FI90989C - Monoklonaalinen vasta-aine, joka tunnistaa N-asetyylineuramiinihapon -järjestyksessä, sen käyttö ja sitä tuottava hybridooma - Google Patents

Description

i 90989

Monoklonaalinen vasta-aine, joka tunnistaa N-asetyylineur-amiinihapon β-jSrjestyksessS, sen kayttii ja sita tuottava hybridooma 5 Kyseinen keksintO koskee uutta hydridoomasolua, N-asetyylineuramiinihapolle β-konfiguraatiossa spesifista monoklonaalista vasta-ainetta ja sen kayttoa.

Vuonna 1975 KOhler ja Mlllsteln kehittivat menetel-m&n monoklonaalisten vasta-alnelden tuottamiseksi hybri-10 doomasolua kayttaen, jonka avulla on mahdollista tuottaa tailaista yhtenaisen speslfisyyden seka muita ominaisplir-teita omaavaa vasta-ainetta lahes valhteluitta. Jo tata alemmln oil todettu, etta tavallinen vastaseerumi, joka on tuotettu immunisoimalla jokln eiain antigeenilla, mukaan 15 lukien kasvainsoluilla, sisaitaa lukuisia erilaisia, spe-sifisyytensa ja ominaispllrteidensa osalta toislstaan poikkeavla vasta-aineita. KOhlerin et al. menetelma edel-lyttaa Immunisoidun eiaimen pernasolujen fuusiointia pysy-vaan myeloomasolulinjaan, jolloin solufuusiossa muodostu-20 neet hybridoomasolut seulotaan halutun vasta-aineen tuot-tokyvyn suhteen ell valitaan klooni, joka kykenee tuotta-maan tal erittamaan sanotuista nåin muodostuneista fuusi-oituneista, "hybridoomasoluiksi" kutsutuista soluista halutun spesifisyyden omaavaa vasta-ainetta. Tailainen kloo-25 ni kykenee tuottamaan jatkuvasti sllle luontaista vasta-ainetta. Kloonattua hybridoomaa voidaan viljells jatkuvasti tai se voidaan pdin vastoin såilOft jaadytettyna neste-typpeen. Taten voidaan taata tasaisena pysyva varanto erilaisia ykslttaisia vasta-aineita.

30 Vasta-aineet ovat proteiineja, jotka kykenevat tun- nistamaan spesifisesti muita, antigeeneinM tunnettuja mo-lekyyleja ja aineita, ja jotka niinikSSn kykenevat sitou-tumaan naihin. Monoklonaalinen vasta-alne on luonnollises-ti sekin vasta-aine, mutta sen ominaispiirteet ovat hyvin 35 yhtenaisia ja se tunnistaa vain yhden antigeenin tai anti-geenimaareen. Solufuusiomenettelylia voidaan muodostaa “ ----- T~ 2 monia erilaisia hybridoomasoluja, mutta kaikki kloonatut hybridoomat, jotka on saatu esimerkiksi fuusioimalla mye-loomasoluja immunisoidusta eiaimesta saatuihin vasta-ai-netta tuottaviin soluihin, eivåt ole spesifisia jollekin 5 halutulle antigeenille. Koska lisaksi eri kloonattujen hybridoomasolujen tuottamat vasta-aineet voivat reagoida saman molekyylin kasittamien eri antigeenimaareiden kans-sa, jonkin nimenomaisen kloonatun hybridooman tuottama vasta-aine poikkeaa muiden kloonien tuottamista vasta-ai-10 neista, vaikka kyseiset vasta-aineet olisivatkin spesifisia jollekin halutulle antigeenille. Taman vuoksi ei ole mahdollista ennustaa oikein jonkin antigeenin tiettya ni-menomaista keskusta, jonka kukin yksittainen monoklonaali-nen vasta-aine kykenee tunnistamaan. Nykyåan alalla ollaan 15 hyvin perilia erilaisista menettelyista monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi seka menettelyista niita tuo-ttamaan kykenevien hybridoomasolujen muodostamiseksi. TS1-ta osin voidaan viitata tuoreeseen julkaisuun "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", toim. 20 John G. Hurrell, 1983.

