JP2849683B2 - 「動物及びヒトのムチンを用い、並びに合成炭水化物−担体結合物を用いた免疫による、ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体」 - Google Patents

「動物及びヒトのムチンを用い、並びに合成炭水化物−担体結合物を用いた免疫による、ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体」

Info

Publication number
JP2849683B2
JP2849683B2 JP1504002A JP50400289A JP2849683B2 JP 2849683 B2 JP2849683 B2 JP 2849683B2 JP 1504002 A JP1504002 A JP 1504002A JP 50400289 A JP50400289 A JP 50400289A JP 2849683 B2 JP2849683 B2 JP 2849683B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antigen
mucin
antibody
monoclonal antibody
sialyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP1504002A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH02503387A (ja
Inventor
トマス ジェイ ジェルドソン
ヘンリック クローゼン
アニル シンガイ
タツシ トヨクニ
ヘリオ タカハシ
センイチロー ハコモリ
Original Assignee
オオツカ アメリカ ファーマシューティカル、インコーポレーティッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by オオツカ アメリカ ファーマシューティカル、インコーポレーティッド filed Critical オオツカ アメリカ ファーマシューティカル、インコーポレーティッド
Publication of JPH02503387A publication Critical patent/JPH02503387A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2849683B2 publication Critical patent/JP2849683B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/00117—Mucins, e.g. MUC-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A61K2039/645—Dendrimers; Multiple antigen peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はヒト癌関連抗原に特異的なモノクローナル抗
体の製造方法並びにそれにより製造されるハイブリドー
マ及びモノクローナル抗体に関する。より詳細には本発
明は化学構造が明らかにされた精製抗原を免疫原として
用いるヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体の新
規な製造方法に関し、該方法においては目的のモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を化学構造の
明らかにされたムチン型糖蛋白質を用いて選択する。本
方法は、従来のヒト癌関連抗原に対するモノクローナル
抗体の製造法に比較して、多くの余分なステップを省く
ことができる。さらに本発明は、新規な方法で製造され
たハイブリドーマおよびそのハイブリドーマから分泌さ
れるモノクローナル抗体にも関する。上記本発明に係わ
るハイブリドーマは従来法により製造されたハイブリド
ーマと同様に質的に優れ、又上記ハイブリドーマにより
産生されるモノクローナル抗体も従来法により産生され
る抗体と同様に質的に優れ、むしろ望ましくない交叉反
応性を示さない点でより優れていることが認められた。
本発明はさらに、ムチン型糖蛋白質に対するIgGモノ
クローナル抗体で癌患者を受動免疫する方法及びムチン
型糖蛋白質又は担体高分子に結合させた合成多糖類で能
動免疫することに基づくワクチンの製造方法にも関す
る。
発明の背景 ヒト癌細胞での免疫による多数のモノクローナル抗体
が、ヒト癌細胞ラインに対する正の反応性及び正常組織
や正常細胞ラインに対する負の反応性により選択され
た。これらの抗体の多くは、ムチン型糖蛋白質に対する
ものと同定され、多数のＯ−結合性オリゴ糖類を有しジ
スルフィド結合のある非常に異質の高分子量ポリペプチ
ドとして特徴づけられる。Ｏ結合性オリゴ糖類の大部分
は二糖からなる核構造（Galβ１→3Ga1NAcα１→Ｏ−Se
r/Thr）を有し、これにシアル酸、フコース、Ｎ−アセ
チルグルコサミンのような糖残基が結合して、ヒトでは
非常に複雑な構造を形成する。これらのムチン型糖蛋白
質は主に上皮細胞に存在し、ゴブレット細胞から分泌さ
れて粘液分泌物を形成する。
腫瘍形質転換に関連して多くの糖鎖の合成がブロック
される［Hakomori S.,Murakami W.T.,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,59,254−261（1968）;Hakomori S.,Cancer Re
s.,45,2405−2414（1985）］。多くのヒト癌では、ムチ
ン型糖蛋白質の炭水化物鎖の合成もまた強くブロックさ
れ、その結果末梢構造の無い、即ち核構造の修飾は無
く、短い炭化水素鎖を有するムチン型糖蛋白質が、多く
形成される。これらの不完全なオリゴ糖鎖を有する糖蛋
白質のうちT,Tn,およびシアリル−Tnが同定されてい
る。これらは正常組織に潜在形態で存在する全てのムチ
ン型糖蛋白質の、一般的な核構造である［Springer G.,
Sience,224,1198−1206,（1984）;Hirohashi S.et al.P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7039−7043,（1985）］。
ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体を製造す
る現行の方法では、免疫原として癌組織ホモジネート又
は癌細胞ラインを使用し、産生する抗体の特異性を多数
の癌細胞及び組織切片を用いて分析することによりハイ
ブリドーマを選択する。
例えば、糖蛋白質のセリン又はトレオニンに結合する
α−GalNac残基と血液型Ａとの交叉反応抗原性について
は、Uhlenbruckにより報告されており、血液型Ａ赤血球
を優先的に凝集させる種々のGalNacレクチン（Helix po
matia,Soja hispeda及びSarothamnus sclparius）によ
って検出されるTn抗原に関連がある。エピトープは、ト
ランスメンブレン糖蛋白質及びムチン型糖蛋白質中に存
在するＯ−結合炭化水素鎖の最深部にあるα−GalNAc残
基に相当する。従って、この抗原は正常細胞又は分泌物
中では隠れており、脱シアル化の後スミス分解すると現
出する［Dahr,W.,et al.,Vox Sang.,27,29−42（197
4）］。Tn抗原についてはSpringerらも報告しており、
トムセン−フリーデレイヒ（Thomsen−Friedenreich）
抗原（Ｔ抗原）の前駆体に関連し、Tn及びＴ抗原は乳癌
［Springer G.F.,et al,J.Natl.Cancer Inst.,54,335
（1975）］及び種々の他の癌［Springer G.F.,et al,Ca
ncer556,561−569（1985）］で発現する。しかし、この
抗原が種々のタイプのヒト癌で広く発生すること及び正
常組織では分布が限定されていることは、このエピトー
プに特異的なモノクローナル抗体が最近になって確立さ
れるまでは良く理解されていなかった［Hirohashi S.et
al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7039−7043,（198
5）］。マウスにヒト肺偏平上皮細胞癌Lu65を免疫した
後、腫瘍に対し特異的に反応し正常組織とは反応しない
ことにより選択し、IgM抗体NCC−LU−35及びNCC−LU−8
1が最初に確立された。これらの抗体はＡ抗原と交叉反
応性を有し、Tn抗原に対するものと同定された［Hiroha
shi S.,Murakami W.T.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,703
9−7043,（1985）］。NCC−LU−35については血液型Ａ
抗原との大きな交叉反応性が示され、NCC−LU−81につ
いては交叉反応性がより少ないことが示されたにもかか
わらず、これらの抗体により、特に血液型Ｏ及びＢに個
体の腫瘍中でTn抗原を確認できる。これらの抗Tn抗体の
反応性が非Ａ型腫瘍組織に高度に制限されることが見出
だされたため［Hirohasi S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,82,7039−7043,（1985）］、血液型Ａと交叉反応
性しないIgGクラスの抗Tn抗原の獲得が強く望まれてい
る。なぜならIgG抗体のみが腫瘍細胞で抗体異存性の細
胞障害効果を発揮できるからである［Young,W.W.,Jr.an
d Hakomori,S.,Science,211,487−489（1981）;Houghto
n,A.N.,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,1242−1246
（1985）;Herberman,R.B.,et al,In:R.A. Reisfeld an
d S.Sell（eds.）,Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy,pp.193−203,AlanR,Liss,Inc.,New York,（198
5）;and Herlyn,D.M.,et al,Cancer Res.,40,717−721
（1980）］。IgG抗体は、毒素、他の抗腫瘍剤及び治療
の為の放射性又は磁性マーカーとの結合物の調製並びに
腫瘍のイメージ化に対し、IgMよりも適当である。
さらに、B 72.3［Nuti,M.,er al,J.Inst.Cancer,29,5
39−545,（1982）;Thor,A.,et al.,Cancer Res.,46,850
−857（1986）］及びMSL 102［Kurasawa,A.et al,In:Tu
mor marler and their significance in the managemen
t of breast cancer.（Eds,Dao,T.,Brodie,A.,and Ip,
C.）pp47−70,Alan R.Liss Inc.,N.Y.,（1986）］の２
個のモノクローナル抗体が、ヒト転移性乳癌及び腸癌細
胞ラインでの免疫により確立された。これらは種々のヒ
ト癌に対して高度の特異性を示し、正常組織に対する反
応性は限定されている。
しかし、これらの現行の方法は多数のステップを必要
とし、従って非常に扱いにくく、時間もかかる。
従って、ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体
を製造する為のより効率的な方法が望まれており、同様
に、正常な炭水化物配列及び構造を有する糖蛋白質と好
ましくない交叉反応性を示さないモノクローナル抗体を
分泌するハイブリドーマの単離も望まれている。
さらに、腫瘍増殖を抑制するための能動免疫が、腫瘍
免疫学において長い歴史を有している。実験的腫瘍で幾
つかの成果が得られたが、多くの試みは失敗している。
この原因の一つとして、使用した腫瘍抗原が化学的にあ
まり明確でなく、そのため宿種に免疫反応を起こして腫
瘍増殖を抑制する能力が曖昧であったことが挙げられ
る。最近、モノクローナル抗体によって確認された幾つ
かの腫瘍関連炭水化物抗原が、化学的によく特徴付けら
れたきた。このような抗原を、腫瘍増殖を抑制する為の
免疫原として用いることが、今では可能である。
化学的に決められた癌関連糖蛋白質自体は、腫瘍に対
する生体内免疫反応を起こす目的で、癌患者の能動免疫
に単独で使用できる。Ｔ及びTn抗原を有するルイス肺癌
から単離された糖蛋白質、TCAが、癌患者の免疫に用い
られ、その結果、癌患者の33/71に部分的又は完全な退
行が見られた［Adachi,M.,et al.,Anticancer Researc
