NO173556B - Monoklonalt antistoff som gjenkjenner alfa-2-3-bindinger, og hybridomcellelinje som produserer antistoffet - Google Patents
Monoklonalt antistoff som gjenkjenner alfa-2-3-bindinger, og hybridomcellelinje som produserer antistoffet Download PDFInfo
- Publication number
- NO173556B NO173556B NO88885113A NO885113A NO173556B NO 173556 B NO173556 B NO 173556B NO 88885113 A NO88885113 A NO 88885113A NO 885113 A NO885113 A NO 885113A NO 173556 B NO173556 B NO 173556B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- ganglioside
- hybridoma
- solution
- cells
- Prior art date
Links
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 claims abstract description 30
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical group CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- -1 GD3 ganglioside Chemical class 0.000 claims description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 19
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 abstract description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 13
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 abstract description 10
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 abstract description 10
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 7
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 abstract description 6
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 abstract description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 24
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 13
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 3
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 3
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- PFJKOHUKELZMLE-VEUXDRLPSA-N ganglioside GM3 Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@@H]([C@H](O)/C=C/CCCCCCCCCCCCC)NC(=O)CCCCCCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 PFJKOHUKELZMLE-VEUXDRLPSA-N 0.000 description 2
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 2
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N (-)-D-erythro-Sphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCC=CC(O)C(N)CO WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 241001222774 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Minnesota Species 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 1
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- GIVLTTJNORAZON-HDBOBKCLSA-N ganglioside GM2 (18:0) Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 GIVLTTJNORAZON-HDBOBKCLSA-N 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N sphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](N)CO WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57469—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving tumor associated glycolinkage, i.e. TAG
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/806—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving IgM
- Y10S424/807—Monoclonal
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/863—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgM
- Y10S530/864—Monoclonal
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører et monoklonalt antistoff som gjenkjenner cx-2—>3-bindinger, og en hybridomcellelinje som produserer antistoffet.
Hittil har anti-sera blitt fremstilt ved å absorbere serumet fra et immunisert dyr på forskjellige sorter antigener. Anti-sera inneholder imidlertid et stort antall anti-stoffmolekyler som stammer fra forskjellige B-celler (poly-klonale), og forårsaker ofte kryssreaksjoner med annet antistoff. Det er derfor vanskelig å oppnå anti-sera med ut-merket spesifisitet.
Under slike omstendigheter utviklet Kohler i 1975 et hybridom som produserer anti-sau rødt blodlegeme-antistoff og som fremstilles ved å fusjonere miltceller utvunnet fra et immunisert dyr og mus-myelomceller for frembringelse av hybridomer. En klon som er et hybridom som stammer fra en enkel celle, kan isoleres fra slike hybridomceller (såkalt "kloning") på grunn av dens store proliferasjonskraft. Alle antistoffene fremstilt ved hjelp av et slikt klonet hybridom er identiske, har enhetlig spesifisitet til et antigen og gjenkjenner således det samme sted i et spesifikt antigen. I tillegg kan hybridomene lagres i nedfryst tilstand, f.eks. i flytende nitrogen. Stabil tilgang på de individu-elle antistoffer kan derfor sikres. Ved hjelp av cellefusjons-teknikk er det således blitt mulig å oppnå et monoklonalt antistoff som er svært spesifikt til et bestemt antigen.
Antistoffer er proteiner som kan gjenkjenne et molekyl eller stoff henvist til som "antigen" som hører naturlig til antistoffet, og kan bindes til dette. Det monoklonale antistoff betyr et antistoff som har et sted som spesifikt gjenkjenner et bestemt antigen, med andre ord gjenkjenner det bare en antigen determinant. I dag er forskjellige tek-nikker for fremstilling av monoklonale antistoffer og for frembringelse av hybridomer som er i stand til å produsere de monoklonale antistoffene, godt kjent innen teknikken.
I denne henseende kan det vises til en nyere publikasjon "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applica-tions", redigert av John G. Hurrell, 1983.
Glycolipidet i pattedyrceller tilhører kategorien av såkalt spingoglycolipid og omfatter (a) en lipidstruktur henvist til som ceramid bestående av en langkjedet aminoalkohol kalt spingosin hvortil en fettsyre er syre/amido-bundet og (b) forskjellige kombinasjoner av sukkere. valgt fra gruppen bestående av glucose, galactose, N-acetylglucosamin, N-ace-tylgalactosamin, fucose og sialinsyre som er bundet til strukturen gjennom glycosidbindinger. Blant disse kalles glycolipidene som bærer sialinsyrerest for gangliosider.
