JP2002205999A - Ｇｍ２特異的抗体の製造方法 - Google Patents
Ｇｍ２特異的抗体の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、“ＧＭ２”として知られてい
るモノシアロガングリオシド（monosialoganglioside
s）に特異的な抗体の製造方法と、これらの抗体の用途
を提供することを目的とする。 【解決手段】 実験用動物を、下記の構造を有する抗原
で免疫する工程、ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌ（ＩＩ3
ＮｅｕＡｃ）Ｈｅｘ、但し、前記抗原はＧＭ２ではない
ものである、を有することを特徴とする、ＧＭ２に結合
する抗体を製造する方法。
るモノシアロガングリオシド（monosialoganglioside
s）に特異的な抗体の製造方法と、これらの抗体の用途
を提供することを目的とする。 【解決手段】 実験用動物を、下記の構造を有する抗原
で免疫する工程、ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌ（ＩＩ3
ＮｅｕＡｃ）Ｈｅｘ、但し、前記抗原はＧＭ２ではない
ものである、を有することを特徴とする、ＧＭ２に結合
する抗体を製造する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、糖脂質に対する抗
体の製造、およびこれら抗体の利用方法に関する。詳し
くは、本発明は、”ＧＭ２”として知られているモノシ
アロガングリオシド（monosialogangliosides）に特異
的な抗体の製造方法と、これらの抗体の利用方法とに関
する。その用途には、診断およびスクリーニングへの適
用、更に、治療方法が含まれる。
体の製造、およびこれら抗体の利用方法に関する。詳し
くは、本発明は、”ＧＭ２”として知られているモノシ
アロガングリオシド（monosialogangliosides）に特異
的な抗体の製造方法と、これらの抗体の利用方法とに関
する。その用途には、診断およびスクリーニングへの適
用、更に、治療方法が含まれる。
【０００２】
【従来の技術】ガングリオシドは、糖脂質の１クラスの
分子である。様々なガングリオシドが、メラノーマ、お
よび、他の神経外胚葉起源の腫瘍を含む種々のトランス
フォーム細胞の顕著な細胞表面構成物質として同定され
ている。たとえば、参考文献として、本出願にその内容
全体が合体される、リッター（Ｒｉｔｔｅｒ）及びリヴ
ィングストン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ）他，Ｓｅｍ．Ｃ
ａｎｃ．Ｂｉｏｌ．２：４０１−４０９（１９９１），
Ｏｅｔｔｇｅｎ，ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓ Ｇｅｓｅｌ
ｌｓｈａｆｔ（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ １
９８９）参照。ガングリオシドは、シアル酸残基による
グリコシル化の程度によって、モノー、ジー、トリ、又
はポリシアロガングリオシドとして知られている。これ
らの分子を識別するために使用される略語として、”Ｇ
Ｍ１”，”ＧＤ３”，”ＧＴ１”等があり、ここで、”
Ｇ”は、ガングリオシドであることを表わし、”
Ｍ”，”Ｄ”又は”Ｔ”等は、シアル酸残基の数を示
し、数字又は数字＋文字は（たとえば、”ＧＴ１ａ”）
は、その分子について観察される結合パターンを指す。
レーニンガー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ），Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，ｐｇ．２９４−２９６（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８１）；ヴィーガント（Ｗｉｅ
ｇａｎｄｔ），ｉｎ Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ： Ｎｅ
ｗ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ （ノイベルガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）他，ｅ
ｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５），ｐｐ．１９９−
２６０参照。
分子である。様々なガングリオシドが、メラノーマ、お
よび、他の神経外胚葉起源の腫瘍を含む種々のトランス
フォーム細胞の顕著な細胞表面構成物質として同定され
ている。たとえば、参考文献として、本出願にその内容
全体が合体される、リッター（Ｒｉｔｔｅｒ）及びリヴ
ィングストン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ）他，Ｓｅｍ．Ｃ
ａｎｃ．Ｂｉｏｌ．２：４０１−４０９（１９９１），
Ｏｅｔｔｇｅｎ，ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓ Ｇｅｓｅｌ
ｌｓｈａｆｔ（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ １
９８９）参照。ガングリオシドは、シアル酸残基による
グリコシル化の程度によって、モノー、ジー、トリ、又
はポリシアロガングリオシドとして知られている。これ
らの分子を識別するために使用される略語として、”Ｇ
Ｍ１”，”ＧＤ３”，”ＧＴ１”等があり、ここで、”
Ｇ”は、ガングリオシドであることを表わし、”
Ｍ”，”Ｄ”又は”Ｔ”等は、シアル酸残基の数を示
し、数字又は数字＋文字は（たとえば、”ＧＴ１ａ”）
は、その分子について観察される結合パターンを指す。
レーニンガー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ），Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，ｐｇ．２９４−２９６（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８１）；ヴィーガント（Ｗｉｅ
ｇａｎｄｔ），ｉｎ Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ： Ｎｅ
ｗ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ （ノイベルガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）他，ｅ
ｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５），ｐｐ．１９９−
２６０参照。
【０００３】モノシアロガングリオシドＧＭ２は下記の
構造を有する。
構造を有する。
【化２】
【０００４】これに対して、ＧＭ１は下記の構造を有す
る。
る。
【化３】
【０００５】前述したように、ガングリオシドは、メラ
ノーマ等のトランスフォーム細胞における有力な細胞表
面マーカーである。このことによって、ガングリオシド
は、ガン研究に於いて魅力的な課題となってきた。前述
の参考文献として本出願にその内容が合体されるリヴィ
ングストン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２９１１−２
９１５（１９８７）は、ワクチンに基づく試験の結果を
記載しており、ここで、メラノーマを患う患者に、ワク
チンとして、高レベルのＧＭ２を提示する細胞そのも
の、純粋なＧＭ２、又は純粋なＧＭ２にバクテリア・ア
ジュバントを加えたもののいずれかが投与された。又、
その両方を参考文献として本出願にその内容を合体させ
る、リヴィングストン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ）他，
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２（５）：１０３６−１
０４４（１９９４）およびアイリー（Ｉｒｉｅ）他の米
国特許第４，５５７，９３１号も注目され、これらは、
ＧＭ２のワクチンとしての利用に関する。
ノーマ等のトランスフォーム細胞における有力な細胞表
面マーカーである。このことによって、ガングリオシド
は、ガン研究に於いて魅力的な課題となってきた。前述
の参考文献として本出願にその内容が合体されるリヴィ
ングストン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２９１１−２
９１５（１９８７）は、ワクチンに基づく試験の結果を
記載しており、ここで、メラノーマを患う患者に、ワク
チンとして、高レベルのＧＭ２を提示する細胞そのも
の、純粋なＧＭ２、又は純粋なＧＭ２にバクテリア・ア
ジュバントを加えたもののいずれかが投与された。又、
その両方を参考文献として本出願にその内容を合体させ
る、リヴィングストン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ）他，
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２（５）：１０３６−１
０４４（１９９４）およびアイリー（Ｉｒｉｅ）他の米
国特許第４，５５７，９３１号も注目され、これらは、
