JPH11246599A - モノクローナル抗体、ハイブリッド細胞、およびモノクローナル抗体の製造方法 - Google Patents
モノクローナル抗体、ハイブリッド細胞、およびモノクローナル抗体の製造方法Info
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- JPH11246599A JPH11246599A JP10062147A JP6214798A JPH11246599A JP H11246599 A JPH11246599 A JP H11246599A JP 10062147 A JP10062147 A JP 10062147A JP 6214798 A JP6214798 A JP 6214798A JP H11246599 A JPH11246599 A JP H11246599A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 糖化蛋白質等に特異的に反応する抗体であっ
て、特異的認識部位が分子構造レベルで特定されてお
り、臨床診断、分析等において有用なモノクローナル抗
体を提供する。 【解決手段】 メチルグリオキサールで修飾した蛋白質
を調製し、前記工程で得られた蛋白質を抗原として免疫
した恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細
胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、該ハイブリッ
ド細胞を培養して培養物中からメチルグリオキサール修
飾アルギニン誘導体を特異的に認識するモノクローナル
抗体を取得する。該モノクローナル抗体は、Ｎδ−（５
−ヒドロキシ−４，６−ジメチルピリミジン−２−イ
ル）オルニチン、Ｎδ−（５−ハイドロ−５−メチル−
４−イミダゾロン−２−イル）オルニチン、及びＭＡ１
と反応性を有する。
て、特異的認識部位が分子構造レベルで特定されてお
り、臨床診断、分析等において有用なモノクローナル抗
体を提供する。 【解決手段】 メチルグリオキサールで修飾した蛋白質
を調製し、前記工程で得られた蛋白質を抗原として免疫
した恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細
胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、該ハイブリッ
ド細胞を培養して培養物中からメチルグリオキサール修
飾アルギニン誘導体を特異的に認識するモノクローナル
抗体を取得する。該モノクローナル抗体は、Ｎδ−（５
−ヒドロキシ−４，６−ジメチルピリミジン−２−イ
ル）オルニチン、Ｎδ−（５−ハイドロ−５−メチル−
４−イミダゾロン−２−イル）オルニチン、及びＭＡ１
と反応性を有する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、モノクローナル抗
体及びその製造方法、特にメチルグリオキサールとアミ
ノ酸、ペプチドあるいは蛋白質のアルギニン残基との反
応物に対する高い特異性を有するモノクローナル抗体、
該モノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞、お
よびモノクローナル抗体の製造方法に関する。さらに詳
しくは、メチルグリオキサール修飾アルギニン誘導体を
特異的に認識するモノクローナル抗体、該モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリッド細胞、およびモノクロー
ナル抗体の製造方法に関する。
体及びその製造方法、特にメチルグリオキサールとアミ
ノ酸、ペプチドあるいは蛋白質のアルギニン残基との反
応物に対する高い特異性を有するモノクローナル抗体、
該モノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞、お
よびモノクローナル抗体の製造方法に関する。さらに詳
しくは、メチルグリオキサール修飾アルギニン誘導体を
特異的に認識するモノクローナル抗体、該モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリッド細胞、およびモノクロー
ナル抗体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アミノ酸、ペプチド或いは蛋白質のアミ
ノ基は、還元糖のアルデヒド基と非酵素的に縮合し、非
酵素的に糖化され、糖化アミノ酸、糖化ペプチド或いは
糖化蛋白質（以下、「糖化蛋白質等」と略すこともあ
る。）となることが知られている。該糖化反応は、メイ
ラード反応と呼ばれ、この反応が生体内でも進行し、老
化や糖尿病合併症の進展に関与していることが知られて
いる（Ｂｉｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｖｏｌ．１３，Ｎ
ｏ．７，ｐ１４，１９９６）。
ノ基は、還元糖のアルデヒド基と非酵素的に縮合し、非
酵素的に糖化され、糖化アミノ酸、糖化ペプチド或いは
糖化蛋白質（以下、「糖化蛋白質等」と略すこともあ
る。）となることが知られている。該糖化反応は、メイ
ラード反応と呼ばれ、この反応が生体内でも進行し、老
化や糖尿病合併症の進展に関与していることが知られて
いる（Ｂｉｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｖｏｌ．１３，Ｎ
ｏ．７，ｐ１４，１９９６）。
【０００３】メイラード反応は前期段階および後期段階
の反応に分けることができる。前期段階の反応は、蛋白
質の側鎖アミノ基やＮ末端アミノ基と糖のカルボニル基
が反応し、シッフ塩基を形成した後、アマドリ転位化合
物が形成される。生体内に存在する該前期段階反応生成
物としては、例えば、ヘモグロビンＡ１Ｃや糖化アルブ
ミン等が知られており、さまざまな病態、特に糖尿病に
関与していることが知られている。
の反応に分けることができる。前期段階の反応は、蛋白
質の側鎖アミノ基やＮ末端アミノ基と糖のカルボニル基
が反応し、シッフ塩基を形成した後、アマドリ転位化合
物が形成される。生体内に存在する該前期段階反応生成
物としては、例えば、ヘモグロビンＡ１Ｃや糖化アルブ
ミン等が知られており、さまざまな病態、特に糖尿病に
関与していることが知られている。
【０００４】後期段階の反応は、上記前期段階反応の
後、さらに酸化・脱水・縮合・環状化等の複雑な反応を
経由し、蛍光性、褐色化、分子内・分子間架橋お
よび生物学的認識のうち少なくともどれか一つの特性
を有する後期反応生成物（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃ
ａｔｉｏｎ Ｅｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．以下「ＡＧ
Ｅ」と略す。）を生じる。
後、さらに酸化・脱水・縮合・環状化等の複雑な反応を
経由し、蛍光性、褐色化、分子内・分子間架橋お
よび生物学的認識のうち少なくともどれか一つの特性
を有する後期反応生成物（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃ
ａｔｉｏｎ Ｅｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．以下「ＡＧ
Ｅ」と略す。）を生じる。
【０００５】該ＡＧＥ構造体としては、カルボキシメチ
ルリジン、ピラリン、ペントシジン、クロスリン、或い
はＸ１等が提唱されている。
ルリジン、ピラリン、ペントシジン、クロスリン、或い
はＸ１等が提唱されている。
【０００６】ところで、糖化蛋白質等に特異的に反応す
る抗体であって、特異的認識部位が分子構造レベルで特
定された抗体は、該抗体を抗原物質の検出に使用した場
合に正確、且つ精密に検出することができるので、臨床
診断、分析等において有用なものである。抗原物質の検
出方法としては、免疫化学的な検出方法ならばいずれの
方法でも使用することが可能であるが、具体的には免疫
組織学的方法、酵素免疫学的測定法等が挙げられる。従
って、このような特定分子構造を特異的に認識する抗体
の出現が強く要望されている。
る抗体であって、特異的認識部位が分子構造レベルで特
定された抗体は、該抗体を抗原物質の検出に使用した場
合に正確、且つ精密に検出することができるので、臨床
診断、分析等において有用なものである。抗原物質の検
出方法としては、免疫化学的な検出方法ならばいずれの
方法でも使用することが可能であるが、具体的には免疫
組織学的方法、酵素免疫学的測定法等が挙げられる。従
って、このような特定分子構造を特異的に認識する抗体
の出現が強く要望されている。
【０００７】このような背景から、上記ＡＧＥ構造体に
対する抗体が調製され、その免疫学的研究によれば、老
化・糖尿病、糖尿病性腎症或いは哺乳動物のレンズクリ
スタリン等で陽性であることが知られている（Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８５．３８０−３８４，１９９
０， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，３７５８−
３７６４，１９８９， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．，８９．１１０２−１１１２，１９９２）。また、
特開平９−１７８７４０号公報によれば、糖尿病又は糖
尿病合併症用マーカーとしてのカルボキシメチルリジン
に対する抗体の利用について記載されている。
対する抗体が調製され、その免疫学的研究によれば、老
化・糖尿病、糖尿病性腎症或いは哺乳動物のレンズクリ
スタリン等で陽性であることが知られている（Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８５．３８０−３８４，１９９
０， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，３７５８−
３７６４，１９８９， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．，８９．１１０２−１１１２，１９９２）。また、
特開平９−１７８７４０号公報によれば、糖尿病又は糖
尿病合併症用マーカーとしてのカルボキシメチルリジン
に対する抗体の利用について記載されている。
【０００８】一方、メチルグリオキサール（以下、「Ｍ
Ｇ」と略すこともある。）は、トリオースリン酸、ジヒ
ドロキシアセトンリン酸、或いはグリセルアルデヒド−
３−リン酸の非酵素的あるいは酵素的異化により生体
内、特に血中に比較的多量に存在することが知られてお
り、糖尿病患者での血清レベルが高値であること、或い
はストレプトゾトシンにより糖尿病を誘発したラットの
レンズに多量に存在することが報告されている（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６，８０５−８１
１，１９９３、Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．，８７，２１−２
９，１９９４）。また、ＭＧは、生体内濃度レベルで蛋
白質と反応して蛍光性の産物を生成し、ＡＧＥを生成す
る直接的なメディエーターとして機能することができる
ばかりでなく、糖尿病や老化との関連性も報告されてい
る（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１
２７０，３６−４３，１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６９，３２２９９−３２３０５，１９９４、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，４３６４−４３６
９，１９９２）。
Ｇ」と略すこともある。）は、トリオースリン酸、ジヒ
ドロキシアセトンリン酸、或いはグリセルアルデヒド−
３−リン酸の非酵素的あるいは酵素的異化により生体
内、特に血中に比較的多量に存在することが知られてお
り、糖尿病患者での血清レベルが高値であること、或い
はストレプトゾトシンにより糖尿病を誘発したラットの
レンズに多量に存在することが報告されている（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６，８０５−８１
１，１９９３、Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．，８７，２１−２
９，１９９４）。また、ＭＧは、生体内濃度レベルで蛋
白質と反応して蛍光性の産物を生成し、ＡＧＥを生成す
る直接的なメディエーターとして機能することができる
ばかりでなく、糖尿病や老化との関連性も報告されてい
る（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１
２７０，３６−４３，１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６９，３２２９９−３２３０５，１９９４、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，４３６４−４３６
９，１９９２）。
【０００９】従って、ＭＧと蛋白質の反応により生じた
ＡＧＥ構造体を有する物質或いは部位を特異的に検出す
ることは、臨床診断、分析等に有用であると考えられ
る。
ＡＧＥ構造体を有する物質或いは部位を特異的に検出す
ることは、臨床診断、分析等に有用であると考えられ
る。
【００１０】このような状況下、ＭＧで修飾されたアミ
ノ酸に対するポリクローナル抗体を使用した免疫組織学
的研究では、ヒト動脈硬化病巣には該ポリクローナル抗
体により強く染色される部位が存在することが報告され
ている（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４１０，３１３−
３１８，１９９７）。
ノ酸に対するポリクローナル抗体を使用した免疫組織学
的研究では、ヒト動脈硬化病巣には該ポリクローナル抗
体により強く染色される部位が存在することが報告され
ている（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４１０，３１３−
３１８，１９９７）。
【００１１】しかしながら、上記抗体はポリクローナル
抗体であり、抗体を得る場合、多量の抗原が必要であ
る、抗体の力価が製造毎に異なる、経済的効率が低
い等の問題があり、さらには抗体の特異的認識部位が分
子構造レベルで特定されていないため測定対象が明確で
ない等の問題が生じており、このようなデメリットの無
い、特定分子構造を特異的に認識するモノクローナル抗
体が必要とされている。
抗体であり、抗体を得る場合、多量の抗原が必要であ
る、抗体の力価が製造毎に異なる、経済的効率が低
い等の問題があり、さらには抗体の特異的認識部位が分
子構造レベルで特定されていないため測定対象が明確で
ない等の問題が生じており、このようなデメリットの無
い、特定分子構造を特異的に認識するモノクローナル抗
体が必要とされている。
【００１２】ところで、ＭＧと蛋白質の反応は既に知ら
れており（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２６
９．ｐ３２２９９−３２３０５．１９９４， Ｊ，Ｐｒ
ｏｔ．Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ．１４．ｐ３５９−３７
２．１９９５）、ＭＧが蛋白質、ペプチドあるいはアミ
ノ酸と反応する場合、ＭＧは蛋白質、ペプチド中のアル
ギニン、あるいは単独アルギニンと反応することが知ら
れている。したがって、ＭＧと蛋白質、ペプチド中のア
ルギニン、あるいは単独アルギニンが反応して生じたメ
チルグリオキサール修飾アルギニン誘導体を有する物質
あるいは部位を検出することにより、糖化蛋白質等を検
出することは臨床学上あるいは分析方法上有用である。
れており（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２６
９．ｐ３２２９９−３２３０５．１９９４， Ｊ，Ｐｒ
ｏｔ．Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ．１４．ｐ３５９−３７
２．１９９５）、ＭＧが蛋白質、ペプチドあるいはアミ
ノ酸と反応する場合、ＭＧは蛋白質、ペプチド中のアル
ギニン、あるいは単独アルギニンと反応することが知ら
れている。したがって、ＭＧと蛋白質、ペプチド中のア
ルギニン、あるいは単独アルギニンが反応して生じたメ
チルグリオキサール修飾アルギニン誘導体を有する物質
あるいは部位を検出することにより、糖化蛋白質等を検
出することは臨床学上あるいは分析方法上有用である。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、糖化蛋白質等に特異的に反応する抗体であって、特
異的認識部位が分子構造レベルで特定されており、臨床
診断、分析等において有用なモノクローナル抗体を提供
することである。
は、糖化蛋白質等に特異的に反応する抗体であって、特
異的認識部位が分子構造レベルで特定されており、臨床
診断、分析等において有用なモノクローナル抗体を提供
することである。
【００１４】
【発明を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点に鑑み、検討した結果、メチルグリオキサール（略
語：ＭＧ）と供にカギアナカサガイのヘモシアニン（以
下、「ＫＬＨ」と略すこともある。）をインキュベート
してＭＧで修飾したＫＬＨを調製し、これを抗原として
免疫された恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエロ
ーマ細胞とのハイブリッド細胞が、メチルグリオキサー
ル修飾アルギニン誘導体を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体を産生することを見いだし本発明の完成に至っ
た。
点に鑑み、検討した結果、メチルグリオキサール（略
語：ＭＧ）と供にカギアナカサガイのヘモシアニン（以
下、「ＫＬＨ」と略すこともある。）をインキュベート
してＭＧで修飾したＫＬＨを調製し、これを抗原として
免疫された恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエロ
ーマ細胞とのハイブリッド細胞が、メチルグリオキサー
ル修飾アルギニン誘導体を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体を産生することを見いだし本発明の完成に至っ
た。
【００１５】すなわち、本発明はメチルグリオキサール
修飾アルギニン誘導体を特異的に認識することを特徴と
するモノクローナル抗体である。
修飾アルギニン誘導体を特異的に認識することを特徴と
するモノクローナル抗体である。
【００１６】本発明はＭＧで修飾した蛋白質を調製し、
これを抗原とし、該抗原で免疫された恒温動物から得ら
れる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させたハイ
ブリッド細胞が産生する、メチルグリオキサール修飾ア
ルギニン誘導体を特異的に認識するモノクローナル抗体
であることを特徴とする。
これを抗原とし、該抗原で免疫された恒温動物から得ら
れる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させたハイ
