JPH03103190A - 腫瘍関連ガングリオシド及びフコガングリオシドに対するモノクローナル抗体及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は腫瘍関連ガングリオシドに対するモノクローナ
ル抗体の改良された製造法並びにその方法により製造さ
れるハイブリドーマ及びモノクローナル抗体に関する。

より詳しくは、本発明は精製されたガングリオシド　ラ
クトンを免疫ステップでブースターとして用いる、腫瘍
関連ガングリオシドに対するモノクローナル抗体の新規
な製造法に関する。本発明はさらに、改良された方広に
より製造される新規なハイブリドーマ及び該ハイブリド
ーマから産生される新規なモノクローナル抗体に関する
。該モノクローナル抗体はガングリオシドを含む腫瘍の
検出及び治療に有用である。

従来の技術 細胞は細胞膜で囲まれている。細胞膜はその中にグリコ
スフィンゴリピッドと呼ばれる成分を含む。この戊分は
細胞の特徴的表面構造の形戊に役立っている。細胞の各
タイプは、細胞膜に存在するガングリオシドとして知ら
れる戊分を含むグリコスフィンゴリピッドの特性により
特，徴付けられる。ガングリオシドはシアル酸として知
られる特別なタイプの酸性炭水化物を含む。さらに、腫
瘍細胞を含む多くの特定のタイプの細胞は、その細胞膜
中に特別なタイプのガングリオシドを含むことにより特
徴付けられる。

近年、ヒト腫瘍細胞又は組織で免疫することにより、多
くのモノクローナル抗体が確立された。

これらのモノクローナル抗体はその腫瘍細胞に対する反
応陽性及び正常細胞又は組織に対する反応陰性により選
択される。メラノーマ、ニューロブラストーマ、アデノ
カルシノーマに対する選択的反応性により選択された多
くのモノクローナル抗体は、ガングリオシドに対するも
のであることが確認されている。特異的イソタイプ（特
にＩｇＧ３及びＩｇＧ２−）でありガングリオシドに対
し強い反応性を示すこれらの抗ガングリオシド抗体の幾
つかは、イン　ビボで腫瘍の成育を抑制することが見出
だされた。例えば、幾人かの患者のメラノーマは特異的
抗ＧＤ３ガングリオシド抗体の大量投与により抑制され
た［Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２．１２
４２−１２４６（１９８５）］。さらに、最近、ＢＣＧ
細菌に吸収させたＧＭ２が、検出可能な免疫反応を起こ
すことが示された。このように、ＧＭ２はヒトメラノー
マに対して有用なワクチンとなり得ると述べられている
［Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｐ．０．ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４．２９
１１−２９１５（１９８７）］。このように、ガングリ
オシドは腫瘍組織及び腫瘍細胞の重要な抗原又は免疫原
である［ｌＩａｋｏｍｏｒｉ　．Ｓ．　，Ａｎｎｕ．Ｒ
ｅｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２．１０３−１２６（１９
８４）　；Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．　．Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ　ｏｆＬｉｐｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｖｏ１．３．
Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
Ｋａｎｆｅｒ．Ｊ．Ｎ．ｅｔ　ａｌ編．　Ｐｌｅｎｕｍ
出版．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．ｌ−１６５頁（１９８３）　
；　Ｈａｋｏｍｏｒｉ．Ｓ．．Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．．２
５４．４４−５３（１９８６）　］。

しかしながら、ガングリオシドは重要な細胞タイプ特異
的マーカーであるが、液性又は細胞性免疫反応を生じさ
せるには弱い免疫原でしかない。

ガングリオシドの小部分は腫瘍細胞及び組織にそのラク
トン型で存在する。例えば、メラノーマ細胞に存在する
ＧＭ３と呼ばれる特別なガングリオシドの０．１．％以
下が、そのラクトンであると確認された。ガングリオシ
ドラクトンはシアル酸のカルボキシル基及び同じ分子内
の糖残基の一級又は二級水酸基の間での内部エステルで
あることが確認された。

ガングリオシド　ラクトンが検出され、それが天然に生
成する細胞膜成分であると信じられているにもかかわら
ず、その量は非常に少なく、従って天然での生成につい
ては論争中である［Ｎｏｒｅｓ，Ｇ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ１．．１３９．３１７１−３１７８（
１９８７）　：Ｒｉｂｏｎｉ　，　Ｌ．　，　Ｊ　．Ｂ
ｉｏ　ｌ　．Ｃｈｅｍ．　．　２６１　．　８５１４−
８５１９　（１９８６）］。

ガングリオシド　ラクトンは、その天然生成に問題はあ
るが、それ自身は強い免疫原であり、本来のガングリオ
シドよりも非常に強い免疫反応を生起させ得る［Ｎｏｒ
ｅｓ．Ｇ．Ａ．ｅｔ　ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．．Ｌ
３９，３１７１−３１７６（１９８７）］　．ざらにノ
アス（Ｎｏｔｅｓ　）らは、免疫原としてガングリオシ
ド　ラクトンを用いて得た抗体はＩｇＧ３タイプである
ことを見出した。

本発明においては、ハイブリドーマ製造における免疫ス
テップで、腫瘍細胞及び腫瘍細胞膜の使用に引続き精製
ガングリオシド　ラクトンのブーストを行うと、ヒト癌
関連フコガングリオシドを含む種々の腫瘍関連ガングリ
オシドに対するモノクローナル抗体を産生ずる新規なハ
イブリドーマが得られることが発見された。さらに、新
規な抗体のなかには既知の抗体と類似の結合特異性を示
すものもあるが、そのイソタイプは異なる。従って、そ
の薬力学的活性は異なることが期待される。

又、新規な抗体の多くは独特の交叉反応性を有する。

従って本発明の目的は、腫瘍関連ガングリオシド、特に
腫瘍関連フコガングリオシドに対する抗体を製造する改
良された方法を提供することにある。

腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体を産生ずる新
規なハイブリドーマを提供することもまた、本発明の目
的である。

さらに本発明の目的は、腫瘍関連抗原に対する新規なモ
ノクローナル抗体を提供することにもある。

本発明の他の目的の一つは、ガングリオシドを含む腫瘍
を治療するための、受動免疫方法を提供することにある
。

さらに本発明の他の目的は、ガングリオシドを含む腫瘍
の検出方法を提供することである。

問題を解決するための手段 以下に本発明を詳細に説明し、本発明の上記又は他の目
的を具体的に明らかにする。

本発明の一態様は、腫瘍関連ガングリオシドに結合する
モノクローナル抗体の製造法に関する。

本方法は、 （１）宿主を腫瘍細胞で免疫し、 （２）腫瘍細胞膜と少なくとも１種の精製ラクトン化腫
瘍関連ガングリオシドとの混合物を含む懸濁液で該宿主
をブーストし、 （３）担体に吸着または結合した腫瘍関連ガングリオシ
ド　ラクトンを含む免疫原で該宿主をブーストし、 （４）該宿主からの免疫細胞にミエローマ細胞を融合し
てハイブリドーマ細胞を形成させ、（５）ステップ（３
）の該ガングリオシドに桔合する抗体を産生ずるハイブ
リドーマ細胞を選択し、 （６）選択された該ハイブリドーマ細胞を培養し、及び （７）該抗体を回収する各ステップを含む。

本発明はさらに、以下の同定上の特徴を有するモノクロ
ーナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞ラインを提供
する。

（１）ＩｇＭイソタイプであり、 （２）（ａ）シアリルＬｅｘ及び （ｂ）シアリル　ジフコシルＬｅｘに結合する。

本発明はさらに、以下の同定上の特徴を有するモノクロ
ーナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞ラインを提供
する。

（１）ＩｇＧｔイソタイプであり、 （２）シアリル２→３Ｌｅ　　に結合する。

本発明はさらに、以下の同定上の特徴を有するモノクロ
ーナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞ラインを提供
する。

（１）ＩｇＭイソタイプであり、 （２）（ａ）シアリル２→３Ｌｅａａ （ｂ）Ｌｅａ （ｃ）Ｌｅ　　エピトープを有するペンタオシルセ゜ラ
ミド及びヘキサオシルセ ラミド （ｄ）Ｌｅ　　／Ｌｅ　　ハイブリッド及び（ｅ）ラク
トイソオクタオシルセラミドの二価のＬｅａ に結合する。

本発明はさらに、以下の同定上の特徴を有するモノクロ
ーナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞ラインを提供
する。