ＧＭ２のワクチンとしての利用に関する。
【０００６】又、ガングリオシドに結合するモノクロー
ナル抗体等の抗体の製造方法と利用方法も注目されてき
た。このような抗体は、抗原特異性を含む、すべての抗
体に共通の特定を有し、診断用としても又、治療用とし
ても注目されている。たとえば、クイェルドセン（Ｋｊ
ｅｌｄｓｅｎ）他の米国特許第５，２２９，２８９号、
ヌーデルマン（Ｎｕｄｅｌｍａｎｎ）他の米国特許第
５，２４０，８３３号、ハコモリ（Ｈａｋｏｍｏｒｉ）
他の米国特許第５，３０８，６１４号、およびハコモリ
（Ｈａｋｏｍｏｒｉ）他の米国特許第５，３８９，５３
０を参照。これらの特許は、すべて、参考文献として本
出願にその内容が合体され、全部が、概してガングリオ
シド特異的抗体の製造方法に関連している。
ナル抗体等の抗体の製造方法と利用方法も注目されてき
た。このような抗体は、抗原特異性を含む、すべての抗
体に共通の特定を有し、診断用としても又、治療用とし
ても注目されている。たとえば、クイェルドセン（Ｋｊ
ｅｌｄｓｅｎ）他の米国特許第５，２２９，２８９号、
ヌーデルマン（Ｎｕｄｅｌｍａｎｎ）他の米国特許第
５，２４０，８３３号、ハコモリ（Ｈａｋｏｍｏｒｉ）
他の米国特許第５，３０８，６１４号、およびハコモリ
（Ｈａｋｏｍｏｒｉ）他の米国特許第５，３８９，５３
０を参照。これらの特許は、すべて、参考文献として本
出願にその内容が合体され、全部が、概してガングリオ
シド特異的抗体の製造方法に関連している。
【０００７】ガングリオシドの免疫学に固有の困難性が
あり、これらについてここで簡単に触れておく。第１
に、これらの分子は、トランスフォーム細胞上で優勢で
あるが、これらは、又、神経細胞等のある種の正常細胞
においても普通に存在する。患者にガングリオシドを投
与するに当たって、その結果起こる抗体産生応答によっ
て正常細胞が損傷を受けるというリスクがある。事実、
ギャン−バレー症候群等のある種の自己免疫疾患は、Ｇ
Ｍ１又はＧＱ１ｂと反応する自己免疫抗体によって特徴
付けられる。たとえば、ユーキ（Ｙｕｋｉ）他，Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１７７１−１７７５（１９９
３）；アスピナル（Ａｓｐｉｎａｌｌ）他，Ｉｎｆｅｃ
ｔ＆Ｉｍｍｕｎ．６２（５）：２１２２−２１２５（１
９９４）を参照。
あり、これらについてここで簡単に触れておく。第１
に、これらの分子は、トランスフォーム細胞上で優勢で
あるが、これらは、又、神経細胞等のある種の正常細胞
においても普通に存在する。患者にガングリオシドを投
与するに当たって、その結果起こる抗体産生応答によっ
て正常細胞が損傷を受けるというリスクがある。事実、
ギャン−バレー症候群等のある種の自己免疫疾患は、Ｇ
Ｍ１又はＧＱ１ｂと反応する自己免疫抗体によって特徴
付けられる。たとえば、ユーキ（Ｙｕｋｉ）他，Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１７７１−１７７５（１９９
３）；アスピナル（Ａｓｐｉｎａｌｌ）他，Ｉｎｆｅｃ
ｔ＆Ｉｍｍｕｎ．６２（５）：２１２２−２１２５（１
９９４）を参照。
【０００８】更に、ガングリオシドを、免疫処置プロト
コール用に十分な量、確保することは極めて困難である
という実用上の問題もある。現在において、実用的な合
成方法は存在しない。従って、ガングリオシドは、ウシ
脳組織等の組織からの精製によって確保されている。し
かし、最適条件下に於いても、純粋なガングリオシドの
収率は、極めてわずかである。更に、哺乳類組織からの
精製には、ウィルス、プリオン粒子、等のコンタミナン
トが伝搬されるリスクがある。従って、ガングリオシド
特異的抗体を確保するための別の方法が強く望まれてい
る。
コール用に十分な量、確保することは極めて困難である
という実用上の問題もある。現在において、実用的な合
成方法は存在しない。従って、ガングリオシドは、ウシ
脳組織等の組織からの精製によって確保されている。し
かし、最適条件下に於いても、純粋なガングリオシドの
収率は、極めてわずかである。更に、哺乳類組織からの
精製には、ウィルス、プリオン粒子、等のコンタミナン
トが伝搬されるリスクがある。従って、ガングリオシド
特異的抗体を確保するための別の方法が強く望まれてい
る。
【０００９】リポ多糖、即ち”ＬＰＳ”分子は、グラム
陰性細菌の表面上に見られる。これらの分子の多くは、
極めて毒性が高く、トキシックショック症候群、エンド
トキシン中毒症、その他の状態を引き起こす。種々の細
菌のＬＰＳ分子には非常に多様性がある。事実、或特定
のタイプの細菌の範囲内においてさえ、ＬＰＳ分子は、
種々の血清型（serotype/serovar）間で異なる可能性が
ある。
陰性細菌の表面上に見られる。これらの分子の多くは、
極めて毒性が高く、トキシックショック症候群、エンド
トキシン中毒症、その他の状態を引き起こす。種々の細
菌のＬＰＳ分子には非常に多様性がある。事実、或特定
のタイプの細菌の範囲内においてさえ、ＬＰＳ分子は、
種々の血清型（serotype/serovar）間で異なる可能性が
ある。
【００１０】カンピロバクター-ジェジュニ（Campyloba
cter jejuni）（”Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ”）のＬＰＳ分子
は、ある程度詳しく研究されている。これらＬＰＳ分子
に関する研究の代表的なものとして以下のものがある
が、これらは徹底的な研究ではない。アスピナル（Ａｓ
ｐｉｎａｌｌ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１
３：１０１７−１０２７（１９９３）；アスピナル（Ａ
ｓｐｉｎａｌｌ）他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：２４１−
２４９（１９９４）；ユーキ（Ｙｕｋｉ）他，Ｉｎｆｅ
ｃｔ ＆ Ｉｍｍｕｎ．６２（５）：２１０１−２１０
３（１９９４）；アスピナル（Ａｓｐｉｎａｌｌ）他，
Ｉｎｆｅｃｔ．＆ Ｉｍｍｕｎ．６２（５）：２１２２
−２１２５（１９９４）。これらの文献のすべてを参考
文献として本出願にその内容を合体させる。前記アスピ
ナル（Ａｓｐｉｎａｌｌ）１９９３の論文は、Ｃ．ｊｅ
ｊｕｎｉ血清型０：１，０：４，０：２３および０：３
６のＬＰＳの構造を提供しているために、特に注目され
る。アスピナル（Ａｓｐｉｎａｌｌ）他は、ＯＳ：１
と、ＯＳ：２３とＯＳ：３６とは互いに識別不能であ
り、ＧＭ２のものと同じ鎖末端を有するのに対して、Ｏ
Ｓ：４鎖末端は、ＧＤ１ａと同じである、と述べてい
る。これらの論文の内のいくつかは、０：１９ＬＰＳ分
子の部分とＧＭ１との間のある種の類似性について論じ
ており、この考えは、参考文献として本出願にその内容
を合体させる、ヴィルグイン（Ｗｉｒｇｕｉｎ）他，Ａ
ｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３５（６）：６９８−７０３（１
９９４）と、更に、アスピナル（Ａｓｐｉｎａｌｌ）
他，Ｉｎｆｅｃｔ．＆ Ｉｍｍｕｎ．５２（５）：２１
２２−２１２５（１９９４）；ユーキ（Ｙｕｋｉ）他，
Ｉｎｆｅｃｔ．＆ Ｉｍｍｕｎ．６２（５）：２１０２
−２１０３（１９９４）；ユーキ（Ｙｕｋｉ）他，Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１７７１−１７７５（１９９
３）にも論じられている。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ細菌は、そ
れ自身、胃腸障害に関係しており、サンプル中のＣ．ｊ
ｅｊｕｎｉの存在を判定する診断検査法の開発も注目さ
れ、その開発活動も行われている。この点に関して、ラ
イト（Ｗｒｉｇｈｔ）他のＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１８
０８、ブレイザー（Ｂｌａｓｅｒ）他の米国特許第５，
２００，３４４号、ヤマザキ（Ｙａｍａｚａｋｉ）他の
米国特許第５，１６９，７５７号、そして日本特許出願
第６３−２７３４９７号を参照。これらの文献のすべて
に於いて、前記抗体を生産する方法は、細胞そのものを
使用したものであることが銘記される。ブレイザー（Ｂ
ｌａｓｅｒ）他は、Ｃ．ｊｅｎｕｎｉに対して固有の抗
原に言及しているが、それはタンパク質であって、糖脂
質ではない。
cter jejuni）（”Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ”）のＬＰＳ分子
は、ある程度詳しく研究されている。これらＬＰＳ分子
に関する研究の代表的なものとして以下のものがある
が、これらは徹底的な研究ではない。アスピナル（Ａｓ
ｐｉｎａｌｌ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１
３：１０１７−１０２７（１９９３）；アスピナル（Ａ
ｓｐｉｎａｌｌ）他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：２４１−
２４９（１９９４）；ユーキ（Ｙｕｋｉ）他，Ｉｎｆｅ
ｃｔ ＆ Ｉｍｍｕｎ．６２（５）：２１０１−２１０
３（１９９４）；アスピナル（Ａｓｐｉｎａｌｌ）他，
Ｉｎｆｅｃｔ．＆ Ｉｍｍｕｎ．６２（５）：２１２２
−２１２５（１９９４）。これらの文献のすべてを参考
文献として本出願にその内容を合体させる。前記アスピ
ナル（Ａｓｐｉｎａｌｌ）１９９３の論文は、Ｃ．ｊｅ
