FI95043B - Menetelmä 2 3-sidoksen tunnistavan monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi ja vasta-ainetta tuottava hybridooma - Google Patents

Description

95043

Menetelmä cu ..-sidoksen tunnistavan mönoklonaalisen vasta-2-»3 aineen valmistamiseksi ja vasta-ainetta tuottava hybridoo-ma 5 Tämä keksintö koskee uutta hybridoomaa sekä mene telmää hybridooman tuottaman siaalihappoa sisältävää gly-kolipidiä vastaan muodostetun monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi.

Tähän asti antiseerumeja on tuotettu adsorboimalla 10 seerumi eri antigeeneillä immunisoidusta eläimestä. Anti-seerumit kuitenkin sisältävät suuren määrän vasta-ainemo-lekyylejä, jotka ovat peräisin eri B-soluista (polyklonaa-lisia) ja aiheuttavat usein ristiinreaktioita muun vasta-aineen kanssa. Siksi on vaikeaa saada aikaan erittäin spe-15 sifistä antiseerumia.

Näissä olosuhteissa Köhler kehitti vuonna 1975 hybridooman, joka tuottaa anti-lampaan punasolu -vasta-ainetta ja joka saadaan aikaan fuusioimalla immunisoidusta eläimestä saatuja pernasoluja ja hiiren myeloomasoluja 20 hybridoomien muodostamiseksi. Klooni, joka on yhdestä so lusta peräisin oleva hybridooma, voidaan eristää sellaisista hybridoomasoluista (ns. "kloonaus") korkean lisään-tymiskykynsä vuoksi. Kaikki sellaisen hybridooman tuottamat vasta-aineet ovat identtisiä, niiden antigeenispesifi-. 25 syys on tasainen ja ne siten tunnistavat tietyn antigeenin saman kohdan. Lisäksi hybridoomat voidaan varastoida jäädytettyinä, esimerkiksi nestemäisessä typessä. Siksi tiet-tyjen vasta-aineiden vakaa saatavuus voidaan varmistaa. Niinpä solufuusiotekniikalla tulee mahdolliseksi saada 30 aikaan monoklonaalinen vasta-aine, joka on erittäin spesifinen tietylle antigeenille.

Vasta-aineet ovat proteiineja, jotka voivat tunnistaa molekyylin tai aineen, jota kutsutaan siihen liittyväksi "antigeeniksi", ja sitoutua siihen. Monoklonaalinen 35 vasta-aine tarkoittaa vasta-ainetta, jossa on kohta, joka 2 95043 spesifisesti tunnistaa tietyn antigeenin, toisin sanoen se tunnistaa vain yhden antigeenideterminantin. Nykyään tunnetaan alalla monia menetelmiä monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi ja niitä tuottavien hybridoomien muo-5 dostamiseksi. Tässä suhteessa voidaan viitata uudehkoon julkaisuun "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", toimittanut John G. Hurrell, 1983.

Nisäkässolujen glykolipidi kuuluu niin sanottujen sfingoglykolipidien luokkaan ja sisältää (a) lipidiraken-10 teen, jota kutsutaan keramidiksi, joka on muodostunut sfingosiiniksi kutsutusta pitkäketjuisesta aminoalkoho-lista, johon rasvahappo on happoamidositoutunut, ja (b) eri kombinaatioista sokereita, jotka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat glukoosi, galaktoosi, N-asetyyliglukosamii-15 ni, N-asetyyligalaktosamiini, fukoosi ja siaalihappo, jotka ovat sitoutuneet rakenteeseen glykosidikytkentöjen välityksellä. Näiden joukossa glykolipidejä, joihin on kiinnittynyt siaalihappotähde, kutsutaan gangliosideiksi.

Useimmat näistä yhdisteistä sijaitsevat yleensä 20 ulommaisessa solumembraanissa, ja viimeaikaisten tutkimusten perusteella on luultu, että gangliosideillä on tärkeä rooli funktioissa, kuten tunnistamisen ja informaation vastaanotossa, reseptorifunktioissa, erilaistumisessa, lisääntymisessä, pahanlaatuisissa muutoksissa tai solujen 25 käyttäytymisessä.

Näiden gangliosidien joukossa GD3-gangliosidit tunnetaan hermosolujen erilaistuneena antigeeninä, ja ne on tunnistettu edelleen ihmisen melanoomasolujen syöpään liittyvänä antigeeninä.

