JP2706777B2 - 非天然型ｇｄ▲下３▼を認識するモノクローナル抗体 - Google Patents
非天然型ｇｄ▲下３▼を認識するモノクローナル抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なハイブリドーマ、その製造法および
それによって産生される抗シアル酸糖脂質類モノクロー
ナル抗体に関する。
それによって産生される抗シアル酸糖脂質類モノクロー
ナル抗体に関する。
糖鎖抗原、とりわけ糖脂質抗原が癌抗原として重要で
あることが最近モノクローナル抗体の技術の発達にとも
ない判明してきた。糖脂質抗原に対するモノクローナル
抗体を樹立することは、癌の診断および治療にとって有
用であると考えられるに至っている。しかしながら、糖
脂質によっては天然界の材料からモノクローナル抗体の
樹立に必要な量を精製することがほとんど不可能な微細
成分のものもある。また、その存在が十分に予想されな
がら、未だ天然界からは分離精製されていないようなも
のもある。このような糖脂質抗原に対してモノクローナ
ル抗体を作成するためには、目的の糖脂質を人工的に合
成してこれに対して抗体の作成を試みるという方法があ
る。また、癌抗原として重要な糖鎖抗原の中には、糖脂
質にはその存在が知られていないが、糖蛋白質には存在
していることが知られているものもある。このような糖
鎖抗原に対するモノクローナル抗体を作成する際には、
糖蛋白を免疫したのでは抗体の作成効率が極めて低いこ
とが知られており、同じ糖鎖を有する糖脂質を合成して
これを免疫原に用いる方が、より容易に抗体を作成でき
ると予測される。糖蛋白よりも、糖脂質に対するモノク
ローナル抗体の作成法の方が、現状ではより確立してい
るためである。したがって、かかる現状に鑑み、稀抗
原、例えば癌関連糖脂質抗原に対するモノクローナル抗
体を得る新規な方法およびモノクローナル抗体自体に対
する要求が存在し続けている。
あることが最近モノクローナル抗体の技術の発達にとも
ない判明してきた。糖脂質抗原に対するモノクローナル
抗体を樹立することは、癌の診断および治療にとって有
用であると考えられるに至っている。しかしながら、糖
脂質によっては天然界の材料からモノクローナル抗体の
樹立に必要な量を精製することがほとんど不可能な微細
成分のものもある。また、その存在が十分に予想されな
がら、未だ天然界からは分離精製されていないようなも
のもある。このような糖脂質抗原に対してモノクローナ
ル抗体を作成するためには、目的の糖脂質を人工的に合
成してこれに対して抗体の作成を試みるという方法があ
る。また、癌抗原として重要な糖鎖抗原の中には、糖脂
質にはその存在が知られていないが、糖蛋白質には存在
していることが知られているものもある。このような糖
鎖抗原に対するモノクローナル抗体を作成する際には、
糖蛋白を免疫したのでは抗体の作成効率が極めて低いこ
とが知られており、同じ糖鎖を有する糖脂質を合成して
これを免疫原に用いる方が、より容易に抗体を作成でき
ると予測される。糖蛋白よりも、糖脂質に対するモノク
ローナル抗体の作成法の方が、現状ではより確立してい
るためである。したがって、かかる現状に鑑み、稀抗
原、例えば癌関連糖脂質抗原に対するモノクローナル抗
体を得る新規な方法およびモノクローナル抗体自体に対
する要求が存在し続けている。
本発明は癌関連糖脂質抗原に対するモノクローナル抗
体を産生する新規なハイブリドーマ、その製造法および
それによって産生される抗シアル酸糖脂質類モノクロー
ナル抗体を提供することである。
体を産生する新規なハイブリドーマ、その製造法および
それによって産生される抗シアル酸糖脂質類モノクロー
ナル抗体を提供することである。
すなわち、本発明者らは、糖脂質抗原ガングリオシド
NeuAcα２→9NeuAcα２→6Galβ１→4Glcβ１→Cerを化
学合成し、かかるガングリオシドに対するモノクローナ
ル抗体の樹立を試み、数種のモノクローナル抗体を得る
ことに成功し、本発明を完成した。
NeuAcα２→9NeuAcα２→6Galβ１→4Glcβ１→Cerを化
学合成し、かかるガングリオシドに対するモノクローナ
ル抗体の樹立を試み、数種のモノクローナル抗体を得る
ことに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、エピトープ（抗原決定基）とし
てNeuAcα２→9NeuAc末端を含有するシアル酸糖脂質に
特異性を有するモノクローナル抗体（以下、抗体Ａとい
う）、エピトープ（抗原決定基）としてNeuAcα２→9Ne
uAc末端またはNeuAcα２→6Galβ末端を含有するシアル
