HU204573B - Process for producing monoclone antibodies recognizing alpha-2-3 bonds of n-acetyl-neuraminic acid - Google Patents

Process for producing monoclone antibodies recognizing alpha-2-3 bonds of n-acetyl-neuraminic acid Download PDF

Info

Publication number
HU204573B
HU204573B HU885935A HU593588A HU204573B HU 204573 B HU204573 B HU 204573B HU 885935 A HU885935 A HU 885935A HU 593588 A HU593588 A HU 593588A HU 204573 B HU204573 B HU 204573B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
monoclonal antibody
fused
ganglioside
producing
Prior art date
Application number
HU885935A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT48679A (en
Inventor
Yoshitaka Nagai
Hideki Yamamoto
Kinji Takada
Masayoshi Ito
Yoshiyasu Shitori
Original Assignee
Kanto Ishi Pharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kanto Ishi Pharma Co Ltd filed Critical Kanto Ishi Pharma Co Ltd
Publication of HUT48679A publication Critical patent/HUT48679A/hu
Publication of HU204573B publication Critical patent/HU204573B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57469—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving tumor associated glycolinkage, i.e. TAG
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/806—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving IgM
    • Y10S424/807—Monoclonal
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/863—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgM
    • Y10S530/864—Monoclonal

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás új hibridőma létrehozására, továbbá a hibridőma által termelt szialinsay-tartalmú glikolipiddel szembeni monoklonális antitestek előállítására.
Eddig az antiszérumokat immunizált állatok szérumának különböző antigénekre való adszorbeálásával állították elő. Azonban az antiszérum nagyszámú olyan antitestmolekulát tartalmaz, amelyek különböző B-sejtekből (poliklonális) származnak és gyakran keresztreakcióba lépnek más antitestekkel. Ezért nehéz nagy specifítású antíszérumot előállítani.
Hyen körülmények között 1975-ben Kohler kifejlesztett egy olyan hibridőmát, amely antibiika-vörösvérsejt antitestet termel, és amelyet immunizált állat lépsejtjeinek és egénnyeloma-sejtek fúziójával hozott létre. Az ilyen hibridőmasejtekből egy klónt lehet izolálni, amely egyetlen sejtből származó hibridőmasejtekből áll (úgynevezett klónozás), és amelynek nagy a proliferácíós képessége. Az ilyen klónozott hibridőma által termelt minden antitest azonos, egy antigénnel szembeni specifitásuk í egységes és így ezek a specifikus antigén azonos helyét ismerik fel. Ezenkívül a hihridómák fagyasztott állapotban tárolhatók, például folyékony nitrogénben, ezért biztosított az egyéni antitestek stabil alkalmazása. A sejtfűziós technikával lehetővé válik egy olyan monoklonális an- 2 titest termelése, amely nagymértékben specifikus egy specifikus antigénnel szemben.
Az antitestek fehérjék, amelyek képesek egy molekulát vagy anyagot felismerni, amelyet antigénnek nevezünk, és képesek ehhez kötődni. A monoklonális 3 antitest egy olyan hellyel rendelkezik, amely specifikusan felismer egy specifikus antigént, más szavakkal, csak egy antigéndeterminánst ismer fel. Jelenleg már jól ismertek különböző technikák a monoklonális antitestek és az ezek termelésére képes hihridómák előállí- 3: tására. Ezzel kapcsolatban a következő legutóbbi közleményre lehet hivatkozni: „Monoclonal Hybridoma Antibodies: Technique and Applications”, John G. Hurrel kiadása, 1983.
Az emlős sejtek glikolipidjei az úgynevezett szfin- 4( goglikolipidek kategóriájába tartoznak és tartalmaznak (a) egy ceramidnak tekintett lipid szerkezetet, amely egy szfíngozinnak nevezett hosszú láncú amino-alkoholból és ahhoz savamidkötéssel kapcsolódó zsírsavból áll, valamint (h) cukrok különböző kombinációját, 4£ amelyek glükóz, galaktóz, N-acetil-glükozamin, Nacetil-galaktozamin, fukőz és szialinsav lehetnek, és amelyek a szerkezethez glükozidkőtéssel kapcsolódnak. Ezen vegyületek között a szialinsavat tartalmazó glikohpideket gangliozidoknak nevezzük. 50
Ezen vegyületek legnagyobb része általában a külső sejtmembránban helyezkedik el, és a legutóbbi vizsgálatok alapján feltételezték, hogy fontos szerepet játszanak a felismerés és információ fogadásában és válaszában, a receptorfunkcióban, a differenciáciőban, proliferációban, 55 malignus változásban vagy a sejtek viselkedésében.
Ezek között a gangliozidok között a GD3 gangliozidok ismertek az idegsejtek differenciált antigénjeként és ezenkívül a humán melanomasejtek rákkal kapcsolatos antigénjeként is azonosították ezeket. 60
AJ. Exp. Med,, 115, 1133-47 (1982)-hen leírnak ugyan GD3 gangfiozidra specifikus antitestet, de kötési helyét nem tisztázzák, és más hasonló szialinsav szerkezeti részletet tartalmazó glikoproteinekhez nem kö5 tődik. A Cancer Rés., 44, 806-10 (1984) és a 47, 1229-33 (1987) közlemények GD3 diszialil-gangliozidot, illetve GD2-I1ÖZ és gyengébben GD3-hoz kötődő antitesteket ismertetnek, de ezek kötési helyét nem azonosították, és ezek más hasonló szialinsavkőtést tartalmazó antigéneket nem ismernek fel.
