JP2789469B2 - ガングリオシドＧＱ▲下１▼▲下ｂ▼およびＧＴ▲下１▼▲下ａ▼を認識するモノクローナル抗体 - Google Patents
ガングリオシドＧＱ▲下１▼▲下ｂ▼およびＧＴ▲下１▼▲下ａ▼を認識するモノクローナル抗体Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な抗ガングリオシド糖脂質モノクロー
ナル抗体、それを産生するハイブリドーマおよびその製
造法に関する。
ナル抗体、それを産生するハイブリドーマおよびその製
造法に関する。
1975年にケーラーらは、免疫動物の脾細胞とマウス骨
髄腫細胞を用いた細胞融合法にて抗ヒツジ赤血球抗体を
産生するハイブリドーマを得た。この様なハイブリドー
マはその特異な増殖特性を利用して１個の細胞由来のク
ローン細胞にする事（cloning）が可能であり、このク
ローニングされたハイブリドーマから産生される抗体
は、全て同一の抗体分子である。従って抗原認識部位も
同じである為、同一の抗原特異性を示し、又細胞を凍結
保存できる事から半永久的にこのモノクローナル抗体を
供給するこ事ができる。従来の抗血清は免疫動物の血清
に種々の抗原を吸収させ調製するため異なるＢリンパ球
由来の抗体分子を数多く含んでおり（ポリクローナル）
他の抗原と交差反応を示す場合が多く、このような方法
によって、特異性のすぐれた抗血清を調製するのは困難
であった。近年、上述の細胞融合法により、特定の抗原
に対して特異的な反応を示すモノクローナル抗体の作成
が可能となった。
髄腫細胞を用いた細胞融合法にて抗ヒツジ赤血球抗体を
産生するハイブリドーマを得た。この様なハイブリドー
マはその特異な増殖特性を利用して１個の細胞由来のク
ローン細胞にする事（cloning）が可能であり、このク
ローニングされたハイブリドーマから産生される抗体
は、全て同一の抗体分子である。従って抗原認識部位も
同じである為、同一の抗原特異性を示し、又細胞を凍結
保存できる事から半永久的にこのモノクローナル抗体を
供給するこ事ができる。従来の抗血清は免疫動物の血清
に種々の抗原を吸収させ調製するため異なるＢリンパ球
由来の抗体分子を数多く含んでおり（ポリクローナル）
他の抗原と交差反応を示す場合が多く、このような方法
によって、特異性のすぐれた抗血清を調製するのは困難
であった。近年、上述の細胞融合法により、特定の抗原
に対して特異的な反応を示すモノクローナル抗体の作成
が可能となった。
抗体は、抗原として知られる分子を認識しこれと結合
する能力を有するタンパク質である。モノクローナル抗
体は唯一の抗原認識部位を持つ抗体であり、ただ１種の
抗原決定基を認識する。モノクローナル抗体およびハイ
ブリドーマを生成させる多くの技術は、「単クローン性
ハイブリドーマ抗体：技術および適用（Monoclonal Hyb
ridoma Antibodies:Techniques and Applications）」
〔ハレル（John G.Hurrell）編、1983〕に詳しく述べら
れている。
する能力を有するタンパク質である。モノクローナル抗
体は唯一の抗原認識部位を持つ抗体であり、ただ１種の
抗原決定基を認識する。モノクローナル抗体およびハイ
ブリドーマを生成させる多くの技術は、「単クローン性
ハイブリドーマ抗体：技術および適用（Monoclonal Hyb
ridoma Antibodies:Techniques and Applications）」
〔ハレル（John G.Hurrell）編、1983〕に詳しく述べら
れている。
哺乳動物細胞の糖脂質（グリコリピド）は、スフィン
ゴシンという長鎖アミノアルコールに脂肪酸が酸アミド
結合したセラミドという脂質構造に、グルコース、ガラ
クトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガ
ラクトサミン、フコース、シアル酸などの糖が種々の組
み合せでクリコシド結合したもので、いわゆるスフィン
ゴ糖脂質といわれる範疇に属する。このうちシアル酸を
有するものを特にガンクリオシドと称する。
ゴシンという長鎖アミノアルコールに脂肪酸が酸アミド
結合したセラミドという脂質構造に、グルコース、ガラ
クトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガ
ラクトサミン、フコース、シアル酸などの糖が種々の組
み合せでクリコシド結合したもので、いわゆるスフィン
ゴ糖脂質といわれる範疇に属する。このうちシアル酸を
有するものを特にガンクリオシドと称する。
