JPH061271B2 - カテコ−ルアミンの酸性代謝物に対する抗体の製造法およびそれに使用する抗原 - Google Patents
カテコ−ルアミンの酸性代謝物に対する抗体の製造法およびそれに使用する抗原Info
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- JPH061271B2 JPH061271B2 JP61037252A JP3725286A JPH061271B2 JP H061271 B2 JPH061271 B2 JP H061271B2 JP 61037252 A JP61037252 A JP 61037252A JP 3725286 A JP3725286 A JP 3725286A JP H061271 B2 JPH061271 B2 JP H061271B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、カテコールアミンの酸性代謝物に対する抗体
の製造法およびそれに使用する抗原に関するものであ
る。
の製造法およびそれに使用する抗原に関するものであ
る。
カテコールアミン産生腫瘍として、成人では褐色細胞
腫、小児では神経芽細胞腫が知られている。その診断に
はカテコールアミンの酸性代謝物であるホモバニリン酸
(HVA)とバニルマンデル酸(VMA)を測定するこ
とが行われている。これらの物質は最終代謝物であるた
め、カテコールアミンや中間代謝物に比べ、数百〜数千
倍の高濃度で尿中に排泄されている。
腫、小児では神経芽細胞腫が知られている。その診断に
はカテコールアミンの酸性代謝物であるホモバニリン酸
(HVA)とバニルマンデル酸(VMA)を測定するこ
とが行われている。これらの物質は最終代謝物であるた
め、カテコールアミンや中間代謝物に比べ、数百〜数千
倍の高濃度で尿中に排泄されている。
HVAやVMAの分析法としては、比色法、蛍光法、ガ
スクロマトグラフィー・マススペクトロメトリー、高速
液体クロマトグラフィー(HPLC)などが開発されて
いる。これらの分析法のうち、比色法は簡便迅速に分析
が行われる利点を有し、1次スクリーニングとして現在
利用されているが、ジアゾカップリング反応による呈色
の判定を肉眼で行うため、精度が低く、また他のフェノ
ール性化合物にも妨害されるため、特異性に問題が残っ
ている。正確度において優れているHPLCも、多種類
の検体の測定には簡便さに欠ける。
スクロマトグラフィー・マススペクトロメトリー、高速
液体クロマトグラフィー(HPLC)などが開発されて
いる。これらの分析法のうち、比色法は簡便迅速に分析
が行われる利点を有し、1次スクリーニングとして現在
利用されているが、ジアゾカップリング反応による呈色
の判定を肉眼で行うため、精度が低く、また他のフェノ
ール性化合物にも妨害されるため、特異性に問題が残っ
ている。正確度において優れているHPLCも、多種類
の検体の測定には簡便さに欠ける。
一方、カテコールアミンおよびメチル化カテコールアミ
ンの抗原および抗体に関する研究はすでに報告されてい
る(吉岡,Methods in Biogenic Amine Research,p2
95〜309、Elsevier Science Publishers B.V.,1
983、特公昭56−49312号公報)。しかし、カ
テコールアミンの酸性代謝物の抗原および抗体に関する
報告はない。
ンの抗原および抗体に関する研究はすでに報告されてい
る(吉岡,Methods in Biogenic Amine Research,p2
95〜309、Elsevier Science Publishers B.V.,1
983、特公昭56−49312号公報)。しかし、カ
テコールアミンの酸性代謝物の抗原および抗体に関する
報告はない。
本発明は、カテコールアミンの酸性代謝物の免疫学的測
定に使用されうるそれらに対して特異的に抗体を製造す