30 Koska monoklonaalinen vasta-aine on hyvin spesifi nen tietylle antigeenille ja voi siten havaita tämän herkästi, kuten yllä on kuvattu, jos saadaan aikaan GD3-gang-liosideille spesifinen monoklonaalinen vasta-aine, voidaan olettaa, että sellaista monoklonaalista vasta-ainetta käy-35 tettäisiin syöpien diagnoosiin (syöpämerkkinä) ja immuno-

II

3 95043 logiseen hoitoon samoin kuin sokeriketjun roolin selvittämiseen solufunktioissa.

Niinpä tämän keksinnön ensisijainen tavoite on tuottaa hybridooma, joka kykenee tuottamaan monoklonaali-5 sta vasta-ainetta, joka on spesifinen tietylle antigeeniselle determinantille GD3-gangliosidissa, joka tunnetaan ihmisen melanoomasolujen syöpään liittyvänä antigeeninä.

Esitetään myös menetelmä sellaisen hybridooman tuottamiseksi.

10 Lisäksi tämän keksinnön tarkoitus on tarjota mene telmä GD3-gangliosidin spesifisille antigeeniselle determinantille spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi.

Tämän keksinnön keksijät ovat suorittaneet erilai-15 siä tutkimuksia eliminoidakseen edellä mainitut haitat ja ovat huomanneet, että solufuusiotekniikassa puhdistettua GD3-gangliosidia käytetään antigeeninä hybridooman muodostamiseksi, joka kykenee tuottamaan haluttua monoklonaa-lista vasta-ainetta, ja siten on saatu aikaan tämä kek-20 sintö.

Esillä oleva keksintö koskee hybridoomaa, joka tuottaa monoklonaalista vasta-ainetta, joka sitoo immuno-logisesti gangliosideja ja tunnistaa N-asetyylineuramiini-happoepitoopin, jossa on c^^-sidos, ja jonka ATCC-talle-25 tustunnus on HB 9475.

Tällaista monoklonaalista vasta-ainetta tuottava hybridooma valmistetaan menetelmällä, jossa yhdistetään (i) B-soluja (B-lymfosyyttejä), jotka on saatu immunisoimalla eläin käyttäen antigeeninä siaalihappoa sisältäviä 30 glykolipidejä, joissa on c^^g-sidoksen sisältävä N-ase- tyylineuramiinihappotähde, ja (ii) myeloomasoluja.

Esillä oleva keksintö koskee lisäksi menetelmää monoklonaalisen vasta-aineeen valmistamiseksi, joka sitoo immunologisesti gangliosideja ja tunnistaa N-asetyylineu-35 ramiinihappoepitoopin, jossa on c^^g-sidos. Menetelmälle 4 95043 on tunnusomaista, että viljellään hybridoomasolulinjaa ATCC HB 9475 ja otetaan vasta-aine talteen viljelysuperna-t anti st a.

Kuvio 1 kuvaa keksinnön mukaisesti valmistettujen 5 monoklonaalisten vasta-aineiden spesifisyyttä antigeeneille GD3 ja GM3 määritettynä entsyymileimattu vasta-aine -tekniikalla.

Kuviot 2 ja 3 kuvaavat erilaisten gangliosidien an-tigeenispesifisyyttä keksinnön mukaisesti valmistetulle 10 monoklonaaliselle vasta-aineelle; ja

Kuvio 4 on kaavio, jota on käytetty keksinnön mukaisesti valmistetun monoklonaalisen vasta-aineen luokittamiseen.

Keksintöä selitetään yksityiskohtaisemmin alla.

15 Keksinnön mukainen hybridooma voidaan luoda yhdis tämällä B-soluja (B-lymfosyyttejä), jotka on saatu eläimestä, joka on immunisoitu antigeenillä, Köhlerin ja Mill-steinin menetelmän mukaisesti (katso Nature 1975). Tässä käytetty "antigeeni" on esimerkiksi gangliosidit, jotka 20 sisältävät N-asetyylineuramiinihappotähteen, jossa on °2-»3-sidos, edullisesti gangliosidiglykolipidit, jotka sisältävät N-asetyylineuramiinihappotähteen, jossa on a2-*3-sidos. sidos. Esimerkkejä niistä ovat seuraavat: 25 (A) GD3

Gal-Glc-Cer i

NeuAc

NeuAc 30 (B) GM3

Gal-Glc-Cer

NeuAc 5 95043 (C) GM;