Találmányunk célkitűzése az N-acetil-neuraminsav alfa 2—>3 kötési helyet felismerő antitest előállítása volt Minthogy a monoklonális antitest egy specifikus antigénnel szemben nagy specifítással rendelkezik és így
- amint a fentiekben leírtuk - nagy érzékenységgel detektálható, ha a GD3 gangliozidra specifikus monoklonális antitestet állítunk elő, várható, hogy ez a monoklonális antitest alkalmazható rákdiagnózis céljára (rákmarkefként) és immunológiaíkezelésre, valamint a
-0 cukorláncnak a sejtfunkciőkban betöltött szerepének a tisztázására.
A találmány tárgya eljárás egy olyan hibridőma létrehozására, amely a GD3 gangliozidon levő specifikus antigéndeterminánsra specifikus monoklonális antitest !5 termelésére képes, amelyet humán melanomasejtek tumorhoz kapcsolt antigénjeként azonosítottak.
A találmány további tárgya egy olyan monoklonális antitest biztosítása, amely specifikus a GD3 gangliozidon lévő specifikus antigéndetermínánssal szemben.
A feltalálók különböző tanulmányokat végeztek a fenti hátrányok kiküszöbölésére és azt találták, hogy a . sejtfűzíős technikában a tisztított GD3 gangliozidotkell alkalmazni antigénként egy olyan hibridőma létrehozására, amely képes a kívánt monoklonális antitestet ter5 melni.
A találmány egyik tárgya eljárás egy olyan hibridőma létrehozására, amely egy alfa 2—>3 kötésű N-acetilneuraminsav-csoport-tartalmú szialinsavat tartalmazó, glikolipídekkel szemben specifikus monoklonális anti) testet képes termelni.
Azeljárás (1) egy alfa 2-^3 kőtésűN-acetil-neuraminsav-csoport-taríalmú szialinsavat tartalmazó glikolipíddel, mint antigénnel immunizált állatból nyert B-sejtek (B-Jimfociták) és (11) myelomasejtekfűziőjából áll.
> A találmány további tárgya az is, hogy rendelkezésre bocsájt egy alfa 2->3 kötésű N-acetil-neuraminsavcsoport-tartalmú szialinsavat tartalmazó glikolipidekkel szemben specifikus monoklonális antitestet, amelyet az előbb leírt hibridőma termel.
Az ábrákrövid magyarázata:
1. ábra: Bemutatja a találmány szerinti monoklonális antitest GD3 és GM3 antigénekkel szembeni specifitását, amelyet enzimmel jelzett antitesttechnikával határoztunk meg.
2. és 3. ábrák: A különböző fajtájú gangliozidoknak a. találmány szerinti monoklonális antitesttel szembeni antigén specifítását mutatják be.
4. ábra: A találmány szerinti monoklonális antitest osztályozására szolgáló diagramot mutatja be.
HU 204573 Β
A találmányt az alábbiakban részletesebben ismertetjük.
A találmány szerinti hibridómát egy antigénnel immunizált állatból nyert B-sejtek (B-limfociták) fúziójával lehet előállítani Kohler és Millstein módszere szerint (lásd Natúré 1975). Az itt alkalmazott „antigének” lehetnek például alfa 2->3 kötésű N-acetil-neuraminsav-csoportot tartalmazó gangliozidok, előnyösen alfa 2->3 kötésű N-acetil-neuraminsav-csoportot tartalmazó gangliozid glikolipidek. Ezek jellemző példái a következők:
(A) GD3 Gal-Glc-Cer
NeuAc
NeuAc (B) GM3 Gal-Glc-Cer
NeuAc (C) GM2 GalNAc-Gal-Glc-Cer
NeuAc (D) GMj Gal-GalNAc-Gal-Glc-Cer
NeuAc (E) GDja Gal-GalNAc-Gal-Glc-Cer
NeuAc NeuAc (F) GTia GalGalNAc-Gal-Glc-Cer
NeuAc NeuAc
NeuAc (G) GM4 Gal-Cer
NeuAc (H) GD2 GalNAc-Gal-Glc-Cer
NeuAc
NeuAc (K) GTib Gal-GalNAc-Gal-Glc-Cer
NeuAc NeuAc NeuAc (L) GQib Gal-GalNAc-Gal-Glc-Cer
NeuAc NeuAc
NeuAc NeuAc (NeuAc-acetil-neuraminsav-csoport)
Gal-galaktóz
Glc-glükóz
Cer-ceramid
A találmány szerinti hibridóma által termelt monoklonális antitest felismeri az alfa 2->3 kötésű Nacetil-neuraminsavat, mint epitopot vagy antigéndeterminánst, és azzal specifikusan reagál. Ezért a hibridóma által termelt monoklonális antitest kiemelkedően magas reakcióképességet mutat alfa 2->3 kötésű N-acetil-neuraminsav-csoport-tartalmú szialinsavat tartalmazó glikolipidekkel szemben, különösen
GD3 és GM3 gangliozidokkal szemben. Ezenkívül a monoklonális antitest ezt a specifikus hatását kifejti minden fajta szialinsav-tartalmú glikolipiddel szemben, függetlenül attól, hogy az milyen állatból származik.