これらの化合物は一般に細胞脂質２重層の外側に局在
し、最近の研究によれば細胞における識別の情報の受容
と応答、レセプター機能、分化、細胞の増殖・悪性変化
・行動などにおいて重要な役割を果たしているものと考
えられている。
し、最近の研究によれば細胞における識別の情報の受容
と応答、レセプター機能、分化、細胞の増殖・悪性変化
・行動などにおいて重要な役割を果たしているものと考
えられている。
ところで、これらのガングリオシドの内、GQ1bガング
リオシドは神経細胞の生長・分化等のある種のマーカー
と考えることができる。
リオシドは神経細胞の生長・分化等のある種のマーカー
と考えることができる。
したがって、このGQb1ガングリオシドに対するモノク
ローナル抗体の作成は、そのすぐれた抗原特異性と高い
検出感度を特徴とすることから、細胞機能における糖鎖
の役割を解明し、さらに動物の発生などの研究のために
も重要な課題であった。
ローナル抗体の作成は、そのすぐれた抗原特異性と高い
検出感度を特徴とすることから、細胞機能における糖鎖
の役割を解明し、さらに動物の発生などの研究のために
も重要な課題であった。
本発明の発明は、神経細胞の生長・分化等のマーカー
として同定されているGQ1bガングリオシドに対して、特
異性を有するモノクローナル抗体、それを産生するハイ
ブリドーマ、およびその製造法を提供することにある。
として同定されているGQ1bガングリオシドに対して、特
異性を有するモノクローナル抗体、それを産生するハイ
ブリドーマ、およびその製造法を提供することにある。
本発明者らは、精製GQ1bガングリオシドを免疫原とし
て抗GQ1bガングリオシドモノクローナル抗体を作成し、
該モノクローナル抗体に対して高い特異性を有するエピ
トープ（抗原決定基）を同定し、本発明を完成した。
て抗GQ1bガングリオシドモノクローナル抗体を作成し、
該モノクローナル抗体に対して高い特異性を有するエピ
トープ（抗原決定基）を同定し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、 エピトープ（抗原決定基）： を有するガングリオシドGQ1bまたはGT1aに対して特異性
を有するモノクローナル抗体に関する。
を有するモノクローナル抗体に関する。
また、本発明は、 エピトープ（抗原決定基）： を含有するガングリオシドGQ1bまたはGT1aに対して特異
性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ（受託番号HB9714）に関する。
性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ（受託番号HB9714）に関する。
さらに、本発明は、 （Ａ）エピトープ（抗原決定基）： を含有するガングリオシド糖脂質を抗原として動物に免
疫して得られるＢ細胞（リンパ球）と （Ｂ）骨髄腫細胞とを細胞融合することを特徴とする上
記ハイブリドーマの製造法に関する。
疫して得られるＢ細胞（リンパ球）と （Ｂ）骨髄腫細胞とを細胞融合することを特徴とする上
記ハイブリドーマの製造法に関する。
本発明をさらに詳細に説明する。
本発明のハイブリドーマは、ケーラーおよびミルシュ
タイン等の方法、すなわち、抗原を動物に免疫して得ら
れるＢ細胞（リンパ球）と骨髄腫細胞とを細胞融合させ
ることにより調製される。
タイン等の方法、すなわち、抗原を動物に免疫して得ら
れるＢ細胞（リンパ球）と骨髄腫細胞とを細胞融合させ
ることにより調製される。
本発明のエピトープを含有する化合物であるGQ1bおよ
びGT2aは次の構造式を有する。
びGT2aは次の構造式を有する。
本発明のモノクローナル抗体はエピトープ（抗体決定
基）として、下記構造式 を認識し、特異的に反応する。したがって、本発明のモ
ノクローナル抗体は、上記抗原決定基を含有するガング
リオシド糖脂質、特にGQ1bガングリオシド、GT1aガング
リオシドに特に強い特異性を有している。また、ガング
リオシド糖脂質が上記抗菌、決定基を有するものであれ
ば、特に動物種に限定されることなく、本発明のモノク
ローナル抗体に対して同様な特異性を有する。
基）として、下記構造式 を認識し、特異的に反応する。したがって、本発明のモ
ノクローナル抗体は、上記抗原決定基を含有するガング
リオシド糖脂質、特にGQ1bガングリオシド、GT1aガング
リオシドに特に強い特異性を有している。また、ガング
リオシド糖脂質が上記抗菌、決定基を有するものであれ
ば、特に動物種に限定されることなく、本発明のモノク
ローナル抗体に対して同様な特異性を有する。