De fleste av disse forbindelsene finnes vanligvis i den ytre cellemembran, og ut fra senere undersøkelser er det blitt antatt at gangliosider spiller en viktig rolle i funk-sjonene som en mottakelse av og respons på gjenkjennelse og informasjon, reseptorfunksjoner, differensiering, prolifera-sjon, malign endring eller oppførsel hos celler.
Blant disse gangliosidene er GD^-gangliosidet kjent
som det differensierte antigen i nerveceller og videre identifisert som det kreft-relaterte antigen i humane melanomceller.
Ettersom det monoklonale antistoff har høy spesifisitet til et bestemt antigen og således kan påvise dette med stor følsomhet som beskrevet ovenfor, ville det, dersom det ble erholdt et monoklonalt antistoff som er spesifikt til GD^-gangliosidene, forventes å finne anvendelse for et slikt monoklonalt antistoff til diagnose av kreft (som kreft-markør) in vitro, samt til belysningen av sukkerkjedens rolle i cellefunksjoner.
Følgelig er det et formål ved foreliggende oppfinnelse
å tilveiebringe et hybridom som er i stand til å produsere monoklonale antistoffer som er spesifikke for en bestemt antigen determinant både i GD^- og GM^-gangliosidet, som er identifisert som antigenene i humane melanomceller som er forbundet med kreft.
Det er videre et formål ved foreliggende oppfinnelse
å tilveiebringe et monoklonalt antistoff som utviser spesi-
fisitet til den bestemte antigene determinant både på GD^-og GM^-gangliosidet.
Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har utført forskjellige undersøkelser for å eliminere de tidligere nevnte ulemper, og har funnet at i cellefusjonsteknikken anvendes det rensede GD3~gangliosid som et antigen for å frembringe et hybridom som er i stand til produsere et ønsket monoklonalt antistoff, og på denne måte har foreliggende oppfinnelse blitt fullført.
Ifølge et aspekt av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en hybridomcellelinje som er kjennetegnet ved at den har ATCC deponeringsnummer HB 9475 og produserer et monoklonalt antistoff som er et immunoglobulinmolekyl av IgM-type, binder både GD^-gangliosid og GM^-gangliosid immunologisk og gjenkjenner epitopen N-acetylneuraminsyre som har en a-2—>3-binding.
Ifølge et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse er det også tilveiebragt et monoklonalt antistoff som er kjennetegnet ved at det er et immunoglobulinmolekyl av IgM-type, er fremstilt ved hjelp av en hybridomcellelinje med ATCC deponeringsnummer HB 9475, binder både GD^-gangliosid og GM^-gangliosid immunologisk og gjenkjenner epitopen N-acetylneuraminsyre som har en a-2->3-binding.
Figur 1 viser spesifisiteten av det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse til antigener GD^ og GM^ bestemt i henhold til enzymmerket antistoffteknikk,
figurene 2 og 3 viser antigenspesifisitet av forskjellige slag av gangliosider mot det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse, og
figur 4 viser et diagram som brukes til å klassifisere det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse.
Foreliggende oppfinnelse vil nedenunder bli forklart nærmere.
Hybridomet ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved å fusjonere 'B-celler (B-lymfocytter) erholdt fra et dyr som er immunisert med et antigen i henhold til fremgangsmåten til Kohler & Millstein (se Nature 1975). "Antigenet" som her er brukt, er f.eks. gangliosider som inneholder N-acetylneuraminsyrerest med alfa-2—>3-binding, fortrinnsvis gangliosidglycolipider som inneholder N-acetyl-neuarminsyrerest med alfa-2—>3-binding. Bestemte eksempler på dette er:
Det monoklonale antistoff fremstilt ved hjelp av hybridomet ifølge foreliggende oppfinnelse gjenkjenner N-acetylneuraminsyre med alfa-2—>3 som epitopen eller den antigene determinant, og reagerer spesifikt med denne. Det monoklonale antistoff fremstilt ved hjelp av hybridomet viser derfor særlig høy reaktivitet med sialinsyre-holdige glycolipider som bærer N-acetylneuraminylrest med alfa-2—>3-binding, særlig GD^- og GM^-gangliosider. I tillegg utviser det monoklonale antistoff likt en slik spesifisitet til hvilke som helst av disse sialinsyre-holdige glycolipider uavhengig av typene av opphavsdyr.