A fent említett szialinsav-tartalmú glikolipid antigénnel immunizált állat bármilyen állat lehet. így például nyúl, ember, egér és patkány, előnyösen egér és még előnyösebben Balb/c egér.
A találmány szerinti monoklonális antitesteket termelő B-sejtek (B-limfociták) előnyösen lépből származnak. Másrészről a találmányban alkalmazott „myelomasejtek” bármilyen állatból származhatnak, így emberből, egérből, patkányból és nyálból, előnyösen egérből, még előnyösebben Balb/c egerek (X63Ag8.653) myelomasejtjeiből. Ezek a myelomasejtek kiemelkedően magas proliferációs képességgel rendelkeznek, így ezeket fuzionálva a B-sejtekkel olyan hibridóma jön létre, amely folyamatosan képes termelni a találmány szerinti monoklonális antitestet.
A találmány szerinti hibridómát az alábbiakban részletesen leírt módon lehet létrehozni.
Mindenekelőtt GD3 gangliozidot injektálunk egerekbe intraperitoneálisan, szubkután vagy intravénásán, előnyösen intravénásán, azok immunizálása céljából. Ezen immunizáció során akár inkomplett, akár komplett adjuvánsokat lehet alkalmazni, azaz egy immunválaszt fokozó szert, amelynek specifikus példái olajok, emulgeálószerek, elölt Tuberculosis bacillus, elölt Salmonella és ezek keveréke, előnyösen elölt Salmonella minnesota, amelyeket alkalmazni lehet intraperitoneális vagy szubkután injekció céljára és intravénás injekció céljára. Ezeket az antigéneket és adjuvánsokat előnyösen lehet alkalmazni megfelelő fiziológiai összetételű oldat formájában, így például foszfáttal pufferolt sóoldatban.
Meg kell jegyezni, hogy ezen immunizáció során egy immunizálandó állatot nehéz érzékennyé tenni a saját komponenseivel és így inkább attól az állattól, amelyből az antigénanyagot nyertük, fenogenetikusan. eltérő állatot választunk. Azonban az immunizáció in vitro is elvégezhető ennek a nehézségnek az elkerülése céljából.
Ezután a B-sejteket fuzionáljuk. Sejtfúziós anyagként alkalmazni lehet polietilénglikolt és HVJ-t, (Hemagglutinating Vírus of Japan-Sendai Vírus), előnyösen polietilénglikol 6000-et. Ezenkívül előnyben részesítjük a HAT-közeg alkalmazását tápközegként, amely lehetővé teszi a hibridómasejtek izolálását a nem fuzionált maradék myelomasejtekből.
Ezután a kapott hibridómasejteket klónozási eljárásnak vetjük alá, így metilcellulóz-technikával, lágyagartechnikával vagy határhígításos technikával dolgozunk, hogy izoláljuk a kívánt egyedi klónozott hibridómát.
Az így létrehozott monoklonális antitestet termelő hibridóma antitesttiterét szokásos módon meg lehet határozni abból a célból, hogy szelektáljuk a magas antitesttiteru hibridómákat. Az így kiválasztott hibridómát ezután tároljuk.
HU 204573 Β
A találmány szerinti hibridőma által termelt monoklonális antitestet fel lehet használni az ember vagy állatok rákos szöveteiben természetesen előforduló glikolipid antigén detektálására. Ezért a monoklonális antitestet alkalmazni lehet például ELISA- és RIA-vizsgálatokban, amelyeket általánosan használnak a rákos sejtekhez kapcsolódó gangliozidok detektálására. Továbbá a találmány szerinti monoklonális antitestet fel lehet használni afSnítás-kromatográfíához az azt kötni képes antigének tisztítására. Ha a monoklonális antitestet radioizotóppal jelöljük, az alkalmas tumorok detektálására vagy annak pontos helyének a megállapítására ugyanúgy, mint alkalmazni lehet nagy adagjait tumoros betegek kezelésére. Köthető egy kemoterápiás szerhez abból a célból, hogy emeljük annak a daganatos sejtekre gyakorolt toxikus hatását A találmány szerinti monoklonális antitestet alkalmazni lehet olyan fajok kezelésére vagy diagnosztizálására, amelyek ilyen antigénnel rendelkeznek, így ember és állatok, például egér esetében. Várható, hogy a találmány szerinti monoklonális antitest alkalmazható az idegsejtek alapos tanulmányozására és felhasználható különböző klinikai célokra.
Á találmányt a következőkben részleteiben ismertetjük a nem korlátozó jellegű példákkal.
Példa (A) Az antigén előállítása
I. A GDi és GM3 gangliozidok extrakciója és tisztítása
Miután sertés mellékvesét hideg acetonban homogenizáltunk és megszáritottuk, a száraz terméket kloroform- és metanoleleggyel ismert módon extraháltuk.