次に、上記したガングリオシド糖脂質を抗原として免
疫される「動物」としては、ウサギ、マウス、ラット等
ほとんどの動物が使用でき、好ましくはマウス、より好
ましくはBalb/cマウスである。しかして、得られるＢ細
胞（リンパ球）は、本発明のモノクローナル抗体を産生
する細胞であり、好ましくは、脾臓細胞を用いる。
疫される「動物」としては、ウサギ、マウス、ラット等
ほとんどの動物が使用でき、好ましくはマウス、より好
ましくはBalb/cマウスである。しかして、得られるＢ細
胞（リンパ球）は、本発明のモノクローナル抗体を産生
する細胞であり、好ましくは、脾臓細胞を用いる。
一方、「骨髄腫細胞」としては、各種動物、例えば、
マウス、ラット、ウサギなどほとんどすべての動物由来
のミエローマ細胞を包含するものであり、好ましくは、
マウス由来のミエローマ細胞、より好ましくは、Balb/c
マウス由来のX63−Ag8.653ミエローマ細胞が使用でき
る。これらのミエローマ細胞は活発な増殖能力を有し、
上記Ｂ細胞と細胞融合させて得られる本発明のハイブリ
ドーマに対して活発な増殖能力を付与するものである。
マウス、ラット、ウサギなどほとんどすべての動物由来
のミエローマ細胞を包含するものであり、好ましくは、
マウス由来のミエローマ細胞、より好ましくは、Balb/c
マウス由来のX63−Ag8.653ミエローマ細胞が使用でき
る。これらのミエローマ細胞は活発な増殖能力を有し、
上記Ｂ細胞と細胞融合させて得られる本発明のハイブリ
ドーマに対して活発な増殖能力を付与するものである。
次に、本発明のハイブリドーマの製造法について詳述
する。
する。
まず、GQ1bガングリオシドをマウスの腹腔内、皮下、
好ましくは静脈内に投与する。この免疫の際、アジュバ
ント、すなわち免疫増強剤としては不完全アジュバント
または完全アジュバントのいずれも使用でき、例えば腹
腔内、皮下投与では油、乳化剤、結核死菌、サルモネラ
死菌およびこれらの混合物、好ましくはサルモネラ・ミ
ネソタ死菌が使用できる。また、これらの抗原およびア
ジュバントは、生理的条件に近い溶液、例えばリン酸緩
衝液生理食塩水を用いるのが好ましい。
好ましくは静脈内に投与する。この免疫の際、アジュバ
ント、すなわち免疫増強剤としては不完全アジュバント
または完全アジュバントのいずれも使用でき、例えば腹
腔内、皮下投与では油、乳化剤、結核死菌、サルモネラ
死菌およびこれらの混合物、好ましくはサルモネラ・ミ
ネソタ死菌が使用できる。また、これらの抗原およびア
ジュバントは、生理的条件に近い溶液、例えばリン酸緩
衝液生理食塩水を用いるのが好ましい。
免疫に用いる動物は、自己成分に対して免疫感作が困
難であるため原則として、抗原に用いる物質を得た動物
より系統発生的に遠縁の動物種を免疫に用いる動物とし
て選ぶのが好ましい。しかし、これらの困難を回避する
ためイン・ビトロ（in vitro）においても免疫すること
ができる。
難であるため原則として、抗原に用いる物質を得た動物
より系統発生的に遠縁の動物種を免疫に用いる動物とし
て選ぶのが好ましい。しかし、これらの困難を回避する
ためイン・ビトロ（in vitro）においても免疫すること
ができる。
次に、上記で得られたＢ細胞とミエローマ細胞とを細
胞融合する。
胞融合する。
ここで、融合剤としては、ポリエチレングリコール、
HVJ等が使用でき、好ましくはポリエチレングリコール6
000である。
HVJ等が使用でき、好ましくはポリエチレングリコール6
000である。
また、培養液としては、ハイブリドーマ細胞とミエロ
ーマ細胞を選択するためHAT培地を使用するのが好まし
い。さらに、得られたハイブリドーマをクローニング
法、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、また
は限界希釈法を用いてクローニングし、得られたハイブ
リドーマ細胞に抗体を産生させる。
ーマ細胞を選択するためHAT培地を使用するのが好まし
い。さらに、得られたハイブリドーマをクローニング
法、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、また
は限界希釈法を用いてクローニングし、得られたハイブ
リドーマ細胞に抗体を産生させる。
かくして得られたモノクローナル抗体を、常法にて抗
体価をチェックし、抗体価の高いハイブリドーマを選択
して保存する。
体価をチェックし、抗体価の高いハイブリドーマを選択
して保存する。
本発明のモノクローナル抗体は神経細胞の生長・分化
等のマーカーとして、細胞機能における糖類の役割を解
