JP2754206B2 - α２→３結合を認識するモノクローナル抗体 - Google Patents
α２→３結合を認識するモノクローナル抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、新規なハイブリドーマ、その製造法および
それによって産生される抗シアル酸含有糖脂質モノクロ
ーナル抗体に関する。 〔従来の技術〕 関連技術の説明 1975年にケーラーらは、免疫動物の脾細胞とマウス骨
髄腫細胞を用いた細胞融合法にて抗ヒツジ赤血球抗体を
産生するハイブリドーマを得たこの様なハイブリドーマ
はその増殖性から細胞を１個由来のクローン細胞にする
事が可能であり（cloning）このクローニングされたハ
イブリドーマから産生される抗体は全て同一の抗体分子
である。従って抗原認識部位も同じである為均一の抗原
特異性を示し又細胞を凍結保存できる事から半永久的に
このモノクローナル抗体を供給する事ができる。従来の
抗血清は免疫動物の血清を種々の抗原で吸収し調製した
が異なるＢリンパ球由来の抗体分子を数多く含んでいる
為に（ポリクローナル）他の抗原と交さ反応を示す場合
が多く特異性のすぐれた抗血清を調製するのは困難であ
ったが細胞融合法により、特定の抗原に対してより特異
的な反応を示すモノクローナル抗体の作成が可能となっ
た。 抗体は、抗原として知られる分子との結合およびそれ
を認識する能力を有するタンパク質である。単クローン
性抗体は同一の抗原認識部位を持つ抗体の事であり、た
だ１種の抗原決定基を認識する。単クローン性抗体およ
びハイブリドーマを生成させる多くの技術は、参照によ
り加入される最近の図書「単クローン性ハイブリドーマ
抗体：技術および適用（Monoclonal Hybridoma Antibod
ies:Techniques and Applications）」〔ハレル（John
G.Hurrell）編、1983〕に詳しく述べられている。 〔発明の背景〕 哺乳動物細胞の糖脂質（グリコリヒド）は、スフィン
ゴシンという長鎖アミノアルコールに脂肪酸が酸アミド
結合したセラミドという脂質構造に、グルコース、ガラ
クトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガ
ラクトサミン、フコース、シアル酸などの糖が種々の組
み合せでグリコシド結合したもので、いわゆるスフィン
ゴ糖脂質といわれる範疇に属する。このうちシアル酸を
有するものを特にガングリオシドと称する。 これらの化合物は一般に細胞膜脂質２重層の外側に局
在し、最近の研究によれば細胞における識別や情報の受
容と応用、レセプター機能、分化、細胞の増殖・悪性変
化・行動などにおいて重要な役割を果たしているものと
考えられている。 ところで、これらのガングリオシドの内、GD3ガング
リオシドは神経細胞の分化抗原として知られており、ま
た、ヒトメラノーマ細胞の癌関連抗原として同定されて
いる。 したがって、このGD3ガングリオシドに対するモノク
ローナル抗体の作成は、そのすぐれた抗原特異性と高い
検出感度を特徴とすることから、ガンマーカーとして癌
患者の血清診断や免疫療法のみならず、細胞機能におけ
る糖鎖の役割を解明するためにも重要な課題であった。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的は、ヒトメラノーマ細胞の癌関連抗原と
して同定されているGD3ガングリオシドのある特定の抗
原決定基に対して、特異性を有するモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ、その製造法及びそのハイブ
リドーマから産生されるモノクローナル抗体を提供する
ことにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、上記問題点に鑑み、精製GD3ガングリ
オシドを免疫原として抗GD3ガングリオシドモノクロー
ナル抗体を作成し、該モノクローナル抗体に対して高い
特異性を有するエピトープ（抗原決定基）を同定し、本
発明を完成した。 すなわち、本発明は、エピトープ（抗原決定基）とし
てα２→３結合を有するＮアセチルノイラミン酸を含有
するシアル酸含有糖脂質に対して特異性を有するモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。 また、本発明は（Ａ）α２→３結合を有するＮ−アセ
チルノイラミン酸を含有するシアル酸含有糖脂質を抗原
としてマウスに免疫して得られたＢ細胞（リンパ球）と
（Ｂ）骨髄腫細胞とを細胞融合することを特徴とするハ
イブリドーマの製造法に関する。 さらに、本発明は、エピトープ（抗原決定基）として
α２→３結合を有するＮ−アセチルノイラミン酸を含有
するシアル酸含有糖脂質に対して特異性を有するハイブ
リドーマによって産生されたモノクローナル抗体に関す
る。 本発明をさらに詳細に説明する。 本発明のハイブリドーマは、ケーラー、ミルシュタイ
ン等の方法、すなわち、抗原を動物に免疫して、得られ
るＢ細胞（リンパ球）と骨髄腫細胞として細胞融合させ
ることにより調製される。本発明のハイブリドーマは、
1987年４月８日に、ATCCに、受託番号HB9475として寄託
された。ここで、本発明に使用される「抗原」として
は、α２→３結合Ｎ−アセチルノイラミン酸を含有する
ガングリオシド、好ましくは、α２→３結合を有するガ
ングリオシド糖脂質を挙げることができる。以下に本発
明に使用できるガングリオシド糖脂質類を例示する。 本発明のハイブリドーマから産生されるモノクローナ
ル抗体はエピトープ（抗原決定基）としてα２→３結合
したＮ−アセチルノイラミン酸を認識し、特異的に反応
する。したがって、本発明のハイブリドーマから産生さ
