JP2739203B2 - 合成グリコスフィンゴ脂質特異性単クローン性抗体 - Google Patents
合成グリコスフィンゴ脂質特異性単クローン性抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明はグリコスフインゴ脂質に特異性の単クローン
性抗体を生ずるハイブリドーマ細胞系および該ハイブリ
ドーマにより生成される単クローン性抗体を指向する。
より詳しくは、本発明はグリコスフインゴ脂質中の異常
分枝構造を認識する単クローン性抗体を生成するハイブ
リドーマを指向する。本発明はさらにグリコスフインゴ
脂質の化学合成法および本発明の単クローン性抗体を用
いる癌関連グリコスフインゴ脂質を検出する方法を指向
する。 関連技術の説明 1975年にコーラーほか（Kohlor and Millstein）は精
密かつ複製可能特異性を有する抗体のほゞ無限量の生成
を可能にする雑種細胞（ハイブリドーマ）を用いる単ク
ローン性抗体を製造する方法を導入した。それより前に
動物を腫瘍細胞または他の抗原であ免疫処置することに
より生成された普通の抗血清が特異性および性質の異な
る種々の抗体を含むことが認められた。一方、ハイブリ
ドーマは均一な特性を有する単一の抗体を生ずる。コー
ラーほか（Kohlor−Millstein）法は免疫処置動物の脾
臓細胞とイモータル骨髄腫細胞系との融合を必要とす
る。ハイブリドーマとして知られる融合細胞から所望特
異性の抗体を生ずるクローンを選ばれる。各クローンは
その１抗体のみを生成し続ける。ハイブリドーマ細胞は
無限に培養でき、または液体窒素中に凍結して貯蔵する
ことができ、その個々の抗体の一定供給が保証される。 抗体は、抗原として知られる他の分子との結合および
それを認識する能力を有するタンパク質である。単クロ
ーン性抗体は他の抗体と異ならないが、しかしそれらは
その性質が非常に均一であり、ただ１種の抗原または決
定基として知られる抗原の部分を認識する。ハイブリド
ーマの多くは接種動物が生じた抗体を他の異質物質と反
応させるので、腫瘍細胞と抗体産生細胞との融合に起因
するハイブリドーマクローンがすべて所望の異質物質ま
たは抗原に対して特異性であるわけではない。異なる細
胞により生成された抗体が同一分子の異なる抗原決定基
と反応できるので、主題抗原に対する抗体でもクローン
毎に異なる。従って、個々の単クローン性抗体が抗原分
子のどの特定部分を認識できるかを予め予測することが
できない。単クローン性抗体およびハイブリドーマを生
成させる多くの技術は、参照により加入される最近の図
書「単クローン性ハイブリドーマ抗体：技術および適用
（Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and A
pplications）」〔ハレル（John G.Hurrell）編、198
3〕により証明されるように今日普通である。 本発明は殊に癌に関連する一定の炭水化物抗原を認識
する単クローン性抗体（およびそれを生成するハイブリ
ドーマ）を指向する。炭水化物抗原は若干の研究者によ
り重要な癌関連抗原であると示された、ハコモリほか
（Hakomori,S.and Kannagi,R.）、ジャーナル・オブ・
ザ・ナショナル・カンサー・インステイチュート（J.Na
tl.Cancer Inst.）、71、231〜251;フエイジ（Feizi,
T.）、ネーチヤー（Nature）、314、53〜54、1985;ハコ
モリほか（Hakomori,S.）カンサー・リサーチ（Cancer
Res.）、45、2405〜2414、1985;およびマグナニ（Magna
ni,J.L.）、バイオケミカル・ソサイエテイー・トラン
スアクションズ（Biochem.Soc.Trans.）、12、543〜54
5、1984参照、それらはそれぞれ参照により加入され
る。癌細胞に対して生ずる若干の単クローン性抗体が糖
脂質により、またはよりまれではあるが糖タンパク質に
より、帯有される異常細胞表面炭水化物抗原を認識する
ことが示された。これらの抗体の若干は既に種々の癌を
有する患者の血清中の抗原の存在の測定に適用されてい
る、コプロウスキー（Koprowski,H.）ほか、サイエンス
（Science）、212、53〜55、1979;メッガー（Metzger）
ほか、カンサー・リサーチ（Cancer Res.）、42、601〜
608、1982;バスト（Bast,R.）ほか、ニュー・イングラ
ンド・ジャーナル・オブ・メデイシン（N.Eng.J.Me
d.）、309、883〜887、1983参照。 より最近には、種々のヒト腫瘍細胞から抽出し、精製
した癌関連糖脂質抗原がマウスの免疫処置に直接利用さ
れ、ヒト癌の検出に有用な若干の単クローン性抗体が作
られた、ハコモリ（Hakomori,S.）ほか、ジョーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）、259、4681〜4685、1984;フクシ（Fukushi,Y.）ほ
か、ジョーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem）、259、10511〜10517、1984;フクシ（F
ukushi,Y.）ほか、カンサー・リサーチ（Cancer Re
s.）、45、3711〜3717、1985;およびカンナギ（Kannag
i）ほか、カンサー・リサーチ（Cancer Res.）、46、26
19〜2626、1986参照。 糖脂質抗原に対する抗体の生成における上記成功にも
かかわらず、若干の癌関連糖脂質が非常に少ない膜成分
であり、しばしば単クローン性抗体の調製に十分な量を
天然源から精製することは容易でない。糖脂質抗原の精
製に対する方法論において進歩がなされたけれども、こ
れらの物質の量が少なく、単クローン性抗体を若干の場
合に得ることを不可能にした。そのような場合、糖脂質
抗原を化学合成により得、次いで合成抗原を指向する単
クローン性抗体を得ることが一層良いであろう。しか
し、これらの糖脂質の化学合成はその厳密な構造要件、
例えば異常な分枝構造、立体化学配置、大分子量および
他の複雑な構造特徴により非常に複雑になる。さらに、
合成図式は所要反応の低い収率および包含される長い反
応列のためにしばしば容易ではない。 癌関連糖脂質に特異的な単クローン性抗体の入手にお
ける他の複雑化因子は所望モノクローナルが糖脂質の特
定特徴例えば異常分枝部分を認識しなければならないこ
とである。同時に、モノクローナルが組立てられた抗原
分子の個々のセグメント上に存在する抗原分子の部分と
交差反応すべきではない。 上記困難のために、希抗原、例えば癌関連糖脂質抗原
に対する単クローン性抗体を得る新規な方法および単ク
ローン性抗体自体に対する要求が存在し続けている。 発明の概要 従って本発明の目的は癌関連グリコスフインゴ脂質中
の異常分枝構造を認識する単クローン性抗体を提供する
ことである。 本発明のなお他の目的はアシアロGM2（Gg3）およびア
ミノCHT（LC3）の異常分枝ハイブリッド分子である癌関
連ラクトガングリオ系列糖脂質を認識できる単クローン
性抗体であって、糖脂質の非分枝小部分例えばアシアロ
GM2および純アミノCTHと交差反応しない単クローン性抗
体を提供することである。 本発明のなお他の目的は本発明による単クローン性抗
体を生成できるハイブリドーマ細胞を提供することであ
る。 本発明のなお他の目的は癌関連糖脂質抗原の分枝構造
の存在を検出する方法を提供することである。 本発明のなお他の目的は癌関連ラクトガングリオ系列
糖脂質を合成する方法を提供することである。 上記および他の目的は、以下により明らかになるよう
に、癌関連ラクトガングリオ系列糖脂質を製造する合成
法およびこの糖脂質の分枝構造を認識する単クローン性
抗体を生成するハイブリドーマを提供する本発明により
達成された。 図面の簡単な説明 第１図−ラクトガングリオ系列糖脂質を合成する総括図
式。 Bn、ベンジル;Phth、フタロイル;Bz、ベンゾイル;A
c、アセチル。 第２〜６図−ラクトガングリオ系列糖脂質を合成する特
定段階 第７図−TLC染色により確認される単クローン性抗体、Y
I328−−18およびYI328−51、の特異性 a.TLCのオルシノール−H2SO4反応、 b.aと同じTLCの単クローン性YI328−18抗体による免疫
染色（immunostaining）。レーン１、Ｏ型ヒト赤血球か