A kapott mintát 37 °C-on 2 óra hosszat 0,2 mólos nátrium-hidroxid-oldattal kezeltük és ezután a GD3 gangliozidot DEAE Sephadex A-25 anioncserélőn és Iatrobeds-oszlopon tisztítottuk.
A GM3 gangliozidot úgy állítottuk elő, hogy heparinnal kezelt kutyaszérumot centrifugáltunk, az üledéket háromszor mostuk foszfátpufferes sóoldattal [a továbbiakban PBS(-)], Iiofílizáltuk, majd a tennéket kloroform-metanol eleggyel kivonatoltuk. A tisztítása a fent már lent módon történt.
A GDi„ GDib és GQib gangliozidok a Diatron Co., Ltd-nél szerezhetők be, a Gal-Cer és GIc-Cer gangliozidok pedig a Sigma cégtől, és a GTib és GM2 a Funakoshi cégtől szerezhetők be. Ezeket további tisztítás nélkül használtuk.
Ezeket a gangliozid glikolipideket kloroform-metanol (1:1 tf/tf) elegyben vagy etanolban oldottuk és -20 °C-on tároltuk.
2. Állat
Hat nőstény Balb/c egeret használtunk a kísérletekhez, amelyek hat hetes korúak voltak normális körülmények közötti megtermékenyítés után.
3. Az antigénoldat készítése
Sertésmellékveséből kivont és tisztított GD3 gangliozidot és ecetsavval és dietil-éterrel (1:4 tömegarány) kezelt Salmonella minnesota R 595-öt [Handbook of
Experimental Immunology, Vol. 4, 117,1-117,20 (1986); Blackwell Ed. Boston] PBS (-)-ben összekevertünk úgy, hogy a GD3 gangliozid koncentráció 5 100 mikrogramm/ml, és a kapott oldatot használtuk antigénoldatként.
4. Tápközeg
Tápközeg: Tápkőzegként Nissui RPML 1640-et 10 használtunk (beszerezhető a Nissui Seiyaku, Tokyo, Japan, cégnél), A közeghez kanamicin-szulfátot és fetális marhaszérumot (fetal bovine serum, továbbiakban FBS) adtunk úgy, hogy ezek végső koncentrációja az alkalmazás előtt 50 mikrogramm/ml, ill. 10% 15 legyen.
HAT-tápközeg: 0,0388 g timidint és 0,1361 g hipoxantint oldunk 100 ml desztillált vízben melegítés közben és a kapott oldatot (a) 20 ’C-on tartjuk törzsoldatként, az oldat koncentrációja 100-szorosa a kí20 vántnak. Hasonló módon 0,0176 g aminopterint oldunk 100 ml desztillált vízben egy kevés vizes 1 N nátrium-hidroxid-oldatot adunk hozzá, majd RPMI 1640 tápközeggel 10-szeresére hígítjuk és a kapott törzsoldatot (b) -20 ’C-on fénytől védetten tároljuk, 25 az oldat koncentrációja 100-szor magasabb, mint a kívánt oldaté. A HAT-kőzeget úgy készítjük el, hogy mindkét oldatból 10% FBS-tartalmú RPMI 1640 közeghez közvetlenül a felhasználás előtt 1/100 részt adunk.
Továbbá a HT-közeget úgy készítjük, hogy egyszerűen a hipoxantint és timidint tartalmazó (a) törzsoldatből 1/100 térfogatot adunk ugyanahhoz a 10% FBS-t tartalmazó RPMI 1640 közeghez.
5. Tőrzssejtek
A sejtfúzióhoz törzssejtként Balb/c egerekből származó myelomasejteket (X63-Ag8-6.5.3 sejtek) [J. hnmunology, 123, 1548 (1979); „Q”-sejtek; dep. szám: ATCC CRL 1580] alkalmaztunk. Ezeket a sejteket 40 szubkultúrában tartottuk előzőleg 10% FBS-taríalmú RPMI 1640 tápközegben, és a mutánsok keletkezésének a meggátlására 3 mikrogramm/ml koncentrációban 6-tiogüanint adtunk hozzá.
(B) A hibridóma létrehozása
1. Az immunizáció módszere
Hat hetes, nőstény Balb/c egereket immunizáltunk a következő immunogén oldat intravénás adásával a következő immunizációs időrendben (az injektált meny50 nyiséget a gangliozidok mennyiségében fejezzük ki): kezdetben 5 mikrogrammot, a 4. napon 10 mikrogrammot, a 7. napon 15 mikrogrammot, a 12. napon 20 mikrogrammot és a kezdet utáni 79. napon 20 mikrogrammot, Az immunizáció befejezése után 3 nappal 55 az egereket leöltük, hogy kivegyük a lépjüket, az egyedi lépsejtekből szuszpenzíót készítettünk és ezt követően azokat használtuk fel a sejtfúzióhoz.
Immunogén oldat: Sertésmellékveséből izolált és tisztított 100 mikrogramm GD3 gangliozidot és adju60 vánsként 400 mikrogramm Salmonella minnesota R
HU 204573 Β
595-öt kevertünk el 1 ml PBS(-)- (Ca^- és Mg^-mentes) oldatban és a kapott oldatot ezután megfelelően hígítottuk az immunogén oldat számára.