（１）Ｉ　ｇＧ１イソタイプであり、 （２）（ａ）シアリル２→３Ｌｅ　　及び（ｂ）補助的
脂質を用いて、またはプラスチック被覆プレートを用い
たＴＬ Ｃ免疫染色により試験したとき、シ アリル２→３　タイプ１鎖パラグロ ボシドに結合する。

他の態様において、本発明は上記の同定上のハイブリド
ーマから産生ずるモノクローナル抗体を提供する。

他の態様において、本発明は、 （１）宿主を腫瘍細胞で免疫し、 （２）腫瘍細胞膜と少なくとも１種の精製ラクトン化腫
瘍関連ガングリオシドとの混合物を含む懸濁液で該宿主
をプーストし、 （３）担体に吸着または結合した腫瘍関連ガングリオシ
ド　ラクトンを含む免疫原で該宿主をプーストし、 （４）該宿主からの免疫細胞にミエローマ細胞を融合し
てハイブリドーマ細胞を形成させ、（５）ステップ（３
）の該ガングリオシドに結合する抗体を産生ずるハイブ
リドーマ細胞を選択し、 （６）選択された該ハイブリドーマ細胞を培養し、及び （７）該抗体を回収する、 各ステップを含む方法により製造された薬理的有効量の
抗体を対象に投与することから成る、ガングリオシドを
含む腫瘍を治療するための受動免疫方法を提供する。

他の態様において本発明は、 （Ａ）（１）宿主を腫瘍細胞で免疫し、（２）腫瘍細胞
膜と少なくとも１種の精製ラクトン化腫瘍関連ガングリ
オシ ドとの混合物を含む懸濁液で該宿主 をブーストし、 （３）担体に吸着または結合した腫瘍関連ガングリオシ
ド　ラクトンを含む 免疫原で該宿主をブーストし、 （４）該宿主からの免疫細胞にミエローマ細胞を融合し
てハイブリドーマ細 胞を形成させ、 （５）ステップ（３）の該ガングリオシドに結合する抗
体を産生ずるハイブ リドーマ細胞を選択し、 （６）選択された該ハイブリドーマ細胞を培養し、及び （７）該抗体を回収する、 各ステップを含む方法により製造される抗体に試験試料
を接触させ、 （Ｂ）該試験試料中に含まれる抗原に対する上記抗体の
特異的結合を測定する、 各ステップを含むガングリオシドを含む腫瘍の検出方法
を提供する。

本発明に従えば、腫瘍関連ガングリオシドに対するモノ
クローナル抗体を製造する新規な方法が提供される。本
方法の重要な点は、宿主の免疫に腫瘍関連ガングリオシ
ドのラクトンを用いたブースター　ステップが含まれる
ことである。

本方法は、 （１）宿主を腫瘍細胞で免疫し、 （２）腫瘍細胞膜と少なくとも１秤生精製ラクトン化腫
瘍関連ガングリオシドとの混合物を含む懸濁液で該宿主
をブーストし、 （３）担体に吸着または結合した腫瘍関連ガングリオシ
ド　ラクトンを含む免疫原で該宿主をブーストし、 （４）該宿主からの免疫細胞にミエローマ細胞を融合し
てハイブリドーマ細胞を形戊させ、（５）ステップ（３
）の該ガングリオシドに結合する抗体を産生ずるハイブ
リドーマ細胞を選択し、 （６）選択された該ハイブリドーマ細胞を培養し、及び （７）該抗体を回収する、 各ステップを含む。

本方法のステップ（１）及び（２）で夫々使用される腫
瘍細胞および腫瘍細胞膜は特に制限されず、腫瘍細胞抗
原に対する抗体を産生ずるハイブリドーマの製造に通常
用いられるものを任意に使用できる［Ｆｕｋｕｓｈｉ　
ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．）３ｆｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９．
４６７２−４６８０　（１９８４）　；　Ｊ　．Ｂｉｏ
　ｌ　．Ｃｈｅｍ　．　．　２５９　．　１０５１１−
１０５１７（１９８４）］　。

その例としては結腸癌細胞（例えばＳＷ９４８及びｃｏ
ｌｏ　　２０５）、及びヒト肺カルシノマ細胞（例えば
ＰＣ９）等が含まれる。

腫瘍細胞による免疫は通常の方法に従いおこなわれる。

ステップ（２）に使用される膜分画は常法により調製さ
れる［Ｐｕｋｕｓｈｉ．ｅｔ　ａｌ．ｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５９．４５７２−４６８０（１９８４）　：
Ｊ．Ｂｉｏｌ　．Ｃｈｅｍ．　，２５９，ｌ０５Ｌｌ−
１０５Ｌ７（１９８４）　］。

腫瘍細胞膜と少なくとも一種の精製ラクトン化腫瘍関連
ガングリオシドとの混合物が、ステップ（２）の免疫に
使用される。該混合物は膜分画に精製ラクトン化腫瘍関
連ガングリオシドを加え、ｐＨ６．０〜６．５（このｐ
Ｈではラクトンが安定である）でインキユベートするこ
とにより調製できる。あるいは該混合物は、腫瘍細胞膜
ガングリオシド及び精製ガングリオシドをラクトン化す
る既知の方法で混合物を処理することによっても調製で
きる。

例えば、膜分画を調製し、５％酢酸に懸濁し、精製ガン
グリオシドと混合し、その後凍結乾燥する。この方法は
ラクトン化と膜ガングリオシドの豊富化を起こす。

凍結乾燥された物質をＰＢＳに懸濁し、よく知られた方
法に従い静脈内投与する。

本発明のステップ（２）及び（３）に使用される腫瘍関
連ガングリオシドは重要ではない。このような腫瘍関連
ガングリオシドの例はメラノーマに認められるＧＤ３　
　［Ｐｕｋｅｌ．Ｃ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．ｉ．Ｅｘｐ、Ｍ
ｅｄ．，１５５．１１３３−１１４７（１９８２）；Ｎ
ｕｄｅｌｍａｎ，Ｅ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃ
ｈｅｍ．，２５７．１２７５２−１２７５６（１９８２
）　］　、メラノーマ及びニューロブラストーマの様な
神経外胚葉性腫瘍に認められるＧＤ２　　［Ｃａｈａｎ
，Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７９．７６２９−７６３３（１９８２
）　］　、胃腸及び膵臓癌に認められるシアリルＬｅａ
［Ｍａｇｎａｎｉ．Ｊ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏ１
．Ｃｈｅｍ．．２５７．１４３６５−１４３６９（１９
ｇ２）　］　、結腸直腸、胃腸及び肺腺癌に認められる
シアリルＬ　ｅ　ｘ［Ｐｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｋ．ｅｔ　
ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，４４．５２７９−５
２８５（１９８４）］　、結腸直腸、胃腸及び肺腺癌に
認められるシアリル　ジフコシルＬ　ｅ　　［Ｆｕｋｕ
ｓｈｉ．Ｙ．ｅｔ　ａ１１．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．．２
５９．１０５１１−１０５１７（１９８４）　］　、メ
ラノーマに認められるＧＭ３　　［Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ
，Ｍ．．Ｇａｎｎ，７５，４１８−４２６（１９８４）
；Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ．Ｙ　ｅｔ　ａｌ．．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．ＣｏｍＩＩｌｕｎ
．　．　１１３　，　７９１−７９８　（１９８３）　
：Ｎｏｒｅｓ　．Ｇ．ｅｔ　ａｌ　．　．　Ｊ　．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ　．　，　１３９　．　３１７１−３１７６
　（１９８７）コ、結腸直腸カルシノーマに認められる
６Ｃガングリオシド［１１ａｋｏｍｏｒｉ．Ｓ．ｅｔ　
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃ
ｏｍｍｕｎ．，１１３，７９１−７９８（１９８３）　
］　、ミエロゲナスリューケミア細胞に認められるＧ２
ガングリオシド［Ｆｕｋｕｄａ．Ｙ．ｅｔ　ａｌ．．Ｊ
．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ．，２６１．５４８７−５４９５
（１９８Ｂ）］　、結腸直腸癌に認められるジシアロシ
ルＬ　ｅ　ａ［Ｎｕｄｅｌｍａｎ．Ｅ．ｅｔ　ａｌ．．
Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．．銭貝５４８７−５４９５（
１９８６）　］　、結腸直腸カルシノーマ・及びテラト
カルシノーマに認められるモノシアリル　タイプ１鎖［
Ｎｉｌｓｓｏｎ．Ｏ．ｅｔ　ａｌ．．ＰＥＢｓＬｅｔｔ
ｅｒｓ，１８２．３９８−４０２（　↓９８５）；Ｆｕ
ｋｕｄａ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ　　ａｔ．，Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃ
ｈｅｍ．２６１．５１４５−５１５３（１９８Ｂ）コ、
結腸直腸癌に認められるジシアロシル　タイプ１鎖［Ｐ
ｕｋｕｓｈｉ．Ｙ．ｅｔ　ａｌ．．Ｂｉｏｃｈｅｍ．．
２５．２８５９−２８６６（１９８６）］　、小細胞肺
カルシノーマに認められるフコシルＧＭ．　　［Ｎｉｌ
ｓｓｏｎ．０．ｅｔ　ａｌ．．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅ　Ｊ．，１．４３−４９（１９８４）　］等を含
む。