る方法、およびその抗体の製造に使用する抗原を提供す
ることを目的とするものである。
定に使用されうるそれらに対して特異的に抗体を製造す
る方法、およびその抗体の製造に使用する抗原を提供す
ることを目的とするものである。
すなわち、本発明は、一般式(I) (式中、R1は水素原子またはメチル基、R2は水素原
子または水酸基を示す)で表されるカテコールアミンの
酸性代謝物に対する抗体を、抗原を動物に免疫させて得
る方法において、抗原として一般式(II) (式中、R1及びR2は前記と同意義であり、−NH−
Qは担体タンパク質またはペプチドを意味する)で模式
的に表示され、かつ担体タンパク質またはペプチド1モ
ル当たりカテコールアミンの酸性代謝物が29〜37モ
ル結合したものを使用することを特徴とする抗体の製造
法に関するものである。さらに本発明は、その抗体の製
造に使用される前記一般式(II)で模式的に表され、か
つ担体タンパク質またはペプチド1モル当りカテコール
アミンの酸性代謝物が29〜37モル結合した、カテコ
ールアミンの酸性代謝物に対する抗体の製造に使用する
抗原に関するものである。
子または水酸基を示す)で表されるカテコールアミンの
酸性代謝物に対する抗体を、抗原を動物に免疫させて得
る方法において、抗原として一般式(II) (式中、R1及びR2は前記と同意義であり、−NH−
Qは担体タンパク質またはペプチドを意味する)で模式
的に表示され、かつ担体タンパク質またはペプチド1モ
ル当たりカテコールアミンの酸性代謝物が29〜37モ
ル結合したものを使用することを特徴とする抗体の製造
法に関するものである。さらに本発明は、その抗体の製
造に使用される前記一般式(II)で模式的に表され、か
つ担体タンパク質またはペプチド1モル当りカテコール
アミンの酸性代謝物が29〜37モル結合した、カテコ
ールアミンの酸性代謝物に対する抗体の製造に使用する
抗原に関するものである。
本発明において「カテコールアミン酸性代謝物」は前記
一般式(I)で表わされ、具体的にはたとえばジヒドロ
キシフェニル酢酸(DOPAC;R1=R2=H)、ジ
ヒドロキシマンデル酸(DOMA;R1=H,R2=O
H)、ホモバニリン酸(HVA;R1=CH3,R2=
H)、バニルマンデル酸(VAM;R1=CH3,R2=
OH)などが挙げられる。
一般式(I)で表わされ、具体的にはたとえばジヒドロ
キシフェニル酢酸(DOPAC;R1=R2=H)、ジ
ヒドロキシマンデル酸(DOMA;R1=H,R2=O
H)、ホモバニリン酸(HVA;R1=CH3,R2=
H)、バニルマンデル酸(VAM;R1=CH3,R2=
OH)などが挙げられる。
本発明の抗原は、カテコールアミンの酸性代謝物のカテ
コールまたはメチルカテコール骨格と担体蛋白質または
ペプチドのアミノ基とをマンニッヒ反応により結合させ
たものであり、特異性の高い優れた抗体を産性させるこ
とができる。
コールまたはメチルカテコール骨格と担体蛋白質または
ペプチドのアミノ基とをマンニッヒ反応により結合させ
たものであり、特異性の高い優れた抗体を産性させるこ
とができる。
担体蛋白質またはペプチドとしては、ハプテン抗原作成
に使用しうるものであればよく、たとえば哺乳動物の血
清アルブミン、γ−グロブリンなどの蛋白質、ポリリジ
ンなどのペプチドなどが用いられる。さらに、これらの
担体蛋白質またはペプチドに末単に1級アミノ基を有す
るスペーサー(たとえば、アミノアルキルシラン残基、
アミノ酸残基、ω−アミノアルキルアミノ残基など)を
導入したものを使用することができる。
に使用しうるものであればよく、たとえば哺乳動物の血
清アルブミン、γ−グロブリンなどの蛋白質、ポリリジ
ンなどのペプチドなどが用いられる。さらに、これらの
担体蛋白質またはペプチドに末単に1級アミノ基を有す
るスペーサー(たとえば、アミノアルキルシラン残基、
アミノ酸残基、ω−アミノアルキルアミノ残基など)を
導入したものを使用することができる。