明し、また動物の発生などの基礎研究に役立てられる。
また、臨床への応用も期待される。
等のマーカーとして、細胞機能における糖類の役割を解
明し、また動物の発生などの基礎研究に役立てられる。
また、臨床への応用も期待される。
（Ａ）ザンプルの製造 （１）GD3ガングリオシド、GM3およびGT12ガングリオシ
ドの抽出精製、その他のガングリオシドの入手 ブタ副腎を冷アセトン中でホモンジナイズした後乾燥
させ、これをクロロホルム−メタノールを用い常法にて
抽出を行った。
ドの抽出精製、その他のガングリオシドの入手 ブタ副腎を冷アセトン中でホモンジナイズした後乾燥
させ、これをクロロホルム−メタノールを用い常法にて
抽出を行った。
得られたサンプルをアルカリ処理した後DEAE−セファ
デックスＡ−25陰イオン交換樹脂、イアトロビーズカラ
ムを用いてGD3ガングリオシドの精製を行った。
デックスＡ−25陰イオン交換樹脂、イアトロビーズカラ
ムを用いてGD3ガングリオシドの精製を行った。
GM3ガングリオシドはヘパリン処理した犬の血清を遠
沈しPBS（−）溶液で３回洗浄後凍結乾燥を行い、クロ
ロホルム−メタノールを用いて抽出を行った。以下GD3
ガングリオシドの場合と同様の操作によりGM3ガングリ
オシドの精製を行った。
沈しPBS（−）溶液で３回洗浄後凍結乾燥を行い、クロ
ロホルム−メタノールを用いて抽出を行った。以下GD3
ガングリオシドの場合と同様の操作によりGM3ガングリ
オシドの精製を行った。
牛脳をGD3ガングリオシドの場合と同様に処理して、
精製GT1aガングリオシドを得た。
精製GT1aガングリオシドを得た。
ガングリオシドGQ1b、GD1aおよびGD1bはダイヤヤトロ
ン社から、GT1bおよびGM2はフナコシ社から夫々購入し
たものを使用した。
ン社から、GT1bおよびGM2はフナコシ社から夫々購入し
たものを使用した。
これらのガングリオシド糖脂質はクロロホルム：メタ
ノール＝1:1（v/v）あるいはエタノールに溶解し−20℃
で保存した。
ノール＝1:1（v/v）あるいはエタノールに溶解し−20℃
で保存した。
（２）実験動物 メスの６週令Balb/cマウスを通常飼育にて実験に使用
した。
した。
（３）抗原溶液の調製 GQ1bガングリオシド100μｇとアンジュバントとして
酢酸処理したサルモネラ・ミネソタ（Salmonella mines
ota）R595 1000μｇとをリン酸緩衝生理食塩水（PBS
（−）、Ca、Mgを除いた）1mlにて混合して調製した。
酢酸処理したサルモネラ・ミネソタ（Salmonella mines
ota）R595 1000μｇとをリン酸緩衝生理食塩水（PBS
（−）、Ca、Mgを除いた）1mlにて混合して調製した。
（４）培養液 培養液：ニッスイRPMI−1640を使用した。使用時に
カナマイシン硫酸塩を最終濃度50μg/ml、牛胎児血清
（FBS）を10％となる様調整した。
カナマイシン硫酸塩を最終濃度50μg/ml、牛胎児血清
（FBS）を10％となる様調整した。
HAT培地：チミジン0.0388g、ヒポキサンチン0.1361g
とを蒸留水100mlに加熱溶解し、100倍濃度の保存溶液と
し−20℃で保存した。同様に0.0716gのアミノプテリン
を、少量のIN水酸化ナトリウム水溶液を加えた蒸留水10
0mlに溶かし、これをRPMI−1640培地にて10倍に希釈
し、100倍濃度の保存液として−20℃で遮光して保存し
た。使用時には、10％FBS含有RPMI−1640培地にそれぞ
れ1/100量ずつ加え、HAT培地とした。
とを蒸留水100mlに加熱溶解し、100倍濃度の保存溶液と
し−20℃で保存した。同様に0.0716gのアミノプテリン
を、少量のIN水酸化ナトリウム水溶液を加えた蒸留水10
0mlに溶かし、これをRPMI−1640培地にて10倍に希釈
し、100倍濃度の保存液として−20℃で遮光して保存し
た。使用時には、10％FBS含有RPMI−1640培地にそれぞ
れ1/100量ずつ加え、HAT培地とした。
また、HT培地としては、チミジンおよびヒポキサンチ
ン保存液のみを1/100量加え使用した。
ン保存液のみを1/100量加え使用した。
（５）親細胞 細胞融合を行う際の親細胞としては、Balb/cマウス由
来のミエローマ細胞であるSP Z/0−Ag14細胞を使用し
た。この細胞を10％FBS含有RPMI−1640培地により継代
を行い、培地に６−チオグアニンを３μg/mlの濃度とな
る様に加える事により突然変異体の出現を阻止した。
来のミエローマ細胞であるSP Z/0−Ag14細胞を使用し