本方法のステップ（３）に用いるガングリオシドのラク
トンは既知の方法により製造できる［Ｎｏｒｅｓ，Ｇ．
Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ１．，１３９．３
１７１−３１７６（１９８７）コ　。

例えば、ラクトンは任意のガングリオシドを氷酢酸に溶
解し、溶液を少なくとも４８時間放置した後、酢酸を凍
結乾燥することにより調製できる。

ガングリオシド　ラクトンの生成は、薄層クロマ１・グ
ラフィによりモニターできる。薄層クロマトグラフィに
あたっては、ガングリオシド　ラクトンは薄層クロマト
グラフィ上で本来のガングリオシドよりも顕著に高い移
動性を示すため、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｃｏ．　（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）から
購入した高速薄層クロマトグラフィ　ブレート及び０．
０５％（ｗ／ｖ）Ｃ　ａ　Ｃ　１　２を含むクｏｏホル
ム：メタノール：水（５０：４０：１０（ｖ／ｖ／ｖ）
　）を溶媒として使用する。上記溶媒組戊は特に限定さ
れず、ラクトンからガングリオシドを分離可能な任意の
知られた溶媒、例えばノアーズ（Ｎｏｒｅｓ．Ｇ．Ａ．
）らの記載したものを使用できる［Ｊ．Ｉｎ＋ｍｕｎｏ
ｌ．，１３９．３１７１−３１７６　（１９８７）］。

また、より効率的には、ガングリオシド　ラクトンは任
意のガングリオシドをクロロホルム：メタノール：　１
　２Ｎ　　ＨＣ　１　（１０：３５：４．５（ｖ／ｖ／
ｖ））に溶解し、溶液を約１日放置することに・より調
製できる。得られた溶液をＤＥＡＥ−セファデックスを
用いクロロホルム：メタノール：水（０．１：１：１　
（ｖ／ｖ／ｖ）　）でクロマトグラフィを行う。主な２
成分及び構造の未だはっきりしていない幾つかの少量の
成分が、この系で分析できる。得られたガングリオシド
　ラクトンは、ワタナベ（　％（ａｔａｎａｂｅＫ．）
らの方法により　［Ｊ．Ｌｉｐｉａ　Ｒｅｓ．．２２．
１０２９−１０２４（１９８１）］　、イアトロビーズ
（Ｉａｔｒｏｂｅａｄｓ）　６ＲＳ８０１０を用いたＨ
ＰＬＣで、イソプロパノール：ヘキサン：水（５５：２
５：２０（ｖ／ｖ／ｖ）　）中で勾配溶離により精製で
きる。精製されたガングリオシド　ラクトンの構造は、
リボニ（Ｒｉｂｏｎｉ　．　Ｌ．　．　）の方法で［Ｊ
．Ｂｉｏｌ　．Ｃｈｅｍ．，２６１．８５１４−８５１
９（１９８６）］、直接プローブ高速原子衝撃質量スペ
クト口メトリ−　（ｄｉｒｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ　ｆａｓ
　　ａｔｏｍ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　ｍａｓｓｓｐ
ｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）により確認できる。

ガングリオシド　ラクトンはカルボジイミドの処理によ
っても調製できる［Ｓｏｎｎｉｎｏ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．
Ｇｌｙｃｏｅｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｊ．．２，３４３−３
５４（１９８５）　］。

精製したラクトン化ガングリオシドは、適当な担体と共
に宿主に静脈内投与される。

腫瘍関連ガングリオシドのラクトンと共に用いられる担
体は、本発明では制限されない。このような使用できる
担体の例として酸処理サルモネラミネソタ（Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ　ｍｉｎｎｅｓｏｔａｅ　）　、ニューキャ
ッスル病ウイルス膜のような再構成ウイルス膜、及びオ
クチルグルコースとインキュベートの後透析した任意の
再構成細胞膜を挙げることができる。

ハイブリドーマ製造のため免疫される宿主は本発明では
制限されない。適当な宿主の例には、マウス、ウサギ、
ラット及びヒツジが含まれる。

本明細書で用いられる「免疫細胞」の用語は、免疫され
た宿主の感作された牌臓細胞、例えばＢａｌｂ／ｃマウ
スのようなマウスのそれのことをいう。

本発明で使用される特別なミエローマ細胞も限定的では
なく、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヒト由来
のハイブリドーマ調製に有用な良く知られたミエローマ
細胞を用いることができる。

このようなミエローマ細胞の例には、ＮＳ／１細胞およ
びＳｐ−２細胞のようなＨＡＴ感受性マウス　ミエロー
マ細胞が含まれる。

本発明において投与される腫瘍細胞、膜とガングリオシ
ドの混合物及び腫瘍関連ガングリオシドラクトンの量は
免疫される動物の年齢、体重、性および種によって変化
し、この技術の当業者が容易に決めることができる。例
えば、ラクトンの免疫原としての適当な有効量としては
、投与１回当り２０〜１００μｇの担体に吸収させた約
２．０〜５．０μｇである。

本発明に於いて、マウスの様な動物のガングリオシド　
ラクトンによる免疫、免疫細胞の単離、免疫細胞の例え
ばマウス　ミエローマ細胞との融合および得られた融合
細胞のハイブリドーマの生育できる条件下での培養は、
全て技術的にすでに確立された良く知られた方法により
行われる［Ｙｏｕｎｇ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ　　ａｌ．，Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．．ｌ５０．ｌＯ０８一王０１９（１９
７９）　　；　Ｐｕｋｕｓｈｉ，Ｙ．ｅｔ　ａｌ．．Ｊ
．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．．２５９．４６８１−４６８５
（１９８４）　］。

得られたハイブリドーマをスクリーンし、ステップ（３
）でラクトンの調製に用いたガングリオシドに特異的に
結合するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ
を単離する。スクリーンは、例えばガングリオシド被覆
ウエルを用いた固相ラジオイミュノアッセイ及び第２抗
体（ウサギ抗マウス１　ｇＭ＋　Ｉ　ｇ　Ｇ　（Ｍｉｌ
ｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ
）　）と１２５■ラベル化プロテインＡとを用いたアッ
セイで行う。

このようにして本発明方法により単離したハイブリドー
マから分泌されるモノクローナル抗体は、ハイブリドー
マ細胞を大バッチで生育させ上清から抗体を精製するこ
とにより、またはハイブリドーマ　ラインをマウスに投
与して腹腔液の生成を刺激することにより、大量に製造
できる。両方法はいずれもこの技術分野で良く知られて
いる。

本発明に従い単離されたハイブリドーマは懸濁培地で大
バッチで生育でき、又はより簡便には、細胞がパックさ
れ、高密度で生育でき、その中で抗体が培地中に拡散さ
れ得るファイバーグラスコンテナ中で生育できる。本発
明に従いモノクローナル抗体を大量に製造する方法は上
記ヤング（Ｙｏｕｎｇ　）らが記載している。

モノクローナル抗体は知られた方法、例えばプロテイン
Ａを用いたアフィニティ分離、或いは、逆層アルキル化
シリカゲル上の又は合成ポリスチレン　ゲル濾過カラム
を用いた高圧液体クロマトグラフィにより精製できる。

上記の方法に従い製造された新規ハイブリド−マは、ヒ
ト癌関連フコガングリオシドを含む種々の腫瘍関連ガン
グリオシドに対する新規モノクローナル抗体を産生ずる
。これらの新規抗体は、同様の結合特異性を示す既知の
抗体とは異なるイソタイプを有し、新規抗体の多くは独
有の交叉反応性を有する。さらに、本方法は、予期せず
にＩｇＧ３以外のイソタイプを持つ抗体が得られる点で
、従来のフコガングリオシドで免疫する方法とは異なる
。このイソタイプにはＩｇＭ及びＩｇＧ１が含まれる。