ら調製した天然糖脂質混合物；レーン２、合成ラクトン
ガングリオ系列糖脂質；レーン３、非分化M1細胞から精
製したラクトガングリオ系列糖脂質；レーン４、純アミ
ノセラミドトリヘキソシド（CTH）；レーン５、純アシ
アロGM2;レーン６、非分化M1細胞クローンｎ−D6の１つ
から調製した中性糖脂質混合物、カンナギ（Kannagi）
ほか、プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Pro.Natl.Acad.Sci.）US
A、80、2844〜2848、1983参照。ｂ中の星印付矢はラク
トガングリオ系列糖脂質のTLC移動度を示す。レーン
２、３および６中のラクトガングリオ系列糖脂質のみが
TLC免疫染色による陽性を示す。 c.TLCのオルシノール−H2SO4反応、 d.c中と同じTLCの単クローン性YI328−51抗体による免
疫染色。 レーン１、Ｏ型ヒト赤血球から調製した天然糖脂質混
合物；レーン２、合成ラクトガングリオ系列糖脂質；レ
ーン３、ｎ−D6から調製した中性糖脂質混合物、ｄ中の
星印付矢により示されるように陽性染色はレーン２およ
び３に認められる。天然源から精製したラクトガングリ
お系列糖脂質および純アミノCTHまたはアシアロGM2に対
するYI328−51抗体の反応性はYI328−18抗体の反応性と
実質的に同じであった（図示なし）。 略号:Glob、グロボシド（Gb4）;GA2、アシアロGM2（G
g3）。CHD（LacCer）、セラミドドジヘキソシドまたは
ラクトシルセラミド。CMH、セラミドモノヘキソシド。 第８図−固相酵素免疫検定により確認された単クローン
性抗体YI328−18（ａ）およびYI328−51（ｂ）の特異
性。 （ｏ）、合成ラクトガングリオ系列糖脂質；（●）、非
分化M1細胞から精製したラクトガングリオ系列糖脂質；
（△）、アミノCTH;および（▲）、アシアロGM2を抗原
として用いた。 第９図−TLC染色により確認されたラクトガングリオ系
列ハイブリッド糖脂質の分化依存低下。 a.TLCのオルシノール−H2SO4反応、および b.aと同じTLCの単クローン性YI328−18抗体による免疫
染色。 レーン１、Ｏ型ヒト赤血球から調製した中性糖脂質混
合物；レーン２、非分化M1細胞から調製した中性糖脂質
混合物；レーン３、分化M1細胞から調製した中性糖脂質
混合物。陽性染色バンドはレーン２にのみ認められ、そ
のTLC移動度はｂ中に星印付矢により示される。テクト
ガングリオ系列糖脂質のTLC移動度はグロボシドのすぐ
下に移行するパラグロボシドの移動度に一致する。 略号:Glob、グロボシド（Gb4）、GA2、アシアロGM2（Gg
3）。 好ましい態様の説明 本発明による殊に好ましい分枝糖脂質は第１図に示す
ようにラクトガングリオ系列糖脂質である。第１図の糖
脂質の他の構造的に関連する類似体もまた本発明の目的
に有用であることができよう。殊に、分子の分枝部分が
同一であれば、分子の他の部分の置換および修飾が可能
である。例えば遠位のヒドロキシル基をアミノにより置
換することができる。またC13およびC23炭素鎖は例えば
５個までの追加またはより少ない炭素原子を含むことが
でき、多不飽和が例えばこれらの炭素鎖中に存在するこ
とができる。 第１図のラクトガングリオ系列糖脂質は非分化細胞の
少糖脂質成分である、カンナギ（Kannagi,R.）ほか、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bi
ol.Chem.）、257、14865〜74（1982）参照。この型の糖
脂質の存在と細胞の分化との間の関連が認められた。培
養マウス白血病細胞M1は適当な誘発因子例えばLPGまた
は調整培地で培養すると成熟マクロフアージ様細胞に分
化する能力を有する、イチカワ（Ichikawa,J.）、ジャ
ーナル・オブ・セルラー・フイジオロジー（J.Cell Phy
siol.）、74、223〜224、1969;カンナギ（Kannagi,R.）
ほか、ビオシミカ・エ・フイジカ・アクタ（Biochim.Bi
ophys.Acta）、712、161〜168、1982;カンナギ（Kannag
i,R.）ほか、バイオケミカル・アンド・バイオフイジカ
ル・リサーチ・コミニュケーションズ（Biochem.Biophy
s,Res.Comm.）、105、1964〜171、1982参照。分化の過
程中に細胞の糖脂質組成が数段階の著しい変化をうける
〔カンナギ（Kannagi,R.）ほか、プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、80、2844〜2848（198
3）〕。多くの非分化細胞は主にガングリオ系列糖脂質
および秤量のラクト系列脂質を含む。ラクト系列の糖脂
質の著しい増加およびガングリオ系列の糖脂質の付随す
る低下が分化の中間段階に認められ、最後にグロボ系列
糖脂質（CTH:Gb3）の合成が開始される。この糖脂質は
分化段階の終りに全細胞糖脂質の47％まで含まれる。 第１図に示すラクトガングリオ系列糖脂質の炭水化物
構造はガングリオ系列構造（アシアロGM2構造）および
ラクト系列構造（アミノCTH構造）が同一分子中に共存
するので非常に異常であり、II−ガラクトースにおける
異常分枝構造を通して仲介される。異常分岐構造は、典
型的なβ１→４結合に加えて、β１→３結合の分岐を有
する構造を意味する。この糖脂質の略示構造は次の通り
である： GalNAcβ１４ Galβ１4Glcβ１1Cer GlcNAcβ１３ 基本的な非分枝構造体例えばアシアロGM2、アミノCH
T、およびもちろんCDHは非常に普通の糖脂質であり、そ
れらは若干の正常組織および腫瘍組織中に認められ、容
易に比較的多量に精製することができる。これらの簡単
な糖脂質を認識する単クローン性抗体は既に報告され
た、ヤンク（Young,W.W.Jr.）ほか、ジャーナル・オブ
・エクスペリメンタル・メデイシン（J.Exp.Med.）、15
0、1008〜1019、1979;シミングトン（Symington,F.W.）
ほか、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J.Biol.Chem.）、159、6008〜6012、1984;およびシ
ミングトン（Symington,F.W.）ほか、モレキュラー・イ
ムノロジー（Mol,Immunol.）、21、877〜882、1984参
照。該糖脂質はその異常構造、およびこの糖脂質の含量
が分化の過程中に減少するとの知見のために腫瘍関連糖
脂質とみなされる。殊に本発明のラクトガングリオ系列
糖脂質（第１図参照）は白血病に関連する、カンナギ
（Kannagi,R.）ほか、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、259、8444〜8451
参照、それは参照により加入される。 炭水化物構造の癌関連変化のパターンには（１）異常
伸長または縮小、（２）異常反復、および（３）異常分
枝が含まれる。ラクトガングリオ系列糖脂質は炭水化物
の癌関連異常分枝を示す典型的な例とみなされ、同様の
異常分枝構造が他のマウスおよびヒト白血病細胞中、並
びに他の癌組織中に存在するかどうかを特異単クローン
性抗体の利用により知見することが関心であった。 しかし、糖脂質は非常に少ない成分であり、単クロー
ン性抗体の製造に十分な量の純糖脂質を得ることが困難
であった。 そのような目的には糖脂質を立体およびレギオ制御し
た方法で厳密に合成しなければならない。好ましくない
アノマーまたは位置異性体、あるいは他の汚染物質が最
終合成糖脂質調製物中に混入されると、これらが免疫原
性であることができ、原糖脂質に特異性の単クローン性
抗体の調製を妨害することができよう。 本発明により開発された方法にはラクトース単位、セ
ラミド単位およびヘキソサミン供与体を合成単位（シン
トン）として用いた酵素転化を含まない有機合成技術に
よる化学合成が含まれる。この特定ラクトガングリオ系
列糖脂質を生成させる合成図式に含まれる段階は実施例
に記載され、第１図〜第６図に略示される。 図面に略示した反応の型の他の特定観点は公表された
文献例えば、レミュークスほか（R.U.Lemieux,T.Taked
a,B.Y.Chung）、ACSシンポジウム（ACS Sympo.）,ser.,
39、90（1970）；レミュークスほか（R.U.Lemieux,R.M.