マンニッヒ反応は、たとえばカテコールアミンの酸性代
射物をヒト血清アルブミン(HSA)もしくはウシ血清
アルブミン(BSA)などの担体に対して、数十〜数百
倍モル量用い、水に溶解後、過剰量のホルムアルデヒド
および酢酸塩緩衝液を加えて室温でまたは加温して数日
間反応させることにより行うことができる。
射物をヒト血清アルブミン(HSA)もしくはウシ血清
アルブミン(BSA)などの担体に対して、数十〜数百
倍モル量用い、水に溶解後、過剰量のホルムアルデヒド
および酢酸塩緩衝液を加えて室温でまたは加温して数日
間反応させることにより行うことができる。
反応後、たとえば蒸留水などに対して10℃で数回透析
し、過剰のホルムアルデヒドおよびカテコールアミンの
酸性代謝物を除去し、凍結乾燥することにより抗原を得
ることができる。
し、過剰のホルムアルデヒドおよびカテコールアミンの
酸性代謝物を除去し、凍結乾燥することにより抗原を得
ることができる。
かくして得られる抗原の一例の理化学的性質は次のとお
りである。
りである。
A.セルロースアセテート膜電気泳動 実施例1および2で調製した抗原溶液(約5mg/ml)1
μをセルロースアセテート膜に添加する。4℃、1mA
/cmで15〜20分間0.07Mベロナール緩衝液(pH
8.6)で泳動する。ポンソ3Rで染色後、1%酢酸で
脱色し、乾燥する。
μをセルロースアセテート膜に添加する。4℃、1mA
/cmで15〜20分間0.07Mベロナール緩衝液(pH
8.6)で泳動する。ポンソ3Rで染色後、1%酢酸で
脱色し、乾燥する。
ハプテンを除いて抗原調製法と同様にして調製したHS
A(HCHO−HSA)を対照とする。
A(HCHO−HSA)を対照とする。
ε−ジニトロフェニルリジン(ε−DNP−Lys)を原
点とし、プロモクレゾールグリーン(BCG)の移動度
を+1.00とした。各移動度は次のとおりであった。
点とし、プロモクレゾールグリーン(BCG)の移動度
を+1.00とした。各移動度は次のとおりであった。
上表に明らかなように、酸性代謝物がHSAに結合する
ことにより、HSAは酸性となり、陽極に対照のHSA
より大きく移動している。
ことにより、HSAは酸性となり、陽極に対照のHSA
より大きく移動している。
B.酸性代謝物の結合量 酸性代謝物の担体蛋白質の結合量は、280nm付近の極
大波長における抗原反応液の透析後の吸光度の増加率よ
り、ハプテンの結合モル比を算出する。
大波長における抗原反応液の透析後の吸光度の増加率よ
り、ハプテンの結合モル比を算出する。
ハプテンは0.025mg/ml、抗原およびHCHO−H
SAは0.5mg/mlの濃度で、HCHO−HSAを比較
対照として用いる。
SAは0.5mg/mlの濃度で、HCHO−HSAを比較
対照として用いる。
この結果、実施例1および2で得られたものは15〜4
0モルのハプテンが1モルの担体に結合していた。ハプ
テンの平均結合モル比は、1モルのHSAあたりHVA
37モル、VMA29モルであった。この比と、電気泳
動度は比例していた。
0モルのハプテンが1モルの担体に結合していた。ハプ
テンの平均結合モル比は、1モルのHSAあたりHVA
37モル、VMA29モルであった。この比と、電気泳
動度は比例していた。
本発明抗原を用いたカテコールアミン酸性代謝物に対し
て特異的な抗体を製造する方法は常法によればよい。
て特異的な抗体を製造する方法は常法によればよい。
たとえば、前記のようにして得られた抗原をりん酸緩衝
生理食塩水(PBS:0.01M KH PO4、0.
15M NaCl,pH7.4)に溶解させ、等量のフロ
インドの補助液(Complete Freund′s Adjuvant)と混
合し、W/O型エマルジョンをウシ、ウサギ、ヒツジ、
ラット、マウス、モルモット等の哺乳動物に投与し、2
週〜数ヶ月間の適当な時期に追加免疫を行って抗血清を
得ることができる。
生理食塩水(PBS:0.01M KH PO4、0.
