JPH01132374A - α２→３結合を認識するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なハイブリドーマ、その製造法およびそ
れによって産生される抗シアル酸含有糖脂質モノクロー
ナル抗体に関する。 〔従来の技術〕 関連技術の説明 １９７５年にケーラーらは、免疫動物の胛細胞とマウス
骨髄腫細胞を用いた細胞融合法にて抗ヒツジ赤血球抗体
を産生ずるハイブリドーマを得たこの様なハイブリドー
マはその増殖性から細胞を１個由来のクローン細胞にす
る事が可能であり（ｃｌｏｎｉｎｇ）このクローニング
されたハイブリドーマから産生される抗体は全て同一の
抗体分子である。従って抗原認識部位も同じである為均
−の抗原特異性を示し又細胞を凍結保存できる事から半
永久的にこのモノクローナル抗体を供給する事ができる
。従来の抗血清は免疫動物の血清を種々の抗原で吸収し
調製したが異なる８９２８球由来の抗体分子を数多く含
んでいる為に（ポリクローナル）他の抗原と交さ反応を
示す場合が多く特異性のすぐれた抗血清を調製するのは
困難であったが細胞融合法により、特定の抗原に対して
より特異的な反応を示すモノクローナル抗体の作成が可
能となった。 抗体は、抗原として知られる分子との結合およびそれを
認識する能力を有するタンパク質である。 単クローン性抗体は同一の抗原認識部位を持つ抗体の事
であり、ただ１種の抗原決定基をδ忍識する。 単クローン性抗体およびハイブリドーマを生成させる多
くの技術は、参照により加入される最近の図書「単クロ
ーン性ハイブリドーマ抗体；技術および適用（Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｃｌ　Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ）　Ｊ　　［バレル（ＪｏｈｎＧ、Ｈｕｒ
ｒｅｌｌ）　絹、１９８３］に詳しく述べられている。 〔発明の背景〕 哺乳動物細胞の糖脂質（グリコリピド）は、スフィンゴ
シンという長鎖アミノアルコールに脂肪酸が酸アミド結
合したセラミドという脂質構造に、グルコース、ガラク
トース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラ
クトサミン、フコース、シアル酸などの糖が種々の組み
合せでグリコシド結合したもので、いわゆるスフィンゴ
糖脂質といわれる箱鳴に属する。このうちシアル酸を有
するものを特にガングリオシドと称する。 これらの化合物は一般に細胞膜脂質２重層の外側に局在
し、最近の研究によれば細胞における識別や情報の受容
と応答、レセプクー機能、分化、細胞の増殖・悪性変化
・行動などにおいて重要な役割を果たしているものと考
えられている。 ところで、これらのガングリオシドの内、ＧＤ３ガング
リオシドは神経細胞の分化抗原として知られており、ま
た、ヒトメラノーマ細胞の癌関連抗原として同定されて
いる。 したがって、このＧＤ、ガングリオシドに対するモノク
ローナル抗体の作成は、そのすぐれた抗原特異性と高い
検出感度を特徴とすることから、ガンマ−カーとして癌
患者の血清診断や免疫療法のみならず、細胞機能におけ
る糖鎖の役割を解明するためにも重要な課題であった。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的は、ヒトメラノーマ細胞の癌関連抗原とし
て同定されているＧＤ３ガングリオシドのある特定の抗
原決定基に対して、特異性を有するモノクローナル抗体
を産生ずるハイブリドーマ、その製造法及びそのハイブ
リドーマから産生されるモノクローナル抗体を提供する
ことにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、上記問題点に鑑み、精製ＧＤ３ガングリ
オシドを免疫原として抗ＧＤ３ガングリオシドモノクロ