ｊｕｎｉ血清型０：１，０：４，０：２３および０：３
６のＬＰＳの構造を提供しているために、特に注目され
る。アスピナル（Ａｓｐｉｎａｌｌ）他は、ＯＳ：１
と、ＯＳ：２３とＯＳ：３６とは互いに識別不能であ
り、ＧＭ２のものと同じ鎖末端を有するのに対して、Ｏ
Ｓ：４鎖末端は、ＧＤ１ａと同じである、と述べてい
る。これらの論文の内のいくつかは、０：１９ＬＰＳ分
子の部分とＧＭ１との間のある種の類似性について論じ
ており、この考えは、参考文献として本出願にその内容
を合体させる、ヴィルグイン（Ｗｉｒｇｕｉｎ）他，Ａ
ｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３５（６）：６９８−７０３（１
９９４）と、更に、アスピナル（Ａｓｐｉｎａｌｌ）
他，Ｉｎｆｅｃｔ．＆ Ｉｍｍｕｎ．５２（５）：２１
２２−２１２５（１９９４）；ユーキ（Ｙｕｋｉ）他，
Ｉｎｆｅｃｔ．＆ Ｉｍｍｕｎ．６２（５）：２１０２
−２１０３（１９９４）；ユーキ（Ｙｕｋｉ）他，Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１７７１−１７７５（１９９
３）にも論じられている。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ細菌は、そ
れ自身、胃腸障害に関係しており、サンプル中のＣ．ｊ
ｅｊｕｎｉの存在を判定する診断検査法の開発も注目さ
れ、その開発活動も行われている。この点に関して、ラ
イト（Ｗｒｉｇｈｔ）他のＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１８
０８、ブレイザー（Ｂｌａｓｅｒ）他の米国特許第５，
２００，３４４号、ヤマザキ（Ｙａｍａｚａｋｉ）他の
米国特許第５，１６９，７５７号、そして日本特許出願
第６３−２７３４９７号を参照。これらの文献のすべて
に於いて、前記抗体を生産する方法は、細胞そのものを
使用したものであることが銘記される。ブレイザー（Ｂ
ｌａｓｅｒ）他は、Ｃ．ｊｅｎｕｎｉに対して固有の抗
原に言及しているが、それはタンパク質であって、糖脂
質ではない。
【００１１】Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＬＰＳ抗原が、ＧＭ２
に対する特異的抗体を供給する供与源であるという関連
付けこれまでなかった。更に、このようにして産生され
た抗体を、ガン等の病状に対する診断および治療アプロ
ーチに使用可能であるという示唆はこれまでなかった。
これらは、すべて、ここで次の開示に詳細に記載される
本発明の特徴である。
に対する特異的抗体を供給する供与源であるという関連
付けこれまでなかった。更に、このようにして産生され
た抗体を、ガン等の病状に対する診断および治療アプロ
ーチに使用可能であるという示唆はこれまでなかった。
これらは、すべて、ここで次の開示に詳細に記載される
本発明の特徴である。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した問
題点を解決するガングリオシド特異的抗体を確保するた
めの方法を提供することを課題とする。すなわち、本発
明の目的は、新規な“ＧＭ２”として知られているモノ
シアロガングリオシドに特異的な抗体の製造方法を提供
することにある。また、本発明の他の目的は、新規な
“ＧＭ２”として知られているモノシアロガングリオシ
ドに特異的な抗体の製造方法によって作製された抗体の
利用方法を提供することにある。そして、本発明の更に
他の目的は、新規な“ＧＭ２”として知られているモノ
シアロガングリオシドに特異的な抗体の製造方法によっ
て作製された抗体の診断およびスクリーニングへの適
用、更に治療方法が含まれる。
題点を解決するガングリオシド特異的抗体を確保するた
めの方法を提供することを課題とする。すなわち、本発
明の目的は、新規な“ＧＭ２”として知られているモノ
シアロガングリオシドに特異的な抗体の製造方法を提供
することにある。また、本発明の他の目的は、新規な
“ＧＭ２”として知られているモノシアロガングリオシ
ドに特異的な抗体の製造方法によって作製された抗体の
利用方法を提供することにある。そして、本発明の更に
他の目的は、新規な“ＧＭ２”として知られているモノ
シアロガングリオシドに特異的な抗体の製造方法によっ
て作製された抗体の診断およびスクリーニングへの適
用、更に治療方法が含まれる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記した
課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、ＬＰＳ抗
原がＧＭ２に対する特異的抗体を供与源となり得ること
を見出した。更に、これらの知見に基づき、検討を重ね
た結果、このように作製された抗体がガン等の病状に対
する診断および治療アプローチに利用可能であるという
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、ＬＰＳ抗
原がＧＭ２に対する特異的抗体を供与源となり得ること
を見出した。更に、これらの知見に基づき、検討を重ね
た結果、このように作製された抗体がガン等の病状に対
する診断および治療アプローチに利用可能であるという
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】本発明を概説すれば、本発明の第１の発明
は、モノシアロガングリオシド（ｍｏｎｏｓｉａｌｏｇ
ａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）ＧＭ２に結合する抗体を製造す
る方法であって、以下の工程、（ｉ）実験用動物を、そ
の動物による抗体の産生を誘発するのに十分な量の、下
記の構造を有する抗原で免疫する工程、
は、モノシアロガングリオシド（ｍｏｎｏｓｉａｌｏｇ
ａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）ＧＭ２に結合する抗体を製造す
る方法であって、以下の工程、（ｉ）実験用動物を、そ
の動物による抗体の産生を誘発するのに十分な量の、下
記の構造を有する抗原で免疫する工程、
【化４】ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌ（ＩＩ3ＮｅｕＡ
ｃ）Ｈｅｘ 但し、前記抗原はＧＭ２ではないものであり、そして
（ｉｉ）前記動物によって産生された前記抗体を単離す
る工程、を有する方法を提供する。
ｃ）Ｈｅｘ 但し、前記抗原はＧＭ２ではないものであり、そして
（ｉｉ）前記動物によって産生された前記抗体を単離す
る工程、を有する方法を提供する。
【００１５】ここで、前記抗原がリポ多糖であること
が、好ましく、また、リポ多糖が、グラム陰性細菌から
精製したリポ多糖であることが更に好ましく、また、具
体的には、前記グラム陰性細菌がカンピロバクター−ジ
ェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎ
ｉ）であることがより好ましく、より具体的には、血清
型０：１または血清型０：３６のカンピロバクター−ジ
ェジュニであることが特に好ましい。
が、好ましく、また、リポ多糖が、グラム陰性細菌から
精製したリポ多糖であることが更に好ましく、また、具
体的には、前記グラム陰性細菌がカンピロバクター−ジ
ェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎ
ｉ）であることがより好ましく、より具体的には、血清
型０：１または血清型０：３６のカンピロバクター−ジ
ェジュニであることが特に好ましい。
【００１６】そして、リポ多糖がアジュバントと組み合
わされることが好ましく、具体的には、アジュバントが
完全フロイントアジュバント又は不完全フロイントアジ
ュバントであることがより好ましい。
わされることが好ましく、具体的には、アジュバントが
完全フロイントアジュバント又は不完全フロイントアジ
ュバントであることがより好ましい。
【００１７】本発明の第２の発明は、サンプル中のモノ
シアロガングリオシドＧＭ２の存在を判定する方法であ
って、前記サンプルを、第１の発明によって作り出され
た抗体と接触させて、前記サンプル中におけるＧＭ２の
判定として前記抗体の結合を判定することからなる方法
を提供する。サンプルは、トランスフォーム細胞を有す
ることが好ましく、具体的には、トランスフォーム細胞
が、メラノーマ細胞、神経芽腫細胞、肉腫細胞、グリオ
ーマ細胞、又は精上皮腫細胞であることがより好まし
い。
シアロガングリオシドＧＭ２の存在を判定する方法であ
って、前記サンプルを、第１の発明によって作り出され
た抗体と接触させて、前記サンプル中におけるＧＭ２の
判定として前記抗体の結合を判定することからなる方法
を提供する。サンプルは、トランスフォーム細胞を有す
ることが好ましく、具体的には、トランスフォーム細胞
が、メラノーマ細胞、神経芽腫細胞、肉腫細胞、グリオ
ーマ細胞、又は精上皮腫細胞であることがより好まし
い。
【００１８】本発明の第３の発明は、細胞上におけるＧ
Ｍ２分子の異常発現によって特徴づけられる病状を有す
る患者を治療するため方法であって、前記患者に対し
て、本発明の第１の発明の方法によって作成された抗体
を治療上有効な量で投与することからなる方法を提供す
る。
Ｍ２分子の異常発現によって特徴づけられる病状を有す
る患者を治療するため方法であって、前記患者に対し
て、本発明の第１の発明の方法によって作成された抗体