15M NaCl,pH7.4)に溶解させ、等量のフロ
インドの補助液(Complete Freund′s Adjuvant)と混
合し、W/O型エマルジョンをウシ、ウサギ、ヒツジ、
ラット、マウス、モルモット等の哺乳動物に投与し、2
週〜数ヶ月間の適当な時期に追加免疫を行って抗血清を
得ることができる。
また、このようにして免疫を獲得した動物から抗体産生
細胞を取得し、ミエローマ細胞と細胞融合することによ
りハイブリドーマを得、モノクローナル抗体を産生させ
ることもできる。細胞融合法の詳細について総説、成
書、たとえば岩崎辰夫ら著「単クローン抗体−ハイブリ
ドーマとELISA−」、株式会社講談社、昭和58年
2月20日発行などのの記載を参照することができる。
細胞を取得し、ミエローマ細胞と細胞融合することによ
りハイブリドーマを得、モノクローナル抗体を産生させ
ることもできる。細胞融合法の詳細について総説、成
書、たとえば岩崎辰夫ら著「単クローン抗体−ハイブリ
ドーマとELISA−」、株式会社講談社、昭和58年
2月20日発行などのの記載を参照することができる。
得られた抗血清については、必要に応じて担体の抗体を
吸収した後、二重拡散法(O.Ouchterlony,Handbook of
Experimental Immunology,19,13(1973))に
よってそれぞれの抗原に特異性のある抗体であることが
確かめられた。
吸収した後、二重拡散法(O.Ouchterlony,Handbook of
Experimental Immunology,19,13(1973))に
よってそれぞれの抗原に特異性のある抗体であることが
確かめられた。
さらに、抗血清の特異性は、酸素免疫測定法(EIA)
により確認することができた。
により確認することができた。
EIAは、次のような手順で行った。すなわち、一定量
の抗原を塩化ビニル製マイクロプレートに吸着させ、こ
れに抗血清を希釈して加えて抗体を反応させる。この時
の抗血清に、抗原試料の場合はそのまま、ハプテン試料
の場合はHSAとマンニッヒ反応後希釈して試料を加え
る。アルカリ性ホスタファーゼ標識第二抗体を反応させ
る。プレートを洗浄後、基質であるp−ニトロフェニル
ホスフェートを加えて酵素反応させる。反応後、生成す
るp−ニトロフェノールをアルカリ性で400nmの吸光度
を測定する。
の抗原を塩化ビニル製マイクロプレートに吸着させ、こ
れに抗血清を希釈して加えて抗体を反応させる。この時
の抗血清に、抗原試料の場合はそのまま、ハプテン試料
の場合はHSAとマンニッヒ反応後希釈して試料を加え
る。アルカリ性ホスタファーゼ標識第二抗体を反応させ
る。プレートを洗浄後、基質であるp−ニトロフェニル
ホスフェートを加えて酵素反応させる。反応後、生成す
るp−ニトロフェノールをアルカリ性で400nmの吸光度
を測定する。
実施例3で得られたHVAに対する抗血清(Anti-HV
A)は、第1図に示したようにHVA−HSAにVMA
−HSAより低濃度で反応する。また、実施例4で得ら
れたVMAに対する抗血清(Anti-HVA)では、第2
図に示すように、VMA−HSAにHVA−HSAより
低濃度で反応する。しかし、これらの抗血清は、いずれ
もハプテンであるHVAおよびVMAとは高濃度でなけ
れば反応しないので、ハプテン相互の特異性を比較する
ために、マンニッヒ反応でHVAまたはVMAをHSA
と結合させて抗原と同一構造にして試験した。
A)は、第1図に示したようにHVA−HSAにVMA
−HSAより低濃度で反応する。また、実施例4で得ら
れたVMAに対する抗血清(Anti-HVA)では、第2
図に示すように、VMA−HSAにHVA−HSAより
低濃度で反応する。しかし、これらの抗血清は、いずれ
もハプテンであるHVAおよびVMAとは高濃度でなけ
れば反応しないので、ハプテン相互の特異性を比較する
ために、マンニッヒ反応でHVAまたはVMAをHSA
と結合させて抗原と同一構造にして試験した。
実施例3で得られたAnti-HVAは、第3図に示したよ
うに、HVA−HSAと最も低濃度で反応し、VMA−
HSA、DOPAC−HSA、バニルピルビン酸(VP
A)−HSA、メタネフリン−HSAおよびHCHO−
HSAの順に交叉が弱くなった。
うに、HVA−HSAと最も低濃度で反応し、VMA−
HSA、DOPAC−HSA、バニルピルビン酸(VP
A)−HSA、メタネフリン−HSAおよびHCHO−
HSAの順に交叉が弱くなった。
一方、同様に実施例4で得られたAnti-VMAは、第4
図に示したようにVMA−HSAと最も強く反応した。
図に示したようにVMA−HSAと最も強く反応した。
本発明による抗原を免疫に用いることにより、カテコー
ルアミンの酸性代謝物に特異的な抗体を産生させること
ができる。したがって、これらの抗体を用いる免疫学的
測定法によりカテコールアミン産生腫瘍の診断等に有用