N-asetyylineuramiinihapon tiedetaan esiintyvan soker iketj un paassa glykokonjugaatissa (kompleksinen hiili-hydraatti) seka silia tiedetaan olevan erilaisia biologisesti tarkeita funktioita. Vastikaan on ilmoitettu, etta 25 vapaan N-asetyylineuramiinihapon pitoisuudessa on todetta- vissa huomattavaa nousua sellaisten potilaiden veressd tai virtsassa, jotka potevat syOpasairautta tai akuuttia tu-lehdussairautta ja taman vuoksi taman hapon kvantitatiivi-seen ja/tai kvalitatiiviseen mittaamiseen on viime aikoina 30 kohdistettu erityista mielenkiintoa.

Toisin ilmaisten, koska monoklonaalinen vasta-aine omaa korkean spesifisyyden nimenomaisen antigeenin suh-teen, jolloin se havaitsee mainitun erittain suurella herkkyydelia, olisi luontevaa kayttaa tailaista monoklo-35 naalista vasta-ainetta sybpaa diagnosoitaessa sen totea- miseksi ja hoitamiseksi varhaisvaiheessa. Diagnoosi suori- 90989 3 tettaisiin toteamalla N-asetyylineuramiinihapon lasnaolo esimerkiksi kyseisen yksilOn seerumissa jotain monoklonaa-lista vasta-ainetta syfipSmerkkinS kSyttaen sillS edelly-tykselltt, etta tailainen edelia mainitulle vapaalle N-ase-5 tyylineuramiinihapolle spesifinen monoklonaalinen vasta- aine on saatavissa.

Kyseisen asiantilan johdosta on alustavasti esi-tetty lukuisia erilaisia menetelmia vapaan N-asetyyli-neuramiinihapon toteamiseksi tai sen kvantitatiiviseksi 10 maarittamiseksi suurella herkkyydelia. Kuitenkin naiden tavanomaisiksi vakiintuneiden menetelmien huonona puolena ovat suoritushelppouteen seka spesifisyyteen halutulle antigeenille tai antigeenimaareelle liittyvat ongelmat.

Kaikki N-asetyylineuramiinihappojaann6kset, jotka 15 esiintyvat luontaisesti esiintyvien kompleksisten hiili- hydraattien sokeriketjupaadyissa, ovat α-konfiguraatiossa, kun taas vapaa N-asetyylineuramiinihappo on β-konfiguraatiossa. Naille kompleksisille hiilihydraateille spesifi-sista monoklonaalisista vasta-ainelsta ldytyy useita mono-20 klonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat spesifisesti N-asetyylineuramiinihappojaanndksia epitooppeina sisai-tavia keskuksia, mutta edelia mainituista syista jokainen vasta-aine ei kykene tunnistamaan mainittua vapaata N-ase-tyylineuramiinihappoa tai sitoutumaan siihen. Lisaksi 25 N-asetyylineuramlinihappo on alhaisen molekyylipainon omaava hapteeni, jolloin sen vasta-aineita synnyttéva ky-ky on vain vahainen. Taman vuoksi vaikuttaa silta, etta monoklonaalisten vasta-aineiden saaminen on hyvin vaikeaa, jos kaytetty eiain on immunoitu tailaisella alhaisen mo-30 lekyylipainon omaavalla hapteenilla.

Julkaisuissa Zeitschrift fiir Par asi tenkunde, vol.

71, 1985, s. 663 - 672 ja Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 76, 1979, s. 4913 - 4917 kuvataan monoklonaallsia vasta-aineita, jotka reagoivat N-asetyyli-35 neuramiinlhapon kanssa. US-patentti 4 694 076 kuvaa sla- loyyliglykopidia, joka sisaitaa biologisesti aktiivista 4 sialiinihappoa ei-redusoivassa paassa. SiinS esitetaan mytts esilia olevan keksinnttn mukaisen vasta-aineen tunnis-tama yhdiste. Viitejulkaisuissa ei kuitenkaan esiteta sita, etta kun kdytetaan antigeenia, jossa N-asetyylineur-5 amiinihappo on β-konfiguraatiossa, saadaan monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat spesifisia N-asetyylineuramiini-hapon β-konfiguraatiolle. Vastaavasti niissa ei kuvata sita, etta kun antigeenina kaytetaan N-asetyylineuramiini-hapon muotoa, joilla on α-konfiguraatio, saadaan vasta-10 aineita, jotka ovat spesifisia N-asetyylineuramiinihapon a-konfiguraatiolle.