酸糖脂質に特異性を有するモノクローナル抗体（以下、
抗体Ｂという）、およびエピトープ（抗原決定基）とし
てNeuAcα２→9NeuAc末端、NeuAcα２→6Galβ末端およ
びNeuAcα２→1Cerから選ばれる少なくとも１種を含有
するシアル酸糖脂質に特異性を有するモノクローナル抗
体（以下、抗体Ｃという）に関し、加えて、本発明は、
抗体Ａ、抗体Ｂまたは抗体Ｃを産生するハイブリドーマ
に関し、加えて、本発明は、NeuAcα２→9NeuAc末端、N
euAcα２→6Galβ末端およびNeuAcα２→1Cerから選ば
れる少くとも１種を含有するシアル酸糖脂質を抗原とし
て動物に免疫して得られるＢ細胞（リンパ球）と骨髄腫
細胞とを細胞融合することを特徴とするハイブリドーマ
の製造法に関する。
てNeuAcα２→9NeuAc末端を含有するシアル酸糖脂質に
特異性を有するモノクローナル抗体（以下、抗体Ａとい
う）、エピトープ（抗原決定基）としてNeuAcα２→9Ne
uAc末端またはNeuAcα２→6Galβ末端を含有するシアル
酸糖脂質に特異性を有するモノクローナル抗体（以下、
抗体Ｂという）、およびエピトープ（抗原決定基）とし
てNeuAcα２→9NeuAc末端、NeuAcα２→6Galβ末端およ
びNeuAcα２→1Cerから選ばれる少なくとも１種を含有
するシアル酸糖脂質に特異性を有するモノクローナル抗
体（以下、抗体Ｃという）に関し、加えて、本発明は、
抗体Ａ、抗体Ｂまたは抗体Ｃを産生するハイブリドーマ
に関し、加えて、本発明は、NeuAcα２→9NeuAc末端、N
euAcα２→6Galβ末端およびNeuAcα２→1Cerから選ば
れる少くとも１種を含有するシアル酸糖脂質を抗原とし
て動物に免疫して得られるＢ細胞（リンパ球）と骨髄腫
細胞とを細胞融合することを特徴とするハイブリドーマ
の製造法に関する。
本発明をさらに詳細に説明する。
本発明のハイブリドーマは、ケラー等の方法、すなわ
ち、抗原を動物に免疫して、得られるＢ細胞（リンパ
球）と骨髄腫細胞とを細胞融合させることにより調製さ
れる。ここで、本発明に使用される「抗原」としては、
エピトープとしてNeuAcα２→9NeuAc末端、NeuAcα２→
6Galβ末端およびNeuAcα２→1Cerから選ばれる少なく
とも１種を含有するシアル酸糖脂質、好ましくは、ガン
グリオシドNeuAcα２→9NeuAcα２→6Galβ１→4Glcβ
１→1Cer（非天然型GD3）を挙げることができる。
ち、抗原を動物に免疫して、得られるＢ細胞（リンパ
球）と骨髄腫細胞とを細胞融合させることにより調製さ
れる。ここで、本発明に使用される「抗原」としては、
エピトープとしてNeuAcα２→9NeuAc末端、NeuAcα２→
6Galβ末端およびNeuAcα２→1Cerから選ばれる少なく
とも１種を含有するシアル酸糖脂質、好ましくは、ガン
グリオシドNeuAcα２→9NeuAcα２→6Galβ１→4Glcβ
１→1Cer（非天然型GD3）を挙げることができる。
本発明のハイブリドーマから産生されるモノクローナ
ル抗体は上記したガングリオシド糖脂質類のうちエピト
ープ（抗原決定基）としてNeuAcα２→9NeuAc末端、Neu
Acα２→6Galβ末端およびNeuAcα２→1Cerから選ばれ
る少なくとも１種を認識し、特異的に反応する。したが
って、本発明のハイブリドーマから産生されるモノクロ
ーナル抗体は、上記エピトープを含有するシアル酸糖脂
質であればいずれのものでも高い特異性を有する。ま
た、これらのシアル酸糖脂質を有する動物であれば、特
に動物種に限定されることなく、本発明のモノクローナ
ル抗体に対して同様な特異性を有する。
ル抗体は上記したガングリオシド糖脂質類のうちエピト
ープ（抗原決定基）としてNeuAcα２→9NeuAc末端、Neu
Acα２→6Galβ末端およびNeuAcα２→1Cerから選ばれ
る少なくとも１種を認識し、特異的に反応する。したが
って、本発明のハイブリドーマから産生されるモノクロ
ーナル抗体は、上記エピトープを含有するシアル酸糖脂
質であればいずれのものでも高い特異性を有する。ま
た、これらのシアル酸糖脂質を有する動物であれば、特
に動物種に限定されることなく、本発明のモノクローナ
ル抗体に対して同様な特異性を有する。
次に、上記したシアル酸糖脂質を抗原として免疫され
る「動物」としては、ウサギ、ヒト、マウス、ラット等
ほとんどの動物が使用でき、好ましくはマウス、より好
ましくはBalb/cマウスである。しかして、得られるＢ細
胞（リンパ球）は、本発明のモノクローナル抗体を産生
する細胞であり、好ましくは、脾臓細胞を用いる。