ーナル抗体を作成し、該モノクローナル抗体に対して高
い特異性を有するエピトープ（抗原決定基）を同定し、
本発明を完成した。 すなわち、本発明は、エピトープ（抗原決定基）として
α２→３結合を有するＮ−アセチルノイラミン酸を含有
するシアル酸含有糖脂質に対して特異性を有するモノク
ローナル抗体を産生ずるハイブリドーマに関する。 また、本発明は（Δ）α２→３結合を有するＮ−アセチ
ルノイラミン酸を含有するシアル酸含有糖脂質を抗原と
してマウスに免疫して得られたＢ細胞（リンパ球）と （Ｂ）骨髄腫細胞とを細胞融合することを特徴とするハ
イブリドーマの製造法に関する。 さらに、本発明は、エピトープ（抗原決定基）としてα
２→３結合を有するＮ−アセチルノイラミン酸を含有す
るシアル酸含有糖脂質に対して特異性を有するハイブリ
ドーマによって産生されたモノクローナル抗体に関する
。 本発明をさらに詳細に説明する。 本発明のハイブリドーマは、ケーラー、ミルシュタイン
等の方法、すなわち、抗原を動物に免疫して、得られる
Ｂ細胞（リンパ球）と骨髄腫細胞とを細胞融合させるこ
とにより調製される。ここで、本発明に使用される「抗
原」としては、α２→３結合Ｎ−アセチルノイラミン酸
を含有するガングリオシド、好ましくは、α２→３結合
を有するガングリオシド糖脂質を挙げることができる。 以下に本発明に使用できるガングリオシド糖脂質類を例
示する。 （Ｂ　）　Ｇ　Ｍ３　　　　　Ｇａｌ　−Ｇｌｃ　−Ｃ
ｅｒ■ ＮｅｕＡｃ （Ｃ）ＧＭ２　　Ｇａ１ＮΔｃ　−Ｇａｌ　−Ｇｌｃ　
−Ｃｅｒ□ ＮｅｕＡｃ （Ｄ）　ＧＭ＋　　Ｇａ１−Ｇａ１ＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇ
ｌｃ−Ｃｅｒ□ ＮｅｕＡｃ （Ｅ）　ＣＤ＋ａ　　Ｇａ１−Ｇａ１ＮＡｃ−Ｇａｌ−
Ｇｌｃ−ＣｅｒＩ ＮｅｕＡｃ　　　　　　ＮｅｕΔＣ ■ ＮｅｕＡｃ ＮｅｕＡｃ ＮｅｕＡｃ 本発明のハイブリドーマから産生されるモノクローナル
抗体はエピトープ　（抗原決定基）としてα２→３結合
したＮ−アセチルノイラミン酸を認識し、特異的に反応
する。したがって、本発明のハイブリドーマから産生さ
れるモノクローナル抗体は、α２→３結合を有するＮ−
アセチルノイラミン酸を含有するシアル酸糖脂質、特に
ＧＩ）’１ガングリオシド、ＧＭ３ガングリオシドに特
に強い反応性を有している。また、これらのシアル酸含
有糖脂質を有する動物であれば、特に動物種に限定され
ることなく、本発明のモノクローナル抗体に対して同様
な特異性を有する。 次に、上記したシアル酸糖脂質を抗原として免疫される
「動物」としては、ウサギ、ヒト、マウス、ラット等は
とんどの動物が使用でき、好ましくはマウス、より好ま
しくはＢａｌｂ／Ｃマウスである。 しかして、得られるＢ細胞（リンパ球）は、本発明のモ
ノクローナル抗体を産生ずる細胞であり、好ましくは、
牌臓細胞を用いる。 一方、「骨髄腫細胞」としては、各種動物、例えば、ヒ
ト、マウス、ラット、ウサギなどほとんどすべての動物
由来のミエローマ細胞を包含するものであり、好ましく
は、マウス由来のミエローマ細胞、より好ましくは、Ｂ
ａｌｂ／ｃマウス由来のＸ６３−Ａｇ８．６５３ミエロ
ーマ細胞が使用できる。これらのミエローマ細胞は、上
記Ｂ細胞と細胞融合させた本発明のハイブリドーマから
モノクローナル抗体を産生ずるための活発な増殖能力を
有するものである。 次に、本発明のハイブリドーマの製造法について詳述す
る。 まず、ＣＤ３ガングリオシドをマウスの腹腔内、皮下、
好ましくは静脈内に投与する。この免疫の際、アジュバ
ント、すなわち免疫増強剤としては不完全アジュバント
または完全アジュバントのいずれも使用でき、例えば腹
腔内、皮下投与では油、乳化剤、結核死菌、サラモネラ
死菌およびこれらの混合物であり、好ましくはサラモネ
ラ・ミネソタ死菌が使用できる。また、これらの抗原お
よびアジュバントは、生理的条件に近い溶液、例えばリ