"Dyr" som skal immuniseres med antigenet, det tidligere nevnte sialinsyre-holdige glycolipid, kan være enhver type dyr. Bestemte eksempler på slike er kanin, menneske, mus og rotte, fortrinnsvis mus og helst Balb/c-mus.
B-cellene (B-lymfocyttene) som produserer det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse utvinnes fortrinnsvis fra miltceller. På den annen side kan "myelomceller" som anvendes i foreliggende oppfinnelse, også være de som er utvunnet fra hvilke som helst dyr, slik som menneske, mus, rotte og kanin, fortrinnsvis de som er utvunnet fra mus og helst myelomceller (X63-Ag8.653) utvunnet fra Balb/c-mus. Disse myelomcellene utviser svært høy proliferasjonskraft, slik at hybridomet som er frembragt ved å fusjonere dem med B-cellene, kontinuerlig kan produsere det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen.
Hybridomet ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved hjelp av fremgangsmåten forklart nærmere nedenunder .
Først av alt injiseres GD^-gangliosid i mus intraperi-tonealt, subkutant eller intravenøst, fortrinnsvis intra-venøst, for å immunisere dem. Ved denne immunisering kan det anvendes enten mangelfulle adjuvantia eller komplette adjuvantia som et adjuvans, dvs. et middel for immunologisk forsterkning, og bestemte eksempler på dette er oljer, emul-geringsmidler, drept tuberkelbacillus, drept salmonella og blanding derav, fortrinnsvis drept Salmonella minesota, for intraperitoneal eller subkutan injeksjon og for intravenøs injeksjon. Disse antigener og adjuvantia anvendes fortrinnsvis i form av en oppløsning med omtrentlig fysiologisk akseptabel sammensetning, slik som en oppløsning av fosfatbufret medisinsk salt.
Ved denne immunisering bør det legges merke til at det er vanskelig å sensibilisere et dyr som skal immuniseres, med egen-bestanddelene og det er derfor i prinsippet foretrukket å velge et dyr som fenogenetisk er fjernt fra det som det antigene stoff erholdes fra. Immuniseringen kan imidlertid også utføres in vitro for å unngå slike vanskelig-heter .
Så fusjoneres B-cellene og myelomcellene sammen. Som et middel for cellefusjon kan det anvendes polyethylenglycol og HVJ, fortrinnsvis polyethylenglycol 6000. I tillegg er det foretrukket å anvende HAT-medium som dyrkningsmedium for lett å isolere hybridomceller fra myelomceller som forblir ufusjonert.
Deretter underkastes de resulterende hybridomceller slik kloningsoperasjon som methylcelluloseteknikk, bløt-agaroseteknikk eller begrensende fortynningsteknikk for å isolere et ønsket enkelt klonet hybridom.
Antistofftiteren av det monoklonale antistoff-produ-serende hybridom frembragt på denne måte kan undersøkes på vanlig måte for å velge ut hybridom som utviser høy anti-stof f titer. Det således utvalgte hybridom lagres så.
Det monoklonale antistoff fremstilt ved hjelp av hybridomet ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes til in vitro påvisning av glycolipidantigenet som naturlig forekommer i kreftvev hos menneske eller dyr. Det monoklonale antistoff kan derfor brukes f.eks. i ELISA- og RIA-analyser som på vanlig måte er tilpasset til påvisningen av kreft-assosi-erte gangliosider. D.et monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan dessuten anvendes i affinitetskromato-grafi for å rense antigener som er i stand til å binde seg til det monoklonale antistoff. Det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes til å diagnos-tisere arter in vitro med antigenet, slik...som menneske og dyr, slik som mus. Det er forventet at det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes til grunnleggende undersøkelse av nerveceller og kan anvendes til forskjellige kliniske formål.
Foreliggende oppfinnelse vil bli forklart nærmere i eksemplene nedenunder.
Eksempel
(A) Fremstilling av antigen
(1) Ekstraksjon og rensing av GD3~ og GM3~gangliosider
Etter at binyre fra svin var homogenisert i kaldt aceton og tørket, ble det tørkede produkt ekstrahert med
kloroform/methanol på vanlig måte.