る「動物」としては、ウサギ、ヒト、マウス、ラット等
ほとんどの動物が使用でき、好ましくはマウス、より好
ましくはBalb/cマウスである。しかして、得られるＢ細
胞（リンパ球）は、本発明のモノクローナル抗体を産生
する細胞であり、好ましくは、脾臓細胞を用いる。
一方、「骨髄腫細胞」としては、各種動物、例えば、
ヒト、マウス、ラット、ウサギなどほとんどすべての動
物由来のミエローマ細胞を包含するものであり、好まし
くは、マウス由来のミエローマ細胞、より好ましくは、
Balb/cマウス由来のX63−Ag8.653ミエローマ細胞が使用
できる。これらのミエローマ細胞は、上記Ｂ細胞と細胞
融合させた本発明のハイブリドーマ（受託番号HB 947
3、HB 9474およびHB 9551（ATCC））からモノクロー
ナル抗体を産生するための活発な増殖能力を有するもの
である。
ヒト、マウス、ラット、ウサギなどほとんどすべての動
物由来のミエローマ細胞を包含するものであり、好まし
くは、マウス由来のミエローマ細胞、より好ましくは、
Balb/cマウス由来のX63−Ag8.653ミエローマ細胞が使用
できる。これらのミエローマ細胞は、上記Ｂ細胞と細胞
融合させた本発明のハイブリドーマ（受託番号HB 947
3、HB 9474およびHB 9551（ATCC））からモノクロー
ナル抗体を産生するための活発な増殖能力を有するもの
である。
次に、本発明のハイブリドーマの製造法について詳述
する。
する。
まず、上記した抗原、例えばガングリオシドNeuAcα
２→9NeuAcα２→6Galβ１→4Glcβ１→1Cerなどを免疫
原としてマウスの筋肉、皮下、腹腔内、好ましくは腹腔
内に免疫する。この免疫の際、アジュバント、すなわち
免疫増強剤としては不完全アジュバントまたは完全アジ
ュバントのいずれも使用でき、例えば、油、乳化剤、結
核死菌、サルモネラ死菌およびこれらの混合物であり、
好ましくはサルモネラ・ミネソタ死菌が使用できる。ま
た、これらの抗原およびアジュバントは、生理的条件に
近い溶液、例えばリン酸緩衝液生理食塩水を用いるのが
好ましい。
２→9NeuAcα２→6Galβ１→4Glcβ１→1Cerなどを免疫
原としてマウスの筋肉、皮下、腹腔内、好ましくは腹腔
内に免疫する。この免疫の際、アジュバント、すなわち
免疫増強剤としては不完全アジュバントまたは完全アジ
ュバントのいずれも使用でき、例えば、油、乳化剤、結
核死菌、サルモネラ死菌およびこれらの混合物であり、
好ましくはサルモネラ・ミネソタ死菌が使用できる。ま
た、これらの抗原およびアジュバントは、生理的条件に
近い溶液、例えばリン酸緩衝液生理食塩水を用いるのが
好ましい。
このように免疫する際の注意点は、免疫に用いる動物
は、自己成分に対して免疫感作が困難であるため原則と
して、抗原に用いる物質を得た動物より系統発生的に遠
縁の動物種を選ぶのが好ましい。しかし、これらの困難
を回避するためイン・ビトロ（in vitro）においても免
疫することができる。
は、自己成分に対して免疫感作が困難であるため原則と
して、抗原に用いる物質を得た動物より系統発生的に遠
縁の動物種を選ぶのが好ましい。しかし、これらの困難
を回避するためイン・ビトロ（in vitro）においても免
疫することができる。
次に、上記で得られたＢ細胞とミエローマ細胞とを細
胞融合する。
胞融合する。
ここで、融合剤としては、ポリエチレングリコール、
HVJ等が使用でき、好ましくはポリエチレングリコール4
000である。
HVJ等が使用でき、好ましくはポリエチレングリコール4
000である。
また、培養液としては、ハイブリドーマ細胞とミエロ
ーマ細胞を選択するためHAT培地を使用するのが好まし
い。さらに、得られたハイブリドーマをクローニング
法、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、また
は限界希釈法を用いてクローニングし、それらの細胞に
抗体を産生させる。
ーマ細胞を選択するためHAT培地を使用するのが好まし
い。さらに、得られたハイブリドーマをクローニング
法、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、また
は限界希釈法を用いてクローニングし、それらの細胞に
抗体を産生させる。
かくして得られたモノクローナル抗体の抗体価を、常
法により測定し、抗体価の大きい抗体を産生するハイブ
リドーマを選択して保存する。
法により測定し、抗体価の大きい抗体を産生するハイブ
リドーマを選択して保存する。
〔発明の効果〕 本発明のハイブリドーマから産生されるモノクローナ