ン酸緩衝液生理食塩水を用いるのが好ましい。 このように免疫する際の注意点は、免疫に用いる動物は
、自己成分に対して免疫感作が困難であるため原則とし
て、抗原に用いる物質を得た動物より系統発生的に遠縁
の動物種を選ぶのが好ましい。しかし、これらの困難を
回避するためイン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）におい
ても免疫することができる。 次に、上記で得られたＢ細胞とミエローマ細胞とを細胞
融合する。 ここで、融合剤としては、ポリエチレングリコーノペＨ
ＶＪ等が使用でき、好ましくはポリエチレングリコール
６０００である。 また、培養液としては、ハイブリドーマ細胞とミエロー
マ細胞を選択するためＨＡＴ培地を使用するのが好まし
い。さらに、得られたハイブリドーマをクローニンク法
、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、または
限界希釈法を用いて抗体を産生させる。 かくして得られたモノクローナル抗体を、常法にて抗体
価をチエツクし、抗体価の高いハイブリドーマを選択し
て保存する。 〔発明の効果〕 本発明のハイブリドーマから産生されるモノクローナル
抗体は、ヒトまたは動物の癌組織中の天然存在糖脂質抗
原の検出に使用できる。したがって、本発明によるモノ
クローナル抗体は、癌関連ガングリオシドの検出に通常
用いられる方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどに使
用できる。また、本発明によるモノクローナル抗体をア
フィニティークロマトグラフィーに用いて、結合性抗原
を精製することができる。さらに、放射性同位元素で標
識したモノクローナル抗体を腫瘍の検出または局在化に
、また高用量で腫瘍の治療処置に用いることができる。 さらに、化学療法薬をモノクローナル抗体に結合させて
癌細胞に対するその毒性を高めることができる。抗原を
有する種、例えばヒトおよびマウスなどの動物に本発明
のモノクローナル抗体を用いる治療または診断試験に供
することができる。また、本発明によるモノクローナル
抗体は、神経細胞などの基礎研究および臨床への応用が
期待される。 実施例 ＜Ａ）原料の製造 ブタ副腎を冷アセトン中でホモジナイズした後乾燥させ
これをクロロホルム−メタノールを用い常法にて抽出を
行った。 得られたサンプルをアルカリ処理した後ＤＢＡＩＥ−セ
ファデックスΔ−２５陰イオン交換樹脂、イアトロビー
ズカラムを用いてＧＤ３ガングリオシドの精製を行った
。 ＧＭ３ガングリオシドはヘパリン処理した犬の血清を遠
沈しＰＢＳ　（−）溶液で３回洗浄後凍結乾燥を行いク
ロロホルム−メタノールを用いて抽出を行った。以下同
上の操作によりＧ　Ｍ　３ガングリオシドの精製を行っ
た。 ガングリオシドＣＤ、、、　ＧＤ、、およびＧＱ、。 はダイヤヤトロン社から、またＧａ１ＣｅｒおよびＧ　
ｌｃ　Ｃｅｒはシグマ社から、ＧＴｌｂおよびＧ　Ｍ　
２はフナコシ社から夫々購入したものを使用した。 １に れらのガングリオシド糖脂質はクロロホルム：メタノー
ル−１：　１　（Ｖ／Ｖ）あるいはエタノールに溶解し
一２０℃で保存した。 （２）実験動物 メスの６退会ＢＡＬＢ／Ｃマウスを通常飼育にて実験に
使用した。 （３）抗原溶液の調整 上記で抽出・精製したブタ副腎からガングリオシドＧＤ
３とアジュバントとして酢酸処理したサラモネラ・ミネ
ソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｅｓｏｔａ）Ｒ５
９５とを重量比１：４でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ
　（−）ＧＤ３ガングリオシド１００μｇ／ｍｊ！とな
る様に混合して抗原溶液とした。 （４）培養液 培養液；ニッスイ■ＲＰＭ１１６４０を使用した。使用
時にカナマイシン硫酸塩を最終濃度５０Ａｔｇ／ｍ＋ｊ