Ratcliff）、カナジアン・ジャーナル・オブ・ケミスト
リー（Can.J.Chem.）、57、1244（1979）；オガワほか
（T.Ogawa,M.Sugimoto）、カルボハイドレート・リサー
チ（Carbohydr.Res.）、135、C5（1985）；イトーほか
（Y.Ito,M.Sugimoto,S.Goto,T.Ogawa）、テトラヘドロ
ン・レターズ（Tetrahedron Lett.）、27、4753（198
6）；コイケほか（K.Koike,Y.Nakahara,T.Ogawa）、グ
リココンジュゲート・ジャーナル（Glycoconjugate
J.）、１、107（1984）；およびスギモトほか（M.Sugim
oto,T.Ogawa）、グリココンジュゲート・ジャーナル（G
lycoconjugate J.）、２、５（1985）に見出すことがで
きる。 化学合成糖脂質を得た後、ハレル（John G.Hurrel
l）、「単クローン性ハイブリドーマ抗体：技術および
適用」、CRC、1983に開示された技術を用いて単クロー
ン性抗体を生成させるために、それを抗原として使用し
た。 特に関心のある２つのハイブリドーマ、YI 328−18お
よびYI328−51が得られた。これはともにラクトガング
リオ系列糖脂質抗原の異常分枝構造を特異的に認識し、
抗原分子のより小さい非分枝セグメントとほとんど交差
反応性を有しないIgG3アイソタイプ抗体を生ずる。交差
反応性は実施例に示した方法により決定することができ
る。非分枝の基本構造例えばアシアロGM2またはアミノC
THに対する０〜１％の交差反応性が好ましい。殊に好ま
しいものは0.78％未満の非分枝基本構造に対する交差反
応性である。これらのハイブリドーマはアメリカン・タ
イプ・カルチヤ・コレクション〔American Type Cultur
e Collection（ATTCC）、12301、Park1awn Drive,Rockv
ille,MD20852〕に寄託された。ハイブリドーマYI328−1
8はATCC No.HB9306およびハイブリドーマYI328−51はA
TCC No.HB9307である。ともに1986年10月24日の寄託日
付を有する。 本発明によれば、合成糖脂質を免疫源として用いて非
常に少い成分である種々の癌関連糖脂質を指向する特異
単クローン性抗体を生成させること、または人工設計で
きる推定癌関連糖脂質に向けられる単クローン性抗体を
得ることが可能である。 実施例における結果は明らかに得られた単クローン性
抗体が合成ラクトガングリオ系列糖脂質およびMI細胞か
ら分離された天然存在糖脂質と等しい反応性によって証
明されるように、設計糖脂質を特異的に認識することを
示す。これは合成糖脂質が化学的意味だけでなく、また
その免疫グレードに関して十分純粋であることを示す。 公知の抗炭水化物単クローン性抗体の大部分はIgMク
ラスの抗体に属する。しかし、意外にも本研究で得られ
た２つの抗体はともに抗炭水化物抗体に特異であるIgM
クラスに属する。抗アシアロGM2、抗アミノCTHおよび抗
CDH抗体は主にIgMクラスである、ヤングほか（Young,W.
W.Jr.,McDonald,E.M.S.,Nowinski,R.C.＆ Hakomori,D）
1979、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイ
シン（J.Exp.Med.）、150、1008〜1019;シミングトンほ
か（Symington,F.W.,Bernstein,I.D.＆ Hakomo−ri,
S.）、（1984）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（J.Biol.Chem.）、159、6008〜6012;並び
にシミングトンほか（Symington,F.W.,Fenderson,B.A.
＆ Hakomori,S.）、（1984）、モレキュラー・イムノロ
ジー（Mol.Immunol.）、21、877〜882参照。この結果は
異常分枝構造が優先的IgM応答を誘発できることを示
す。 この結果は複雑な構造を有する癌関連糖脂質抗原の合
成およびヒトまたは動物の癌組織中の天然存在糖脂質抗
原の検出に使用できる単クローン性抗体の発生が全く容
易であることを示す。この方法の組合せは抗炭水化物単
クローン性抗体の範囲を著しく拡大することが期待でき
る。この組合せにより、非常に少ないがしかし有用な癌
関連炭水化物抗原に対する単クローン性抗体および人工
設計推定腫瘍関連抗原に対する抗体を自由に得ることを
可能にする。 本発明による抗体は癌関連ラクトガングリオ系列糖脂
質の存在の検出に有用であり、例えば白血病を含め、癌
の診断に役立つ。試験は免疫検定技術によく知られた方
法、例えばELISA、RIAなどにより行なうことができる。
組織試料、血清、尿、腹水、髄液、水胸および精液を検
定試料として使用できる。さらに本発明の単クローン性
抗体をアフィニティークロマトグラフィーに用いて結合
性抗原を精製することができる。放射性同位元素で標識
した単クローン性抗体を腫瘍の検出または局在化に、ま
た高用量で腫瘍の治療処置に用いることができる。化学
療法薬を単クローン性抗体に結合させて癌細胞に対する
その毒性を高めることができる。抗原を有する種、例え
ばヒトおよびマウス、を本発明の単クローン性抗体を用
いる治療または診断試験にかけることができる。 一般的に記載した本発明は次に一定の特定実施例の参
照により一層よく理解されよう、該実施例は単に例示の
ために包含され、特記しなければ本発明またはその態様
を限定するものではない。 実施例 天然源からの糖脂質の調製 分化および非分化MI細胞およびヒトＯ型赤血球からの
中性糖脂質混合物を前に記載されたように調製した、カ
ンナギ（Kannagi,R.）ほか、プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.）USA、80、2844〜48、1983;カンナ
ギ（Kannagi,R.）ほか、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、257、14865〜87
4、1982;およびカンナギ（Kannagi,R.）、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）、259、8444〜451、1984参照。非分化MI細胞中のラ
クトガングリオ系列糖脂質は高速液体クロマトグラフィ
ー、次いで調製用TLCにより、カンナギ（Kannagi,
R.）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J.Biol.Chem.）、257、14865〜874、1982に記載さ
れたように精製した。アミノCTH（LC3）は酸加水分解お
よびβ−ガラクトシダーゼ〔タチナタマメから、シグマ
社（Simga,St.Louis,MO）製〕処理によるヒト赤血球か
ら精製されたシアリルパラグロボシドの逐次分解により
精製した。純シアロGM2はカンナギ（Kannagi,R.）ほ
か、カンサー・リサーチ（Canser Res.）、43、4997〜5
005、1983に記載されたように調製用TLCによりマウス培
養リンパ腫細胞L5178Yから得た。 糖脂質の化学合成のためのシントン Ｄ−エリトロセラミドはコイケ（Koike,K.）ほか、グ
リココンジュゲート・ジャーナル（Glycoconjugate
J.）、１、107〜109、1985に記載されたようにＤ−グル
コースから合成した。ベンジル2,3,6,2′,6′−ペンタ
−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ラクシドはオガワほか（Ogaw
a,T.and Sugimoto,M.）、カルボハイドレート・リサー
チ（Carbohydrate Res.）、135、C5〜C9、1985およびリ
トパク（Litpak,A.）ほか、カルボハイドレート・リサ
ーチ（Carbohydrae Res.）、52、17〜22、1976に記載さ
れたようにラクトース−水和物〔関東化学（Kanto Chem
ical Co.Tokyo,Japan）製〕から製造した。3,4,6−トリ
−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β
−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミドおよび3,4,6−トリ
−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β
−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミドは、それぞれレミュ
ークスほか（Lemieux,R.U.and Ratcliff,R.M.）カナジ
アン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Can.J.Che
m.）、57、1244〜51、1979中の手順に従ってＤ−ガラク
トース〔和光純薬（Wako Pure Chemical Industries,Lt
d.,Osaka Japan）製〕およびＤ−グルコサミン塩酸塩
〔東京化成工業（Tokyo Kasei Kogyo Co.,Ltd.,Tokyo,J
apan）製〕から調製した。各合成の段階の全系列は第２
図〜第６図に示される。 単クローン性抗体手順 合成ラクトガングリオ系列糖脂質を酸処理サルモネラ
ミネソタ株R595の表面に吸収させ、Balb/cマウスの反復
腹腔内免疫処置に用いた、カンナギほか（Kannagi,R.an
d Hakomori,S.）、「実験免疫学ハンドブック（Handboo
k of Experimental Immunology）４巻」、ウエアほか
（Weir,D.M.and Herzenberg,L.）編、ブラックウエル・
サイエンティフィック・バブリッシング社（Blackwell
Scientific Pub.Inc.,Boston）、1986、117.1〜117.20
頁参照。免疫処置プロトコルは第４日５μｇ、第７日20
μｇ、第12日25μｇおよび最終二次免疫第26日35μｇで
あった。３日後、脾臓細胞を回収し、マウス骨髄腫P3/X
63−Ag8U1（P3U1）と融合させた。免疫処置に用いたと
同じ合成糖脂質をクローニング手順の培養上澄みの固相
酵素免疫検定における抗原として用いた。この研究の目
的の１つが化学合成糖脂質を免疫原として癌抗原に対す
る特異単クローン性抗体の調製に使用する可能性または
容易さを試験することであるので、単クローン性抗体の
調製の過程中合成糖脂質のみを用いた。合成糖脂質と反
応性の抗体を分泌する２つの代表的なクローンを二重融
合で得られた184クローンから選択した。２つのクロー
ン、YI328−18およびYI−328−51、が独立に得られ、と
もにIgG3抗体を分泌した。 単クローン性抗体と種々の糖脂質との反応性の評価 酵素免疫検定は96ウエル培養平板に固定化した種々の
糖脂質抗原およびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIg
G（重鎖および軽鎖）を用いて、ハコモリほか（HaKomor
i,S.and Kannagi,R.）により「実験免疫学ハンドブック
（Handbook of Experimental Immunology）１巻」、ウ
エアほか（Weir,D.M.and Herzenberg,L.）編、ブラツウ
エル・サイエンティフィック・パブリッシング社（Blac
kwell Scientific Pud.Inc.Boston）、1986に記載され
た標準法により行なった。またカンナギほか（Kannagi,
R.,Stroup,R.,Cochean,N.A.,Urdal D.L.,Young,W.W.Jr.