Kyseisen keksinnttn paamaara on tarjota jotain mono-klonaalista vasta-ainetta tuottamaan kykeneva hybridooma-solu, joka monoklonaalinen vasta-aine omaa korkean spesi-15 fisyyden vapaille N-asetyylineuramiinihappojaannbksille, joita esiintyy kohonneina pitoisuuksina sybpakasvaimista tai akuutista tulehdussairauksista karsivien potilaiden veressa ja/tai virtsassa.

Kyseisen keksinnttn toinen paamaara on tarjota me-20 netelma tailaisen hybridoomasolun tuottamiseksi, joka ky-kenee tuottamaan vapaalle N-asetyylineuramiinihapolle (tai sen jaannttksille) spesifista monoklonaalista vasta-ainetta.

Kyseisen keksinnttn paamaarana on edelleen tarjota 25 monoklonaalinen vasta-aine, joka on spesifinen vapaita N-asetyylineuramiinihappojaannttksia kasittavaile epitoopil-le.

Kyseisen keksinnttn tekijat ovat suorittaneet eri-laisia tutkimuksia edelia mainittujen, tavanomaisiin me-30 nettelyihin liittyvien ongelmien poistamiseksi, ja tai-lttin havainneet, etta halutulle epitoopille tai antigee-nimaareelle spesifinen monoklonaalinen vasta-aine voidaan saada kayttamaiia immunogeenina β-konfiguraation omaavaa, kemiallisesti syntetisoitua sialiinihappojohdannaista. 35 Taten kyseinen keksinttt on saatettu paatttkseen taman ha-vainnon perusteella.

90989 5

Kyseisen keksinniin erSSn nåkiJkohdan mukaan tarjotaan uusi hybridoomasolu, joka tuottaa N-asetyylineuramii-nihapolle tal sen johdannaisille β-konfiguraatiossa epi-tooppina tal antigeenimaareena spesifista monoklonaalista 5 vasta-ainetta.

Kuvataan myOs menetelma hybridoomasolun tuottami-seksi, joka tuottaa N-asetyylineuramiinihapolle tal sen jollekin johdannaiselle β-konfiguraatiossa epitoopplna tal antigeenimaareina spesifista monoklonaalista vasta-ainet-10 ta, jolloin menetelman mukaan fuusioidaan (i) B-soluja tai B-imusoluja, jotka on saatu immunisoimalla jokin eiain kayttaen antigeenina N-asetyylineuramiinihapon jotain joh-dannaista β-konfiguraatiossa ja (ii) myeloomasoluja.

Kyseisen keksinnOn eraan lisanakOkohdan mukaan tar-15 jotaan monoklonaalinen vasta-aine, joka on erittain spesi-finen N-asetyylineuramiinihapolle β-konfiguraatiossa epi-tooppina tai antigeenimaareena.

Keksinniin mukaiselle hybridoomalle ja vasta-aineel-le on tunnusomaista se, mita patenttivaatimuksissa esite- 20 taan.

Kuviot 1-3 ovat kaaviokuvia, jotka havainnollis-tavat tuloksia ristireaktiosta taman keksinnOn mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen ja vaihtelevien N-asetyyli-neuramiinihappojohdannaisten β-konfiguraatiossa vaiilia, 25 jotka tulokset on saatu entsyymiliitteisen vasta-ainereak- tiotekniikan avulla;

Kuvio 4 on kaaviokuva, joka esittaa vapaan N-asetyylineuramiinihapon kilpailevaa estovaikutusta taman kek-sinnbn mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen ja antigeeni-30 na toimivan yhdisteen (A) vaiiseen sitoutumiseen, jota estovaikutusta tutkitaan entsyymiliitteisen vasta-aine-reaktiotekniikan avulla; ja

Kuviossa 5 esitetaan tulokset monoklonaalisen vasta-aineen ja jollakin radioisotoopilla leimatun N-asetyy-35 lineuramiinihapon vaiisesta sitoutumisreaktiosta.

Tassa tekstiosuudessa kyseista keksinttta kuvataan yksityiskohtaisemmin.