ル抗体は、ヒトまたは動物の癌組織中の天然存在糖脂質
抗原の検出に使用できる。したがって、本発明によるモ
ノクローナル抗体は、癌関連ガングリオシド糖脂質の検
出に通常用いられる方法、例えば、ELISA、RIAなどに使
用できる。また、本発明によるモノクローナル抗体をア
フィニティークロマトグラフィーに用いて、結合性抗原
を精製することができる。さらに、放射性同位元素で標
識したモノクローナル抗体を腫瘍の検出または局在化の
検知に、また高用量で腫瘍の治療処置に用いることがで
きる。さらに、化学療法薬をモノクローナル抗体に結合
させて癌細胞に対するその毒性を高めることができる。
抗原を有する種、例えばヒトおよびマウスなどの動物に
本発明のモノクローナル抗体を用いる治療または診断試
験に供することができる。
ル抗体は、ヒトまたは動物の癌組織中の天然存在糖脂質
抗原の検出に使用できる。したがって、本発明によるモ
ノクローナル抗体は、癌関連ガングリオシド糖脂質の検
出に通常用いられる方法、例えば、ELISA、RIAなどに使
用できる。また、本発明によるモノクローナル抗体をア
フィニティークロマトグラフィーに用いて、結合性抗原
を精製することができる。さらに、放射性同位元素で標
識したモノクローナル抗体を腫瘍の検出または局在化の
検知に、また高用量で腫瘍の治療処置に用いることがで
きる。さらに、化学療法薬をモノクローナル抗体に結合
させて癌細胞に対するその毒性を高めることができる。
抗原を有する種、例えばヒトおよびマウスなどの動物に
本発明のモノクローナル抗体を用いる治療または診断試
験に供することができる。
（Ａ） サンプルの製造 （１）ガングリオシドNeuAcα２→9NeuAcα２→6Galβ
１→4Glcβ→1Cer（化合物（ａ））の製造法 次ページ以下の製造工程ダイヤフラムに従って製造し
た（詳細は特願昭61−157647号参照）。
１→4Glcβ→1Cer（化合物（ａ））の製造法 次ページ以下の製造工程ダイヤフラムに従って製造し
た（詳細は特願昭61−157647号参照）。
（２）抗原溶液の調製 化学合成した化合物（ａ）1mgに200μのエタノール
を加えアジュバントとして酢酸処理したサルモネラ・ミ
ネソタ（Salmonella minesota）R595 4mgとを50℃の水
溶中50分間インキュベートした後リン酸緩衝生理食塩水
（PBS（−）、Ca、Mgを除いた）0.8ml中にて混合して抗
原溶液とした。
を加えアジュバントとして酢酸処理したサルモネラ・ミ
ネソタ（Salmonella minesota）R595 4mgとを50℃の水
溶中50分間インキュベートした後リン酸緩衝生理食塩水
（PBS（−）、Ca、Mgを除いた）0.8ml中にて混合して抗
原溶液とした。
（３）実験動物 メスの６週令Balb/cマウスを通常飼育にて実験に使用
した。
した。
（４）培 地 RPMI培地：ニッスイRPMI−1640を使用した。使用時
にカナマイシン硫酸塩を最終濃度50μg/ml、牛胎児血清
（FBS）を10％となる様調製し、５％CO2存在下で37℃で
24時間培養した。
にカナマイシン硫酸塩を最終濃度50μg/ml、牛胎児血清
（FBS）を10％となる様調製し、５％CO2存在下で37℃で
24時間培養した。
HAT培地：チミジン0.0388gとヒポキサンチン0.1361g
とを蒸留水100mlに加熱融解し、100倍濃度の保存溶液と
し−20℃で保存した。同様に0.0176gのアミノプテリン
を蒸留水100mlに少量の1N水酸化ナトリウム水溶液を加
えて溶かし、これをRPMI−1640培地にて10倍に希釈し、
100倍濃度の保存液として−20℃で遮光して保存した。
使用時には、10％FBS含有RPMI−1640培地にそれぞれ1/1
00量ずつ加え、HAT培地とした。
とを蒸留水100mlに加熱融解し、100倍濃度の保存溶液と
し−20℃で保存した。同様に0.0176gのアミノプテリン
を蒸留水100mlに少量の1N水酸化ナトリウム水溶液を加
えて溶かし、これをRPMI−1640培地にて10倍に希釈し、
100倍濃度の保存液として−20℃で遮光して保存した。
使用時には、10％FBS含有RPMI−1640培地にそれぞれ1/1
00量ずつ加え、HAT培地とした。
HT培地：チミジンおよびヒポキサンチン保存液のみを
1/100量加え使用した。６−チオグアニンを３μg/mlの
濃度となる様に加える事により突然変異体の出現を阻止
した。
1/100量加え使用した。６−チオグアニンを３μg/mlの
濃度となる様に加える事により突然変異体の出現を阻止
した。