GalNAc-Gal-Glc-Cer

NeuAc

5 (D) GMX

Gal-GalNAc-Gal-Glc-Cer

NeuAc (E) GDla

Gal-GalNAc-Gal-Glc-Cer

I I

10 NeuAc NeuAc (F) GTla

Gal-GalNAc-Gal-Glc-Cer

I I

NeuAc NeuAc 15 NeuAc (G) GM<

Gal-Cer

NeuAc 20 (H) GD2

GalNAc-Gal-Glc-Cer I

NeuAc

NeuAc : 25 (K) GTlb

Gal-GalNAc-Gal-Glc-Cer I I

NeuAc NeuAc

NeuAc 30 (L) GQlb

Gal-GalNAc-Gal-Glc-Cer I I

NeuAc NeuAc

I I

NeuAc NeuAc 35 6 95043

Keksinnön mukaisen hybridooman tuottama monoklonaa-linen vasta-aine tunnistaa N-asetyylineuramiinihapon, jossa on sidos epitooppina tai antigeenisenä determi nanttina ja joka reagoi spesifisesti sen kanssa. Siksi 5 hybridooman tuottama monoklonaalinen vasta-aine on erityisen reaktiivinen siaalihappoa sisältävien glykolipidien kanssa, joissa on N-asetyylineuramiinihappotähde, jossa on cu^^-sidos, erityisesti GD3- ja GM3-gangliosidien kanssa. Lisäksi monoklonaalinen vasta-aine on samalla tavoin spe-10 sifinen mille tahansa näistä siaalihappoja sisältävistä glykolipideistä lähde-eläimestä riippumatta.

Eläimet, jotka immunisoidaan siaalihappoa sisältävä glykolipidiantigeenilla voivat olla mitä tahansa eläimiä. Esimerkkejä niistä ovat kani, ihminen, hiiri ja rot-15 ta, edullisesti hiiri ja edullisemmin Balb/c hiiri.

B-solut (B-lymfosyytit), jotka tuottavat keksinnön monoklonaalista vasta-ainetta ovat edullisesti peräisin pernasoluista. Toisaalta tässä keksinnössä käytetyt "mye-loomasolut" voivat olla myös peräisin mistä tahansa eläi-20 mestä, kuten ihmisestä, hiirestä, rotasta ja kanista, edullisesti ne ovat hiirestä ja edullisemmin myeloomasolu-ja (X63-Ag8.653) Balb/c-hiirestä. Näillä myeloomasoluilla on erittäin suuri lisääntymiskyky, joten hybridooma, joka on luotu yhdistämällä ne B-soluihin voi jatkuvasti tuottaa ; 25 keksinnön monoklonaalista vasta-ainetta.

Keksinnön mukainen hybridooma voidaan valmistaa menetelmällä, joka kuvataan tarkemmin alla.

Ensinnäkin GD3-gangliosidia ruiskutetaan hiiriin intraperitoneaalisesti, subkutaanisesti tai intravenoosi-30 sesti, edullisesti intravenoosisesti niiden immunisoimi- seksi. Tässä immunisaatiossa voidaan käyttää joko epätäydellisiä adjuvantteja tai täydellisiä adjuvantteja adju-vantteina eli aineina immunologiseen tehostamiseen, ja esimerkkejä näistä ovat öljyt, emulgoivat aineet, tapetut 7 95043 tuberkuloosibasillit, tapetut salmonellat ja niiden seokset, edullisesti tapettu Salmonella mlnesota intraperito-neaaliseen tai subkutaaniseen injektioon ja intravenoosi-seen injektioon. Näitä antigeenejä ja adjuvantteja käyte-5 tään edullisesti liuoksena, jolla on suunnilleen fysiologisesti hyväksyttävä koostumus, kuten liuoksena fosfaatti-puskuroidussa suolaliuoksessa.

Tässä immunisaatiossa on huomattava, että on vaikeaa herkistää immunisoitavaa eläintä itsekomponenteilla, 10 ja siksi on periaatteessa edullista valita sellainen eläin, joka on fenogeneettisesti kaukana siitä, josta an-tigeeniaine on saatu. Immunisaatio voidaan kuitenkin myös suorittaa in vitro sellaisten vaikeuksien välttämiseksi.