Den resulterende prøve ble behandlet med et alkali og så ble GD^-gangliosid renset under anvendelse av DEAE-Sepha-dex A-25 anionbytterharpiks og "Iatrobeads"-kolonne.
GM^-gangliosid ble fremstilt ved å sentrifugere hunde-serum behandlet med heparin, vaske det resulterende sediment tre ganger med fosfatbufret saltoppløsning (PBS(-)), lyofi-lisere det og så ekstrahere produktet med kloroform/methanol. Rensingen derav ble utført på samme måte som ovenfor.
Gangliosidene GD]_a» ^Dib°^ ^lb' Gal-Ser og Glc-Cer, og GTj^ og GM2 var alle kommersielt tilgjengelige og ble brukt uten ytterligere rensing.
Disse gangliosidglycolipidene ble oppløst i kloroform/ methanol (1:1 (volum/volum)) eller ethanol og lagret ved -20°C.
(2) Dyr
Seks 6 uker gamle Balb/c-mus av hunnkjønn ble brukt
til forsøkene etter oppaling under vanlige betingelser.
(3) Fremstilling av antigenoppløsning
Gangliosid GD^ som er ekstrahert fra binyre fra svin og så renset, og Salmonella minesota R 595 behandlet med eddik-syre (vektforhold = 1:4) og med ditehylether, ble blandet i PBS(-) slik at konsentrasjonen av GD^-gangliosid var 100 ug/ ml, og den resulterende oppløsning ble brukt som antigen-oppløsning .
(4) Dyrkningsmedium
Dyrkningsmedium: Nissui RPMI 1640 ble brukt som dyrkningsmedium. Til mediet ble det tilsatt kanamycinsulfat og bovint fosterserum (FBS) slik at sluttkonsentrasjonen derav var lik med henholdsvis 50 ug/ml og 10% før bruk.
HAT-medium: 0,038 8 g thymidin og 0,13 61 g hypoxanthin ble oppløst i 100 ml destillert vann under oppvarming, og den resulterende oppløsning (a) ble lagret ved 20°C som en standardoppløsning med en konsentrasjon som var 100 ganger høyere enn den ønskede. Likeledes ble 0,0176 g aminopterin oppløst i 100 ml destillert vann ved å tilsette en liten mengde IN natriumhydroxyd i vandig oppløsning, så ble denne fortynnet 10 ganger med RPMI 1640 dyrkningsmedium og den resulterende oppløsning (b) ble lagret ved -20°C som en standardoppløsning med en konsentrasjon som var 100 ganger høyere enn den ønskede, mens det ble skjermet mot lys. HAT-medium ble fremstilt ved å tilsette 1/100-dels volum
hver av de to oppløsningene til 10% FBS RPMI 1640 medium øyeblikkelig før bruk.
Videre ble HT-medium fremstilt ved ganske enkelt å tilsette 1/100-dels volum av standardoppløsningen (a) inne-holdende hypoxanthin og thymidin til det samme 10% FBS RPMI 1640 medium.
(5) Opphavsceller
Som opphavscellene for cellefusjon ble det brukt myelomceller (C63-Ag8-6.5.3-celler) som var blitt utvunnet fra Balb/c-mus. Disse cellene ble underkastet subdyrking i RPMI 1640 medium hvortil 10% FBS var tilsatt, mens genereringen av mutant ble inhibert ved å tilsette 6-thioguanin til mediet, slik at konsentrasjonen av dette var lik med 3 yg/ml.
(B) Fremstilling av hybridom
(1) Immuniseringsmetode
6 uker gamle Balb/c-mus av hunnkjønn ble immunisert
ved intravenøs injeksjon av den følgende immunogenoppløsning i henhold til den følgende immuniseringsplan (mengde inji-sert ble uttrykt i mengden av gangliosid): til å begynne med 5 yg, 10 ug på dag 4, 15 ug på dag 7 HL, 2 0 yg på dag 12 og 20 yg på dag. 79 etter start. På dag 3 etter slutt-immuniseringen ble musene avlivet for å skjære bort milten, og en suspensjon av individue-He miltceller ble fremstilt for etterfølgende bruk i cellefusjon.