and Hakomori,S.）、カンサー・リサーチ（Cancer re
s.）、43、4997〜5005、1983参照。TLC免疫染色は、初
めにマグナミ（Magnami,J.L.）ほか、アナリティカル・
バイオケミストリー（Anal.Biochem.）109、399〜402、
1980に記載され、後に改良された〔カンナギ（Kannagi,
R.）ほか、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（J.Biol.Chem.）、257、14865〜874、1982〕よ
うに、ベーカー（Baker）HPTLCプレート〔ベーカー（Ba
ker,Phillipsburg,NJ）製〕および125IプロテインＡを
用いて行なった。 ラクトガングリオ系列糖脂質の化学合成の概要 ラクトガングリオ系列糖脂質および関連糖脂質の炭水
化物構造は表１に示される。 ラクトガングリオ系列糖脂質（LcGg4）は立体および
レギオ制御方法で合成した。合成計画は第１図に示すよ
うに、レトロ合成分析に基いて設計した。鍵グリコシ供
与体〔２〕はベンジル2,3,6,2′,6′−ペンタ−Ｏ−ベ
ンジル−β−Ｄ−ラクトシド〔４〕から出発して合成し
た。Ｄ−グルコースから製造した３−Ｏ−ベンゾイル−
Ｄ−エリトロ−セラミド〔３〕をグリコシル受容体とし
て用いた。3,4,6−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ
−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシブロミド
〔５〕および3,4,6−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキ
シ−２−フタルイミド−β−Ｄ−ガラクトピラノシルブ
ロミド〔６〕はヘキソサミン供与体として用いた。レギ
オ化学の制御のために〔４〕の２つのヒドロキシル基
を、グリコシル化に対するその相対反応性の差異を利用
して分画した。グリコシド間結合の立体化学制御は
〔４〕と〔５〕との反応に対して銀トリフレートを、
〔４＋５〕と〔６〕との反応に対してケイ酸銀を、活性
化触媒として用いることによりフタルイミド基の1,2−
トランス指向性に導く〔レミュークス（Lemieux,R.U.）
ほか、ACSシンポジウム（ACS Symp.）、Ser.39、9011
5、1976〕、ポールセン（Paulsen,H.）、アンゲバンテ
・ヘミー・インタナショナル・エデイション（Ang.Che
m.Int.Ed.）、21、155〜173、1982参照。合成の最後の
段階で構造物〔２〕を過塩素酸銀、塩化第一スズおよび
トリメチルシリルトリフレートの存在下に保護セラミド
〔３〕と反応させた。合計42段階が最終生成物〔１〕の
合成に必要であった。これらの段階は第２図〜第６図に
示される。合成糖脂質の炭水化物構造は反応列か証明さ
れ、さらにTLCおよび1H−NMRにより支持された。 TLC免疫染色および固相酵素免疫検定により確認された
入手単クローン性抗体の特異性 作られたハイブリドーマ、YI328−18およびYI328−51
により生成された単クローン性抗体の特異性はTLC免疫
染色法により確認された。第７図に示すように、両抗体
は合成ラクトガングリオ列糖脂質（第７図ａ〜ｄ中のレ
ーン２）または天然源から精製した糖脂質（第７図ａお
よびｂ中のレーン３）と等しくよく反応し、それは両レ
ーン中の同じTLC移動度を有する糖脂質バンドの強い染
色により示される。両抗体は非分化MI細胞クローンから
調製した天然糖脂質混合物中のラクトガングリオ系列糖
脂質のみを認識し、同一調製物中に存在するアシアロGM
2とは反応性でなかった（第７図ａおよびｂ中のレーン
６、第７図ｃおよびｄ中のレーン３）。高度に関連する
がしかし非分化単純構造物、純アミノCTHおよびアシア
ロGM2（第７図ａおよびｂ中のレーン３および４）との
抗体の反応性は無視できるが、対照抗体2D4〔ヤング（Y
oung,W.W.Jr.）ほか、ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メデイシン（J.Exp.Med.）、150、1008〜101
9、1979〕はアシアロGM2とのみ強く反応し、合成および
天然ラクトガングリオ列糖脂質とは反応しない。 類似の結果が特異性を固相酵素免疫検定により試験し
たときに得られた（第８図ａおよびｂ）。再びYI328−1
8およびYI328−51抗体はともに合成ラクトガングリオ系
列糖脂質および天然源MI細胞から精製した同一糖脂質と
等しくよく反応した。有意な交差反応性は関連単純構造
物、アシアロGM2およびアミノCTHと27範囲以上で認めら
れなかった。 特異単クローン性抗体により確認された癌関連ラクトガ
ングリオ系列糖脂質の分化依存性変動 TLC免疫染色を分化または非分化MI細胞から調製した
糖脂質混合物に特異単クローン性抗体YI328−18で行な
った。第９図に明瞭に示されるように、非分化MI細胞中
のラクトガングリオ系列糖脂質（レーン２）は矢により
示されるように強い染色を示す。これはこのバンドを生
ずる糖脂質がラクトガングリオ系列糖脂質であり、前の
化学的知見〔カンナギ（Kannagi,R.）ほか、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）、257、14865〜14874、1982〕を支持する。一方分
化型細胞（レーン３）と同じTLC移動度を有するバンド
は抗体により染色されなかった。この知見はバンドがパ
ラグロボシドからなりラクトガングリオ系列糖脂質でな
いとする前の化学的知見に適合する。異常ラクトガング
リオ系列糖脂質は、普通の正常糖素質であるパラグロボ
シドと一致するTLC移動都を有するが、この異常糖脂質
の検出および識別は特異単クローン性抗体例えばYI328
−18またはYI328−51でのみ可能である。 本発明は十分に記載されたので、発明の精神または範
囲から逸脱することなく本発明に多くの変更および改変
を行なうことができることは当業者に明らかであろう。
性抗体を生ずるハイブリドーマ細胞系および該ハイブリ
ドーマにより生成される単クローン性抗体を指向する。
より詳しくは、本発明はグリコスフインゴ脂質中の異常
分枝構造を認識する単クローン性抗体を生成するハイブ
リドーマを指向する。本発明はさらにグリコスフインゴ
脂質の化学合成法および本発明の単クローン性抗体を用
いる癌関連グリコスフインゴ脂質を検出する方法を指向
する。 関連技術の説明 1975年にコーラーほか（Kohlor and Millstein）は精
密かつ複製可能特異性を有する抗体のほゞ無限量の生成
を可能にする雑種細胞（ハイブリドーマ）を用いる単ク
ローン性抗体を製造する方法を導入した。それより前に
動物を腫瘍細胞または他の抗原であ免疫処置することに
より生成された普通の抗血清が特異性および性質の異な
る種々の抗体を含むことが認められた。一方、ハイブリ
ドーマは均一な特性を有する単一の抗体を生ずる。コー
ラーほか（Kohlor−Millstein）法は免疫処置動物の脾
臓細胞とイモータル骨髄腫細胞系との融合を必要とす
る。ハイブリドーマとして知られる融合細胞から所望特
異性の抗体を生ずるクローンを選ばれる。各クローンは
その１抗体のみを生成し続ける。ハイブリドーマ細胞は
無限に培養でき、または液体窒素中に凍結して貯蔵する
ことができ、その個々の抗体の一定供給が保証される。 抗体は、抗原として知られる他の分子との結合および
それを認識する能力を有するタンパク質である。単クロ
ーン性抗体は他の抗体と異ならないが、しかしそれらは
その性質が非常に均一であり、ただ１種の抗原または決
定基として知られる抗原の部分を認識する。ハイブリド
ーマの多くは接種動物が生じた抗体を他の異質物質と反
応させるので、腫瘍細胞と抗体産生細胞との融合に起因
するハイブリドーマクローンがすべて所望の異質物質ま
たは抗原に対して特異性であるわけではない。異なる細
胞により生成された抗体が同一分子の異なる抗原決定基
と反応できるので、主題抗原に対する抗体でもクローン
毎に異なる。従って、個々の単クローン性抗体が抗原分
子のどの特定部分を認識できるかを予め予測することが
できない。単クローン性抗体およびハイブリドーマを生
成させる多くの技術は、参照により加入される最近の図
書「単クローン性ハイブリドーマ抗体：技術および適用
（Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and A
pplications）」〔ハレル（John G.Hurrell）編、198
3〕により証明されるように今日普通である。 本発明は殊に癌に関連する一定の炭水化物抗原を認識
する単クローン性抗体（およびそれを生成するハイブリ
ドーマ）を指向する。炭水化物抗原は若干の研究者によ