h,4,1−４（1984）;Adachi,M,mer al,Anticancer Resea
rch,発行予定］。
発明の要約 従って本発明の目的は、ヒト癌関連ムチン型糖蛋白質
抗原に対するモノクローナル抗体の確立及び新規な製造
方法を提供することにある。本方法は、従来法に必要な
幾つかの余分なステップを回避し、しかも従来法による
ものと同程度の優れた品質を有するハイブリドーマを与
えるものである。
本発明の目的は、特別な癌関連抗原に対するモノクロ
ーナル抗体を分泌するハイブリドーマを提供することに
もある。
本発明の目的はさらに、モノクローナル抗体が正常の
炭水化物構造を持つ糖蛋白質と望ましくない交叉反応を
示さないという点で、従来法による抗体と少なくとも質
的に同等かむしろより優れたモノクローナル抗体を提供
することにある。
さらなる本発明の目的は、ワクチンの開発方法、即
ち、癌細胞により発現される抗原に特異的な抗体又は他
の免疫反応を誘導できる糖蛋白質又は合成オリゴ糖付加
ポリマー複合体を、動物又はヒトに投与することにより
癌細胞の増殖及び複製を防ぐ方法を提供することにあ
る。
本発明の他の目的は、ムチン型糖蛋白質の核構造に関
連する炭水化物に対する抗体であり、癌細胞により発現
される抗原に特異的であるものを使用する、癌の治療方
法を提供することにある。
本発明は、（１）ムチン型糖蛋白質の核構造で宿主を
免疫する；（２）免疫された宿主から得た脾細胞をミエ
ローマ細胞と融合させハイブリドーマ細胞を形成する；
（３）ハイブリドーマ細胞を選択培地で培養する；
（４）ステップ（３）で生き残ったハイブリドーマ細胞
からムチン型糖蛋白質の核構造と結合する抗体を分泌す
るものを選択する；（５）ステップ（４）で選択したハ
イブリドーマ細胞をクローニングする；（６）クローン
したハイブリドーマ細胞を培養する；及び（７）抗体を
回収する；の各ステップを含む、ヒト癌関連ムチン型糖
蛋白質抗原に結合するモノクローナル抗体の製造方法に
係わるものである。
本発明は、以下の確認された性質を持つモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマをも提供する： （１）IgG2aイソタイプ （２）Tn抗原と反応する （３）Ｎ−アセチルガラクトサミン（GalNAc）に特異性
を有し、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）、ガラク
トース（Gal）又はグルコース（Glc）には特異性を有し
ない （４）α−Ｎ−アセチルガラクトサミン（α−GalNAc）
に対しエピトープ特異性を有し、β−Ｎ−アセチルガラ
クトサミンに対してはエピトープ特異性を有さない、及
び （５）血液型Ａとは交叉反応しない。
本発明は、以下の確認された性質を持つモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマをも提供する： （１）IgMイソタイプ （２）シアリルTn抗原と反応し、Ｔ又はTn抗原とは反応
しない、及び （３）NeuAcα２→6GalNAcα１→Ｏ−Ser/Thrに対しエ
ピトープ特異性を有し、NeuAcα２→6GalNAcβ１→Ｏ−
Ser/Thrに対しエピトープ特異性を有さない。
本発明は、以下の確認された性質を持つモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマをも提供する： （１）IgG1イソタイプ （２）シアリルTn抗原と反応しＴ又はTn抗原とは反応し
ない （３）NeuAcα２→6GalNAcα１→Ｏ−Ser/Thrに対しエ
ピトープ特異性を有し、NeuAcα２→6GalNAcβ１→Ｏ−
Ser/Thrに対しエピトープ特異性を有さない、及び （４）Fab又は(Fab)2フラグメントに容易に分解でき
る。
もう一つの態様では、本発明は上記の確認されたハイ
ブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体を提供
する。本抗体は、ムチン型糖蛋白質の核構造、即ち、Tn
及びシアリルTn構造を発現する癌を有する患者の受動免
疫のために特に有用である。
もう一つの態様に於いて本発明は、ワクチンを対象に
投与して癌細胞に対する免疫反応を誘導することによ
る、ムチン型糖蛋白質の核構造を発現する癌細胞の増殖
及び複製を防ぐ方法を提供する。上記ワクチンは、 （ａ）Tn又はシアリルTnエピトープを有する精製ムチン
型糖蛋白質、精製されたムチン型糖蛋白質の核構造、又
はムチン型糖蛋白質に対する免疫反応を誘導可能な、担
体分子にリンクされた化学合成炭水化物成分を含む薬理
的効量の抗原 （ｂ）製薬的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤。
を含有する。
本発明は、化学的に同定された糖蛋白質、即ち、Tn及
びシアリルTnを有するウシ又はヒツジの下顎ムチン（BS
M,OSM）を免疫原として使用し、腫瘍をチャレンジ後、
シンジェニック（syngenic）マウスのTA3HAマウス腫瘍
の増殖を防ぎ、腫瘍をチャレンジしたマウスの生存を増
大することを開示する。Tn及びシアリルTn決定基は多種
類のヒト癌で高度に発現するため［Hirohashi S.,et a
l.,（1985）Proc Natl Acad Sci USA,82,7039−7043;Ta
kahashi HK,et al（1988）Cancer Res,48,4361−4367;k
jeldsen T,et alCancer Res,48,2214−2220,（1988）;K
urosaka A.,J Biol.Chem.,263,8724−8726］、BSM,OSM
又はこれら決定基を有する任意の他のムチン型糖蛋白質
による能動免疫はヒト癌の増殖を防ぐワクチンを提供す
るうえで有用であると期待される。
本発明はさらに、（ａ）ムチン型糖蛋白質の精製され
た核構造に対して作られた抗癌抗体の薬理的有効量、及
び（ｂ）製薬上受容できる担体、希釈剤又は賦形剤を含
有する薬剤を対象に投与することから成る、癌細胞がム
チン型糖蛋白質の核構造を発現する癌の治療法をも提供
する。
図面の簡単な説明 第１図Ａ及びＢは、ヒト偏平上皮細胞癌LU−65の培養
上清中に存在する糖蛋白質のTn活性を示すゲル濾過パタ
ーンを表わす。
第1A図:LU−65細胞上清中の全糖蛋白質の、セファロ
ースCL−4Bによるゲル濾過パターン及び実施例１に記載
の方法でアッセイしたTn活性。縦軸は抗Tn抗体NCC−LU
−81の結合を示し、横軸は分画No.を示す。実線で示し
た分画（分画７−15）を更にセファクリルS200で精製し
た（下記参照）。
第1B図：第1A図の７−15分画中のTn活性の、セファク
リルS200によるゲル濾過パターン。左の縦軸は280nmに
於けるUV吸収を示し、右の縦軸はTn抗体の結合活性を示
す。横軸は分画No.及び溶出液の全容積を示す。白丸はT
n抗体活性を表わし、黒丸は280nmでの吸光度により示さ
れた蛋白質濃度を表わす。
第２図Ａ、Ｂ、およびＣは、固相Tn抗原に対するBM−
８抗体の結合の、単糖による又はグリコシドによる阻害
を測定するアッセイの結果を示すグラフである。縦軸は
抗体結合活性を示し、横軸はmMで表わした糖の濃度を示
す。
第2A図：抗体の結合の単糖による阻害。黒四角はBM−
８結合のGlcNAc又はGlcによる阻害を表わし、黒丸はBM
−８結合のGalNAcによる阻害を表わし、白四角はBM−８
結合のGalによる阻害を表わす。
第2B図：固相Tn抗原へのBM−８抗体の結合の、ｐ−ニ
トロフェニル−α又はβ−GalNAcによる阻害。黒丸はｐ
−ニトロフェニル−α−GalNAcによる阻害を示し、白三
角はｐ−ニトロフェニル−β−GalNAcによる阻害を示
し、白四角はGalNAc（α及びβの混合物）を表わし、黒
四角はGlcNAcを表わす。
第2C図：固相Tn抗原へのBM−８抗体の結合の、ｐ−ニ
トロフェニル−α又はβ−GlcNAcによる阻害。白丸はｐ
−ニトロフェニル−α−GalNAcを表わし、黒三角はGalN
Ac（α及びβの混合物）を表わし、白三角はｐ−ニトロ
フェニル−β−GalNAcを表わし、黒四角はGlcNAcを表わ
す。
第３図は、種々の細胞ラインに対するBM−８抗体の結
合能を示す。各棒グラフは各細胞ラインを示す。抗体の
結合はQG−56（100％）に対するパーセントで表わされ
ている。
第４図はBM−８抗体に引起される、種々の細胞ライン
の抗体依存性細胞障害（antibody−dependent cytotoxi
city）を示すグラフである。４個のパネルは、エフェク
ターを標的細胞に対し種々の割合とした時に生じる腫瘍
細胞の溶解を示す。
第５図Ａ及びＢは、モノクローナル抗体BM−３の固相
OSMに対する反応性を示す。
第5A図：種々の濃度のBM−３上清に於ける、OSMに対
するBM−３の反応性。
第5B図：種々の濃度のOSMに対するBM−３の反応性。
天然のOSMに対する反応性は黒丸で示し、ノイラミニ
ダーゼ処理OSMに対する反応性は白丸で示す。
第６図の２個のグラフは、種々の糖を用いたときの、
OSMに対するBM−３の反応性を示す。
第6A図:BM−３に対する単糖類 フーコース（白
丸）、ガラクトース（白四角）、グルコース（黒三
角）、Ｎ−アセチルグルコサミン（白三角）、Ｎ−アセ
チルガラクトサミン（黒四角）及びＮ−アセチルノイラ
ミン酸（黒丸）の阻害作用。
第6B図:BM−３に対する二糖 NeuAcα２→6GalNAcα
１→セリン（黒四角）及びラクトース（黒丸）の阻害作
用。
第７図は、BM−３モノクローナル抗体を用いた、ホル
マリン固定しパラフィン包埋した悪性腫瘍のイミュノペ
ロキシダーゼ染色を示す。
第7A図：肺腺癌に対するBM−３の反応性（×90）。一
方正常肺は染色されない。
第7B図：適度に分化した結腸腺癌の染色。周囲の正常
細胞及びストロマ（stroma）は反応しない。
第7C図:BM−３による癌細胞の不均一な染色を示す粘
性（mucinous）胃癌（×90）。
第7D図:BM−３による細葉肺腺癌の染色。正常肺組織
は染色されない。
第８図は、BM−４モノクローナル抗体を用いた、ホル
マリン固定しパラフィン包埋した悪性腫瘍のイミュノペ
ロキシダーゼ染色を示す。
第8A図：肺腺癌に対するBM−４の反応性（×40）。
第8B図:BM−４による粘性胃癌の染色（×90）。
第8C図：適度に分化した結腸腺癌に対するBM−４の反
応性（×90）。正常結腸細胞及びストロマは反応しな
い。
第９図は肝臓TA3HA細胞をチャレンジされたマウスの
生存に対するノイラミニダーゼ処理BSM（Ｎ−BSM）の効
果を示す。実線はフロイント、アジュバント（FA）のみ
で免疫されたマウスを表わし、破線はＮ−BSMで免疫さ
れたマウスを表わす。
第10図はマウス血清中の抗Tn、抗シアリル−Tn又は抗
Ｔ抗体の力価に対するＮ−BSM免疫の効果を示す。白四
角はＮ−BSM（Tn）に対する抗体の力価を表わし、白三
角はOSM（シアリル−Tn）に対する抗体の力価を表わ
し、黒四角はノイラミニダーゼ処理されたグリコホリン
Ａ（Ｔ）を表わす。
第11図は、腫瘍サイズに対するＮ−BSM免疫の効果を
示す。白四角はFAで免疫されたマウスを示し、＋印はフ
ロイント、アジュバントと共にＮ−BSMで免疫されたマ
ウスを示す。
第12図は、実施例４に記載の炭水化物エピトープTnの
化学合成を図示したものである。シアリル−Tnの合成
は、シアリル残基を酵素的又は化学的に付加することに
よって容易に行うことができる。
発明の詳細な記載 本明細書に於て下記の用語は以下の意味を有する。
ムチン型グリコプロテイン……セリン又はトレオニン
残基に高度にＯ−リンクしたグリコシレーションを高度
に有する高分子量蛋白質（Mr＞106）。ムチン型糖蛋白
質はＳ−Ｓ結合によりさらに重合し、これは上皮分泌物
の主成分である。
ムチン型糖蛋白質の核構造……ムチン糖蛋白質の蛋白
質部分に直接結合した、末梢の置換の無い塩基性炭水化
物構造。最も高頻度で主要なこのような構造はＴ抗原に
等しい（下記参照）。以下の核構造Ｔ、Tn、及びシアリ
ルTnは全て種によらず（種々の動物及びヒト）全ての型
のムチン糖蛋白質に共通する。
Ｔ抗原……Galβ１→3GalNAcの如き構造をとるGal及
びGalNAc各１モルずつから成る二糖。還元末端GalNAcは
ポリペプチド鎖のセリン又はトレオニン残基のヒドロキ
シル基にα−結合している。
Tn抗原……その最も内部にあるα−GalNAc残基が、ポ
リペプチド鎖のセリン又はトレオニン残基のヒドロキシ
ル基に直接結合している抗原。α−GalNAcは血液型Ａ抗
原の一部であるため、多くの抗Tn抗体はＡ抗原と交叉反
応する。
シアリルTn抗原……Tn抗原のα−GalNAc残基の６位の
ヒドロキシル基がシアル酸で置換されている、即ち、ポ
リペプチド鎖のセリン又はトレオニン残基のヒドロキシ