！、牛胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となる様調整した。 ＨＡＴ培地：チミジン０．（１３８８ｇ、ヒポキサンチ
ン０．１３６１　ｇとを蒸留水１００ｍ７に加熱融解し
、１００倍濃度の保存溶液とし一２０℃で保存した。同
様に０．０１７６ｇのアミノプテリンを蒸留水１００ｍ
ｊ！に少量のＩＮ水酸化ナトリウム水溶液を加えて溶か
し、これをＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地にて１０倍に希釈
し、１００倍濃度の保存液として一２０℃で遮光して保
存した。使用時には、１０％Ｆ　Ｂ　Ｓ、　ＲＰＭ１１
６４０培地にそれぞれ１／１００量ずつ加え、ＨＡＴ培
地とした。 また、ＨＴ培地としては、チミジンおよびヒボキサンチ
ン保存液のみを１／１００量加え使用した。 （５）親細胞 細胞融合を行う際の親細胞としては、ＢＡＬＢ／Ｃマウ
ス由来のミエローマ細■包であるＸ６３−Ａｇ８−６．
５．３細胞を使用した。この細胞を１０％ＦＢＳ　　Ｒ
ＰＭ１１６４０培地により継代を行い、培地に６−チオ
グアニンを３μｇ／ｍｌｉの濃度となる様に加える事に
より突然変異体の出現を阻止した。 （Ｂ）ハイブリドーマの製造 （１）免疫法 メスの６退会ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、免疫原としてブタ
副腎より抽出精製したＧＤ３ガングリオシド１００μｇ
とアジュバントとしてサラモネラ・ミネソタ４００μｇ
とをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ　（−）　、Ｃａ、
　Ｍｇを除いた）　１ｍｊ！にて混合し、前記マウスの
静脈内に０日　ＧＤ３ガングリオシド量で５μｇ１４日
　１０μｇ１７日　１５μｇ１１２日　２０μｇ１７９
日２０μｇ、３日後に脾臓を摘出し肺細胞の懸濁液を作
製し細胞融合に用いた。 （２）細胞融合法 上記で得られた肺細胞リンパ球と前記親細胞のマウスミ
エローマ細胞との細胞融合をケーラーおよびミルシュタ
インの方法に従って実施した。すなわち、■×１０８個
の肺細胞リンパ球を、５０％のポリエチレングリコール
（ＰＥＧ６０００）の存在下で、２Ｘ１０７個の骨髄腫
細胞と融合した。 （３）ハイブリドーマの選択および成長細胞の融合後、
得られた細胞をＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプ
テリンおよびチミジン）中で３７℃において５％のＣＯ
２を使用して培養した。 （Ｃ）モノクローナル抗体とガングリオシドとの反応性
の評価 （１）酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法） ９６穴式平底プレート（ファルコン社製）をエタノール
で前処理して実験に使用した。エタノールにて至適濃度
ＧＤ３ガングリオシド２０μｇ／ｍｌｌとした抗原溶液
５０μβを各プレートに分注し蒸発させた後、１％卵白
アルブミンＰＢＳ　（−）溶液１００μｌを加え３０分
間室温に放置した。プレートを下向きに振って溶液を除
いた後、−次抗体としてハイブリドーマ培養液を５０μ
ｌ加え室温に１時間３０分放置した。同様にしてプレー
トから一時抗体を除きＰＢＳ　（−）溶液１５０μｌを
加え３回ウェル（ｗｅｌｌ）を洗浄した後に１％卵白ア
ルブミンＰＢＳ　（−）溶液１００μｌを加え３０分間
放置した。この溶液を除いた後に１％卵白アルブミンＰ
ＢＳ　（−）にて至適濃度に希釈した２次抗体５０μｌ
を加え室温で１時間３０分放置した。−次抗体と同様に
ＰＢＳ　（−）で３回ウェルを洗浄し反応溶液１００μ
ｌをウェルに注ぎ暗所にて反応を進行させた。反応溶液
はクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ＝　５　＞にオルトフ