上記方法に従い単離された５種の好ましいモノクローナ
ル抗体はＳＮＨ３、ＮＫＨ１、ＮＫＨ２、ＮＫＨ３及び
ＮＫＨ４である。これらのモノクローナル抗体を産生ず
るハイブリドーマは夫々ハイブリドーマＳＮＨ３、ＮＫ
Ｈ　１、ＮＫＨ２、ＮＫＨ３及びＮＫＨ４と呼び、，Ｒ
ｏｃｋｖｉ　ｌＩｅ．ＭａｒｙｌａｎｄのＡｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎに１９８９年１月５日寄託され、夫々、ＡＴＣＣ寄託
番号ＨＢ９９４１、ＨＢ９９４２、ＨＢ９９４３、ＨＢ
９９４４、ＨＢ９９４５を有する。

本発明に従うモノクローナル抗体ＳＮＨ３は、ハイブリ
ドーマＳＮＨ３から産生され、以下の重要な特徴を有す
る。

（１）ＩｇＭイソタイプであり、 （２）（ａ）シアリルＬｅＸ及び （ｂ）シアリル　ジフコシルＬｅｘに結合する。

（３）特にプラスティック　コーティング物質で前処理
したＴＬＣ免疫染色において （ａ）２→３シアリルノルへキサオシルセラミド（ＶＩ
３ＮｅｕＡｃｎＬｃ６　）及び （ｂ）拡張ＬｅＸ（Ｖｌ３ＮｅｕＡｃＩＩＩ３Ｆｕｃｎ
Ｌｃ６） と弱く結合する。

この反応性は、ＦＨ６及びＣＳＬＥＸを含む多くの同様
の知られた抗体とは異なるものである。

本発明に従うモノクローナル抗体ＮＫＨ１は、ハイブリ
ドーマＮ　Ｋ　Ｈ　１から産生され、以下の重要な特徴
を有する。

（１）ＩｇＧエイソタイプであり、 （２）シアリル２→３Ｌｅａに結合する。

この反応性は公知のモノクローナル抗体Ｎ−１９−９及
びＣＳＬＥＡと類似している。しかし、モノクローナル
抗体ＮＫＨ１のイソタイプはＮ−１９−９及びＣＳＬＥ
Ａとは異なり、したがってその薬力学的活性はＮ−１９
−９及びＣＳＬＥＡとは異なることが予想される。

本発明に従うモノクローナル抗体ＮＫＨ２はハイブリド
ーマＮ　Ｋ　Ｈ　２から産生され、以下の重要な特徴を
有する。

（１）ＩｇＭイソタイプであり、 （２）（ａ）シアリル２　→　３　Ｌｅａ（ｂ）Ｌｅａ （Ｃ）Ｌｅａエピトーブを有するペンタオシルセラミド
及びヘキサオシル セラミド （ｄ）Ｌｅ　　／Ｌｅ　　ハイブリッド及び（ｅ）ラク
トイソオクタオンルセラミドの二価のＬｅａ に結合する。

モノクローナル抗体ＮＫＨ２は、Ｌｅａ含有構造に対す
る交叉反応性において独有のものである。

本発明に従うモノクローナル抗体ＮＫＨ３及びＮＫＨ４
はハイブリドーマＮＫＨ３及びＮＫＨ４から夫々産生き
れ、以下の重要な特徴を有する。

（１）ＩｇＧｔイソタイプであり、 （２）（ａ）シアリル２　→　３　Ｌ　ｅａ及び（ｂ）
補助的脂質を用いて、またはプラ スチック被覆プレートを用いたＴ ＬＣ免疫染色により試験したとき、 シアリル２→３　タイプ１鎖パラ グロボンド に結合する。

モノクローナル抗体Ｎ　Ｋ　Ｈ　３及びＮＫＨ４は見掛
けの反応性においてモノクローナル抗体ＣＡ５０に類似
するが、イソタイプは異なる。従ってモノクローナル抗
体ＮＫＨ３及びＮＫＨ４の薬力学的活性はＣＡ５０とは
異なることが予想される。

さらに、モノクローナル抗体ＮＫＨ３及びＮＫＨ４のシ
アリル２→３Ｌｅ　　との反応性は実験条件によらず非
常に明確であるが、シアリル　タイプ１鎖パラグロボシ
ドとの交叉反応性は、実施例により詳細に記載したよう
に補助脂質と共に試験するか又はプラスチック　コート
されたプレートを用いたＴＬＣ免疫染色による試験以外
は不明瞭である。

本発明に従うモノクローナル抗体ＳＮＨ３、ＮＫＨ１、
ＮＫＨ２、ＮＫＨ３及びＮＫＨ４のイソタイプ及びこれ
らモノクローナル抗体の結合特性を下記第１表に要約す
る。

さらに本発明は、ガングリオシドを含む腫瘍を治療する
ための受動免疫方法を提供する。本方法は、 （１）宿主を腫瘍細胞で免疫し、 （２）腫瘍細胞膜と少なくとも１種の精製ラクトン化腫
瘍関連ガングリオシドとの混合物を含む懸濁液で該宿主
をブーストし、 （３）担体に吸着または結合した腫瘍関連ガングリオシ
ド　ラクトンを含む免疫原で該宿主をブーストし、 （４）該宿主からの免疫細胞にミエローマ細胞を融合し
てハイブリドーマ細胞を形成させ、（５）ステップ（３
）の該ガングリオシドに結合する抗体を産生ずるハイブ
リドーマ細胞を選択し、 （６）選択された該ハイブリドーマ細胞を培養し、及び （７）該抗体を回収する、 各ステップを含む方法により製造された薬理的有効量の
抗体を対象に投与することから成る。

抗体を製造する詳細は前記の通りである。

薬理学的に受容できる希釈剤が本発明の免疫方法で使用
できる。使用する薬理学的に受容できる希釈剤は特に限
定されない。このような希釈剤の例には、生理食塩水、
リンゲル液、ビタミン　カクテル及びアミノ酸ビタミン
　カクテルが含まれる。

抗体の投与によりイン　ビボで抗腫瘍効果を起こすため
には、担体は使用しないほうがよい。精製された抗体は
担体なしに静脈内投与される。

投与される本発明抗体の、薬理的有効量は、年齢、体重
、性及び動物種に依存して変化する。

般には、薬理学的有効量は、一回の投与で約１．０〜５
．０μｇ／１００ｇ体重である。一般に抗体は５〜１０
回投与されるが、これに限られない。

本発明に於いて投与されるべき抗体は、治療しようとす
る腫瘍に存在するガングリオシドに依存する。腫瘍中に
存在する特定のガングリオシドは、種々のガングリオシ
ドについての血清アッセイ又は生検アッセイにより知る
ことができる。ここで用いられる用語「治療」は、腫瘍
形成の防止及び存在する腫瘍の治療の両者を意味する。

本発明はまた、 （Ａ）（１）宿主を腫瘍細胞で免疫し、（２）腫瘍細胞
膜と少なくとも１種の精製ラクトン化腫瘍関連ガングリ
オシ ドとの混合物を含む懸濁液で該宿主 をブーストし、 （３）担体に吸着または結合した腫瘍関連ガングリオシ
ド　ラクトンを含む 免疫原で該宿主をブーストし、 （４）該宿主からの免疫細胞にミエローマ細胞を融合し
ハイブリドーマ細胞 を形成させ、 （５）ステップ（３）の該ガングリオシドに結合する抗
体を産生ずるハイブ リドーマ細胞を選択し、 （６）選択された該ハ，イブリドーマ細胞を培養し、及
び （７）該抗体を回収する、 各ステップを含む方法により製造される抗体に試験試料
を接触させ、 （Ｂ）該試験試料中に含まれる抗原に対する該抗体の特
異的結合を測定する、 各ステップを含むガングリオシドを含む腫瘍の検出方法
を提供する。