ル基にNeuAcα２→6GalNAcがα結合している抗原。
Ｔ抗原、Tn抗原及びシアリルTn抗原の構造を下記表に
示す。
本発明は、ヒト癌関連ムチン型糖蛋白質抗原に対する
モノクローナル抗体を製造する新規な方法を提供する。
この新規な方法において重要な２つの点は、（１）本方
法で用いられる免疫原は、構造が化学的に明らかにされ
た精製又は合成抗原である点及び、（２）ハイブリドー
マの選択は化学構造が明らかにされた同じ免疫原を使用
して行われることである。
免疫原の調製 本発明に従えば、抗体を得るために使用する免疫原
は、上記に明らかにしたムチン型糖蛋白質の核構造であ
る。即ち、どの様なムチン型糖蛋白質の核構造も、その
糖蛋白質が免疫原性を発揮するに十分な大きさの分子量
を有し且つ全重量の50％以上がグルコシル化されている
ムチンと同程度まで、グリコシル化されている限り使用
可能である。
本発明の免疫原として有用なムチン型糖蛋白質の核構
造の例には、Ｔ抗原、Tn抗原、シアリルTn抗原、及びこ
れらの抗原を含む動物性ムチンが含まれる。Galβ１→
３［GlcNAcβ１→４］GalNAc、GlcNAcβ１→4GalNAc及
びGalβ１→３［Galβ１→4GlcNAcβ１→４］GalNAcの
様な他の核構造も使用できる。特に好ましい免疫原はＴ
抗原、Tn抗原、およびシアリルTn抗原、並びにこれら抗
原を含む動物性ムチンである。
免疫原は、ムチン型糖蛋白質を酵素的又は化学的に修
飾して核構造を露出させ、又は核構造をその中に有する
ムチンを単離することにより得られる。これらのムチン
は幾つかの動物種に存在する。
種々のムチン型糖蛋白質の核構造を露出させるために
使用可能な酵素的修飾のタイプの例には、末端に位置す
るα２→３シアリル残基のインフルエンザ ウイルス
シアリダーゼによる除去、又はクロストリジウム ペル
フリンゲンズ（Clostridium perfringense）シアリダー
ゼによる全シアル酸残基の総除去が含まれる。酵素的修
飾にはさらに、β−ガラクトシダーゼ（好ましくはChar
onia lampasからのもの）、α−フコシダーゼ及びＮ−
アセチルヘキサミニダーゼを用いた処理が含まれ得る。
ムチン糖蛋白質の酵素的加水分解はヒロハシ（Hirohash
i）らにより記載されている［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
82,7039−7043（1985）］。
ムチン型糖蛋白質の核構造を露出させるために使用可
能な化学的反応の例には、過ヨウ素酸塩酸化及びこれに
続く硼化水素ナトリウムを用いた還元及び弱酸処理が含
まれる。この方法はスミス分解［Spiro,G.,Methods Enz
ymol.,28,3−48（1972）］と呼ばれる。この化学的処理
により、シアル酸以外の炭水化物残基の非還元末端が除
去され、シアル酸は上記の様にシアリダーゼ処理により
除去できる。
動物から単離され、免疫原として使用できるムチンの
例には、90％の炭水化物鎖がシアリルTn抗原から成るヒ
ツジ下顎腺ムチン（OSM）及び50％の炭水化物鎖がシア
リルTn抗原から成り30％の炭水化物鎖がTn抗原及び他の
確認されていない残基から成るウシ下顎ムチンが含まれ
る。動物種のムチン糖蛋白質の構造が全て明らかにされ
ている訳ではない。しかし、ヒツジ胃ムチンにすでに見
出だされているトリヘキソサミン核（GlcNAcβ１→４
［GlcNAcβ１→３］GalNAc）［Hounsell,E.et al.,Bioc
hem.Biopys.Res.Commun.,92,1143−1159（1979）］のよ
うな新規な構造は幾つかのヒト癌ムチンの核構造に存在
すると考えられ、この場合にはこれらも本発明で用いる
ことができる。種々の動物種のムチン核構造の系統的な
理解は不完全であるが、ムチン核構造が知られると、当
業者は本発明にそれらが有用であるかを容易に決めるこ
とができるであろう。
さらに、種々の動物種での系統的な適用により、免疫
原として共通の構造が見出だされるだろう。この様な構
造を明らかにする方法には、硼化水素存在下でのアルカ
リ加水分解（β−エリミネーション）、メチレーション
分析及び遊離した各オリゴ糖のマス スペクトロメトリ
ーが含まれる。これらの方法は最近刊行された本に編纂
されている。
［Hakomori,S.,and Kannagi,R.（1986）.In:Hankbook o
f Experimental Immunology,Vol.I,Blackwell Scientif
ic Publications.Oxford,pp.9.1−9.39］。
免疫原は常法に従い単離し精製する。
例えば、酵素的又は化学的に修飾して核構造を生ずる
ムチン型糖蛋白質はセファロース4B又はセファクリル20
0Sによるゲル濾過により単離される。
次いで、単離された糖蛋白質を上記方法で酵素的又は
化学的に修飾して核構造を露出させ、核構造を免疫原と
しての使用のために以下の様にして精製する。：修飾さ
れたムチンはセファロース4B又はセファクリル200Sによ
るゲル濾過により分離できる。合成分子濾過カラムの高
圧クロマトグラフィ（fast liquid chromatography;Pha
rmacia製）もまた酵素的及び化学的に修飾されたムチン
の分離に有用である。しかし、修飾されたムチンは免疫
原としては精製する必要はない。少量の非修飾ムチンの
存在は本発明に従う免疫原としての使用に有害ではない
であろう。さらに、適当な注意の下に、修飾は通常定量
的に行われる。
動物種に由来し、すでに核構造の形態にある糖蛋白質
を含むムチンは、常法により得られる。例えば上記のよ
うにセファロース4B、セファクリル200によるゲル濾過
又はFPLCにより得る。
このようにして動物から得たムチンは、免疫原として
の使用のため、通常のゲル濾過又はFPLCの様な上記と同
様の方法で更に精製することができる。しかし、免疫原
の純度は本質的ではない。
上記のように、特に好ましい抗原はＴ抗原、Tn抗原及
びシアリルTn抗原である。
Ｔ抗原は下記の核構造を有するオリゴ糖を有する種々
の糖蛋白質をシアリダーゼ処理することにより［Hiroha
shi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7039−7043（1
985）］調製できる。
この様な糖蛋白質の典型例は、ウシ下顎腺ムチン及び
ヒト赤血球グルコホリンである。ウシ下顎腺ムチンはニ
シザワ（Nisizawa,K.）及びピグマン（Pigman,W.）の記
載した方法により［Arch.Oral Biol.,1,161（1959）］
ウシ下顎腺から得ることができる。ヒツジ下顎腺ムチン
は既に記載のある同様の方法［Tettamanti,G.,and Pigm
an,W.,Arch,Biochem.Biopys.,124,45−50（1986）］に
より調製できる。
ヒト赤血球糖蛋白質はヒト赤血球膜から、Marchesi,
V.T.及びAndrews,E.D.が最初に記載した方法［Science,
174,1247−1248（1971）］により得ることができる。
ウシ下顎腺ムチン及びヒト赤血球グリコホリンはピー
ナッツ レクチンに対する強い反応性により特徴付けら
れる。しかし、上記構造を有する他のタイプの糖蛋白質
も、Ｔ抗原を得るために用いることができる。
糖蛋白質が上記構造を有するかどうかは、ピーナッツ
レクチン カラムを用いたアフィニティー クロマト
グラフィ［Carter,W.G.,and Sharon,N.,Arch.Biochem.B
iopys,180,570−582（1977）］又は抗Ｔ抗体（ChemBiom
ed,Edmonston,Alberta,Canadaから購入可能）を用いた
糖蛋白質のイミュノブロッティングにより測定できる。
ヒツジ下顎腺ムチンはシアリダーゼ処理なしにＴ抗原
の核を含む。したがって、これを修飾なしにＴ抗原免疫
原として用いることができる。ヒツジ下顎腺ムチンはヒ
ツジ下顎腺から、先に記載した方法［Teetamanti and P
igman上記参照］で直接抽出及び精製するほかは、さら
に精製をすることなく得られる。
Tn抗原は、種々のタイプの糖蛋白質から、エキソグリ
コシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼで順次処理して得
られる。しかし、β−ガラクトシダーゼはα−GalNAcに
結合したβ１→３ガラクトシル構造を切断可能でなけれ
ばならない。
適当なエキソグリコシダーゼ及びβ−ガラクトシダー
ゼの例には、クロストリジウム ペルフリンゲンズ（Cl
ostridium perfringens）（Sigma Chemical Co.,St.Lou
is.MO製）由来のシアリダーゼ及びカロニア ランパス
（Caronia lampas）（Seikagaku Kogyo,Tokyo,Japan
製）のβ−ガラクトシダーゼが含まれる［Hirohashi et
al.,上記参照］。
エキソグリコシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼによ
る順次処理は以下のように行う。0.02％の適当なデター
ジェントを含む適当な緩衝液によるムチンの安定な溶液
を酵素と混合し、37℃で数時間〜18時間インキュベート
する。0.02〜0.05％のトリトンＸ−100又はNP40を含む5
0mMの酢酸緩衝液pH4.5〜5.0がしばしば用いられる。
次に、この様に処理した糖蛋白質を免疫原として用い
るために、上記の適当なカラムでゲル濾過することによ
り精製する。修飾されないムチンの存在はインビボでの
修飾ムチンの免疫反応に影響しないため、免疫原の精製
は必須ではない。
更に、ヒツジ下顎腺ムチンのような幾つかの動物ムチ
ンは天然型に多量のTn抗原を含む。従って、天然ヒツジ
下顎ムチンはTn免疫反応を引き起こす優秀な免疫原であ
る。
ヒツジ下顎腺ムチンは上記のようにして得られる。
他の効果的なTn免疫原はヒト偏平上皮細胞癌細胞ライ
ンLU−65から分泌される天然Tn糖蛋白質である。この細
胞は懸濁液として培養され、既使用（spent）培地は凍
結乾燥して体積を初めの1/50まで減小させる。次いで濃
縮既使用培地を0.01％ナトリウム アジドを含むリン酸
緩衝生理食塩液に４℃で十分に透析する。次に、透析し
た物質をセファロース4Bにかけ、ゲル濾過する。ボイド
ボリュームをプールし、さらに濃縮し、セファクリル
200で再度クロマトグラフを行う（第１図参照）。ボイ
ド ボリュームの糖蛋白質分画を免疫原として用いる。
ヒト偏平上皮肺癌細胞ラインQG56及びヒト ヘパトーマ
細胞ラインHUH−７（第５図参照）のように抗Tn抗体に
高反応性を示す細胞ラインの既使用培地も又、Tn抗原の
調製に使用できる。
シアリルTn抗原の分布は、どちらかといえば限られて
いる。しかし、本発明に有用なシアリルTn抗原の一つの
供給源は、偏平上皮肺癌細胞ラインQG56及びLU−65の培
養上清である［Hirohashi S.,et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,82,7039−7043（1985）］。
第二の供給源はまた、高密度のシアリルTnを含むヒツ
ジ下顎腺ムチンである。
培養上清から本発明の免疫原として有用な形でシアリ
ルTnを得るために、上記の種々の細胞ラインを既知の方
法に従い培養する。培養上清は、Tn抗原についての上記
記載と同様の方法で処理しシアリルTn抗原を得る。ただ
し、シアリル結合は不安定なので、全ての行程は限られ
た時間内及び低温（４℃）で行わなければならない。
培養上清からムチンを調製する典型例は下記の実施例
１に記す。
ヒツジ下顎腺ムチンはヒツジ下顎腺から得、Tettaman
ti及びPigmanらの方法（上記参照）により精製する。
炭水化物エピトープＴ、Tn及びシアリルTnは、第12図
に示した様に化学的に合成でき、またTamの記載の様に
［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,5409−5413（1988）］ｔ
−ブトキシカルボニル−β−アラニン ユニットに基く
高度に分枝した合成担体分子又はポリリジン、ヒト血清
アルブミンの様な合成又は天然の担体に共有結合するこ
とができる。炭水化物エピトープTnの化学合成の詳細な
記載は実施例４に明らかにする。シアリルTnの合成はシ
アリル残基を酵素的に又は化学的に付加することにより
容易に行うことができる。
免疫の方法 上記記載のように調製した免疫原を免疫のため以下の
ように処理する。
糖蛋白質抗原（例えば4.0mg）を蒸留水（例えば4ml）
に溶解し、適当な量の酸処理サルモネラ ミネソタ（Sa
lmonella minnesota）（例えば16mg）と完全に混合し、
凍結乾燥する。乾燥した混合物を適当な容量（例えば4.