れるモノクローナル抗体は、α２→３結合を有するＮ−
アセチルノイラミン酸を含有するシアル酸糖脂質、特に
GD3ガングリオシド、GD3ガングリオシドに特に強い反応
性を有している。また、これらのシアル酸含有糖脂質を
有する動物であれば、特に動物種に限定されることな
く、本発明のモノクローナル抗体に対して同様な特異性
を有する。 次に、上記したシアル酸糖脂質を抗原として免疫され
る「動物」としては、ウサギ、マウス、ラット等ほとん
どの動物が使用でき、好ましくはマウス、より好ましく
はBalb/cマウスである。しかして、得られるＢ細胞（リ
ンパ球）は、本発明のモノクローナル抗体を産生する細
胞であり、好ましくは、脾臓細胞を用いる。 一方、「骨髄腫細胞」としては、各種動物、例えば、
ヒト、マウス、ラット、ウサギなどほとんどすべての動
物由来のミエローマ細胞を包含するものであり、好まし
くは、マウス由来のミエローマ細胞、より好ましくは、
Balb/cマウス由来のX63-Ag8.653ミエローマ細胞が使用
できる。これらのミエローマ細胞は、上記Ｂ細胞と細胞
融合させた本発明のハイブリドーマからモノクローナル
抗体を産生するための活発な増殖能力を有するものであ
る。 次に、本発明のハイブリドーマの製造法について詳述
する。 まず、GD3ガングリオシドをマウスの腹腔内、皮下、
好ましくは静脈内に投与する。この免疫の際、アジュバ
ント、すなわち免疫増殖剤としては不完全アジュバント
または完全アジュバントのいずれも使用でき、例えば腹
腔内、皮下投与では油、乳化剤、結核死菌、サラモネラ
死菌およびこれらの混合物であり、好ましくはサラモネ
ラ・ミネソタ死菌が使用できる。また、これらの抗原お
よびアジュバントは、生理的条件に近い溶液、例えばリ
ン酸緩衝液生理食塩水を用いるのが好ましい。 このように免疫する際の注意点は、免疫に用いる動物
は、自己成分に対して免疫感作が困難であるため原則と
して、抗原に用いる物質を得た動物より系統発生的に遠
縁の動物種を選ぶのが好ましい。しかし、これらの困難
を回避するためイン・ビトロ（in vitro）においても免
疫することができる。 次に、上記で得られたＢ細胞とミエローマ細胞とを細
胞融合する。 ここで、融合剤としては、ポリエチレングリコール、
HVJ等が使用でき、好ましくはポリエチレングリコール6
000である。 また、培養液としては、ハイブリドーマ細胞とミエロ
ーマ細胞を選択するためHAT培地を使用するのが好まし
い。さらに、得られたハイブリドーマをクローニング
法、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、また
は限界希釈法を用いて抗体を産生させる。 かくして得られたモノクローナル抗体を、常法にて抗
体価をチェックし、抗体価の高いハイブリドーマを選択
して保存する。 〔発明の効果〕 本発明のハイブリドーマから産生されるモノクローナ
ル抗体は、ヒトまたは動物の癌組織中の天然存在糖脂質
抗原の検出に使用できる。したがって、本発明によるモ
ノクローナル抗体は、癌関連ガングリオシドの検出に通
常用いられる方法、例えば、ELISA、RIAなどに使用でき
る。また、本発明によるモノクローナル抗体をアフィニ
ティークロマトグラフィーに用いて、結合性抗原を精製
することができる。さらに、放射性同位元素で標識した
モノクローナル抗体を腫瘍の検出または局在化に、また
高用量で腫瘍の治療処置に用いることができる。さら
に、化学療法薬をモノクローナル抗体に結合させて癌細
胞に対するその毒性を高めることができる。抗原を有す
る種、例えばヒトおよびマウスなどの動物に本発明のモ
ノクローナル抗体を用いる治療または診断試験に供する
ことができる。また、本発明によるモノクローナル抗体
は、神経細胞などの基礎研究および臨床への応用が期待
される。 実施例 （Ａ） 原料の製造 （１） GD3ガングリオシドおよびGM3ガングリオシドの
抽出精製 ブタ副腎を冷アセトン中でホモジナイズした後乾燥さ
せてこれをクロロホルム−メタノールを用い常法にて抽
出を行った。 得られたサンプルをアルカリ処理した後DEAE−セファ
デックスＡ−25陰イオン交換樹脂、イアトロビーズカラ
ムを用いてGD3ガングリオシドの精製を行った。 GD3ガングリオシドはヘパリン処理した犬の血清を遠
沈しPBS（−）溶液で３回洗浄後凍結乾燥を行いクロロ
ホルム−メタノールを用いて抽出を行った。以下同上の
操作によりGD3ガングリオシドの精製を行った。 ガングリオシドGD1a、GD1bおよびGQ1bはダイヤヤトロ
ン社から、またGalCerおよびGlcCerはシグマ社から、GT
1bおよびGM2はフナコシ社から夫々購入したものを使用
した。 これらのガングリオシド糖脂質はクロロホルム：メタ
ノール＝1:1（v/v）あるいはエタノールに溶解し−20℃
で保存した。 （２） 実験動物 メスの６週令BALB/Cマウスを通常飼育にて実験に使用
した。 （３） 抗原溶液の調整 上記で抽出・精製したブタ副腎からガングリオシドGD
3とアジュバントとして酢酸処理したサラミネラ・ミネ
ソタ（Salmonella minesota）R595とを重量比1:4でリン
酸緩衝生理食塩水（PBS（−）GD3ガングリオシド100μg
/mlとなる様に混合して抗原溶液とした。 （４） 培養液 培養液：ニッスイRPMI1640を使用した。使用時にカ
ナマイシン硫酸塩を最終濃度50μg/ml、牛胎児血清（FB
S）を10％となる様調整した。 HAT培地：チミジン0.0338g、ヒポキサンチン0.1361g
とを蒸留水100mlに加熱融解し、100倍濃度の保存溶液と
し−20℃で保存した。同様に0.0176gのアミノプテリン
を蒸留水100mlに少量の1N水酸化ナトリウム水溶液を加