（Ｂ） ハイブリドーマの製造 （１）免疫法 前記マウスの腹腔内に前記抗原溶液を化合物（ａ）量
で０日目５μｇ、４日目15μｇ、７日目20μｇ、12日目
25μｇ、26日目35μｇを使い免疫した。５回目の免疫
後、脾細胞リンパ球をマウスから取り出し、次に単一細
胞の懸濁液をつくった。
で０日目５μｇ、４日目15μｇ、７日目20μｇ、12日目
25μｇ、26日目35μｇを使い免疫した。５回目の免疫
後、脾細胞リンパ球をマウスから取り出し、次に単一細
胞の懸濁液をつくった。
（２）細胞融合法 上記で得られた脾細胞リンパ球とマウスミエローマ細
胞との細胞融合をケラーおよびミルシュタインの方法に
従って実施した。すなわち、１×108個の脾細胞リンパ
球を、無血清RPMI−1640培地中で50％のポリエチレング
リコール（PEG4000）の存在下で、１×107個のミエロー
マ細胞と融合した。
胞との細胞融合をケラーおよびミルシュタインの方法に
従って実施した。すなわち、１×108個の脾細胞リンパ
球を、無血清RPMI−1640培地中で50％のポリエチレング
リコール（PEG4000）の存在下で、１×107個のミエロー
マ細胞と融合した。
（３）ハイブリドーマの選択および成長 細胞の融合後、得られた細胞をHAT培地（ヒポキサン
チン、アミノプテリンおよびチミジン）中で37℃におい
て５％のCO2を使用して培養した。
チン、アミノプテリンおよびチミジン）中で37℃におい
て５％のCO2を使用して培養した。
（Ｃ） モノクローナル抗体とガングリオシド糖脂質と
の反応性の評価 化合物（ａ）に対する抗体活性を示すハイブリドーマ
をクローニングし、得られたハイブリドーマ（受託番号
HB 9473、HB 9474およびHB 9551（ATCC））の培養液
について次の（ａ）〜（ｆ）に示すガングリオシド糖脂
質との反応性を酵素抗体法により調べた。
の反応性の評価 化合物（ａ）に対する抗体活性を示すハイブリドーマ
をクローニングし、得られたハイブリドーマ（受託番号
HB 9473、HB 9474およびHB 9551（ATCC））の培養液
について次の（ａ）〜（ｆ）に示すガングリオシド糖脂
質との反応性を酵素抗体法により調べた。
（ａ）NeuAcα２→9NeuAcα２→6Galβ１→4Glcβ１→1
Cer （ｂ）NeuAcα２→9NeuAcα２→1Cer （ｃ）NeuAcα２→6Galβ１→4Glcβ１→1Cer （ｄ）NeuAcα２→6Galβ１→4GlcNAcβ１→3Galβ１→
4Glcβ１→1Cer （ｅ）NeuAcα２→3Galβ１→4GlcNAcβ１→3Galβ１→
4Glcβ１→1Cer （ｆ）NeuAcα２→1Cer （１）酵素抗体法（ELISA法） 96穴式平底プレート（ファルコン社製）をエタノール
で前処理して実験に使用した。至適濃度50μg/mlとした
糖脂質のエタノール溶液20μを各プレートの１ウェル
に分注し蒸発させた後、１％卵白アルブミンPBS（−）
溶液100μを加え30分間室温に放置した。プレートを
下向きに振って溶液を除いた後、一次抗体を50μ加え
室温に１時間30分放置した。同様にしてプレートから一
次抗体を除きPBS（−）溶液150μを加え３回ウェルを
洗浄した後に１％卵白アルブミンPBS（−）溶液100μ
を加え30分間放置した。この溶液を除いた後に１％卵白
アルブミンPBS（−）にて至適濃度に希釈した二次抗体5
0μを加え室温で１時間30分放置した。一次抗体と同
様にPBS（−）で３回ウェルを洗浄し反応溶液100μを
ウェルに注ぎ暗所にて反応を進行させた。反応溶液とし
てはクエン酸−リン酸緩衝液（pH＝５）にオルトフェニ
レンジアミン、過酸化水素水を最終濃度がそれぞ0.4mg/
ml、0.01％となる様に添加し、実験に使用した。反応は
8N硫酸を30μ加えて停止させ、500nmの吸収波長にて
比色測定を行った。一次抗体としてハイブリドーマ培養
液またはモノクローナル抗体を使用し二次抗体としては
西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ヤギ抗マウスI
G.M.A.抗体を使用した。
Cer （ｂ）NeuAcα２→9NeuAcα２→1Cer （ｃ）NeuAcα２→6Galβ１→4Glcβ１→1Cer （ｄ）NeuAcα２→6Galβ１→4GlcNAcβ１→3Galβ１→
4Glcβ１→1Cer （ｅ）NeuAcα２→3Galβ１→4GlcNAcβ１→3Galβ１→
4Glcβ１→1Cer （ｆ）NeuAcα２→1Cer （１）酵素抗体法（ELISA法） 96穴式平底プレート（ファルコン社製）をエタノール
で前処理して実験に使用した。至適濃度50μg/mlとした