り重要な癌関連抗原であると示された、ハコモリほか
（Hakomori,S.and Kannagi,R.）、ジャーナル・オブ・
ザ・ナショナル・カンサー・インステイチュート（J.Na
tl.Cancer Inst.）、71、231〜251;フエイジ（Feizi,
T.）、ネーチヤー（Nature）、314、53〜54、1985;ハコ
モリほか（Hakomori,S.）カンサー・リサーチ（Cancer
Res.）、45、2405〜2414、1985;およびマグナニ（Magna
ni,J.L.）、バイオケミカル・ソサイエテイー・トラン
スアクションズ（Biochem.Soc.Trans.）、12、543〜54
5、1984参照、それらはそれぞれ参照により加入され
る。癌細胞に対して生ずる若干の単クローン性抗体が糖
脂質により、またはよりまれではあるが糖タンパク質に
より、帯有される異常細胞表面炭水化物抗原を認識する
ことが示された。これらの抗体の若干は既に種々の癌を
有する患者の血清中の抗原の存在の測定に適用されてい
る、コプロウスキー（Koprowski,H.）ほか、サイエンス
（Science）、212、53〜55、1979;メッガー（Metzger）
ほか、カンサー・リサーチ（Cancer Res.）、42、601〜
608、1982;バスト（Bast,R.）ほか、ニュー・イングラ
ンド・ジャーナル・オブ・メデイシン（N.Eng.J.Me
d.）、309、883〜887、1983参照。 より最近には、種々のヒト腫瘍細胞から抽出し、精製
した癌関連糖脂質抗原がマウスの免疫処置に直接利用さ
れ、ヒト癌の検出に有用な若干の単クローン性抗体が作
られた、ハコモリ（Hakomori,S.）ほか、ジョーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）、259、4681〜4685、1984;フクシ（Fukushi,Y.）ほ
か、ジョーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem）、259、10511〜10517、1984;フクシ（F
ukushi,Y.）ほか、カンサー・リサーチ（Cancer Re
s.）、45、3711〜3717、1985;およびカンナギ（Kannag
i）ほか、カンサー・リサーチ（Cancer Res.）、46、26
19〜2626、1986参照。 糖脂質抗原に対する抗体の生成における上記成功にも
かかわらず、若干の癌関連糖脂質が非常に少ない膜成分
であり、しばしば単クローン性抗体の調製に十分な量を
天然源から精製することは容易でない。糖脂質抗原の精
製に対する方法論において進歩がなされたけれども、こ
れらの物質の量が少なく、単クローン性抗体を若干の場
合に得ることを不可能にした。そのような場合、糖脂質
抗原を化学合成により得、次いで合成抗原を指向する単
クローン性抗体を得ることが一層良いであろう。しか
し、これらの糖脂質の化学合成はその厳密な構造要件、
例えば異常な分枝構造、立体化学配置、大分子量および
他の複雑な構造特徴により非常に複雑になる。さらに、
合成図式は所要反応の低い収率および包含される長い反
応列のためにしばしば容易ではない。 癌関連糖脂質に特異的な単クローン性抗体の入手にお
ける他の複雑化因子は所望モノクローナルが糖脂質の特
定特徴例えば異常分枝部分を認識しなければならないこ
とである。同時に、モノクローナルが組立てられた抗原
分子の個々のセグメント上に存在する抗原分子の部分と
交差反応すべきではない。 上記困難のために、希抗原、例えば癌関連糖脂質抗原
に対する単クローン性抗体を得る新規な方法および単ク
ローン性抗体自体に対する要求が存在し続けている。 発明の概要 従って本発明の目的は癌関連グリコスフインゴ脂質中
の異常分枝構造を認識する単クローン性抗体を提供する
ことである。 本発明のなお他の目的はアシアロGM2（Gg3）およびア
ミノCHT（LC3）の異常分枝ハイブリッド分子である癌関
連ラクトガングリオ系列糖脂質を認識できる単クローン
性抗体であって、糖脂質の非分枝小部分例えばアシアロ
GM2および純アミノCTHと交差反応しない単クローン性抗
体を提供することである。 本発明のなお他の目的は本発明による単クローン性抗
体を生成できるハイブリドーマ細胞を提供することであ
る。 本発明のなお他の目的は癌関連糖脂質抗原の分枝構造
の存在を検出する方法を提供することである。 本発明のなお他の目的は癌関連ラクトガングリオ系列
糖脂質を合成する方法を提供することである。 上記および他の目的は、以下により明らかになるよう
に、癌関連ラクトガングリオ系列糖脂質を製造する合成
法およびこの糖脂質の分枝構造を認識する単クローン性
抗体を生成するハイブリドーマを提供する本発明により
達成された。 図面の簡単な説明 第１図−ラクトガングリオ系列糖脂質を合成する総括図
式。 Bn、ベンジル;Phth、フタロイル;Bz、ベンゾイル;A
c、アセチル。 第２〜６図−ラクトガングリオ系列糖脂質を合成する特
定段階 第７図−TLC染色により確認される単クローン性抗体、Y
I328−−18およびYI328−51、の特異性 a.TLCのオルシノール−H2SO4反応、 b.aと同じTLCの単クローン性YI328−18抗体による免疫
染色（immunostaining）。レーン１、Ｏ型ヒト赤血球か
ら調製した天然糖脂質混合物；レーン２、合成ラクトン
ガングリオ系列糖脂質；レーン３、非分化M1細胞から精
製したラクトガングリオ系列糖脂質；レーン４、純アミ
ノセラミドトリヘキソシド（CTH）；レーン５、純アシ
アロGM2;レーン６、非分化M1細胞クローンｎ−D6の１つ
から調製した中性糖脂質混合物、カンナギ（Kannagi）
ほか、プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Pro.Natl.Acad.Sci.）US
A、80、2844〜2848、1983参照。ｂ中の星印付矢はラク
トガングリオ系列糖脂質のTLC移動度を示す。レーン
２、３および６中のラクトガングリオ系列糖脂質のみが
TLC免疫染色による陽性を示す。 c.TLCのオルシノール−H2SO4反応、 d.c中と同じTLCの単クローン性YI328−51抗体による免
疫染色。 レーン１、Ｏ型ヒト赤血球から調製した天然糖脂質混
合物；レーン２、合成ラクトガングリオ系列糖脂質；レ
ーン３、ｎ−D6から調製した中性糖脂質混合物、ｄ中の
星印付矢により示されるように陽性染色はレーン２およ
び３に認められる。天然源から精製したラクトガングリ
お系列糖脂質および純アミノCTHまたはアシアロGM2に対
するYI328−51抗体の反応性はYI328−18抗体の反応性と
実質的に同じであった（図示なし）。 略号:Glob、グロボシド（Gb4）;GA2、アシアロGM2（G
g3）。CHD（LacCer）、セラミドドジヘキソシドまたは
ラクトシルセラミド。CMH、セラミドモノヘキソシド。 第８図−固相酵素免疫検定により確認された単クローン
性抗体YI328−18（ａ）およびYI328−51（ｂ）の特異
性。 （ｏ）、合成ラクトガングリオ系列糖脂質；（●）、非
分化M1細胞から精製したラクトガングリオ系列糖脂質；
（△）、アミノCTH;および（▲）、アシアロGM2を抗原
として用いた。 第９図−TLC染色により確認されたラクトガングリオ系
列ハイブリッド糖脂質の分化依存低下。 a.TLCのオルシノール−H2SO4反応、および b.aと同じTLCの単クローン性YI328−18抗体による免疫
染色。 レーン１、Ｏ型ヒト赤血球から調製した中性糖脂質混
合物；レーン２、非分化M1細胞から調製した中性糖脂質
混合物；レーン３、分化M1細胞から調製した中性糖脂質
混合物。陽性染色バンドはレーン２にのみ認められ、そ
のTLC移動度はｂ中に星印付矢により示される。テクト
ガングリオ系列糖脂質のTLC移動度はグロボシドのすぐ
下に移行するパラグロボシドの移動度に一致する。 略号:Glob、グロボシド（Gb4）、GA2、アシアロGM2（Gg
3）。 好ましい態様の説明 本発明による殊に好ましい分枝糖脂質は第１図に示す
ようにラクトガングリオ系列糖脂質である。第１図の糖
脂質の他の構造的に関連する類似体もまた本発明の目的
に有用であることができよう。殊に、分子の分枝部分が
同一であれば、分子の他の部分の置換および修飾が可能
である。例えば遠位のヒドロキシル基をアミノにより置
換することができる。またC13およびC23炭素鎖は例えば
５個までの追加またはより少ない炭素原子を含むことが
でき、多不飽和が例えばこれらの炭素鎖中に存在するこ
とができる。 第１図のラクトガングリオ系列糖脂質は非分化細胞の
少糖脂質成分である、カンナギ（Kannagi,R.）ほか、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bi