Immunogenoppløsning: 100 \ iq GD^-gangliosid ekstrahert fra svinebinyre og renset, og 400 ug Salmonella minesota T 595 som et adjuvans, ble blandet il ml PBS(-) (fri for Ca<++> og-Mg<++>), og den resulterende oppløsning ble så passende fortynnet til bruk som immunogenoppløsning.
(2) Cellefusjon
Fusjon av miltcellene erholdt ovenfor og mus-myelomcellene ble utført ifølge fremgangsmåten til Kohler og Millstein. Nærmere bestemt ble 1 x 10 g miltlymfocytter fusjonert med 2 x 10 7 myelomceller i nærvær av 50% polyethylenglycol (PEG 6000) i et dyrkningsmedium.
(3) Utvelgelse og dyrking av hybridom
Etter cellefusjonen ble de resulterende celler dyrket
i HAT-medium (hypoxanthin, aminopterin og thymidin) ved 37°C i nærvær av 5% C02.
Det derved frembragte hybridom er blitt deponert ved American Type Culture Collection (ATCC) under deponeringsnummer ATCC HB 9475.
(C) Beregning av reaktiviteten til det monoklonale antistoff med gangliosider
96-brønners flatbunnet plate ble forbehandlet i ethanol før anvendelse i forsøkene. 50 yl av antigenoppløsningen (immunogenoppløsningen) som var blitt fortynnet med ethanol for å regulere konsentrasjonen av GD^-gangliosid til 20 yg/ml (optimal konsentrasjon), ble pipettert over i hver brønn i platen, så ble oppløsningsmidlet avdampet, 200 yl 1% ovalbumin PBS(-)-oppløsning ble innført i hver av brønnene og de fikk stå i 30 minutter ved værelsetemperatur. Platen ble rystet med oppsiden ned for å fjerne oppløsningen, så ble 50 yl av supernatanten fra hybridomkulturmediet som det primære antistoff, tilsatt til hver brønn og platen fikk stå i 1,5 timer ved værelsetemperatur. På samme måte ble det primære antistoff fjernet fra brønnene, så ble brønnene vasket 3 ganger ved å tilsette 150 yl PBS(-)-oppløsning og fikk stå i 30 minutter ved værelsetemperatur etter tilsetning av 100 yl i hver brønn av 1% ovalbumin-PBS(-)-oppløsning. Etter fjern-ingen av denne oppløsning ble 50 yl sekundært antistoff fortynnet med 1% ovalbumin-PBS(-)-oppløsning til dets opti-
male konsentrasjon tilsatt til hver brønn og platen ble hen-satt i 1,5 timer ved værelsetemperatur. Som i tilfellet med det primære antistoff ble brønnene vasket 3 ganger med PBS(-)-oppløsning og 100 yl av en reaksjonsoppløsning ble tilsatt til hver brønn for å forårsake reaksjon i mørket. Reak-sjonsoppløsningen ble fremstilt ved oppløsning i citrat/fos-fat-buffer (pH = 5), O-fenylendiamin og hydrogenperoxyd slik at konsentrasjonene var henholdsvis 0,4 mg/ml og 0,01%. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 30 yl 8N svovelsyre-oppløsning til hver brønn og så ble produktet undersøkt ved kolorimetri ved 500 nm. Som det sekundære antistoff ble det brukt geit-anti-mus-IgG-, -IgM- og -IgA-antistoffer merket med pepperrotperoxydase (HRP).
De oppnådde resultater er plottet på figur 1 hvor den igjenfyllte ring representerer gangliosid GM^ og den åpne ring representerer gangliosid GD^.
Som det sees av resultatene plottet på figur 1, forårsaker gangliosidene GD^ og GM^ antigen/antistoff-reaksjoner med det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse ved høy sensitivitet. Således bærer begge gangliosidene GD^ og GM^ den antigene determinant mot det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen. I denne forbindelse utviser gangliosidet GD^ høyere reaktivitet med det monoklonale antistoff enn gangliosidet GM3. Det er derfor funnet at gangliosidet GD^ har en epitop eller antigen determinant med mye høyere spesifisitet til det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse.