えて溶かし、これをRPMI1640培地にて10倍に希釈し、10
0倍濃度の保存液として−20℃で遮光して保存した。使
用時には、10％FBS、RPMI1640培地にそれぞれ1/100量ず
つ加え、HAT培地とした。 また、HT培地としては、チミジンおよびヒポキサンチ
ン保存液のみを1/100量加え使用した。 （５） 親細胞 細胞融合を行う際の親細胞としては、BALB/Cマウス由
来のミエローマ細胞であるX63-Ag8−6.5.3細胞を使用し
た。この細胞を10％FBS RPMI1640培地により継代を行
い、培地に６−チオグアニンを３μg/mlの濃度となる様
に加える事により突然変異体の出現を阻止した。 （Ｂ） ハブリドーマの製造 （１） 免疫法 メスの６週令BALB/Cマウスを、免疫原としてブタ副腎
より抽出精製したGD3ガングリオシド100μｇとアジュバ
ントとしてサラモネラ・ミネソタ400μｇとをリン酸緩
衝生理食塩水（PBS（−）、Ca、Mgを除いた）1mlにて混
合し、前記マウスの静脈内に０日GD3ガングリオシド量
で５μｇ、４日10μｇ、７日15μｇ、12日20μｇ、79日
20μｇ、３日後に脾臓を摘出し脾細胞の懸濁液を作製し
細胞融合に用いた。 （２） 細胞融合法 上記で得られた脾細胞リンパ球と前記親細胞のマウス
ミエローマ細胞との細胞融合をケーラーおよびミルシュ
タインの方法に従って実施した。すなわち、１×108個
の脾細胞リンパ球を、50％のポリエチレングリコール
（PEG6000）の存在下で、２×107個の骨髄腫細胞と融合
した。 （３） ハイブリドーマの選択および成長 細胞の融合後、得られた細胞をHAT培地（ヒポキサン
チン、アミノプテリンおよびチミジン）中で37℃におい
て５％のCO2を使用して培養した。 （Ｃ） モノクローナル抗体とガングリオシドとの反応
性の評価 （１） 酵素抗体法（ELISA法） 96穴式平底プレート（ファルコン社製）をエタノール
で前処理して実験に使用した。エタノールにて至適濃度
GD3ガングリオシド20μg/mlとした抗原溶液50μｌを各
プレートに分注し蒸発させた後、１％卵白アルブミンPB
S（−）溶液100μｌを加え30分間室温に放置した。プレ
ートを下向きに振って溶液を除いた後、一次抗体として
ハイブリドーマ培養液を50μｌ加え室温に１時間30分放
置した。同様にしてプレートから一時抗体を除きPBS
（−）溶液150μｌを加え３回ウェル（well）を洗浄し
た後に１％卵白アルブミンPBS（−）溶液100μｌを加え
30分間放置した。この溶液を除いた後に１％卵白アルブ
ミンPBS（−）にて至適濃度に希釈した２次抗体50μｌ
を加え室温で１時間30分放置した。一次抗体と同様にPB
S（−）で３回ウェルを洗浄し反応溶液100μｌをウェル
に注ぎ暗所にて反応を進行させた。反応溶液はクエン酸
−リン酸緩衝液（pH＝５）にオルトフェニレンジアミ
ン、過酸化水素水の最終濃度が0.4mg/ml、0.01％となる
様調整し実験に使用した。反応は8N硫酸を30μｌ加えて
停止させ、500nmの吸収波長にて比色測定を行った。２
次抗体としては西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標
識ヤギ抗マウスIgG.M.A抗体を使用した。 その結果を第１図に示す。 ○はガングリオシドGD3を示す。 ●はガングリオシドGM3を示す。 この図からガングリオシドGM3およびGD3は、本発明の
モノクローナル抗体を高い抗原抗体反応を起こすことが
判かる。したがって、ガングリオシドGM3およびGD3はい
ずれも本発明のモノクローナル抗体に対する抗原決定基
を有する。しかし、ガングリオシドGD3の方がガングリ
オシドGM3より高い抗原抗体反応を起こすのでガングリ
オシドGD3により高い特異性を有するエピトープ（抗原
決定基）があることが判る。 （２） TLC免疫染色（immuno staining）法 シリカゲル薄層クロマト（TLC（poly gram SIL G）プ
レートを適当な大きさに切りクロロホルム：メタノール
＝1:1（v/v）に溶解した糖脂質をプレート上にスポット
した。目的に応じてこのプレートをクロロホルム：メタ
ノール：水＝60:40:10（v/v）、クロロホルム：メタノ
ール:0.5％CaCl2＝55:45:10（v/v）あるいはクロロホル
ム：メタノール:2.5N NH4OH＝60:40:9（v/v）の展開溶
媒で展開し、１％卵白アルブミン１％ポリビニルピロリ
ドン（Ｋ−30）PBS（−）溶液にて一晩４℃に放置し
た。次いで一次抗体に浸たし２時間室温で振とうした。
PBS（−）にて十分に洗浄した後、１％卵白アルブミン
１％ポリビニルピロリドン（Ｋ−30）PBS（−）に室温
で30分浸たした。プレートをとり出し３％ポリビニルピ
ロリドン（Ｋ−30）PBS（−）溶液にて至適濃度に希釈
した２次抗体に十分浸たし室温で２時間振とうした後、
PBS（−）で十分洗浄し、反応液を加えた。反応液は４
−クロロ−−１−ナフトール4mgをメタノール1mlに溶解
した後50mmolトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、200mmol NaCl（pH＝7.4）緩衝液を5ml加え、0.01％
になる様過酸化水素水を加えて実験に使用した。反応は
水洗により停止させ、プレートを風乾した。 （３） 本発明のモノクローナル抗体に対するエピトー
プ（抗原決定基）の同定： 第２図はTLC染色法（オルシノール染色）（Ａ）およ
びTLC免疫染色法（Ｂ）を使用した各種糖脂質の定性及
び免疫反応試験の結果を示している。この図からレーン
５のガングリオシドGD3は、本発明のモノクローナル抗
体に対する抗原決定基を有することがわかる。 また、レーン３のガングリオシドGD3にビブリオ・コ