2. Sejtfúzió
A fenti módon nyert lépsejtek és az egér myelomasejtek fúzióját Kohler és Millstein módszere szerint hajtottuk végre. Részletesebben: blO8 léplimfocitát fuzionáltunk 2·107 myelomasejttel 50% polietilénglikol (PEG 6000) tartalmú tápközegben.
3. Szelekció és a hibridóma létrehozása
A sejtfúzió után a kapott sejteket HAT-tápközegben (hipoxantin, aminopterin és timidin) 37 °C-on 5% CO2 jelenlétében tenyésztettük.
Az így létrejövő hibridómát letétbe helyeztük az American Type Culture Collection (ATCC)-nél ATCC HB 9475 szám alatt.
(C) A monoklonális antitestek gangliozidokkal való reaktivitásának a meghatározása 96 tartályos lapos aljú lemezt (beszerezhető a Falcon Co., Ltd-nél) használat előtt etanollal előkezeltünk, GD3 gangliozid antigénoldatból (immunogén oldat) 50-50 mikrolitert pipettáztunk a lemez tartályaiba, miután az oldatokat etanollal úgy hígítottuk, hogy a GD3 gangliozid koncentrációja 20 mikrogramm/ml legyen (optimális koncentráció), majd az oldószert elpárologtattuk, ezután a tartályokba 1% ovalbumint tartalmazó PBS(-)-oIdatot adagoltunk és 30 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk. A lemezeket lefelé fordítottuk, hogy az oldatot eltávolítsuk, majd a hibridómasejt-tenyészet 50 mikrolitereit, mint primer antitestet adtuk a lemezek tartályaiba és szobahőmérsékleten 1,5 órán át állni hagytuk azt. Hasonló módon eltávolítottuk a primer antitestet a tartályokból, majd a tartályokat háromszor mostuk 150 mikroliter PBS(-)-oldattal, és miután mindegyikhez 100 mikroliter 1% ovalbumintartalmú PBS(-)-oldatot adtunk, 30 percen át állni hagytuk szobahőmérsékleten. Ennek az oldatnak az eltávolítása után 1% ovalbumintartalmú PBS(-)-oldattal optimális koncentrációra hígított 50 mikroliter szekunder antitestet adagoltunk és 1,5 órán át állni hagytuk szobahőmérsékleten. Amint azt a primer antitestek esetében tettük, a tartályokat háromszor mostuk PBS(-)-oldattal és mindegyik reakcióelegy bői 100 mikrolitert adtunk a reakció létrehozásához, a reakciót sötétben hajtottuk végre. A reakcióelegyet úgy készítettük, hogy cltrát-foszfát-pufferben (pH-5) o-feniléndiamint és peroxidot oldottunk, hogy azok koncentrációja 0,4 mg/ml, ill. 0,01% legyen. A reakciót 30 mikroliter 8 N kénsav hozzáadásával állítottuk le és ezután a terméket kolorimetriásan 500 nm-en meghatároztuk. Szekunder antitestként kecske antiegér IgG, IgM és IgA antitesteket alkalmaztunk, amelyek torma-peroxidázzal (horseradish peroxidase-HRP) voltak jelzettek.
A kapott eredményeket az 1. ábrában adjuk meg, ahol a tömör karikák a GM3 gangliozidot, az üres körök pedig a GD3 gangliozidot jelentik.
Az 1. ábrában megadott eredményekből láthatóan a
GD3 és GM3 gangliozidok igen érzékeny antigén-antitest reakciót hoznak létre a találmány szerinti monoklonális antitesttel. így a GD3 és a GM3 gangliozidok redelkeznek a találmány szerinti monoklonális antitesttel szembeni antigéndeterminánssal. Ezzel kapcsolatban meg kell jegyezni, hogy a GD3 gangliozid reakcióképessége a monoklonális antitesttel szemben nagyobb, mint a GM3 gangliozidé. Azt tapasztaltuk, hogy a GD3 gangliozid epitop vagy antigéndeterminánssal rendelkezik a találmány szerinti monoklonális antitesttel szemben, amely az előbbinél sokkal nagyobb specifitású.
2. TLC-immunfestési technika
Egy szilikagél vékonyréteglemezt (TLC, poligram SIL G) megfelelő méretű darabokra vágunk és a glikolipid kloroform-metanol (1:1 tf/tf) oldatából egy cseppet teszünk rá. A céltól függően a kromatogram kifejlesztését kloroform-metanol-víz (60:40:10), kloroform-metanol-0,5% CaCU-oldat (55:45:10) vagy klorofonn-metanol-2,5 N NH4OH-oldat (60:40:9) elegyekkel végezzük, és ezután állni hagyjuk azokat 1% ovalbumin-, 1% polivinilpirrolidon (K-30) PBS(-)-oldatban éjjelen át 4 °C-on. Ezután azokat a primer antitestoldatba mártva 2 órán át szobahőmérsékleten rázatjuk. Miután PBS(-)-oldattal kielégítően kimostuk, 1% ovalbumin-, 1% polivinilpirrolidon (K-30) PBS(-)oldatba mártjuk szobahőmérsékleten 30 percre, Ezután a lemezeket kivesszük és 2 órára a szekunder antitest oldatába merítjük, amelynek optimális koncentrációját 3% polivinilpirrolidon (K-30) PBS(-)-oldatával beállítottuk, rázatjuk, majd megfelelően kimossuk PBS(-)oldattal és egy reagensoldatot adunk hozzá. A reagensoldatot úgy készítjük, hogy 4 mg 4-klór-l-naftolt 1 ml metanolban oldunk, 50 mmól trisz(hidroxi-metil)-amino-etánt, 200 mmól NaCl-t és 5 ml puffért (pH=7,4) adunk hozzá, majd annyi hidrogén-peroxidot, hogy annak koncentrációja 0,01% legyen. A lemezeket vízzel kimosva a reakciót leállítjuk és a lemezeket levegőn megszárítjuk.
