에 상술하기로 한다 :
(1) 레인 1 : GM1㎍
(2) 레인 2 : N-아세틸뉴라민산(NANA)알파 2→3 Gal 1㎍
베타 1→1 Cer
(3) 레인 3 : N-아세틸뉴라민산(NANA)알파 2→3 Gal 1㎍
알파 1→1 Cer
(4) 레인 4 : N-아세틸뉴라민산(NANA)베타 2→3 Gal 0.5㎍
알파 1→1 Cer
(5) 레인 5 : N-아세틸뉴라민산(NANA)베타 2→3 Gal 1㎍
베타 1→1 Cer
(6) 레인 6 : GD1㎍
(5) 정성적인 명역확산기법(오크털로니 기법)
제4도는 면역확산 기법에 의하여 얻어진 결과를 도시한다. 제4도로부터 알 수 있는바, 본 발명의 하이브리도마에 의해 생성된 단일클론성 항체는 IgM이다. 이 방법에서, 항-혈청, 항-MIgM, GKD-MIgG, 항-MIgG, 항-MIgG및 항-MIgG는 마일즈 컴패니로부터 구입하였다.
(1) 항-MIgM
(2) 항-MIgG
(3) 항-MIgG
(4) 항-MIgG
(5) 항-MIgG
(6) 본 발명의 단일클론성 항체가 IgM이라는 사실은 또한 효소-표시 항체기법에 따라 얻어진 결과에 의해 증명되며, 방법에서 얻어진 결과는 아래의 표 Ⅱ에 요약한다.
Figure kpo00004
항원 : GD500㎎/웰
3차 항체 : 염소 항-토끼 Ig-HRP

Claims (16)

  1. 알파 2→3 결합을 가지는 N-아세틸뉴라민산 잔기를 운반하는 강글리오시드 당지질에 특이적인 단일클론성 항체를 생성하는 수탁번호가 ATCC HB 9475인 하이브리도마 세포주.
  2. 알파 2→3 결합을 가지는 N-아세틸뉴라민산 잔기를 운반하는 강글리오시드 당지질에 특이적인 단일클론성 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마의 제조방법에 있어서, (i) 알파 2→3 결합을 가지는 N-아세틸뉴라민산 잔기를 운반하는 강글리오시드 당지질로 인간을 제외한 포유동물을 면역시켜서 얻어진 B 세포 또는 임파구와, (ii) 골수종 세포를 융합시키는 것으로 이루어지는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 세포융합에 의해 생성된 하이브리도마가 추가로 클론되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 강글리오시드는 GD3강글리오시드 또는 GM3강글리오시드인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 포유돌물이 Balb/c 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, B 세포가 Balb/c 마우스의 비장세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제2항에 있어서, 골수중 세포가 사람, 쥐 또는 마우스로부터 유도된 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 골수종 세포가 Balb/c 마우스로부터 유도된 것임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제2항에 있어서, 세포 융합시에 폴리에틸렌글리콜이 세포융합용 제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제2항에 있어서, 살모넬라 미네소타 R595가 보조제로서 포유동물을 면역시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 에피토프 또는 항원 결정기로서의 알파 2→3 결합을 가지는 N-아세틸뉴라민산을 운반하는 강글리오시드 당지질에 특이적인 단일클론성 항체.
  12. 제11항에 있어서, 강글리오시드가 GD3강글리오시드 또는 GM3강글리오시드인 것을 특징으로 하는 단일클론성 항체.
  13. 제11항에 있어서, IgM 형 면역글로불린 분자인 것을 특징으로 하는 단일클론성 항체.
  14. 제11항에 있어서, 강글리오시드 정제에 사용되는 것을 특징으로 하는 단일클론성 항체.
  15. 제11항에 있어서, 흑색종 세포의 표면항원과 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 단일클론성 항체.
  16. 제15항에 있어서, 진단용 혈청용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 단일클론성 항체.
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