0ml）の適当なキャリアー（例えば140mM NaClを含む20m
Mリン酸緩衝液pH7.0）に懸濁し、その内約100μｌ（即
ちムチン100μｇ及びバクテリア400μｇ）を静脈内投与
した。
免疫スケジュールはムチン抗原の型よらず、ほぼ同様
である。
免疫はバクテリアへの吸着の代わりに完全フロイント
アジュバントと共に行うこともでき、ムチン及びサルモ
ネラ ミネソタ（Salmonella minnesota）の量比は変化
できる。既に記載されているように［Yang,W.W.et al.,
J.Exp.Med.,150,1008−1019（1979）］サルモネラ ミ
ネソタ（Salmonella minnesota）を酢酸処理した時、最
も良い結果が得られている。
免疫に使用する宿主としては、任意の系統のマウスや
ラット、又はその脾細胞がハイブリドーマの調製に適当
な、即ち、安定なハイブリドーマを確立するためのHAT
感受性ミエローマ細胞ラインとの細胞融合に感受性を有
する、他の種類の動物が可能である。
免疫スケジュールは宿主動物のムチン免疫に対する感
受性に依存するが上記方法はマウスに適当である。他の
条件も又適用できる。適当な免疫スケジュールは当業者
が決定できる。
例えば、Balb/cマウスに適当な免疫スケジュールとし
ては、調製した免疫原を尾静脈から週１回、５週間静脈
内投与し、次いで１か月放置した後、調製免疫原でブー
ストする。
宿主に投与する免疫原製剤の量はムチンの分子量、炭
水化物エピトープの露出度、及びムチン型糖蛋白質に関
連するエピトープの特殊性と密度に依存する。マウスに
投与する糖蛋白質の範囲は、生理食塩水100μｌに懸濁
したサルモネラ ミネソタ（Salmonella minesota）30
〜50μｇをコートされた３〜５μｇであり、体重100〜1
50gの各マウス個体に静脈内投与する。
完全フロイント アジュバントを用いる時は、500μ
ｌの生理食塩水溶解の約20μｇの糖蛋白質を500μｌの
完全フロイント アジュバントと共に乳化し、約200μ
ｌを複数の部位に皮下投与する（約50μl/サイト）。サ
ルモネラ ミネソタ（Salmonella minesota）をコート
され、又は完全フロイント アジュバントと混合した、
同様の量の抗原が、ラット、ハムスター又はモルモット
の様な他の宿主に使用され、数倍量の抗原が、ウサギの
様な他の宿主に使用される。動物の体重に比例して抗原
量を増加させる必要は無い。
免疫は、十分な抗体が全血清から検出されるまで繰り
返す。宿種の脾細胞を取出し、脾細胞をHAT感受性ミエ
ローマ細胞とよく確立された技術により融合する［Kohl
er,G.AND Milstein,C.,Nature,256,495−497（1975）an
d Young,W.W.et al（上記参照）］。
HAT感受性ミエローマ細胞としては、例えばNS−１、S
P−１又はSP−２が可能であるが、任意の種類のHAT感受
性ミエローマ細胞を用いることができる。場合により、
宿主血清中に抗体が検出されなくても、宿主脾細胞とミ
エローマ細胞との融合の後ハイブリドーマを確立でき
る。従って、細胞融合の前に抗体を検出することは必須
ではない。融合は、通常ヤングらの記載のように（上
記）、ポリエチレングリコール中で行われる。
本発明で使用する好ましいミエローマ細胞ラインはSP
−２である。
融合細胞は96ウェル プレートで、ミニクローンが形
成されるまで培養する。多くの増殖する生存融合細胞を
得るためには、最終ブースター投与の48〜72時間後に脾
細胞を用い、よく分化したミエローマ細胞と融合させる
ことが重要である。インキュベーター中の湿度及びCO2
濃度は、融合細胞の培養初期の段階に注意深く制御しな
くてはならない。
支持細胞（feeder cell）は、本発明の方法に従って
融合細胞を増殖させるためには必須ではない。当業者は
適当な培養条件を容易に決定できる。
適当な培養時間の後、免疫に使用した糖蛋白質の核構
造と反応する抗体を分泌するハイブリドーマを、限界希
釈法によりクローニング及びサブクローニングする。即
ち、新たな培養体当り１個以下の細胞しか期待されない
点まで希釈した後、ウェルにプレーティングする。
一般に、96ウェル プレートの各ウェルを、糖蛋白質
のPBS溶液と共にインキュベートすることにより、免疫
原として使用した核構造を含むムチン糖蛋白質でコート
する。即ち、５〜10μg/50μl/ウェルを加え、一晩イン
キュベートする。糖蛋白質溶液を除去し、洗浄し、さら
にウシ血清アルブミン（10μg/50μl/ウェル）と共にイ
ンキュベートし、抗体のスクリーニングに使用する前に
プレートをブロックする。この方法はヒロハシらにより
記載されている（上記参照）。
特別の抗原と反応する抗体を分泌するハイブリドーマ
を、以下のようにしてスクリーニングした。抗原でコー
トしたウェルに結合した抗体は、最初にヤングらが記載
したように（上記参照）、通常、二次抗体（抗マウスIg
M及びIgGヤギ又はウサギ抗体）の後、125Iラベル化プロ
テインＡにより検出する。本方法は市販のELISAアッセ
イにより感受性が良いが、ELISAも使用可能である。ELI
SA法は市販の自動リーダー及びELISAキットの使用によ
り便利に行われる。
このようにして、本発明の方法に従い単離されたハイ
ブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体は、ハ
イブリドーマ細胞培養体の大バッチを増殖させ上清から
抗体を精製することにより、又はハイブリドーマ ライ
ンをマウスに投与し腹腔液の生成を刺激することによ
り、多量に製造できる。両方法は技術的によく知られて
いる。本発明に従ってモノクローナル抗体を多量に製造
する方法はヤングらにより記載されている（上記参
照）。
本発明に従い単離されたハイブリドーマは懸濁培養の
大バッチで増殖させ、又は、より簡便には、細胞がパッ
クされ高密度に成育し、その中で抗体が培地中に拡散す
ることができるファイバーグラス コンテナー中で、増
殖させることができる。
モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡを用いる
アフィニティー単離、逆相アルキル化シリカゲルによる
高圧液体クロマトグラフィー又は合成ポリスチレン ゲ
ル濾過カラムの様な知られた方法により精製できる。
上記方法に従えば、モノクローナル抗体を分泌するハ
イブリドーマは、常法により製造された抗体と比べて、
少なくとも質的に同等の優れた抗体を製造でき、むし
ろ、本発明のモノクローナル抗体は、完全なグルコシル
化構造を持つ正常糖配列を有する正常糖蛋白質と好まし
くない交叉反応をしない点で、公知のヒト癌関連抗原に
特異的なモノクローナル抗体よりも優れている。本発明
の方法に従って分離された３種の好ましいモノクローナ
ル抗体は、BM−８、BM−３及びBM−４である。これらモ
ノクローナル抗体を分泌する、ハイブリドーマBM−８、
BM−３及びBM−４と名付けられたハイブリドーマは、ア
メリカン タイプ カルチャー コレクション、ロック
ビル、メリーランドに寄託されており、各々のATCC寄託
番号は、HB−9873、HB−9653及びHB−9654である。
本発明に従うモノクローナル抗体BM−８はハイブリド
ーマBM−８により分泌され、以下の確認された性質を有
する。
（１）IgG2aイソタイプであり、 （２）Tn抗原と反応し、 （３）GalNAcに特異的であり、GlcNAc、Gal又はGlcには
特異的でなく、 （４）α−GalNAcにエピトープ特異性を有し、β−GalN
Acにはエピトープ特異性を有さず、且つ （５）血液型Ａとは交叉反応しない。
更に、モノクローナル抗体BM−８は、第３図に示し、
下記の実施例１に記載したように、種々の細胞ラインと
結合する。モノクローナル抗体BM−８は、正常ヒト線維
芽細胞BRASCH及びWI−38又は腫瘍細胞ラインHEL−299及
びIMR−90とは反応しない。
モノクローナル抗体BM−８は、第４図に示し、下記実
施例１に記載したように、種々の腫瘍細胞に対するサイ
トトキシック細胞の活性化を示す。特に、ヒト赤白血病
細胞ラインK562及びヒト偏平上皮細胞肺癌LU−65は、モ
ノクローナル抗体BM−８により誘導される抗体依存性細
胞障害（antibody−dependent cytotoxicity）に顕著な
感受性を示し、ヒト線維芽細胞BRASCH及びWI−38並びに
ヒト赤白血病細胞ラインHEL299はBM−８依存性細胞障害
に感受性を持たない。
Tn抗原に対するIgMモノクローナル抗体を分泌する２
個のハイブリドーマNCC−LU−35及び−81は、既に確立
されている。これらの抗体は肺偏平上皮細胞癌LU−65に
より免疫した後、得られる［Hirohashi et al.,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,82,7029−7043（1985）］。抗体BM−
８の細胞増殖の阻害及び細胞障害の性質は、本抗体を明
確にNCC−LU−35及び−81由来の抗体と区別する。
本発明のモノクローナル抗体BM−３はハイブリドーマ
BM−３から分泌され、以下の確認された性質を有する。
（１）IgMイソタイプであり、 （２）シアリルTn抗原と反応し、Ｔ抗原とは反応せず、
及び （３）NeuAcα２→6GalNAcα１→Ｏ−Ser/Thrに対しエ
ピトープ特異性を有し、NeuAcα２→6GalNAcβ１→Ｏ−
Ser/Thrにはエピトープ特異性を有さない。
本発明のモノクローナル抗体BM−４はハイブリドーマ
BM−４から分泌され、以下の確認された性質を有する。
（１）IgG1イソタイプであり、 （２）シアリルTn抗原と反応し、Ｔ抗原又はTn抗原とと
は反応せず、 （３）NeuAcα２→6GalNAcα１→Ｏ−Ser/Thrに対しエ
ピトープ特異性を有し、NeuAcα２→6GalNAcβ１→Ｏ−
Ser/Thrにはエピトープ特異性を有さず、及び （４）容易にFab又は(Fab)2フラグメントに分解され
る。
抗体イソタイプの確認 本発明に方法に従い単離されたモノクローナル抗体の
イソタイプは、Cappel Laboratriesのような種々の業者
から購入できるイソタイプ特異的抗マウス抗体に対する
抗体を用いた、固相ラジオイミュノアッセイの様な通常
の方法により確認できる。
抗体の特異性の確認 本発明に従い単離された抗体の特異性は、天然の及び
酵素的又は化学的に処理したムチン型糖蛋白質に対する
（１）競合結合アッセイ、（２）阻害アッセイ、（３）
結合アッセイを含む多くの方法で確認できる。
競合結合アッセイ 本アッセイは固相ラジオイミュノアッセイ（RIA）競
合アッセイである。本アッセイは、本発明の方法に従い
分離されたモノクローナル抗体の使用及び本発明の方法
に従い分離されたモノクローナル抗体が有すると推定さ
れるのと同じ抗原特異性を有すると知られている他のモ
ノクローナル抗体１種以上の使用を含む。さらに２種の
モノクローナル抗体は、異なるイソタイプを有し、又は
共に存在した時に二次抗体に別々に認識され得るような
異なる種由来のものでなければならない。
このアッセイにおいて、既知の特異性を有する各モノ
クローナル抗体について、２つのインキュベーションを
行う。即ち、１つのインキュベーションは、２つのモノ
クローナル抗体の内１つを一定量で用い、チャレンジす
るモノクローナル抗体を順次増加して用いて行う。他の
インキュベーションでは、２つのモノクローナル抗体の
役割を入れ替える。即ち、最初のインキュベーションで
一定量用いた抗体を、二回目のインキュベーションでは
順次増加して用い、最初のインキュベーションで順次増
加して用いた抗体を、二回目のインキュベーションでは
一定量用いる。
各インキュベーションでは、２つの抗体は最初に混合
され、次いで抗体の混合物を調べたい抗原と共にインキ
ュベートする。簡単に述べると、順次希釈した（約12希
釈で十分である）１つの抗体（約1.5μｇ〜60ng）を、1
00μｌの適当な緩衝液中、例えばPBS中の約1.5μｇの他
の抗体に加える。次に、２種のモノクローナル抗体の役
割を入れ替えた反応を行う。各混合物の量を同じ緩衝
液、例えばPBSで200μｌに調整し、そのうち約100μｌ
の２種の抗体の混合液を、予め調べたい抗原でコートし
（約５μg/ウェル）、PBS中の１％BSAでブロックしたア
ッセイ プレート中で、一晩４℃でインキュベートす
る。
インキュベーションの後、プレートを適当な回数、例
えば３回、適当な緩衝液、例えばPBSで洗浄し、チャレ
ンジ後抗原に結合したままのモノクローナル抗体の量
を、種又はサブクラス特異的抗体（例えばマウスIgMに
対しては抗マウスIgM、マウスIgG3に対しては抗マウスI
gG3）と反応させた後、適当にラベルしたプローブと反
応させて測定する。
種又はサブクラス特異的抗体との反応に適当な反応時
間は、約２時間であり、適当な反応温度は室温即ち22〜
25℃である。