を治療上有効な量で投与することからなる方法を提供す
る。
【００１９】
【発明の実施の形態】ここで、添付の図面について簡単
に説明する。
に説明する。
【００２０】図１は、様々なガングリオシド種をテスト
して得られた結果を示すドット・ブロットであり、抗血
清は、種々のカンピロバクター-ジェジュニ血清型から
調製されたＬＰＳによる、ウサギの免疫処置後に得られ
た。レーン１および２は、０：１での免疫処置後の抗血
清を使用し、レーン３および４は０：１９を使用し、レ
ーン５および６は０：２３を使用し、レーン７および８
は０：３６を使用し、レーン９および１０はウシ脳ガン
グリオシドＧＭ２を使用した。奇数番号のレーンは、免
疫前血清でのテストであり、偶数番号のレーンは免疫血
清である。図２および図３は、免疫薄層クロマトグラフ
ィー・テストで得られたデータを示している。図２は、
免疫前血清のテストによって得られた結果を示してい
る。この免疫前血清は、ＬＰＳ ０：１によるテストに
用いた免疫処置前のウサギからのものであり、ＰＢＳ中
で１：１００に希釈された。ＴＬＣは、血清での重層
（ｏｖｅｒｌａｙｉｎｇ）の前に、二つの溶媒（即ち、
第１溶媒は、ＣＨ3Ｃｌと、アセトンとが１：１、第２
溶媒は、ＣＨＣｌ3、メタノール、および０．２％Ｃａ
Ｃｌ2が、５５：４５：１０の割合）中で展開された。
各レーンを順に参照すると、レーン１は、混合ウシ脳ガ
ングリオシド（１０μｌ）でのテストを示し、レーン２
はウシ脳ガングリオシドＧＭ２（１μｇ）をテストした
ものであり、レーン３−５は、それぞれ、ヒト・メラノ
ーマ（５μｌ）、ヒト神経芽細胞腫（４μｌ）、および
ヒト腎ガン（５μｌ）細胞ライン、レーン６は新鮮なヒ
ト・メラノーマ（３μｌ）をテストしたものである。図
３に於いて、同じ実験用動物からの免疫血清をテストし
た。この血清は、第５回目の採血から得られ、前記材料
がテストされた時と同様に、ＰＢＳ中で１：５００に希
釈された。尚、レーン５および６の上側のバンドは、免
疫前血清がテストされた時のバンドにも見られ、従っ
て、これらは免疫処置の結果によるものではないことが
銘記される。これに対して、レーン５および６の下側の
バンドは、免疫処置の結果であり、上側のバンドはそう
ではない。図４および５は、抗体依存性細胞傷害テスト
に於いて得られた結果を示している。使用した血清は、
ＬＰＳ血清型０：１での免疫処置の後に得られた。図４
に於いて、その表面上にＧＭ２を提示することが知られ
ている腎細胞ガン細胞ラインＳＫ−ＲＣ−９がテストさ
れ、図５に於いては、ＧＭ２を提示しない結腸ガン細胞
ラインＳＷ１２２２がテストされた。これら両方の図に
於いて、○は、エフェクター細胞と、標的細胞と、免疫
血清が混合されたデータ点を示し、図面中「黒丸印」は、
エフェクター細胞と、標的細胞と、免疫前血清とを含む
テストからのデータ点を示し、そして図面中「黒四角印」
は、エフェクター細胞抜きの、標的細胞と免疫血清とを
混合したものを示している。
して得られた結果を示すドット・ブロットであり、抗血
清は、種々のカンピロバクター-ジェジュニ血清型から
調製されたＬＰＳによる、ウサギの免疫処置後に得られ
た。レーン１および２は、０：１での免疫処置後の抗血
清を使用し、レーン３および４は０：１９を使用し、レ
ーン５および６は０：２３を使用し、レーン７および８
は０：３６を使用し、レーン９および１０はウシ脳ガン
グリオシドＧＭ２を使用した。奇数番号のレーンは、免
疫前血清でのテストであり、偶数番号のレーンは免疫血
清である。図２および図３は、免疫薄層クロマトグラフ
ィー・テストで得られたデータを示している。図２は、
免疫前血清のテストによって得られた結果を示してい
る。この免疫前血清は、ＬＰＳ ０：１によるテストに
用いた免疫処置前のウサギからのものであり、ＰＢＳ中
で１：１００に希釈された。ＴＬＣは、血清での重層
（ｏｖｅｒｌａｙｉｎｇ）の前に、二つの溶媒（即ち、
第１溶媒は、ＣＨ3Ｃｌと、アセトンとが１：１、第２
溶媒は、ＣＨＣｌ3、メタノール、および０．２％Ｃａ
Ｃｌ2が、５５：４５：１０の割合）中で展開された。
各レーンを順に参照すると、レーン１は、混合ウシ脳ガ
ングリオシド（１０μｌ）でのテストを示し、レーン２
はウシ脳ガングリオシドＧＭ２（１μｇ）をテストした
ものであり、レーン３−５は、それぞれ、ヒト・メラノ
ーマ（５μｌ）、ヒト神経芽細胞腫（４μｌ）、および
ヒト腎ガン（５μｌ）細胞ライン、レーン６は新鮮なヒ
ト・メラノーマ（３μｌ）をテストしたものである。図
３に於いて、同じ実験用動物からの免疫血清をテストし
た。この血清は、第５回目の採血から得られ、前記材料
がテストされた時と同様に、ＰＢＳ中で１：５００に希
釈された。尚、レーン５および６の上側のバンドは、免
疫前血清がテストされた時のバンドにも見られ、従っ
て、これらは免疫処置の結果によるものではないことが
銘記される。これに対して、レーン５および６の下側の
バンドは、免疫処置の結果であり、上側のバンドはそう
ではない。図４および５は、抗体依存性細胞傷害テスト
に於いて得られた結果を示している。使用した血清は、
ＬＰＳ血清型０：１での免疫処置の後に得られた。図４
に於いて、その表面上にＧＭ２を提示することが知られ
ている腎細胞ガン細胞ラインＳＫ−ＲＣ−９がテストさ
れ、図５に於いては、ＧＭ２を提示しない結腸ガン細胞
ラインＳＷ１２２２がテストされた。これら両方の図に
於いて、○は、エフェクター細胞と、標的細胞と、免疫
血清が混合されたデータ点を示し、図面中「黒丸印」は、
エフェクター細胞と、標的細胞と、免疫前血清とを含む
テストからのデータ点を示し、そして図面中「黒四角印」
は、エフェクター細胞抜きの、標的細胞と免疫血清とを
混合したものを示している。
【００２１】
【実施例】以下に本発明の実施例を説明する。
【００２２】例 １ 使用したすべての細菌は、ＡＴＣＣ（ｔｈｅ Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ）から得た。血清型０：１，０：１９，０：２３お
よび０：３６のカンピロバクター-ジェジュニ（Campylo
bacter jejuni）（以後、”Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ”）のサ
ンプルを使用した。各サンプルにつき、リポ多糖抗原
（以後、”ＬＰＳ”抗原）を、ここに参考文献として本
出願にその内容を合体させるウェストファール（Ｗｅｓ
ｔｐｈａｌ）他，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｌａｇ．
７ｂ：１４８−１５５（１９５２）の高温フェノール−
水法（hot phenol-water methodology）を、少し改変し
た方法を使用して、熱不活性化された細菌から抽出し
た。具体的な抽出方法は、ＲＮＡを、市販のウシ膵臓Ｒ
ＮＡでの消化によって除去し、その後、ゴールドマン
（Ｇｏｌｄｍａｎ），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３
８：２６７−２７５（１９８７）に依るＳｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−２５でのサイズ排除クロマトグラフィーを行っ
た。抽出されたＬＰＳを凍結乾燥し、使用時まで−２０
℃で保存した。
ｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ）から得た。血清型０：１，０：１９，０：２３お
よび０：３６のカンピロバクター-ジェジュニ（Campylo
bacter jejuni）（以後、”Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ”）のサ
ンプルを使用した。各サンプルにつき、リポ多糖抗原
（以後、”ＬＰＳ”抗原）を、ここに参考文献として本
出願にその内容を合体させるウェストファール（Ｗｅｓ
ｔｐｈａｌ）他，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｌａｇ．
７ｂ：１４８−１５５（１９５２）の高温フェノール−
水法（hot phenol-water methodology）を、少し改変し
た方法を使用して、熱不活性化された細菌から抽出し
た。具体的な抽出方法は、ＲＮＡを、市販のウシ膵臓Ｒ
ＮＡでの消化によって除去し、その後、ゴールドマン
（Ｇｏｌｄｍａｎ），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３
８：２６７−２７５（１９８７）に依るＳｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−２５でのサイズ排除クロマトグラフィーを行っ
た。抽出されたＬＰＳを凍結乾燥し、使用時まで−２０
℃で保存した。
【００２３】例 ２ 次に、前記ＬＰＳ抗原の調製物を使用して免疫原性組成
物を調製した。各ケースに於いて、前記ＬＰＳ抗原をア
ジュバントと混合した。各組成物に対して、２匹のウサ
ギを実験用動物として使用した（雌ニュージーランド・
ホワイト・ウサギ、体重２−２．５ｋｇ）。第０日に、
これらの動物に、完全フロイントアジュバントに含ませ
た５００μｇのＬＰＳを皮内注射した。１４日後、前記
動物に、今度は不完全フロイントアジュバントに含ませ
た５００μｇのＬＰＳの第２回目の注射をした。この
後、第２８日目と第４２日目とに於いて、それぞれ、不
完全フロイントアジュバントに含ませた２５０μｇのＬ
ＰＳの注射を行った。二匹の動物に、純粋なウシ脳ＧＭ