(2) TLC-immunofargingsteknikk
En tynnsjiktkromatografiplate av silikagel (TLC(poly-gram SIL G)) ble skåret opp i stykker av passende størrelse og ble flekket med en liten dråpe av oppløsningen av et glycolipid i kloroform/methanol (1:1 (volum/volum)). Avhengig av formål ble platen fremkalt med en fremkallingsoppløsning som f.eks. kloroform/methanol/vann (60/40/10, volum/volum), kloroform/methanol/0,5% CaC^-oppløsning (55/45/10, volum/ volum) eller kloroform/methanol/2,5N NH4OH-oppløsning (60/ 40/9, volum/volum), og så fikk platen stå i 1% ovalbumin/1% polyvinylpyrrolidon (K-30) PBS(-)-oppløsning ved 4°C over natten. Den ble så rystet i 2 timer ved værelsetemperatur under neddypping i oppløsningen av primært antistoff. Etter tilstrekkelig vasking med PBS(-), ble den dyppet i 1% ovalbumin/1% polyvinylpyrrolidon (K-30) PBS(-)-oppløsning ved værelsetemperatur i 30 minutter. Platen ble tatt ut av opp-løsningen, ble dyppet i 2 timer i det sekundære antistoff som var fortynnet til sin optimale konsentrasjon med 3% polyvinylpyrrolidon (K-30) PBS(-)-oppløsning under rysting, så vasket tilstrekkelig med PBS(-) og en reaksjonsoppløsning ble tilsatt. Reaksjonsoppløsningen ble fremstilt ved å oppløse 4 mg 4-klor-l-nafthol i 1 ml methanol, tilsette 50 mmol tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 2 00 mmol NaCl og 5 ml av en buffer (pH = 7,4), og så tilsette hydrogenperoxyd slik at konsentrasjonen derav var 0,01%. Reaksjonen ble stanset ved å vaske platen med vann og så ble den lufttørket. (3) Identifisering av epitoper som er spesifikke til det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse Resultatene av kvalitative tester og immunoreaksjoner av forskjellige typer glycolipider erholdt ved hjelp av TLC-fargingsteknikk (orcinol^farging) (A) og TLC-immunofargingsteknikk (B), er vist i figur 2. Det ble funnet fra resultatene vist i figur 2 at gangliosidet GD^ i felt 5 har en antigen determinant som er spesifikk for det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse.
Dessuten påvises CDH (Gal-Glc-Cer), som ble fremstilt ved å la Vibrio cholera sialidase virke på gangliosidet GD^
i felt 3, ikke når det ble underkastet TLC-immunofarging. Dette viser klart at Gal-Glc-Cer (CDH)-strukturen ikke er en antigen determinant for det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. I tillegg indikerer båndet som kommer til syne i felt 3 i TLC-immunofargingen, gangliosid GD^ som ikke påvirkes av den ovenfor nevnte sialidase. I figur 2 viser CMH i felt 1 Gal-Cer og CMH i felt 2 Glc-Cer,
og CTH i felt 4 viser Gal-Gal-Glc-Cer.
Det er således funnet at disse strukturene ikke er antigene determinanter for det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse ettersom de ikke ble farget ved hjelp av TLC-immunofargingsteknikken.
Som det sees ovenfor, ble det funnet at den antigene determinant for det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen er N-acetylneuraminsyre-rester.
Hvert felt i figur 2 er som følger:
På samme måte er resultatene oppnådd ved å farge forskjellige gangliosider med N-acetylneuraminsyre-rester ved hjelp av TLC-immunofarging, oppsummert i tabell I nedenunder.
(4) Identifisering av epitop eller antigen determinant for det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse Som i figur 2, viser figur 3 resultatene av kvalitative tester og immunoreaksjoner av forskjellige typer glycolipider erholdt ved TLC-fargingsteknikk (A) og TLC-immunofargingsteknikk (B). I figur 3 viser feltene 2 og 3 resultatene av naturlig forekommende gangliosid, med andre ord N-acetylneuraminsyre med alfa-2—>3-binding. Disse feltene viser klart at N-acetylneuraminsyren med alfa-2—>3-binding har sterk spesifisitet til det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse.
I tillegg viser feltene 4 og 5 resultatene av kjemisk syntetiserte N-acetylneuraminsyrederivater. Disse resultatene indikerer at det syntetiserte gangliosid ikke har spesifisitet til det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse.
Når man tar i betraktning både de foreliggende observa-sjoner og de som ble oppnådd under punkt (3), kan det konklu-deres med at det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse gjenkjenner alfa-2—>3-bindingen i N-acetylneuraminsyre som sin epitop eller antigene determinant.