反応の後、プレートを適当な回数、例えば３回、適当
な緩衝液、例えばPBSで洗浄し、適当にラベルしたプロ
ーブを加える。適当なプローブの１つの例は、125Iラベ
ル化プロテインＡである。例えば1.3時間室温、即ち22
〜25℃での適当なインキュベーションの後、プレートを
例えば５回、例えばPBSのような適当な緩衝液で再度洗
浄し、使用したラベルの種類に従いプローブの量を定量
する。例えば、125Iラベル化プローブはガンマ カウン
ターでカウントする。
本発明の方法に従って単離されたモノクローナル抗体
の特定の抗原に対する結合が、既知の特異性を有するモ
ノクローナル抗体により競合的に阻害された場合には、
本発明の方法に従い単離されたモノクローナル抗体はそ
の特定の抗原に特異性を持つと考えられる。
本アッセイが、通常抗マウスIgG＋IgMである二次抗体
を、省いて行うことができることは、当業者に明らかで
ある。
阻害アッセイ 本発明の方法に従い分離された抗体は糖蛋白質の核構
造に対するものであるので、特異性は、そのモノクロー
ナル抗体が対すると仮定される抗原への結合能に対す
る、種々の単糖及び二糖の阻害能をアッセイすることに
より確認できる。
アッセイはモノクローナル抗体を種々の単糖又は二糖
とインキュベートすることにより行われる。モノクロー
ナル抗体と糖との適当なモル比は約1:5から約1:100で、
適当な緩衝液はPBSである。インキュベーションはモノ
クローナル抗体が糖と反応するのに十分な時間及び温度
で、例えば、室温付近で１時間行う。インキュベーショ
ンの後、モノクローナル抗体／糖の混合物の部分を取出
し、モノクローナル抗体が特異性を有すると仮定される
抗原と、上記と類似の方法でインキュベートする。即
ち、予めPBSの様な適当な緩衝液中で、抗原でコートしB
SAでブロックしたウェルに、混合物の部分を加える。抗
原との適当なインキュベーション条件は、４℃一晩であ
る。
次いで、抗原に対するモノクローナル抗体の結合に対
する種々の糖の阻害効果を、上記固相RIAにより確認し
た。
当業者は、阻害実験に使用する適当な糖を容易に決め
ることができる。
例えば、Tn抗原に特異性を有すると仮定されるモノク
ローナル抗体については、GalNAc、GlcNAc、Gal及びGlc
の単糖が使用できる。もしもモノクローナル抗体が実際
Tn抗原に特異的ならば、モノクローナル抗体の抗原に対
する結合はGalNAcに阻害され、他の３つの糖には阻害さ
れない。
更に、Tn抗原に特異的なモノクローナル抗体について
は、抗体が特異性を有するGalNAcの実際のエピトープ
は、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−GalNAc、ｐ−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−GalNAc、並びにα−誘導体の混合物
及びβ−ｐ−ニトロフェニル誘導体の混合物を用いた阻
害アッセイを行うことにより確認できる。
もしも、モノクローナル抗体がTn抗原に特異的なら
ば、モノクローナル抗体のTn抗原に対する結合は、α−
ｐ−ニトロフェニル誘導体に阻害され、β−ｐ−ニトロ
フェニル誘導体には阻害されない。さらに、完全ではな
いある程度の阻害が、α−ｐ−ニトロフェニル誘導体及
びβ−ｐ−ニトロフェニル誘導体混合物で見られる。
さらなる例として、もしもモノクローナル抗体がシア
リルTn抗原に特異性を有するならば、GalNAc及びNeuA
c、Ｌ−フーコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコー
ス及びＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンの様な単糖を用い
て阻害アッセイを行うことができる。
抗体がシアリルTn抗原に特異的であれば、抗体の抗原
に対する結合はGalNAc及びNeuAcにより阻害されるが他
の単糖には阻害されない。
同様に、二糖NeuAcα２→6GalNAcα１→Ｏ−セリンは
シアリルTn抗原に特異的なモノクローナル抗体の反応を
阻害するが、ラクトースは阻害活性を持たない。しか
し、Tn抗原に対するモノクローナル抗体はNeuAcα２→6
GalNAcβ１→Ｏ構造と交叉反応可能であり、従って、こ
の構造のＯ−プロピル誘導体には軽度に阻害される。
処理され又は処理されないムチン型糖蛋白質に対する結
合 本アッセイは、種々のムチンに対するある種の酵素的
及び／又は化学的処理が抗原構造を露出又は消失させる
というという事実に基く。本アッセイは以下の様に行
う。
ムチン型糖蛋白質で96ウェルのプラスティック プレ
ートを、一晩10μg/50μ1PBS/ウェル インキュベート
することによりコートする。プラスティック表面に吸収
させる糖蛋白質は、各々シアリダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、並びにα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ
により処理されたもの又はその未処理のものである。次
いで、この様な処理又は未処理の固相糖蛋白質に対する
抗体の結合を比較する。抗体BM−３により確認されるシ
アリルTn活性は、プラスティック表面に吸収されたヒツ
ジ下顎腺ムチンの様なシアリルTn抗原をシアリダーゼで
処理すると、BM−８により確認されるTn活性に変換でき
る。Ｔ又はTn活性を持たないヒト赤血球グリコホリンＡ
は、プラスティック表面に吸収させ、シアリダーゼで処
理するか（Ｔ抗原に変換する）、又はシアリダーゼ及び
β−ガラクトシダーゼで順次処理すると（Tn抗原に変換
する）、Ｔ又はTn抗原に変換できる。このような方法は
ヒロハシらにより記載されている（上記参照）。
当業者は本アッセイに使用される適当なムチン型糖蛋
白質並びに酵素的及び化学的処理を容易に決めることが
できる。
例えば、モノクローナル抗体がシアリルTn抗原に特異
的であるならば、種々の酵素的分解の前及び後にOSMに
対する抗体の反応性を比較することができる。具体的に
言うと、天然OSMの約90％の炭水化物鎖はシアリルTn抗
原である。しかし、この抗原はシアリダーゼを用いた酵
素的処理により分解される。このように、シアリルTn抗
原に特異的なモノクローナル抗体は、天然OSMと反応す
るがシアリダーゼ処理OSMとは反応しない。
加えて、本発明者らは、グリコホリンＡがその天然型
ではＴ、Tn又はシアリルTn抗原を含まないことを発見し
た。しかし、脱シアル化したグリコホリンＡはＴ抗原を
露出するが、Tn抗原を露出しない。従って、Ｔ抗原と結
合するモノクローナル抗体はシアル化グリコホリンＡと
は反応するが天然グリコホリンＡとは反応しない。
さらに、グリコホリン抗体及びそのシアリル化誘導体
はシアリルTn抗原に対するモノクローナル抗体の検出に
使用できる。グリコホリンＡのシアリルTn抗原を露出さ
せる変換は困難である。天然グリコホリンＡを、シアリ
ル２→3Galを分解するがシアリル２→6GalNAcは分解し
ないインフルエンザ ウイルスのシアリダーゼ又はニュ
ー キャッスル病ウイルスのシアリダーゼで処理するな
らば、核構造はGalβ１→３［NeuAcα１→６］GalNAcを
含むであろう。この構造は、β−ガラクトシダーゼによ
るGal残基の脱離により、さらにシアリルTn抗原に変換
できる。しかし、NeuAcα２→６結合構造が隣接した場
所に存在するときβ−ガラクトシダーゼは能率的に脱離
しないため、これは実際は非常に難しい。
本発明まで、Ｔ、Tn又はシアリルTn抗原に対するモノ
クローナル抗体は意図して作られてはいなかった。むし
ろ、それらは常法により選択された、即ち、腫瘍細胞又
は組織に対する優先的反応に基く多くのハイブリドーマ
のなかに含まれる。
本発明に従えば、このようなモノクローナル抗体が意
図的に作成できる。
癌細胞の増殖及び複製を防ぐ方法並びに癌の治療方法 本発明は、癌細胞の増殖及び複製を防ぐ方法並びに癌
の治療方法をも提供する。
より詳しくは、本発明は、 （ａ）精製ムチン型糖蛋白質、ムチン型糖蛋白質の精製
核構造、又はムチン型糖蛋白質に対する免疫反応を誘導
可能な、担体分子に結合している化学合成された炭水化
物抗原決定基を含む抗原の薬理的有効量、及び （ｂ）製薬的に受容できる担体は、希釈剤又は賦形剤を
含有するワクチンを対象に投与することにより抗癌細胞
免疫反応を誘導することからなる、ムチン型糖蛋白質の
核構造を発現する癌細胞の増殖および複製を防ぐ方法を
提供する。
抗原は、抗癌細胞免疫反応を誘導できるものであり、
Tn又はシアリルTnエピトープを有する精製ムチン型糖蛋
白質、ムチン型糖蛋白質の精製核構造、並びに上記のよ
うに担体分子に結合した化学合成炭水化物の抗原決定基
が含まれる。抗癌細胞免疫反応は、ムチン型糖蛋白質又
は化学合成された炭水化物の抗原決定基に対する抗体の
産生であり、又サイトトクシック キラーＴ細胞、アノ
マラス キラー細胞（AK細胞）及び抗体依存性細胞障害
細胞等の誘導の様な種々の他のタイプの免疫反応の誘導
であり得る。
好ましい抗原は、天然の供給源から精製したものであ
るか、化学合成したものかによらず、Ｔ抗原、Tn抗原及
びシアリルTn抗原であり、Tn抗原とシアリルTn抗原が特
に好ましい。
Tn又はシアリルTnエピトープを有する精製ムチン型糖
蛋白質を含む抗原としては、ウシ又はヒツジ下顎ムチン
が好ましい。
抗原がハイブリドーマの調製に適当な脾細胞でその抗
体を誘導可能な抗癌細胞抗体の例は、上記BM−８、BM−
３及びBM−４である。
当業者は、投与量並びに適当な製薬的に受容できる担
体、希釈剤及び賦形剤を容易に決めることができる。
上記のように、本発明は、 （ａ）ムチン型糖蛋白質の精製された核構造に対して産
生される、薬理的有効量の抗癌抗体、及び （ｂ）製薬的に受容できる担体、希釈剤又は賦形剤を含
有する薬剤を対象に投与することから成る、癌細胞がム
チン型糖蛋白質の核構造を発現する癌の治療法をも供給
する。
抗原は、上記の様なムチン型糖蛋白質の精製された核
構造であればよく、Ｔ抗原、Tn抗原およびシアリルTn抗
原が含まれ、特にTn抗原及びシアリルTn抗原が好まし
い。
抗癌抗体は上記のように製造され単離される。
好ましい抗癌抗体にはBM−８、BM−３及びBM−４が含
まれる。
当業者は投与量並びに適当な薬理的に受容できる担
体、希釈剤及び賦形剤を容易に決めることができる。
実施例 以下に本発明を、特定の実施例を挙げて説明する。し
かし、本発明は実施例に制限されて解釈されるものでは
ない。実施例に於て、他に特に記述しない限り、全ての
パーセント、割合等は重量による。
モノクローナル抗体BM−８の精製 モノクローナル抗体BM−８は腹腔液からシリカゲル−
プロテインＡカラムのアフィニティークロマトグラフィ
ーにより精製した。抗体は3.0Mチオシアン酸ナトリウム
を用いて溶離した。Tn抗原に対する活性を持つ分画（各
1.0ml）は固相ラジオイミュノアッセイにより確認して
プールし、PBSに対して透析し、蛋白質量をA280を読み
とることにより定量した。培養上清はアミコン（Amico
n）濃縮装置（Amicon,Boston,MA製）を用いた限外濾過
により1/100容量まで濃縮した。濃縮した上清を逆相C18
シリカゲル カラムで精製し、IgM及びIgG分画を得た。
抗体依存性細胞障害作用（antibody−dependent cytoto
xicity）の測定 抗体依存性細胞障害作用の測定には４時間51Cr遊離試
験を用いた。この方法は、例えばMischell及びShiigiに
より報告されている［Selected Methods in Cellular l
mmunology,W.H.Freeman＆Co.,San Francisco,（198
0）］。２人の健常人から得た末梢血リンパ球をフィコ
ール−ハイパック（Ficoll−Hypaque）により分離して
エフェクター細胞を得た。ターゲット細胞に対するエフ
ェクター細胞の割合は100:1、50:1、25:1及び12.5:1と
した。
ターゲット細胞は細胞ラインK562、LU−65、WI−38、
BRASCH、MKN−45、SKOV3、QG56、HEL299、HUH7及びBXPC
3であり、これらは全て上記文献に記載されている。タ
ーゲット細胞（106個）を100μCiの51Crと共にPBS中で3
7℃で１時間インキュベートすることによりラベルした
後、細胞を３回洗浄し、RPMI培地に再懸濁した。15μ１
の培地中のラベルされたターゲット細胞（５×103個）
を各ウェルに入れ、エフェクター細胞を種々の個数（５
×105、2.5×105、1.25×105及び6.25×104個／ウェ
ル）加えた。混合物を４時間インキュベートした後、プ
レートを500×ｇで遠心した。上清を分離し、125μｌの
試料中の放射活性をガンマ カウンターで測定した。グ
ループ当り３回実験を行い、自発遊離量は抗体及びリン