3. A találmány szerinti monoklonális antitestre specifikus epitopok azonosítása
A minőségi vizsgálatok és a különböző glikolipidek TLC-festési technikával (orcinol festés) [J. Neurochem., 1, 42 (1966)] (A) és a TLC-immunfestési technikával (B) megállapított immunreakcióinak az eredményeit a 2. ábra mutatja be. A 2. ábrában látható eredményekből megállapítottuk, hogy az 5. kromatográfiás oszlopban lévő GD3 gangliozid rendelkezik a találmány szerinti monoklonális antitesttel szembeni specifikus antigéndeterminánssal.
Továbbá a CDH (Gal-Glc-Cer), amelyet a Vibrio cholera szialidázzal a GD3 gangliozidból hoztunk létre, és amely a 3. oszlopban szerepel, nem detektáltunk, ha azt a TLC-immunfestésnek vetettük alá. Ez világosan jelzi, hogy a Gal-Glc-Cer (CDH) szerkezet nem antigéndetermínánsa a találmány szerinti monoklonális antitestnek. Ezenkívül a TLC-immunfestés során a 3.
HU 204573 Β oszlopban megjelenő sáv olyan GD3 gangliozídot mutat, amelyet a fenti szialidáznem bont. A 2. ábrában, az 1. oszlopban lévő CMH Gal- Cer és a 2. oszlopban levő GIc-Cer szerkezetű, és a 4. oszlopban lévő CTH GalNAc-Gal-Glc-Cer szerkezetű.
Tehát azt találtuk, hogy ezek a szerkezetek nem antigéndeterminánsai a találmány szerinti monoklonális antitestnek, minthogy ezek nem festődtek a TLCimmunfestési technikával.
Amint a fentiekből látható, azt találtuk, hogy a talál- 10 mány szerinti monoklonális antitest antigéndeterminánsa N-acetil-neuiaminsav-csoport.
A 2. ábrában lévő oszlopok a következők:
(1) 1. oszlop CMH (Gal-Cer) 1 mikrogiamm (2) 2. oszlop CMH (GIc-Cer) 1 mikrogramm (3) 3. oszlop CDH (Gal-Glc-Cer) 1 mikrogramm (4) 4. oszlop CTH (GalNAc-Gal-Glc-Cer) 1 mikrogramm 20 (5) 5. oszlop GD3 I mikrogramm
Hasonlóan N-acetil-neurannnsav-csoportot tártál- Gal béta 1—>1 Cer mázó különböző gangliozidök a TLC-immunfestésiel- 25 (3) 3. oszlop N-acetil-neuraminsav 1 mikrogramm járással kapott eredményeit az alábbi táblázatban adjuk (NANA) alfa 2->3 meg. Gal alfa 1-»1 Cer (4) 4. oszlop N-acetil-neuraminsav 0,5 mikrogr.
1. táblázat (NANA) béta 2->3
A TLC-immunfestési teszt eredményei 30 Gal alfa 1—>1 Cer
Antigén (100 pmól) ATCC HB 9475
GM3 ++++++
gd3 ++++++
GDxa ++
GDib +
GT,b ++
GQib +++
Minták: 578 nm
Kontroll: 710 nm
Antitesttiten +<20 000
20 000 <++<10000
40000 <+++<60000
60000 <++++<80000
80000 <+++++<100 000
100000 <++++++
zíd, más szóval a 2-+3 kötést tartalmazó N-acetil-neuraminsav eredményeit mutatja. Ezek az oszlopok világosan mutatják, hogy az alfa 2->3 kötést tartalmazó N-acetil-neuraminsav nagymértékben specifi5 kus a találmány szerinti monoklonális antitesttel szemben.
Ezenkívül a 4. és 5. oszlopok a kémiai úton szintetizált N-acetil-neuraminsav-származékok eredményeit mutatják be. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a szintetikusan előállított gangliozid nem rendelkezik a találmány szerinti monoklonális antitesttel szemben specifitással.
Összegezve a jelen megfigyeléseket, valamint a 3. fejezetben elmondottakat, levonható az a következtető tés, hogy a találmány szerinti monoklonális antitest az N-acetil-neuraminsav alfa 2—»3 kötéseit, mintepitopját vagy antigéndeterminánsát ismeri fel.