6

Kyseisen keksinndn mukainen hybridoomasolu voidaan saada edelia mainitun KOhlerin et al. menetelman mukaan. Toisin sanoen hybridoomasolu voidaan tuottaa fuusioimalla jollain antigeenilia immunisoidusta elSimesta perSisin 5 olevia B-soluja ja myeloomasoluja. T3ss3 yhteydessa ilmai-sulla "antigeeni" tarkoitetaan jotain N-asetyylineuramii-nihappojohdannaista, joka on β-konfiguraatiossa. Seuraa-vat ovat nimenomaisia esimerkkejS nSista yhdisteistS: IQ Yhdiste (A) -OCi 4H29 OH Η,,Ο,,Ο- HO \ / ν' ^^0 /NC00»a H° / /

AcHN--

HO

20 \

Yhdiste (B) ^ 25 HO H° _Γ C00Na 30 Ac^

HO

Yhdiste (C) -VHCOC23H47

OH OH 0\ A /v H

\ / 1 \/ \ 1 3 π j 7

35 OH

H0 / / COONa

AcNH---

OH

90989 7

Yhdiste (D) 0 C 1 s H 3 1 HO — 5 HO^_^OH 0 —

AcKH -

10 OH

Yhdiste (E) — OCx 4H29 15 HisCi«0 OH OH S — o' / 0 / C 0 0 iV a no / / 20 A c N H--

OH

Yhdiste (F) —OCO(CH2)i2CH3 25 CH3(CH2) ,2coo — HQ^ ^OH Ο—* 0"/ COON’a M:-w

OH

Nimenomaisia esimerkkeja N-asetyylineuramiinihappo-johdannaisista α-konfiguraatiossa, Jolloin ne eivSt reagoi 35 keksinnOn mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, ovat seuraavat: 8

Yhdiste (Η) C Η

Hf COO.N'a H(f j ° / —OC, <Hae A c Η M —OC, 4 Ha 9

HO

10

Yhdiste (I)

15 HO jL I_I

H0 J cooNa y' HO\Τ^^Ό f 20 AcH« —i-7^y

HO

Yhdiste (J) 25 HO OH COON’a NHCOCasH«, H0

AcNH "—^I 30 OH

EdelthvissS kaavoissa Ac merkitsee asetyyliryhmha. Kyseisen keksinndn mukaisen hybridoomasolun tuottama mono-klonaalinen vasta-aine tunnistaa N-asetyylineuramiinihapon 35 β-konfiguraatiossa epitooppina tai antigeenimSåreenS ja 90989 9 reagoi spesifisesti sen kanssa. Taman vuoksi kyseisen keksinnOn mukaisen hybridoomasolun tuottama monoklonaali-nen vasta-aine osoittaa ilmeisesti korkeaa spesifisyytta N-asetyylineuramlinihapon ja sen minka tahansa johdannai-5 sen suhteen, kunhan nama ovat β-konfiguraatiossa.

Kyseisen keksinnOn mukaisessa menetelmassa hybridoomasolun tuottamiseksi johonkin eiaimeen, kuten hiireen, ruiskutetaan jotain edelia luetellun kaltaista N-asetyyli-neuramiinihappojohdannaista lihaksensisaisesti, laskimon-10 sisaisesti, ihonalaisesti tai vatsaontelon sisaisesti ky-seisen elaimen herkistamiseksi ja siten B-solujen saami-seksi, erityisesti pernan B-solujen tai imusolujen. Tassa immunisoinnissa tehosteena voidaan kayttaa joko epataydel-lisia tai taydellisia tehosteita eli aineita, jotka tehos-15 tavat immuunlvastetta ja joista spesifisia esimerkkeja ovat Oljyt, emulgaattorit, tapetut tuberkkelibasillit, tapetut Salmonella-lajit ja mainittujen seokset, edulli-sesti tapettu Salmonella-kanta minnesota R 595.

Sitten nain saadut B-solut fuusioidaan myelooma-20 soluihin. Tassa solufuusiossa kaytettavina fuusioedista- jina voidaan mainita esimerkiksi polyetyleeniglykoli ja HJV, edullisesti polyetyleeniglykoli-4000. Lisaksi kas-vualustana hybridoomasolujen erottamiseksi ei-fuusioitu-neista myeloomasoluista kaytetaan edullisesti HAT-kasvu-25 alustaa.