ol.Chem.）、257、14865〜74（1982）参照。この型の糖
脂質の存在と細胞の分化との間の関連が認められた。培
養マウス白血病細胞M1は適当な誘発因子例えばLPGまた
は調整培地で培養すると成熟マクロフアージ様細胞に分
化する能力を有する、イチカワ（Ichikawa,J.）、ジャ
ーナル・オブ・セルラー・フイジオロジー（J.Cell Phy
siol.）、74、223〜224、1969;カンナギ（Kannagi,R.）
ほか、ビオシミカ・エ・フイジカ・アクタ（Biochim.Bi
ophys.Acta）、712、161〜168、1982;カンナギ（Kannag
i,R.）ほか、バイオケミカル・アンド・バイオフイジカ
ル・リサーチ・コミニュケーションズ（Biochem.Biophy
s,Res.Comm.）、105、1964〜171、1982参照。分化の過
程中に細胞の糖脂質組成が数段階の著しい変化をうける
〔カンナギ（Kannagi,R.）ほか、プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、80、2844〜2848（198
3）〕。多くの非分化細胞は主にガングリオ系列糖脂質
および秤量のラクト系列脂質を含む。ラクト系列の糖脂
質の著しい増加およびガングリオ系列の糖脂質の付随す
る低下が分化の中間段階に認められ、最後にグロボ系列
糖脂質（CTH:Gb3）の合成が開始される。この糖脂質は
分化段階の終りに全細胞糖脂質の47％まで含まれる。 第１図に示すラクトガングリオ系列糖脂質の炭水化物
構造はガングリオ系列構造（アシアロGM2構造）および
ラクト系列構造（アミノCTH構造）が同一分子中に共存
するので非常に異常であり、II−ガラクトースにおける
異常分枝構造を通して仲介される。異常分岐構造は、典
型的なβ１→４結合に加えて、β１→３結合の分岐を有
する構造を意味する。この糖脂質の略示構造は次の通り
である： GalNAcβ１４ Galβ１4Glcβ１1Cer GlcNAcβ１３ 基本的な非分枝構造体例えばアシアロGM2、アミノCH
T、およびもちろんCDHは非常に普通の糖脂質であり、そ
れらは若干の正常組織および腫瘍組織中に認められ、容
易に比較的多量に精製することができる。これらの簡単
な糖脂質を認識する単クローン性抗体は既に報告され
た、ヤンク（Young,W.W.Jr.）ほか、ジャーナル・オブ
・エクスペリメンタル・メデイシン（J.Exp.Med.）、15
0、1008〜1019、1979;シミングトン（Symington,F.W.）
ほか、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J.Biol.Chem.）、159、6008〜6012、1984;およびシ
ミングトン（Symington,F.W.）ほか、モレキュラー・イ
ムノロジー（Mol,Immunol.）、21、877〜882、1984参
照。該糖脂質はその異常構造、およびこの糖脂質の含量
が分化の過程中に減少するとの知見のために腫瘍関連糖
脂質とみなされる。殊に本発明のラクトガングリオ系列
糖脂質（第１図参照）は白血病に関連する、カンナギ
（Kannagi,R.）ほか、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、259、8444〜8451
参照、それは参照により加入される。 炭水化物構造の癌関連変化のパターンには（１）異常
伸長または縮小、（２）異常反復、および（３）異常分
枝が含まれる。ラクトガングリオ系列糖脂質は炭水化物
の癌関連異常分枝を示す典型的な例とみなされ、同様の
異常分枝構造が他のマウスおよびヒト白血病細胞中、並
びに他の癌組織中に存在するかどうかを特異単クローン
性抗体の利用により知見することが関心であった。 しかし、糖脂質は非常に少ない成分であり、単クロー
ン性抗体の製造に十分な量の純糖脂質を得ることが困難
であった。 そのような目的には糖脂質を立体およびレギオ制御し
た方法で厳密に合成しなければならない。好ましくない
アノマーまたは位置異性体、あるいは他の汚染物質が最
終合成糖脂質調製物中に混入されると、これらが免疫原
性であることができ、原糖脂質に特異性の単クローン性
抗体の調製を妨害することができよう。 本発明により開発された方法にはラクトース単位、セ
ラミド単位およびヘキソサミン供与体を合成単位（シン
トン）として用いた酵素転化を含まない有機合成技術に
よる化学合成が含まれる。この特定ラクトガングリオ系
列糖脂質を生成させる合成図式に含まれる段階は実施例
に記載され、第１図〜第６図に略示される。 図面に略示した反応の型の他の特定観点は公表された
文献例えば、レミュークスほか（R.U.Lemieux,T.Taked
a,B.Y.Chung）、ACSシンポジウム（ACS Sympo.）,ser.,
39、90（1970）；レミュークスほか（R.U.Lemieux,R.M.
Ratcliff）、カナジアン・ジャーナル・オブ・ケミスト
リー（Can.J.Chem.）、57、1244（1979）；オガワほか
（T.Ogawa,M.Sugimoto）、カルボハイドレート・リサー
チ（Carbohydr.Res.）、135、C5（1985）；イトーほか
（Y.Ito,M.Sugimoto,S.Goto,T.Ogawa）、テトラヘドロ
ン・レターズ（Tetrahedron Lett.）、27、4753（198
6）；コイケほか（K.Koike,Y.Nakahara,T.Ogawa）、グ
リココンジュゲート・ジャーナル（Glycoconjugate
J.）、１、107（1984）；およびスギモトほか（M.Sugim
oto,T.Ogawa）、グリココンジュゲート・ジャーナル（G
lycoconjugate J.）、２、５（1985）に見出すことがで
きる。 化学合成糖脂質を得た後、ハレル（John G.Hurrel
l）、「単クローン性ハイブリドーマ抗体：技術および
適用」、CRC、1983に開示された技術を用いて単クロー
ン性抗体を生成させるために、それを抗原として使用し
た。 特に関心のある２つのハイブリドーマ、YI 328−18お
よびYI328−51が得られた。これはともにラクトガング
リオ系列糖脂質抗原の異常分枝構造を特異的に認識し、
抗原分子のより小さい非分枝セグメントとほとんど交差
反応性を有しないIgG3アイソタイプ抗体を生ずる。交差
反応性は実施例に示した方法により決定することができ
る。非分枝の基本構造例えばアシアロGM2またはアミノC
THに対する０〜１％の交差反応性が好ましい。殊に好ま
しいものは0.78％未満の非分枝基本構造に対する交差反
応性である。これらのハイブリドーマはアメリカン・タ
イプ・カルチヤ・コレクション〔American Type Cultur
e Collection（ATTCC）、12301、Park1awn Drive,Rockv
ille,MD20852〕に寄託された。ハイブリドーマYI328−1
8はATCC No.HB9306およびハイブリドーマYI328−51はA
TCC No.HB9307である。ともに1986年10月24日の寄託日
付を有する。 本発明によれば、合成糖脂質を免疫源として用いて非
常に少い成分である種々の癌関連糖脂質を指向する特異
単クローン性抗体を生成させること、または人工設計で
きる推定癌関連糖脂質に向けられる単クローン性抗体を
得ることが可能である。 実施例における結果は明らかに得られた単クローン性
抗体が合成ラクトガングリオ系列糖脂質およびMI細胞か
ら分離された天然存在糖脂質と等しい反応性によって証
明されるように、設計糖脂質を特異的に認識することを
示す。これは合成糖脂質が化学的意味だけでなく、また
その免疫グレードに関して十分純粋であることを示す。 公知の抗炭水化物単クローン性抗体の大部分はIgMク
ラスの抗体に属する。しかし、意外にも本研究で得られ
た２つの抗体はともに抗炭水化物抗体に特異であるIgM
クラスに属する。抗アシアロGM2、抗アミノCTHおよび抗
CDH抗体は主にIgMクラスである、ヤングほか（Young,W.
W.Jr.,McDonald,E.M.S.,Nowinski,R.C.＆ Hakomori,D）
1979、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイ
シン（J.Exp.Med.）、150、1008〜1019;シミングトンほ
か（Symington,F.W.,Bernstein,I.D.＆ Hakomo−ri,
S.）、（1984）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（J.Biol.Chem.）、159、6008〜6012;並び
にシミングトンほか（Symington,F.W.,Fenderson,B.A.