ブリッド細胞が産生する、メチルグリオキサール修飾ア
ルギニン誘導体を特異的に認識するモノクローナル抗体
であることを特徴とする。
【００１７】本発明のモノクローナル抗体は、Ｎδ−
（５−ヒドロキシ−４，６−ジメチルピリミジン−２−
イル）オルニチン、Ｎδ−（５−ハイドロ−５−メチル
−４−イミダゾロン−２−イル）オルニチン、及びＭＡ
１と反応性を有する。
（５−ヒドロキシ−４，６−ジメチルピリミジン−２−
イル）オルニチン、Ｎδ−（５−ハイドロ−５−メチル
−４−イミダゾロン−２−イル）オルニチン、及びＭＡ
１と反応性を有する。
【００１８】Ｎδ−（５−ヒドロキシ−４，６−ジメチ
ルピリミジン−２−イル）オルニチン（略語：ＡＰ）
は、次式（１）で示される化合物である。
ルピリミジン−２−イル）オルニチン（略語：ＡＰ）
は、次式（１）で示される化合物である。
【００１９】
【化１】 （Ａｃはアセチル基を示す。）
【００２０】Ｎδ−（５−ヒドロキシ−５−メチル−４
−イミダゾロン−２−イル）オルニチン（略語：５ＨＭ
Ｉ）は、次式（２）で示される化合物である。
−イミダゾロン−２−イル）オルニチン（略語：５ＨＭ
Ｉ）は、次式（２）で示される化合物である。
【００２１】
【化２】 （Ａｃはアセチル基を示す。）
【００２２】ＭＡ１は、次式（３）で示される化合物で
ある。
ある。
【００２３】
【化３】 （Ａｃはアセチル基を示す。）
【００２４】また、本発明は、（１）メチルグリオキサ
ールで修飾した蛋白質を調製し、（２）前記工程で得ら
れた蛋白質を抗原として免疫した恒温動物から得られる
抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリ
ッド細胞とし、（３）該ハイブリッド細胞を培養して培
養物中からメチルグリオキサール修飾アルギニン誘導体
を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得すること
を特徴とするモノクローナル抗体の製造方法である。
ールで修飾した蛋白質を調製し、（２）前記工程で得ら
れた蛋白質を抗原として免疫した恒温動物から得られる
抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリ
ッド細胞とし、（３）該ハイブリッド細胞を培養して培
養物中からメチルグリオキサール修飾アルギニン誘導体
を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得すること
を特徴とするモノクローナル抗体の製造方法である。
【００２５】なお、本発明の前記モノクローナル抗体及
びその製造方法においては、ＭＧと供にインキュベート
されるべき蛋白質はカギアナカサガイのヘモシアニン
（略語：ＫＬＨ）であることが望ましい。
びその製造方法においては、ＭＧと供にインキュベート
されるべき蛋白質はカギアナカサガイのヘモシアニン
（略語：ＫＬＨ）であることが望ましい。
【００２６】
【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体は、
ＭＧと供にインキュベートした蛋白質を調製し、これを
抗原として免疫された恒温動物から得られる抗体産生細
胞と、得られた抗体産生細胞を継代培養可能なミエロー
マ細胞とのハイブリッド細胞を創出し、このハイブリッ
ド細胞の中から目的のモノクローナル抗体のみを産生す
るハイブリッド細胞をスクリーニングし、このハイブリ
ッド細胞が抗体を産生する環境下で大量培養することに
より抗体は製造される。
ＭＧと供にインキュベートした蛋白質を調製し、これを
抗原として免疫された恒温動物から得られる抗体産生細
胞と、得られた抗体産生細胞を継代培養可能なミエロー
マ細胞とのハイブリッド細胞を創出し、このハイブリッ
ド細胞の中から目的のモノクローナル抗体のみを産生す
るハイブリッド細胞をスクリーニングし、このハイブリ
ッド細胞が抗体を産生する環境下で大量培養することに
より抗体は製造される。
【００２７】本発明のモノクローナル抗体の製造に用い
ることができる抗原は、蛋白質とＭＧの反応物であれば
良い。蛋白質としては特に限定されず、例えば、ウシ血
清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と略すこともあ
る。）、卵白アルブミン、カギアナカサガイのヘモシア
ニン（略語：ＫＬＨ）などが挙げられ、ＫＬＨが好まし
く使用できる。
ることができる抗原は、蛋白質とＭＧの反応物であれば
良い。蛋白質としては特に限定されず、例えば、ウシ血
清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と略すこともあ
る。）、卵白アルブミン、カギアナカサガイのヘモシア
ニン（略語：ＫＬＨ）などが挙げられ、ＫＬＨが好まし
く使用できる。
【００２８】ＭＧと蛋白質の反応を行うための具体的な
方法としては、例えば、前記蛋白質とＭＧを緩衝液中で
混合（攪拌）して得ることが可能である。用いる緩衝液
としては、リン酸塩、炭酸塩などの緩衝液が挙げられ、
好ましくはリン酸緩衝液が用いられる。緩衝液のｐＨは
該反応が進行するｐＨであれば特に限定されないが、ｐ
Ｈ６〜１１、好ましくはｐＨ７〜９である。緩衝液の濃
度は、該反応が進行する濃度であれば特に限定されない
が、１ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭの
緩衝液である。この反応過程は、蛋白質中のアミノ酸の
減少率で検出することが可能である。アミノ酸の減少率
は、例えば、反応前後の試料のＭＧと反応していないア
ミノ酸をアミノ酸自動分析装置で測定することにより求
めることができる。アミノ酸減少率としては、使用する
蛋白質により異なるが、アルギニン減少率が１０％以
上、好ましくは２０％以上減少することが望ましい。
方法としては、例えば、前記蛋白質とＭＧを緩衝液中で
混合（攪拌）して得ることが可能である。用いる緩衝液
としては、リン酸塩、炭酸塩などの緩衝液が挙げられ、
好ましくはリン酸緩衝液が用いられる。緩衝液のｐＨは
該反応が進行するｐＨであれば特に限定されないが、ｐ
Ｈ６〜１１、好ましくはｐＨ７〜９である。緩衝液の濃
度は、該反応が進行する濃度であれば特に限定されない
が、１ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭの
緩衝液である。この反応過程は、蛋白質中のアミノ酸の
減少率で検出することが可能である。アミノ酸の減少率
は、例えば、反応前後の試料のＭＧと反応していないア
ミノ酸をアミノ酸自動分析装置で測定することにより求
めることができる。アミノ酸減少率としては、使用する
蛋白質により異なるが、アルギニン減少率が１０％以
上、好ましくは２０％以上減少することが望ましい。
【００２９】このようなアミノ酸減少率となる反応条件
は、例えば、２５〜４５℃で１時間〜１カ月が好まし
く、さらに好ましくは３０〜４０℃で１日〜７日であ
る。
は、例えば、２５〜４５℃で１時間〜１カ月が好まし
く、さらに好ましくは３０〜４０℃で１日〜７日であ
る。
【００３０】本発明で免疫される動物は恒温動物が使用
できる。該免疫動物としては、例えばマウス、ハムスタ
ー、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ等であれば特に
制限されないが、抗体産生細胞を融合するミエローマ細
胞がマウス由来のものであるため、好ましくはマウスが
使用される。
できる。該免疫動物としては、例えばマウス、ハムスタ
ー、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ等であれば特に
制限されないが、抗体産生細胞を融合するミエローマ細
胞がマウス由来のものであるため、好ましくはマウスが
使用される。
【００３１】免疫する方法は、通常の公知の免疫方法を
用いることができる。例えば、７ないし３０日、特に１
２ないし１６日間隔で２または３回の投与が好ましい。
１回の投与量は、免疫される動物により異なるが、例え
ば、約０．０５〜２ｍｇ程度を目安とする。投与経路は
皮下注射、皮内注射、腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉
内注射等を選択することができるが、好ましくは腹膜
腔、皮下もしくは筋肉内に注射して行う投与形態であ
る。さらに好ましくは、前記投与経路を２ないし３組み
合わせた投与経路、例えば、腹膜腔注射、皮下注射およ
び筋肉内注射全ての投与経路を組み合わせるのが好まし
い。
用いることができる。例えば、７ないし３０日、特に１
２ないし１６日間隔で２または３回の投与が好ましい。
１回の投与量は、免疫される動物により異なるが、例え
ば、約０．０５〜２ｍｇ程度を目安とする。投与経路は
皮下注射、皮内注射、腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉
内注射等を選択することができるが、好ましくは腹膜
腔、皮下もしくは筋肉内に注射して行う投与形態であ
る。さらに好ましくは、前記投与経路を２ないし３組み
合わせた投与経路、例えば、腹膜腔注射、皮下注射およ
び筋肉内注射全ての投与経路を組み合わせるのが好まし
い。
【００３２】なお、この場合、抗原は適当な緩衝液、例
えばフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完
全アジュバント、水酸化アルミニウム等の通常用いられ
るアジュバントの１種を含有するナトリウムリン酸緩衝
液、生理食塩水等に溶解して用いることができるが、上
記のようなアジュバントを使用しなくとも良い。ここ
で、アジュバントとは抗原と共に投与したとき、非特異
的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味す