Sitten B-solut ja myeloomasolut yhdistetään. Solu-15 fuusioaineena voidaan käyttää polyetyleeniglykolia ja HVJ:tä, edullisesti polyetyleeniglykooli 6000:tta. Lisäksi on edullista käyttää HAT-alustaa viljelyalustana, jotta hybridoomasolut voitaisiin helposti eristää fuusioitumattomista myeloomasoluista.

20 Sen jälkeen syntyville hybridoomasoluille suorite taan kloonaus esimerkiksi metyyliselluloosatekniikalla, pehmeäagaroositekniikalla tai rajoittavan laimennuksen tekniikalla halutun yhden kloonatun hybridooman eristämiseksi .

; 25 Siten muodostetun monoklonaalista vasta-ainetta tuottavan hybridooman vasta-ainetiitteri voidaan tutkia tavalliseen tapaan sellaisen hybridooman valitsemiseksi, jolla on korkea vasta-ainetiitteri. Siten valittu hybri-dooma säilötään.

30 Keksinnön hybridooman tuottamaa monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää ihmisen tai eläinten syöpä-kudoksissa luonnossa esiintyvän glykolipidiantigeenin havaitsemiseen. Siksi monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää esimerkiksi ELISA- ja RIA-määrityksissä, joita 35 yleensä käytetään syöpään liittyvien gangliosidien havait- β 95043 semiseen. Lisäksi tämän keksinnön monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää affiniteettikromatografiassa siihen sitoutumaan kykenevien antigeenien puhdistamiseksi. Jos monoklonaalinen vasta-aine leimataan radioisotoopilla, 5 sitä voidaan käyttää tuumorin havaitsemiseen tai sen oikean sijainnin havaitsemiseen, samoin sitä voidaan käyttää suurena annoksena tuumorista kärsivien potilaiden hoitoon. Se voidaan myös kytkeä mihin tahansa kemoterapeuttiseen aineeseen sen tekemiseksi myrkyllisemmäksi syöpäsoluille. 10 Keksinnön mukaisesti saatua monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää hoidettaessa tai diagnosoitaessa lajeja, joissa on antigeeni, kuten ihmistä tai eläimiä, kuten hiirtä. Odotetaan, että keksinnön mukaisesti valmistettua monoklonaalista vasta-ainetta voidaan soveltaa hermosolu-15 jen perustutkimukseen ja käyttää eri kliinisiin tarkoituksiin.

Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin viitaten seuraaviin ei-rajoittaviin työesimerkkeihin.

Esimerkki 20 (A) Antigeenin valmistus (1) GD3- ja GMj-gangliosidien uutto ja puhdistus

Kun sian adrenaliinia oli homogenisoitu kylmässä asetonissa ja kuivattu, kuivattu tuote uutettiin kloro-formi-metanolilla tavalliseen tapaan.

; 25 Syntyvää näytettä käsiteltiin emäksellä, ja sitten GD3-gangliosidi puhdistettiin käyttäen DEAE-Sephadex A-25 -anionivaihtohartsia ja Iatrobeads-kolonnia.

GM3-gangliosidi valmistettiin sentrifugoimalla koiran seerumia, jota oli käsitelty hepariinilla, pesemällä 30 syntyvä sedimentti kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS(-)), lyofilisoimalla se ja sitten uuttamalla tuote kloroformimetanolilla. Sen puhdistus suoritettiin samoin kuin yllä.

Gangliosidit GDla, GDlb, ja GQlb olivat saatavilla 35 DIATRON CO., LTDrstä, gangliosidit Gal-Cer ja Glc-Cer Sig- 9 95043 ma Companystä ja GTlb ja GM2 FUNAKOSHI Companystä, ja näitä käytettiin ilman enempää puhdistusta.

Nämä gangliosidiglykolipidit liuotettiin kloroformi -metanoliin (1:1, v/v) tai etanoliin ja varastoitiin 5 -20eC:ssa.

(2) Eläin

Kuusi naaraspuolista, 6 viikon ikäistä Balb/c-hiir-tä käytettiin kokeisiin, kun ne oli kasvatettu normaaleissa oloissa.

10 (3) Antigeeniliuoksen valmistus

Sian lisämunuaisesta uutettua ja sitten puhdistettua gangliosidia GD3 ja Salmonella minesota R 595 -kantaa käsiteltynä etikkahapolla (painosuhde = 1:4) ja dietyyli-eetterillä sekoitettiin PBS(-):ssä niin, että GD3-ganglio-15 sidin konsentraatio oli 100 pg/ml, ja syntyvää liuosta käytettiin antigeeniliuoksena.