Feltene i figur 3 vil bli omtalt nærmere nedenunder:
(5) Kvalitativ immunodiffusjonsteknikk (Ouchterlony-teknikk)
Figur 4 viser resultatene oppnådd ved immunodiffusjonsteknikk. Som det sees fra figur 4, er det monoklonale antistoff fremstilt ved hjelp av hybridomet ifølge oppfinnelsen IgM. Ved denne fremgangsmåte ble antiseraene anti-MIgM, anti-MlgG^, anti-MIgG2a, anti-MIgG2b og anti-MIgG3 erholdt kommersielt.
(1) anti-MIgM
(2) anti-MIgGi
(3) anti-MIgG2a
(4) anti-MIgG2b
(5) anti-MIgG3
(6) Det faktum at det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse er IgM demonstreres også gjennom resultatene oppnådd ifølge enzym-merket antistoffteknikk, idet resultatene som ble oppnådd ved fremgangsmåten er oppsummert i tabell II nedenunder.
Claims (3)
1. Monoklonalt antistoff,
karakterisert ved at det er et immunoglobulinmolekyl av IgM-type, er fremstilt ved hjelp av en hybridomcellelinje med ATCC deponeringsnummer HB 9475, binder både GD3-gangliosid og GM3-gangliosid immunologisk og gjenkjenner epitopen N-acetylneuraminsyre som har en a-2-*3-binding.
2. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at gangliosidet er GD3-gangliosid.
3. Hybridomcellelinje,
karakterisert ved at den har ATCC deponeringsnummer HB 9475 og produserer et monoklonalt antistoff som er et immunoglobulinmolekyl av IgM-type, binder både GD3-gangliosid og GM3-gangliosid immunologisk og gjenkjenner epitopen N-acetylneuraminsyre som har en a-2-»3-binding.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62290310A JP2754206B2 (ja) | 1987-11-17 | 1987-11-17 | α２→３結合を認識するモノクローナル抗体 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO885113D0 NO885113D0 (no) | 1988-11-16 |
| NO885113L NO885113L (no) | 1989-05-18 |
| NO173556B true NO173556B (no) | 1993-09-20 |
| NO173556C NO173556C (no) | 1993-12-29 |
Family
ID=17754449
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO885113A NO173556C (no) | 1987-11-17 | 1988-11-16 | Monoklonalt antistoff som gjenkjenner alpha-2-3-bindinger, og hybridomcellelinje som produserer antistoffet |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5141864A (no) |
| EP (1) | EP0316882B1 (no) |
| JP (1) | JP2754206B2 (no) |
| KR (1) | KR960014441B1 (no) |
| CN (1) | CN1042734A (no) |
| AT (1) | ATE108482T1 (no) |
| AU (1) | AU624583B2 (no) |
| CA (1) | CA1337800C (no) |
| DE (1) | DE3850634T2 (no) |
| FI (1) | FI95043C (no) |
| HU (1) | HU204573B (no) |
| IL (1) | IL88400A (no) |
| NO (1) | NO173556C (no) |
| NZ (1) | NZ226974A (no) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4107154A1 (de) * | 1990-10-11 | 1992-04-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Monoklonale antikoerper gegen melanom |
| DE4208795A1 (de) * | 1992-03-19 | 1993-09-23 | Behringwerke Ag | Monoklonaler anti-gangliosid-antikoerper, seine herstellung und verwendung als tumortherapeutikum |
| CN1057128C (zh) * | 1993-09-22 | 2000-10-04 | 南通医学院 | 感觉神经抗体及其制备方法 |
| US5674681A (en) | 1994-12-06 | 1997-10-07 | Rothenberg; Barry E. | Methods to identify hemochromatosis |
| CU23007A1 (es) * | 2001-04-06 | 2004-12-17 | Ct De Inmunologia Molecular Ct De Inmunologia Mole | Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos |
| CN100347296C (zh) * | 2003-03-28 | 2007-11-07 | 财团法人富山县新世纪产业机构 | 使用单个抗原特异性b淋巴细胞制备产生抗原特异性抗体的杂交瘤的方法以及单克隆抗体的制备方法 |
| FI20070199A0 (fi) * | 2007-03-08 | 2007-03-08 | Glykos Finland Oy | Uusia happamia N-glykaanirakenteita |
| EP2606897A1 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-26 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Methods and compositions for the treatment of diseases caused by enveloped viruses |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4507391A (en) * | 1982-04-02 | 1985-03-26 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Method for detecting the presence of GD3 ganglioside |