た。この細胞を10％FBS含有RPMI−1640培地により継代
を行い、培地に６−チオグアニンを３μg/mlの濃度とな
る様に加える事により突然変異体の出現を阻止した。
（Ｂ）ハイブリドーマの製造 （１）免疫法 免疫原として前記抗原溶液を前記マウスの静脈内に０
日GQ1bガングリオシド量で５μｇ、８日５μｇ、22日５
μｇそれぞれ注射し、３回の免疫から４日後に脾臓を摘
出し脾細胞の懸濁液を作製し細胞融合に用いた。
日GQ1bガングリオシド量で５μｇ、８日５μｇ、22日５
μｇそれぞれ注射し、３回の免疫から４日後に脾臓を摘
出し脾細胞の懸濁液を作製し細胞融合に用いた。
（２）細胞融合法 上記で得られた脾細胞のリンパ球と前記親細胞のマウ
スミエローマ細胞との細胞融合をケーラーおよびミルシ
ュタインの方法に従って実施した。すなわち、１×108
個の脾細胞リンパ球を、50％のポリエチレングリコール
（PEG6000）の存在下で、２×107個のマウスミエローマ
細胞と融合した。
スミエローマ細胞との細胞融合をケーラーおよびミルシ
ュタインの方法に従って実施した。すなわち、１×108
個の脾細胞リンパ球を、50％のポリエチレングリコール
（PEG6000）の存在下で、２×107個のマウスミエローマ
細胞と融合した。
（３）ハイブリドーマの選択および成長 細胞の融合後、得られた細胞をHAT培地（ヒポキサン
チン、アミノプテリンおよびチミジン）中で37℃におい
て５％のCO2を使用して培養した。
チン、アミノプテリンおよびチミジン）中で37℃におい
て５％のCO2を使用して培養した。
えられたハイブリドーマの培養液について酵素抗体法
により抗体の産生を調べ、検出されたウェルのハイブリ
ドーマをクローニングし、抗体産生株を得た（受託番号
HB 9714）。このハイブリドーマの培養液中のモノクロ
ーナル抗体について（Ｃ）の評価を行なった。
により抗体の産生を調べ、検出されたウェルのハイブリ
ドーマをクローニングし、抗体産生株を得た（受託番号
HB 9714）。このハイブリドーマの培養液中のモノクロ
ーナル抗体について（Ｃ）の評価を行なった。
（Ｃ）モノクローナル抗体とガングリオシドとの反応性
の評価 （１）酵素抗体法（ELISA法） 96穴式平底プレート（ファルコン社製）をエタノール
で前処理して実験に使用した。エタノールにて至適濃度
GQ1bガングリオシド20μg/mlとした抗原溶液50μを各
プレートに分注し蒸発させた後、１％卵白アルブミンPB
S（−）溶液100μを加え30分間室温に放置した。プレ
ートを下向きに振って溶液を除いた後、一次抗体として
ハイブリドーマ培養液を50μ加え室温に１時間30分放
置した。同様にしてプレートから一次抗体を除きPBS
（−）溶液150μを加え３回ウェル（well）を洗浄し
た後に１％卵白アルブミンPBS（−）溶液100μを加え
30分間放置した。この溶液を除いた後に１％卵白アルブ
ミンPBS（−）にて至適濃度に希釈した二次抗体50μ
を加え室温で１時間30分放置した。一次抗体と同様にPB
S（−）で３回ウェルを洗浄し反応溶液100μをウェル
に注ぎ暗所にて反応を進行させた。反応溶液はクエン酸
−リン酸緩衝液（pH＝５）にオルトフェニレンジアミ
ン、過酸化水素水の最終濃度がそれぞれ0.4mg/ml、0.01
％となる様調整し実験に使用した。反応は8N硫酸を30μ
加えて停止させ、500nmの吸収波長にて比色測定を行
った。二次抗体としては西洋ワサビペルオキシダーゼ
（HRP）標識ヤギ抗マウスIgG.M.A.抗体を使用した。
の評価 （１）酵素抗体法（ELISA法） 96穴式平底プレート（ファルコン社製）をエタノール
で前処理して実験に使用した。エタノールにて至適濃度
GQ1bガングリオシド20μg/mlとした抗原溶液50μを各
プレートに分注し蒸発させた後、１％卵白アルブミンPB
S（−）溶液100μを加え30分間室温に放置した。プレ
ートを下向きに振って溶液を除いた後、一次抗体として
ハイブリドーマ培養液を50μ加え室温に１時間30分放
置した。同様にしてプレートから一次抗体を除きPBS
（−）溶液150μを加え３回ウェル（well）を洗浄し
た後に１％卵白アルブミンPBS（−）溶液100μを加え
30分間放置した。この溶液を除いた後に１％卵白アルブ
ミンPBS（−）にて至適濃度に希釈した二次抗体50μ
を加え室温で１時間30分放置した。一次抗体と同様にPB
S（−）で３回ウェルを洗浄し反応溶液100μをウェル
に注ぎ暗所にて反応を進行させた。反応溶液はクエン酸
−リン酸緩衝液（pH＝５）にオルトフェニレンジアミ