ェニレンジアミン、過酸化水素水の最終濃度が０．４ｍ
ｇ／ｍＬ０．０１％となる様調整し実験に使用した。 反応は８Ｎ硫酸を３０μｌ加えて停止させ、５００ｎｍ
の吸収波長にて比色測定を行った。２次抗体としては西
洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウス
ＩｇＧ、Ｍ、Ａ抗体を使用した。 その結果を第１図に示す。 ○はガングリオシドＧＤ３を示す。 ・はガングリオシドＧＭ３を示す。 この図からガングリオシドＧＭ３およびＧＤ３は、本発
明のモノクローナル抗体を高い抗原抗体反応を起こすこ
とが判かる。したがって、ガングリオシドＧＭ３および
ＧＤ３はいずれも本発明のモノクローナル抗体に対する
抗原決定基を有する。しかし、ガングリオシドＧＤ３の
方がガングリオシドＧＭ３より高い抗原抗体反応を起こ
すのでガングリオシドＧＤ３により高い特異性を有する
エピトープ（抗原決定基）があることが判る。 （２）　Ｔ　Ｌ　Ｃ免疫染色（ｉｍｍｕｎｏ　ｓｔａｉ
ｎｉｎｇ）法シリカゲル薄層クロマト（Ｔ　Ｌ　Ｃ（ｐ
ｏｌｙ　ｇｒａｍＳＩＬ　Ｇ）プレートを適当な大きさ
に切りクロロホルム：メタノール−１：　１　（Ｖ／Ｖ
）に溶解し、た糖脂質をプレート上にスポットした。目
的に応じてこのプレートをクロロホルム：メタノール：
水−６０：４０：１０　（ｖ／ｖ）、クロロホルム：メ
タノール：０．５％ＣａＣＲ２＝　５５　＋４５：１０
（Ｖ／Ｖ）あるいはクロロホルム：メタノール：２，５
Ｎ　ＮＨ４０Ｈ＝６０　：　４０　：９　（ｖ／ｖ）の
展開溶媒で展開し、１％卵白アルブミン１％ポリビニル
ピロリドン（Ｋ−３０）ＰＢＳ　（ｉ溶液にて一晩４℃
に放置した。次いで一次抗体に浸たし２時間室温で振と
うした。 Ｐ　Ｂ　Ｓ　（−）にて十分に洗浄した後、１％卵白ア
ルブミン１％ポリビニルピロリドン（Ｋ−３０）ＰＢＳ
　（−）に室温で３０分浸たした。プレートをとり出し
３％ポリビニルピロリドン（Ｋ−３０）ＰＢＳ　（−）
溶液にて至適濃度に希釈した２次抗体に十分浸たし室温
で２時間振とうした後、ＰＢＳ　（−）で十分洗浄し、
反応液を加えた。反応液は４−クロロー−１−ナフトー
ル４ｍｇをメタノール１ｍｊ２に溶解した後５　Ｑ　ｍ
ｍｏβトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、２０
０　ｍｍｏＡ　ＮａＣｊ！　（ｐＨ＝　７．４）緩衝液
を５ｍｌ加え、０．０１％になる様過酸化水素水を加え
て実験に使用した。反応は水洗により停止させ、プレー
トを風乾した。 第２図はＴＬＣ染色法（オルシノール染色）（Ａ）およ
びＴＬＣ免疫染色法（Ｂ）を使用した各種糖脂質の定性
及び免疫反応試験の結果を示している。この図からレー
ン５のガングリオシド　ＣＤ、は、本発明のモノクロー
ナル抗体に対する抗原決定基を有することがわかる。 また、レーン３のガングリオシドＧＤ３にビブリオ・コ
レラ　シアリダーゼ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａＳ
ｉａｌｉｄａｓｅ）を作用させた場合に生ずるＣＤＨ（
Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）は、ＴＬＣ免疫染色により検
出されなかった。このことにより、Ｇａ１−Ｇｌｃ−Ｃ
ｅｒ　（ＣＤ　Ｈ）構造は、本発明のモノクローナル抗
体の抗原決定基とはなり得ないことがわかる。また、レ
ーン３のＴＬＣ免疫染色に表われたバンドは、前記シリ
ダーゼの作用を受けなかったガングリオシドＧＤ３を示
している。 さらに、レーン１のＣＭＨはＧａ１−ＣｅｒおよびＧｌ
ｃ−Ｃｅｒを表わし、レーン４のＣＴＨは、Ｇａｌ　−
Ｇａｌ　−Ｇｌｃ　−Ｃｅｒを表わす。 これらの構造は、ＴＬＣ免疫染色されなかったことから
本発明のモノクローナル抗体の抗原決定基にはなり得な