Taman jaikeen saadut hybridoomasolut kloonataan esimerkiksi metyyliselluloosamenetelman, pehmea agar -me-netelman tai rajaavan laimennosmenetelman mukaan halutun yksittaisen kloonin eristamiseksi.

30 Nain saadun monoklonaalista vasta-ainetta tuotta- van hybridooman vasta-ainetiitteria voidaan tutkia vakio-menetelman mukaan korkean vasta-ainetiitterin omaavan hybridooman valitsemiseksi. Nain saatu hybridooma sijoitetaan sitten varastotilaan.

10

Kyseisen keksinnOn mukainen hybridoomasolu on tal-letettu talletuslaitokseen the American Type Culture Collection (ATCC) hakunumerolla HB 9619.

Kyseisen keksinnOn mukaisen hybridoomasolun tuotta-5 maa monoklonaalista vasta-ainetta voidaan kayttaa ihmis-tai eiainveressa tai -virtsassa esiintyvan vapaan N-ase-tyylineuramiinihapon toteamiseksi ja/tai sen maaran maa-rittamiseksi jonkin menetelman, kuten kilpailevan RIA-me-netelman mukaan.

10 Taman mukaan kyseisen keksinnOn mukaista monoklo naalista vasta-ainetta odotetaan kaytettavan kliinisiin tarkoituksiin, kuten tiettyjen syOpalajien ja akuuttien tulehdussairauksien diagnoosit ja kyseisia sairauksia koskevien ennusteiden laadinta. Sita paitsi sita voidaan 15 edelleen kayttaa N-asetyylineuramiinihapon eri funktioita glykolipidiliitteisissa sairauksissa koskevassa perustut-kimuksessa seka edelleen sellaisia aineita koskevissa vas-taavissa tutkimuksissa, joilla on tarkea osa eiavissa or-ganismeissa, jolloin naita aineita ovat esimerkiksi N-ase-20 tyylineuramiinihappo, sialidaasi ja sialyylitransferaasi.

On niinikaan mahdollista puhdistaa N-asetyylineuramiini-happoa β-konfiguraatiossa nain tuotettua monoklonaalista vasta-ainetta affiniteettikromatogra£isissa menetelmissa kayttaen.

25 Kyseista keksintoa selvitetaan tarkemmin seuraa- van, ei-rajaavan suoritusesimerkin avulla.

Esimerkki (A) Immunoaeenin valmistus (1) Yhdisteen (A) svnteesi 30 Metanoliin liuotettiin 3-0-(metyyli-(5-asetamido- 4,7,8,9-tetra-0-asetyyli-3,5-dideoksi-p-D-glysero-D-galak-to-2-nonulopyranosyyli)-onaatti)-1,2-di-0-tetradesyyli-Snglyserolia ja saatu liuos hydrolysoitiin lisaamaiia 1 N natriumhydroksidiliuosta huoneeniampOtilassa. Saatu reak-35 tiotuote neutraloitiin Amberlite-hartsia (Rhome & Haas Co., kauppanimi) lisaamaiia, minka jalkeen sita puhdistet- 90989 11 tiin kaanteisfaasikromatografia-ajon avulla, jolloin saa-tlin yhdiste (A), jota sitten kaytettiin Inununogeenlna (ks. tarkastamaton JP-hakemusjulkalsu nro 59-164798).

(2) Elaimet 5 Kokeissa kaytettiin viitta naaraspuolista, kuuden viikon ikaista Balb/c-hiirta, joita pidettiin koetta edel-tavat seitseman paivaa ilmastoidussa tilassa.

(3) Antioeeniliuoksen valmistus

Yhdistetta (a) (1 mg) seka Salmonella-kantaa mine-10 sota R 595 (4 mg), jota oli kasitelty etikkahapolla, lietettiin 1 mlraan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta [PBS-(-)] ja sekoitettiin, jolloin saatiin haluttu anti-geeniliuos.

(4) Kasvualusta 15 Kasvualusta: Kaytettiin Nissui RPMI 1640 -kasvu- alustaa. Kasvualustaan lisattiin 100 U/ml penisilliini-G-kaliumia, 1 mg-tlitteri/ml streptomysiinisulfaattia, 1 mM natriumpyruvaattia ja 10 % nautasikiOseerumia (FBS) ennen kayttoa.