糖脂質のエタノール溶液20μを各プレートの１ウェル
に分注し蒸発させた後、１％卵白アルブミンPBS（−）
溶液100μを加え30分間室温に放置した。プレートを
下向きに振って溶液を除いた後、一次抗体を50μ加え
室温に１時間30分放置した。同様にしてプレートから一
次抗体を除きPBS（−）溶液150μを加え３回ウェルを
洗浄した後に１％卵白アルブミンPBS（−）溶液100μ
を加え30分間放置した。この溶液を除いた後に１％卵白
アルブミンPBS（−）にて至適濃度に希釈した二次抗体5
0μを加え室温で１時間30分放置した。一次抗体と同
様にPBS（−）で３回ウェルを洗浄し反応溶液100μを
ウェルに注ぎ暗所にて反応を進行させた。反応溶液とし
てはクエン酸−リン酸緩衝液（pH＝５）にオルトフェニ
レンジアミン、過酸化水素水を最終濃度がそれぞ0.4mg/
ml、0.01％となる様に添加し、実験に使用した。反応は
8N硫酸を30μ加えて停止させ、500nmの吸収波長にて
比色測定を行った。一次抗体としてハイブリドーマ培養
液またはモノクローナル抗体を使用し二次抗体としては
西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ヤギ抗マウスI
G.M.A.抗体を使用した。
第１図および第２図にハイブリドーマ培養液中のモノ
クローナル抗体と（ａ）〜（ｆ）で示されるガングリオ
シド糖脂質との反応結果を示す。第１図（イ）と第２図
（ホ）、第１図（ロ）と第２図（ヘ）、第１図（ハ）と
第２図（ト）はそれぞれ同一のモノクローナル抗体につ
いて得られた結果であり、第１図（ニ）および第２図
（チ）は天然糖脂質に対して得られたNeuAcα２→6Gal
βに特異性を示すモノクローナル抗体を対照として実験
に用い、化合物（ａ）〜（ｄ）との反応特異性を調べた
結果を示す。
クローナル抗体と（ａ）〜（ｆ）で示されるガングリオ
シド糖脂質との反応結果を示す。第１図（イ）と第２図
（ホ）、第１図（ロ）と第２図（ヘ）、第１図（ハ）と
第２図（ト）はそれぞれ同一のモノクローナル抗体につ
いて得られた結果であり、第１図（ニ）および第２図
（チ）は天然糖脂質に対して得られたNeuAcα２→6Gal
βに特異性を示すモノクローナル抗体を対照として実験
に用い、化合物（ａ）〜（ｄ）との反応特異性を調べた
結果を示す。
第１図および第２図から第１図（イ）と第２図（ホ）
で使用したモノクローナル抗体（ハイブリドーマ受託番
号HB 9473（ATCC））はエピトープとしてNeuAcα２→9
NeuAc末端および／またはNeuAcα６→6Galβ末端を認識
しているから本発明の抗体Ｂであり、第１図（ロ）と第
２図（ヘ）のモノクローナル抗体（ハイブリドーマ受託
番号HB 9474（ATCC））はエピトープとしてNeuAcα２
→9NeuAc末端、NeuAcα２→6Galβ末端およびNeuAcα２
→1Cerから選ばれる少くとも１種を認識しているから本
発明の抗体Ｃであることがわかる。このことから本発明
のモノクローナル抗体Ｃは特に類縁構造を有する各種天
然および合成糖脂質とある程度の交差反応性を示す広汎
な特異性を示すことがわかる。また、第１図（ハ）およ
び第２図（ヘ）のモノクローナル抗体（ハイブリドーマ
受託番号HB 9551（ATCC））はエピトープとしてNeuAc
α２→9NeuAc末端を認識しているから本発明のモノクロ
ーナル抗体Ａであることがわかる。
で使用したモノクローナル抗体（ハイブリドーマ受託番
号HB 9473（ATCC））はエピトープとしてNeuAcα２→9
NeuAc末端および／またはNeuAcα６→6Galβ末端を認識
しているから本発明の抗体Ｂであり、第１図（ロ）と第
２図（ヘ）のモノクローナル抗体（ハイブリドーマ受託
番号HB 9474（ATCC））はエピトープとしてNeuAcα２
→9NeuAc末端、NeuAcα２→6Galβ末端およびNeuAcα２
→1Cerから選ばれる少くとも１種を認識しているから本
発明の抗体Ｃであることがわかる。このことから本発明
のモノクローナル抗体Ｃは特に類縁構造を有する各種天
然および合成糖脂質とある程度の交差反応性を示す広汎
な特異性を示すことがわかる。また、第１図（ハ）およ
び第２図（ヘ）のモノクローナル抗体（ハイブリドーマ
受託番号HB 9551（ATCC））はエピトープとしてNeuAc
α２→9NeuAc末端を認識しているから本発明のモノクロ
ーナル抗体Ａであることがわかる。
本実施例の結果から本発明のモノクローナル抗体Ｃは
特に、類縁構造を有する各種天然および合成糖脂質とあ
る程度の交差反応性を示す広汎な反応特異性を示すこと