る。
えばフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完
全アジュバント、水酸化アルミニウム等の通常用いられ
るアジュバントの１種を含有するナトリウムリン酸緩衝
液、生理食塩水等に溶解して用いることができるが、上
記のようなアジュバントを使用しなくとも良い。ここ
で、アジュバントとは抗原と共に投与したとき、非特異
的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味す
る。
【００３３】そして、上記の抗原を免疫した恒温動物を
７〜３０日間処置せずに放置した後、該恒温動物の血清
を少量採取し、抗体価をウエスタンブロット法、凝集
法、酵素免疫測定法、一元放射状免疫拡散法等により測
定することができる。より簡便には酵素免疫測定法によ
り測定することができる。抗体価が上昇してきたら、状
況に応じて抗原の追加投与を適当回数行うことができ
る。例えば、０．０１〜１ｍｇ、特に、０．０５〜０．
５ｍｇの投与量で１もしくは２回の追加投与が行われ
る。最後の投与の１ないし３０日後、特に好ましくは１
〜７日後に免疫した恒温動物から抗体を産生するリンパ
球を含む組織を摘出する。摘出する組織は、抗体を産生
するリンパ球を含む抹消リンパ系組織ならどこでも良い
が、好ましくは脾臓である。
７〜３０日間処置せずに放置した後、該恒温動物の血清
を少量採取し、抗体価をウエスタンブロット法、凝集
法、酵素免疫測定法、一元放射状免疫拡散法等により測
定することができる。より簡便には酵素免疫測定法によ
り測定することができる。抗体価が上昇してきたら、状
況に応じて抗原の追加投与を適当回数行うことができ
る。例えば、０．０１〜１ｍｇ、特に、０．０５〜０．
５ｍｇの投与量で１もしくは２回の追加投与が行われ
る。最後の投与の１ないし３０日後、特に好ましくは１
〜７日後に免疫した恒温動物から抗体を産生するリンパ
球を含む組織を摘出する。摘出する組織は、抗体を産生
するリンパ球を含む抹消リンパ系組織ならどこでも良い
が、好ましくは脾臓である。
【００３４】得られた組織は、例えば、「単クローン抗
体実験操作入門」（講談社サイエンティフィック 安藤
民衛ら １９９１）等に記載されている方法により、継
代培養可能な細胞とするために、例えば、仙台ウイルス
やポリエチレングリコール存在下、ある種のガン細胞と
細胞融合させて、ハイブリッド細胞を得ることができ
る。ここで用いられるガン細胞は、同じ恒温動物でも同
種の恒温動物のガン細胞を用いることが望ましく、例え
ばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させ
る場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好まし
い。実際に用いられる細胞融合の方法としては、公知の
技術（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄ ３９：
２８５−３０８，１９８０）を用いることができる。
体実験操作入門」（講談社サイエンティフィック 安藤
民衛ら １９９１）等に記載されている方法により、継
代培養可能な細胞とするために、例えば、仙台ウイルス
やポリエチレングリコール存在下、ある種のガン細胞と
細胞融合させて、ハイブリッド細胞を得ることができ
る。ここで用いられるガン細胞は、同じ恒温動物でも同
種の恒温動物のガン細胞を用いることが望ましく、例え
ばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させ
る場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好まし
い。実際に用いられる細胞融合の方法としては、公知の
技術（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄ ３９：
２８５−３０８，１９８０）を用いることができる。
【００３５】例えば、免疫されたマウスから得られた脾
臓とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール存
在下で融合を行い、ハイブリッド細胞のみが生育可能で
あるＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チ
ミジン添加培地）により選択的にハイブリッド細胞を増
殖させ、ハイブリッド細胞がコロニーを形成させた後、
培養上清中の抗体をスクリーニングすることで目的の抗
体を産生するハイブリッド細胞を得ることができる。
臓とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール存
在下で融合を行い、ハイブリッド細胞のみが生育可能で
あるＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チ
ミジン添加培地）により選択的にハイブリッド細胞を増
殖させ、ハイブリッド細胞がコロニーを形成させた後、
培養上清中の抗体をスクリーニングすることで目的の抗
体を産生するハイブリッド細胞を得ることができる。
【００３６】スクリーニングする方法としては、例え
ば、ウエスタンブロット法あるいは酵素免疫化学的測定
法等が挙げられる。また、目的の抗体を産生するハイブ
リッド細胞は、限界希釈法を繰り返すことにより最終的
に単一のハイブリッド細胞を得ることができる。
ば、ウエスタンブロット法あるいは酵素免疫化学的測定
法等が挙げられる。また、目的の抗体を産生するハイブ
リッド細胞は、限界希釈法を繰り返すことにより最終的
に単一のハイブリッド細胞を得ることができる。
【００３７】さらには、これら目的の抗体を産生するハ
イブリッド細胞は抗体を産生する環境下で大量培養する
ことにより抗体を製造することができる。
イブリッド細胞は抗体を産生する環境下で大量培養する
ことにより抗体を製造することができる。
【００３８】さらに、これらの目的とする抗体を産生す
るハイブリッド細胞が産生した抗体は、例えば遠心分
離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを
用いる蛋白質分画、水性二層分配法、ゲル濾過クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、電気泳動等の蛋白質の一般
的な生化学的分離方法を、単独もしくはいくつかの方法
を組み合わせて使用することにより精製することができ
る。
るハイブリッド細胞が産生した抗体は、例えば遠心分
離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを
用いる蛋白質分画、水性二層分配法、ゲル濾過クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、電気泳動等の蛋白質の一般
的な生化学的分離方法を、単独もしくはいくつかの方法
を組み合わせて使用することにより精製することができ
る。
【００３９】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。なお、本発明は本実施例に限定されるものではな
い。
る。なお、本発明は本実施例に限定されるものではな
い。
【００４０】〔実施例１〕 １．抗原の調製 １００ｍＭのメチルグリオキサール（略語：ＭＧ）に１
ｍｇのカギアナカサガイのヘモシアニン（略語：ＫＬ
Ｈ）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶解した
溶液（濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を即座に加え、３７℃で３
日間反応させてＭＧとＫＬＨのコンジュゲート（略語：
ＭＧ−ＫＬＨ）を得て、これを抗原とした。自動アミノ
酸分析装置〔ＪＥＯＬ ＪＬＣ−５００、日本分光
（株）製〕でＭＧ−ＫＬＨ中の減少したアミノ酸を調べ
たところ、リジン（以下、「Ｌｓｙ」と略すこともあ
る。）およびアルギニン（以下、「Ａｒｇ」と略すこと
もある。）は、各々５７％、６５％減少していた。
ｍｇのカギアナカサガイのヘモシアニン（略語：ＫＬ
Ｈ）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶解した
溶液（濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を即座に加え、３７℃で３
日間反応させてＭＧとＫＬＨのコンジュゲート（略語：
ＭＧ−ＫＬＨ）を得て、これを抗原とした。自動アミノ
酸分析装置〔ＪＥＯＬ ＪＬＣ−５００、日本分光
（株）製〕でＭＧ−ＫＬＨ中の減少したアミノ酸を調べ
たところ、リジン（以下、「Ｌｓｙ」と略すこともあ
る。）およびアルギニン（以下、「Ａｒｇ」と略すこと
もある。）は、各々５７％、６５％減少していた。
【００４１】２．免疫方法 ＭＧ−ＫＬＨ（濃度：１ｍｇ／ｍｌ）は等量のフロイン
トの完全アジュバントとよく混合してエマルジョンと
し、これをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、オス、６〜８週齢）
の腹腔内に１００μｌ免疫した。初回免疫から１０〜１
４日後、抗原とフロイントの不完全アジュバントをよく
混合してエマルジョンとして、追加免疫を行った。追加
免疫から３週間後、抗原とリン酸緩衝生理食塩水（以
下、「ＰＢＳ」と略す。）を混合して最終免疫を行っ
た。なお、抗体価は、追加免疫の１週間後、マウス眼孔
静脈から血液を採取し、得られた血清を用いて酵素免疫
化学的方法で抗原に対する抗体が産生していることを確
認した。酵素免疫化学的方法では、免疫したマウスから
得られた血清と比較対照となる免疫前のマウスから得ら
れた血清の間に比較的大きな抗体価の差異が見られ、免