ン、過酸化水素水の最終濃度がそれぞれ0.4mg/ml、0.01
％となる様調整し実験に使用した。反応は8N硫酸を30μ
加えて停止させ、500nmの吸収波長にて比色測定を行
った。二次抗体としては西洋ワサビペルオキシダーゼ
（HRP）標識ヤギ抗マウスIgG.M.A.抗体を使用した。
その結果を表−１に示す。
この表から本発明のモノクローナル抗体はGQ1bを認識
することがわかる。
することがわかる。
さらに、ハイブリドーマの培養上清を希釈して、一次
抗体とし、抗原抗体反応を行わせた。その結果を表−２
に示す。この表から本発明のモノクローナル抗体GQ1bに
対する反応性を有することがわかる。
抗体とし、抗原抗体反応を行わせた。その結果を表−２
に示す。この表から本発明のモノクローナル抗体GQ1bに
対する反応性を有することがわかる。
（２）TLC免疫染色（immuno staining）法 シリカゲル薄層クロマト（TLC）（poly gram SIL G）
プレートを適当な大きさに切りクロロホルム：メタノー
ル−1:1（v/v）に溶解した糖脂質をプレート上にスポッ
トした。目的に応じてこのプレートをクロロホルム：メ
タノール：水＝60:40:10（v/v）、クロロホルム：メタ
ノール:0.5％ CaCl2＝55:45:10（v/v）あるいはクロロ
ホルム：メタノール:2.5N NH4OH＝60:40:9（v/v）の展
開溶媒で展開し、１％卵白アルブミン１％ポリビニルピ
ロリドン（Ｋ−30）PBS（−）溶液にて一晩４℃に放置
した。次いで一次抗体に浸し２時間室温で振とうした。
PBS（−）にて十分に洗浄した後、１％卵白アルブミン
１％ポリビニルピロリドン（Ｋ−30）PBS（−）に室温
で30分浸した。プレートをとり出し３％ポリビニルピロ
リドン（Ｋ−30）PBS（−）溶液にて至適濃度に希釈し
た二次抗体に十分浸し室温で２時間振とうした後、PBS
（−）で十分洗浄し、反応液を加えた。反応液は４−ク
ロロ−１−ナフトール4mgをメタノール1mlに溶解した後
50mmolトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、200m
mol NaCl（pH＝7.4）緩衝液を5ml加え、0.01％になる様
過酸化水素水を加えて実験に使用した。反応は水洗によ
り停止させ、プレートを風乾した。結果を表−３に示
す。
プレートを適当な大きさに切りクロロホルム：メタノー
ル−1:1（v/v）に溶解した糖脂質をプレート上にスポッ
トした。目的に応じてこのプレートをクロロホルム：メ
タノール：水＝60:40:10（v/v）、クロロホルム：メタ
ノール:0.5％ CaCl2＝55:45:10（v/v）あるいはクロロ
ホルム：メタノール:2.5N NH4OH＝60:40:9（v/v）の展
開溶媒で展開し、１％卵白アルブミン１％ポリビニルピ
ロリドン（Ｋ−30）PBS（−）溶液にて一晩４℃に放置
した。次いで一次抗体に浸し２時間室温で振とうした。
PBS（−）にて十分に洗浄した後、１％卵白アルブミン
１％ポリビニルピロリドン（Ｋ−30）PBS（−）に室温
で30分浸した。プレートをとり出し３％ポリビニルピロ
リドン（Ｋ−30）PBS（−）溶液にて至適濃度に希釈し
た二次抗体に十分浸し室温で２時間振とうした後、PBS
（−）で十分洗浄し、反応液を加えた。反応液は４−ク
ロロ−１−ナフトール4mgをメタノール1mlに溶解した後
50mmolトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、200m
mol NaCl（pH＝7.4）緩衝液を5ml加え、0.01％になる様
過酸化水素水を加えて実験に使用した。反応は水洗によ
り停止させ、プレートを風乾した。結果を表−３に示
す。
表−３の結果から本発明のモノクローナル抗体は、GQ
1bのみと特異的に反応したことがわかる。
1bのみと特異的に反応したことがわかる。
（３）本発明のモノクローナル抗体に対するエピトープ
（抗原決定基）の同定： 第１図はTLC染色法（レゾルシノール染色）（Ａ）お
よびTLC免疫染色法（Ｂ）を使用した各種糖脂質の定性
及び免疫反応試験の結果を示している。この図からレー
ン４および５のガングリオシドGT1aおよびGQ1bは、本発
明のモノクローナル抗体に対する抗原決定基を有するこ
とがわかる。
（抗原決定基）の同定： 第１図はTLC染色法（レゾルシノール染色）（Ａ）お
よびTLC免疫染色法（Ｂ）を使用した各種糖脂質の定性
及び免疫反応試験の結果を示している。この図からレー