なカテコールアミン酸性代謝物の測定を正確かつ間便に
行うことが可能になる。
ルアミンの酸性代謝物に特異的な抗体を産生させること
ができる。したがって、これらの抗体を用いる免疫学的
測定法によりカテコールアミン産生腫瘍の診断等に有用
なカテコールアミン酸性代謝物の測定を正確かつ間便に
行うことが可能になる。
〔実施例〕 実施例 1 HVA抗原の調製 HVA0.3ミリモルおよびHSA100mgを0.3M
炭酸水素ナトリウム1.0mlに溶解させ、これに37%
ホルマリン0.2mlを加え、pH6.0〜7.0になるよう
に3M酢酸ナトリウムで調製した。共栓試験管の空間部
を窒素ガスで置換し、20±3℃で約70時間遮光放置
した。反応後、10℃の蒸留水で数回透析し、凍結乾燥
し、−18℃で保存してHVA抗原(HVA−HSA)
を得た。
炭酸水素ナトリウム1.0mlに溶解させ、これに37%
ホルマリン0.2mlを加え、pH6.0〜7.0になるよう
に3M酢酸ナトリウムで調製した。共栓試験管の空間部
を窒素ガスで置換し、20±3℃で約70時間遮光放置
した。反応後、10℃の蒸留水で数回透析し、凍結乾燥
し、−18℃で保存してHVA抗原(HVA−HSA)
を得た。
実施例 2 VMA抗原の調製 HVAの代りにVMAを用いて実施例1と同様に操作し
てVMA抗原(VMA−HSA)を得た。
てVMA抗原(VMA−HSA)を得た。
実施例 3 HVAに対する抗体の調製 HVA−HSAO.17〜75μgを完全にアジュバン
ドに溶解させた。これを、マウス(BALB/c×DB
A,F1,雄,5週令)に1週間予備飼育した後、腹腔
内投与し、以後2週間から数ヶ月の間隔で0.17〜4
0μgのHVA−HSAを不完全アジュバンドに溶解さ
せ、数回投与した。採血により、HVA−HSAの抗血
清(Anti−HVA)を得、凍結乾燥して−18℃で保
存した。
ドに溶解させた。これを、マウス(BALB/c×DB
A,F1,雄,5週令)に1週間予備飼育した後、腹腔
内投与し、以後2週間から数ヶ月の間隔で0.17〜4
0μgのHVA−HSAを不完全アジュバンドに溶解さ
せ、数回投与した。採血により、HVA−HSAの抗血
清(Anti−HVA)を得、凍結乾燥して−18℃で保
存した。
実施例 4 VAMに対する抗体の調製 HVA−HSAの代りにVMA−HSAを使用して実施
例3と同様に操作してVMA−HSAの抗血清(Anti
−VMA)を得た。
例3と同様に操作してVMA−HSAの抗血清(Anti
−VMA)を得た。
参考例 酸素免疫測定法 抗原は、PBSpH7.3で200μg/mlより倍々
希釈する。塩化ビニル製のマイクロプレートに5μl/
well塗布し、直ちに25℃で1時間吸着させる。
希釈する。塩化ビニル製のマイクロプレートに5μl/
well塗布し、直ちに25℃で1時間吸着させる。
溶液を除去し、0.05%ツイーン(Tween)20
のPBS溶液(tPBS)100μ/wellを分注し、
ブロッキングする。これを3回くり返す。
のPBS溶液(tPBS)100μ/wellを分注し、
ブロッキングする。これを3回くり返す。
第一抗体である抗血清はtPBSで希釈する。抗原
の場合はそのまま、ハプテンの場合はHSAとマンニッ
ヒ反応後、それぞれの抗血清で倍倍希釈して用いる。こ
れを37℃で10分間反応させた後、マイクロプレート
に各濃度5μ/well分注し、37℃で1時間反応させ
る。ハプテンに対するマンニッヒ反応は抗原の調製法を
応用する。すなわち、HVAまたはVMA100μgをP
BS100μに溶解させ、さらにHSA1mgを加えて
溶解させ、次いで35%ホルマリン21μを加え、3
7℃の1時間反応させる。
の場合はそのまま、ハプテンの場合はHSAとマンニッ
ヒ反応後、それぞれの抗血清で倍倍希釈して用いる。こ
れを37℃で10分間反応させた後、マイクロプレート
に各濃度5μ/well分注し、37℃で1時間反応させ
る。ハプテンに対するマンニッヒ反応は抗原の調製法を
応用する。すなわち、HVAまたはVMA100μgをP
BS100μに溶解させ、さらにHSA1mgを加えて
溶解させ、次いで35%ホルマリン21μを加え、3
7℃の1時間反応させる。
tPBSで2回洗浄後、第二抗体であるアルカリ性
ホスファターゼ標識抗マウス1gGを25μ/well分
注し、37℃で1時間反応させる。
ホスファターゼ標識抗マウス1gGを25μ/well分
注し、37℃で1時間反応させる。
tPBSで3回洗浄した後、酵素基質として16mM
p−ニトロフェニルホスフェイトとなるよう1mM塩化マ
グネシウム含有100mM炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH
9.8)で希釈する。25μ/well分注し、37℃で
1時間酵素反応させる。反応停止には0.1N水酸化ナ
トリウム25μ/wellを分注する。
p−ニトロフェニルホスフェイトとなるよう1mM塩化マ