２（同実験中の同じ時点で、２００μｇ，２００μｇ，
１００μｇ，１００μｇ）を注射した。第０日目、第１
４日目、第２８日目、第４２日目および第６４日目に、
すべての動物から採血し、抗体価を測定し、更に分析を
行った。いくらかのウサギには、更に、第４回目の注射
の後、１３週間および１７週間目に、ＩＦＡに含ませた
２５０μｇのＬＰＳの追加接種も行い、最後の追加接種
後２週間目に採血した。
物を調製した。各ケースに於いて、前記ＬＰＳ抗原をア
ジュバントと混合した。各組成物に対して、２匹のウサ
ギを実験用動物として使用した（雌ニュージーランド・
ホワイト・ウサギ、体重２−２．５ｋｇ）。第０日に、
これらの動物に、完全フロイントアジュバントに含ませ
た５００μｇのＬＰＳを皮内注射した。１４日後、前記
動物に、今度は不完全フロイントアジュバントに含ませ
た５００μｇのＬＰＳの第２回目の注射をした。この
後、第２８日目と第４２日目とに於いて、それぞれ、不
完全フロイントアジュバントに含ませた２５０μｇのＬ
ＰＳの注射を行った。二匹の動物に、純粋なウシ脳ＧＭ
２（同実験中の同じ時点で、２００μｇ，２００μｇ，
１００μｇ，１００μｇ）を注射した。第０日目、第１
４日目、第２８日目、第４２日目および第６４日目に、
すべての動物から採血し、抗体価を測定し、更に分析を
行った。いくらかのウサギには、更に、第４回目の注射
の後、１３週間および１７週間目に、ＩＦＡに含ませた
２５０μｇのＬＰＳの追加接種も行い、最後の追加接種
後２週間目に採血した。
【００２４】例 ３ 上述した免疫処置プロトコールを参考にして、各採血
後、免疫されたウサギからの血清を、標準ＥＬＩＳＡ
（固相酵素免疫検定法）によって分析し、（ｉ）ＧＭ２
に対する抗体が存在しているか否か、又、（ｉｉ）存在
しているならば、これらはクラスＩｇＧ又はＩｇＭのも
のであるか、を判定した。これは、市販の抗ウサギＩｇ
Ｇ又はＩｇＭ抗体を使用して行った。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ
血清型０：１での免疫処置によって、ＩｇＧ抗体、高い
力価の血清（１：３２００，および追加接種後では≧６
０，０００）と、更に、低い力価のＩｇＭ抗体（１：１
００）とが産生され、これらは共にＧＭ２を認識した。
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ０：３６での免疫処置では、中程度の
力価のＩｇＭ抗体（１：８００）と、低い力価のＩｇＧ
抗体（１：１００）とが産生された。これらも、又、Ｇ
Ｍ２を認識した。０：１９での免疫処置では、高い力価
のＩｇＧ抗体（ピーク： １：１２８００）と、中程度
ないし高い力価のＩｇＭ抗体（ピーク： １：１２０
０）とが産生されたが、これらの抗体は、ガングリオシ
ドＧＭ１を認識した。純粋なウシ脳ＧＭ２でのテストで
は、低い力価のＩｇＭ（１：２００）とＩｇＧ（１：２
００）とが産生された。
後、免疫されたウサギからの血清を、標準ＥＬＩＳＡ
（固相酵素免疫検定法）によって分析し、（ｉ）ＧＭ２
に対する抗体が存在しているか否か、又、（ｉｉ）存在
しているならば、これらはクラスＩｇＧ又はＩｇＭのも
のであるか、を判定した。これは、市販の抗ウサギＩｇ
Ｇ又はＩｇＭ抗体を使用して行った。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ
血清型０：１での免疫処置によって、ＩｇＧ抗体、高い
力価の血清（１：３２００，および追加接種後では≧６
０，０００）と、更に、低い力価のＩｇＭ抗体（１：１
００）とが産生され、これらは共にＧＭ２を認識した。
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ０：３６での免疫処置では、中程度の
力価のＩｇＭ抗体（１：８００）と、低い力価のＩｇＧ
抗体（１：１００）とが産生された。これらも、又、Ｇ
Ｍ２を認識した。０：１９での免疫処置では、高い力価
のＩｇＧ抗体（ピーク： １：１２８００）と、中程度
ないし高い力価のＩｇＭ抗体（ピーク： １：１２０
０）とが産生されたが、これらの抗体は、ガングリオシ
ドＧＭ１を認識した。純粋なウシ脳ＧＭ２でのテストで
は、低い力価のＩｇＭ（１：２００）とＩｇＧ（１：２
００）とが産生された。
【００２５】例 ４ 上述したようにして得られた血清の特異性を、ドット・
ブロット法によって徹底的に分析した。ニトロセルロー
スペーパーに固定化されたＧＭ２、及びＧＭ３，ＧＭ
１，ＧＤ３，ＧＤ２，ＧＤ１ａ，ＧＤ１ｂ，ＧＴ１ｂお
よびＧＱ１ｂを含むウシ脳材料由来の他のガングリオシ
ドのパネルに対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体について血
清を染色した。その結果を次の表１に示す。前記ドット
・ブロット法は、１：１００の血清希釈物と、市販の抗
―ウサギＩｇＧおよびＩｇＭ抗体とを使用した、標準式
のものであった。その後の表２に於いて、”３＋”の等
級は、強い染色があったことを意味し、”２＋”は、中
−強程度の染色、”１＋”は弱い染色、そして、”＋
／”はわずかな染色をそれぞれ意味する。後の図１に、
ドット・ブロットを示している。
ブロット法によって徹底的に分析した。ニトロセルロー
スペーパーに固定化されたＧＭ２、及びＧＭ３，ＧＭ
１，ＧＤ３，ＧＤ２，ＧＤ１ａ，ＧＤ１ｂ，ＧＴ１ｂお
よびＧＱ１ｂを含むウシ脳材料由来の他のガングリオシ
ドのパネルに対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体について血
清を染色した。その結果を次の表１に示す。前記ドット
・ブロット法は、１：１００の血清希釈物と、市販の抗
―ウサギＩｇＧおよびＩｇＭ抗体とを使用した、標準式
のものであった。その後の表２に於いて、”３＋”の等
級は、強い染色があったことを意味し、”２＋”は、中
−強程度の染色、”１＋”は弱い染色、そして、”＋
／”はわずかな染色をそれぞれ意味する。後の図１に、
ドット・ブロットを示している。
【００２６】
【表１】
【００２７】表１に示されているように、Ｃ．ｊｅｊｕ
ｎｉ血清型０：１ ＬＰＳで免疫された動物からはＧＭ
２に対する強い血清ＩｇＧ抗原反応性があったのに対し
て、テストされたその他の血清サンプルは陰性であっ
た。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清型０：１９で免疫された動物
からの血清はＧＭ１に対する強い抗原反応性と、ＧＤ１
ｂに対する中程度の抗原反応性を示した。ＧＤ１ａに対
する弱い活性も見られた。
ｎｉ血清型０：１ ＬＰＳで免疫された動物からはＧＭ
２に対する強い血清ＩｇＧ抗原反応性があったのに対し
て、テストされたその他の血清サンプルは陰性であっ
た。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清型０：１９で免疫された動物
からの血清はＧＭ１に対する強い抗原反応性と、ＧＤ１
ｂに対する中程度の抗原反応性を示した。ＧＤ１ａに対
する弱い活性も見られた。
【００２８】例 ５ 更に別の実験に於いて、免疫薄層クロマトグラフィーに
依り、血清の、精製ウシ脳ＧＭ２、及び新鮮なヒト・メ
ラノーマと、ヒト腎細胞ガン細胞ラインと、ヒト・メラ
ノーマ細胞ラインと、ヒト神経芽細胞腫細胞ラインとか
ら抽出されたＧＭ２とに対する抗原反応性をテストし
た。前記免疫薄層クロマトグラフィーテストは、標準方
法を使用して行われた。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清型０：１
で免疫された動物の血清から得られたＩｇＧ抗体は、す
べての供与源からのＧＭ２と強く反応した。図２および
図３は、これらの結果を示している。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ
血清型０：１９で免疫された動物の血清から得られたＩ
ｇＧ抗体は、精製ウシ脳ＧＭ１と強く反応した。
依り、血清の、精製ウシ脳ＧＭ２、及び新鮮なヒト・メ
ラノーマと、ヒト腎細胞ガン細胞ラインと、ヒト・メラ
ノーマ細胞ラインと、ヒト神経芽細胞腫細胞ラインとか
ら抽出されたＧＭ２とに対する抗原反応性をテストし
た。前記免疫薄層クロマトグラフィーテストは、標準方
法を使用して行われた。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清型０：１
で免疫された動物の血清から得られたＩｇＧ抗体は、す
べての供与源からのＧＭ２と強く反応した。図２および
図３は、これらの結果を示している。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ
血清型０：１９で免疫された動物の血清から得られたＩ
ｇＧ抗体は、精製ウシ脳ＧＭ１と強く反応した。
【００２９】例 ６ 前記ＧＭ２特異的血清が、細胞表面に結合する能力を、
標準式混合赤血球吸着アッセイによってテストした。こ
のアッセイに於いて、その表面に高いレベルの細胞表面
ＧＭ２を発現する、ヒト腎ガン細胞ラインＳＫ−ＲＣ−
９を、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清型０：１ ＬＰＳで免疫さ
れた動物から得た血清と混合された。前記血清中の抗体
は、表面反応性であった（ピーク・力価 １：６０
０）。次の表２を参照。
標準式混合赤血球吸着アッセイによってテストした。こ
のアッセイに於いて、その表面に高いレベルの細胞表面
ＧＭ２を発現する、ヒト腎ガン細胞ラインＳＫ−ＲＣ−