(4) Viljelyalusta

Viljelyalusta: Nissui RPMI 1640:ä (toimittaja Nis-sui Seiyaku, Tokio, Japani) käytettiin viljelyalustana. 20 Alustaan lisättiin kanamysiinisulfaattia ja naudan fetaa-liseerumia (FBS) niin, että niiden lopulliset konsentraa-tiot olivat 50 pg/ml ja 10 % ennen käyttöä.

HAT-alusta: 0,0388 g tymidiiniä ja 0,1361 g hypok-santiinia liuotettiin 100 ml:aan tislattua vettä kuumen-. 25 taen, ja syntyvä liuos (a) varastoitiin 20 °C:ssa varas- toliuoksena, jonka konsentraatio oli 100-kertainen haluttuun nähden. Samoin liuotettiin 0,0176 g aminopteriinia 100 ml:aan tislattua vettä lisäämällä pieni määrä 1 N nat-riumhydroksidin vesiliuosta, ja tämä laimennettiin kymmen-30 kertaisesti RPMI 1640 -viljelyalustalla, ja syntyvä liuos (b) varastoitiin valolta suojattuna -20 eC:ssa varasto-liuoksena, jonka konsentraatio oli 100-kertainen haluttuun nähden. HAT-alusta valmistettiin lisäämällä 1/100 tilavuus kumpaakin näitä liuoksia 10-%:inen FBS - RPMI 1640 35 -alustaan juuri ennen käyttöä.

10 95043 π _

Lisäksi HT-alustaa valmistettiin yksinkertaisesti lisäämällä 1/100 tilavuus varastoliuosta (a), joka sisälsi hypoksantiinia ja tymidiiniä, samaan 10-%:inen FBS - RPMI 1640 -alustaan.

5 (5) Isäntäsolut

Solufuusion isäntäsoluina käytettiin myeloomasoluj a (C63-Ag8-6.5.3-soluja), jotka saatiin Balb/c hiiristä.

Näitä soluja jatkoviljeltiin RPMI 1640 -alustassa, johon lisättiin 10 % FBS:a, inhiboiden mutanttien syntymistä li-10 säämällä 6-tioguaniinia alustaan siten, että sen konsent-raatio oli 3 pg/ml.

(B) Hybridooman valmistus (1) Immunisaatiomenetelmä

Naaraspuolisia, 6 viikon ikäisiä Balb/c hiiriä im-15 munisoitiin injektoimalla seuraavaa immunogeeniliuosta seuraavan immunisointiaikataulun mukaisesti (injektoitu määrä ilmaistiin gangliosidin määränä): alunperin 5 pg, 10 pg päivänä 4, 15 pg päivänä 7 HL, 20 pg päivänä 12 ja 20 pg päivänä 79 aloittamisen jälkeen. Päivänä 3 viimeisen 20 immunisaation jälkeen hiiret tapettiin niiden pernan poistamiseksi ja valmistettiin suspensio yksittäisistä perna-soluista käytettäväksi myöhemmin solufuusiossa.

Immunogeeniliuos: 100 pg sian lisämunuaisesta uutettua ja puhdistettua GD3-gangliosidia ja 400 pg Salmonel-25 la minesotaa R 595 adjuvanttina sekoitettiin 1 ml:ssa PBS(-) (Ca+*- ja Mg~-vapaa), ja syntyvä liuos laimennettiin sitten sopivasti käytettäväksi immunogeeniliuoksena.

(2) Solufuusio

Yllä saatujen pernasolujen ja hiiren myeloomasolu-30 jen fuusio suoritettiin Köhlerin ja Millsteinin menetelmän mukaisesti. Tarkemmin, 1 x 10® pernalymfosyyttiä fuusioitiin 2 x 107 myeloomasoluun 50 % polyetyleeniglykolin (PEG 6000) läsnäollessa viljelmäalustassa.

(3) Hybridooman valinta ja lisäys 35 Solufuusion jälkeen syntyviä soluja viljeltiin 11 95043 HAT-alustassa (hypoksantiini, aminopteriini ja tymidiini) 37 °C:ssa 5 % C02:n läsnäollessa.

Siten aikaansaatu hybridooma oli talletettu American Type Culture Collection (ATCC) -talletuslaitokseen 5 talletusnumerolla ATCC HB 9475.