がわかる。したがって、糖鎖抗原は一般に互いに重複す
る複数の抗原エピトープを分子表面に所有しており、こ
れに対する免疫応答の複雑性を示す所見であると考えら
れる。
特に、類縁構造を有する各種天然および合成糖脂質とあ
る程度の交差反応性を示す広汎な反応特異性を示すこと
がわかる。したがって、糖鎖抗原は一般に互いに重複す
る複数の抗原エピトープを分子表面に所有しており、こ
れに対する免疫応答の複雑性を示す所見であると考えら
れる。
第１図および第２図は酵素抗体法による抗原に対するモ
ノクローナル抗体の特異性を示す。
ノクローナル抗体の特異性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】NeuAcα２→9NeuAc末端、NeuAcα２→6Gal
β末端およびNeuAcα２→1Cerから選ばれる少なくとも
１種を含有するシアル酸糖脂質に特異性を有するモノク
ローナル抗体であって、NeuAcα２→9NeuAc末端、NeuAc
α２→6Galβ末端およびNeuAcα２→1Cerから選ばれる
少なくとも１種をエピトープとするモノクローナル抗
体。 - 【請求項２】請求項１に記載のモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ。 - 【請求項３】請求項１に記載のモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマの製造法であって、 （Ａ） NeuAcα２→9NeuAc末端、NeuAcα２→6Galβ末
端およびNeuAcα２→1Cerから選ばれる少なくとも１種
を含有するシアル酸糖脂質を抗原として非ヒト動物に免
疫して得られるＢ細胞と （Ｂ） 骨髄腫細胞とを 細胞融合することを特徴とするハイブリドーマの製造
法。 - 【請求項４】シアル酸糖脂質がNeuAcα２→9NeuAcα２
→6Galβ１→4Glcβ１→1Cerを有するガングリオシドで
ある請求項３に記載のハイブリドーマの製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63037068A JP2706777B2 (ja) | 1988-02-19 | 1988-02-19 | 非天然型ｇｄ▲下３▼を認識するモノクローナル抗体 |
| US07/310,654 US5173420A (en) | 1988-02-19 | 1989-02-15 | Monoclonal antibody recognizing un-natural ganglioside gd3 |
| CA000591114A CA1316848C (en) | 1988-02-19 | 1989-02-15 | Monoclonal antibody recognizing un-natural ganglioside gd |
| IL89308A IL89308A (en) | 1988-02-19 | 1989-02-16 | Monoclonal antibodies exhibiting specificity to sialic acid glycolipid, hybridomas for producing said monoclonal antibodies and a process for preparing the hybridomas |
| EP19890102786 EP0332879A3 (en) | 1988-02-19 | 1989-02-17 | Monoclonal antibody recognizing un-natural ganglioside gd3 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63037068A JP2706777B2 (ja) | 1988-02-19 | 1988-02-19 | 非天然型ｇｄ▲下３▼を認識するモノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01211499A JPH01211499A (ja) | 1989-08-24 |
| JP2706777B2 true JP2706777B2 (ja) | 1998-01-28 |
Family
ID=12487231
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63037068A Expired - Lifetime JP2706777B2 (ja) | 1988-02-19 | 1988-02-19 | 非天然型ｇｄ▲下３▼を認識するモノクローナル抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5173420A (ja) |