疫後に抗体価の上昇が確認された。
トの完全アジュバントとよく混合してエマルジョンと
し、これをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、オス、６〜８週齢）
の腹腔内に１００μｌ免疫した。初回免疫から１０〜１
４日後、抗原とフロイントの不完全アジュバントをよく
混合してエマルジョンとして、追加免疫を行った。追加
免疫から３週間後、抗原とリン酸緩衝生理食塩水（以
下、「ＰＢＳ」と略す。）を混合して最終免疫を行っ
た。なお、抗体価は、追加免疫の１週間後、マウス眼孔
静脈から血液を採取し、得られた血清を用いて酵素免疫
化学的方法で抗原に対する抗体が産生していることを確
認した。酵素免疫化学的方法では、免疫したマウスから
得られた血清と比較対照となる免疫前のマウスから得ら
れた血清の間に比較的大きな抗体価の差異が見られ、免
疫後に抗体価の上昇が確認された。
【００４２】３．抗体価の確認方法 抗体価はＭＧとウシ血清アルブミンを固相とした酵素免
疫測定法により確認した。すなわち、抗原の調製に記載
した方法と同様にウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳ
Ａ」と略すこともある。）とＭＧを反応させて、ＭＧと
ＢＳＡのコンジュゲート（以下、「ＭＧ−ＢＳＡ」と略
すこともある。）を得た。これを９６穴イムノプレート
に物理吸着させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−トリス緩
衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ＴＴＢＳ」と略すことも
ある。）で３回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むトリス緩
衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ブロッキング液」と略す
こともある。）でブロッキングを行った。このプレート
のウエルにマウスから得られた血清（１００μｌ／ウエ
ル）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗
浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されているマ
ウス抗体に対するウサギ抗体をＴＴＢＳで５０００倍希
釈した液（１００μｌ／ウエル）（以下、「酵素標識抗
体溶液」と略す。）を入れて、３７℃で１時間反応させ
た。ウエルを洗浄後、Ｏ−フェニレンジアミン（０．４
ｍｇ／ｍｌ）および過酸化水素（０．００３％）を含む
０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５）（１００μ
ｌ／ウエル）（以下、発色液と略す。）を入れて室温で
１５−２０分間反応させた。発色反応は１Ｍの硫酸（５
０μｌ／ウエル）（以下、反応停止液と略す。）を入れ
ることで停止し、マイクロプレートリーダーで４９２ｎ
ｍの吸光度を測定して抗体価の確認を行った。なお、ブ
ランクとしては、ＭＧ−ＢＳＡのかわりにＢＳＡを用い
たプレートを準備して用いた。
疫測定法により確認した。すなわち、抗原の調製に記載
した方法と同様にウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳ
Ａ」と略すこともある。）とＭＧを反応させて、ＭＧと
ＢＳＡのコンジュゲート（以下、「ＭＧ−ＢＳＡ」と略
すこともある。）を得た。これを９６穴イムノプレート
に物理吸着させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−トリス緩
衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ＴＴＢＳ」と略すことも
ある。）で３回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むトリス緩
衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ブロッキング液」と略す
こともある。）でブロッキングを行った。このプレート
のウエルにマウスから得られた血清（１００μｌ／ウエ
ル）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗
浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されているマ
ウス抗体に対するウサギ抗体をＴＴＢＳで５０００倍希
釈した液（１００μｌ／ウエル）（以下、「酵素標識抗
体溶液」と略す。）を入れて、３７℃で１時間反応させ
た。ウエルを洗浄後、Ｏ−フェニレンジアミン（０．４
ｍｇ／ｍｌ）および過酸化水素（０．００３％）を含む
０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５）（１００μ
ｌ／ウエル）（以下、発色液と略す。）を入れて室温で
１５−２０分間反応させた。発色反応は１Ｍの硫酸（５
０μｌ／ウエル）（以下、反応停止液と略す。）を入れ
ることで停止し、マイクロプレートリーダーで４９２ｎ
ｍの吸光度を測定して抗体価の確認を行った。なお、ブ
ランクとしては、ＭＧ−ＢＳＡのかわりにＢＳＡを用い
たプレートを準備して用いた。
【００４３】４．細胞融合 免疫したマウスからマウス脾臓を摘出し、よくほぐして
脾細胞を得た。得られた脾細胞はＲＰＭＩ−１６４０培
地で洗浄した。この洗浄した脾細胞と同様にＲＰＭＩ−
１６４０培地でよく洗浄したミエローマ細胞であるマウ
ス６５３細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８，６５３：ＣＲＬ・
１５８０）を細胞数が７：１の割合になるように混和
し、培地に対して５０ｗ／ｖ％のポリエチレングリコー
ル１５４０溶液を徐々に加えて５分間混和した。これに
ＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて反応を停止させた後、
５分間遠心分離して上清を廃棄した。これにＲＰＭＩ−
１６４０培地を加えた後、５分間遠心分離を行い上清を
廃棄した。この操作を２回繰り返して細胞を洗浄した。
脾細胞を得た。得られた脾細胞はＲＰＭＩ−１６４０培
地で洗浄した。この洗浄した脾細胞と同様にＲＰＭＩ−
１６４０培地でよく洗浄したミエローマ細胞であるマウ
ス６５３細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８，６５３：ＣＲＬ・
１５８０）を細胞数が７：１の割合になるように混和
し、培地に対して５０ｗ／ｖ％のポリエチレングリコー
ル１５４０溶液を徐々に加えて５分間混和した。これに
ＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて反応を停止させた後、
５分間遠心分離して上清を廃棄した。これにＲＰＭＩ−
１６４０培地を加えた後、５分間遠心分離を行い上清を
廃棄した。この操作を２回繰り返して細胞を洗浄した。
【００４４】５．クローニング 前記工程で得られた洗浄細胞に３０ｍｌのＨＡＴ培地を
加えて細胞を懸濁し、９６穴マイクロプレートの各ウエ
ルに１００μｌずつ分注し、ＨＡＴ培地により選択的に
ハイブリッド細胞を増殖させた。融合から１０日後、Ｈ
Ｔ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）
でウエル中の１／２量の培養上清を置換した。この操作
を２〜３回繰り返した。培養上清については酵素免疫化
学的方法により抗体価を確認し、スクリーニングを行っ
た。なお、抗体価の確認方法は、前述の抗体価の確認方
法と同様であるが、試験に用いる試料として血清の代わ
りに得られた培養上清を用いた。スクリーニングにより
抗体活性の確認されたウエルの細胞は限界希釈を行い培
養し、最終的にはスクリーニングと限界希釈を繰り返す
ことによりＭＧ修飾蛋白質に対して高い抗体活性を有
し、且つ単一の細胞からなるクローン株を得た。該クロ
ーン株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所に平成１０年２月２５日に寄託番号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１６６６５）として寄託されている。
加えて細胞を懸濁し、９６穴マイクロプレートの各ウエ
ルに１００μｌずつ分注し、ＨＡＴ培地により選択的に
ハイブリッド細胞を増殖させた。融合から１０日後、Ｈ
Ｔ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）
でウエル中の１／２量の培養上清を置換した。この操作
を２〜３回繰り返した。培養上清については酵素免疫化
学的方法により抗体価を確認し、スクリーニングを行っ
た。なお、抗体価の確認方法は、前述の抗体価の確認方
法と同様であるが、試験に用いる試料として血清の代わ
りに得られた培養上清を用いた。スクリーニングにより
抗体活性の確認されたウエルの細胞は限界希釈を行い培
養し、最終的にはスクリーニングと限界希釈を繰り返す
ことによりＭＧ修飾蛋白質に対して高い抗体活性を有
し、且つ単一の細胞からなるクローン株を得た。該クロ
ーン株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所に平成１０年２月２５日に寄託番号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１６６６５）として寄託されている。
【００４５】得られたクローン株の生産するモノクロー
ナル抗体は、前記クローン株をＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹
腔内で増殖させ、その腹水中からプロテイン−Ａセファ
ロースＦＦカラム（ファルマシア社製）を用いてそれぞ
れを精製した。
ナル抗体は、前記クローン株をＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹
腔内で増殖させ、その腹水中からプロテイン−Ａセファ
ロースＦＦカラム（ファルマシア社製）を用いてそれぞ
れを精製した。
【００４６】〔実施例２〕前記実施例１のクローン株か
ら得られたＭＧ修飾蛋白質を認識するモノクローナル抗
体の内、６Ｂ株のモノクローナル抗体の反応特異性につ
いて確認を行った。なお、検討に用いるモノクローナル
抗体は、前記の精製したものを用いた。
ら得られたＭＧ修飾蛋白質を認識するモノクローナル抗
体の内、６Ｂ株のモノクローナル抗体の反応特異性につ
いて確認を行った。なお、検討に用いるモノクローナル
抗体は、前記の精製したものを用いた。
【００４７】１．モノクローナル抗体の反応特異性の評
価法−１ 本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測
定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートに
ウエル当たり１００μｌの糖或いは、アルデヒド等と供
にインキュベートしたＢＳＡ（４μｇ／ｍｌ）または、
銅酸化した低比重リポ蛋白質（４μｇ／ｍｌ）を加え、
４℃で一昼夜静置してプレートに物理吸着させ、ウエル
当たり３００μｌのＴＴＢＳで３回洗浄した後、１％Ｂ
ＳＡ含有ＴＴＢＳもしくは蒸留水で４倍希釈したブロッ
クエースをウエル当たり３００μｌ加えてブロッキング
した。このプレートを上記と同様にＴＴＢＳで３回洗浄
した後、ウエル当たり１００μｌのＴＴＢＳで希釈した
本モノクローナル抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を加えて、
３７℃で３時間インキュベートした。このプレートをＴ
ＴＢＳで３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ
で標識されているマウス抗体に対するウサギ抗体をＴＴ
ＢＳで５０００倍希釈した液を入れて３７℃で１時間反
応させた。このプレートをＴＴＢＳで３回洗浄した後、
ウエル当たり１００μｌの発色液を加えて室温で１５〜
２０分間インキュベートした。さらにウエル当たり５０
μｌの反応停止液を加えた後、マイクロプレートリーダ
ーで４９２ｎｍの吸光度を測定し、本発明のモノクロー
ナル抗体の反応特異性を評価した。
価法−１ 本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測
定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートに
ウエル当たり１００μｌの糖或いは、アルデヒド等と供
にインキュベートしたＢＳＡ（４μｇ／ｍｌ）または、
銅酸化した低比重リポ蛋白質（４μｇ／ｍｌ）を加え、
４℃で一昼夜静置してプレートに物理吸着させ、ウエル
当たり３００μｌのＴＴＢＳで３回洗浄した後、１％Ｂ
ＳＡ含有ＴＴＢＳもしくは蒸留水で４倍希釈したブロッ
クエースをウエル当たり３００μｌ加えてブロッキング
した。このプレートを上記と同様にＴＴＢＳで３回洗浄
した後、ウエル当たり１００μｌのＴＴＢＳで希釈した
本モノクローナル抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を加えて、
３７℃で３時間インキュベートした。このプレートをＴ
ＴＢＳで３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ
で標識されているマウス抗体に対するウサギ抗体をＴＴ
ＢＳで５０００倍希釈した液を入れて３７℃で１時間反
応させた。このプレートをＴＴＢＳで３回洗浄した後、
ウエル当たり１００μｌの発色液を加えて室温で１５〜
２０分間インキュベートした。さらにウエル当たり５０
μｌの反応停止液を加えた後、マイクロプレートリーダ
ーで４９２ｎｍの吸光度を測定し、本発明のモノクロー
ナル抗体の反応特異性を評価した。
【００４８】２．モノクローナル抗体の反応特異性評価
法−２ 本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測
定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートに
ＭＧと供にインキュベートしたＢＳＡを加えてプレート
に物理吸着させたプレートのウエルに、本発明によるモ
ノクローナル抗体（１μg／ｍｌ）に終濃度１ｍＭとな
るように各種のＭＧ処理アミノ酸（ＭＧ−アミノ酸）を
加えたものを試料とする以外は前項に記載の方法と同様
にして吸光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の
反応特異性を評価した。
法−２ 本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測
定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートに
ＭＧと供にインキュベートしたＢＳＡを加えてプレート
に物理吸着させたプレートのウエルに、本発明によるモ
ノクローナル抗体（１μg／ｍｌ）に終濃度１ｍＭとな
るように各種のＭＧ処理アミノ酸（ＭＧ−アミノ酸）を
加えたものを試料とする以外は前項に記載の方法と同様
にして吸光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の
反応特異性を評価した。
【００４９】３．ＭＧ処理アミノ酸の調製方法 ＭＧ−アミノ酸は、前記実施例１の「抗原の調製」に記
載した方法に準じて調製を行った。すなわち、アミノ酸
として、Ｎ−α−アセチル−Ｌ−リジン（略語：Ｎａｃ
ｅｔｙｌ−Ｌｙｓ）または、Ｎ−α−アセチル−Ｌ−ア
ルギニン（略語：Ｎａｃｅｔｙｌ−Ａｒｇ）をＭＧと供
にインキュベートしてＭＧ−アミノ酸誘導体を調製し
た。調製したＭＧ−アミノ酸誘導体は、それぞれ、溶媒
系として１０％メタノール含有５０ｍＭ酢酸を流速１．
０ｍｌ／ｍｉｎとするＤｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−Ｈ
Ｇ−５（８×２５０ｍｍ；Ｎｏｍｕｒａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ）に供した。溶出プロフィルは、２１５ｎｍの吸
光度によりモニターし、ピークを分取した。得られたピ
ークをマススペクトロメーター（ＪＯＥＬ ＪＭＳ−Ｄ
Ｘ ７０５ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）お
よびＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ ＡＲＸ−４００ ｓｐｅｃ
ｔｒｏｍｅｔｅｒ）で解析した結果、ＭＧ−（Ｎａｃｅ
ｔｙｌ−Ｌｙｓ）誘導体として、１，３−ジ−Ｎα−ア
セチルリジノ−４−メチルイミダゾール（略語：ＩＬ）
およびＮδ−（カルボキシエチル）−Ｎα−アセチルリ
ジン（略語：ＣＥＬ）、ＭＧ−（Ｎａｃｅｔｙｌ−Ａｒ
ｇ）誘導体として、前記式（１）で示されるＮδ−（５
−ヒドロキシ−４，６−ジメチルピリミジン−２−イ
ル）オルニチン（略語：ＡＰ）、前記式（２）で示され
るＮδ−（５−ハイドロ−５−メチル−４−イミダゾロ
ン−２−イル）オルニチン（略語：５ＨＭＩ）、および
前記式（３）で示されるＭＡ１を得た。
載した方法に準じて調製を行った。すなわち、アミノ酸
として、Ｎ−α−アセチル−Ｌ−リジン（略語：Ｎａｃ
ｅｔｙｌ−Ｌｙｓ）または、Ｎ−α−アセチル−Ｌ−ア
ルギニン（略語：Ｎａｃｅｔｙｌ−Ａｒｇ）をＭＧと供
にインキュベートしてＭＧ−アミノ酸誘導体を調製し
た。調製したＭＧ−アミノ酸誘導体は、それぞれ、溶媒
系として１０％メタノール含有５０ｍＭ酢酸を流速１．
０ｍｌ／ｍｉｎとするＤｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−Ｈ
Ｇ−５（８×２５０ｍｍ；Ｎｏｍｕｒａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ）に供した。溶出プロフィルは、２１５ｎｍの吸
光度によりモニターし、ピークを分取した。得られたピ
ークをマススペクトロメーター（ＪＯＥＬ ＪＭＳ−Ｄ
Ｘ ７０５ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）お
よびＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ ＡＲＸ−４００ ｓｐｅｃ
ｔｒｏｍｅｔｅｒ）で解析した結果、ＭＧ−（Ｎａｃｅ
ｔｙｌ−Ｌｙｓ）誘導体として、１，３−ジ−Ｎα−ア
セチルリジノ−４−メチルイミダゾール（略語：ＩＬ）
およびＮδ−（カルボキシエチル）−Ｎα−アセチルリ
ジン（略語：ＣＥＬ）、ＭＧ−（Ｎａｃｅｔｙｌ−Ａｒ
ｇ）誘導体として、前記式（１）で示されるＮδ−（５
−ヒドロキシ−４，６−ジメチルピリミジン−２−イ
ル）オルニチン（略語：ＡＰ）、前記式（２）で示され
るＮδ−（５−ハイドロ−５−メチル−４−イミダゾロ
ン−２−イル）オルニチン（略語：５ＨＭＩ）、および
前記式（３）で示されるＭＡ１を得た。
【００５０】なお、ＩＬは次式（４）で示される化合物
である。
である。
【００５１】
【化４】 （Ａｃはアセチル基を示す。）
【００５２】また、ＣＥＬは次式（５）で示される化合
物である。
物である。
【００５３】
【化５】 （Ａｃはアセチル基を示す。）
【００５４】４．モノクローナル抗体の反応特異性−１ 前記実施例１のモノクローナル抗体に関して蛋白質に対