本発明のガングリオシドを含む腫瘍の検出方法において
、「試験試料」とは、例えば組織生検、血清、腹腔液及
び髄液を意味する。

抗体の製造法の詳細は既に記載した通りである。

検出はイン　ビトロ又はイン　ビボで行い得る。

イン　ビトロでの検出は、任意の良く知られたイン　ビ
トロ免疫アッセイ、例えばヤング（Ｙｏｕｎｇ，Ｗ．Ｗ
．）らの記載［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．．ｌ５０．ｌＯ０
８−１０１９（１９７９）］及びカンナギ（Ｋａｎｎａ
ｇｉ．Ｒ．）らの記載［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．．４３
．４９７７−５００５（１９８３）］の方法により行う
ことができる。又イン　ビボでの検出は、例えばバーチ
ェル（Ｂｕｒｃｈｅｌｌ．Ｊ．　）ら［ｌｎｔ．Ｊ．Ｃ
ａｎｃｅｒ．３４，７６３−７Ｅｉ８（１９８４）　］
　、−Ｌペネタス（Ｅｐｅｎｅｔｏｓ．Ａ．Ａ．　）ら
［Ｌａｎｃｅｔ　，２　．９９９−１００４（１９８２
）コ、チャタル（Ｃｈａｔａｌ．Ｊ．一Ｆ．）ら［Ｊ．
Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｍｅｄ．−．２５．３０７−３１４（
１９８４）　］　、？ンッ（Ｍｕｎｚ，Ｄｉｌ．　　）
　　ら　［Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ　　Ｍｅｄ．．２７．１
７３９−１７４５（１９８６）］　、及びキーナン（Ｋ
ｅｅｎａｎ．Ａ．Ｎ．　）ら［Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ　｝
ｔｅｄ．．２６，５３１−５３７　（１９８５）］によ
り記載された良く知られたイン　ビボの免疫アッセイを
使用して行うことができる。

実施例 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例に限定されない。

実施例１ ＳＮＨ３抗体は、以下のようにマウスを腫瘍細胞及びラ
クトン化したシアリル　ジフコシルＬｅｘで免疫して得
た。１０６ＳＷ９４８結腸癌細胞をＢａｌｂ／ｃマウス
に１週１回ずつ２回（第１週及び第２週）腹腔内投与し
た。次いで１０６個のヒト肺カルシノーマＰＣ９細胞を
第３週及び第４週に腹腔内投与した。最後に第５週にサ
ルモネラ　ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍｉｎｅ
ｓｏｔａｅ）に吸着させたラクトン化シアリル　ジフコ
ンルＬｅ　Ｘを静脈内投与した。免疫前のシアリル　ジ
フコシル　Ｌｅ　　ガングリオシドのラクトン化及びサ
ルモネラ　ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｌＩＩｉ
ｎｅｓｏｔａｅ）への吸着は公知の方法で行った［Ｎｏ
ｒｅｓ　．　Ｇ　．　Ａ　．　ｅｔａｌ，Ｊ．　　Ｉｍ
ｍｕｎｏ１．，１３９．３１７１−３１７６（１９８７
）コ。シアリル　ジフコシルＬｅｘのラクトン化は氷酢
酸中で行うか［Ｎｏｒｅｓ．Ｇ．Ａ．ｅｔ　ａｌ，Ｊ．
Ｉ＋ｎｍｕｎｏｌ．，Ｌ３９，３Ｌ７Ｌ−３１７６（１
９８７）］　、または最近の方法によりカルボジイミド
で処理して行った［Ｓｏｎｎ４ｎｏ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ，
Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｊ．．２，３４３−３
５４（１９８５）　］　ｏ　シアリル　ジフコシルＬｅ
ｘラク１・ン抗原の場合、５μｇの抗原を２００μ１の
リン酸緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）に懸濁した４０μ
ｇのサルモネラ　ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ
ｉｎｅｓｏｔａｃ）に吸着させ、静脈内投与した。ラク
トン投与から３日後、牌細胞を摘出し、マウス　ミエロ
ーマＳＰ２またはＮＳ１と融合させた。シアリル　ジフ
コシルＬｅＸ抗原（第１表、構造式２）に対する反応陽
性によりクローンを選択し、確立されたハイブリドーマ
ＳＮＨ３から分泌される抗体の特異性をＴＬＣ免疫染色
及び固相ラジオイミュノアッセイにより公知の方法で試
験した。抗体Ｓ　Ｎ　Ｈ　３の反応性を第１図に示す。

固相ラジオイミュノアッセイは公知の方法で行った［Ｋ
ａｎｎａｇｉ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ
ｓ．，４３．４９９７−５００５（１９８３）コ　。

第１図に於いて、縦軸は第一抗体および第二抗体に結合
するプロテインＡの活性を、分当りのカウントで示す。

横軸は抗原の稀釈度を示し、例えば１と記された１番目
のウェルは１００ｎｇの抗原を、２と記された２番目の
ウエルは５０ｎＨの抗原を含む。白丸は腫瘍から単離さ
れたシアリルジフコシルＬｅＸ（第１表、構造式２；■
３ＮｅｕＡｃＶ３Ｆｕｃｍ３ＦｕｃＮＬｃ６　）を示す
。

白三角は同じ抗原であるがシアリル２−３ノルヘキサオ
シルセラミドから酵素的に合成したものを示す。黒逆三
角は［から単離されたシアリルＬｅＸヘキササッ力ライ
ド　セラミド（第１表、構造式１　；ＩＶ３ＮｅｕＡｃ
ＩＩｒ３ＦｕｃｎＬｃ４）を示す。白逆三角はシアリル
２−３ノルヘキサオシルセラミドを示す。黒丸はＧＭ３
、２−３シアリルパラグロボンド（ＳＰＧ）（ＩＶ３Ｎ
ｅｕＡｃｎＬｃ４　）　　、２→６ＳＰＧ　　（ＶＩ６
　Ｎｅ　ｕＡｃ　ｎＬｃ４）、シアリル２→３Ｌｅａａ
（第１表、構造式３；ＩＶ３ＮｅｕＡｃｍ’　ＦｕｃＬ
ｃ４）およびシアリル２→６ノルヘキサオシルセラミド
（ＶＩ６ＮｅｕＡｃｎＬｃ６　）を示す。

第１図のデータは、ＳＮＨ３抗体は長鎖シアリルシフコ
シルＬｅｘと優先的に反応するだけでなく、短鎖シアリ
ルＬｅＸ（即ち、シアリルＬｅｘヘキササッ力ライド　
セラミド）ともかなり良く反応することを示す。本抗体
はまた、シアリル２→３ラクトノルヘキサオシルセラミ
ド（■３ＮｅｕＡｃｎＬｃ６　）及び内部のＧ１ｃＮＡ
ｃにフコシル残基を有するシアリル２→３ラクトノルヘ
キサオシルセラミド（ＶＩ３ＮｅｕＡｃＩＩＩ３Ｆｕｃ
ｎＬｃ６）とも弱く反応する。ＳＮＨ３は池の関連構造
とは反応しない。この反応性は同様の抗体の公知の反応
性とは異なる。即ち、短鎖シアリルＬｅｘ　（ＴＶ３Ｎ
ｅｕＡｃＩＩＩ’　　ＦｕｇｎＬｃ４）とは反応しない
ＦＨ６、及び内部フコシル化したシアリル２→３ノルヘ
キサオシル構造またはシアリル２→３ノルヘキサオシル
構造とは反応しないＣＳＬＥＸとは異なる。本抗体は他
種類のヒト癌の血清のアッセイによる診断に特に有用で
ある。

実施例２ 各抗体のイソタイプ及び特異性は以下の通りであ′る。

ＮＫＨ１・・・ＩｇＧ１　；シアリル２　→３　Ｌ　ｅ
　　と特異的に反応する。

Ｎ　Ｋ　Ｈ　２・・・ＩｇＭ．主としてシアリル２→３
Ｌｅａと反応するが、Ｌｅａとも交 叉反応する。

ＮＫＨ３−　１　ｇＧｔ　　；シアリル２→３Ｌｅ　　
及びＳＰＧタイプ１鎖の両者と反応す る（ＣＡ５０の特異性に類似する）。

ＮＫＨ４−Ｉ　ｇＧｔ　　；シアリル２→３Ｌｅ　　及
びＳＰＧタイプ１鎖の両者と反応す る（ＮＫＨ３に非常に似るが、２種 のガングリオシド間の交叉反応性の 程度に微妙な差がみられる）。

ハイブリドーマの調製方法は以下の通りである。

ａ）Ｂａｌｂ／ｃｖウスを、５Ｘ１０６個のＣｏ１　ｏ
２０５全細胞で１週１回ずつ３回腹腔内投与し免疫した
。

ｂ）Ｃｏｌｏ　　２０５の膜分画を公知の方法で調製し
、５％酢酸に懸濁し、３〜５μｇの精製ガングリオシド
（シアリル２→３Ｌｅ　　及びＳＰＧタイプ１鎖）と混
合し、凍結乾燥した。この方法は膜ガングリオシドのラ
クトン化及び豊富化を起こす。凍結乾燥された物質をＰ
ＢＳに懸濁し、第４週に静脈内投与した。