グネシウム含有100mM炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH
9.8)で希釈する。25μ/well分注し、37℃で
1時間酵素反応させる。反応停止には0.1N水酸化ナ
トリウム25μ/wellを分注する。
反応液40μを、さらに0.1N水酸化ナトリウ
ム500μで希釈後、波長400nmにて吸光度を測定
する。
ム500μで希釈後、波長400nmにて吸光度を測定
する。
実施例 5 I.ハイブリドーマの取得 VMA−HSA(1mg/μ)を生理食塩水に溶解さ
せ、完全フロインドアジュバンドと1:1で混合してエ
マルジョンとしたものを、BALB/cマウス(雌、6
週冷)に2週間おきに数回腹腔内投与し、最後にVMA
−HSA50μgを静注した。
せ、完全フロインドアジュバンドと1:1で混合してエ
マルジョンとしたものを、BALB/cマウス(雌、6
週冷)に2週間おきに数回腹腔内投与し、最後にVMA
−HSA50μgを静注した。
最終免疫から3日後にマウスの脾細胞を取り出し、イー
グル最少基本倍地(MEM)で洗浄した。マウスミエロ
ーマMOPC−21ライン由来のP3/X63−Ag8
U1(P3U1)(Current Topics in Micro biology
and Immunology,81,p1−7(1978))をME
Mで洗浄し、脾細胞とP3U1を10:1で混合して遠
心後、ペレットに50%ポリエチレングリコール100
0イーグル最少基本培地(MEM)溶液1mlを徐々に加
えて細胞融合を行わせた。さらにMEM溶液を徐々に加
え、最終的に10mlとした。再び遠心し、ペレットを1
5%ウシ胎児血清含有RPMI1640倍地にP3U1
として1×105cell/0.1mlとなるように懸濁させ、
96穴マイクロプレートに0.1mlずつまいた。
グル最少基本倍地(MEM)で洗浄した。マウスミエロ
ーマMOPC−21ライン由来のP3/X63−Ag8
U1(P3U1)(Current Topics in Micro biology
and Immunology,81,p1−7(1978))をME
Mで洗浄し、脾細胞とP3U1を10:1で混合して遠
心後、ペレットに50%ポリエチレングリコール100
0イーグル最少基本培地(MEM)溶液1mlを徐々に加
えて細胞融合を行わせた。さらにMEM溶液を徐々に加
え、最終的に10mlとした。再び遠心し、ペレットを1
5%ウシ胎児血清含有RPMI1640倍地にP3U1
として1×105cell/0.1mlとなるように懸濁させ、
96穴マイクロプレートに0.1mlずつまいた。
1日後、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン
(HAT)培地を0.1mlずつ添加し、その後3〜4日
ごとに培地の半分量を新しいHAT培地で交換した。7
日間当たりから、いくつかのウェルでハイブリドーマの
生育が認められた。
(HAT)培地を0.1mlずつ添加し、その後3〜4日
ごとに培地の半分量を新しいHAT培地で交換した。7
日間当たりから、いくつかのウェルでハイブリドーマの
生育が認められた。
ハイブリドーマが生育してきたウェルの上清0.05ml
を取り、それぞれ予めVMA−HSAおよびHSAでコ
ートした96穴マイクロプレートに添加した。アジビン
D−酵素結合体としてアジビンD−ペルオキシダーゼ
(ベクター社製)、基質および発色剤として過酸化水
素、4−アミノアンチピリン、フェノールを用いてEL
ISA法により、VMA−HSAとは反応するが、HS
Aとは反応しないものを選び、限界希釈法によりクロー
ニングを行った。
を取り、それぞれ予めVMA−HSAおよびHSAでコ
ートした96穴マイクロプレートに添加した。アジビン
D−酵素結合体としてアジビンD−ペルオキシダーゼ
(ベクター社製)、基質および発色剤として過酸化水
素、4−アミノアンチピリン、フェノールを用いてEL
ISA法により、VMA−HSAとは反応するが、HS
Aとは反応しないものを選び、限界希釈法によりクロー
ニングを行った。
その結果、VMA−HSAに特異性を有する抗体を産生
するハイブリドーマ8株を取得した。
するハイブリドーマ8株を取得した。
II.単一クローン抗体の生産 ハイブリドーマVM1、VM2、VM3、VM4、VM
5、VM6、VM7、VM8株をそれぞれ15%ウシ胎
児血清含有RPMI1640培地で96穴マイクロプレー
ト、25cm2フラスコ、75cm2フラスコとスケールアッ
プしながら培養し、培養上清を集めた。
5、VM6、VM7、VM8株をそれぞれ15%ウシ胎
児血清含有RPMI1640培地で96穴マイクロプレー
ト、25cm2フラスコ、75cm2フラスコとスケールアッ
プしながら培養し、培養上清を集めた。
III.抗体のサブクラスの決定 96穴マイクロプレートに各単一クローン抗体をコート