する反応特異性を評価した。すなわち、ＭＧ、キシロー
ス、フルクトース、グルコース、アラビノース、ヘキサ
ナール、ペンタナール、プロペナール、ノネナール、オ
クテナール、ヘキセナール、クロトナール、アクロレイ
ン、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、４−ヒドロキシノ
ネナール（ＨＮＥ）、カルボキシメチルリジン（ＣＭ
Ｌ）、銅酸化低比重ＬＤＬ蛋白質（Ｃｕ２＋ＬＤＬ）、
フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）、グルコース−６
−リン酸（Ｇ６Ｐ）、未処理ＢＳＡ（Ｎａｔｉｖｅ）な
どの図１に記載される各種物質と供にインキュベートし
たＢＳＡを用い、前記のモノクローナル抗体の反応特異
性評価法−１により測定した。その結果を縦軸に物質、
横軸に吸光度（Ｏ．Ｄ．）をとったグラフとして図１に
示す。ＭＧとインキュベートしたＢＳＡは認識されるも
のの、他の物質でインキュベートしたＢＳＡは全く認識
されなかった。
する反応特異性を評価した。すなわち、ＭＧ、キシロー
ス、フルクトース、グルコース、アラビノース、ヘキサ
ナール、ペンタナール、プロペナール、ノネナール、オ
クテナール、ヘキセナール、クロトナール、アクロレイ
ン、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、４−ヒドロキシノ
ネナール（ＨＮＥ）、カルボキシメチルリジン（ＣＭ
Ｌ）、銅酸化低比重ＬＤＬ蛋白質（Ｃｕ２＋ＬＤＬ）、
フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）、グルコース−６
−リン酸（Ｇ６Ｐ）、未処理ＢＳＡ（Ｎａｔｉｖｅ）な
どの図１に記載される各種物質と供にインキュベートし
たＢＳＡを用い、前記のモノクローナル抗体の反応特異
性評価法−１により測定した。その結果を縦軸に物質、
横軸に吸光度（Ｏ．Ｄ．）をとったグラフとして図１に
示す。ＭＧとインキュベートしたＢＳＡは認識されるも
のの、他の物質でインキュベートしたＢＳＡは全く認識
されなかった。
【００５５】５．モノクローナル抗体の反応特異性−２ 前記実施例１のモノクローナル抗体に関してＭＧ−アミ
ノ酸反応生成物に対する反応特異性を評価した。前記、
実施例１、「抗原の調製」の項に示したように、ＭＧと
蛋白質を反応させた場合、自動アミノ酸分析装置で測定
したＭＧ修飾蛋白質中の減少するアミノ酸は、リジン
（以下、「Ｌｓｙ」と略すこともある。）およびアルギ
ニン（以下、「Ａｒｇ」と略すこともある。）である。
従って、ＭＧ−アミノ酸誘導体としては、アミノ酸とし
てＬｙｓおよびＡｒｇを用いて前記実施例１のモノクロ
ーナル抗体の反応特異性を評価した。すなわち、Ｎａｃ
ｅｔｙｌ−Ｌｙｓ、Ｎａｃｅｔｙｌ−ＡｒｇおよびＮａ
ｃｅｔｙｌ−ＬｙｓまたはＮａｃｅｔｙｌ−ＡｒｇのＭ
Ｇ修飾物（略語：ＭＧ＋Ｎａｃｅｔｙｌ−Ｌｙｓ、ＭＧ
＋Ｎａｃｅｔｙｌ−Ａｒｇ）を競合物質として前記のモ
ノクローナル抗体の反応特異性評価法−２により測定し
た。その結果を縦軸に競合物質、横軸に吸光度（Ｏ．
Ｄ．）をとったグラフとして図２に示す。その結果、Ｎ
ａｃｅｔｙｌ−ＡｒｇのＭＧ修飾物を競合物質として添
加したもののみ吸光度が減少した。従って本抗体はＭＧ
＋Ｎａｃｅｔｙｌ−Ａｒｇは認識するものの、他のＭＧ
−アミノ酸誘導体は全く認識しないことが明らかとなっ
た。
ノ酸反応生成物に対する反応特異性を評価した。前記、
実施例１、「抗原の調製」の項に示したように、ＭＧと
蛋白質を反応させた場合、自動アミノ酸分析装置で測定
したＭＧ修飾蛋白質中の減少するアミノ酸は、リジン
（以下、「Ｌｓｙ」と略すこともある。）およびアルギ
ニン（以下、「Ａｒｇ」と略すこともある。）である。
従って、ＭＧ−アミノ酸誘導体としては、アミノ酸とし
てＬｙｓおよびＡｒｇを用いて前記実施例１のモノクロ
ーナル抗体の反応特異性を評価した。すなわち、Ｎａｃ
ｅｔｙｌ−Ｌｙｓ、Ｎａｃｅｔｙｌ−ＡｒｇおよびＮａ
ｃｅｔｙｌ−ＬｙｓまたはＮａｃｅｔｙｌ−ＡｒｇのＭ
Ｇ修飾物（略語：ＭＧ＋Ｎａｃｅｔｙｌ−Ｌｙｓ、ＭＧ
＋Ｎａｃｅｔｙｌ−Ａｒｇ）を競合物質として前記のモ
ノクローナル抗体の反応特異性評価法−２により測定し
た。その結果を縦軸に競合物質、横軸に吸光度（Ｏ．
Ｄ．）をとったグラフとして図２に示す。その結果、Ｎ
ａｃｅｔｙｌ−ＡｒｇのＭＧ修飾物を競合物質として添
加したもののみ吸光度が減少した。従って本抗体はＭＧ
＋Ｎａｃｅｔｙｌ−Ａｒｇは認識するものの、他のＭＧ
−アミノ酸誘導体は全く認識しないことが明らかとなっ
た。
【００５６】６．モノクローナル抗体の反応性−３ 前記実施例２の「モノクローナル抗体の反応性−２」か
ら得られた結果をさらに詳細に検討するために、実施例
１のモノクローナル抗体に関してＭＧ−アミノ酸誘導体
に対する反応特異性を評価した。すなわち、ＭＧ−（Ｎ
ａｃｅｔｙｌ−Ｌｙｓ）誘導体として、１，３−ジ−Ｎ
α−アセチルリジン−４−メチルイミダゾール（略語：
ＩＬ）およびＮδ−（カルボキシエチル）−Ｎα−アセ
チルリジン（略語：ＣＥＬ）、ＭＧ−（Ｎａｃｅｔｙｌ
−Ａｒｇ）誘導体として、Ｎδ−（５−ハイドロ−５−
メチル−４−イミダゾロン−２−イル）オルニチン（略
語：５ＨＭＩ）、Ｎδ−（５−ヒドロキシ−４，６−ジ
メチルピリミジン−２−イル）オルニチン（略語、Ａ
Ｐ）およびＭＡ１を競合物質として前記のモノクローナ
ル抗体の反応特異性評価法−２により測定した。その結
果を縦軸に競合物質、横軸に吸光度（Ｏ．Ｄ．）をとっ
たグラフとして図３に示す。その結果、ＭＧとＡｒｇの
反応生成物である、ＭＡ１、５ＨＭＩおよびＡＰを競合
物質として添加したもののみ吸光度が減少した。従って
本抗体はＭＧとＡｒｇの反応生成物、ＭＧ―アミノ酸誘
導体のみを認識することが明らかとなった。
ら得られた結果をさらに詳細に検討するために、実施例
１のモノクローナル抗体に関してＭＧ−アミノ酸誘導体
に対する反応特異性を評価した。すなわち、ＭＧ−（Ｎ
ａｃｅｔｙｌ−Ｌｙｓ）誘導体として、１，３−ジ−Ｎ
α−アセチルリジン−４−メチルイミダゾール（略語：
ＩＬ）およびＮδ−（カルボキシエチル）−Ｎα−アセ
チルリジン（略語：ＣＥＬ）、ＭＧ−（Ｎａｃｅｔｙｌ
−Ａｒｇ）誘導体として、Ｎδ−（５−ハイドロ−５−
メチル−４−イミダゾロン−２−イル）オルニチン（略
語：５ＨＭＩ）、Ｎδ−（５−ヒドロキシ−４，６−ジ
メチルピリミジン−２−イル）オルニチン（略語、Ａ
Ｐ）およびＭＡ１を競合物質として前記のモノクローナ
ル抗体の反応特異性評価法−２により測定した。その結
果を縦軸に競合物質、横軸に吸光度（Ｏ．Ｄ．）をとっ
たグラフとして図３に示す。その結果、ＭＧとＡｒｇの
反応生成物である、ＭＡ１、５ＨＭＩおよびＡＰを競合
物質として添加したもののみ吸光度が減少した。従って
本抗体はＭＧとＡｒｇの反応生成物、ＭＧ―アミノ酸誘
導体のみを認識することが明らかとなった。
【００５７】
【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によればメチルグリオキサールと蛋白質の反応生成物が
結合したときに生じるメチルグリオキサール修飾アルギ
ニン誘導体を特異的に認識するモノクローナル抗体を提
供することができる。また、上記実施例から明らかなよ
うに、本発明のモノクローナル抗体は、認識部位が分子
構造レベルで限定されているので、臨床診断、分析等に
おいて有用性が有り、糖化蛋白質等の疾患・病態との関
連性の解明のための一助となることが期待される。
によればメチルグリオキサールと蛋白質の反応生成物が
結合したときに生じるメチルグリオキサール修飾アルギ
ニン誘導体を特異的に認識するモノクローナル抗体を提
供することができる。また、上記実施例から明らかなよ
うに、本発明のモノクローナル抗体は、認識部位が分子
構造レベルで限定されているので、臨床診断、分析等に
おいて有用性が有り、糖化蛋白質等の疾患・病態との関
連性の解明のための一助となることが期待される。
【図１】種々の物質をＢＳＡと供にインキュベートした
ＢＳＡ修飾体に対する本発明のモノクローナル抗体の反
応性について、酵素免疫学的測定法により測定した結果
を示すグラフである。
ＢＳＡ修飾体に対する本発明のモノクローナル抗体の反
応性について、酵素免疫学的測定法により測定した結果
を示すグラフである。
【図２】ＭＧ−アミノ酸誘導体に対する本発明のモノク
ローナル抗体の認識構造について、酵素免疫学的測定法
により測定した結果を示すグラフである。
ローナル抗体の認識構造について、酵素免疫学的測定法
により測定した結果を示すグラフである。
【図３】本発明のモノクローナル抗体の認識構造につい
て、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラ
フである。
て、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラ
フである。
Claims (7)
- 【請求項１】 メチルグリオキサール修飾アルギニン誘
導体を特異的に認識することを特徴とするモノクローナ
ル抗体。 - 【請求項２】 Ｎδ−（５−ヒドロキシ−４，６−ジメ
チルピリミジン−２−イル）オルニチン、Ｎδ−（５−
ハイドロ−５−メチル−４−イミダゾロン−２−イル）
オルニチン、及びＭＡ１と反応性を有する請求項１記載
のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 前記モノクローナル抗体は、メチルグリ
オキサールで修飾した蛋白質を抗原とし、該抗原で免疫
された恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ
細胞とを融合させたハイブリッド細胞から得られたもの