いことがわかる。 以上から本発明のモノクローナル抗体のエピトープ（抗
原決定基）はＮ−アセチルノイラミン酸であることがわ
かる。 以下、第２図の説明をする。 （１）　　レーンＬ　　ＣＭＨ［Ｃａ１−Ｃｅｒ、Ｇｌ
ａ−Ｃｅｒ）（ヒト脳）　　　　１μｇ （２）　　レーン２．　　ＣＤＨ（Ｃ，Ｄ３にビブリオ
コレラシアリダーゼを作用）１μｇ （３）　　レーン３　　ＣＤ８　　　　　　　　　１μ
ｇ（４）　　レーン４　　ＣＴＨ化学合成品　　１μｇ
（５）　　レーン５　　ＣＤ３　　　　　　　　１μｇ
同様に、Ｎ−アセチルノイラミン酸を有する各種ガング
リオシド類のＴＬＣ免疫染色の結果を表−１に示す。 表−Ｉ　　　ＴＬＣ−免疫染色法 Ｑ　Ｍ　、、　　　　　　　　　　　　　　　　＋＋＋
＋＋＋＋　Ｄ３　　　　　　　　　　　　　　　　＋＋
十＋＋十ＧＤｌａ　　　　　　　＋＋ Ｇ［）ｌｂ　十 ＧＴｌｂ　　　　　　　　　　　　　＋十ＧＱ１ｂ　　
　　　　　　　　　　　＋＋十試料５７８ｎｍ 対照７１０ｎｍ 抗体価 ＋　　　　　　　＜　　　２０，０００２０．０００　
＜　＋＋　　＜　４０，０００４０．０００　＜　＋＋
＋　　＜　６０，０００６０．０００　＜　十＋＋＋　
　＜　８０，０００８０、０００　　＜　　＋＋＋＋＋
　　＜１００．０００１００．０００　　＜　　　十＋
＋＋＋十（４）本発明のモノクローナル抗体に対するエ
ピトー第３図は、第２図と同様にＴＬＣ染色法（Ａ）お
よびＴＬＣ免疫染色法（Ｂ）により得られた各種糖脂質
の定性及び免疫反応試験の結果を示す。この図から、レ
ーン２および３は天然型のガングリオシド、すなわちα
２→３結合を有するＮ−アセチルノイラミン酸であり、
本発明のモノクローナル抗体に対して強い特異性を示す
ことがわかる。 また、レーン４および５はβ２→３結合を有する化合合
成Ｎ−アセチルノイラミン酸誘導体であり、合成型のガ
ングリオシドに対しては、本発明のモノクローナル抗体
は特異性を示さないことがわかる。 （３）で得られた知見と本知見とを総合的に考察すると
、本発明のモノクローナル抗体は、Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸のα２→３結合をエピトープ　（抗原決定基）と
して認識することがわかる。 以下、第３図の説明をする。 （１）　　レーン１：６Ｍ３　　　　　　　　　１μｇ
（２）　　レーン２：Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡ
ＮＡ）α２→３Ｇａｌβ１−＋ＩＣｅｒ１μｇ （３）　　レーン３；Ｎ〜ルアセチルノイラミン（ＮＡ
ＮＡ）　α２→３Ｇａｌαｌ−＋１Ｃｅｒ１μｇ （４）　　レーン４：Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡ
ＮＡ）β２−＋　３０ａｌ　ａ　ｌ　−＋　ｌ　Ｃｅｒ
Ｏ０５μｇ （５）　　レーン５：Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡ
ＮＡ）β２−３Ｇａｌβ１→ＩＣｅｒ１μｇ （６）　　レーン５：ＧＤ、、　　　　　　　　　　　
１μｇ（５）定性的免疫拡散法（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎ
ｙ法）第４図は免疫拡散法を使用した結果を示す。 この図により、本願発明のハイブリドーマより産生され
るモノクローナル抗体はＩｇＭであることがわかる。α
ＭＩｇＭ、　αＭＩｇＧ１．２ａ２ｂおよび３の抗血清
はそれぞれマイルス）社から購入した。 （１）　　αＭＩｇＭ （２）　　αＭＩｇＧ＋ （３）　　αＭＩｇ０２ａ （４）　　αＭＩｇＧ２ｂ （５）　　αＭＩｇＧ３ （６）また表−２から、以下の結果に示すように酵素抗
体法によってもＩｇＭであることが示された。 表−２ 抗マウスＩｇＭ　　　Ｏ，９７７±０．０７６　　０．
０６６±０．００７抗マウスＩｇＧ１　　０．１３１±