し、1%BSA含有PBSでブロッキングした後、MO
NOABID EIA KIT(ZYMED社製)によ
り抗IgA抗体、抗IgG1抗体、抗IgG2a抗体、
抗1gG2b抗体、抗IgG3抗体、抗IgM抗体との
反応を見て、各単一クローン抗体のサグクラスを決定し
た。
し、1%BSA含有PBSでブロッキングした後、MO
NOABID EIA KIT(ZYMED社製)によ
り抗IgA抗体、抗IgG1抗体、抗IgG2a抗体、
抗1gG2b抗体、抗IgG3抗体、抗IgM抗体との
反応を見て、各単一クローン抗体のサグクラスを決定し
た。
またL鎖の抗χ抗体、抗λ抗体との反応性を調べてタイ
プを決定した。
プを決定した。
その結果、VM1、VM3、VM4、VM6の4株の産
生するモノクローナル抗体がIgG1,χ、VM2株の
産生するモノクローナル抗体がIgG,λ、VM8株の
産生するモノクローナル抗体がIgG2a,χ、VM7
株の産生するモノクローナル抗体がIgG2b,χであ
った。
生するモノクローナル抗体がIgG1,χ、VM2株の
産生するモノクローナル抗体がIgG,λ、VM8株の
産生するモノクローナル抗体がIgG2a,χ、VM7
株の産生するモノクローナル抗体がIgG2b,χであ
った。
実施例 6 HVA抗原の調製 HVA3ミリモルおよび1,6−ヘキサンジアミン3ミ
リモルに蒸留水160μと、37%ホルマリン310
μを加え、80℃で1時間反応させ、HVAと1,6
−ヘキサンジアミンの結合物を得た。
リモルに蒸留水160μと、37%ホルマリン310
μを加え、80℃で1時間反応させ、HVAと1,6
−ヘキサンジアミンの結合物を得た。
この結合物10mg、HSA10mgおよびDCC20mgを
50mMクエン酸緩衝液に溶解させた後、pHを6〜7に調
整し、総液量を1ml程度とした。4℃で約12時間遮光
放置して反応させ、PBSで数回透析し、HVAを1,
6−ヘキサンジアミン基(hd)を介してHSAと結合
させたHVA抗原(HVA−hd−HSA)を得た。
50mMクエン酸緩衝液に溶解させた後、pHを6〜7に調
整し、総液量を1ml程度とした。4℃で約12時間遮光
放置して反応させ、PBSで数回透析し、HVAを1,
6−ヘキサンジアミン基(hd)を介してHSAと結合
させたHVA抗原(HVA−hd−HSA)を得た。
実施例 7 VMA抗原の調製 HVAの代りにVMAを用いて実施例6と同様に操作し
てVMAを1,6−ヘキサンジアミノ基を介してHSA
と結合させたVMA抗原(VMA−hd−HSA)を得
た。
てVMAを1,6−ヘキサンジアミノ基を介してHSA
と結合させたVMA抗原(VMA−hd−HSA)を得
た。
実施例 8 HVA−hd−HSAを用いて実施例5と同様に操作し
てHVA−hd−HSAに特異性を有する抗体を産生す
るハイブリドーマ5株、HV41、HV42、HV43、HV
44、HV45株を取得した。
てHVA−hd−HSAに特異性を有する抗体を産生す
るハイブリドーマ5株、HV41、HV42、HV43、HV
44、HV45株を取得した。
これらのハイブリドーマから実施例5と同様にしてHV
Aに対するモノクローナル抗体を調製し、それぞれのサ
ブクラスを決定した。その結果、HV41、HV42、HV
43、HV45株の産生するモノクローナル抗体がIg
G1,κ、HV44株の産生するモノクローナル抗体がI
gG2a、χであった。
Aに対するモノクローナル抗体を調製し、それぞれのサ
ブクラスを決定した。その結果、HV41、HV42、HV
43、HV45株の産生するモノクローナル抗体がIg
G1,κ、HV44株の産生するモノクローナル抗体がI
gG2a、χであった。
また、これらの抗体の力価ならびに特異性がELIS、
法によって調べたところ、全てがHVAに対して高い特
異性を示すことがわかった。
法によって調べたところ、全てがHVAに対して高い特
異性を示すことがわかった。
第1図は、本発明実施例で得られたホモバニリン酸に対
する抗血清(anti-HVA)とホモバニリン酸抗原(H
VA−HSA)およびバニルマンデル酸抗原(VMA−
HSA)との反応を示し、第2図は、同じくバニルマン
デル酸に対する抗血清(anti-VMA)とHVA−HS
AおよびVMA−HSAとの反応を示す。第3図は、an
ti-HVAとハプテンおよび類縁体との反応を示し、第
4図はanti-VAとハプテンおよび類縁体との反応を示
す。なお、図中VPAはバニルピルビン酸、DOPAC
はヒドロキシフェニル酢酸を示す。
する抗血清(anti-HVA)とホモバニリン酸抗原(H
VA−HSA)およびバニルマンデル酸抗原(VMA−
HSA)との反応を示し、第2図は、同じくバニルマン
デル酸に対する抗血清(anti-VMA)とHVA−HS
AおよびVMA−HSAとの反応を示す。第3図は、an
ti-HVAとハプテンおよび類縁体との反応を示し、第