ン４および５のガングリオシドGT1aおよびGQ1bは、本発
明のモノクローナル抗体に対する抗原決定基を有するこ
とがわかる。
以下、第１図の説明をする。
（１） レーン１ GM3 846pmol GD1a 860pmol （２） レーン２ GD3 679pmol GD1b 592pmol （３） レーン３ GM2 1nmol GT1b 354pmol （４） レーン４ GT1a 195pmol （５） レーン５ GQ1b 290pmol
第１図（Ａ）は、TLCレゾルシノール染色法による各種
ガングリオシドの定性試験結果を示し、第１図（Ｂ）
は、TLC免疫染色法による本発明のモノクローナル抗体
に対する各種ガングリオシドの抗原特異性を示す。
ガングリオシドの定性試験結果を示し、第１図（Ｂ）
は、TLC免疫染色法による本発明のモノクローナル抗体
に対する各種ガングリオシドの抗原特異性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/08 C12N 5/12 C12N 15/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】ガングリオシドGQ1bまたはGT1aのエピトー
プ（抗原決定基）： に対するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】請求項（１）記載のモノクローナル抗体を
生産するハイブリドーマATCC寄託番号HB9714。 - 【請求項３】（Ａ）エピトープ（抗原決定基）： を含有するガングリオシドGQ1bまたはGT1aを抗原として
動物（ヒトを除く）に免疫して得られるＢ細胞（リンパ
球）と、 （Ｂ）骨髄腫細胞とを細胞融合することを特徴とする請
求項（２）記載のハイブリドマーの製造法。
Priority Applications (15)
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|---|---|---|---|
| JP63177582A JP2789469B2 (ja) | 1988-07-16 | 1988-07-16 | ガングリオシドＧＱ▲下１▼▲下ｂ▼およびＧＴ▲下１▼▲下ａ▼を認識するモノクローナル抗体 |
| CA000605260A CA1335654C (en) | 1988-07-16 | 1989-07-10 | Monoclonal antibodies capable of recognizing gangliosides go__ and gt |
| US07/377,121 US5142028A (en) | 1988-07-16 | 1989-07-10 | Monoclonal antibodies capable of recognizing gangliosides gq1b and gt1a |
| IL9093689A IL90936A (en) | 1988-07-16 | 1989-07-11 | Monoclonal antibodies that can recognize gangliosides B1QG and A1TG |
| AU38144/89A AU617492B2 (en) | 1988-07-16 | 1989-07-14 | Monoclonal antibody capable of recognising gangliosides GQ1b and GT1a |
| ES89112953T ES2061818T3 (es) | 1988-07-16 | 1989-07-14 | Anticuerpos monoclonales capaces de reconocer gangliosidos gq1b y gt1a. |
| FI893427A FI96609C (fi) | 1988-07-16 | 1989-07-14 | Monoklonaalinen vasta-aine, joka pystyy tunnistamaan gangliosideja GQ1b ja GT1a, sitä tuottava hybridooma sekä menetelmä hybridooman valmistamiseksi |
| NZ229946A NZ229946A (en) | 1988-07-16 | 1989-07-14 | Monoclonal antibody to gangliosides gq1b and gt1a and hybridomas producing it |