A 3. ábra oszlopait a következőkben részletezzük:
(1) 1. oszlop GM3 1 mikrogramm (2) 2. oszlop N-acetil-neuraminsav I mikrogramm (NANA) alfa 2-+3 (5) 5. oszlop N-acetil-neuiaminsav 1 mikrogramm (NANA) béta 2->3 Gal béta 1—>1 Cer (6) 6. oszlop CD3 1 mikrogramm
5. Minőségi immundiffuziós technika (Ouchterlony
Techntque)
A 4. ábra az immundiffúziós technikával nyert eredményeket mutatja be, amint a 4. ábrából látható, a találmány szerinti hibridóma által termelt monoklonális antitest IgM. Ebben az eljárásban az anti-MIgM, anti-MlgGi, anti-MIgGíj, anti-MIgG2b és anti-MTgG3 antiszérumokat a Miles Company tói szereztük be. (Anti-M...=antiegér...) (1) anti-MIgM (2) anti-MTgGi (3) anti-MrgG2a (4) antiMIgG2b (5) anti-MIgG3
6. Azt a tényt, hogy a találmány szerinti monoklonális antitest IgM, az enzimmel jelzett antitesttechnikával kapott eredmények is bizonyítják. Az ezzel a módszerrel kapott eredményeket az alábbi 2. táblázatban összegeztük:
4. A találmány szerinti monoklonális antitest epitopjának vagy antigéndeterminánsának az azonosítása 55
A 2. és a 3. ábrák a különböző glikolípidek minőségi vizsgálatainak és az immunreakcióinak az eredményeit mutatják be. Az utóbbiakat TLC-festésí eljárással (A) és TLC-immunfestési eljárással (B) kaptuk. A
3. ábrában a 2. és 3. oszlopok a természetes ganglio- 60
HU 204573 Β
2. táblázat
Szekunder Hibridómából nyert antitest
antitest + -
antiegér IgM 0,977±0,079 0,066±0,007
antiegér IgGi 0,131±0,011 0,062+0,011
antiegér IgGa, 0,137±0,013 0,109±0,010
antiegér IgG» 0,121+0,003 0,072±0,006
antiegér IgG3 0,131±0,007 0,046±0,003
OD [optikai sűrűség (optical
density)] 500 nm-en mérve
Antigén: GD3 500 ng/tartály
Harmadik antitest: kecske antinyúl Ig-HRP

Claims (13)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás szialinsav-tartalmú glikolipidre specifikus, antigéndeterminánsként az alfa 2—>3 kötésű N-acetilneuraminsav-csoportot felismerő monoklonális antitestek termelésére képes hibridóma létrehozására, azzal jellemezve, hogy alfa 2—93 kötésű N-acetil-neuraminsav-csoportot hordozó szialinsav-tartalmú glikolipiddel immunizált emlős állat B-sejtjeit myelomasejtekkel fuzionáljuk, szelektáljuk a tárgyi körben meghatározott specifitású antitesteket termelő hibridómákat, és azokat tovább klónozzuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szialinsav-tartalmú glikolipidként egy gangliozid gliklipiddel immunizált emlős állat B-sejtjeit fuzionáljuk myelomasejtekkel.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy GD3 ganglioziddal immunizált emlős állat B-sejtjeit fuzionáljuk myelomasejtekkel.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy immunizált Balb/c egerek B-sejtjeit fuzionáljuk myelomasejtekkel.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy B-sejtekként immunizált Balb/c egerek lépsejtjeit fuzionáljuk myelomasejtekkel.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy myelomasejtekként egérből származó myelomasejteket fuzionálunk B-sejtekkel.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Balb/c egérből származó myelomasejteket fuzionálunk B-sejtekkel.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejteket polietilénglikol jelenlétében fuzionáljuk.
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az állatok immunizálásához adjuvánsként Salmonella minnesota R 595-öt használunk.
  10. 10. Eljárás szialinsav-tartalmú glikolipidre specifikus, antigéndeterminánsként az alfa 2-93 kötésű N-acetil-neuraminsav-csoportot felismerő monoklonális antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított hibridómákat megfelelő körülmények között tenyésztjük, és a termelt antitesteket kinyerjük.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás egy gangliozid glikolipidre specifikus monoklonális antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerint előállított hibridómákat megfelelő körülmények között tenyésztjük, és a termelt antitesteket kinyerjük.
  12. 12. All. igénypont szerinti eljárás GD3 gangliozidra specifikus monoklonális antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3. igénypont szerint előállított hibridómákat megfelelő körülmények között tenyésztjük, és a termelt antitesteket kinyerjük.
  13. 13. A10. igénypont szerinti eljárás olyan monoklonális antitest előállítására, amely egy IgM típusú immunoglobulin molekula, azzal jellemezve, hogy a 4-7. igénypontok bármelyike szerint előállított hibridómákat megfelelő körülmények között tenyésztjük, és a termelt antitesteket kinyerjük.