パ球に触れないターゲット細胞から培地に遊離したcpm
とし、全遊離量は測定の終りに2.0％のトリトンＸ−100
を加えて溶解したターゲット細胞から遊離したカウント
数とした。細胞障害性％は下記式から算出した。
BM−８により誘導された種々のターゲット細胞ライン
に対する抗体依存性細胞障害作用を第４図に示す。ヒト
赤白血病細胞ラインK562及びヒト偏平上皮細胞肺癌LU−
65はBM−８抗体により誘導された抗体依存性細胞障害に
注目すべき感受性を示した。対照的にヒト線維芽細胞BR
ASCH、WI−38、及びヒト赤白血病細胞HEL299はBM−８依
存性細胞障害に感受性を示さなかった。ヒト偏平上皮細
胞肺癌QG56及びヒト胃癌細胞ラインMKN−45はBM−８抗
体に対し最も強い結合活性を示したにもかかわらず、BM
−８抗体依存性細胞障害には低い感受性を有した。
これらの結果から、BM−８抗体は幾つかの腫瘍細胞に
対するサイトトキシック細胞の明確な活性化を示した。
しかし、各種癌細胞の抗体依存性細胞障害に対する感受
性は大きく異なり、抗体発現との定量的相関性は無かっ
た。
種々の組織切片の免疫組織学 モノクローナル抗体BM−８の免疫組織学的染色能を以
下のように測定した。
凍結及びパラフィン包埋組織は共に外科手術により得
た。組織はOCT化合物（免疫組織学では広く使用されて
いる特許された化合物、Tissue−TekII Division,Miles
Laboratories,Naperville,Illinois製）中に包埋し、
ドライアイス−アセトン中で凍結し、使用までレブコ
（Revco）冷凍庫で−80℃で保存した。凍結切片（４〜
５μｍ厚）は低温層を用いて調製し、対物ガラス上で室
温で30分乾燥し、アセトン中で４℃で10分固定し、４℃
のPBSで洗浄した。組織切片（５〜７μｍ厚）は、常法
に従いホルマリン固定しパラフィン包埋した標本から調
製した。切片はキシレン中で４℃で５分間脱パラフィン
し、段階的エタノールで脱水し、４℃のPBSで洗浄し
た。次いで凍結切片及びパラフィン包埋切片を両者共、
0.03％の過酸化水素水を含む100％メタノールで室温で3
0分間処理することにより、内因性ペロキシデースをブ
ロックした。PBSで３回洗浄後、切片をブロックし、即
ち正常ウマ血清と共に室温で30分インキュベートして内
因性ペロキシデースを不活性化した。次いで切片をPBS
で３回洗浄し、一次抗体溶液（BM−８培養上清；抗体濃
度＝50μg/ml）と共にモイスト チャンバー中で４℃で
一晩インキュベートした。PBSで３回洗浄後、切片を1:1
00希釈のビオチン化二次抗体（ビオチン化ウマ抗マウス
IgG、Vector Lab,Inc.,Burlingame,CA製）と共に室温で
１時間モイスト チャンバー中でインキュベートした。
PBSで３回洗浄後、切片を予め作成したアビジン−ビオ
チン化ペロキシダーゼ複合体（Vector Lab,Inc.,Burlin
game,CA製）の容量比1:100の希釈溶液と共に室温で１時
間モイスト チャンバー中でインキュベートした。PBS
及び50mM Tris/HCl緩衝液（pH7.6）で３回リンスの後、
切片を0.05％ ３−３′ジアミノベンジジン（Sigma Ch
emical Co.,St.Louis,MO製）を含む50mM Tris/HCl緩衝
液（pH7.6）及び0.03％過酸化水素水中で10分インキュ
ベートした後、ヘマトキシリンで対比染色した。次いで
切片を段階的エタノール、キシレンで脱水し、封入し
た。
モノクローナル抗体BM−８による種々の癌及び正常組
織の染色陽性の発生を第１表に要約する。
第１表に示した結果から、BM−８抗体により測定した
Tn抗原は胃、結腸、肺、及び乳癌で染色陽性の高い発生
を示した。正常結腸及び正常乳房における染色陽性の低
い発生も、染色強度が低いながら示された。
実施例２ シアリルTn抗原に対するモノクローナル抗体の製造及び
特徴付け シアリルTn抗原の供給源としてヒツジ下顎腺ムチン
（OSM）を用いた。OSMの約90％の炭水化物鎖はシアリル
Tn抗原から成る。
OSMはヒツジ下顎腺から常法により単離した［Tettama
nti,G.,and Pigman,W.Arch.Biochem.Biophys.,124,45−
50（1968）］。簡単には、下顎腺の水性抽出物を酸性pH
（例えば3.5）で沈殿させた。これをムチン クロット
と呼ぶ。ムチン クロットを遠心し、水に溶解し、pHを
中性に合わせ、酢酸ナトリウム中で分別エタノール沈殿
を行った。
このように単離したOSMを免疫原の組成として用い
た。
免疫及びモノクローナル抗体の確立 Balb/bマウスを実施例１の記載の従い免疫した。
実施例１に記載の常法により脾臓の細胞を取出し、脾
細胞をマウス ミエローマSP−２細胞と融合した。
選択培地で増殖したハイブリドーマを実施例１の記載
と類似の方法で、上記OSM、脱シアル化OSM、ウス下顎ム
チン（BSM）（BSMの約50％の炭水化物鎖はシアリルTn抗
原から成る）、及びグリコフォリンＡに対するモノクロ
ーナル抗体の反応性によりスクリーニングした。ウシ下
顎腺ムチン（BSM）及びグルコホリンＡはシグマ ケミ
カル カンパニー［Sigma Chemical Campany,St.Louis,
Missouri］から購入した。OSMは、常法に従い0.1ユニッ
ト/mlのクロストリジウム ペルフリンゲンズ（Clostri
dium Perfringens）タイプＸ由来のノイラミニダーゼ
（Sigma製）で処理し脱シアル化した［Magnani,j.L.et
al.,J.Biol.Chem..,257,14365（1982）;Fukushi et a
l.,J.Biol.Chem.259,10511（1984）］。
OSMに反応陽性のモノクローナル抗体を分泌する約22
個のハイブリドーマが見出だされた。
これらハイブリドーマをスケール アップし、モノク
ローナル抗体のOSM、脱シアル化OSM、BSM、及びグリコ
フォリンＡに対する反応性を再検査した。
OSMに対し強い反応性を示し、BSMに対しては弱い反応
性を示し、グリコフォリンＡ又はシアリダーゼ処理OSM
に対しては反応しないモノクローナル抗体を分泌する２
個のハイブリドーマを再クローニングし、続く実験に用
いた。
ハイブリドーマ及びこれから産生されるモノクローナ
ル抗体をBM−３及びBM−４と呼ぶ。
抗体イソタイプの確認 抗体イソタイプは実施例１に従い固相ラジオイミュイ
アッセイにより決定した。結果は抗体BM−３はIgMイソ
タイプであり、抗体BM−４はIgG1イソタイプであること
を示した。
抗体の特異性の確認 BM−３及びBM−４の特異性をｉ）シアリダーゼ処理OS
Mと比較した天然OSMに対する反応性、及びii）種々の単
糖及び二糖による抗体結合の阻害により測定した。各方
法を以下に示す。
天然及びシアリダーゼ処理OSMに対する反応性 OSMの表現する抗原の性質を調べるため、天然OSM及び
シアリダーゼ処理OSMを抗Tn（モノクローナル抗体CA323
9由来の腹腔液中に存在）及び抗Ｔ（モノクローナル抗
体HH8の培養上清中に存在）と反応させた［Clausen,H.e
t al.,ln:Glycoconjugates,Proceedings of the IXth I
nternational Symposium,Lille,France,p.F49（198
7）］。
測定は固相ラジオイミュノアッセイを用いて行った。
室温で18時間インキュベートすることによりOSM及びシ
アリダーゼ処理OSMで96ウェル プレートをコートし、
１％BSAで２時間ブロックした後、BSAで３回洗浄した。
一次抗体（抗Tn又は抗Ｔ HH8抗体）を加え室温で２時
間反応させた後、PBSで洗浄した。固相OSM又はシアリダ
ーゼ処理OSMに結合した抗体を二次抗体及び125Ｉラベル
化プロテインＡで定量した。本方法は多くの刊行物に記
載されている［Hirohashi,et al.（上記参照）,Fukushi
et al,JBC,2569,4681（1984）;JBC,259,10511（198
4）;Young et al.,J.Exp.Med.,150,1008（1979）］。
結果から天然OSMはCA3239由来の抗Tnに弱い反応性を
示したが、シアリダーゼ処理の後反応性は大きく増大し
た。さらに、HH8由来の抗Ｔに対しては、シアリダーゼ
処理の前及び後で反応性は見られなかった。
これらの反応性は、OSMはＴ又はTn抗原を発現しない
がシアリルTn抗原を強く発現することを示唆する。
モノクローナル抗体BM−３及びBM−４は天然OSMとの
反応及びシアリダーゼ処理OSMとの反応により特徴づけ
られる。天然OSMはシアリル２→6GalNAcα１→Ｏ−Ser/
Thrを主な炭水化物グループとして含み、BM−３及びBM
−４はこれと反応する。このことからBM−３及びBM−４
は共にシアリルTn抗原を認識することが示唆される。さ
らにBM−３及びBM−４の反応性は、OSMのシアリダーゼ
処理により完全に消失した。この処理でシアリルTnグル
ープは全てTn残基に変換されており、このことからBM−
３及びBM−４はＴ抗原とは反応しないことが示唆され
る。OSMのシアリダーゼ処理はプラスティック表面に吸
着した固相上で行った。本方法はヒロハシ（Hirohasi）
らにより既に報告されている（上記参照）。
BM−３についての結果を第５図に示す。パネルＡは種
々の濃度のBM−３上清におけるBM−３のOSMに対する反
応性を示し、パネルＢは種々の濃度のOSMに対するBM−
３の反応性を示す。黒丸は天然OSMに対する反応性を示
し、白丸はノイラミニダーゼ（又はシアリダーゼ）で処
理されたOSMに対する反応性を示す。
結果は、モノクローナル抗体BM−３は天然OSMに対す
る反応性を有し、この反応性はシアリダーゼ処理の後大
きく減少することを示す。
この様にモノクローナル抗体BM−３はシアリル−Tn抗
原に特異的である。モノクローナル抗体BM−４について
も同様のことが見出だされた。
BM−３抗体の反応性の単糖及び二糖による阻害 単糖溶液を、96ウェル プレートの一連のウェル中で
初めの濃度500mMから２倍希釈した。各々の単糖溶液をB
M−３又はBM−４抗体に加え（10〜50ng/ウェル）、溶液
を室温で１時間インキュベートした。96ウェル プレー
トの一連のプラスティック ウェルは、上記方法でOSM
でプレコートし（室温で一晩、生理食塩水溶解のOSMの
インキュベーション）、BSAでプレウォッシュした。単
糖又は多糖と抗体との反応混合液をOSMでコートしたプ
レート上に移し、２時間インキュベートした後、BSAで
洗浄し、上記方法により二次抗体及び125Iラベルしたプ
ロテインＡで抗体の結合を検出した。阻害の程度は、単
糖又は二糖と混合しない抗体と比較し、コントロールの
反応性に対する％で表した。
BM−３についての結果を第６図に示す。パネルＡは単
糖のフーコース（白丸）、ガラクトース（白四角）、グ
ルコース（黒三角）、Ｎ−アセチルグルコサミン（白三
角）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（黒四角）、Ｎ−ア
セチルノイラミン酸（黒丸）によるBM−３の阻害を示
し、パネルＢは二糖NeuAcα２→6GalNAcα１→セリン
（黒四角）及びラクトース（黒丸）によるBM−３の阻害
を示す。
結果は単糖のGalNAc及びNeuAcのみがBM−３のOSM及び
BSMに対する結合を阻害することができ、一方他の単糖
Ｌ−フーコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース及
びＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンは反応を阻害できなか
った。NeuAcの阻害活性はGalNAcよりも強かった。二糖N
euAcα２→6GalNAcα１→Ｏ−セリンも又はBM−３の反
応を阻害したが、そのアノメリック アイソマー、NeuA
cα２→6GalNAcβ１→Ｏ−プロピル、及びラクトースは
阻害活性を有さなかった。
これらの結果はBM−３抗体により認識されるハプテン
構造はNeuAcα２→6GalNAcα１→Ｏ−Ser/Thr、即ち正
確にシアリルTn構造であることを示唆する。
同様の結果がBM−４について得られた。
種々の組織切片の免疫組織学 モノクローナル抗体BM−３及びBM−４の免疫組織学的
染色能を既に記載された方法に従って（Fukushi et a
l.,J.Exp.Med.,159,506（1984）］調べた。簡単には、
抗体検出のため標本をホルマリンで固定し、パラフィン
に包埋した。モノクローナル抗体を脱パラフィンした組
織切片に加え４℃で一晩インキュベートした。結合した
モノクローナル抗体の検出はビオチニル抗マウスIgG＋I
gM及びビオチニル−ペロキシダーゼ複合体を用いて行っ
た（vactastain ABC kit;Vector Laboratories Inc.