| DK349389A DK349389A (da) | 1988-07-16 | 1989-07-14 | Monoclonalt antistof, hybridoma der er i stand til at producere dette og fremgangsmaade til fremstilling af hybridomaet |
| DE68914054T DE68914054T2 (de) | 1988-07-16 | 1989-07-14 | Monoklonale Antikörper mit der Fähigkeit zur Erkennung von Gangliosiden GQ1b und GT1a. |
| EP89112953A EP0351731B1 (en) | 1988-07-16 | 1989-07-14 | Monoclonal antibodies capable of recognizing gangliosides GQ1b and GT1a |
| HU893581A HU212324B (en) | 1988-07-16 | 1989-07-14 | Process for the production of monoclonal antibodies capable of recognizing gangliosides gq1b and gt1a and hybridomas producing them |
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| NO892906A NO174632C (no) | 1988-07-16 | 1989-07-14 | Monoklonale antistoffer som er i stand til å gjenkjenne gangliosider GQ1B og GT1A og en hyberidom som produserer disse antistoffene |
| KR89010173A KR960014701B1 (en) | 1988-07-16 | 1989-07-18 | Monoclonal antibodies capable of recognizing gangliosides gq1b and gt1a |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP63177582A JP2789469B2 (ja) | 1988-07-16 | 1988-07-16 | ガングリオシドＧＱ▲下１▼▲下ｂ▼およびＧＴ▲下１▼▲下ａ▼を認識するモノクローナル抗体 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=16033496
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| IL (1) | IL90936A (ja) |
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1989
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- 1989-07-10 US US07/377,121 patent/US5142028A/en not_active Expired - Fee Related
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- 1989-07-14 AT AT89112953T patent/ATE103340T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1989-07-14 AU AU38144/89A patent/AU617492B2/en not_active Ceased
- 1989-07-14 DE DE68914054T patent/DE68914054T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-07-14 DK DK349389A patent/DK349389A/da not_active Application Discontinuation
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| AU3814489A (en) | 1990-01-18 |
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