０．０１１　　０．０６２±０．０１１抗マウスＩｇＧ
２ａ　　０．１３７±０．０１３　　０．１（１９±０
．０１０抗マウスＩｇＧ２ｂ　　Ｏ，１２１±０．０（
１３　　０．０？２±０．００６抗マウスＩｇＧ３　　
０．１３１±０．００７　　０．０４６±０．０（１３
４、

【図面の簡単な説明】

第１図は酵素抗体法による抗原に対するモノクローナル
抗体の特異性を示し、第２図および第３図は、クローナ
ル抗体に対する各種ガングリオシドの抗原特異性を示し
、第４図はモノクローナル抗体の抗体種の確認図を示す
。

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）エピトープ（抗原決定基）としてα２→３結合を
   有するＮ−アセチルノイラミン酸を含有するシアル酸含
   有糖脂質に対して特異性を有するモノクローナル抗体を
   産生するハイブリドーマ。
2. （２）ＡＴＣＣにＮｏ．ＨＢ９４７５として寄託された
   細胞の特質を有する特許請求の範囲第（１）項記載のハ
   イブリドーマ。
3. （３）（Ａ）α２→３結合を有するＮ−アセチルノイラ
   ミン酸を含有するシアル酸含有糖脂質を抗原として動物
   に免疫して得られたＢ細胞（リンパ球）と （Ｂ）骨髄腫細胞とを細胞融合すること を特徴とするハイブリドーマの製造法。
4. （４）シアル酸含有糖脂質がガングリオシド糖脂質であ
   る特許請求の範囲第（３）項記載のハイブリドーマ製造
   法。
5. （５）ガングリオシドがＧＤ＿３ガングリオシドまたは
   ＧＭ＿３ガングリオシドである特許請求の範囲第（４）
   項記載のハイブリドーマの製造法。
6. （６）動物がＢａｌｂ／ｃマウスである特許請求の範囲
   第（３）項記載のハイブリドーマの製造法。
7. （７）Ｂ細胞がＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞である特
   許請求の範囲第（３）項記載のハイブリドーマの製造法
   。
8. （８）骨髄腫細胞がヒト、ラット、マウス由来のミエロ
   ーマ細胞である特許請求の範囲第（３）項記載のハイブ
   リドーマの製造法。
9. （９）マウスミエローマ細胞がＢａｌｂ／ｃマウス由来
   のミエローマ細胞である特許請求の範囲第（８）項記載
   のハイブリドーマの製造法。
10. （１０）細胞融合にポリエチレングリコールを融合剤と
    して用いる特許請求の範囲第（３）項記載のハイブリド
    ーマの製造法。
11. （１１）免疫する際アジュバントとしてサルモネラミネ
    ソタＲ５９５を使用する特許請求の範囲第（３）項記載
    のハイブリドーマの製造法。
12. （１２）エピトープ（抗原決定基）としてα２→３結合
    を有するＮ−アセチルノイラミン酸を含有するシアル酸
    含有糖脂質に対して特異性を有するハイブリドーマによ
    って産生されたモノクローナル抗体。
13. （１３）シアル酸含有糖脂質がガングリオシドである特
    許請求の範囲第（１２）項記載のモノクローナル抗体。
14. （１４）ガングリオシドがＧＤ＿３ガングリオシドまた
    はＧＭ＿３ガングリオシドである特許請求の範囲第（１
    ３）項記載のモノクローナル抗体。
15. （１５）ＩｇＭタイプの免疫グロブリン分子である特許
    請求の範囲第（１２）項記載のモノクローナル抗体。
16. （１６）ガングリオシドを精製処理する際に使用する特
    許請求の範囲第（１３）項記載のモノクローナル抗体。
17. （１７）メラノーマ細胞表面抗原と特異的に反応する特
    許請求の範囲第（１３）項記載のモノクローナル抗体。
18. （１８）メラノーマ患者の治療に使用しうる特許請求の
    範囲第（１７）項記載のモノクローナル抗体。
19. （１９）血清診断に使用しうる特許請求の範囲第（１７
    ）項記載のモノクローナル抗体。