である請求項１または２記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 前記抗原は、メチルグリオキサールで修
飾したカギアナカサガイのヘモシアニンである請求項３
記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項５】 請求項１または２記載のモノクローナル
抗体を産生することができるハイブリッド細胞。 - 【請求項６】 （１）メチルグリオキサールで修飾した
蛋白質を調製し、 （２）前記工程で得られた蛋白質を抗原として免疫した
恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞と
を融合させてハイブリッド細胞とし、 （３）該ハイブリッド細胞を培養して培養物中からメチ
ルグリオキサール修飾アルギニン誘導体を特異的に認識
するモノクローナル抗体を取得することを特徴とするモ
ノクローナル抗体の製造方法。 - 【請求項７】 前記抗原は、メチルグリオキサールで修
飾したカギアナカサガイのヘモシアニンである請求項６
記載のモノクローナル抗体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06214798A JP4016304B2 (ja) | 1998-02-26 | 1998-02-26 | モノクローナル抗体、ハイブリッド細胞、およびモノクローナル抗体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06214798A JP4016304B2 (ja) | 1998-02-26 | 1998-02-26 | モノクローナル抗体、ハイブリッド細胞、およびモノクローナル抗体の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11246599A true JPH11246599A (ja) | 1999-09-14 |
| JP4016304B2 JP4016304B2 (ja) | 2007-12-05 |
Family
ID=13191707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06214798A Expired - Lifetime JP4016304B2 (ja) | 1998-02-26 | 1998-02-26 | モノクローナル抗体、ハイブリッド細胞、およびモノクローナル抗体の製造方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4016304B2 (ja) |
Cited By (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010121208A3 (en) * | 2009-04-16 | 2011-04-14 | Forsyth Dental Infirmary For Children | New methods of making an antibody and compositions thereof |
| WO2011081110A1 (ja) * | 2009-12-28 | 2011-07-07 | 学校法人福岡大学 | 糖尿病前症の検査方法 |
| JP2017096837A (ja) * | 2015-11-26 | 2017-06-01 | オリエンタル酵母工業株式会社 | 最終糖化産物（ＡＧＥｓ）が関連する疾患の罹患又はそのリスクを予測する方法 |
| US10584180B2 (en) | 2014-09-19 | 2020-03-10 | Siwa Corporation | Anti-AGE antibodies for treating inflammation and auto-immune disorders |
| CN111638347A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-09-08 | 吉林省格瑞斯特生物技术有限公司 | Mgo和go快速定量联合检测装置及其制备方法 |
| US10858449B1 (en) | 2017-01-06 | 2020-12-08 | Siwa Corporation | Methods and compositions for treating osteoarthritis |
| US10919957B2 (en) | 2017-04-13 | 2021-02-16 | Siwa Corporation | Humanized monoclonal advanced glycation end-product antibody |
| US10925937B1 (en) | 2017-01-06 | 2021-02-23 | Siwa Corporation | Vaccines for use in treating juvenile disorders associated with inflammation |
| US10961321B1 (en) | 2017-01-06 | 2021-03-30 | Siwa Corporation | Methods and compositions for treating pain associated with inflammation |
| US10960234B2 (en) | 2010-11-22 | 2021-03-30 | Siwa Corporation | Selective removal of cells having accumulated agents |
| US10995151B1 (en) | 2017-01-06 | 2021-05-04 | Siwa Corporation | Methods and compositions for treating disease-related cachexia |
| US11213585B2 (en) | 2016-06-23 | 2022-01-04 | Siwa Corporation | Vaccines for use in treating various diseases and disorders |
| US11261241B2 (en) | 2008-05-23 | 2022-03-01 | Siwa Corporation | Methods, compositions and apparatuses for facilitating regeneration |
| US11518801B1 (en) | 2017-12-22 | 2022-12-06 | Siwa Corporation | Methods and compositions for treating diabetes and diabetic complications |
| US11833202B2 (en) | 2016-02-19 | 2023-12-05 | Siwa Corporation | Method and composition for treating cancer, killing metastatic cancer cells and preventing cancer metastasis using antibody to advanced glycation end products (AGE) |
| US11873345B2 (en) | 2014-12-18 | 2024-01-16 | Siwa Corporation | Product and method for treating sarcopenia |
| US11872269B2 (en) | 2014-12-18 | 2024-01-16 | Siwa Corporation | Method and composition for treating sarcopenia |
| US11958900B2 (en) | 2016-04-15 | 2024-04-16 | Siwa Corporation | Anti-age antibodies for treating neurodegenerative disorders |
-
1998
- 1998-02-26 JP JP06214798A patent/JP4016304B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| US8399220B2 (en) | 2009-04-16 | 2013-03-19 | Forsyth Dental Infirmary For Children | Antibacterial compositions |
| US8802105B2 (en) | 2009-04-16 | 2014-08-12 | Forsyth Dental Infirmary For Children | Antibacterial compositions |
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| WO2011081110A1 (ja) * | 2009-12-28 | 2011-07-07 | 学校法人福岡大学 | 糖尿病前症の検査方法 |
| JP2011154018A (ja) * | 2009-12-28 | 2011-08-11 | Fukuoka Univ | 糖尿病前症の検査方法 |
| US10960234B2 (en) | 2010-11-22 | 2021-03-30 | Siwa Corporation | Selective removal of cells having accumulated agents |
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