4図はanti-VAとハプテンおよび類縁体との反応を示
す。なお、図中VPAはバニルピルビン酸、DOPAC
はヒドロキシフェニル酢酸を示す。
Claims (2)
- 【請求項1】一般式(I) (式中、R1は水素原子またはメチル基、R2は水素原
子または水酸基を示す)で表されるカテコールアミンの
酸性代謝物に対する抗体を、抗原を動物に免疫させて得
る方法において、抗原として一般式(II) (式中、R1及びR2は前記と同意義であり、−NH−
Qは担体タンパク質またはペプチドを意味する)で模式
的に表され、かつ担体タンパク質またはペプチド1モル
当りカテコールアミンの酸性代謝物が29〜37モル結
合したものを使用することを特徴とする抗体の製造法。 - 【請求項2】一般式(II) (式中、R1は水素原子またはメチル基、R2は水素原
子または水酸基、−NH−Qは担体タンパク質またはペ
プチドを意味する)で模式的に表され、かつ担体タンパ
ク質またはペプチド1モル当りカテコールアミンの酸性
代謝物が29〜37モル結合した、カテコールアミンの
酸性代謝物に対する抗体の調製に使用する抗原。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60-36276 | 1985-02-27 | ||
JP3627685 | 1985-02-27 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6211165A JPS6211165A (ja) | 1987-01-20 |
JPH061271B2 true JPH061271B2 (ja) | 1994-01-05 |
Family
ID=12465251
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61037252A Expired - Lifetime JPH061271B2 (ja) | 1985-02-27 | 1986-02-24 | カテコ−ルアミンの酸性代謝物に対する抗体の製造法およびそれに使用する抗原 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH061271B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0352817A3 (en) * | 1988-07-29 | 1990-04-25 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Monoclonal antibody to catecholamine metabolite and quantitative assay for catecholamine metabolite |
US5298397A (en) * | 1989-10-19 | 1994-03-29 | Yamasa Shoyu Kabushiki Kaisha | Method of assaying d-vanillylmandelic acid |
US6274857B1 (en) * | 2000-02-10 | 2001-08-14 | Inductoheat, Inc. | Induction heat treatment of complex-shaped workpieces |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5055381A (ja) * | 1973-09-12 | 1975-05-15 | ||
JPS51101120A (en) * | 1975-02-28 | 1976-09-07 | Dai Ichi Kogyo Seiyaku Co Ltd | Kogen oyobi kotainoseiho |
JPS5283931A (en) * | 1976-01-01 | 1977-07-13 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | Antigen of catechol amine derivatives |
US4108973A (en) * | 1976-08-25 | 1978-08-22 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immunoassay for catecholamines |
-
1986
- 1986-02-24 JP JP61037252A patent/JPH061271B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6211165A (ja) | 1987-01-20 |
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