＆ Hakomori,S.）、（1984）、モレキュラー・イムノロ
ジー（Mol.Immunol.）、21、877〜882参照。この結果は
異常分枝構造が優先的IgM応答を誘発できることを示
す。 この結果は複雑な構造を有する癌関連糖脂質抗原の合
成およびヒトまたは動物の癌組織中の天然存在糖脂質抗
原の検出に使用できる単クローン性抗体の発生が全く容
易であることを示す。この方法の組合せは抗炭水化物単
クローン性抗体の範囲を著しく拡大することが期待でき
る。この組合せにより、非常に少ないがしかし有用な癌
関連炭水化物抗原に対する単クローン性抗体および人工
設計推定腫瘍関連抗原に対する抗体を自由に得ることを
可能にする。 本発明による抗体は癌関連ラクトガングリオ系列糖脂
質の存在の検出に有用であり、例えば白血病を含め、癌
の診断に役立つ。試験は免疫検定技術によく知られた方
法、例えばELISA、RIAなどにより行なうことができる。
組織試料、血清、尿、腹水、髄液、水胸および精液を検
定試料として使用できる。さらに本発明の単クローン性
抗体をアフィニティークロマトグラフィーに用いて結合
性抗原を精製することができる。放射性同位元素で標識
した単クローン性抗体を腫瘍の検出または局在化に、ま
た高用量で腫瘍の治療処置に用いることができる。化学
療法薬を単クローン性抗体に結合させて癌細胞に対する
その毒性を高めることができる。抗原を有する種、例え
ばヒトおよびマウス、を本発明の単クローン性抗体を用
いる治療または診断試験にかけることができる。 一般的に記載した本発明は次に一定の特定実施例の参
照により一層よく理解されよう、該実施例は単に例示の
ために包含され、特記しなければ本発明またはその態様
を限定するものではない。 実施例 天然源からの糖脂質の調製 分化および非分化MI細胞およびヒトＯ型赤血球からの
中性糖脂質混合物を前に記載されたように調製した、カ
ンナギ（Kannagi,R.）ほか、プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.）USA、80、2844〜48、1983;カンナ
ギ（Kannagi,R.）ほか、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、257、14865〜87
4、1982;およびカンナギ（Kannagi,R.）、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）、259、8444〜451、1984参照。非分化MI細胞中のラ
クトガングリオ系列糖脂質は高速液体クロマトグラフィ
ー、次いで調製用TLCにより、カンナギ（Kannagi,
R.）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J.Biol.Chem.）、257、14865〜874、1982に記載さ
れたように精製した。アミノCTH（LC3）は酸加水分解お
よびβ−ガラクトシダーゼ〔タチナタマメから、シグマ
社（Simga,St.Louis,MO）製〕処理によるヒト赤血球か
ら精製されたシアリルパラグロボシドの逐次分解により
精製した。純シアロGM2はカンナギ（Kannagi,R.）ほ
か、カンサー・リサーチ（Canser Res.）、43、4997〜5
005、1983に記載されたように調製用TLCによりマウス培
養リンパ腫細胞L5178Yから得た。 糖脂質の化学合成のためのシントン Ｄ−エリトロセラミドはコイケ（Koike,K.）ほか、グ
リココンジュゲート・ジャーナル（Glycoconjugate
J.）、１、107〜109、1985に記載されたようにＤ−グル
コースから合成した。ベンジル2,3,6,2′,6′−ペンタ
−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ラクシドはオガワほか（Ogaw
a,T.and Sugimoto,M.）、カルボハイドレート・リサー
チ（Carbohydrate Res.）、135、C5〜C9、1985およびリ
トパク（Litpak,A.）ほか、カルボハイドレート・リサ
ーチ（Carbohydrae Res.）、52、17〜22、1976に記載さ
れたようにラクトース−水和物〔関東化学（Kanto Chem
ical Co.Tokyo,Japan）製〕から製造した。3,4,6−トリ
−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β
−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミドおよび3,4,6−トリ
−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β
−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミドは、それぞれレミュ
ークスほか（Lemieux,R.U.and Ratcliff,R.M.）カナジ
アン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Can.J.Che
m.）、57、1244〜51、1979中の手順に従ってＤ−ガラク
トース〔和光純薬（Wako Pure Chemical Industries,Lt
d.,Osaka Japan）製〕およびＤ−グルコサミン塩酸塩
〔東京化成工業（Tokyo Kasei Kogyo Co.,Ltd.,Tokyo,J
apan）製〕から調製した。各合成の段階の全系列は第２
図〜第６図に示される。 単クローン性抗体手順 合成ラクトガングリオ系列糖脂質を酸処理サルモネラ
ミネソタ株R595の表面に吸収させ、Balb/cマウスの反復
腹腔内免疫処置に用いた、カンナギほか（Kannagi,R.an
d Hakomori,S.）、「実験免疫学ハンドブック（Handboo
k of Experimental Immunology）４巻」、ウエアほか
（Weir,D.M.and Herzenberg,L.）編、ブラックウエル・
サイエンティフィック・バブリッシング社（Blackwell
Scientific Pub.Inc.,Boston）、1986、117.1〜117.20
頁参照。免疫処置プロトコルは第４日５μｇ、第７日20
μｇ、第12日25μｇおよび最終二次免疫第26日35μｇで
あった。３日後、脾臓細胞を回収し、マウス骨髄腫P3/X
63−Ag8U1（P3U1）と融合させた。免疫処置に用いたと
同じ合成糖脂質をクローニング手順の培養上澄みの固相
酵素免疫検定における抗原として用いた。この研究の目
的の１つが化学合成糖脂質を免疫原として癌抗原に対す
る特異単クローン性抗体の調製に使用する可能性または
容易さを試験することであるので、単クローン性抗体の
調製の過程中合成糖脂質のみを用いた。合成糖脂質と反
応性の抗体を分泌する２つの代表的なクローンを二重融
合で得られた184クローンから選択した。２つのクロー
ン、YI328−18およびYI−328−51、が独立に得られ、と
もにIgG3抗体を分泌した。 単クローン性抗体と種々の糖脂質との反応性の評価 酵素免疫検定は96ウエル培養平板に固定化した種々の
糖脂質抗原およびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIg
G（重鎖および軽鎖）を用いて、ハコモリほか（HaKomor
i,S.and Kannagi,R.）により「実験免疫学ハンドブック
（Handbook of Experimental Immunology）１巻」、ウ
エアほか（Weir,D.M.and Herzenberg,L.）編、ブラツウ
エル・サイエンティフィック・パブリッシング社（Blac
kwell Scientific Pud.Inc.Boston）、1986に記載され
た標準法により行なった。またカンナギほか（Kannagi,
R.,Stroup,R.,Cochean,N.A.,Urdal D.L.,Young,W.W.Jr.