Ｃ）実施例１と同様にして調製し、実施例１の方法で２
００μ１の生理食塩水中の４０μｇのサルモネラ　ミネ
ソタ（Ｓ．ｍｉｎｎｅｓｏｔａｅ）上にコートした、３
〜５μｇの精製ラクトン化ガングリオシド（シアリル２
→３Ｌｅａ）を第５週に静脈内投与した。

ｄ）５回目の投与の３日後牌臓を摘出し、牌細胞をＳＰ
２細胞と融合させた。精製ガングリオシド　シアリル２
→３Ｌｅａ及びＳＰＧタイプ１鎖に対する特異反応性に
より、実施例１の方法でハイブリドーマを選択した。

全てのハイブリドーマ（ＮＨＫＩ、２、３及び４）を同
様の方法で調製した。

ＮＫＨ系列の抗体の固相ラジオイミュノアッセイによる
反応性を第２図に、ＴＬＣ免疫染色による反応性のデー
タを第３図に示す。

固相ラジオイミュノアッセイ１こ用いた方法は既に記載
がある［Ｋａｎｎａｇｉ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃ
ｅｒ　Ｒｅｓ．．４３，４９９７−５００５（１９８３
）　］。抗体ＣＦ４Ｃ４は既知の抗Ｌｅａ抗体であるが
、これをＮ　Ｋ　Ｈ　１、２、３、及び４の測定に使用
した各試料のＬｅａ活性を確かめるため、又、交叉反応
性を検出するために用いた。第１表、構造式５、７及び
８のようなＬｅａ抗原決定基を有するグリコリピッドは
ＣＦ４Ｃ４に陽性であったが、構造式３のものはＣＦ４
Ｃ４に陰性であり、ＮＫＨ２に陽性であった。

第２図中、縦軸は抗原に結合した第一抗体と反応する第
二抗体に対するプロテインＡの活性を示す。横軸は第１
図と同様に抗原の稀釈度を示す。

白三角は腫瘍から精製されたシアリル２→３Ｌｅａ（第
１表、構造式３　；ＩＶ３ＮｅｕＡｃＩＩＩ’ＦｕｃＬ
ｃ４）を示す。白逆三角は胎便から単離した同じ抗原を
示す（ジシアリルＬｅａも含有する）。黒四角はシアリ
ルパラグロボシド（Ｓ　Ｐ　Ｇ）タイプ１鎖を示す。黒
三角はＬｅａ（第１表、構造式５　；ｍ’　ＦｕｃＬｃ
４　）を示す。黒逆三角はＬｅａ／Ｌｅｘハイブリッド
（第１表、構造式７）を示す。黒丸はラクトイソオクタ
オンルセラミドの二価Ｌｅａ（イソＬｅａ）（第１表、
構造式８）を示す。白四角は合成シアリル２−３パラグ
ロボシドを示す。

第３図に示された各抗体による種々のグリコリピッド試
料の免疫染色パターンにおいて、各レーンのグリコリピ
ットは０．０１％ＣａＣ　１２を含むクロロホルムーメ
タノールー水（５５：３０：ｌｏ．ｖ／ｖ／Ｖ）で展開
した。ＨＰＴＬＣプレートはマグナニ（Ｍａｇｎａｎｉ
　）らの変法により染色した［Ｍａｇｎａｎｉ　，Ｊ．
Ｌ．ｅｔ　ａｌ．．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．．１０
９．３９９−４０２（１９８０）］。

第３図中、レーン１は胎便のモノシアロガングリオシド
分画、レーン２はメトキシド　ナトリウム処理した胎便
のモノシアロガングリオシド分画（Ｏ−アセチル基を含
むガングリオシドの存在可能性を調べるため）、レーン
３はＯ赤血球の上位中性グリコリピッド、レーン４はヒ
ト結腸癌細胞ラインＣｏｌｏ　　２０５からのモノシア
口ガングリオシド分画、．レーン５はＬｅａ活性を有す
るセラミド　ペンタサツカライド（ｍ’ＦｕｃＬｃ４Ｃ
ｅｒ；第１表、構造式５）、レーン６は胎便から単離さ
れたシアリル２＋３パラグロボシド　タイプ１鎖（第１
表、構造式４）、レーン７はＣＭＰ−シアル酸及びＬｃ
４Ｃｅｒ（タイプ１鎖　パラグロボシド）から合成した
シアリル２→３パラグロボシド　タイプ１鎖（第１表、
構造式４）、レーン８はシアリル２→３Ｌｅ　　　（Ｉ
Ｖ　　ＮｅｕＡｃｍ４ＦｕｃｎＬｃ４Ｃｅ　ｒ　；第１
表、構造式３）レーン９はＬｅｘ抗原決定基上のＬｅａ
（■３Ｇａｌβ１→３　［Ｆ　ｕ　ｃ　ａ　１→４］　
Ｇ　１　ｃＮＡ　ｃｍ３ＦｕｃｎＬｃ４　Ｃｅ　ｒ　；
第１表、構造式７）、レーン１０は分枝ラクトイソオク
タオシルセラミド上のＬｅａ（Ｖ３ＦｕｃＴＶ６Ｇａ　
１β１−３［Ｆｕ　Ｃα１→３コ　Ｇｌ　　ｃＮＡｃｎ
Ｌｃ６　Ｃｅ　　ｒ　　；第１表、構造式８）を夫々示
す。第３Ｂ図レーン６に見られるスポットは２→３シア
リルＬｅ　　による汚染の為であり、特異性を示すもの
ではない。

第２図及び第３図のデータは、以下のことを示す。

（１）ＮＫＨ１はシアリル２→３Ｌｅ　ｌ．：回い特異
性を示し、２→３シアリルパラグロボシド（ＳＰＧ）タ
イプ１鎖又はパラグロボシド（Ｐ　Ｇ）タイプ１鎖とは
交叉反応しない。この反応性はＮ　−　１　９　−　９
　［Ｍａｇｎａｎｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔａｌ．．Ｊ．　Ｂｉ
ｏ１．Ｃｈｅ［ＩＩ．．２５７．１４３６５−１４８６
９（１９８２）　］及びＣ　Ｓ　Ｌ　Ｅ　Ａ　［Ｃｈｉ
ａ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ．．ｃａｎｃｅｒ　Ｔｅｓ．．４５
．　４３５−４３７（１９８５）］のような公知の抗体
に類似する。しかし、Ｎ　Ｋ　Ｈ　１のイソタイプはＮ
−１９−９及びＣＳＬＥＡと異なる。

（２）抗体ＮＫＨ２はＬｅ　　及びシアリル２→３Ｌｅ
ａの両者と反応する点で特徴付けられる。

ＰＧタイプ１鎖に対しても、弱い反応性が示された。こ
の様な反応性は新規である。即ち、このような特異性を
有する抗体は今まで記載がなかった。

（３）ＮＫＨ３及び４は、ＴＬＣ免疫プロッティングに
よりシアリル２→３Ｌｅ　　及びシアリル２→３　タイ
プ１鎖の双方と反応するが、固相ラジオイミュノアッセ
イではシアリル２−→３Ｌｅａａ及びＳＰＧタイプ１鎖
との反応性は弱い。

さらに詳細な特異性を試験するため、Ｌｅｘ上にＬｅａ
構造を有するハイブリッド　グリコリピッド（第１表、
構造式７）及びラクトイソオクタオシルセラミド上の二
価Ｌｅａ（第１表、構造式８）のようなタイプ１鎖アナ
ログを酵素的に合成した。Ｌｅｘ上のＬｅａハイブリッ
ド構造は二価Ｌｅａと同様に、ＮＫＨ２抗体とのみ反応
した。

本発明をその特定の実施例に関連して詳細に説明したが
、本発明の精神及び範囲からはずれることなく種々の変
更をなし得ることは当業者に明らかであろう。

寄託について ハイブリドーマ細胞ラインＳＮＨ３、ＮＫＨ１、Ｎ　Ｋ
　Ｈ　２、ＮＫＨ３、及びＮＫＨ４はアメリカンタイプ
　力ルチャー　コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐ
ｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　；　１２
３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ．Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ．Ｍａｒｙｌａｎｄ　）に１９８９年１月５日寄
託され、夫々、寄託番号ＨＢ９９４１、９９４２、９９
４３、９９４４、９９４５を有する。