HU885935A 1987-11-17 1988-11-16 Process for producing monoclone antibodies recognizing alpha-2-3 bonds of n-acetyl-neuraminic acid HU204573B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP62290310A JP2754206B2 (ja) 1987-11-17 1987-11-17 α２→３結合を認識するモノクローナル抗体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT48679A HUT48679A (en) 1989-06-28
HU204573B true HU204573B (en) 1992-01-28

Family

ID=17754449

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU885935A HU204573B (en) 1987-11-17 1988-11-16 Process for producing monoclone antibodies recognizing alpha-2-3 bonds of n-acetyl-neuraminic acid

Country Status (14)

Country Link
US (1) US5141864A (hu)
EP (1) EP0316882B1 (hu)
JP (1) JP2754206B2 (hu)
KR (1) KR960014441B1 (hu)
CN (1) CN1042734A (hu)
AT (1) ATE108482T1 (hu)
AU (1) AU624583B2 (hu)
CA (1) CA1337800C (hu)
DE (1) DE3850634T2 (hu)
FI (1) FI95043C (hu)
HU (1) HU204573B (hu)
IL (1) IL88400A (hu)
NO (1) NO173556C (hu)
NZ (1) NZ226974A (hu)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4107154A1 (de) * 1990-10-11 1992-04-16 Boehringer Mannheim Gmbh Monoklonale antikoerper gegen melanom
DE4208795A1 (de) * 1992-03-19 1993-09-23 Behringwerke Ag Monoklonaler anti-gangliosid-antikoerper, seine herstellung und verwendung als tumortherapeutikum
CN1057128C (zh) * 1993-09-22 2000-10-04 南通医学院 感觉神经抗体及其制备方法
US5674681A (en) * 1994-12-06 1997-10-07 Rothenberg; Barry E. Methods to identify hemochromatosis
CU23007A1 (es) * 2001-04-06 2004-12-17 Ct De Inmunologia Molecular Ct De Inmunologia Mole Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos
WO2004087911A1 (ja) * 2003-03-28 2004-10-14 Toyama New Industry Organization １個の抗原特異的ｂリンパ球を用いた抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法及びモノクローナル抗体の製造方法
FI20070199A0 (fi) * 2007-03-08 2007-03-08 Glykos Finland Oy Uusia happamia N-glykaanirakenteita
EP2606897A1 (en) * 2011-12-22 2013-06-26 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Methods and compositions for the treatment of diseases caused by enveloped viruses

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4507391A (en) * 1982-04-02 1985-03-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method for detecting the presence of GD3 ganglioside

Also Published As

Publication number Publication date
AU624583B2 (en) 1992-06-18
JP2754206B2 (ja) 1998-05-20
NO173556C (no) 1993-12-29
KR960014441B1 (ko) 1996-10-15
DE3850634D1 (de) 1994-08-18
ATE108482T1 (de) 1994-07-15
NO173556B (no) 1993-09-20
FI885279A (fi) 1989-05-18
KR890008320A (ko) 1989-07-10
NZ226974A (en) 1990-03-27
IL88400A (en) 1993-06-10
HUT48679A (en) 1989-06-28
EP0316882A3 (en) 1990-03-14
EP0316882A2 (en) 1989-05-24
EP0316882B1 (en) 1994-07-13
NO885113L (no) 1989-05-18
CA1337800C (en) 1995-12-26
NO885113D0 (no) 1988-11-16
AU2518688A (en) 1989-05-25
FI95043C (fi) 1995-12-11
FI885279A0 (fi) 1988-11-15
JPH01132374A (ja) 1989-05-24
FI95043B (fi) 1995-08-31
DE3850634T2 (de) 1994-10-27
US5141864A (en) 1992-08-25
CN1042734A (zh) 1990-06-06
IL88400A0 (en) 1989-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7291343B2 (en) Enterococcus antigens and vaccines
US5240833A (en) Method for the production of monoclonal antibodies directed to tumor-associated gangliosides and fucogangliosides
EP0381310A1 (en) Monoclonal antibodies directed to tumor-associated gangliosides and fucogangliosides and method for production thereof
Ito et al. Carbohydrates as antigenic determinants of tumor‐associated antigens recognized by monoclonal anti‐tumor antibodies produced in a syngeneic system
HU204573B (en) Process for producing monoclone antibodies recognizing alpha-2-3 bonds of n-acetyl-neuraminic acid
US5158886A (en) Monoclonal antibodies specific for free N-acetylfuraminic acid and beta-glycosides and beta-glycoconjugates thereof
EP0368222A1 (en) Anti-fucosylceramide monoclonal antibody
EP0369425A1 (en) Monoclonal antibody specifically recognizing N-glycolyl type GM2, hybridoma producing the antibody and method for preparing the hybridoma
JP2706777B2 (ja) 非天然型ｇｄ▲下３▼を認識するモノクローナル抗体
EP0351731B1 (en) Monoclonal antibodies capable of recognizing gangliosides GQ1b and GT1a
US5443957A (en) Anti-asialo-GM1 monoclonal antibodies and method of use
EP0295305A1 (en) Monoclonal antibody specific to tumor cell surface ganglioside and hybridoma yielding same
JP2743015B2 (ja) Ｏ―アセチル化されたガングリオシドｇｍ▲下３▼に特異的なモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及びその作製方法
HUT52167A (en) Process for producing monoclonal antibody capable of recognizing sulfated glycolipids

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee