ES2322212T3

ES2322212T3 - Composicion de antigeno y linea celular que lleva el receptor manosa.

Info

Publication number: ES2322212T3
Application number: ES98947738T
Authority: ES
Inventors: Ian F. C. Mckenzie; Vasso Apostolopoulos; Geoffrey A. Pietersz
Original assignee: Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health Ltd
Current assignee: Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health Ltd
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-29
Publication date: 2009-06-17
Anticipated expiration: 2018-09-29
Also published as: DK1027063T3; US20070071765A1; JP2001517709A; DE69840578D1; EP1027063B1; CA2304952A1; CA2304952C; JP4669930B2; US8771701B2; AU754065B2; EP1027063A1; JP5192020B2; WO1999016455A1; ATE422893T1; JP2011046723A; EP1027063A4; AU9455598A

Abstract

Una composición inmunorreguladora que comprende células que llevan el receptor manosa aislado y un conjugado que comprende un antígeno y manosa seleccionado del grupo que consiste de manosa completamente oxidada y aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida, en donde dicha composición provoca una respuesta inmune mediada por célula contra dicho antígeno.

Description

Composición de antígeno y línea celular que lleva el receptor manosa.

La presente invención se relaciona con un producto y proceso para regular la actividad de células T utilizando un compuesto carbohidrato, específicamente manosa. El producto de la presente invención se relaciona particularmente con una célula que lleva el receptor manosa y una manosa oxidada ligada a un antígeno, el producto es capaz de mejorar la presentación de antígeno MHC clase I.

Antecedente de la invención

El cáncer es la causa principal de muerte y trauma severo en la sociedad moderna. El cáncer afecta a las personas jóvenes, ancianas, hombres, mujeres y personas de todas las razas, aunque el cáncer en niños es relativamente raro, no obstante con la excepción de leucemia en la infancia. En la sociedad occidental, el cáncer de colon y carcinoma broncopulmonar son enfermedades principales. En las mujeres, el cáncer de mama es la forma más común de cáncer.

Muchos cánceres se acompañan por la sobreproducción de mucina humana. Las mucinas son proteínas altamente glucosiladas (más de aproximadamente 100 kilodalton (kD) que se producen por muchos tumores y células epiteliales (Gendler et al., J. Biol.Chem, 263: 12820-12823, 1988). Las mucinas encontradas en células neoplásicas son diferentes en algunos aspectos a aquellas en células epiteliales normales, en que algunas mucinas tienen una deficiencia en su cubierta de carbohidrato con deja expuesto el núcleo de proteína (Harisch et al., J. Biol. Chem., 264: 872-883, 1989). Existen siete formas de mucina conocidas humanas denominadas MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC6 y MUC7 (Marjolijn et al., J. Biol. Chem., 265: 5573-5578, 1990; Crocker et al., Br. J.Cancer, 55: 651-652, 1987; Apostolopoulos et al., Crit. Rev. Immunol., 14: 293-309, 1994; y Bobek et al.; J. Biol.Chem., 268: 20563-20569, 1993). El MUC1 es más ubicuo. Todas las varias mucinas tienen propiedades muy similares, que son, glucoproteínas de transmembrana, todas tienen un número de variables de secuencias de aminoácido repetidas, que tienen un alto contenido de serina, treonina y prolina. La sobreproducción de mucinas glucosiladas aberrantemente (no glucosilado y una deficiencia en la glucosilación) es característica de tumores de mama, ovario, páncreas, colon, bronquios-pulmones, próstata y otros tumores de tejido secretor. Se han clonado y caracterizado las secuencias de copia de ADN (cADN) de los núcleos de proteína respectivos de la mucina humana MUC1 a MUC7 y se ha encontrado que contiene porciones centrales altamente repetitivas de varios números de repeticiones particularmente de motivos de aminoácido (conocido como VNTR). Por vía de ejemplo, el MUC1 consiste de secuencias de terminal carboxilo y amino únicas separadas por una porción central altamente repetitiva que contiene cuarenta a ochenta copias dispuestas en tándem o repeticiones de un motivo de veinte aminoácidos. Los VNTR de MUC1 a MUC7 se establecen adelante:

MUC1 VNTR- SAPDTRPAPGSTAPPAHGVT (SEQ ID NO: 1)

MUC2 VNTR- PTTTPISTTTMVTPTPTGTQT (SEQ ID NO: 2)

MUC3 VNTR- HSTPSFTSSITTTETTS (SEQ ID NO: 3)

MUC4 VNTR - TSSASTGHATPLPVTD (SEQ ID NO: 4)

MUC5 VNTR - PTTSTTSA (494 insertos de par base-ocho repeticiones de aminoácido en tándem)

MUC6 VNTR - 169 unidades de repetición de aminoácido (SEQ ID NO: 5)

MUC7 VNTR- TTAAPPTPPATTPAPPSSSAPPE (SEQ ID NO: 6).

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La subunidad repetida de MUC6 comprende 169 aminoácidos, aunque en este momento la secuencia de aminoácido de esta unidad repetida no se ha caracterizado completamente. La secuencia MUC7 ha sido recientemente publicada (Bobek et al., ibid.).

Finn y colegas han demostrado que en los ganglios linfáticos de pacientes con cáncer de mama (Barnd et al.,Proc. Natl. Acad. Sci USA, 86: 7159-7163, 1989; y Jerome et al., in Cell. Immunity and Immunotherapy of Cancer,pp. 321-328, 1990), cáncer de páncreas, ovario y otros tumores, los linfocitos citotóxicos que están presentes reaccionan con mucina humana. Los anticuerpos para el péptido MUC1 pueden bloquear la actividad de estos linfocitos T citotóxicos en MUC1 y las células objetivo (Barnd et al., ibid.; y Jerome et al., ibid.). Recientemente, también se han descrito linfocitos citotóxicos para un carcinoma broncopulmonar de murino (Mandelboimo et al., Nature, 369: 67-71, 1994).

La cirugía asociada con la remoción del tumor es traumática para el paciente, desfigurándolo frecuentemente, y es costosa. Los procedimientos de radiación y quimioterapéuticos establecidos para el tratamiento del tumor que se pueden llevar a cabo en lugar de, o en conjunto con, procedimientos quirúrgicos son a menudo debilitantes y se asocian con severos efectos colaterales. De acuerdo con esto existe una necesidad urgente para composiciones inmunorreguladoras y métodos para la prevención/tratamiento de tumores.

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Existe una necesidad urgente para nuevas composiciones y métodos para el tratamiento del cáncer. De forma similar, se aprecia la necesidad para composiciones alternativas y métodos para el tratamiento de otros estados de enfermedad tal como alergias tipo I, malaria, VIH, caries dental, gripe, cólera, enfermedad de la boca y el pie, meningitis, infección Leishmania, tosferina, rabia, infección por estreptococo, infección respiratoria, sarampión, enfermedad de Lyme, tuberculosis, meningitis bacteriana, zóster, rubeola, hepatitis, herpes, hepatitis A, polio, enfermedad venérea/tracoma, hepatitis B, resfriado común, cáncer cervical, meningitis/neumonitis, viruela aviar, viruela y neumonía/PUO.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona una composición inmunorreguladora que comprende células que llevan el receptor manosa aislado y un conjugado que comprende un antígeno y manosa seleccionado del grupo que consiste de manosa completamente oxidada y aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida que es capaz de regular una respuesta de linfocito T (células T) en un animal, tratando o aliviando por lo tanto la ocurrencia de la enfermedad. La presente invención es ventajosa debido a que esta regula las respuestas de células T al suministrar un antígeno a la ruta MHC clase I para presentación mediante moléculas clase I, induciendo por lo tanto la producción de linfocitos T citotóxicos y citoquina Tl (es decir, TH1), por ejemplo, IL-2, IL-12 y gamma interferón. La invención es particularmente ventajosa porque regula las respuestas de célula T al incrementar la retoma de un conjugado de antígeno:manosa de la presente invención al inducir receptores para manosa en células capaces de estimular células T reactivas al antígeno del conjugado. En adición, la invención es particularmente ventajosa porque posibilita un antígeno, por ejemplo una mucina: conjugado de polímero manosa de la presente invención, a ser administrado por un animal de tal manera que une al antígeno, por ejemplo, mucina, se evita mediante anticuerpos de ocurrencia natural dirigidos contra o de reacción cruzada con el antígeno en el animal. Más aún, una composición inmunorreguladora de la presente invención posee la ventaja de no ser sustancialmente tóxica luego de administración a los animales, y como una consecuencia las composiciones son bien toleradas por los animales.

Una modalidad de la presente invención incluye una composición inmunorreguladora que comprende células aisladas que llevan el receptor manosa y un conjugado que comprende un antígeno y manosa seleccionada de manosa completamente oxidada y/o aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida en donde la composición provoca una respuesta inmune mediada por células contra el antígeno. Antígenos preferidos incluyen antígenos de tumor, víricos, fúngicos, protozoarios o bacterianos. La manosa oxidada preferida comprende un polímero carbohidrato con aldehídos.

Otra modalidad de la presente invención incluye una composición que comprende una población celular que lleva el receptor manosa inmunorregulador, en donde la población se puede derivar al cultivar células que llevan el receptor manosa bajo condiciones efectivas para producir la población celular inmunorreguladora que lleva el receptor manosa, las condiciones que comprenden un medio de suministro de antígeno. El medio de suministro de antígeno comprende un conjugado que comprende un antígeno y manosa seleccionado de manosa oxidada y/o aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida.

Todavía otra modalidad de la presente invención incluye una población celular que lleva el receptor manosa inmunorregulador para uso en provocar una respuesta inmune mediada por célula, en la cual la población celular que lleva el receptor manosa inmunorregulador se puede derivar mediante un método que comprende: (a) cultivar células que llevan el receptor manosa in vitro con uno o más modificadores de la respuesta biológica para producir una población celular que lleva el receptor manosa mejorado; y (b) incubar la población celular que lleva el receptor manosa mejorado con un conjugado que comprende un antígeno y manosa seleccionada de manosa oxidada y/o aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida, para obtener la población celular que lleva del receptor manosa inmunorregulador. Los modificadores preferidos de la respuesta biológica incluyen citoquinas y vitaminas.

La presente invención también incluye un vehículo de suministro de antígeno mucina, que comprende una célula que lleva el receptor manosa aislado y un conjugado que comprende antígeno mucina y un polímero carbohidrato que comprende manosa seleccionado de manosa completamente oxidada y/o aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida.

La presente invención también incluye un método para obtener una población que comprende células inmunorreguladoras que llevan el receptor manosa, el método que comprende cultivar una población de células enriquecidas por células que llevan el receptor manosa bajo condiciones efectivas para obtener células inmunorreguladoras que llevan el receptor manosa, las condiciones que comprenden un medio de suministro de antígeno que comprende un conjugado que comprende un antígeno y manosa seleccionado del grupo que consiste de manosa oxidada completamente y aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida. Preferiblemente, el método incluye incubar la población de células enriquecidas por células que llevan el receptor manosa en la presencia de uno o más modificadores de la respuesta biológica antes de la etapa de cultivo.

Otra modalidad de la presente invención incluye una composición inmunorreguladora que comprende células que llevan el receptor manosa y un conjugado que comprende un antígeno y manosa seleccionada de manosa completamente oxidada y/o aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida para uso en inducir una respuesta inmune.

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De aquí que una célula que lleva el receptor manosa aislado puesto en contacto con un conjugado que comprende antígeno y manosa seleccionada de manosa completamente oxidada y/o aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida, es capaz de provocar una respuesta inmune a un antígeno.

Adicionalmente, una célula que lleva el receptor manosa que ha sido puesta en contacto con un conjugado que comprende un antígeno y manosa seleccionada de manosa completamente oxidada y/o aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida, es capaz de presentar el antígeno a una célula T de tal manera que se provoca una respuesta de la célula T.

Se describe aquí un compuesto que comprende un antígeno conjugado con un polímero manosa que comprende manosa parcialmente reducida que tiene grupos aldehído.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1 ilustra Frecuencias CTLp obtenidas mediante una inmunización in vitro única comparado con tres inmunizaciones in vivo utilizando células de exudado peritoneal pulsadas con diferentes formas de polímero manosa.

Fig. 2 ilustra el número mínimo células que llevan el receptor manosa que presentan antígeno necesarias por inducir una respuesta de célula T.

Fig. 3 ilustra crecimiento de tumor en ratones inmunizados con antígeno exudado peritoneal que presenta células que llevan el receptor manosa pulsado con MUC1 oxidado, proteína de fusión manan oxidada o amortiguador solo.

Fig. 4 ilustra frecuencias CTLp utilizando células de exudado peritoneal, que contienen células que llevan el receptor manosa que presentan antígeno, tratado con GM-CSF o interferón gamma y pulsado con proteína de fusión manan oxidada.

Fig. 5 ilustra frecuencias CTLp de ratones inactivados GM-CSF o G-CSF inmunizados con proteína de fusión manan oxidada.

Fig. 6 ilustra frecuencias CTLp en ratones inyectados con GM-CSF antes de inyección con proteína de fusión manan oxidada.

Fig. 7 ilustra frecuencias CTLp en receptores alogénicos o semialogénicos de macrófagos pulsados con proteína de fusión oxidada.

Fig. 8 ilustra análisis FACS para la reacción cruzada entre MUC1 y gal en Gala (1,3) Gal- líneas celulares y Gala(1,3) Gal+ líneas celulares.

Fig. 9 ilustra la detección de anticuerpos de péptido anti-MUC1 en suero aislado de ratones Gal o/o y ratones C57BL/6 inmunizados con proteína de fusión manan oxidada.

Fig. 10 ilustra la detección de anticuerpos de péptido anti-MUC1 en suero aislado de ratones Gal o/o inmunizados con la proteína de fusión manan oxidada o macrófagos pulsados con proteína de fusión manan oxidada.

Fig. 11 ilustra la diferencia en las frecuencias CTLp entre ratones normales inyectados con mezcla de ox-M-FP y ox-M-FP con suero gal o/o.

Fig. 12 ilustra la diferencia en las frecuencias CTLp entre ratones inmunizados con células de macrófago pulsadas con ox-M-SIINFEKL y ratones inmunizados con células de macrófago pulsadas con mezcla de ox-M-SIINFEKL con suero gal o/o.

Fig. 13 ilustra la diferencia en frecuencias CTLp entre ratones normales y Gal o/o inmunizados con macrófagos y proteína de fusión manan oxidada en la presencia de suero de ratón normal o suero aislado de ratones Gal o/o.

Fig. 14 ilustra el acoplamiento de la proteína de fusión MUC1 a manan.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se relaciona con un producto y su uso para tratar o aliviar la ocurrencia de enfermedad en un animal susceptible a inmunoregulación. El producto incluye una composición inmunorreguladora que comprende células que llevan el receptor manosa, y un conjugado que comprende un antígeno y manosa oxidada.

Una modalidad de la presente invención es una composición inmunorreguladora que comprende células aisladas que llevan el receptor manosa y un conjugado que comprende un antígeno y manosa seleccionada del grupo que consiste de manosa completamente oxidada y aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida. Como se utiliza aquí, el término "manosa oxidada" se puede referir a manosa oxidada completamente (es decir, totalmente) o a aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida (descrito en detalle adelante). Se describen aquí células que llevan el receptor puestas en contacto con un conjugado que comprende un antígeno y manosa oxidada. De acuerdo con la presente invención, la referencia a una composición que comprende "células que llevan el receptor manosa y un conjugado que comprende un antígeno y manosa oxidada" o "células que llevan el receptor manosa puestas en contacto con un conjugado que comprende un antígeno y manosa oxidada" pueden abarcar uno o más de: (1) una mezcla de conjugado y células que llevan el receptor en donde el conjugado no se une a las células; (2) una mezcla de conjugado y las células que llevan el receptor en donde el conjugado se une a las células, pero aún no internalizadas; (3) las células que llevan el receptor en donde el conjugado se ha internalizado; (4) las células que llevan el receptor en donde el conjugado se ha internalizado y procesado; y/o (5) las células que llevan el receptor en donde el conjugado se ha internalizado, procesado y presentado. Se nota que el término "un" o "una" entidad se refiere a una o más entidades; por ejemplo, un compuesto se refiere a uno o más compuestos. Como tal, los términos "un" (o "uno"), "uno o más" y "por lo menos uno" se pueden utilizar intercambiablemente aquí. El término "aislado" se refiere a una entidad, tal como una célula, polipéptido, o péptido, que se ha removido de su milio natural. Como tal, "aislado" no refleja el grado en el cual la entidad se ha purificado. Como se utiliza aquí, una "célula que lleva el receptor manosa" se refiere a cualquier tipo de célula que contiene un receptor manosa (es decir, proteína) que se une específicamente a manosa en la superficie de la célula o que es capaz de expresar un receptor manosa. Receptores manosa como se utiliza aquí se refiere a aquellos receptores manosa conocidos por aquellos expertos en la técnica. Se nota que las células que llevan el receptor manosa pueden ser parte de una población de células que contienen varias concentraciones de células que llevan el receptor manosa. Así, una población de células que llevan el receptor manosa incluye una población de células que incluye por lo menos una célula que lleva el receptor manosa. Alternativamente, una población de células que lleva el receptor manosa puede comprender una población de células puras que llevan el receptor manosa (es decir, 100% células que llevan el receptor manosa). Preferiblemente, una población de células que llevan el receptor manosa comprende por lo menos aproximadamente 25%, mas preferiblemente por lo menos aproximadamente 50%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 75%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 80%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 85%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% y aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95% de células que llevan el receptor manosa. Está dentro del conocimiento de un experto en la técnica notar que la pureza relativa de una población de células que llevan el receptor manosa puede depender de la fuente de células que llevan el receptor manosa. Como se utiliza aquí, una "población enriquecida de células que llevan el receptor manosa" se refiere a una población de células que ha sido tratada de tal manera que las células que no llevan el receptor manosa (es decir, células que tienen, o que son capaces de expresar, receptor manosa) se han removido de la población. Como se utiliza aquí, una "población de célula mejorada que lleva el receptor manosa" se refiere a una población de células que ha sido tratada de tal manera que el número de células que lleva el receptor manosa, y/o el número de receptores manosa en una célula, se incrementa comparado con células en la población antes de tratamiento. Las células que llevan el receptor manosa se pueden enriquecer en una población de células de, por ejemplo, lavado bronquial o ganglio linfático, sangre, médula ósea, utilizando métodos estándar en la técnica, que incluyen pero no se limitan a, toma panorámica, leucofóresis o técnicas enriquecidas de crecimiento. Se describen en detalle aquí métodos para mejorar una población de células que llevan el receptor manosa.

Células adecuadas que llevan el receptor manosa para uso con la presente invención incluyen células que se han aislado de un animal o células que se han adaptado al cultivo de tejido y se hacen crecer in vitro. Como se utiliza aquí, el término "in vitro" se refiere a métodos desarrollados en el exterior de un animal. El término "ex vivo" se refiere a métodos desarrollados en un porción (por ejemplo, tejido, células y fluidos) de un animal (es decir, animal donante), en el exterior del animal, con el objeto de regresar la porción al animal (es decir, animal receptor). El animal receptor necesita ser el mismo animal como el animal donante. Las células preferidas que llevan el receptor manosa de la presente invención se derivan de médula ósea, leucocitos de sangre periférica, macrófagos de pulmón alveolares, blastocitos, células de tumor y/o estromacito. Las células se pueden aislar de un animal utilizando métodos estándar conocidos en la técnica que dependen de la fuente de las células. Las células más preferidas que llevan el receptor manosa incluyen células que se enriquecen por células que presentan antígeno (APC). Las células que presentan antígeno adecuadas incluyen células capaces de presentar un antígeno a una célula T, provocando por lo tanto una respuesta de célula T. Una porción de una respuesta inmune se regula mediante la presentación del antígeno mediante complejos de histocompatibilidad principal (MHC). Los MHC se unen a los fragmentos de péptido derivados de antígenos para formar complejos que se reconocen por los receptores de célula T sobre la superficie de las células T, provocando el fenómeno de reconocimiento de célula T restringida MHC. Una "respuesta a célula T" se refiere a la reacción de una célula T a antígeno presentada por el complejo MHC y péptido. Una respuesta por célula T puede incluir la activación en la célula T tal como con una célula T sin exposición previa, o estimulación de una célula T tal como con una célula T que ya se ha activado. Una "respuesta inmune mediada por célula" se refiere a una respuesta inmune que involucra la activación y/o estimulación de una célula T. De acuerdo con la presente invención, una composición de la presente invención puede provocar una respuesta de célula T al activar y/o estimular células T, en células T específicas a antígeno particular. El antígeno preferido presenta células que incluyen células dendríticas, macrófagos, monocitos y linfocitos B (células B), siendo células macrófagas y monocitos las más preferidas. Se utilizan células que llevan el receptor manosa, es decir células que tiene receptores manosa. Como se utiliza aquí, "que lleva al receptor" y células de receptor positivo se pretenden utilizar intercambiablemente. Las células preferidas que llevan el receptor manosa de la presente invención incluyen células que están enriquecidas por células que se unen específicamente a un anticuerpo que incluye F4/80, anticuerpo anti-MAC-1, anticuerpo de receptor anti-manosa, anticuerpo NLDC-145, anticuepro anti-CD14, anticuerpo anti-CD11b, anticuerpo anti-CD11C, anticuerpo anti-CD68, anticuerpo anti-CD80 o anticuerpo anti-CD86.

Preferiblemente, una célula que lleva el receptor manosa de la presente invención se origina de un animal que es el receptor destinado de la composición inmunorreguladora o un animal que coincide con MHC al receptor destinado, tal como de un donante no relacionado o uno relacionado del animal, preferiblemente un hermano de un animal. Una célula que lleva el receptor manosa preferida se obtiene de un animal que es el receptor destinado de la composición inmunorreguladora de la presente invención.

En una modalidad, células que llevan el receptor manosa incluyen células que llevan el receptor manosa que han sido puestas en contacto con un compuesto capaz de inducir la expresión de los receptores para manosa en células capaces de expresar receptores manosa. Compuestos adecuados útiles para inducir la expresión de los receptores manosa incluyen modificadores de la respuesta biológica, tal como citoquinas. Modificadores preferidos de la respuesta biológica de la presente invención incluyen cualquier compuesto capaz de inducir la expresión de receptores manosa en monocitos, macrófagos y/o células dendríticas. Modificadores más preferidos de la respuesta biológica incluyen, pero no se limitan a, citoquinas y vitaminas. La citoquina útil preferida para incrementar el número de receptores manosa en la superficie de una célula incluyen, pero no se limitan a, factor de estimulación de colonia macrófaga de granulocitos (GM-CSF), interleuquina-3 (IL-3), interleuquina-4 (IL-4), interferón gamma, Ligando Flt-3; factor de estimulación la colonia de granulocitos (G-CSF); interleuquina-12 (IL-12), factor de necrosis de tumor alfa (TNF-a), factor de estimulación de colonia de macrófago (M-CSF), interleuquina-3 (IL-3), interleuquina-4 (IL-4) y/o interleuquina-6 (IL-6), con GM-CSF y siendo más preferido IL-3. Una vitamina preferida para uso con la presente invención incluye, pero no se limita a, vitamina D.

Las células que llevan el receptor manosa se pueden poner en contacto con un modificador de la respuesta biológica antes de o después que las células que llevan el receptor manosa se remuevan de un animal. Como tal, se puede administrar un modificador de la respuesta biológica a un animal bajo condiciones adecuadas para inducir receptores carbohidrato en células in vivo.

En una modalidad preferida, las células que llevan el receptor manosa incluyen una población de células que contienen monocitos, macrófagos y/o células dendríticas que han sido puestas en contacto con una formulación que comprende GM-CSF, IL-3, IL-4, TNF gama y/o vitamina D.

Una población celular que comprende células inmunorreguladoras que llevan el receptor manosa, se puede obtener por el método que comprende cultivar una población de células enriquecidas por células que llevan el receptor manosa bajo condiciones efectivas para obtener el carbohidrato inmunorregulador de las células que llevan el receptor, en cuyas condiciones comprenden un medio de suministro de antígeno. Un medio de suministro de antígeno incluye un conjugado que comprende un antígeno y manosa oxidada. Componentes adicionales de un medio de suministro de antígeno incluyen el medio de cultivo celular adecuado tal como el que se describe aquí en los Ejemplos y aquellos conocidos por un experto en la técnica. Métodos para cultivar una población de células enriquecidas por células que llevan el receptor manosa se describen aquí en los Ejemplos. Preferiblemente, la etapa de cultivo se desarrolla de aproximadamente 1 día a aproximadamente 12 días, más preferiblemente de aproximadamente 3 días a aproximadamente 10 días, y aún más preferiblemente de aproximadamente 5 días a aproximadamente 7 días, con 5 días siendo aún más preferido.

La presente invención también incluye una población celular que lleva el receptor manosa inmunorregulador para uso en provocar una respuesta inmune mediada por célula que se puede derivar por el método que comprende: (a) cultivar células que llevan el receptor manosa in vitro con uno o más modificadores de la respuesta biológica para producir una población celular que lleva el receptor manosa mejorado; y (b) incubar la población celular que lleva el receptor manosa mejorado con un conjugado que comprende un antígeno y manosa oxidada para obtener una población celular que lleva el receptor manosa inmunorregulador. Preferiblemente, la etapa de cultivar se desarrolla de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 6 horas, más preferiblemente de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 4 horas y aún más preferiblemente durante aproximadamente 3 horas.

De acuerdo con la presente invención, un antígeno incluye un polipéptido o un péptido. Los antígenos de la presente invención inician una serie de eventos que culminan en una respuesta inmune, celular o humoral. En particular, los antígenos de la presente invención incluyen aquellos que están presentes en las células T en el contexto de MHC. Antígenos adecuados para uso con la presente invención incluyen polipéptidos y péptidos. Los polipéptidos que comprenden un antígeno se pueden producir de acuerdo procedimientos bien conocidos tal como síntesis de péptido, purificación de proteína, o expresión de polipéptidos en células anfitrionas. La síntesis de péptido se puede empelar los polipéptidos que contienen hasta aproximadamente 100 aminoácidos (por ejemplo, cinco subunidades repetidas de MUC1). Generalmente, para el polipéptido que contiene aproximadamente veinte o más aminoácidos, los medios preferidos de producción es la expresión recombinante en una célula anfitriona, preferiblemente una célula anfitriona procariótica, y más preferiblemente una célula anfitriona bacteriana. Sin embargo, como se discutió anteriormente, también se pueden utilizar sistemas eucarióticos. Los procedimientos para la expresión de proteínas recombinantes en células anfitrionas son bien establecidos, ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1989.

De acuerdo con la presente invención, un péptido es un péptido aislado. Un péptido aislado se refiere a un péptido que no está en su milio natural. Un péptido aislado se puede obtener de su fuente natural, producido por proteólisis de una proteína de longitud completa o fragmento de proteína más grande, producido utilizando tecnología de ADN recombinante o se sintetiza utilizando métodos de síntesis de péptido químico estándar.

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En la medida en que se relaciona la presente invención, el antígeno puede ser un autoantígeno o un péptido antigénico derivado de un virus, microorganismo o planta o una subunidad de aminoácido de por lo menos cinco aminoácidos en longitud de un autoantígeno o un péptido antigénico derivado de un virus, microorganismo o planta. El antígeno también puede consistir de más de una, cinco o más subunidades de aminoácido (como se mencionó anteriormente) ligadas juntas. Estas subunidades ligadas pueden ser los mismos o diferentes orígenes dentro de las uniones descritas anteriormente. Un péptido antigénico es capaz de unir a una molécula MHC.

Ejemplos de los antígenos adecuados para uso en una composición de la presente invención incluyen: antígeno de tumor que incluye, pero no se limita a CEA, p53, Her2/neu, ErB2, melan A, antígenos MAGE, nm23, BRACA1, BRACA2; polen, núcleo del virus de la hepatitis C (VIH), proteínas E1, E2, y NS2; proteína Plasmodium faliciparum circumsporozoite; glucoproteína de envoltura VIH-gp120/160; proteína Ag de superficie de estreptococo; nucleoproteína influenza; infección de la superficie de hemaglutinina-neuraminidasa; subunidad pilin TcpA; proteína VP1; nucleoproteína LMCV; glucoproteína de superficie Leishmania principal (gp63); proteína de superficie Bordetella pertussis; proteína G del virus de la rabia; proteína M Estreptococo; proteínas F o G del virus sincitial respiratorio (RSV); virus Epstein Barr (EBV) gp340 o nucleoantígeno 3A, hemaglutinina, proteína de superficie exterior Borrelia burgdorferi (Osp) A, lipoproteína 38 kDA de micobacterium tuberculosis o Ag85, proteína externa Neisseria meningitides clase 1, virus Varicela zoster IE62 y gpl, proteína cápsida del virus de la rubeola, virus Hepatitis B pre SI ag, gluproteina G o gp D o CP27 del virus de Herpes simplex tipo I, glucoproteína E del virus de encefalitis Murray valley, virus VP1 de Hepatitis A, proteína cápsida de virus VP1, VP2 y VP3 de polio, proteína de superficie chlamydia trachomatis, envoltura del virus de la Hepatitis B Ag pre S2, cápsido (HRV) de rinovirus humano, oncogen de péptidos del virus papiloma E6 y E7, proteína de superficie Listeria, proteína de envoltura del virus Varicela, proteína de envoltura del virus de Vaccinia, proteína de superficie Brucella, una combinación de uno o más de dichos antígenos, una subunidad de aminoácido de dichos antígenos que comprenden cinco o más aminoácidos de longitud o combinaciones de una o más de tales subunidades.

Los antígenos también pueden consistir de células completas o sus fracciones subcelulares. Tales células o sus fracciones subcelulares se pueden derivar de cualquier tipo de tumor u otra fuente. Ejemplos de tipos de cáncer de los cuales las células completas o fracciones subcelulares se pueden derivar son cáncer de mama, bronquios-pulmones, páncreas y colon y melanoma. Algunos ejemplos adicionales de antígenos específicos obtenidos de tumores son antígeno específico a melanoma (por ejemplo, el antígeno de serie MAGE), antígeno de carcinoma embriónico (CEA) de colon y otros cánceres o antígenos efectivos de antígenos extraídos de cualquier tumor.

Se puede utilizar uno cualquiera o más de los antígenos listados anteriormente, y se puede utilizar en particular una cualquiera o más de las mucinas MUC1 humanas a MUC7 que, como se mencionó anteriormente, todas comprenden porciones centrales altamente repetitivas de secuencias de aminoácido repetidas que son altas en serina, treonina y prolina. En particular, las composiciones de esta invención pueden comprender un polipéptido de mucina humana (que contiene un número variable de repeticiones asociadas con variación alélica normal), o puede comprender una o más de las secuencias repetidas de mucina humana, preferiblemente dos a ocho, más preferiblemente dos a veinte y aún más preferiblemente dos a diez subunidades repetidas de mucina humana. La mucina humana y sus subunidades son preferiblemente no glucosiladas o glucosiladas aberrantemente con el fin de provocar una respuesta inmune a las mucinas encontradas en células neoplásicas que tienen una deficiencia en su recubrimiento de carbohidrato que conduce a la exposición del núcleo de la proteína. El uso de mucina humana MUC1 se prefiere particularmente aunque se entiende claramente que la invención se extiende al uso de cualquier antígeno y especialmente al uso de las mucinas humanas MUC1 a MUC7. Para el propósito de conveniencia, el término MUC luego de estos se utilizará para referirse a cualquiera de las mucinas humanas MUC1 a MUC7 y sus unidades repetidas. Mientras solo las mucinas humanas serán tratadas adelantes, se debe tener en mente que esta invención igualmente se relaciona con cualquier otro antígeno como se mencionó previamente.

Los fragmentos de MUC también se pueden conjugar con un polímero carbohidrato. Estos fragmentos pueden comprender cualquier porción de una molécula MUC que es capaz de conjugarse con un carbohidrato. Los fragmentos de una molécula MUC incluyen fragmentos de la secuencia de ocurrencia natural de una molécula MUC y/o una secuencia derivada de una molécula MUC pero que se modifica para mejorar la unión de la molécula MUC a una molécula MHC clase I. Métodos para imitar una molécula MUC incluyen métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, tal como síntesis de péptido o técnicas de ADN recombinante. Fragmentos preferidos de una molécula MUC comprenden péptidos de una molécula MUC. Un péptido preferido de molécula MUC es de aproximadamente cinco a aproximadamente veinte aminoácidos. Fragmentos preferidos de la molécula MUC comprenden regiones VNTR o no VNTR. Fragmentos más preferidos de una molécula MUC incluyen péptidos que tienen una secuencia de aminoácido que incluye APDTR (SEQ ID NO: 7), APDTRPAPG (SEQ ID NO: 8), DTRPAPGSTAPP (SEQ ID NO: 9), y similares. Para conveniencia de la descripción también se incluyen estos fragmentos con la definición MUC. De forma similar, otros fragmentos de antígeno que comprenden por lo menos cinco aminoácidos se pueden conjugar con un polímero carbohidrato.

Un antígeno puede formar parte de una proteína de fusión con el fin de facilitar la expresión y purificación en la producción de la proteína de fusión en células anfitrionas recombinantes. La porción sin antígeno de la proteína de fusión representaría generalmente la región de terminal N del polipéptido de fusión con las secuencias del terminal carboxi que comprenden las secuencias de antígeno. Las proteínas de fusión se pueden seleccionar de glutationa-S-transferasa, b-galactosidasa, o cualquier otra proteína o su parte, particularmente aquellas que capacitan la purificación de afinidad utilizando la unión o las características de afinidad de la proteína para purificar la proteína de fusión resultante. La proteína también se puede fusionar en el terminal C o terminal N de la proteína portadora. La naturaleza de la proteína de fusión dependerá del sistema de vector en el cual se producen las proteínas de fusión. Un ejemplo de un vector de expresión bacteriano es pGEX que en la subclonación de un gen de interés en su vector produce una proteína de fusión que consiste de glutationa-S-transferasa con la proteína de interés. Ejemplos de otros sistemas de vector que hacen surgir a las proteínas de fusión con una proteína de interés se describen en Sambrook et al., ibid. Estos se pueden incluir o dividir; si los que se incluyen pueden tener una función "portadora".

La proteína o proteína de fusión se puede expresar en un número de sistemas de expresión procarióticos (E. coli o b-subtilis) o eucarióticos (baculovirus, células CHO, células Cos o levadura). En alguno de estos sistemas, Por ejemplo, baculovirus o levadura, al introducir motivos de glucosilación en la proteína o proteína de fusión, la glucosilación rica en manosa puede ser adecuada; negando la necesidad de ligado químico con polímeros carbohidratos ricos en manosa. Se pueden utilizar estas proteínas de fusión novedosas con o sin oxidación de peryodato suave.

En una modalidad, un antígeno se conjuga con un polímero carbohidrato que comprende manosa. El número de unidades de monómero repetidas en el polímero manosa no es importante pero generalmente los polímeros manosa comprenderían por lo menos veinte unidades de monómero, preferiblemente en exceso de 100 unidades de monómero, más preferiblemente en exceso de 1000 unidades de monómero, y aún más preferiblemente en exceso de 10.000 unidades de monómero o más. Los polímeros manosa pueden ser una mezcla de cadenas de polisacárido de varios pesos moleculares. La porción de manosa de una composición de la presente invención puede comprender manosa o conformación y configuración de isómeros de manosa. Un polímero carbohidrato de la presente invención comprende manosa. Un polímero carbohidrato más preferido es un polímero de carbohidrato manosa. Un polímero carbohidrato aún más preferido es un polímero de manosa completamente oxidada y/o manosa parcialmente reducida que tiene aldehídos.

La manosa puede comprender una manosa oxidada tratada de tal manera que la manosa se reduce parcialmente. Una manosa preferida comprende una manosa oxidada tratada de tal manera que los grupos aldehído de la manosa no se reducen sustancialmente, y se reducen las bases Schiff predominantemente. Un reactivo adecuado para reducir parcialmente una manosa incluye, pero no se limita a, cianoborohidruro de sodio. Se entiende que otros reactivos adecuados para reducir parcialmente una manosa serán evidentes para aquellos expertos en la técnica y están destinados a estar abarcados aquí. El tratamiento de una manosa oxidada con cianoborohidruro de sodio, por ejemplo, grupos aldehídos retenidos mientras se reducen otros grupos, tal como bases Schiff. Sin ser ligado por la teoría, los presentes inventores consideran que los grupos aldehído expuestos y/o libres de una manosa oxidada son importantes para el suministro de la manosa y antígeno conjugado posiblemente al alterar la retoma, liberación, o pérdida de antígeno de los endosomas o lisosomas en el citoplasma. En una modalidad preferida, una manosa oxidada comprende unidades de manosa oxidada de un polímero manosa que comprende sustancialmente aldehídos libres. Se nota que un polímero manosa puede incluir manosa completamente oxidada o manan parcialmente reducido que tiene aldehídos. Se puede purificar manosa de fuentes naturales o sintetizadas de acuerdo con procedimientos convencionales. La manosa está disponible comercialmente de muchos proveedores.

Se pueden conjugar antígenos con un polímero manosa de acuerdo con procesos estándar bien conocidos en la técnica de la química de carbohidrato para la derivación y reacción de polisacáridos y monosacáridos. Se puede oxidar manosa con reactivos de oxidación convencionales tal como un peryodato, por ejemplo peryodato de sodio, para dar un polialdehído que luego se hace reaccionar directamente con el antígeno (tal como subunidades repetidas de MUC1) en donde los grupos amino funcionales en la cadena de proteína (tal como el grupo de lisina) reaccionan con los grupos aldehído que forman bases Schiff (Ver Fig. 14). Primero se pueden activar cadenas de polisacárido con bromuro cianógeno y el polisacárido activado luego se hace reaccionar con una diamina, seguido por la conjugación al antígeno para formar un conjugado que luego se puede oxidar opcionalmente. La manosa y el polipéptido se pueden derivar con agentes bifuncionales con el fin de reticular la manosa y el polipéptido. Agentes de reticulación comúnmente utilizados incluyen 1,1-bis (diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, ésteres inmino homobifuncionales que incluyen ésteres disuccinimidilo tal como 3,3'-ditiobis (succinimidil-propionato), y maleimidas bifuncionales tal como bis-N-maleimido-1,8-octano. Agentes derivantes tal como metil-3 [(p-azido-fenil)ditio]propioimidato produce intermedios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en la presencia de luz. Se puede hacer reaccionar manosa oxidada con derivados hidrazina de antígenos para dar un conjugado. Alternativamente, se puede hacer reaccionar manosa con reactivos tal como diimidazol carbonilo, que después de oxidación da el conjugado deseado. Tales métodos de conjugación y oxidación se han discutido previamente, por ejemplo, en la Solicitud PCT No. PCT/AU94/00789 (WO 95/18145), presentada en Diciembre 23, 1994. Se entiende que otros métodos de conjugación y oxidación de manosa serán evidentes para aquellos expertos en la técnica.

El acoplamiento de antígenos a manosa involucra convertir cualquiera o todos de los grupos funcionales en los grupos reactivos a manosa y después de esto hacer reaccionar los grupos reactivos en la manosa con grupos reactivos en el polipéptido. Los polímeros manosa están llenos con grupos hidroxilo, y algunos casos, grupos carboxilo (tal como en idruionato), grupos éster (tal como metilgalacturonato) y similare. Estos grupos se pueden activar de acuerdo con procedimientos químicos estándar. Por ejemplo, se pueden hacer reaccionar grupos hidroxilo con haluros de hidrógeno, tal como yoduro de hidrógeno, bromuro de hidrógeno y cloruro de hidrógeno para dar el polisacárido halogenado reactivo. Se pueden activar grupos hidroxi con trihaluros fosforosos, metales activos (tal como etóxido de sodio, isopropóxido de aluminio y terc-butoóxido de potasio), o se esterifica (con grupos tal como cloruro tosilo o ácido acético) para formar grupos reactivos que luego se pueden hacer reaccionar con grupos reactivas en el polipéptido para formar una o más uniones. Otros grupos funcionales en manosa aparte de los grupos hidroxilo se pueden activar para dar grupos reactivos de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica.

En una modalidad preferida de la presente invención, se proporciona una composición inmunorreguladora que comprende una población de células enriquecidas por receptor macrófago que lleva manosa y/o células de monocito, y un conjugado entre un polipéptido de mucina humana, una o más unidades repetidas o no repetidas de este, o un fragmento de las subunidades repetidas o no repetidas, con un polímero carbohidrato que comprende manosa oxidada. En particular, la composición inmunorreguladora comprende una población de células enriquecidas por el macrófago que lleva el receptor manosa y/o células de monocito que han sido puestas en contacto con GM-CSF, IL-3, IL-4, TNF gamma y/o vitamina D antes de ser combinado con el conjugado.

Las composiciones inmunorreguladoras de la presente invención se pueden formular en un portador farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de tales portadores incluyen agua, solución salina, solución Ringer, solución de dextrosa, solución Hank, y otras soluciones de balance fisiológicamente acuoso. También se pueden utilizar vehículos acuosos, tal como aceites fijos, aceite de sésamo, oleato de etilo, ortriglicéridos. Otras formulaciones útiles incluyen suspensiones que contienen agentes que mejoran la viscosidad, tal como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, o dextran. Los excipientes también pueden contener cantidades menores de aditivos, tal como sustancias que mejoran la isotonicidad y estabilidad química. Ejemplos de amortiguadores incluyen amortiguador de fosfato, amortiguador bicarbonato y amortiguador Tris, mientras los ejemplos de conservantes incluyen timerosal, m- o o-cresol, formalina y alcohol bencilo. Formulaciones estándar también pueden ser inyectables líquidos o sólidos que se ponen en una suspensión líquida adecuada o solución para inyección. Así, en una formulación no líquida, el portador puede comprender dextrosa, albúmina de suero humano, conservantes, etc., a los que se puede agregar agua estéril o solución salina antes de administración.

Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender adicionalmente immunopotenciadores, tal como adyuvantes o vehículos de suministro. Los adyuvantes son típicamente sustancias que mejoran generalmente la respuesta inmune de un animal a un antígeno específico. Los adyuvantes adecuados incluyen aquellos adyuvantes que se puede administrar a animales, en particular humanos. Los adyuvantes preferidos para uso con el compuesto inmunorregulador de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, sales basadas en aluminio; sales basadas en calcio; sílice; gamma interferón; IL-12 y otros adyuvantes disponibles comercialmente.

En otro aspecto, una composición inmunorreguladora es para administración a un paciente para protegerlo contra o tratar el paciente de varios estados de enfermedad. En particular, una composición inmunorreguladora de la presente invención es útil para tratar o prevenir el crecimiento de células anormales. Como se utiliza aquí, una célula anormal se refiere a una célula que exhibe la función biológica anormal, tal como crecimiento anormal, desarrollo o muerte. Las células anormales, preferiblemente incluyen células neoplásicas, células infectadas con un agente infeccioso (es decir, un patógeno) y células no cancerosas que tienen crecimiento proliferativo anormal (por ejemplo, sarcoidosis, enfermedad granulomatosa o papilomas) y con células neoplásicas y células infectadas. El crecimiento de células neoplásicas incluye, pero no se limita a, el crecimiento de tumores de tejidos secretores, tal como tumores de mama, colon, bronquios-pulmones, páncreas, próstata, y similares.

Algunos otros estados de enfermedad que se pueden proteger en esta forma incluyen, pero no se limitan a, alergias tipo I, malaria, VIH, caries dental, gripe, cólera, enfermedad de la boca y el pie, meningitis, infección Leishmania, Tosferina, rabia, infección por estreptococo, infección respiratoria, sarampión, enfermedad Lyme, tuberculosis, meningitis bacteriana, herpes zóster, rubeola, hepatitis, herpes, hepatitis A, polio, enfermedad venérea/tracoma, hepatitis B, resfriado común, cáncer cervical, meningitis/neumonitis, viruela aviar, viruela y neumonía/PUO.

Los animales se pueden inmunizar con una composición inmunorreguladora de la presente invención para proteger contra la formación de tumor de tejidos secretores. Alternativamente, los animales que sufren de tumores se pueden inmunizar con la composición inmunorreguladora de la presente invención como parte de un régimen terapéutico para el tratamiento de tumor. Por vía de ejemplo, para proteger a las mujeres del cáncer de mama, las mujeres se pueden inmunizar con la composición inmunorreguladora de la presente invención pre- o post-pubertad y pueden recibir una o más inyecciones, preferiblemente una inmunización inicial, seguido por una o más inyecciones de refuerzo separadas por varios meses a varios años. En un esquema de inmunización, las mujeres se pueden inmunizar con las composiciones de la invención y luego recibir una inmunización de refuerzo en intervalos apropiados. Luego se proporcionan las inmunizaciones de refuerzo adicionales en intervalos regulares. La ruta de inmunización no es diferente de la administración de vacuna humana convencional. De acuerdo con lo anterior, una composición inmunorreguladora de la presente invención se puede administrar subcutáneamente, intramuscularmente, oralmente, intravenosamente, y similares.

La cantidad de las composiciones de la presente invención suministradas a un animal no es crítica o limitante. Una cantidad efectiva de una composición de la invención es la que estimulará una respuesta inmune contra el componente de antígeno. La cantidad de las composiciones suministradas puede variar de acuerdo con el estado inmune de, animal (dependiendo de si el paciente es immunosuprimido o inmunoestimulado), el juicio del médico que atiende o veterinario si el compuesto se utiliza como un terapéutico para evitar o tratar un estado de enfermedad. Una dosis única adecuada es una dosis que es capaz de proteger un animal de, o tratar un animal con, una enfermedad particular cuando se administra una o más veces durante un periodo adecuado de tiempo. Por ejemplo, animales que reciben de aproximadamente 10^{5} a aproximadamente 10^{13} células en una composición de la presente invención, más preferiblemente de aproximadamente 10^{6} a aproximadamente 10^{12} y aún más preferiblemente de aproximadamente 10^{7} a aproximadamente 10^{11} en una composición de la presente invención.

Como se describió anteriormente, las composiciones de la presente invención se pueden administrar a los animales en conjunto con un adyuvante, tal como una citoquina u otro compuesto que mejora una respuesta inmune. Por vía de ejemplo, tales compuestos mejorados que se pueden administrar en conjunto con una composición de la presente invención que incluye uno o más de GM-CSF, G-CSF, M-CSF, TNFa o b, interferón gama o alfa, cualquiera de IL-1 a IL-18, o cualquier otra citoquina. El compuesto mejorado se puede administrar a un animal al mismo tiempo como una composición de la presente invención, opcionalmente como parte de una forma de administración de multicomponente. Alternativamente, el compuesto mejorado de y una composición de la presente invención se puede administrar en diferentes intervalos de tiempo seguido de la administración de una composición inmunorreguladora de la presente invención.

En otro aspecto de esta invención, se proporciona una composición inmunorreguladora de la presente invención para uso en inducir una respuesta inmune contra antígenos. La administración de una composición inmunorreguladora de la presente invención a un animal provoca una respuesta celular potenciada de células T activadas, en particular citotóxico a células que reaccionan con el componente de antígeno. Por vía de ejemplo, un animal se puede inmunizar contra tumores que expresan mucinas u otros determinantes antigénicos de tumor. Un beneficio potencial de esta invención parte del hecho que los animales se pueden proteger contra el cáncer antes de crecimiento de tumor, como una composición de la presente invención puede provocar una respuesta celular inmune de células T citotóxicas que matan las células de tumor que expresan mucina u otros determinantes antigénicos. Esta invención es particularmente aplicable a la inmunización contra tumores de tejido secretor, tal como adenocarcinomas, más particularmente, tumores de mama, ovario, páncreas, colon, bronquios-pulmones, próstata y similares.

Una modalidad de la presente invención incluye una composición inmunorreguladora que comprende células que llevan el receptor manosa y un conjugado que comprende un antígeno y manosa oxidada para uso en inducir una respuesta inmune. Una cantidad efectiva de una composición inmunorreguladora de la presente invención comprende una cantidad capaz de evitar o tratar una enfermedad como se describe aquí.

Los animales incluyen, pero no se limitan a, humanos, animales de compañía y animales de alimento, con humanos o monos siendo más preferidos, y humanos siendo más preferidos.

Otra modalidad de la presente invención es una composición inmunorreguladora que comprende células que llevan el receptor manosa y un conjugado que comprende un antígeno y manosa oxidada para uso en inducir una respuesta inmune contra cáncer. Cualquier antígeno descrito aquí es adecuado para uso con el método presente. Un antígeno preferido comprende un polipéptido mucina.

Una composición de la presente invención puede ser para administración como parte del tratamiento general para la erradicación del cáncer o solo. Si se administra como parte de un tratamiento general, una composición de la presente invención se puede administrar antes de, durante o después de otra forma de tratamiento. Por ejemplo, una composición de la presente invención se puede administrar a animales que sufren de cáncer antes o después de cirugía para remover células cancerosas. De forma similar, una composición de la presente invención se puede administrar antes o después de un régimen quimioterapéutico o de radiación seguido por excisión de tumor. Preferiblemente, una composición de la presente invención se administra en un tiempo cuando el sistema inmune de un animal está intacto tal que una célula que media la respuesta inmune se puede inducir en el animal. Como tal, una composición de la presente invención no se administra preferiblemente luego del tratamiento de extirpación inmune de un animal. Cuando se administra una composición inmunorreguladora de la presente invención a un animal que tiene un tumor, preferiblemente la composición se administra en o alrededor del sitio principal del tumor.

Una respuesta inmune se puede inducir por: (a) aislar una célula que lleva la población del receptor manosa de un animal; (b) poner en contacto las células con uno o más modificadores de la respuesta biológica para producir una población celular que lleva el receptor manosa mejorado; (c) combinar la población celular que lleva el receptor manosa mejorado con un conjugado de un antígeno y manosa oxidada para producir una población celular que lleva el receptor manosa inmunorregulador; y (d) administrar la célula inmunorreguladora que lleva la población del receptor manosa a un animal para inducir una respuesta inmune. Se describen aquí citoquinas y vitaminas preferidas para uso.

Un compuesto que comprende un conjugado entre el polipéptido de mucina humana, se puede utilizar una o más de sus subunidades repetidas, o un fragmento de dichas subunidades repetidas y un polímero manosa en el tratamiento de adenocarcinoma, particularmente cáncer de mama.

La invención descrita aquí no está restringida por la mucina humana MUC1. La invención se extiende claramente al uso de otras mucinas expresadas por células neoplásicas, así como también al uso de otros antígenos que en acoplamiento a los polisacáridos se pueden utilizar para provocar respuestas de célula T citotóxicas contra células de tumor, cuyos compuestos se pueden utilizar en vacunas para evitar la formación de tumor, así como también para el tratamiento de cáncer, y/o el tratamiento o profilaxis de otros estados de enfermedad como se mencionó anteriormente. Se conocen bien en la técnica una variedad de antígenos que corresponden a varias enfermedades y afecciones contra las cuales se desea se provoque una respuesta inmune, tales antígenos que son iguales se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

Un antígeno se puede suministrar a un animal que tiene anticuerpos preexistentes (es decir, anticuerpos naturales) que se unen al antígeno, que resulta en la provocación de una respuesta celular inmune al antígeno. Una de las ventajas de la presente invención es la capacidad para evitar la unión de conjugados mediante anticuerpos de ocurrencia natural (es decir, anticuerpos naturales) los cuales pueden ser capaces de unir al antígeno de interés, por lo tanto inducir preferencialmente una respuesta de anticuerpo sobre una respuesta celular inmune. Por ejemplo, en el caso del antígeno, mucina, los humanos tienen grandes cantidades de anticuerpos de ocurrencia natural, circulantes que se unen al péptido mucina. La especificidad de estos anticuerpos de ocurrencia natural se deriva principalmente contra un epítopo galactosa, pero estos anticuerpos reaccionan en forma cruzada con el péptido mucina. Así, cuando se inmuniza un paciente con el manan: mucina conjugada, los anticuerpos se unen presumiblemente al conjugado y se evita obtener las rutas presentadas de antígeno apropiado para inducir una respuesta celular inmune (por ejemplo, una respuesta CTL). Por lo tanto, la presente invención supera la inducción preferencial de una respuesta humoral (anticuerpo) al combinar células que llevan el receptor manosa con el antígeno: manosa conjugada ex vivo para evitar anticuerpos reactivos cruzados circulantes luego de la administración de una composición terapéutica de la presente invención a un animal. Cuando se introduce en un paciente, una respuesta celular inmune, y particularmente una respuesta CTL y/o Tl (TH1), se induce preferencialmente por las células presentes en un péptido antigénico del antígeno de interés. Una célula que lleva el receptor manosa que ha sido puesta en contacto con un conjugado que comprende antígeno y manosa oxidada, en el cual se puede utilizar las células que llevan el receptor manosa son capaces de presentar el antígeno a una célula T de tal manera que se provoca una respuesta de la célula T. Un antígeno preferido para uso es mucina.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para los propósitos de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1

Este ejemplo describe que objetivar el receptor manosa in vivo provoca Respuestas inmunes celulares T1.

A. Exposición in vitro de células de exudado peritoneal para manan-MUC1

Células de exudado peritoneal (PEC) se preparan como sigue. Se sacrifican ratones, se inyectan intreperitonealmente con 10 ml de solución salina amortiguada con fosfato (PBS), se masajean gentilmente y las células peritoneales se recolectan. Los PEC adherentes se preparan al colocar en placas aproximadamente 2 x 10^{6}/ml PEC en placas de tejido de cultivo y se incuban en aproximadamente 37ºC durante aproximadamente 16 a aproximadamente 24 horas. Las células PEC no adherentes se descargan con una pipeta y las células PEC adherentes se utilizan en los estudios descritos adelante.

Aproximadamente 4 x 10^{6} células PEC de ratones DBA/2 (H-2d), después de adherencia durante aproximadamente 16 a aproximadamente 24 horas, se ceban con 20 \mug/ml proteína de fusión MUC1-manan oxidada (ox-M-FP; se describe en detalle en Apostolopoulos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 10128-10132, 1995a y Apostolopoulos et al., J. Immunol., 155: 5089-5094, 1995b), proteína de fusión MUC1-manan reducida (rojo-M-FP), o proteína de fusión MUC1 no tratada (FP; que contiene un péptido de 10^{5} aminoácidos que contiene 5 repeticiones VNTR fusionadas a glutationa-S-transferasa, como se describe en detalle en Apostolopoulos et al., Br.J. Cancer, 67: 713-720, 1993) o manan-oxglutationa-S-transferasa (M-GST; se describe en detalle en Apostolopoulos et al., ibid., 1993). Cada grupo de células cebadas se transfieren mediante inyección intraperitoneal en ratones DBA/2.

Los ratones luego se prueban para una respuesta (CTL) de célula T citotóxica al medir las frecuencias del precursor CTL (CTLp) como sigue. Las frecuencias CTLp se determinan utilizando un mínimo de 32 replicas de por lo menos 6 dosis de células efectoras al cultivar las células en Bandejas de microtítulo de fondo en U, con aproximadamente 2 a aproximadamente 5 x 10^{5}. Las células de bazo de estimulador DBA/2 se tratan con mitomicina C en una dosis de aproximadamente 25 \mug/ml durante aproximadamente 1 a aproximadamente 1.5 horas, medio Eagle modificado de Dulbeco que contiene 10% de suero de becerro fetal, 5 mM de péptido MUC1 sintético (que consiste de 2 Repeticiones VNTR; como se describe en Apostolopoulos et al., ibid., 1995a) y aproximadamente 10 U/ml de IL-2 humano recombinante. Siete días después, cada microcultivo se ensaya para citotoxicidad al reemplazar 100 \mul del medio de cultivo con 100 ml de la suspensión celular objetivo que contiene aproximadamente 10^{4} células objetivo de tumor ^{51}Cr- MUC1 marcado+P815 (las células P815 se transfieren con un c ADN que codifica MUC1 humano; un obsequio obtenido del Dr. B. Acres, Transgene, Strasbourg, Francia). Los cultivos con células que tienen actividad citotóxica se identifican mediante liberación ^{51}Cr de aproximadamente 3 desviaciones estándar por encima del isotipo medio libre obtenido de aproximadamente 10^{4} células objetivo agregadas a células que responden al tratamiento cultivadas solas, o con células estimuladoras y IL-2 recombinante pero sin el péptido sintético MUC1. Una relación lineal existe entre la dosis de las células que responden, representado en una escala lineal, y la frecuencia de pozos negativos a una escala logarítmica; las frecuencias CTLp se determinan como la inversa de la dosis de la célula que responde requerida para generar 37% de pozos negativas.

Con referencia a Fig. 1, los resultados indican que la frecuencia CTLp obtenida siguiendo una inmunización única con el pulso PEC in vitro con Ox-M-FP es aproximadamente el mismo (1/7,000) como aquella obtenida después de 3 inmunizaciones in vivo la forma proteinácea libre de célula de Ox-M-FP. Una inyección única de Pulso PEC in vitro con rojo-M-FP o FP genera la frecuencia CTLp de 1/28,000 y 1/29,600, respectivamente. Tres inyecciones intraperitoneales de rojo-M-FP o FP da las frecuencias CTLp de 1/89,000 y 1/87,500 respectivamente. Las células cebadas con M-GST dan una frecuencia de 1/800,000. En todos los casos la respuesta es MUC1 específica debido a que las células objetivo P815 no transfectadas no se lisan. Tomados juntos, los resultados indican que ox-M-FP, suministrado por múltiples inyecciones de la proteína de fusión o por una inyección única de los pulsos PEC in vitro con ox-M-FP, estimula una respuesta CTL mayor que el rojo-M-FP o FP solo suministrado por la ruta. La presencia de manosa en el rojo-M-FP no proporciona ventaja selectiva (comparado con FP no tratado) cuando se suministra in vivo como una proteína de fusión. El objetivo de rojo-M-FP o FP para el receptor manosa mediante pulso in vitro de los PEC con estas proteínas y luego utilizando estas células para inmunización, sin embargo, es más efectivo provocar CTLp (frecuencia aprox 1/28,000 para ambos) que la inyección de estas proteínas de fusión (1/80,000 para ambos). Así, los PEC de pulso in vitro con Ox-M-FP (y por lo tanto el objetivo para el receptor manosa) da una mejor respuesta CTL que los PEC de pulso in vitro con rojo-M-FP o FP. En adición, la inyección de la proteína de fusión Ox-M-FP, pero no de rojo-M-FP o FP, mejora la frecuencia CTLp. Finalmente, el pulso de los PEC con rojo-M-FP o FP in vitro mejora la generación de CTLp comparado con la inyección in vivo de estas proteínas.

Con referencia a Fig. 2, una respuesta de dosis del número de los PEC sensibles in vitro inyectados, indican que el número mínimo de los PEC requeridos para mejorar la frecuencia CTLp es 10^{4} células. 10^{4} células da una frecuencia CTLp (1/10,200), no sustancialmente diferente de la obtenida con 400 veces más células (4 x 10^{6} células; Frecuencia CTLp 1/4,000). Así, un número mayor de 10^{4} PEC transfectados, la frecuencia CTLp no es dependiente de dosis en el número de células transfectadas y es similar en el rango de 10^{4}-4 x 10^{6} células. Cuando se transfieren 10^{3} células, la frecuencia CTLp cae a 1/44,000.B.

B. Ratones inmunizados con los PEC de pulso in vitro que se protegen de una inoculación de tumor

Para examinar la capacidad de los PEC sensibles para provocar respuestas protectoras contra inoculación de tumor, los grupos de 5 ratones DBA/2 se inyectan una vez con ox-M-FP, o los PEC pulso ox-M-FP, o con los PEC sin pulso, y luego se inoculan con 5 x 10^{6} células MUC1+P815. Con referencia a Fig. 3, los resultados indican que no hay crecimiento de tumor detectable en ninguno de los cinco ratones inmunizados con los PEC cebados con M-FP oxidado. Por el contrario, tres de los cinco ratones inmunizados una vez con M-FP oxidado desarrolló tumores y cinco de los cinco ratones inmunizados una vez con PEC sin pulso desarrollaron tumores.

Así, los PEC derivados de la cavidad peritoneal de los ratones y cultivados in vitro con M-FP oxidado puede, después de adoptar transferencia, procesar eficientemente y presentar un antígeno MUC1, que conduce a la generación de alta frecuencia de los CTL, y proteger contra una inoculación de tumor posterior.

C. Estudios de unión de M-FP reducido y oxidado

Se desarrollan experimentos para analizar la unión de las diferentes formas manan para diferentes tipos de tejidos, líneas celulares, células y receptores. La Tabla 1 resume los resultados de tales estudios de unión.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Estudios de unión de manan, manan oxidado o manan reducido (FITC marcado)

1

1. Líneas celulares

El manan oxidado o reducido conjugado con isotiocianato fluoresceina (FITC disponible de Sigma, St. Louis, MO; se describe en detalle en Apostolopoulos et al., ibid., 1995a) se mezclan con varios tipos de células utilizando métodos generalmente descritos en Apostolopoulos et al., ibid., 1995a. El FITC conjugado reducido, u oxidado, el manan une a las siguientes líneas celulares: células 3T3 (fibroblasto), células P815 (mastocitoma), células NS1 y Sultan (líneas celulares B), células EL-4, células RMA, células E3 y células CEM (líneas celulares T), células MM200 (melanoma), células COS y células BHK (líneas celulares de riñón). El FITC conjugado reducido, y el FITC conjugado oxidado, el manan une a las células J774 (línea celular macrófago, obtenido como un obsequio del Dr. P. Ricciardi-Castagnoli, Milan, Italia). La unión al línea celular dendrítico, D2SC/1, es negativo con manan-FITC oxidado y muy débil con manan-FITC reducido (Tabla 1).

Se desarrollan estudios de inhibición utilizando carbohidratos para inhibir la unión de manosa conjugada oxidada o reducida con FITC; para células J774. La unión de manan-FITC oxidado a células J774 se inhibe por manan, D-manosa, L-fucosa y N-acetilglucosamina mientras que la unión de manan-FITC reducido se inhibe por manan, D-manosa, L-fucosa y N-acetilgalactosamina; no inhibe otros azúcares (glucosa, D-fucosa y galactosa) (Tabla 1).La capacidad de estos azúcares para inhibir la unión del manan conjugado FITC formado es indicador de su unión al receptor manosa.

2. Tejidos

El manan-FITC reducido y oxidado se inyectan a los ratones intraperitonealmente y después de 1 hora los órganos se fijan en 4% de paraformaldehído y se analizan mediante microscopio confocal utilizando métodos estándar. El material reducido y oxidado se encuentra en el hígado en donde el teñido que está alrededor de los senos que es rico en células Kuppfer; en el bazo en donde el teñido que está alrededor de la pulpa blanca y en la pulpa roja en donde el teñido está con macrófagos de zona marginal. Los resultados se resumen en la Tabla 1.

3. Receptores

Células COS transfectadas con una molécula de ácido nucleico que codifica el receptor manosa se mezclan con rojo-M-FP o ox-M-FP bajo condiciones que permiten la unión del M-FP al receptor manosa. La unión de M-FP al receptor manosa se confirma al disolver complejo M-FP con el receptor mediante gel SDS-PAGE, transferir la proteína separada en el gel y disolver las bandas por Western blot utilizando un anticuerpo que une específicamente al receptor manosa. Estos resultados indican que el rojo-M-FP y ox-M-FP también se unen al receptor manosa.

4. Caracterización de PEC

Los marcadores de superficie celular utilizados para definir los macrófagos y las células dendríticas son F4/80, 33D1 y NLDC-145. Los macrófagos de clasifican como F4/80+33D1- y las células dendríticas se clasifican como F4/80-33D1+. Los PEC adherentes se analizan por citometría de flujo como sigue. Los PEC adherentes se tiñen utilizando técnicas estándar con anticuerpo F4/80 (un anticuerpo monoclonal antiratón de rata que detecta macrófagos pero no células dendríticas; descrito en Austyn et al., Eur.J. Immunol., 11: 805-812, 1981 y Nussenzweig et al., J. Exp. Med., 154: 168-179, 1981); anticuerpo 33D1 (un anticuerpo monoclonal antiratón de rata que reacciona con células dendríticas de ratón pero no con macrófagos; descrito en Steinman, et al.,J. Exp. Med., 157: 613-627, 1983); y anticuerpo NLDC-145 (un anticuerpo monoclonal antiratón de rata que detecta la molécula DEC-205 en las células dendríticas, que está ausente de macrófagos; descrito en Swiggard, et al., Cell. Immunol., 165:302-11, 1995 y proporcionado como un obsequio por el Dr. Derek Hart, Christchurch Hospital, Christchurch, New Zealand). Las células teñidas se disuelven mediante citometría de flujo utilizando métodos estándar. Para estudios serológicos; aproximadamente 100 \mul de cada anticuerpo se agrega a aproximadamente 2 x 10^{5} células PEC y se incuba durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 4ºC. Las células se lavan tres veces con aproximadamente 5 ml de PBS. Aproximadamente 100 \mul de una dilución 1:50 de inmunoglobulina anti-ratón de oveja conjugada con FITC (Fab')_{2} (disponible de Silenus, Australia) se agrega a cada muestra y se incuba durante aproximadamente 45 minutos a aproximadamente 4ºC. Las células se lavan de nuevo y luego se analizan mediante citometría de flujo, utilizando un citómetro de flujo FACScan.

Los resultados se resumen en la Tabla 2 e indican que aproximadamente 75% De los PEC adherentes son F4/80^{+}; aproximadamente30% son NLDC-145^{+} y aproximadamente 33% son 33D1^{+}. Aproximadamente 5% de los PEC adherentes son doblemente positivos (F4/80^{+} 33D1^{+}).

TABLA 2 Fenotipo de células mediante citometría de flujo

3

Una población de los PEC adherentes luego se separan utilizando Dynabeads^{TM} en dos poblaciones. Una población (macrófago enriquecido) está comprendido de aproximadamente 80% F4/80^{+}, aproximadamente 13% 33D1^{+}, aproximadamente 14% F4/80 33D1. La segunda población (células dendrítica enriquecida) es aproximadamente 3% F4/80^{+}, aproximadamente 85% 33D1^{+} y aproximadamente 3% F4/80-33D1- (ver Tabla 2). El método utilizado para derivar estas dos poblaciones es como sigue: Dynabeads (M-450) que se cubre con el anticuerpo para el IgG antirata de oveja, se mezclan con dos anticuerpos monoclonales de rata, F4/80 o 33D1, durante 3 horas a 4ºC. Estos Dynabeads tratados luego se agregan separadamente a 10^{7} PEC y se mezclan durante 30 minutos a 4ºC. Las células que se une al anticuerpo recubierto de Dynabeads se remueven con un magneto y las células que no se unen al Dynabeads se recolectan para estudio adicional. Una muestra de estas células que no se unen a las Dynabeads se prueba mediante citometría de flujo por la capacidad de unir al anticuerpo F4/80 o 33D1. El resto de las células que no se unen a los Dynabeads luego se incuban con ox-M-FP durante 16 a 24 horas y se transfieren adoptivamente en el peritoneo de los ratones singénicos utilizando el método descrito anteriormente en la sección A (Ver siguiente ejemplo).

Las poblaciones enriquecidas de macrófago (33D1^{-}) y células dendríticas (F4/80) descritas inmediatamente anteriores se caracterizan adicionalmente por la expresión del receptor manosa mediante citometría de flujo utilizando manan-FITC, manan-FITC oxidado o manan-FITC reducido. Aproximadamente 100 \mul de cada conjugado FITC se agrega a aproximadamente 2 x 10^{5} poblaciones enriquecidas por células dendríticas o macrófagos y se incuba durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 4ºC. Las células se lavan tres veces con aproximadamente .5 ml de PBS. Las células se analizan mediante citometría de flujo, utilizando un citómetro de flujo FACScan. Con referencia a la Tabla 2, aproximadamente 46% de las células en la población F4/80+33D1 se tiñen con manan-FITC y 58% de las células en esta población une al anticuerpo manan-FITC y F4/80. La población F4/80-33D1^{+} no une al manan-FITC (5% o menos, que es el número de células positivas en la muestra que recibe PBS). Aproximadamente 52% de la población F4/80^{+} teñida con M-FITC reducido (65% de las células en esta población une al anticuerpo manan-FITC reducido y F4/80). De nuevo la población celular 33D1^{+} no se une al manan-FITC reducido. Aproximadamente 70% de la población F4/80^{+} teñida con M-FITC oxidado y 58% de las células en esta población une al manan-FITC oxidado y al anticuerpo F4/80. De nuevo la población celular 33D1^{+} no une al manan-FITC oxidado. Así, ambas formas de manan
(reducido y oxidado) se une a los macrófagos pero no a las células dendríticas, con la mejor unión de material oxidado.

5. Determinación del papel preferencial de los macrófagos y células dendríticas en la población PEC

El PEC se separa en dos poblaciones que contienen 80% F4/80+33D1^{-} células de macrófago enriquecidas y 85% F4/80-33D1^{+} células dendríticas utilizando los anticuerpos F4/80 o 33D1 y Dynabeads como se describió anteriormente en la sección D. Las poblaciones de célula dendrítica y macrófago separado se cultivan separadamente in vitro con aproximadamente 20 \mug de MFP durante aproximadamente 16 a aproximadamente 24 horas. Una población PEC no fraccionada se cultiva de forma similar. Las poblaciones celulares luego se inyectan intreperitonealmente en ratones separados y las frecuencias CTLp específicas MUC1 se determinan utilizando los métodos descritos generalmente en la sección anterior A.

TABLA 3 CTLp en ratones inmunizados con células transferidas adoptivamente

4

Con referencia a la Tabla 3, los resultados indican que la inyección de 10^{6} PEC de pulso in vitro produce una frecuencia CTLp de 1/11,000. De forma similar, 6 x 10^{5} macrófagos de pulso produce una frecuencia CTLp de 1/15,000 mientras que 2 x 10^{5} células dendríticas producen una frecuencia CTLp de 1/64,000. Así, el receptor manosa positivo, F4/80+ macrófagos son principalmente responsables por el incremento en la Frecuencia CTLp. Las células dendríticas, que son receptor manosa negativo, son menos efectivas para mejorar la frecuencia CTLp.

En el experimento anterior el número de macrófagos inyectados (6 x 10^{5}) es diferente del número de células dendríticas inyectadas (2 x 10^{5}). Una comparación se hace posteriormente utilizando la misma dosis (2 x 10^{5}) de cada uno de los tipos celulares. Las poblaciones celulares dendríticas y de macrófago se preparan como se describió anteriormente y se inyectan a los ratones. Aproximadamente 2 x 10^{5} macrófagos y aproximadamente 2 x 10^{5} células dendríticas se inyectan en ratones separados y se determina la frecuencia CTL específica MUC1. La inyección de los macrófagos produce una frecuencia CTLp de 1/13,000 mientras que la inyección de las células dendríticas produce una frecuencia CTLp de 1/65,000 (ver Tabla 3). Así, los macrófagos son las células efectoras principales para generar alta frecuencia CTLp cuando los ratones reciben las células de pulso in vitro con ox-M-FP.