レラ シアリダーゼ（Vibrio cholera Sialidase）を作
用させた場合に生ずるCDH（Gal-Glc-Cer）は、TLC免疫
染色により検出されなかった。このことにより、Gal-Gl
c-Cer（CDH）構造は、本発明のモノクローナル抗体の抗
原決定基とはなり得ないことがわかる。また、レーン３
のTLC免疫染色に表われたバンドは、前記シリダーゼの
作用を受けなかったガングリオシドGD3を示している。
さらに、レーン１のCMHはGal-Cer、レーン２のCMHはGlc
-Cerを表わし、レーン４のCTHは、Gal-Gal-Glc-Cerを表
わす。 これらの構造は、TLC免疫染色されなかったことから
本発明のモノクローナル抗体の抗原決定基にはなり得な
いことがわかる。 以上から本発明のモノクローナル抗体のエピトープ
（抗原決定基）はＮ−アセチルノイラミン酸であること
がわかる。 以下、第２図の説明をする。 同様に、Ｎ−アセチルノイラミン酸を有する各種ガン
グリオシド類のTLC免疫染色の結果を表−１に示す。 （４） 本発明のモノクローナル抗体に対するエピトー
プ（抗原決定基）の同定： 第３図は、第２図と同様にTLC染色法（Ａ）およびTLC
免疫染色法（Ｂ）により得られた各種糖脂質の定性及び
免疫反応試験の結果を示す。この図から、レーン２およ
び３は天然型のガングリオシド、すなわちα２→３結合
を有するＮ−アセチルノイラミン酸であり、本発明のモ
ノクローナル抗体に対して強い特異性を示すことがわか
る。 また、レーン４および５はβ２→３結合を有する化合
合成Ｎ−アセチルノイラミン酸誘導体であり、合成型の
ガングリオシドに対しては、本発明のモノクローナル抗
体は特異性を示さないことがわかる。 （３）で得られた知見と本知見とを総合的に考察する
と、本発明のモノクローナル抗体は、Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸のα２→３結合をエピトープ（抗原決定基）と
して認識することがわかる。 以下、第３図の説明をする。 （５） 定性的免疫拡散法（Ouchterlony法） 第４図は免疫拡散法を使用した結果を示す。この図に
より、本願発明のハイブリドーマより産生されるモノク
ローナル抗体はIgMであることがわかる。αMIgM、αMIg
G1、2a2bおよび３の抗血清はそれぞれマイルス）社から
購入した。 （１） αMIgM （２） αMIgG1 （３） αMIgG2a （４） αMIgG2b （５） αMIgG3 （６） また表−２から、以下の結果に示すように酵素
抗体法によってもIgMであることが示された。
それによって産生される抗シアル酸含有糖脂質モノクロ
ーナル抗体に関する。 〔従来の技術〕 関連技術の説明 1975年にケーラーらは、免疫動物の脾細胞とマウス骨
髄腫細胞を用いた細胞融合法にて抗ヒツジ赤血球抗体を
産生するハイブリドーマを得たこの様なハイブリドーマ
はその増殖性から細胞を１個由来のクローン細胞にする
事が可能であり（cloning）このクローニングされたハ
イブリドーマから産生される抗体は全て同一の抗体分子
である。従って抗原認識部位も同じである為均一の抗原
特異性を示し又細胞を凍結保存できる事から半永久的に
このモノクローナル抗体を供給する事ができる。従来の
抗血清は免疫動物の血清を種々の抗原で吸収し調製した
が異なるＢリンパ球由来の抗体分子を数多く含んでいる
為に（ポリクローナル）他の抗原と交さ反応を示す場合
が多く特異性のすぐれた抗血清を調製するのは困難であ
ったが細胞融合法により、特定の抗原に対してより特異
的な反応を示すモノクローナル抗体の作成が可能となっ
た。 抗体は、抗原として知られる分子との結合およびそれ
を認識する能力を有するタンパク質である。単クローン
性抗体は同一の抗原認識部位を持つ抗体の事であり、た
だ１種の抗原決定基を認識する。単クローン性抗体およ
びハイブリドーマを生成させる多くの技術は、参照によ
り加入される最近の図書「単クローン性ハイブリドーマ
抗体：技術および適用（Monoclonal Hybridoma Antibod
ies:Techniques and Applications）」〔ハレル（John
G.Hurrell）編、1983〕に詳しく述べられている。 〔発明の背景〕 哺乳動物細胞の糖脂質（グリコリヒド）は、スフィン
ゴシンという長鎖アミノアルコールに脂肪酸が酸アミド
結合したセラミドという脂質構造に、グルコース、ガラ
クトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガ
ラクトサミン、フコース、シアル酸などの糖が種々の組
み合せでグリコシド結合したもので、いわゆるスフィン
ゴ糖脂質といわれる範疇に属する。このうちシアル酸を
有するものを特にガングリオシドと称する。 これらの化合物は一般に細胞膜脂質２重層の外側に局
在し、最近の研究によれば細胞における識別や情報の受
容と応用、レセプター機能、分化、細胞の増殖・悪性変
化・行動などにおいて重要な役割を果たしているものと
考えられている。 ところで、これらのガングリオシドの内、GD3ガング
リオシドは神経細胞の分化抗原として知られており、ま
た、ヒトメラノーマ細胞の癌関連抗原として同定されて
いる。 したがって、このGD3ガングリオシドに対するモノク
ローナル抗体の作成は、そのすぐれた抗原特異性と高い
検出感度を特徴とすることから、ガンマーカーとして癌
患者の血清診断や免疫療法のみならず、細胞機能におけ
る糖鎖の役割を解明するためにも重要な課題であった。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的は、ヒトメラノーマ細胞の癌関連抗原と