製）。酵素活性は0.02％のデアミノベンジジン テトラ
ヒドロクロリド及び0.005％の過酸化水素水を含む0.05M
トリスにより測定した。この方法は種々の過酸化水素水
について行われる。これらの方法は種々のモノグラフ、
例えばK.Watanabe及びP.K.Nakane著“Immunoenzymatic
Method"（Interdisciplinary Publications,Toshima,To
kyo,（1985））に詳しく述べられている。
ペロキシダーゼ染色した典型的な免疫組織学像を第７
図及び第８図に示す。
第７図はBM−３抗体を用いた、フォルマリン固定、パ
ラフィン包埋の悪性腫瘍のイミュノペロキシダーゼ染色
を示す。第７図は、BM−３モノクローナル抗体は肺腺癌
と反応するが、正常肺とは反応せずこれらは染色されな
い（パネルＡ）ことを示す。さらにBM−３モノクローナ
ル抗体は適度に分化した結腸腺癌と反応するが、周囲の
正常細胞及びストロマとは反応せず、これらは染色され
ない（パネルＢ）。BM−３モノクローナル抗体は粘性胃
カルシノーマ癌細胞（パネルＣ）及び細葉肺腺癌とも不
均一に反応するが、正常肺組織とは反応せずこれらは染
色されない（パネルＤ）。
第８図はBM−４モノクローナル抗体を用いたホルマリ
ン固定、パラフィン包埋悪性腫瘍のイミュノペロキシダ
ーゼ染色を示す。第８図は、BM−４モノクローナル抗体
は肺腺癌（パネルＡ）、粘性胃癌（パネルＢ）、及び適
度に分化した結腸腺癌と反応するが、正常結腸細胞又は
ストロマとは反応しない（パネルＣ）ことを示す。
種々の癌及び正常組織のモノクローナル抗体BM−３及
びBM−４による染色陽性の発生を他の抗シアリルTn抗体
（B72.3、NCC−LU−35、及びNCC−LU−81）と比較し、
下記第２表に示す。正常組織のBM−３及びBM−４による
染色陽性の発生は非常に限られているため、正常組織の
陽性の図は省略した。
モノクローナル抗体BM−３及びBM−４は共にシアリル
Tnに対するものであるが染色陽性の発生はモノクローナ
ル抗体BM−４を用いた方がずっと高かった。BM−８と比
較して、両抗体はずっと低い正常組織の染色陽性の発生
を示した。
実施例３ Tnエピトープを含むムチン糖蛋白質を用いた免疫による
マウスにおける先天性腫瘍増殖の阻害 Tn抗原を含むウシ下顎ムチン（BSM）はヒルらの方法
に従い精製した［Hill H.D.,et al.,J.Biol.Chem.252,3
791−3798（1977）］。ウシ下顎腺を0.01M NaCl中でホ
モジナイズした。上清をpH4.7に合わせ、沈殿を除い
た。上清をスルホプロピル−セファデックスＣ−25カラ
ムにかけ、モノクローナル抗体により検出したTn及びシ
アリルTn抗原を含む分画を１つにした。
ムチンを、アセチルトリメチルアンモニウム ブロマ
イドの添加及び遠心により沈殿させた。沈殿を4.5M CaC
l2に再溶解し、無水エタノールに溶解して60％濃度にし
た。沈殿を捨て、上清を75％エタノールにした。27,000
gで30分間遠心することによりムチンを集めた。沈殿を1
M NaClに懸濁し、10mMリン酸ナトリウム、pH6.8に透析
した。ムチンはヒドロキシルアパタイト カラムにか
け、Tn及びシアリルTn活性を含む分画を集めた。ムチン
をノイラミニダーゼ（クロストリジウム ペリフリンゲ
ンズ（Clostridium perfringens）由来）で処理し（Ｎ
−BSM）、セファロースCL−4Bカラムにかけた。Tn活性
を含む分画をプールし、透析し、凍結乾燥した。雌性CA
F1マウスをPBS、フロイント アジュバント（FA）、又
は完全FAアジュバントに乳化したＮ−BSM（20μｇ）で
腹腔内投与（i.p.）により免疫した。１週間後、マウス
をPBS、不完全FA、又は不完全FAに乳化したＮ−BSM（40
μｇ）でi.p.より再免疫した。二回目の免疫の10日後、
マウスに先天性乳腫瘍TA3HA細胞（104細胞、皮下投与）
をチャレンジし、腫瘍サイズ、マウスの生存、及び抗体
の産生をマウスでモニターした。結果を第９図及び第11
図に示す。
第９図に於いて、実線はFAのみで免疫したグループを
表し、破線はＮ−BSMで免疫したマウスを表わす。第９
図は、コントロールFAグループのマウスは腫瘍チャレン
ジの14日後には全て死亡したが、一方BSMで免疫したグ
ループではチャレンジの19日後に3/7のマウスが生存し
ていたことを示す。
第10図に示したように、BSM免疫グループは血清中に
高力価のTn及びシアリルTn特異的抗体を有したが、一方
Ｔエピトープ（ノイラミニダーゼ処理グリコホリンＡ）
に対する抗体は検出されなかった。第10図において、白
四角はＮ−BSM（Tn）に対する抗体の力価を表し、白三
角はヒツジ下顎線ムチン（OSM）に対する抗体の力価を
表し、黒四角はノイラミニダーゼ処理グルコホリンＡ
（Ｔ）に対する抗体の力価を表す。PBS又はFAで免疫し
た動物に於いてはTn抗原に対する抗体は検出されなかっ
た。第11図は腫瘍サイズに対するＮ−BSM免疫の効果を
示す。白四角はFAで免疫したマウスを、＋印はフロイン
ト アジュバント中のＮ−BSMで免疫したマウスを示
す。腫瘍はPBS及びBSM免疫のマウス共に増殖するが、腫
瘍増殖の速度は、PBS免疫グループと比較してBSM免疫グ
ループでは遅かった。
実施例４ キャリアー蛋白質に結合したTn及びシアリルTn抗原の化
学合成 多価抗原システムの製造方法の基本的考え方を第12図
スキームＩに要約する。多くの抗原を樹状アームとして
担う核マトリックスとして、リジルリジンを用いること
が、第12図スキームＩの提案の必須部分となっている。
３個のアミノ酸グループを反応末端として使用可能なリ
ジルリジンに連続して結合させることにより、3n個のTn
抗原残基が生成する。続いて、これらの残基を化学的又
は酵素的シアル化によりシアリルTn（NeuAcα２→6GalN
Acα１→Ｒ）に変換する。化学的シアル化に含まれる多
くのステップを避けるため、CMP−NeuAc（シチジン−モ
ノホスホ−シアル酸）及び２→６シアリルトランスフェ
ラーゼを用いた酵素的シアル化が好ましい。これらの結
合物はキャリアー蛋白質に結合後、免疫抗原として用い
ることができる。ｔ−ブトキシカルボニル（Boc）β−A
la−Ｏ−CH2−Panレジン及びリジン核を用いた多価抗原
ペプチド システム（MAP）の合成は既に記載されてい
る［Tam JP,Proc Natl Acad Sci USA,85,5409−5413,
（1988）］。
三価の結合体の合成はTn抗原のＮ−ヒドロキシサクシ
ニミル誘導体をリジルリジンとカップルさせることによ
り行われる。全反応のシークエンスを第12図スキームII
に示す。抗原１は刊行物記載の方法で［Paulsen H andH
olek J−P Carbohydr.Res.,109,89−107（1982）;Grund
ler G.and Schmidt RR,Liebigs Ann.Chem.,1826−1847
（1984）］合成した。高度にチャージされた結合物の発
生を与えるアミノグループのカチオン性の性質を除くた
め、セリンのアミノグループはメタノール溶解の無水酢
酸を用いた選択的Ｎ−アセチル化により修飾する必要が
ある。得られる化合物２を、縮合剤としてジシクロヘキ
シルカルボジイミドの存在下で、そのＮ−ヒドロキシサ
クシニミド誘導体に変換する。３と４（Bachem Bioscie
nce Inc.,Philadelphia,PA）とのカップリング反応は、
３の4.5M過剰量を用いて行い、３価の結合物５を得る。
H2Oを用いたP2カラムクロマトグラフィによる精製の
後、さらに４又はキャリアー蛋白質にカップルさせるた
め、結合物５をその活性エステル６に変換する。
本発明を詳細に且つその特定の態様を参照に説明して
きたが、本発明の精神及び範囲から離れることなく種々
の変更を成し得ることは当業者に明らかである。
寄託について ハイブリドーマ細胞ラインBM−８、BM−３、及びBM−
４はアメリカン タイプ カルチャー コレクション
（American Type Culture Collection,Rockville,Maryl
and）に1988年10月21日、1988年３月２日及び1988年３
月２日に夫々寄託され、夫々寄託番号HB−9873、HB−96
53及びHB−9654を有する。
寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関す
るブタペスト条約に従って成された。
本発明にアメリカ合衆国特許を付与することに対し、
全ての接触の制限は変更なしに除かれる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 クローゼン ヘンリック アメリカ合衆国 98119 ワシントン シアトル，エリオット アベニュー ウ ェスト201 ザ バイオメンブレン イ ンスティテュート内 (72)発明者 シンガイ アニル アメリカ合衆国 98119 ワシントン シアトル，エリオット アベニュー ウ ェスト201 ザ バイオメンブレン イ ンスティテュート内 (72)発明者 トヨクニ タツシ アメリカ合衆国 98119 ワシントン シアトル，エリオット アベニュー ウ ェスト201 ザ バイオメンブレン イ ンスティテュート内 (72)発明者 タカハシ ヘリオ アメリカ合衆国 98119 ワシントン シアトル，エリオット アベニュー ウ ェスト201 ザ バイオメンブレン イ ンスティテュート内 (72)発明者 ハコモリ センイチロー アメリカ合衆国 98119 ワシントン シアトル，エリオット アベニュー ウ ェスト201 ザ バイオメンブレン イ ンスティテュート内 (56)参考文献 特開 昭57−500195（ＪＰ，Ａ) ＪＮＣＩ，Ｖｏｌ．78，Ｎｏ．３ （1987） ｐ．489−495 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/08 C12N 5/20 C12N 15/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の確認された性質を有するモノクロー
    ナル抗体を分泌するハイブリドーマ： （１）IgMイソタイプであり、 （２）シアリルTn抗原と反応し、Ｔ抗原と反応せず、 かつ （３）NeuAcα２→6GalNAcα１→Ｏ−Ser/Thrに対しエ
    ピトープ特異的であり、NeuAcα２→6GalNAcβ１→Ｏ−
    Ser/Thrに対しエピトープ特異的でない。
  2. 【請求項２】モノクローナル抗体が、ハイブリドーマBM
    −３（ATCC寄託番号HB−9653）から分泌されるBM−３の
    確認された性質を全て有するものである請求項１記載の
    ハイブリドーマ。
  3. 【請求項３】モノクローナル抗体が、ハイブリドーマBM
    −３（ATCC寄託番号HB−9653）から分泌されるBM−３で
    ある請求項２記載のハイブリドーマ。
  4. 【請求項４】以下の確認された性質を有するモノクロー
    ナル抗体を分泌するハイブリドーマ： （１）IgG1イソタイプであり、 （２）シアリルTn抗原と反応し、Ｔ又はTn抗原とは反応
    せず、 （３）NeuAcα２→6GalNAcα１→Ｏ−Ser/Thrに対しエ
    ピトープ特異的であり、NeuAcα２→6GalNAcβ１→Ｏ−
    Ser/Thrに対しエピトープ特異的でなく、かつ （４）Fab又は(Fab)2フラグメントに容易に分解でき
    る。
  5. 【請求項５】モノクローナル抗体が、ハイブリドーマBM
    −４（ATCC寄託番号HB−9654）から分泌されるBM−４の
    確認された性質を全て有するものである請求項４記載の
    ハイブリドーマ。
  6. 【請求項６】モノクローナル抗体が、ハイブリドーマBM
    −４（ATCC寄託番号HB−9654）から分泌されるBM−４で
    ある請求項５記載のハイブリドーマ。
  7. 【請求項７】以下の確認された性質を有するモノクロー
    ナル抗体： （１）IgMイソタイプであり、 （２）シアリルTn抗原と反応し、Ｔ抗原と反応せず、 かつ （３）NeuAcα２→6GalNAcα１→Ｏ−Ser/Thrに対しエ
    ピトープ特異的であり、NeuAcα２→6GalNAcβ１→Ｏ−
    Ser/Thrに対しエピトープ特異的でない。
  8. 【請求項８】モノクローナル抗体が、ハイブリドーマBM
    −３（ATCC寄託番号HB−9653）から分泌されるBM−３の
    確認された性質を全て有するものである請求項７記載の
    モノクローナル抗体。
  9. 【請求項９】モノクローナル抗体が、ハイブリドーマBM
    −３（ATCC寄託番号HB−9653）から分泌されるBM−３で
    ある請求項８記載のモノクローナル抗体。
  10. 【請求項１０】以下の確認された性質を有するモノクロ
    ーナル抗体： （１）IgG1イソタイプであり、 （２）シアリルTn抗原と反応し、Ｔ又はTn抗原とは反応
    せず、 （３）NeuAcα２→6GalNAcα１→Ｏ−Ser/Thrに対しエ
    ピトープ特異的であり、NeuAcα２→6GalNAcβ１→Ｏ−
    Ser/Thrに対しエピトープ特異的でなく、かつ （４）Fab又は(Fab)2フラグメントに容易に分解でき
    る。
  11. 【請求項１１】モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ
    BM−４（ATCC寄託番号HB−9654）から分泌されるBM−４
    の確認された性質を全て有するものである請求項10記載
    のモノクローナル抗体。
  12. 【請求項１２】モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ
    BM−４（ATCC寄託番号HB−9654）から分泌されるBM−４
    である請求項11記載のモノクローナル抗体。
JP1504002A 1988-03-11 1989-03-10 「動物及びヒトのムチンを用い、並びに合成炭水化物−担体結合物を用いた免疫による、ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体」 Expired - Lifetime JP2849683B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16778688A 1988-03-11 1988-03-11
US167,786 1988-03-11
US31749289A 1989-03-01 1989-03-01