El papel de las células dendríticas en la presentación del antígeno MUC1 también se determina al inmunizar ratones BALB/c una vez con aproximadamente 10^{6} J774 células de pulso in vitro con ox-M-FP durante 16 a 24 horas. Las células J774 células producen una frecuencia CTLp de 1/33,000 (ver Tabla 3). Ratones BALB/c también se inmunizan una vez con células D2SC/1 (línea celular dendrítico) de pulso con ox-M-FP durante 16 a 24 horas. La inyección de células D2SC/1 produce una frecuencia CTLp de 1/130,000 (ver Tabla 3). Estos resultados demuestran que el pulso de macrófagos con ox-M-FP son más efectivos que el pulso de células dendríticas con ox-MFPat que incrementa la frecuencia CTLp.

6. Efecto de GM-CSF en las respuestas inmunes generadas con Pulso PEC con ox-M-FP

Se aíslan PEC de ratones, adheridos a plástico, pulso con M-FP oxidado y se incuban con GMCSF (aproximadamente 10 ng/ml) o con gamma interferón durante aproximadamente 3 horas, in vitro. Algunas células se incuban con ox-M-FP durante aproximadamente 3 horas en la ausencia de citoquina. Con referencia a Fig. 4, las células luego se transfieren ar ratones sin tratamiento previo separados. Se transfiere de células tratadas GM-CSF que producen una frecuencia CTLp de 1/2,500. Se transfiere de las células no tratadas que no producen una frecuencia CTLp de 1/7,000. Por el contrario, se transfiere de células tratadas con gamma interferón que produce un CTLp de 1/9,000.

En otro estudio, los PEC se aíslan de ratones, adheridos a plástico y pulso con ox-M-FP. Las células de pulso luego se inyectan en ratones GM-CSF o/o (ratones que carecen de GM-CSF producidos por recombinación homóloga; obtenidos del Dr. Ashley Dunn), ratones G-CSF o/o (ratones que carecen de G-CSF producidos por recombinación homóloga; obtenida del Dr. Ashley Dunn) o ratones tipo intacto. Este proceso se repite para un total de tres inyecciones para cada ratón. Con referencia a Fig. 5, los resultados indican que transferir de los PEC aislados de ratones tipo intacto produce una frecuencia CTLp de 1/8,000 en ratones tipo intacto, 1/16,000 en ratones G-CSF o/o y 1/32,000 en ratones GM-CSF o/o. Los ratones GM-CSF o/o se inmunizan adicionalmente con M-FP y también dan GM-CSF. La frecuencia CTLp presente en estos ratones se incrementa a 1/16,000. Así, la respuesta CTLp al pulso de los PEC in vitro con ox-M-FP es parcialmente GM-CSF dependiente y se puede argumentar por GM-CSF.

En otro estudio, ratones tipo intacto se inyectan intreperitonealmente con 1 \mug de GM-CSF recombinante por día durante 2, 3, 4, 5, o 6 días. Los PEC se aíslan d estos ratones, se cuentan y se tiñen utilizando anticuerpos F4/80 o 33D1 y métodos estándar. Se detectan luego células teñidas mediante citometría de flujo utilizando métodos estándar. Se aíslan aproximadamente 10^{6} células PEC/ratón residentes después de un día (1 inyección). Aproximadamente 9.6 x 10^{6} macrófagos (F4/80 + células) se obtienen después de 2 días (2 inyecciones), aproximadamente 1.2 x 10^{7} macrófagos después 3 días (3 inyecciones), y aproximadamente 2 x 10^{7} macrófagos después de 4 a 6 días (4 a 6 inyecciones). Cuatro días de inyecciones GM-CSF son óptimos para aislar el mayor número de macrófagos. Un grupo de ratones luego se inyectan con 1 \mug de GM-CSF recombinante por día durante 4 días. En el quinto día, una inyección única de ox-M-FP luego se administra a estos ratones así como también a un grupo de ratones que no han sido tratados GM-CSF. Con referencia a Fig. 6, los ratones que luego se tratan con GM-CSF y luego reciben una inyección de ox-M-FP tienen una Frecuencia CTLp de 1/9,900. Los ratones que no recibieron GM-CSF, pero que se les da una inyección de ox-M-FP tienen una frecuencia CTLp de 1/45,000. Así la respuesta CTLp a la inyección de la proteína Ox-M-FP puede mejorar la administración de GM-CSF.

7. Transferencia de macrófagos semihalogénicos en ratones

Se aíslan macrófagos de ratones DBA/2 se pulsan, o no se pulsan, con ox-M-FP como se describió anteriormente. Las dos poblaciones celulares luego se inyectan separadamente en ratones DBA/2, C57BL/& o (DBA/2 x C57BL/6)F1. Con referencia a Fig. 7, la inyección de los macrófagos de pulso en ratones DBA/2 produce una frecuencia CTLp de 1/8,000; la inyección de los macrófagos de pulso en ratones C57BL/6 produce una frecuencia CTLp de 1/220,000; y la inyección de los macrófagos de pulso en ratones (DBA/2 x C57BL/6)F1 produce una frecuencia CTLp de 1/10,000. Se inyectan ratones sin macrófagos de pulso que tienen una frecuencia CTLp de <1/10^{6}. Los mismos métodos descritos anteriormente se repiten, excepto que los PEC se aíslan de ratones (DBA/2 x C57BL/6)F1 y, siguiendo pulso con ox-M-FP, se inyectan en ratones C57BL/6 o DBA/2. Se transfiere el ox-M-FP de los PEC de pulso de ratones (DBA/2 x C57BL/6)F1 en ratones C57BL/6 o DBA/2 que produce una alta frecuencia CTLp. Así la respuesta inmune se puede transferir semi-halogénicamente (es decir cuando se comparte un haplotipo).

Tomados juntos, los resultados descritos en las secciones A a G indican que cultivar células de macrófago con ox-M-FP, y transfir adoptivamente las células a ratones singénicos, que induce una respuesta CTL específica a MUC1. En adición, una inmunización de pulso de macrófagos con M-FP oxidado conduce a la protección de tumores MUC1^{+}. La única inmunización con pulso de macrófagos in vitro con ox-M-FP proporciona un incremento en CTLp equivalente al que confiere mediante tres inmunizaciones con la proteína de fusión ox-M-FP. Así, el receptor manosa objetivo mediante pulso in vitro con ox-M-FP, provoca a respuestas celulares inmunes T1.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe la comparación entre agentes de reducción borohidruro de sodio y cianoborohidruro de sodio.

Se prepara Ox-M-FP como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. Se preparan tres muestras diferentes como sigue. Una porción de ox-M-FP se combina con 0.5 mg/mililitro (ml) de borohidruro de sodio para reducir bases Schiff y aldehídos. Otra porción de ox-M-FP se combina con 0.5 mg/ml de cianoborohidruro de sodio para reducir predominantemente solo bases Schiff. Una tercera porción permanece no tratada. Cinco \mug de cada una de las tres muestras se inyectan en ratones separados. Las frecuencias citotóxicas de célula T (CTLp) se determinan utilizando los métodos generalmente descritos anteriormente en el Ejemplo 1.

Los resultados indican que la frecuencia CTLp inducida por ox-M-FP tratado con cianoborohidruro de sodio es 1/10,300. La frecuencia CTLp inducida por ox-M-FP tratada con borohidruro de sodio es 1/79,500. La frecuencia CTLp inducida por el ox-M-FP no tratado es 1/14,575. Tomados juntos, los resultados indican que los grupos aldehído en ox-MFP son importantes para inducción CTL.

Ejemplo 3

Este ejemplo describe el efecto de cultivar células mononucleares de sangre periférica con GM-CSF, IL-3 y vitamina D.

Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aíslan de un donante humano normal utilizando métodos estándar. El PBMC frescamente asilado se cultiva en placas de plato de cultivo de tejido de 6 pozos estándar en medio AIM-V libre de suero en una densidad de 10 x 10^{6} células por 2 ml de medio por pozo, durante 2 horas. Siguiendo la etapa de incubación, células no adherentes se remueven de los pozos. Aproximadamente 2 ml del medio AIM-V libre de suero fresco que contiene 1 nanograma por ml (ng/ml) GMCSF, 10 ng/ml de IL-3, 10 ng/ml IL-4, 50 ng/ml alfa TNF y 50 nM vitamina D se agrega a cada pozo. Las células se incuban durante 2, 4 y 7 días.

En cada punto de tiempo predeterminado, las células se recolectan y se analizan para la expresión del receptor manosa así como también el marcador de superficie celular que identifica monocitos, macrófagos y células dendríticas. Se determina la expresión mediante análisis FACS utilizando generalmente métodos descritos anteriormente en el Ejemplo 1. Los siguientes reactivos se utilizan en el análisis FACS: manan oxidado conjugado con fluoresceina (FITC) (ox-M-FITC; descrito en el Ejemplo 1); ficoeritrina (PE) conjugado con CD11b, PE conjugado con CD11c, PE conjugado con CD14, FITC conjugado con CD68, FITC conjugado con CD80, PE conjugado con CD86 y PE conjugado con CD54.

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Los resultados de los análisis FACS se describen adelante en la Tabla 4.

TABLA 4 Porcentaje de monocito, macrófago y células dendríticas después de activación con citoquina*

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El número mayor de células positivas del receptor se genera después de 2 días de cultivo Día 4 de la incubación. Esto se correlaciona bien con un incremento en las células que llevan CD54, CD80 y CD86 que representan marcadores de activación celular. Más adicionalmente son monocitos o macrófagos, pero no células dendríticas.

Ejemplo 4

Este ejemplo describe la unión de los anticuerpos a MUC1 y los anticuerpo Gal Gala (1,3) son de reactividad cruzada con Gala (1,3) Gal y MUC1, respectivamente.

Se analizan varios ratones para la presencia de anticuerpos que se unen específicamente a Gala (1,3) Gal o MUC1. El suero se obtiene de ratones normales, los ratones en los cuales el gen Gal se ha eliminado por recombinación homóloga (ratones gal o/o), y los ratones se inmunizan intraperitonealmente, tres veces con aproximadamente 5 \mug del péptido MUC1. La presencia de anticuerpos que se unen a MUC1 en este suero se determinan por su capacidad para unir a líneas celulares que expresaron (células BT-20 o células RMA-MUC1) o no expresaron (células ME272 o RMA) MUC1. La unión de anticuerpos de estas células se determina mediante análisis FACS utilizando métodos generalmente descritos en el Ejemplo 1.

Con referencia a Fig. 8, el suero de ratones normales no une a ninguno de los líneas celulares. El antisuero se eleva contra anticuerpos que contienen MUC1 que se unen a las células BT-20 (panel A de Fig. 8) y células RMA-MUC1 (panel C de Fig.8), pero que no se unen a ME272 (panel B de Fig. 8) o células RMA (panel D de Fig. 8).

Las células BT-20 y las células ME272 no expresan Gala (1,3) Gal, mientras que las células RMA-MUC1 y RMA expresan Gala (1,3) Gal. El suero de los anticuerpos naturales que contienen los ratones gal o/o para galactosa como se demuestra por reactividad con células BT-20 (MUC-gal+ células; panel A de Fig. 8) y células RMA-MUC1 (MUC+gal+) células (panel C de Fig. 8), débil en células RMA (MUC-gal+; panel D de Fig. 8) y células ME272 (MUC- gal-) son negativas. El suero de los anticuerpos que contienen los ratones gal o/o se unen más fuertemente a células RMA-MUC1, que difieren de las células RMA solo por la expresión de MUC1.

Tomados juntos, los resultados indican que la expresión de MUC1 mediante células RMA y la expresión de MUC1 en células BT-20 confieren reactividad con anticuerpos anti-gal presentes en los ratones gal o/o. Así, anticuerpos de ocurrencia natural en ratones gal o/o se hacen reaccionar con MUC1 y anticuerpos que surgen contra MUC1 se hacen reaccionar con Gala (1,3) Gal.