して同定されているGD3ガングリオシドのある特定の抗
原決定基に対して、特異性を有するモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ、その製造法及びそのハイブ
リドーマから産生されるモノクローナル抗体を提供する
ことにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、上記問題点に鑑み、精製GD3ガングリ
オシドを免疫原として抗GD3ガングリオシドモノクロー
ナル抗体を作成し、該モノクローナル抗体に対して高い
特異性を有するエピトープ（抗原決定基）を同定し、本
発明を完成した。 すなわち、本発明は、エピトープ（抗原決定基）とし
てα２→３結合を有するＮアセチルノイラミン酸を含有
するシアル酸含有糖脂質に対して特異性を有するモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。 また、本発明は（Ａ）α２→３結合を有するＮ−アセ
チルノイラミン酸を含有するシアル酸含有糖脂質を抗原
としてマウスに免疫して得られたＢ細胞（リンパ球）と
（Ｂ）骨髄腫細胞とを細胞融合することを特徴とするハ
イブリドーマの製造法に関する。 さらに、本発明は、エピトープ（抗原決定基）として
α２→３結合を有するＮ−アセチルノイラミン酸を含有
するシアル酸含有糖脂質に対して特異性を有するハイブ
リドーマによって産生されたモノクローナル抗体に関す
る。 本発明をさらに詳細に説明する。 本発明のハイブリドーマは、ケーラー、ミルシュタイ
ン等の方法、すなわち、抗原を動物に免疫して、得られ
るＢ細胞（リンパ球）と骨髄腫細胞として細胞融合させ
ることにより調製される。本発明のハイブリドーマは、
1987年４月８日に、ATCCに、受託番号HB9475として寄託
された。ここで、本発明に使用される「抗原」として
は、α２→３結合Ｎ−アセチルノイラミン酸を含有する
ガングリオシド、好ましくは、α２→３結合を有するガ
ングリオシド糖脂質を挙げることができる。以下に本発
明に使用できるガングリオシド糖脂質類を例示する。 本発明のハイブリドーマから産生されるモノクローナ
ル抗体はエピトープ（抗原決定基）としてα２→３結合
したＮ−アセチルノイラミン酸を認識し、特異的に反応
する。したがって、本発明のハイブリドーマから産生さ
れるモノクローナル抗体は、α２→３結合を有するＮ−
アセチルノイラミン酸を含有するシアル酸糖脂質、特に
GD3ガングリオシド、GD3ガングリオシドに特に強い反応
性を有している。また、これらのシアル酸含有糖脂質を
有する動物であれば、特に動物種に限定されることな
く、本発明のモノクローナル抗体に対して同様な特異性
を有する。 次に、上記したシアル酸糖脂質を抗原として免疫され
る「動物」としては、ウサギ、マウス、ラット等ほとん
どの動物が使用でき、好ましくはマウス、より好ましく
はBalb/cマウスである。しかして、得られるＢ細胞（リ
ンパ球）は、本発明のモノクローナル抗体を産生する細
胞であり、好ましくは、脾臓細胞を用いる。 一方、「骨髄腫細胞」としては、各種動物、例えば、
ヒト、マウス、ラット、ウサギなどほとんどすべての動
物由来のミエローマ細胞を包含するものであり、好まし
くは、マウス由来のミエローマ細胞、より好ましくは、
Balb/cマウス由来のX63-Ag8.653ミエローマ細胞が使用
できる。これらのミエローマ細胞は、上記Ｂ細胞と細胞
融合させた本発明のハイブリドーマからモノクローナル
抗体を産生するための活発な増殖能力を有するものであ
る。 次に、本発明のハイブリドーマの製造法について詳述
する。 まず、GD3ガングリオシドをマウスの腹腔内、皮下、
好ましくは静脈内に投与する。この免疫の際、アジュバ
ント、すなわち免疫増殖剤としては不完全アジュバント
または完全アジュバントのいずれも使用でき、例えば腹
腔内、皮下投与では油、乳化剤、結核死菌、サラモネラ
死菌およびこれらの混合物であり、好ましくはサラモネ
ラ・ミネソタ死菌が使用できる。また、これらの抗原お
よびアジュバントは、生理的条件に近い溶液、例えばリ
ン酸緩衝液生理食塩水を用いるのが好ましい。 このように免疫する際の注意点は、免疫に用いる動物
は、自己成分に対して免疫感作が困難であるため原則と
して、抗原に用いる物質を得た動物より系統発生的に遠
縁の動物種を選ぶのが好ましい。しかし、これらの困難
を回避するためイン・ビトロ（in vitro）においても免
疫することができる。 次に、上記で得られたＢ細胞とミエローマ細胞とを細
胞融合する。 ここで、融合剤としては、ポリエチレングリコール、
HVJ等が使用でき、好ましくはポリエチレングリコール6
000である。 また、培養液としては、ハイブリドーマ細胞とミエロ
ーマ細胞を選択するためHAT培地を使用するのが好まし
い。さらに、得られたハイブリドーマをクローニング
法、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、また
は限界希釈法を用いて抗体を産生させる。 かくして得られたモノクローナル抗体を、常法にて抗
体価をチェックし、抗体価の高いハイブリドーマを選択
して保存する。 〔発明の効果〕 本発明のハイブリドーマから産生されるモノクローナ
ル抗体は、ヒトまたは動物の癌組織中の天然存在糖脂質
抗原の検出に使用できる。したがって、本発明によるモ
ノクローナル抗体は、癌関連ガングリオシドの検出に通
常用いられる方法、例えば、ELISA、RIAなどに使用でき
る。また、本発明によるモノクローナル抗体をアフィニ
ティークロマトグラフィーに用いて、結合性抗原を精製
することができる。さらに、放射性同位元素で標識した
モノクローナル抗体を腫瘍の検出または局在化に、また