９を、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清型０：１ ＬＰＳで免疫さ
れた動物から得た血清と混合された。前記血清中の抗体
は、表面反応性であった（ピーク・力価 １：６０
０）。次の表２を参照。
【００３０】
【表２】
【００３１】例 ７ 抗体−依存性細胞性細胞傷害（”ＡＤＣＣ”）を仲介す
る抗体の存在を調べるために更に実験を行った。これら
の実験は、周知の51Ｃｒ放出アッセイを使用したもので
あった。これらの実験に於いて、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清
型０：１から単離されたＬＰＳでの６回のワクチン注射
を受けたウサギから得た血清を、様々な腫瘍細胞ライン
と組み合わせた。抗体は、腎細胞ガン細胞ラインＳＫ−
ＲＣ−９（１：８００の血清希釈液で、６０％までの特
異的殺害）と、神経芽細胞腫細胞ライン１ＭＲ−３２
（１：８００の血清希釈液で、８０％までの特異的殺
害）と、ＳＫ−Ｍｅｌ−３１（メラノーマ細胞ライン；
３５％までの特異的溶解）と、腎細胞ガンＳＫ−ＲＣ−
４９（１：４００の血清希釈液で、３５％の特異的溶
解）を含む、ＧＭ２発現腫瘍細胞ラインに対して細胞傷
害性であった。その表面にＧＭ２を提示しない細胞ライ
ンでは特異的溶解は見られなかった。普通の状態のウサ
ギ血清も、細胞溶解を仲介しなかった。これは、図４、
５から理解されるであろう。
る抗体の存在を調べるために更に実験を行った。これら
の実験は、周知の51Ｃｒ放出アッセイを使用したもので
あった。これらの実験に於いて、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清
型０：１から単離されたＬＰＳでの６回のワクチン注射
を受けたウサギから得た血清を、様々な腫瘍細胞ライン
と組み合わせた。抗体は、腎細胞ガン細胞ラインＳＫ−
ＲＣ−９（１：８００の血清希釈液で、６０％までの特
異的殺害）と、神経芽細胞腫細胞ライン１ＭＲ−３２
（１：８００の血清希釈液で、８０％までの特異的殺
害）と、ＳＫ−Ｍｅｌ−３１（メラノーマ細胞ライン；
３５％までの特異的溶解）と、腎細胞ガンＳＫ−ＲＣ−
４９（１：４００の血清希釈液で、３５％の特異的溶
解）を含む、ＧＭ２発現腫瘍細胞ラインに対して細胞傷
害性であった。その表面にＧＭ２を提示しない細胞ライ
ンでは特異的溶解は見られなかった。普通の状態のウサ
ギ血清も、細胞溶解を仲介しなかった。これは、図４、
５から理解されるであろう。
【００３２】以上の諸例は、ガングリオシド、即ち、Ｇ
Ｍ２又はＧＭ１、に対して特異的な抗体の製造方法を記
載したものである。この方法は、免疫原がガングリオシ
ドでない点に於いて驚くべきものである。前述したよう
に、ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌ（ＩＩ3ＮｅｕＡｃ）
−Ｈｅｘの構造の分子での免疫処置は、抗−ＧＭ２特異
的抗体を産生したのに対して、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮ
Ａｃβｌ−４Ｇａｌ（ＩＩ3ＮｅｕＡｃ）の構造の免疫
原での免疫処置は、抗−ＧＭ１特異的抗体を産生した。
これらの分子はガングリオシドではない。使用される免
疫原は好ましくはリポ多糖分子であり、もっとも好まし
くは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉから得られるＬＰＳ分子であ
る。上記記載から理解されるように、異なった血清型の
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉは、その表面に異なるＬＰＳ分子を有
する。ＬＰＳ分子等の分子が、アスピナル（Ａｓｐｉｎ
ａｌｌ）他，１９９３前述、等による所望の構造を有す
るか否かを判断するための分析を行うことは十分当業者
の技術範囲である。従って、本発明は、ここに記載した
特定の血清型の使用に限定されるものではない。
Ｍ２又はＧＭ１、に対して特異的な抗体の製造方法を記
載したものである。この方法は、免疫原がガングリオシ
ドでない点に於いて驚くべきものである。前述したよう
に、ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌ（ＩＩ3ＮｅｕＡｃ）
−Ｈｅｘの構造の分子での免疫処置は、抗−ＧＭ２特異
的抗体を産生したのに対して、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮ
Ａｃβｌ−４Ｇａｌ（ＩＩ3ＮｅｕＡｃ）の構造の免疫
原での免疫処置は、抗−ＧＭ１特異的抗体を産生した。
これらの分子はガングリオシドではない。使用される免
疫原は好ましくはリポ多糖分子であり、もっとも好まし
くは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉから得られるＬＰＳ分子であ
る。上記記載から理解されるように、異なった血清型の
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉは、その表面に異なるＬＰＳ分子を有
する。ＬＰＳ分子等の分子が、アスピナル（Ａｓｐｉｎ
ａｌｌ）他，１９９３前述、等による所望の構造を有す
るか否かを判断するための分析を行うことは十分当業者
の技術範囲である。従って、本発明は、ここに記載した
特定の血清型の使用に限定されるものではない。
【００３３】前記免疫原は、前述した完全及び不完全フ
ロイントアジュバント等の、アジュバントと共に投与さ
れることが好ましい。たとえば、百日咳菌（Ｂｏｒｔａ
ｄｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、水酸化アルミニウ
ム、ＱＳ−２１、ＢＣＧ、サルモネラ・ミネソタ（Salm
onella minnesota）Ｒ５９５、アジュバント、ＭＰＬ、
およびその他当該技術に於いて周知のアジュバントを含
むその他のアジュバントを使用することが可能である。
同様に、前記免疫原は、「そのままで”ａｓｉｓ”」、
即ち、ここに記載した要領で、使用することも可能であ
り、又は、キーホールリンペットヘモシニアン、ウシ血
清アルブミン、等の、その免疫原性を高める物質と結合
させることも可能である。
ロイントアジュバント等の、アジュバントと共に投与さ
れることが好ましい。たとえば、百日咳菌（Ｂｏｒｔａ
ｄｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、水酸化アルミニウ
ム、ＱＳ−２１、ＢＣＧ、サルモネラ・ミネソタ（Salm
onella minnesota）Ｒ５９５、アジュバント、ＭＰＬ、
およびその他当該技術に於いて周知のアジュバントを含
むその他のアジュバントを使用することが可能である。
同様に、前記免疫原は、「そのままで”ａｓｉｓ”」、
即ち、ここに記載した要領で、使用することも可能であ
り、又は、キーホールリンペットヘモシニアン、ウシ血
清アルブミン、等の、その免疫原性を高める物質と結合
させることも可能である。
【００３４】実験用動物は、マウス、ラット、およびそ
の他の齧歯動物、羊、ヤギおよび他の反芻動物等を含
む、当該技術に於いて、抗体の産生に使用される標準哺
乳類宿主のいずれであってもよい。
の他の齧歯動物、羊、ヤギおよび他の反芻動物等を含
む、当該技術に於いて、抗体の産生に使用される標準哺
乳類宿主のいずれであってもよい。
【００３５】ここに記載した抗体の性質はポリクローナ
ルである。しかし、当業者にとって開示されたポリクロ
ーナル抗体を生成させる物質を用いて、ハイブリドー
マ、およびモノクローナル抗体を開発することは十分に
可能であると推定される。周知のケーラー−ミルシュタ
イン法（Ｋｏｅｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｍｅｔｈ
ｏｄ）、および、抗体産生Ｂ細胞を「不死化“ｉｍｍｏ
ｒｔａｌｉｚｅ”」させる他の方法を含むそのような方
法は、ここで記載する必要はない。
ルである。しかし、当業者にとって開示されたポリクロ
ーナル抗体を生成させる物質を用いて、ハイブリドー
マ、およびモノクローナル抗体を開発することは十分に
可能であると推定される。周知のケーラー−ミルシュタ
イン法（Ｋｏｅｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｍｅｔｈ
ｏｄ）、および、抗体産生Ｂ細胞を「不死化“ｉｍｍｏ
ｒｔａｌｉｚｅ”」させる他の方法を含むそのような方
法は、ここで記載する必要はない。
【００３６】ヒトをテスト動物として使用しないとして
も、これらのＬＰＳ構造に対する抗体を作り出すことが
可能であることは、受動免疫化ではなく能動免疫化を達
成するべく、人間にワクチン接種する適当な方法を、当
業者に提供するものである。その免疫原性を大きく変え
ることなく、ＬＰＳ分子の毒性効果を取り除く方法は、
当該技術に於いて十分に周知である。哺乳類免疫系は、
これらのＬＰＳ分子と反応可能で、又、事実反応して、
ＧＭ２に対する抗体を産生するということが示されてい
る。又、腎ガン、神経芽細胞腫ガン、肉腫、グリオー
マ、精上皮腫、およびメラノーマ等の種々のタイプのガ
ンは、部分的に、その表面上に於けるＧＭ２分子の発現
によって特徴付けられる、ということも示されている。
ここに記載した諸例に於いて使用したものを含めて、非
毒性形態のＬＰＳのワクチン接種によって、ＧＭ２提示