20 HAT-kasvualusta: 0,0388 g tymidiinia ja 0,1361 g hypoksantiinia liuotettiin 100 ml:aan tislattua vetta samalla kuumentaen ja saatu liuos (a) varastoitiin -20° C:seen varastoliuokseksi, jonka pitoisuus oli 100-kertainen kayttOpitoisuuteen nahden. Samoin 0,0176 g 25 aminopteriinia liuotettiin 100 ml:aan tislattua vetta li-saamaiia pienl maarå natriumhydroksidin 1 N vesiliuosta, minka jaikeen saatu liuos laimennettiin 10-kertaisesti RPMI 1640 -kasvualustaan ja saatu liuos (b) varastoitiin -20 °C:seen varastoliuokseksi, jonka pitoisuus oli 30 100-kertainen kayttOpitoisuuteen nahden ja jota sailytet-tiin valolta suojattuna. HAT-kasvualusta valmistettiin lisaamaiia l/100-tilavuus kumpaakin edeltavaa kahta liuos-ta 10-%:iseen FBSRPMI 1640 -kasvualustaan vaiittOmasti kayttoa edeltavasti.

35 Lisaksi HT-kasvualusta valmistettiin yksinkertai- sesti lisaamaiia 1/100-tilavuus varastoliuosta (a), joka 12 sisalsi hypoksantiinia ja tymidiinia, samaan 10-%:iseen FBSRPMI 1640 -kasvualustaan.

(5) IsantSsolut

Solufuusion isantasoluina kåytettiin myeloomasoluja 5 (X63-Ag8-6.5.3-soluja), jotka oli saatu Balb/c-hiirista.

Naita soluja siirrostettiin alaviljelmaksi RPMI 1640 -kas-vualustaan, johon oli lisatty 10 % FBS:aa, jolloin mutant-timuodostus estettiin lisaamaiia kasvualustaan 6-tiogua-niinia loppupitoisuudeksi 3 pg/ml.

10 (B) Hvbridoomasolun muodostaminen (1) Immunisointimenetelma

Naaraspuoliset, kuuden viikon ikaiset Balb/c-hii-ret immunisoitiin ruiskuttamalla niihin vatsaontelon si-saisesti immunogeeniliuosta seuraavan immunisointiaikatau-15 lun mukaan: aluksi 5 pg; sitten 10 pg seka 12 paivan etta 16 palvan kuluttua; ja 15 pg seka 26 paivan etta 35 paivan kuluttua. Kun oli kulunut kolme paivaa viimeisesta inununisoinnista, hiiret uhrattiin ja pernasolut (imusolut) eristettiin, minka jaikeen saaduista soluista valmistet-20 tiin eri pernasoluja kasittavia suspensioita.

Immunogeeniliuos: 1 mg yhdistetta (A) immunogeeni-na ja 4 mg Salmonella-kantaa minesota tehosteena sekoi-tettiin 1 ml:aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta [PBS(-); ei Ca** tal Mg**], minka jaikeen saatua lluosta 25 laimennettiin sopivasti immunogeenilluoksena kaytettavak- si.

(2) Solu1en fuusiointi

Pernasolujen (imusolujen) ja isantasoluina toimi-vien hiiren myeloomasolujen vaiinen fuusio suoritettiin 30 KOhlerin ja Millsteinin menetelman mukaan. Tarkemmin ot-taen, 10® pemaimusolua, jotka oli saatu kolmen paivan kuluttua viimeisesta immunisointiruiskeesta, fuusioitiin 107 myeloomasoluun 50-%:isen polyetyleeniglykoli-(PEG 4000)-liuoksen lasnaollessa kasvualustassa.

35 (3) Hvbridoomasolun vallnta 1a tvhlennvs

Kun solut oli fuusioitu, saatuja hybridoomasoluja 90989 13 viljeltiin 15 paivan ajan RPMI 1640 -kasvualustassa, jo-hon oli lisatty HAT-kasvualustaa ja 10 % FBS:aa.

15 paivaa kestaneen viljelyn paatyttya viljelma-supernatantista maaritettiin, tuottivatko hybridoomasolut 5 mahdolli8estl yhdisteelle (A) spesifisia vasta-aineita ja tama suoritettiin entsyymiliitteisen vasta-ainemaaritys-roenetelman mukaan.