高用量で腫瘍の治療処置に用いることができる。さら
に、化学療法薬をモノクローナル抗体に結合させて癌細
胞に対するその毒性を高めることができる。抗原を有す
る種、例えばヒトおよびマウスなどの動物に本発明のモ
ノクローナル抗体を用いる治療または診断試験に供する
ことができる。また、本発明によるモノクローナル抗体
は、神経細胞などの基礎研究および臨床への応用が期待
される。 実施例 （Ａ） 原料の製造 （１） GD3ガングリオシドおよびGM3ガングリオシドの
抽出精製 ブタ副腎を冷アセトン中でホモジナイズした後乾燥さ
せてこれをクロロホルム−メタノールを用い常法にて抽
出を行った。 得られたサンプルをアルカリ処理した後DEAE−セファ
デックスＡ−25陰イオン交換樹脂、イアトロビーズカラ
ムを用いてGD3ガングリオシドの精製を行った。 GD3ガングリオシドはヘパリン処理した犬の血清を遠
沈しPBS（−）溶液で３回洗浄後凍結乾燥を行いクロロ
ホルム−メタノールを用いて抽出を行った。以下同上の
操作によりGD3ガングリオシドの精製を行った。 ガングリオシドGD1a、GD1bおよびGQ1bはダイヤヤトロ
ン社から、またGalCerおよびGlcCerはシグマ社から、GT
1bおよびGM2はフナコシ社から夫々購入したものを使用
した。 これらのガングリオシド糖脂質はクロロホルム：メタ
ノール＝1:1（v/v）あるいはエタノールに溶解し−20℃
で保存した。 （２） 実験動物 メスの６週令BALB/Cマウスを通常飼育にて実験に使用
した。 （３） 抗原溶液の調整 上記で抽出・精製したブタ副腎からガングリオシドGD
3とアジュバントとして酢酸処理したサラミネラ・ミネ
ソタ（Salmonella minesota）R595とを重量比1:4でリン
酸緩衝生理食塩水（PBS（−）GD3ガングリオシド100μg
/mlとなる様に混合して抗原溶液とした。 （４） 培養液 培養液：ニッスイRPMI1640を使用した。使用時にカ
ナマイシン硫酸塩を最終濃度50μg/ml、牛胎児血清（FB
S）を10％となる様調整した。 HAT培地：チミジン0.0338g、ヒポキサンチン0.1361g
とを蒸留水100mlに加熱融解し、100倍濃度の保存溶液と
し−20℃で保存した。同様に0.0176gのアミノプテリン
を蒸留水100mlに少量の1N水酸化ナトリウム水溶液を加
えて溶かし、これをRPMI1640培地にて10倍に希釈し、10
0倍濃度の保存液として−20℃で遮光して保存した。使
用時には、10％FBS、RPMI1640培地にそれぞれ1/100量ず
つ加え、HAT培地とした。 また、HT培地としては、チミジンおよびヒポキサンチ
ン保存液のみを1/100量加え使用した。 （５） 親細胞 細胞融合を行う際の親細胞としては、BALB/Cマウス由
来のミエローマ細胞であるX63-Ag8−6.5.3細胞を使用し
た。この細胞を10％FBS RPMI1640培地により継代を行
い、培地に６−チオグアニンを３μg/mlの濃度となる様
に加える事により突然変異体の出現を阻止した。 （Ｂ） ハブリドーマの製造 （１） 免疫法 メスの６週令BALB/Cマウスを、免疫原としてブタ副腎
より抽出精製したGD3ガングリオシド100μｇとアジュバ
ントとしてサラモネラ・ミネソタ400μｇとをリン酸緩
衝生理食塩水（PBS（−）、Ca、Mgを除いた）1mlにて混
合し、前記マウスの静脈内に０日GD3ガングリオシド量
で５μｇ、４日10μｇ、７日15μｇ、12日20μｇ、79日
20μｇ、３日後に脾臓を摘出し脾細胞の懸濁液を作製し
細胞融合に用いた。 （２） 細胞融合法 上記で得られた脾細胞リンパ球と前記親細胞のマウス
ミエローマ細胞との細胞融合をケーラーおよびミルシュ
タインの方法に従って実施した。すなわち、１×108個
の脾細胞リンパ球を、50％のポリエチレングリコール
（PEG6000）の存在下で、２×107個の骨髄腫細胞と融合
した。 （３） ハイブリドーマの選択および成長 細胞の融合後、得られた細胞をHAT培地（ヒポキサン
チン、アミノプテリンおよびチミジン）中で37℃におい
て５％のCO2を使用して培養した。 （Ｃ） モノクローナル抗体とガングリオシドとの反応
性の評価 （１） 酵素抗体法（ELISA法） 96穴式平底プレート（ファルコン社製）をエタノール
で前処理して実験に使用した。エタノールにて至適濃度
GD3ガングリオシド20μg/mlとした抗原溶液50μｌを各
プレートに分注し蒸発させた後、１％卵白アルブミンPB
S（−）溶液100μｌを加え30分間室温に放置した。プレ
ートを下向きに振って溶液を除いた後、一次抗体として
ハイブリドーマ培養液を50μｌ加え室温に１時間30分放
置した。同様にしてプレートから一時抗体を除きPBS
（−）溶液150μｌを加え３回ウェル（well）を洗浄し
た後に１％卵白アルブミンPBS（−）溶液100μｌを加え
30分間放置した。この溶液を除いた後に１％卵白アルブ
ミンPBS（−）にて至適濃度に希釈した２次抗体50μｌ
を加え室温で１時間30分放置した。一次抗体と同様にPB
S（−）で３回ウェルを洗浄し反応溶液100μｌをウェル
に注ぎ暗所にて反応を進行させた。反応溶液はクエン酸
−リン酸緩衝液（pH＝５）にオルトフェニレンジアミ
ン、過酸化水素水の最終濃度が0.4mg/ml、0.01％となる
様調整し実験に使用した。反応は8N硫酸を30μｌ加えて
停止させ、500nmの吸収波長にて比色測定を行った。２
次抗体としては西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標
識ヤギ抗マウスIgG.M.A抗体を使用した。 その結果を第１図に示す。 ○はガングリオシドGD3を示す。 ●はガングリオシドGM3を示す。 この図からガングリオシドGM3およびGD3は、本発明の