ガン細胞が免疫的に除去（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
ｃｌｅａｒａｎｃｅ）されるはずである。従って、本
発明の一態様は、異常細胞がその表面上にＧＭ２を提示
する、ガン等の病状を有する患者を、該患者中に於ける
抗−ＧＭ２抗体の産生を誘発させるべく、患者に対し
て、有効量の非毒性ＬＰＳ分子を投与することによっ
て、治療する方法に関する。
も、これらのＬＰＳ構造に対する抗体を作り出すことが
可能であることは、受動免疫化ではなく能動免疫化を達
成するべく、人間にワクチン接種する適当な方法を、当
業者に提供するものである。その免疫原性を大きく変え
ることなく、ＬＰＳ分子の毒性効果を取り除く方法は、
当該技術に於いて十分に周知である。哺乳類免疫系は、
これらのＬＰＳ分子と反応可能で、又、事実反応して、
ＧＭ２に対する抗体を産生するということが示されてい
る。又、腎ガン、神経芽細胞腫ガン、肉腫、グリオー
マ、精上皮腫、およびメラノーマ等の種々のタイプのガ
ンは、部分的に、その表面上に於けるＧＭ２分子の発現
によって特徴付けられる、ということも示されている。
ここに記載した諸例に於いて使用したものを含めて、非
毒性形態のＬＰＳのワクチン接種によって、ＧＭ２提示
ガン細胞が免疫的に除去（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
ｃｌｅａｒａｎｃｅ）されるはずである。従って、本
発明の一態様は、異常細胞がその表面上にＧＭ２を提示
する、ガン等の病状を有する患者を、該患者中に於ける
抗−ＧＭ２抗体の産生を誘発させるべく、患者に対し
て、有効量の非毒性ＬＰＳ分子を投与することによっ
て、治療する方法に関する。
【００３７】前述した諸例に示されているように、記載
した方法で産生された抗体は、その表面上にガングリオ
シドＧＭ１又はＧＭ２を提示する細胞がサンプル中に存
在するか否かの判定等に於いて、診断用に有用である。
従って、腫瘍細胞がＧＭ１又はＧＭ２をその表面上に提
示し、他方、非トランスフォーム細胞は提示しない場合
における、腫瘍形成の開始、等の異常性に関してサンプ
ルをスクリーニングすることができる。メラノーマ及び
腎ガンは、そのようなトランスフォーム細胞の例であ
る、同様に、ここに記載した抗体を使用して、一般にサ
ンプルを分析することができる。たとえば、ウシ脳断片
を分析して、所望のガングリオシドＧＭ１および／又は
ＧＭ２が存在しているか否か、そして、もし存在してい
た場合、それらが更なる分析と精製を保証するような量
で存在しているか否か、を判定することができる。
した方法で産生された抗体は、その表面上にガングリオ
シドＧＭ１又はＧＭ２を提示する細胞がサンプル中に存
在するか否かの判定等に於いて、診断用に有用である。
従って、腫瘍細胞がＧＭ１又はＧＭ２をその表面上に提
示し、他方、非トランスフォーム細胞は提示しない場合
における、腫瘍形成の開始、等の異常性に関してサンプ
ルをスクリーニングすることができる。メラノーマ及び
腎ガンは、そのようなトランスフォーム細胞の例であ
る、同様に、ここに記載した抗体を使用して、一般にサ
ンプルを分析することができる。たとえば、ウシ脳断片
を分析して、所望のガングリオシドＧＭ１および／又は
ＧＭ２が存在しているか否か、そして、もし存在してい
た場合、それらが更なる分析と精製を保証するような量
で存在しているか否か、を判定することができる。
【００３８】ワクチンに関するここに記載した研究は、
又、その病状が異常細胞上に於けるＧＭ２又はＧＭ１の
出現によって特徴付けられる、メラノーマ、神経芽細胞
腫、肉腫、グリオーマ、精上皮腫、およびその他のタイ
プのガン等の、病状を治療する方法である本発明の別の
態様に対する支持を提供するものである。治療されるべ
き患者に対して治療的にプラスの効果を与えるのに十分
な治療的有効投与量の本発明の抗体を投与することがで
きる。
又、その病状が異常細胞上に於けるＧＭ２又はＧＭ１の
出現によって特徴付けられる、メラノーマ、神経芽細胞
腫、肉腫、グリオーマ、精上皮腫、およびその他のタイ
プのガン等の、病状を治療する方法である本発明の別の
態様に対する支持を提供するものである。治療されるべ
き患者に対して治療的にプラスの効果を与えるのに十分
な治療的有効投与量の本発明の抗体を投与することがで
きる。
【００３９】本発明のその他の態様は、当業者にとって
明白であり、従って、ここに繰り返す必要はないであろ
う。
明白であり、従って、ここに繰り返す必要はないであろ
う。
【００４０】ここに使用した用語および表現は、限定の
用語としてではなく、記載の用語として使用されたもの
であり、このような用語および表現を使用するに当たっ
て、ここに図示および記載した特徴構成のいかなる均等
物又はその一部も除外する意図はなく、本発明の範囲内
で様々な改変が可能であると認識される。
用語としてではなく、記載の用語として使用されたもの
であり、このような用語および表現を使用するに当たっ
て、ここに図示および記載した特徴構成のいかなる均等
物又はその一部も除外する意図はなく、本発明の範囲内
で様々な改変が可能であると認識される。
【図１】種々のカンピロバクター-ジェジュニ血清型か
ら調製されたＬＰＳによる、ウサギの免疫処置後に得ら
れた抗血清を、様々なガングリオシド種についてテスト
した結果を示すドット・ブロット
ら調製されたＬＰＳによる、ウサギの免疫処置後に得ら
れた抗血清を、様々なガングリオシド種についてテスト
した結果を示すドット・ブロット
【図２】免疫前血清の免疫薄層クロマトグラフィー・テ
ストで得られたデータを示す図
ストで得られたデータを示す図
【図３】免疫血清の免疫薄層クロマトグラフィー・テス
トで得られたデータを示す図
トで得られたデータを示す図
【図４】ＬＰＳ血清型０：１での免疫処置の後の血清を
用いたＧＭ２を提示する腎細胞ガン細胞ラインＳＫ−Ｒ
Ｃ−９の抗体依存性細胞傷害テストの結果を示す図
用いたＧＭ２を提示する腎細胞ガン細胞ラインＳＫ−Ｒ
Ｃ−９の抗体依存性細胞傷害テストの結果を示す図
【図５】ＬＰＳ血清型０：１での免疫処置の後の血清を
用いたＧＭ２を提示しない結腸ガン細胞ラインＳＷ１２
２２の抗体依存性細胞傷害テストの結果を示す図
用いたＧＭ２を提示しない結腸ガン細胞ラインＳＷ１２
２２の抗体依存性細胞傷害テストの結果を示す図
フロントページの続き (71)出願人 594011992 605 ＴＨＩＲＤ ＡＶＥＮＵＥ，ＮＥＷ ＹＯＲＫ，ＮＥＷ ＹＯＲＫ 10158, ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭ ＥＲＩＣＡ (72)発明者 オールド，ロイド，ジェイ アメリカ合衆国 ニューヨーク 10105 ニューヨーク アベニュー・オブ・ジ・ア メリカズ 1345 Ｆターム(参考） 4C085 AA13 BB01 CC07 CC31 EE01 4H045 AA11 AA20 AA30 CA11 DA75 EA20 FA71
Claims (12)
- 【請求項１】 モノシアロガングリオシド（ｍｏｎｏｓ
ｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）ＧＭ２に結合する抗
体を製造する方法であって、以下の工程、 （ｉ）実験用動物を、その動物に依る抗体の産生を誘発
するのに十分な量の、下記の構造を有する抗原で免疫す
る工程、 【化１】ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌ（ＩＩ3ＮｅｕＡ
ｃ）Ｈｅｘ 但し、前記抗原はＧＭ２ではないものであり、そして
（ｉｉ）前記動物によって産生された前記抗体を単離す
る工程、を有する方法。 - 【請求項２】 前記抗原がリポ多糖である請求項１の方
法。 - 【請求項３】 前記リポ多糖が、グラム陰性細菌から精
製したリポ多糖である請求項２の方法。 - 【請求項４】 前記グラム陰性細菌がカンピロバクター
-ジェジュニ（Campylobacter jejuni）である請求項３
の方法。 - 【請求項５】 前記カンピロバクター-ジェジュニが血
清型０：１のものである請求項４の方法。 - 【請求項６】 前記カンピロバクター-ジェジュニが血
清型０：３６のものである請求項４の方法。 - 【請求項７】 前記リポ多糖がアジュバントと組み合わ
される請求項２の方法。 - 【請求項８】 前記アジュバントが完全フロイントアジ
ュバント又は不完全フロイントアジュバントである請求
項７の方法。 - 【請求項９】 サンプル中のモノシアロガングリオシド
ＧＭ２の存在を判定する方法であって、前記サンプル
を、請求項１によって作り出された抗体と接触させて、
前記サンプル中に於けるＧＭ２の判定として前記抗体の
結合を、判定することからなる方法。 - 【請求項１０】前記サンプルがトランスフォーム細胞を
有する請求項９の方法。 - 【請求項１１】前記トランスフォーム細胞が、メラノー
マ細胞、神経芽腫細胞、肉腫細胞、グリオーマ細胞、又
は精上皮腫細胞である請求項１０の方法。 - 【請求項１２】細胞上に於けるＧＭ２分子の異常発現に
よって特徴付けられる病状を有する患者を治療する方法
であって、前記患者に対して、請求項１によって作成さ
れた抗体を治療上有効な量で投与することからなる方
法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/491,310 US6057115A (en) | 1995-06-16 | 1995-06-16 | Process for producing GM2 specific antibodies |