(C) Monoklonaalisen vasta-aineen reaktiivisuuden N-asetyylineuramiinihappojohdannaisten β-konfiguraatiossa 10 suhteen arviointi_ (1) Entsyymiliitteinen vasta-ainemaaritysmenetelma (ELISA-maaritvs)_ 96-kuoppaisen kuoppalevyn (saatavana valmistajalta Falcon Co., Ltd) kuoppapintoja esikasiteltiin etanolilla 15 ennen levyjen kayttamista kokeissa. Levykuoppiin pipetoi-tiin kuhunkin 50 μΐ N-asetyylineuramiinihappojohdannaista 0,002-%:isena etanoliliuoksena, minka jaikeen kuopista poistettiin liuotin haihduttamalla ja kuhunkin kuoppaan lisattiin 200 μΐ 0,2-%:ista kaseiini-PBS(-)-liuosta ja le-20 vyt jatettiin kahdeksi tunniksi huoneenlampOtilaan. Liuos poistettiin imun avulla, minka jaikeen kuhunkin kuoppaan lisattiin 50 μΐ hybridoomasoluviljelmasupematanttia ja levyt jatettiin huoneeniampdtilaan tunniksi. Samoin kysei-nen ensimmainen vasta-aineliuos poistettiin levyilta imun 25 avulla, minka jaikeen levyt pestiin kolmeen kertaan lisaa-maiia 150 μΐ PBS(-)-liuosta ja lisattiin sitten kuhunkin kuoppaan 200 μΐ 0,2-%:ista kaseiini-PBS(-)-liuosta seka jatettiin levyt 30 minuutiksi huoneeniampdtilaan. Liuoksen poistamista seuraten kuhunkin kuoppaan lisattiin 50 μΐ 30 toista vasta-ainetta, joka oli laimennettu optimipitoisuu-teen 0,2-%:ista kaseiini-PBS(-)-liuosta lisaamaiia ja jatettiin levyt 1,5 tunniksi huoneeniampdtilaan. Kuten en-simmaisenkin vasta-aineen kohdalla, levyt pestiin kolmeen kertaan PBS(-)-lluoksella ja lisattiin sitten 100 μΐ rea-35 genssiliuosta pimeassa tapahtuvan reaktion kaynnistamisek-si. Reagenssiliuos valmistettiin liuottamalla sitraatti- 14 fosfaattipuskuriin (pH 5,0) o-fenyleenidiamiinia ja vety-peroksidia siten, etta loppupitoisuuksiksi saatiin 0,4 mg/ml ja vastaavastl 0,01 %. Reaktlo keskeytettlln lis&&-maiia kuhunkin kuoppaan 30 μΐ 8 N rikkihappoliuosta, minka 5 jalkeen mitattiin absorbanssi 490 nm:n aallonpituudella tuotteen maarittamiseksi. Toisena vasta-aineena kéytettiin vuohen hiirivastaisia igG-, IgM- ja IgA-vasta-aineita, jotka oli leimattu piparjuuriperoksidaasilla (HRP).

Kyseisen keksinnOn mukaisen monoklonaalisen vasta-10 aineen spesifisyytta yhdisteiden (A) ja (F) suhteen β-kon-figuraatiossa ja yhdisteiden (H) ja (L) suhteen a-konfigu-raatiossa tutkittiin edelia selostetun menetelman avulla ja saadut tulokset on esitetty oheisissa kuvioissa 1-3.

Kuvioissa 1 ja 2 on esitetty tulokset ristireak-15 tiosta kyseisen keksinnOn mukaisen anti-yhdiste (A)-vasta-aineen ja N-asetyylineuramiinihapon β-konfiguraatiossa kasittavien, vastaavastl antigeeneina kaytettyjen yhdisteiden vftlilia. Kuten on todettavissa kuvioiden 1 ja 2 tuloskuvaajista, kaikki N-asetyylineuramiinihapon a-kon-20 figuraatlossa kasittavat yhdisteet olivat posltllvisia tassa ristireaktiossa.