(C) Monoklonaalisen vasta-aineen reaktiivisuuden arviointi gangliosideilla 96-kaivoinen, tasapohjainen levy (toimittaja Falcon Co., Ltd.) esikäsiteltiin etanolilla ennen käyttöä kokeis-10 sa. 50 μΐ kutakin antigeeniliuosta (immunogeeniliuosta), jotka oli laimennettu etanolilla GD3-gangliosidin konsent-raation säätämiseksi arvoon 20 pg/ml (optimikonsentraa-tio), pipetoitiin levyn kaivoihin, ja liuotin haihdutettiin niistä, 200 μΐ l-%:ista övalbumiinin PBS(-)-liuosta 15 pantiin kaivoihin, ja niiden annettiin seistä 30 minuuttia huoneenlämmössä. Levyä ravistettiin sen ollessa ylösalaisin liuoksen poistamiseksi, sitten lisättiin 50 μΐ hybri-doomaviljelyaluetaa kuhunkin ensimmäisenä vasta-aineena, ja levyn annettiin seistä 1,5 tuntia huoneenlämmössä. Sa-20 moin ensimmäinen vasta-aine poistettiin kaivoista, ja kaivot pestiin kolme kertaa lisäämällä 150 μΐ PBS(-)-liuosta ja annettiin seistä 30 minuuttia huoneenlämmössä sen jälkeen, kun oli lisätty kuhunkin 100 μΐ l-%:ista ovalbumii-nin PBS(-)-liuosta. Tämän liuoksen poiston jälkeen lisät-25 tiin kuhunkin 50 μΐ toista vasta-ainetta laimennettuna optimikonsentraatioonsa l-%:isen övalbumiinin PBS()-liuoksella ja annettiin seistä 1,5 tuntia huoneenlämmössä. Kuten ensimmäisenkin vasta-aineen tapauksessa kaivot pestiin kolme kertaa PBS(-)-liuoksella, ja kuhunkin lisättiin 30 100 μΐ reaktioliuosta pimeäreaktion aikaansaamiseksi.

Reaktioliuos valmistettiin liuottamalla sitraatti-fosfaat-tipuskuriin (pH = 5) o-fenyleenidiamiinia ja vetyperoksidia siten, että niiden konsentraatiot olivat 0,4 mg/ml ja 0,01 %. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 30 μΐ 8 N rikki-35 happoa, ja sitten tuotetta tutkittiin kolorimetrisesti 500 nm:ssä. Toisena vasta-aineena käytettiin vuohen anti- 12 95043 hiiri-IgG, -IgM ja -IgA -vasta-aineita, jotka oli leimattu piparjuuriperoksidaasilla (HRP).

Saadut tulokset on kuvattu kuvassa 1, jossa täytetty ympyrä esittää gangliosidia GM3 ja avoin ympyrä esittää 5 gangliosidia GD3.

Kuten voidaan nähdä tuloksista kuvassa 1, ganglio-sidit GD3 ja GM3 aiheuttavat antigeeni-vasta-aine reaktioi-• ta tämän keksinnön mukaisesti valmistetun monoklonaalisen vasta-aineen kanssa herkästi. Siten molemmissa gangliosi-10 deissa GD3 ja GM3 on antigeenideterminantti tätä monoklo-naalista vasta-ainetta vastaan. Tässä yhteydessä ganglio-sidi GD3 on enemmän reaktiivinen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa kuin gangliosidi GM3. Siksi todetaan, että gan-gliosidissa GD3 on epitooppi tai antigeeninen determinant-15 ti, joka on spesifisempi keksinnön mukaisesti valmistetun monoklonaalisen vasta-aineen suhteen.