US317,492 1989-03-01

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP10205777A Division JP3066741B2 (ja) 1988-03-11 1998-07-07 癌細胞の増殖及び複製を抑制するための組成物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH02503387A JPH02503387A (ja) 1990-10-18
JP2849683B2 true JP2849683B2 (ja) 1999-01-20

Family

ID=26863475

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP1504002A Expired - Lifetime JP2849683B2 (ja) 1988-03-11 1989-03-10 「動物及びヒトのムチンを用い、並びに合成炭水化物−担体結合物を用いた免疫による、ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体」
JP10205777A Expired - Fee Related JP3066741B2 (ja) 1988-03-11 1998-07-07 癌細胞の増殖及び複製を抑制するための組成物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP10205777A Expired - Fee Related JP3066741B2 (ja) 1988-03-11 1998-07-07 癌細胞の増殖及び複製を抑制するための組成物

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0357767B1 (ja)
JP (2) JP2849683B2 (ja)
AT (1) ATE123066T1 (ja)
CA (1) CA1340587C (ja)
DE (1) DE68922806T2 (ja)
WO (1) WO1989008711A1 (ja)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE134649T1 (de) * 1990-01-26 1996-03-15 Bay Dev Corp Sa Arzneimittel und verfahren zur behandlung von erworbenem immundefizienzsyndrom (aids) und aids- verwandtem komplex unter verwendung von karbohydratspezifischen antikörpern
WO1992009293A1 (en) * 1990-11-23 1992-06-11 The General Hospital Corporation Inhibition of cell adhesion protein-carbohydrate interactions
US5876716A (en) * 1991-01-24 1999-03-02 Bay Development Corporation Sa Method of using an antibody to the TN antigen for the inhibition of HIV infection
AUPM322393A0 (en) * 1993-12-24 1994-01-27 Austin Research Institute, The Mucin carbohydrate compounds and their use in immunotherapy
US5527891A (en) * 1994-03-09 1996-06-18 Biomira, Inc. Stereodirected process for synthesis of α-N-acetylgalactosaminides
US6548643B1 (en) * 1994-11-16 2003-04-15 Austin Research Institute Antigen carbohydrate compounds and their use in immunotherapy
US8021667B2 (en) 1994-11-16 2011-09-20 Macfarlane Burnet Institute For Medical Research And Public Health Ltd Compositions for immunotherapy and uses thereof
EP1027063B1 (en) 1997-09-29 2009-02-18 The Macfarlane Burnet Institute For Medical Research And Public Health Ltd Mannose receptor bearing cell line and antigen composition
GB9904695D0 (en) * 1999-03-01 1999-04-21 Imp Cancer Res Tech Peptide
EP1087119B1 (en) 1999-04-06 2004-10-13 Mitsubishi Jidosha Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust emission control device of internal combustion engines
KR102262720B1 (ko) * 2014-04-28 2021-06-08 이카가쿠 소우야쿠 가부시키가이샤 항muc1 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 및 그 용도
EP3694889A1 (en) * 2017-10-13 2020-08-19 Boehringer Ingelheim International GmbH Human antibodies to thomsen-nouvelle (tn) antigen
US11161911B2 (en) 2017-10-23 2021-11-02 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-MUC1 antibodies and their uses
PT110526B (pt) * 2018-01-26 2021-02-04 Univ Nova De Lisboa Anticorpo, fragmento funcional ou sonda do mesmo contra antigénios tumorais

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444744A (en) * 1980-03-03 1984-04-24 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies to cell surface antigens

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＪＮＣＩ，Ｖｏｌ．７８，Ｎｏ．３（１９８７） ｐ．４８９−４９５

Also Published As

Publication number Publication date
ATE123066T1 (de) 1995-06-15
DE68922806D1 (de) 1995-06-29
JPH1192400A (ja) 1999-04-06
CA1340587C (en) 1999-06-08
WO1989008711A1 (en) 1989-09-21
JPH02503387A (ja) 1990-10-18
DE68922806T2 (de) 1996-02-29
EP0357767A4 (en) 1990-09-05
EP0357767B1 (en) 1995-05-24
JP3066741B2 (ja) 2000-07-17
EP0357767A1 (en) 1990-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5229289A (en) Monoclonal antibodies and vaccine development directed to human cancer-associated antigens by immunization with animal and human and with synthetic carbohydrate-carrier conjugates
US5660834A (en) Monoclonal antibodies and vaccine development directed to human cancer-associated antigens by immunization with carbohydrate-carrier conjugates
Fuks et al. Carcinoembryonic antigen (CEA): Molecular biology and clinical significance
JP4122050B2 (ja) ヒト癌腫抗原（ｈｃａ）、ｈｃａ抗体、ｈｃａ免疫アッセイ法、画像化の方法及び治療
JP2849683B2 (ja) 「動物及びヒトのムチンを用い、並びに合成炭水化物−担体結合物を用いた免疫による、ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体」
JPH05504330A (ja) ヒトのがん腫と反応する新しい抗体
US5240833A (en) Method for the production of monoclonal antibodies directed to tumor-associated gangliosides and fucogangliosides
JPH07206707A (ja) 抗原炭水化物複合体及びその免疫療法への応用
US5308614A (en) Methods for the production of antibodies and induction of immune responses to tumor-associated gangliosides by immunization with ganglioside lactones
WO1997011963A1 (en) ANTI-GALα(1,3)GAL ANTIBODY BINDING PEPTIDES
JPH04502702A (ja) ヒト癌に対する新規なモノクローナル抗体
US9487567B2 (en) Method for the production of an immunostimulating mucin (MUC1)
JP4125383B2 (ja) 悪性腫瘍中のｎ−グリコリル化−ガラクトース−グルコース シアル酸オリゴ糖を認識するモノクローナル抗体及びこの抗体を含有する組成物
EP0381310A1 (en) Monoclonal antibodies directed to tumor-associated gangliosides and fucogangliosides and method for production thereof
US5788985A (en) Vaccine composition for eliciting an immune response against N-glycolylated gangliosides and its use for cancer treatment
KR100771752B1 (ko) 항암 예방접종용 항체의 용도
Longenecker et al. Specificity of the IgG response in mice and human breast cancer patients following immunization against synthetic sialyl-Tn, an epitope with possible functional significance in metastasis
US20040001789A1 (en) Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of gp96 or precursors thereof
Ito et al. Carbohydrates as antigenic determinants of tumor‐associated antigens recognized by monoclonal anti‐tumor antibodies produced in a syngeneic system
US5876716A (en) Method of using an antibody to the TN antigen for the inhibition of HIV infection
Adobati et al. In vitro mimicry of CaMBr1 tumor-associated antigen by synthetic oligosaccharides
EP0511967B1 (en) Medicaments and methods for treating acquired immune deficiency syndrome (aids) and aids-related complex (arc) employing anti-carbohydrate antibodies
US5073493A (en) Monoclonal antibody nky13
EP0162825A2 (en) The use of a specific carcinom associated antigen (hapten), fucosylsialosylgangliotetraose (Fuc-GM1) in diagnostic or therapeutic procedures related to human lung cancer (small cell carcinomas)
Cheresh Structural and functional properties of ganglioside antigens on human tumors of neuroectodermal origin

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091113

Year of fee payment: 11