| US08/491,310 | 1995-06-16 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50322597A Division JP3286845B2 (ja) | 1995-06-16 | 1996-06-11 | Ｇｍ２特異的抗体の製造方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002205999A true JP2002205999A (ja) | 2002-07-23 |
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ID=23951660
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50322597A Expired - Fee Related JP3286845B2 (ja) | 1995-06-16 | 1996-06-11 | Ｇｍ２特異的抗体の製造方法 |
| JP2001385622A Pending JP2002205999A (ja) | 1995-06-16 | 2001-12-19 | Ｇｍ２特異的抗体の製造方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50322597A Expired - Fee Related JP3286845B2 (ja) | 1995-06-16 | 1996-06-11 | Ｇｍ２特異的抗体の製造方法 |
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| CA (1) | CA2224460C (ja) |
| DE (1) | DE69630039T2 (ja) |
| WO (1) | WO1997000445A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017044705A (ja) * | 2016-11-21 | 2017-03-02 | 国立大学法人北海道大学 | 糖鎖アレイ |
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|---|---|---|---|---|
| AU1820800A (en) * | 1998-11-12 | 2000-05-29 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy, The | A recombinant polypeptide for use in the manufacture of vaccines against campylobacter induced diarrhea and to reduce colonization |
| ES2568899T3 (es) * | 1999-04-09 | 2016-05-05 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional |
| AP2002002546A0 (en) * | 1999-12-30 | 2002-06-30 | Judith K Gwathmey | Iron chelator delivery system. |
| US6946292B2 (en) | 2000-10-06 | 2005-09-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity |
| GB0414055D0 (en) * | 2004-06-23 | 2004-07-28 | Univ Edinburgh | Specific binding members and uses thereof |
| CN104151372B (zh) * | 2014-07-30 | 2017-05-17 | 湖南利诺生物药业有限公司 | 单唾液酸四已糖神经节苷脂gm1原料的制备方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4557931A (en) * | 1982-12-02 | 1985-12-10 | Regents Of The University Of California | Antigenic compositions and methods for using same |
| GB8422651D0 (en) * | 1984-09-07 | 1984-10-10 | Technology Licence Co Ltd | Monoclonal antibodies |
| US5169757A (en) * | 1987-05-20 | 1992-12-08 | Carleton University | Antibodies or antigens bound to a macroporous hydrophobic synthetic polymer cloth for immunological techniques |
| US5229289A (en) * | 1988-03-11 | 1993-07-20 | The Biomembrane Institute | Monoclonal antibodies and vaccine development directed to human cancer-associated antigens by immunization with animal and human and with synthetic carbohydrate-carrier conjugates |
| CA1337403C (en) * | 1988-03-28 | 1995-10-24 | Biomembrane Institute (The) | Methods for the production of antibodies and induction of immune responses to tumor-associated gangliosides by immunization with ganglioside lactones |
| US4957741A (en) * | 1988-08-02 | 1990-09-18 | Angio-Medical Corp. | Method for the treatment of gastric ulcer |
| US5240833A (en) * | 1989-01-30 | 1993-08-31 | The Biomembrane Institute | Method for the production of monoclonal antibodies directed to tumor-associated gangliosides and fucogangliosides |
| US5258178A (en) * | 1990-07-30 | 1993-11-02 | Abbott Laboratories | Method and product for the treatment of gastric disease |
| US5200344A (en) * | 1990-11-13 | 1993-04-06 | Blaser Martin J | Diagnostic testing for campylobacter jejuni or campylobacter coli infections using novel antigens |
-
1995
- 1995-06-16 US US08/491,310 patent/US6057115A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-06-11 AU AU61086/96A patent/AU705699B2/en not_active Ceased
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- 1997-04-24 US US08/847,369 patent/US5854007A/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-12-19 JP JP2001385622A patent/JP2002205999A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| EP0842428A4 (en) | 2001-05-02 |
| DE69630039T2 (de) | 2004-08-05 |
| EP0842428A1 (en) | 1998-05-20 |
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| CA2224460C (en) | 2002-10-01 |
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| JPH11503172A (ja) | 1999-03-23 |
| WO1997000445A1 (en) | 1997-01-03 |
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| JP3286845B2 (ja) | 2002-05-27 |
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