(2) TLC-immuunivärj äysmenetelmä

Silikageeliohutkerroskromatografialevy (TLC(polygram SIL G)) leikattiin sopivan kokoisiksi palasiksi ja 20 läiskitettiin pienellä tipalla liuosta, jossa oli glykoli-pidiä kloroformi-metanolissa (1:1, v/v). Tarkoituksesta riippuen levy kehitettiin kehitysliuoksella, kuten kloroformi -metanoli -vesi (60/40/10; v/v), kloroformi-metanoli-0,5 %:inen CaCl2-liuos (55/45/10; v/v) tai kloroformi-meta-25 noli-2,5 N NH40H-liuos (60/40/9; v/v) ja annettiin sitten seistä l-%:inen ovalbumiini - l-%:inen polyvinyylipyrroli-doni (K-30) - PBS(-) -liuoksessa 4 °C:ssa yön yli. Sitten sitä ravistettiin 2 tuntia huoneenlämmössä Upottaen ensimmäiseen vasta-aine-liuokseen. Riittävän pesun jälkeen 30 PBS(-):lla se upotettiin l-%:inen ovalbumiini - l-%:inen polyvinyylipyrrolidoni (K-30) - PBS(-) -liuokseen huoneenlämmössä 30 minuutiksi. Levy poistettiin sieltä, upotettiin 2 tunniksi toiseen vasta-aineeseen, joka oli liuotettu optimikonsentraatioonsa 3-%:inen polyvinyylipyrrolidoni 35 (K-30) - PBS(-) -liuoksella ravistaen, pestiin riittävästi PBS(-):lla ja siihen lisättiin reaktioliuos. Reaktioliuos li 13 95043 valmistettiin liuottamalla 4 mg 4-kloori-l-naftolia 1 ml:aan metanolia, lisäämällä 50 mmol tris(hydroksimetyy-li)aminometaania, 200 mmol NaCl:a ja 5 ml puskuria (pH * 7,4) ja lisäämällä sitten vetyperoksidia siten, että sen 5 konsentraatio oli 0,01 %. Reaktio pysäytettiin pesemällä levy vedellä, minkä jälkeen levy kuivattiin ilmassa.

(3) Tämän keksinnön mukaisesti valmistetulle monoklo-naaliselle vasta-aineelle spesifisten epitooppien tunnistaminen 10 Kvalitatiivisista testeistä ja immuunireaktioista erilaisilla glykolipideillä TLC-värjäysmenetelmällä (orsi-nolivärjäys) (A) ja TLC-immuunivärjäysmenetelmällä (B) saadut tulokset esitetään kuviossa 2. Kuviossa 2 esitetyistä tuloksista huomataan, että kaistan 5 gangliosidissa 15 GD3 on antigeenideterminantti, joka on spesifinen tämän keksinnön mukaisesti valmmistetulle monoklonaaliselle vasta-aineelle.

Lisäksi kaistan 3 CDH:ta (Gal-Glc-Cer), joka muodostettiin käyttämällä Vibrio cholera -sialidaasia gang-20 liosidille GD3, ei havaittu, kun sille suoritettiin TLC-immuunivärjäys. Tämä osoittaa selvästi, että Gal-Glc-Cer (CDH) -rakenne ei ole antigeeninen determinantti tämän keksinnön mukaisesti valmistetulle monoklonaaliselle vasta-aineelle. Lisäksi nauha, joka on TLC-immuunivärjäyksen ; 25 kaistalla 3, esittää gangliosidia GD3, johon edellä mainit tu siaiidaasi ei vaikuta. Kuviossa 2 kaistan 1 CMH esittää Gal-Cer:iä ja kaistan 2 CMH esittää Glc-Cer:ä ja kaistan 4 CTH esittää Gal-Gal-Glc-Cer:iä.

Siten huomataan, etteivät nämä rakenteet ole tämän 30 keksinnön mukaisesti valmistetun monoklonaalisen vasta-aineen antigeenisiä determinantteja, koska ne eivät värjäytyneet TLC-immuunivärjäysmenetelmällä.

Kuten edellä olevasta havaitaan, keksinnön mukaisesti valmistetun monoklonaalisen vasta-aineen antigeeni-35 nen determinantti on N-asetyylineuramiinihappotähteet.

14 95043

Kaistat kuviossa 2 ovat seuraavat: (1) Kaista 1: CMH (Gal-Cer) (ihmisen aivot) 1 pg (2) Kaista 2: CMH (Glc-Cer) (ihmisen aivot) 1 pg (3) Kaista 3: CDH (käyttämällä (Vibrio cholera 1 pg 5 -sialidaasia GD3:lle) (4) Kaista 4: CTH (kemiallisesti 1 pg syntetisoitu tuote) (5) Kaista 5: GD3 1 pg 10 Tulokset, jotka saatiin värjäämällä erilaisia gangliosideja, joissa on N-asetyylineuramiinihappotähtei-tä, TLC-immuunivärjäyksellä, on esitetty alla olevassa taulukossa 1.

15 TAULUKKO I

TLC-immuunivärjäystestin tulokset

Antigeeni (100 pmol) ATCC HB 9475 GM3 ++++++ GD3 ++++++ 20 GDla ++ GDlb + GTlb ++ GQlb +++ : ei havaittu.