寄託は特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関す
るブタペスト条約に従ってなされた。

本出願についての合衆国特許の承諾に対し、全ての接近
の制限は変更なく除かれる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるモノクローナル抗体ＳＮＨ３を用
いたラジオイミュノアッセイの結果を示すグラフである
。 第２図は固相ラジオイミュノアッセイにおける抗体ＮＫ
ＨＩ　（第２Ａ図）　、ＮＫＨ２　（第２６図）、ＮＫ
Ｈ３　（第２Ｃ図）　、ＮＫＨ４　（．第２Ｄ図）およ
びＣＦ４Ｃ４　（既知の抗Ｌｅａ抗体；第２Ｅ図）の反
応性を示すグラフである。 第３図は抗体ＮＫＨＩ　（第３Ａ図）、ＮＫＨ２（第３
Ｂ図）　、ＮＫＨ３　（第３Ｃ図）及び抗Ｌｅａ抗体（
第３Ｄ図）を用いた、種々のグリコリピッド試料の免疫
染色パターンを示す。 （以上） ＦＩＧ　２Ａ ＦＩＧ，２６ ＦＩＧ　２Ｃ ＦＩＧ　２Ｄ ＦＩＧ．１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １（１）宿主を腫瘍細胞で免疫し、 （２）腫瘍細胞膜と少なくとも１種の精製ラクトン化腫
   瘍関連ガングリオシドとの混合 物を含む懸濁液で該宿主をブーストし、 （３）担体に吸着させ又は結合させた腫瘍関連ガングリ
   オシドラクトンを含む免疫原 で該宿主をブーストし、 （４）該宿主からの免疫細胞にミエローマ細胞を融合し
   てハイブリドーマ細胞を形成さ せ、 （５）ステップ（３）の該ガングリオシドに結合する抗
   体を産生するハイブリドーマ細 胞を選択し、 （６）選択された該ハイブリドーマ細胞を培養し、及び （７）該抗体を回収する、 各ステップを含む、腫瘍関連ガングリオシドに結合する
   モノクローナル抗体の製造法。 ２　ステップ（３）の該腫瘍関連ガングリオシドが腫瘍
   から単離され又は酵素的に合成されたシアリル２→３Ｌ
   ｅ＾ａ又はシアリルジフコシルＬｅ＾ｘであるか、又は
   シアリル２→３パラグロボシドである請求項１の方法。 ３（１）ＩｇＭイソタイプであり、 （２）（ａ）シアリルＬｅ＾ｘ及び （ｂ）シアリルジフコシルＬｅ＾ｘに結合する ことなる同定上の特徴を有するモノクローナル抗体を産
   生するハイブリドーマ。 ４　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４１を有するハイブリド
   ーマ細胞ラインＳＮＨ３の同定上の特徴を有するハイブ
   リドーマ。 ５　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４１を有するハイブリド
   ーマＳＮＨ３である請求項３又は４のハイブリドーマ ６（１）ＩｇＧ＿１イソタイプであり、 （２）シアリル２→３Ｌｅ＾ａに結合する ことなる同定上の特徴を有するモノクローナル抗体を産
   生するハイブリドーマ。 ７　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４２を有するハイブリド
   ーマＮＫＨ１の同定上の特徴を有するハイブリドーマ。 ８　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４２を有するハイブリド
   ーマＮＫＨ１である請求項６又は７のハイブリドーマ ９（１）ＩｇＭイソタイプであり、 （２）（ａ）シアリル２→３Ｌｅ＾ａ （ｂ）Ｌｅ＾ａ （ｃ）Ｌｅ＾ａエピトープを有するペンタオシルセラミ
   ド及びヘキサオシルセラミド （ｄ）Ｌｅ＾ａ／Ｌｅ＾ｘハイブリッド及び （ｅ）ラクト￥イソ￥オクタオシルセラミド上の二価Ｌ
   ｅ＾ａに結合する ことなる同定上の特徴を有するモノクローナル抗体を産
   生するハイブリドーマ。 １０　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４３を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ２の同定上の特徴を有するハイブリドーマ
   。 １１　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４３を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ２である請求項９又は１０のハイブリドー
   マ。 １２（１）ＩｇＧ＿１イソタイプであり、 （２）（ａ）シアリル２→３Ｌｅ＾ａ及び （ｂ）補助的脂質を用いて、またはプラスチック被覆プ
   レートを用いたＴＬＣ免疫染色により試験したとき、シ
   アリル２→３タイプ１鎖パラグロボシドに結合する ことなる同定上の特徴を有するモノクローナル抗体を産
   生するハイブリドーマ。 １３　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４４を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ３の同定上の特徴を有するハイブリドーマ
   。 １４　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４４を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ３である請求項１２又は１３のハイブリド
   ーマ。 １５　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４５を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ４の同定上の特徴を有するハイブリドーマ
   。 １６　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４５を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ４である請求項１２又は１５のハイブリド
   ーマ。 １７（１）ＩｇＭイソタイプであり、 （２）（ａ）シアリルＬｅ＾ｘ及び （ｂ）シアリルジフコシルＬｅ＾ｘに結合する ことなる同定上の特徴を有するモノクローナル抗体。 １８　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４１を有するハイブリ
   ドーマＳＮＨ３から産生するモノクローナル抗体ＳＮＨ
   ３の同定上の特徴を有するモノクローナル抗体。 １９　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４１を有するハイブリ
   ドーマＳＮＨ３から産生するモノクローナル抗体ＳＮＨ
   ３である請求項１７又は１８のモノクローナル抗体。 ２０（１）ＩｇＧ＿１イソタイプであり、 （２）シアリル２→３Ｌｅ＾ａに結合する ことなる同定上の特徴を有するモノクローナル抗体。 ２１　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４２を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ１から産生するモノクローナル抗体ＮＫＨ
   １の同定上の特徴を有するモノクローナル抗体。 ２２　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４２を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ１から産生するモノクローナル抗体ＮＫＨ
   １である請求項２０又は２１のモノクローナル抗体。 ２３（１）ＩｇＭイソタイプであり、 （２）（ａ）シアリル２→３Ｌｅ＾ａ （ｂ）Ｌｅ＾ａ （ｃ）Ｌｅ＾ａエピトープを有するペンタオシルセラミ
   ド及びヘキサオシルセラミド （ｄ）Ｌｅ＾ａ／Ｌｅ＾ｘハイブリッド及び （ｅ）ラクト￥イソ￥オクタオシルセラミド上の二価Ｌ
   ｅ＾ａに結合する ことなる同定上の特徴を有するモノクローナル抗体。 ２４　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４３を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ２から産生するモノクローナル抗体ＮＫＨ
   ２の同定上の特徴を有するモノクローナル抗体。 ２５　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４３を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ２から産生するモノクローナル抗体ＮＫＨ
   ２である請求項２３又は２４のモノクローナル抗体。 ２６（１）ＩｇＧ＿１イソタイプであり、 （２）（ａ）シアリル２→３Ｌｅ＾ａ及び （ｂ）補助的脂質を用いて、またはプラスチック被覆プ
   レートを用いたＴＬＣ免疫染色により試験したとき、 シアリル２→３タイプ１鎖パラグロボシドに結合する ことなる同定上の特徴を有するモノクローナル抗体。 ２７　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４４を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ３から産生するモノクローナル抗体ＮＫＨ
   ３の同定上の特徴を有するモノクローナル抗体。 ２８　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４４を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ３から産生するモノクローナル抗体ＮＫＨ
   ３である請求項２６又は２７のモノクローナル抗体。 ２９　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４５を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ４から産生するモノクローナル抗体ＮＫＨ
   ４の同定上の特徴を有するモノクローナル抗体。 ３０　ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４５を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ４から産生するモノクローナル抗体ＮＫＨ
   ４である請求項２６又は２９のモノクローナル抗体。 ３１（１）宿主を腫瘍細胞で免疫し、 （２）腫瘍細胞膜と少なくとも１つの精製ラクトン化腫
   瘍関連ガングリオシドとの混合 物を含む懸濁液で該宿主をブーストし、 （３）腫瘍関連ガングリオシドラクトンを含む免疫原で
   該宿主をブーストし、 （４）該宿主からの免疫細胞にミエローマ細胞を融合し
   てハイブリドーマ細胞を形成さ せ、 （５）ステップ（３）の該ガングリオシドに結合する抗
   体を産生するハイブリドーマ細 胞を選択し、 （６）選択された該ハイブリドーマ細胞を培養し、及び （７）該抗体を回収する、 各ステップを含む方法により製造された薬理的有効量の
   抗体を対象に投与することから成る、ガングリオシドを