and Hakomori,S.）、カンサー・リサーチ（Cancer re
s.）、43、4997〜5005、1983参照。TLC免疫染色は、初
めにマグナミ（Magnami,J.L.）ほか、アナリティカル・
バイオケミストリー（Anal.Biochem.）109、399〜402、
1980に記載され、後に改良された〔カンナギ（Kannagi,
R.）ほか、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（J.Biol.Chem.）、257、14865〜874、1982〕よ
うに、ベーカー（Baker）HPTLCプレート〔ベーカー（Ba
ker,Phillipsburg,NJ）製〕および125IプロテインＡを
用いて行なった。 ラクトガングリオ系列糖脂質の化学合成の概要 ラクトガングリオ系列糖脂質および関連糖脂質の炭水
化物構造は表１に示される。 ラクトガングリオ系列糖脂質（LcGg4）は立体および
レギオ制御方法で合成した。合成計画は第１図に示すよ
うに、レトロ合成分析に基いて設計した。鍵グリコシ供
与体〔２〕はベンジル2,3,6,2′,6′−ペンタ−Ｏ−ベ
ンジル−β−Ｄ−ラクトシド〔４〕から出発して合成し
た。Ｄ−グルコースから製造した３−Ｏ−ベンゾイル−
Ｄ−エリトロ−セラミド〔３〕をグリコシル受容体とし
て用いた。3,4,6−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ
−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシブロミド
〔５〕および3,4,6−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキ
シ−２−フタルイミド−β−Ｄ−ガラクトピラノシルブ
ロミド〔６〕はヘキソサミン供与体として用いた。レギ
オ化学の制御のために〔４〕の２つのヒドロキシル基
を、グリコシル化に対するその相対反応性の差異を利用
して分画した。グリコシド間結合の立体化学制御は
〔４〕と〔５〕との反応に対して銀トリフレートを、
〔４＋５〕と〔６〕との反応に対してケイ酸銀を、活性
化触媒として用いることによりフタルイミド基の1,2−
トランス指向性に導く〔レミュークス（Lemieux,R.U.）
ほか、ACSシンポジウム（ACS Symp.）、Ser.39、9011
5、1976〕、ポールセン（Paulsen,H.）、アンゲバンテ
・ヘミー・インタナショナル・エデイション（Ang.Che
m.Int.Ed.）、21、155〜173、1982参照。合成の最後の
段階で構造物〔２〕を過塩素酸銀、塩化第一スズおよび
トリメチルシリルトリフレートの存在下に保護セラミド
〔３〕と反応させた。合計42段階が最終生成物〔１〕の
合成に必要であった。これらの段階は第２図〜第６図に
示される。合成糖脂質の炭水化物構造は反応列か証明さ
れ、さらにTLCおよび1H−NMRにより支持された。 TLC免疫染色および固相酵素免疫検定により確認された
入手単クローン性抗体の特異性 作られたハイブリドーマ、YI328−18およびYI328−51
により生成された単クローン性抗体の特異性はTLC免疫
染色法により確認された。第７図に示すように、両抗体
は合成ラクトガングリオ列糖脂質（第７図ａ〜ｄ中のレ
ーン２）または天然源から精製した糖脂質（第７図ａお
よびｂ中のレーン３）と等しくよく反応し、それは両レ
ーン中の同じTLC移動度を有する糖脂質バンドの強い染
色により示される。両抗体は非分化MI細胞クローンから
調製した天然糖脂質混合物中のラクトガングリオ系列糖
脂質のみを認識し、同一調製物中に存在するアシアロGM
2とは反応性でなかった（第７図ａおよびｂ中のレーン
６、第７図ｃおよびｄ中のレーン３）。高度に関連する
がしかし非分化単純構造物、純アミノCTHおよびアシア
ロGM2（第７図ａおよびｂ中のレーン３および４）との
抗体の反応性は無視できるが、対照抗体2D4〔ヤング（Y
oung,W.W.Jr.）ほか、ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メデイシン（J.Exp.Med.）、150、1008〜101
9、1979〕はアシアロGM2とのみ強く反応し、合成および
天然ラクトガングリオ列糖脂質とは反応しない。 類似の結果が特異性を固相酵素免疫検定により試験し
たときに得られた（第８図ａおよびｂ）。再びYI328−1
8およびYI328−51抗体はともに合成ラクトガングリオ系
列糖脂質および天然源MI細胞から精製した同一糖脂質と
等しくよく反応した。有意な交差反応性は関連単純構造
物、アシアロGM2およびアミノCTHと27範囲以上で認めら
れなかった。 特異単クローン性抗体により確認された癌関連ラクトガ
ングリオ系列糖脂質の分化依存性変動 TLC免疫染色を分化または非分化MI細胞から調製した
糖脂質混合物に特異単クローン性抗体YI328−18で行な
った。第９図に明瞭に示されるように、非分化MI細胞中
のラクトガングリオ系列糖脂質（レーン２）は矢により
示されるように強い染色を示す。これはこのバンドを生
ずる糖脂質がラクトガングリオ系列糖脂質であり、前の
化学的知見〔カンナギ（Kannagi,R.）ほか、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）、257、14865〜14874、1982〕を支持する。一方分
化型細胞（レーン３）と同じTLC移動度を有するバンド
は抗体により染色されなかった。この知見はバンドがパ
ラグロボシドからなりラクトガングリオ系列糖脂質でな
いとする前の化学的知見に適合する。異常ラクトガング
リオ系列糖脂質は、普通の正常糖素質であるパラグロボ
シドと一致するTLC移動都を有するが、この異常糖脂質
の検出および識別は特異単クローン性抗体例えばYI328
−18またはYI328−51でのみ可能である。 本発明は十分に記載されたので、発明の精神または範
囲から逸脱することなく本発明に多くの変更および改変
を行なうことができることは当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
第１図はラクトガングリオ系列糖脂質を合成する統括図
式を示す図、第２図〜第６図をラクトガングリオ系列糖
脂質を合致する特定反応段階で、第２図は単糖供与体合
成の反応段階（３＋８段階）、第３図は二糖受容体合成
の反応段階（６段階）、第４図は四糖供与体合成の反応
段階（８段階）、第５図はモノベンゾイルセラミド生成
能段階（15段階）、第６図は糖脂質合成の反応段階（２
段階）を示す図、第７図はTLC染色により確認された単
クローン性抗体、YI328−18およびYI328−51、の特異性
を示すパターン、第８図は固相酵素免疫検定により確認
された単クローン性抗体、YI328−18およびYI328−51の
特異性を示すグラフ、第９図はTLC染色により確認され
たラクトガングリオ系列ハイブリッド糖脂質の分化依存
低下を示すパターンである。
式を示す図、第２図〜第６図をラクトガングリオ系列糖
脂質を合致する特定反応段階で、第２図は単糖供与体合
成の反応段階（３＋８段階）、第３図は二糖受容体合成
の反応段階（６段階）、第４図は四糖供与体合成の反応
段階（８段階）、第５図はモノベンゾイルセラミド生成
能段階（15段階）、第６図は糖脂質合成の反応段階（２
段階）を示す図、第７図はTLC染色により確認された単
クローン性抗体、YI328−18およびYI328−51、の特異性
を示すパターン、第８図は固相酵素免疫検定により確認
された単クローン性抗体、YI328−18およびYI328−51の
特異性を示すグラフ、第９図はTLC染色により確認され
たラクトガングリオ系列ハイブリッド糖脂質の分化依存
低下を示すパターンである。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(72)発明者 小川 智也
東京都武蔵野市吉祥寺北町３−６−６−
３−101
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．構造： を有する化学合成ラクトガングリオ系列糖脂質である糖
脂質抗原の異常分枝構造に特異的に結合するモノクロー
ナル抗体。 ２．IgG3アイソタイプである特許請求の範囲第（１）項
に記載のモノクローナル抗体。 ３．マウス由来である特許請求の範囲第（１）項に記載
のモノクローナル抗体。 ４．アシアロGM2およびアミノCHTと０〜0.78％の交差反
応性を有する特許請求の範囲第（１）項に記載のモノク
ローナル抗体。 ５．マウス骨髄腫系の細胞と、構造：を有する合成ラクトガングリオ系列糖脂質で予め免疫処
理されたマウスの脾臓細胞との融合により形成されたハ
イブリドーマにより生成される、特許請求の範囲第
（１）項に記載のモノクローナル抗体。 ６．ATCC寄託番号HB9306のハイブリドーマYI328−18に
より生成される特許請求の範囲第（１）項に記載のモノ
クローナル抗体。 ７．ATCC寄託番号HB9307のハイブリドーマYI328−51に
より生成される特許請求の範囲第（１）項に記載のモノ
クローナル抗体。 ８．構造： を有する化学合成ラクトガングリオ系列糖脂質である糖
脂質抗原の異常分枝構造に特異的に結合するモノクロー
ナル抗体を製造する方法であって、 （ａ） マウスを前記の化学合成糖脂質抗原で免疫処理
する段階、 （ｂ） 前記マウスから脾臓を取り出して脾臓細胞の懸
濁液を作製する段階、 （ｃ） 前記脾臓細胞を融合促進剤の存在下でマウス骨
髄腫細胞と融合させる段階、 （ｄ） 融合した細胞を融合骨髄腫細胞の生育のみを維
持する培地中で希釈し個々に培養する段階、 （ｅ） ハイブリドーマを含有する個々の培養物の各々
からの培地を前記糖脂質抗原と反応する抗体の存在につ
いて試験する段階、 （ｆ） 前記糖脂質抗原の異常分枝構造と反応し、前記
抗原の非分枝成分と０〜0.78％の交差反応性を示すモノ
クローナル抗体を生成するハイブリドーマを選択してク
ローン化する段階、および （ｇ） 前記モノクローナル抗体を回収する段階、 を含む上記の方法。 ９．癌関連異常分枝糖脂質抗原の存在を検出する方法で
あって、構造： を有する化学合成ラクトガングリオ系列糖脂質である糖
脂質抗原の異常分枝構造に特異的に結合するモノクロー
ナル抗体を試験検体に接触させること、および前記抗体
と前記試験検体との間の免疫複合体形成の存在または不
存在について分析することを含む上記の方法。 １０．検体が組織試料、血清、尿、腹水、髄液、水胸お
よび精液から成る群から選ばれる、特許請求の範囲第
（９）項に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| US07/013,536 US4885358A (en) | 1987-02-11 | 1987-02-11 | Monoclonal antibodies specific for synthetic glycosphingolipids having abnormal branched structure |
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|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
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| JPS63301796A (ja) | 1988-12-08 |
| US4885358A (en) | 1989-12-05 |
| CA1296661C (en) | 1992-03-03 |
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