; 25 Näytteet 578 nm

Kontrolli 710 nm

Vasta-ainetiitteri + < 20 000 30 20000 < ++ < 10 000 40000 < +++ < 60 000 60000 < ++++ < 80 000 80000 < +++++ < 100 000 100000 < ++++++ 35 15 95043 (4) Epitoopin tai antigeenisen determinantin tunnista minen tämän keksinnön mukaisesti valmistetulle monoklonaa-liselle vasta-aineelle

Kuten kuvio 2 myös kuvio 3 esittää erilaisilla 5 glykolipideillä kvalitatiivisissa testeissä ja immuuni-reaktioissa TLC-värjäysmenetelmällä (orsinolivärjäys) (A) ja TLC-immuunivärjäysmenetelmällä (B) saatuja tuloksia. Kuviossa 3 kaistat 2 ja 3 ovat tuloksia luonnossa esiintyvistä gangliosideista, toisin sanoen N-asetyylineuramii-10 nihaposta, jossa on c^^-sidos. Nämä kaistat osoittavat selvästi, että N-asetyylineuramiinihapolla, jossa on «2-»3~ sidos, on voimakas spesifisyys tämän keksinnön mukaisesti valmistetulle monoklonaaliselle vasta-aineelle.

Lisäksi kaistat 4 ja 5 esittävät tuloksia kemial-15 lisesti syntetisoiduista N-asetyylineuramiinijohdannaisis-ta. Nämä tulokset osoittavat, että syntesoitu gangliosidi ei ole spesifinen tämän keksinnön mukaisesti valmistetulle monoklonaaliselle vasta-aineelle.

Otettaessa huomioon synteettisesti sekä nämä huo-20 miot että ne, jotka saatiin kohdassa (3), voidaan päätellä, että tämän keksinnön mukaisesti valmistettu monoklo-naalinen vasta-aine tunnistaa N-asetyylineuramiinihapon a2-»3-sidoksen epitooppinaan tai antigeenisenä determinanttinaan .

: 25

Kaistat kuvassa 3 ovat seuraavat: (1) Kaista 1: CM3 1 pg (2) Kaista 2: N-asetyylineuramiinihappo 1 pg (NANA) a2^3 ^ 30 β1->1 Cer (3) Kaista 3: N-asetyylineuramiinihappo 1 pg (NANA) Gal ®1-*1 Cer 95043 16 (4) Kaista 4: N-asetyylineuramiinihappo 1 pg (NANA) β2_3 Gal “l-»l Cer (5) -Kaista 5: -N-asetyylineuramiinihappo 1 pg 5 (NANA) B2j3 Gal B1 ·] Cer (6) Kaista 6: CD3 1 pg ( 5) Kvalitatiivinen immuunidif fusiomenetelmä (Ouchter- 10 lonyn menetelmä)

Kuva 4 esittää tulokset, jotka saatiin immuunidif-fuusiomenetelmällä. Kuten nähdään kuvasta 4, tämän keksinnön mukaisen hybridooman tuottama monoklonaalinen vasta-aine on IgM. Tässä menetelmässä antiseerumit anti-MIgM, 15 anti-MIgGi, anti-MIgG2a, anti-MIgG2b ja anti-MIgG3 saatiin

Miles Companystä.

(1) anti-MIgM

(2) anti-MIgG! (3) anti-MIgG2a 20 (4) anti-MIgG2b (5) anti-MIgG3 (6) Sen tosiasian, että tämän keksinnön mukaisesti : valmistettu monoklonaalinen vasta-aine on IgM, osoittavat 25 myös tulokset, jotka saatiin entsyymileimattu vasta-aine -menetelmällä, yhteenveto näistä tuloksista on taulukossa II alla.

Il

Claims (1)

17 95043 TAULUKKO II Toinen vasta-aine Hybridoomasta saatu vasta-aine + anti-hiiren IgM 0,977 ± 0,079 0,066 ± 0,007 5 anti-hiiren IgG3 0,131 ± 0,011 0,062 ± 0,011 anti-hiiren IgG2. 0,137 ± 0,013 0,109 ± 0,010 anti-hiiren IgG2b 0,121 ± 0,003 0,072 ± 0,006 anti-hiiren IgG3 0,131 ± 0,007 0,046 ± 0,003 0D (Optinen tiheys) 500 nm 10 Antigeeni: GD3 500 ng/kaivo Kolmas vasta-aine: vuohen anti-kanin Ig - HRP i .