モノクローナル抗体を高い抗原抗体反応を起こすことが
判かる。したがって、ガングリオシドGM3およびGD3はい
ずれも本発明のモノクローナル抗体に対する抗原決定基
を有する。しかし、ガングリオシドGD3の方がガングリ
オシドGM3より高い抗原抗体反応を起こすのでガングリ
オシドGD3により高い特異性を有するエピトープ（抗原
決定基）があることが判る。 （２） TLC免疫染色（immuno staining）法 シリカゲル薄層クロマト（TLC（poly gram SIL G）プ
レートを適当な大きさに切りクロロホルム：メタノール
＝1:1（v/v）に溶解した糖脂質をプレート上にスポット
した。目的に応じてこのプレートをクロロホルム：メタ
ノール：水＝60:40:10（v/v）、クロロホルム：メタノ
ール:0.5％CaCl2＝55:45:10（v/v）あるいはクロロホル
ム：メタノール:2.5N NH4OH＝60:40:9（v/v）の展開溶
媒で展開し、１％卵白アルブミン１％ポリビニルピロリ
ドン（Ｋ−30）PBS（−）溶液にて一晩４℃に放置し
た。次いで一次抗体に浸たし２時間室温で振とうした。
PBS（−）にて十分に洗浄した後、１％卵白アルブミン
１％ポリビニルピロリドン（Ｋ−30）PBS（−）に室温
で30分浸たした。プレートをとり出し３％ポリビニルピ
ロリドン（Ｋ−30）PBS（−）溶液にて至適濃度に希釈
した２次抗体に十分浸たし室温で２時間振とうした後、
PBS（−）で十分洗浄し、反応液を加えた。反応液は４
−クロロ−−１−ナフトール4mgをメタノール1mlに溶解
した後50mmolトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、200mmol NaCl（pH＝7.4）緩衝液を5ml加え、0.01％
になる様過酸化水素水を加えて実験に使用した。反応は
水洗により停止させ、プレートを風乾した。 （３） 本発明のモノクローナル抗体に対するエピトー
プ（抗原決定基）の同定： 第２図はTLC染色法（オルシノール染色）（Ａ）およ
びTLC免疫染色法（Ｂ）を使用した各種糖脂質の定性及
び免疫反応試験の結果を示している。この図からレーン
５のガングリオシドGD3は、本発明のモノクローナル抗
体に対する抗原決定基を有することがわかる。 また、レーン３のガングリオシドGD3にビブリオ・コ
レラ シアリダーゼ（Vibrio cholera Sialidase）を作
用させた場合に生ずるCDH（Gal-Glc-Cer）は、TLC免疫
染色により検出されなかった。このことにより、Gal-Gl
c-Cer（CDH）構造は、本発明のモノクローナル抗体の抗
原決定基とはなり得ないことがわかる。また、レーン３
のTLC免疫染色に表われたバンドは、前記シリダーゼの
作用を受けなかったガングリオシドGD3を示している。
さらに、レーン１のCMHはGal-Cer、レーン２のCMHはGlc
-Cerを表わし、レーン４のCTHは、Gal-Gal-Glc-Cerを表
わす。 これらの構造は、TLC免疫染色されなかったことから
本発明のモノクローナル抗体の抗原決定基にはなり得な
いことがわかる。 以上から本発明のモノクローナル抗体のエピトープ
（抗原決定基）はＮ−アセチルノイラミン酸であること
がわかる。 以下、第２図の説明をする。 同様に、Ｎ−アセチルノイラミン酸を有する各種ガン
グリオシド類のTLC免疫染色の結果を表−１に示す。 （４） 本発明のモノクローナル抗体に対するエピトー
プ（抗原決定基）の同定： 第３図は、第２図と同様にTLC染色法（Ａ）およびTLC
免疫染色法（Ｂ）により得られた各種糖脂質の定性及び
免疫反応試験の結果を示す。この図から、レーン２およ
び３は天然型のガングリオシド、すなわちα２→３結合
を有するＮ−アセチルノイラミン酸であり、本発明のモ
ノクローナル抗体に対して強い特異性を示すことがわか
る。 また、レーン４および５はβ２→３結合を有する化合
合成Ｎ−アセチルノイラミン酸誘導体であり、合成型の
ガングリオシドに対しては、本発明のモノクローナル抗
体は特異性を示さないことがわかる。 （３）で得られた知見と本知見とを総合的に考察する
と、本発明のモノクローナル抗体は、Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸のα２→３結合をエピトープ（抗原決定基）と
して認識することがわかる。 以下、第３図の説明をする。 （５） 定性的免疫拡散法（Ouchterlony法） 第４図は免疫拡散法を使用した結果を示す。この図に
より、本願発明のハイブリドーマより産生されるモノク
ローナル抗体はIgMであることがわかる。αMIgM、αMIg
G1、2a2bおよび３の抗血清はそれぞれマイルス）社から
購入した。 （１） αMIgM （２） αMIgG1 （３） αMIgG2a （４） αMIgG2b （５） αMIgG3 （６） また表−２から、以下の結果に示すように酵素
抗体法によってもIgMであることが示された。
【図面の簡単な説明】
第１図は酵素抗体法による抗原に対するモノクローナル
抗体の特異性を示し、第２図および第３図は、クローナ
ル抗体に対する各種ガングリオシドの抗原特異性を示
し、第４図はモノクローナル抗体の抗体種の確認図を示
す。
抗体の特異性を示し、第２図および第３図は、クローナ
ル抗体に対する各種ガングリオシドの抗原特異性を示
し、第４図はモノクローナル抗体の抗体種の確認図を示
す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｂ
Ｇ０１Ｎ 33/574 33/577 Ｂ
33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ
(Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａ
ｃｔａ，875［１］ （1986） Ｐ．126
−128
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．α２→３結合を有するＮ−アセチルノイラミン酸を
含有するシアル酸含有糖脂質に特異性を有するモノクロ
ーナル抗体であって、Ｎ−アセチルノイラミン酸のα２
→３結合をエピトープ（抗原決定基）とするモノクロー
ナル抗体。 ２．シアル酸含有糖脂質がガングリオシド糖脂質である
特許請求の範囲（１）項記載のモノクローナル抗体。 ３．ガングリオシドがGD3ガングリオシドまたはGM3ガン
グリオシドである特許請求の範囲（２）項記載のモノク
ローナル抗体。 ４．IgMタイプの免疫グロブリン分子である特許請求の
範囲（１）項記載のモノクローナル抗体。 ５．ガングリオシドを精製処理する際に使用する特許請
求の範囲（２）項記載のモノクローナル抗体。 ６．メラノーマ細胞表面抗原と特異的に反応する特許請
求の範囲（２）項記載のモノクローナル抗体。 ７．メラノーマ患者の治療に使用し得る特許請求の範囲
（６）項記載のモノクローナル抗体。 ８．血清診断に使用し得る特許請求の範囲（６）項記載
のモノクローナル抗体。
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|---|---|---|---|
| JP62290310A JP2754206B2 (ja) | 1987-11-17 | 1987-11-17 | α２→３結合を認識するモノクローナル抗体 |
| KR1019880014846A KR960014441B1 (ko) | 1987-11-17 | 1988-11-11 | 알파 2-3 결합을 인지하는 단일클론성 항체 |
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| EP88119045A EP0316882B1 (en) | 1987-11-17 | 1988-11-15 | Monoclonal antibody recognizing alpha 2-- 3 bonds |
| AT88119045T ATE108482T1 (de) | 1987-11-17 | 1988-11-15 | Alpha 2-3-verbindungen erkennender monoklonaler antikörper. |
| NZ226974A NZ226974A (en) | 1987-11-17 | 1988-11-15 | Hybridoma producing a monoclonal antibody recognising #a#2-3 bonds and the antibody produced |
| FI885279A FI95043C (fi) | 1987-11-17 | 1988-11-15 | Menetelmä 2 3-sidoksen tunnistavan monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi ja vasta-ainetta tuottava hybridooma |
| DE3850634T DE3850634T2 (de) | 1987-11-17 | 1988-11-15 | Alpha 2-3-Verbindungen erkennender monoklonaler Antikörper. |
| NO885113A NO173556C (no) | 1987-11-17 | 1988-11-16 | Monoklonalt antistoff som gjenkjenner alpha-2-3-bindinger, og hybridomcellelinje som produserer antistoffet |
| CA000583272A CA1337800C (en) | 1987-11-17 | 1988-11-16 | Monoclonal antibody recognizing alpha 2 --> 3 bonds |
| HU885935A HU204573B (en) | 1987-11-17 | 1988-11-16 | Process for producing monoclone antibodies recognizing alpha-2-3 bonds of n-acetyl-neuraminic acid |
| CN88107887A CN1042734A (zh) | 1987-11-17 | 1988-11-16 | 识别α2→3键的单克隆抗体 |
| AU25186/88A AU624583B2 (en) | 1987-11-17 | 1988-11-17 | A hybridoma producing a monoclonal antibody |
| IL88400A IL88400A (en) | 1987-11-17 | 1988-11-17 | Monoclonal antibody which recognizes the epitope n-acetylneuraminic acid having an : 24 3 linkage |
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|---|---|---|---|
| JP62290310A JP2754206B2 (ja) | 1987-11-17 | 1987-11-17 | α２→３結合を認識するモノクローナル抗体 |
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