Kuviossa 3 esitetaan samoin tulos ristireaktiosta kyseisen keksinnOn mukaisen vasta-aineen ja N-asetyyli-neuramiinihapon α-konfiguraatiossa kasittavien, vastaavas-25 ti antigeeneina kaytettyjen yhdisteiden vaiilia. Tulok-sena todetaan, etta kaikki N-asetyylineuramiinihapon α-konfiguraatiossa kasittavat yhdisteet olivat negatiivi-sia tassa ristireaktiossa.

Vapaan N-asetyylineuramiinihapon kilpailevan esto-30 vaikutuksen selvittSminen entsyymiliitteisen vasta-aine-maaritvsmenetelman mukaan_

Kyseisen keksinnOn mukainen vasta-aine (anti-yhdiste (A) vasta-aine) saatettiin reagoimaan yhdisteen (A) kanssa antigeeninS paailystSmaiia se kuoppapintaan vapaan 35 N-asetyylineuramlinihapon ldsnO ollessa, jotta voitiin tutkia vapaan N-asetyylineuramiinihapon kilpailevaa esto- li 90989 15 vaikutusta arvti-yhdiste (A)-vasta-aineen sitoutumiseen yh-disteeseen (A) ja tulokset tasta kokeesta on esltetty ku-vaajana kuviossa 4.

Kuvlossa 4 esitetyt tulokset osoittavat, etta va-5 paa N-asetyylineuramiinihappo sitoutuu anti-yhdiste (A)-vasta-alneen antlgeenlsltoutumlskeskukseen, jolloin se inhiboi yhdlsteen (A) sitoutumista suhteessa kyseessa ole-vaan pitoisuuteensa. Tama viittaa siihen, etta kyselsen keksinnOn mukainen anti-yhdiste (A)-vasta-aine on vapaa-10 seen N-asetyylineuramiinihappoon spesifisesti sitoutuva vasta-aine.

(14C)-N-asetyylineuramiinihapon sitoutumisominai-suuksien anti-yhdiste (A)-vasta-aineeseen nahden selvit- taminen_ 15 Anti-yhdiste (A)-vasta-aineita sisaltavaa superna- tanttia laimennettiin vahan kerrallaan 64-kertaisesti, minka jaikeen sita lisattiin kuoppalevyn kuhunkin kuop-paan vasta-aineen kiinnittamiseksi kuoppapintaan. Sitten kuoppiin lisattiin (14C)-N-asetyylineuramiinihappoliuosta 20 ja inkuboitiin, minka jaikeen kuopat pestiin ja jaannOsra-dioaktiivisuus maaritettiin kustakin kuopasta. Saadut tulokset on esitetty kuvaajan muodossa kuviossa 5. Kuvion 5 tuloksista todetaan, etta (l4C)-N-asetyylineuramiinihaposta johtuva radioaktiivisuus kasvaa suhteessa paailysteeksi 25 lisatyn vasta-aineen maaraan.

Edeltavat menettelyt toistettiin kayttaen antigee-nina glukosamiinia (kontrolli), mutta anti-yhdiste (A>-vasta-aineen ja glukosamiinin vaiista sitoutumista ei ol-lut todettavissa. Tama osoittaa niinikaan selvasti, etta 30 kyseisen keksinnOn mukainen monoklonaalinen vasta-aine reagoi spesifisesti N-asetyylineuramiinihapon kanssa sen β-konfiguraatiossa.

Claims (3)

1. Hybridooma, tunnettu siita, etta se on ATCC HB 9619, joka tuottaa monoklonaallsta vasta-ainetta, 5 joka spesifisesti sitoo vapaata N-asetyylineuramiinihap-poa, sen β-glykosideja tai sen β-glykokonjugaatteja ja joka monoklonaalinen vasta-aine ei ristireagoi N-asetyy-lineuramiinihapon a-glykosidin tai a-glykokonjugaatin kanssa.

2. Monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siita, etta se on hybridooman ATCC HB 9619 tuottama vasta-aine, joka spesifisesti sitoo vapaata N-asetyylineuramii-nihappoa, sen B-glykosideja tai sen B-glykokonjugaatteja eika se ristireagoi N-asetyylineuramiinihapon a-glykosidin 15 tai a-glykokonjugaatin kanssa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kayttO syttpakasvaimen tai akuutin tulehdus-sairauden diagnoosissa toteamalla ja kvantitoimalla poti-laan veressa tai virtsassa esiintyvM vapaa N-asetyylineu-20 ramiinihappo. li 90989