| EP (1) | EP0332879A3 (ja) |
| JP (1) | JP2706777B2 (ja) |
| CA (1) | CA1316848C (ja) |
| IL (1) | IL89308A (ja) |
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| US6762032B1 (en) * | 1999-08-23 | 2004-07-13 | Biocrystal, Ltd. | Compositions, assay kits, and methods for use related to a disease condition comprising multiple sclerosis and/or a pro-MS immune response |
| JP2006055141A (ja) * | 2004-08-24 | 2006-03-02 | Tokai Univ | 糖鎖構造に特異的な抗体の同定方法 |
| JP4524414B2 (ja) * | 2004-08-24 | 2010-08-18 | 学校法人東海大学 | 糖結合性ファージ提示型抗体の解析方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4507391A (en) * | 1982-04-02 | 1985-03-26 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Method for detecting the presence of GD3 ganglioside |
| US4990603A (en) * | 1986-07-04 | 1991-02-05 | Mect Corporation | Sialic acid derivatives and process therefor |
| US4844893A (en) * | 1986-10-07 | 1989-07-04 | Scripps Clinic And Research Foundation | EX vivo effector cell activation for target cell killing |
| EP0267615A3 (en) * | 1986-11-13 | 1989-05-03 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Compositions and method for treatment of cancer using monoclonal antibody against gd3 ganglioside together with il-2 |
-
1988
- 1988-02-19 JP JP63037068A patent/JP2706777B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-02-15 CA CA000591114A patent/CA1316848C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-02-15 US US07/310,654 patent/US5173420A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-02-16 IL IL89308A patent/IL89308A/xx not_active IP Right Cessation
- 1989-02-17 EP EP19890102786 patent/EP0332879A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5173420A (en) | 1992-12-22 |
| EP0332879A2 (en) | 1989-09-20 |
| CA1316848C (en) | 1993-04-27 |
| EP0332879A3 (en) | 1991-05-02 |
| IL89308A (en) | 1993-08-18 |
| JPH01211499A (ja) | 1989-08-24 |
| IL89308A0 (en) | 1989-09-10 |
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