   含む腫瘍を治療するための受動免疫方法。 ３２　ステップ（３）の腫瘍関連ガングリオシドが腫瘍
   から単離され又は酵素的に合成されたシアリル２→３Ｌ
   ｅ＾ａ又はシアリルジフコシルＬｅ＾ｘであるか、又は
   シアリル２→３パラグロボシドである請求項３１の方法 ３３　薬理的有効量が、対象の１００ｇ体重当り約１．
   ０〜５．０μｇである請求項３１の方法。 ３４　抗体が以下の（Ａ）〜（Ｄ）からなる群から選ば
   れたものである請求項３１の方法。 （Ａ）（１）ＩｇＭイソタイプであり、 （２）（ａ）シアリルＬｅ＾ｘ及び （ｂ）シアリルジフコシルＬｅ＾ｘに結合する ことなる同定上の特徴を有するモノクローナル抗体。 （Ｂ）（１）ＩｇＧ＿１イソタイプであり、 （２）シアリル２→３Ｌｅ＾ａに結合する ことなる同定上の特徴を有するモノクローナル抗体。 （Ｃ）（１）ＩｇＭイソタイプであり、 （２）（ａ）シアリル２→３Ｌｅ＾ａ （ｂ）Ｌｅ＾ａ （ｃ）Ｌｅ＾ａエピドープを有するペンタオシルセラミ
   ド及びヘキサオシルセラミド （ｄ）Ｌｅ＾ａ／Ｌｅ＾ｘハイブリッド及び （ｅ）ラクト￥イソ￥オクタオシルセラミド上の二価Ｌ
   ｅ＾ａに結合する ことなる同定上の特徴を有するモノクローナル抗体。 （Ｄ）（１）ＩｇＧ＿１イソタイプであり、 （２）（ａ）シアリル２→３Ｌｅ＾ａ及び （ｂ）補助的脂質を用いて、またはプラスチック被覆プ
   レートを用いたＴＬＣ免疫染色により試験したとき、シ
   アリル２→３タイプ１鎖パラグロボシドに結合する ことなる同定上の特徴を有するモノクローナル抗体。 ３５　抗体が以下の（Ａ）〜（Ｅ）から選ばれたもので
   ある請求項３１の方法。 （Ａ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４１を有するハイブリ
   ドーマＳＮＨ３から産生するモノクローナル抗体ＳＮＨ
   ３の同定上の特徴を有するモノクローナル抗体 （Ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４２を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ１から産生するモノクローナル抗体ＮＫＨ
   １の同定上の特徴を有するモノクローナル抗体 （Ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４３を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ２から産生するモノクローナル抗体ＮＫＨ
   ２の同定上の特徴を有するモノクローナル抗体 （Ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４４を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ３から産生するモノクローナル抗体ＮＫＨ
   ３の同定上の特徴を有するモノクローナル抗体 （Ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４５を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ４から産生するモノクローナル抗体ＮＫＨ
   ４の同定上の特徴を有するモノクローナル抗体 ３６　抗体が以下の（Ａ）〜（Ｅ）から選ばれたもので
   ある請求項３１の方法。 （Ａ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４１を有するハイブリ
   ドーマＳＮＨ３から産生されるモノクローナル抗体ＳＮ
   Ｈ３ （Ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４２を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ１から産生されるモノクローナル抗体ＮＫ
   Ｈ１ （Ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４３を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ２から産生されるモノクローナル抗体ＮＫ
   Ｈ２ （Ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４４を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ３から産生されるモノクローナル抗体ＮＫ
   Ｈ３ （Ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４５を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ４から産生されるモノクローナル抗体ＮＫ
   Ｈ４ ３７（Ａ）（１）宿主を腫瘍細胞で免疫し、 （２）腫瘍細胞膜と少なくとも１種の精製ラクトン化腫
   瘍関連ガングリオシドとの混合物を含む懸濁液で該宿主
   をブーストし、 （３）担体に吸着させ又は結合させた腫瘍関連ガングリ
   オシドラクトンを含む免疫原で該宿主をブーストし、 （４）該宿主からの免疫細胞にミエローマ細胞を融合し
   てハイブリドーマ細胞を形成させ、 （５）ステップ（３）の該ガングリオシドに結合する抗
   体を産生するハイブリドーマ細胞を選択し、 （６）選択された該ハイブリドーマ細胞を培養し、及び （７）該抗体を回収する、 各ステップを含む方法により製造される抗体に試験試料
   を接触させ、 （Ｂ）該試験試料中に含まれる抗原に対する該抗体の特
   異的結合を測定する、 各ステップを含むガングリオシドを含む腫瘍の検出方法
   。 ３８　ステップ（３）の腫瘍関連ガングリオシドが腫瘍
   から単離され又は酵素的に合成されたシアリル２→３Ｌ
   ｅ＾ａ又はシアリルジフコシルＬｅ＾ｘであるか、又は
   シアリル２→３パラグロボシドである請求項３７の方法
   。 ３９　抗体が以下の（Ａ）〜（Ｄ）からなる群から選ば
   れたものである請求項３７の方法。 （Ａ）（１）ＩｇＭイソタイプであり、 （２）（ａ）シアリルＬｅ＾ｘ及び （ｂ）シアリルジフコシルＬｅ＾ｘに結合する ことなる同定上の特徴を有するモノクローナル抗体。 （Ｂ）（１）ＩｇＧ＿１イソタイプであり、 （２）シアリル２→３Ｌｅ＾ａに結合することなる同定
   上の特徴を有するモノクローナル抗体。 （Ｃ）（１）ＩｇＭイソタイプであり、 （２）（ａ）シアリル２→３Ｌｅ＾ａ （ｂ）Ｌｅ＾ａ （ｃ）Ｌｅ＾ａエピドープを有するペンタオシルセラミ
   ド及びヘキサオシルセラミド （ｄ）Ｌｅ＾ａ／Ｌｅ＾ｘハイブリッド及び （ｅ）ラクト￥イソ￥オクタオシルセラミド上の二価Ｌ
   ｅ＾ａに結合する ことなる同定上の特徴を有するモノクローナル抗体。 （Ｄ）（１）ＩｇＧ＿１イソタイプであり、 （２）（ａ）シアリル２→３Ｌｅ＾ａ及び （ｂ）補助的脂質を用いて、またはプラスチック被覆プ
   レートを用いたＴＬＣ免疫染色により試験したとき、シ
   アリル２→３タイプ１鎖パラグロボシドに結合する ことなる同定上の特徴を有するモノクローナル抗体。 ４０　抗体が以下の（Ａ）〜（Ｅ）から選ばれたもので
   ある請求項３７の方法。 （Ａ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４１を有するハイブリ
   ドーマＳＮＨ３から産生するモノクローナル抗体ＳＮＨ
   ３の同定上の特徴を有するモノクローナル抗体 （Ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４２を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ１から産生するモノクローナル抗体ＮＫＨ
   １の同定上の特徴を有するモノクローナル抗体 （Ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４３を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ２から産生するモノクローナル抗体ＮＫＨ
   ２の同定上の特徴を有するモノクローナル抗体 （Ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４４を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ３から産生するモノクローナル抗体ＮＫＨ
   ３の同定上の特徴を有するモノクローナル抗体 （Ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４５を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ４から産生するモノクローナル抗体ＮＫＨ
   ４の同定上の特徴を有するモノクローナル抗体 ４１　抗体が以下の（Ａ）〜（Ｅ）から選ばれたもので
   ある請求項３７の方法。 （Ａ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４１を有するハイブリ
   ドーマＳＮＨ３から産生されるモノクローナル抗体ＳＮ
   Ｈ３ （Ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４２を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ１から産生されるモノクローナル抗体ＮＫ
   Ｈ１ （Ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４３を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ２から産生されるモノクローナル抗体ＮＫ
   Ｈ２ （Ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４４を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ３から産生されるモノクローナル抗体ＮＫ
   Ｈ３ （Ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４５を有するハイブリ
   ドーマＮＫＨ４から産生されるモノクローナル抗体ＮＫ
   Ｈ４ ４２　試験試料が血清であり、抗体が （１）イソタイプがＩｇＭであり、 （２）（ａ）シアリルＬｅ＾ｘ及び （ｂ）シアリルジフコシルＬｅ＾ｘと結合することの同
   定上の特徴を有するものである請求項３７の方法。 ４３　試験試料が血清で、抗体がＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ
   ９９４１を有するハイブリドーマＳＮＨ３から産生され
   るモノクローナル抗体ＳＮＨ３の同定上の性質を有する
   請求項３７の方法。 ４４　抗体がＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９９４１を有するハ
   イブリドーマＳＮＨ３から産生されるモノクローナル抗
   体ＳＮＨ３である請求項４２又は４３の方法。