-
1987
- 1987-11-17 JP JP62290310A patent/JP2754206B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-11-11 KR KR1019880014846A patent/KR960014441B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-11-14 US US07/270,205 patent/US5141864A/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-11-15 EP EP88119045A patent/EP0316882B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-15 NZ NZ226974A patent/NZ226974A/en unknown
- 1988-11-15 DE DE3850634T patent/DE3850634T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-11-15 AT AT88119045T patent/ATE108482T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-11-15 FI FI885279A patent/FI95043C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-11-16 CN CN88107887A patent/CN1042734A/zh active Pending
- 1988-11-16 NO NO885113A patent/NO173556C/no unknown
- 1988-11-16 CA CA000583272A patent/CA1337800C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-11-16 HU HU885935A patent/HU204573B/hu not_active IP Right Cessation
- 1988-11-17 IL IL88400A patent/IL88400A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-11-17 AU AU25186/88A patent/AU624583B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI95043C (fi) | 1995-12-11 |
| CA1337800C (en) | 1995-12-26 |
| FI95043B (fi) | 1995-08-31 |
| HUT48679A (en) | 1989-06-28 |
| FI885279A0 (fi) | 1988-11-15 |
| HU204573B (en) | 1992-01-28 |
| JPH01132374A (ja) | 1989-05-24 |
| CN1042734A (zh) | 1990-06-06 |
| NO885113L (no) | 1989-05-18 |
| EP0316882A3 (en) | 1990-03-14 |
| FI885279A (fi) | 1989-05-18 |
| EP0316882A2 (en) | 1989-05-24 |
| AU2518688A (en) | 1989-05-25 |
| ATE108482T1 (de) | 1994-07-15 |
| IL88400A0 (en) | 1989-06-30 |
| EP0316882B1 (en) | 1994-07-13 |
| NZ226974A (en) | 1990-03-27 |
| DE3850634D1 (de) | 1994-08-18 |
| US5141864A (en) | 1992-08-25 |
| AU624583B2 (en) | 1992-06-18 |
| NO173556C (no) | 1993-12-29 |
| NO885113D0 (no) | 1988-11-16 |
| KR960014441B1 (ko) | 1996-10-15 |
| JP2754206B2 (ja) | 1998-05-20 |
| KR890008320A (ko) | 1989-07-10 |
| DE3850634T2 (de) | 1994-10-27 |
| IL88400A (en) | 1993-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO173556B (no) | Monoklonalt antistoff som gjenkjenner alfa-2-3-bindinger, og hybridomcellelinje som produserer antistoffet | |
| US5158886A (en) | Monoclonal antibodies specific for free N-acetylfuraminic acid and beta-glycosides and beta-glycoconjugates thereof | |
| Brade et al. | A nonsubstituted primary hydroxyl group in position 6'of free lipid A is required for binding of lipid A monoclonal antibodies | |
| AU624440B2 (en) | Anti-fucosylcermiade monoclonal antibody | |
| Mahana et al. | Mice ascites as a source of polyclonal and monoclonal antibodies | |
| AU617492B2 (en) | Monoclonal antibody capable of recognising gangliosides GQ1b and GT1a | |
| Marhaug et al. | Monoclonal hybridoma antibodies to human amyloid related protein SAA. | |
| EP0369425A1 (en) | Monoclonal antibody specifically recognizing N-glycolyl type GM2, hybridoma producing the antibody and method for preparing the hybridoma | |
| JP2706777B2 (ja) | 非天然型ｇｄ▲下３▼を認識するモノクローナル抗体 | |
| METTLER et al. | Monoclonal sperm antibodies: their potential for investigation of sperms as target of immunological contraception | |
| US5443957A (en) | Anti-asialo-GM1 monoclonal antibodies and method of use | |
| JP2743015B2 (ja) | Ｏ―アセチル化されたガングリオシドｇｍ▲下３▼に特異的なモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及びその作製方法 | |
| CA2001360A1 (en) | Monoclonal antibody specifically recognizing sulfated glycolipids |