Ejemplo 5

Este ejemplo describe que animales que expresan Gala (1,3) Gal no tienen anticuerpos de ocurrencia natural para Gala (1,3) Gal y no producen anticuerpos que se unen a MUC1 cuando se inmunizan con manan-MUC1 oxidado.

Múltiples inmunizaciones de animales con aproximadamente 5 \mug ox-M-FP (descrito en el Ejemplo 1) se desarrollan en intervalos semanalmente y se dan en los siguientes sitios: intraperitonealmente en ratones; intramuscularmente en conejos y pollos; y en humanos y monos. El suero obtenido de los animales inmunizados se examina para la presencia de anticuerpos a MUC1 mediante inmunoensayo ligado a enzima (ELISA) utilizando el siguiente método. Una placa de microtítulo estándar se recubre con una solución 10 \mug/ml del péptido MUC1 (descrito anteriormente en el Ejemplo 1) en solución salina amortiguada con fosfato (PBS), durante aproximadamente 16 horas a 4ºC. El péptido no unido se remueve de la placa. La placa se lava utilizando métodos estándar. La placa luego se cubre con una solución 2% p/v de albúmina de suero bovino (BSA) durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 4ºC. Se remueve de la placa y la placa se lava utilizando métodos estándar. Aproximadamente 50 \mul de varias diluciones de suero de ratón, conejo, pollo, humano y mono se agregan a pozos separados en la placa cubierta y se incuban durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente. La placa luego se lava para remover los anticuerpos no unidos. La presencia de anticuerpos unidos a la placa de cada una de las especies de animal se detecta utilizando anticuerpos secundarios que incluyen anticuerpo de anti-ratón de oveja para detectar anticuerpos de ratones; el anticuerpo anticonejo para detectar anticuerpos de conejo; el anticuerpo de antipollo para detectar anticuerpos de pollo; anticuerpo anti-humano para detectar anticuerpos de humano; y anticuerpo de anti-mono para detectar anticuerpos de mono. Estos anticuerpos se agregan a la placa y la placa se incuba durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. La presencia del anticuerpo secundario unido a la placa se detecta utilizando aproximadamente 50 \mul de 0.03% 2,2'-azino-di (3)-etilbenztiazolinsulfonato (disponible de Amersham, U.K.), 02% de peróxido de hidrógeno en un aproximado. Amortiguador de citrato1 M, en aproximadamente pH 4. La reacción se desarrolla durante aproximadamente 10 a aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente y luego se lee la absorbancia en 405 nm utilizando un lector ELISA.

Con referencia a la Fig. 9, la inmunización de ratones normales C57BL/6 con ox-M-FP no provoca cualquier producción detectable de anticuerpos que se unen a MUC1 cuando se inmovilizan en la placa de microtítulo. Por el contrario, la inmunización de ratones gal o/o con ox-M-FP resulta en la producción de altos títulos, aproximadamente 10-4 dilución, de anticuerpos que se unen a MUC1. Los anticuerpos de ocurrencia natural a gal presentes en los ratones gal o/o reaccionan con MUC1 intacto o proteína de fusión MUC1 en la solución, pero no reacciona con el péptido sintético de MUC1 inmovilizado en la placa de microtítulo. Esto indica que la carencia de reactividad del suero pre-inmune de ratones gal o/o con inmobilizados con el péptido MUC1 (Fig. 9). En adición, varios otros animales que son negativos para Gala (1,3) Gal demuestran títulos altos para los anticuerpos que se unen a ox-M-FP (ver Tabla 5). Los conejos, que son negativos para Gala (1,3) Gal, no producen anticuerpos que se unen a MUC1. Así, los animales que son positivos para Gala (1,3) Gal (es decir, ratones y conejos), y no tienen anticuerpos pre-existentes que se unen a galactosa, no producen anticuerpos anti-MUC1 siguiendo la inmunización con ox-M-FP. En contraste, los animales que son negativos para galactosa (es decir, humanos, monos, pollos y ratones gal o/o), producen anticuerpos anti-MUC1 en respuesta a la inmunización con ox-M-FP.

TABLA 5 Respuestas inmunes generadas en diferentes especies inmunizadas con manan-MUC1

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Ejemplo 6

Este ejemplo describe que los animales que son positivos para Gala (1,3) Gal generan CTLp, diferente del anticuerpo, en respuesta a inmunización con manan-MUC1.

Ratones normales y ratones gal o/o se inyectan con ox-M-FP y las frecuencias CTLp resultantes se mide utilizando métodos descritos generalmente en el Ejemplo 1. Con referencia a Fig. 11, una a tres inyecciones de ratones normales con ox-M-FP producido por frecuencias CTLp de 1/70,000 y 1/10,000, respectivamente. Inyecciones similares en ratones gal o/o resulta en frecuencias CTLp de 1/200,000 (una inyección) y 1/60,000 (tres inyecciones). Ratones normales y ratones gal o/o también se inyecta de una forma similar con un péptido de control derivada de ovalbumina. La diferencia de la frecuencia CTLp en ratones normales y gal o/o que se observa utilizando ox-M-FP, no se observa utilizando u epitopo ovalbumina. Con referencia a Fig. 12, tres inmunizaciones de ratones normales o gal o/o con péptido ovalbumina conjugado con manan da frecuencias CTLp de 1/10,000 y 1/12,000, respectivamente. Por lo tanto, la respuesta CTLp reducida en ratones gal o/o es única para MUC1 y ratones gal o/o son capaces de monitorear las respuestas CTLp para otros antígenos. Los resultados indican que la respuesta de la frecuencia CTL a inmunización ox-M-FP es mayor en ratones normales comparado con ratones gal o/o. Estos resultados son opuestos a la producción de anticuerpo que resulta de lo descrito anteriormente en el Ejemplo 5.

En un estudio separado, se inmunizan monos con ox-M-FP en una forma similar como los ratones descritos anteriormente. Con referencia a la Tabla 5, monos inmunizados con ox-M-FP producen una respuesta de anticuerpo, pero no una respuesta CTLp. Este resultado es similar a aquel obtenido utilizando los ratones gal o/o.

Así, en especies en las cuales CTLp se puede medir, hay una correlación entre la ausencia de anticuerpos pre-existente para galactosa y el mejoramiento de las respuestas CTLp por inmunización con ox-M-FP.

Ejemplo 7

Este ejemplo describe que anticuerpos para reducir galactosa la apariencia del CTLp cuando se mezcla con ox-MFP antes de inmunización de un animal.

Ratones normales reciben una inyección única o tres inyecciones de mezcla de ox-M-FP o ox-M-FP con suero gal o/o que contiene anticuerpos anti-galactosa. Las frecuencias CTLp se obtienen para ratones inmunizados utilizando los métodos generalmente descritos en el Ejemplo 1. Con referencia a Fig. 11, los ratones que reciben una inyección única da una frecuencia CTLp de 1/62,000 cuando se inmuniza con ox-M-FP y 1/275,000 cuando se inmuniza con mezcla de ox-M-FP con suero gal o/o. De forma similar, las frecuencias CTLp para ratones inyectados tres veces es 1/8,000 para ox-M-FP y 1/59,000 para mezcla ox-M-FP con suero gal o/o. Así, La adición de anticuerpos anti-galactosa para ox-M-FP limita la generación de las frecuencias CTLp en ratones normales en el nivel observado en ratones gal o/o. En adición, la inyección de ratones normales con mezcla de ox-M-FP con suero gal o/o conduce a la producción de anticuerpo significativa (ver Tabla 5).

Ejemplo 8

Este ejemplo describe la inmunización de ratones normales y gal o/o con células de pulso de macrófago in vitro con ox-M-FP y la generación de CTLp, pero no el anticuerpo, en tales ratones.

Las células de macrófago se obtienen de ratones C57BL/6 utilizando los métodos descritos generalmente en el Ejemplo 1. Las células de macrófago se pulsan durante la noche durante la noche utilizando mezcla de ox-M-FP o ox-M-FP con suero gal o/o, utilizando los métodos descritos generalmente en el Ejemplo 1. Se inmunizan ratones normales y gal o/o con células de pulso de macrófago utilizando los métodos descritos generalmente con el Ejemplo 1.

Con referencia a Fig. 13, la inmunización de ratones gal o/o con los macrófagos de pulso provocan CTLp a un nivel esencialmente equivalente para ratones normales (1/11,500 y 1/8,000, respectivamente), pero no provocan una respuesta de anticuerpo detectable (ver Fig. 10). La inmunización de ratones con pulso de macrófagos con mezcla de ox-M-FP con suero gal o/o no provoca respuesta CTLp fuerte.

Mientras modalidades de la presente invención han sido descritas en detalle, es evidente que las modificaciones y adaptaciones de aquellas modalidades ocurrirán a aquellos expertos en la técnica. Se entiende expresamente, sin embargo, que tales modificaciones y adaptaciones están dentro del alcance de la presente invención, como se establece en las siguientes reivindicaciones.

<110> McKenzie,

\hskip1cm

Ian F.C.

\hskip1cm

Apostolopoulos,

\hskip1cm

VassoPietersz,

\hskip1cm

Geoffrey Allan

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<120> COMPOSICIONES PARA INMUNOTERAPIA Y SUS USOS

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<130> 4102-1-PCT

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<140> Aún no asignado

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<141> 1998-09-29

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<150> 60/060,594

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<151> 1997-09-29

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<160> 9

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<170> Patentin Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

8

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<210> 2

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

9

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<210> 3

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

10

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<210> 4

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

11

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<210> 5

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

\hskip1cm

12

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<210> 6

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

13

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<210> 7

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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14

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<210> 8

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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15

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<210> 9

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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16

Claims

1. Una composición inmunorreguladora que comprende células que llevan el receptor manosa aislado y un conjugado que comprende un antígeno y manosa seleccionado del grupo que consiste de manosa completamente oxidada y aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida, en donde dicha composición provoca una respuesta inmune mediada por célula contra dicho antígeno.

2. Una composición inmunorreguladora que comprende células que llevan el receptor manosa aislado y un conjugado que comprende un antígeno y manosa seleccionada del grupo que consiste de manosa completamente oxidada y aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida para uso en inducción una respuesta inmune.

3. La composición como se define en la reivindicación 2, en donde dicha respuesta inmune comprende una respuesta inmune mediada por célula.

4. La composición como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde dichas células que llevan el receptor manosa se combinan con dicho conjugado in vitro.

5. La composición como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde dichas células que llevan el receptor manosa se combinan con dicho conjugado ex vivo.

6. La composición como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde dichas células que llevan el receptor manosa comprenden células que han sido puestas en contacto con uno o más modificadores de la respuesta biológica.

7. La composición como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde dicha composición comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.

8. Una población celular que lleva el receptor manosa inmunorregulador para uso en provocar una respuesta inmune mediada por célula, en donde dicha población celular que lleva el receptor manosa inmunorregulador se deriva por un método que comprende:

a) cultivar células que llevan el receptor manosa in vitro o ex vivo con uno o más modificadores de la respuesta biológica para producir una población celular que lleva el receptor manosa mejorado; y

b) incubar dicha población celular que lleva el receptor manosa mejorado con un conjugado que comprende un antígeno y un polímero carbohidrato que comprende manosa seleccionado del grupo que consiste de manosa completamente oxidada y aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida, para obtener dicha población celular que lleva el receptor manosa inmunorregulador.

9. La población como se define en la reivindicación 8, en donde dicha etapa de cultivar se desarrolla de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 6 horas.

10. La población como se define en la reivindicación 8, en donde dicha etapa de cultivar se desarrolla durante aproximadamente 3 horas.

11. La población como se define en la reivindicación 8, en donde dicha etapa de incubar se desarrolla de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 30 horas.

12. La población como se define en la reivindicación 8, en donde dicha etapa de incubar se desarrolla de aproximadamente 16 horas a aproximadamente 24 horas.

13. La composición como se define en la reivindicación 6 o la población como se define en la reivindicación 8, en donde dichos modificadores de la respuesta biológica son capaces de inducir receptores manosa en una célula capaz de expresar dichos receptores manosa.

14. La composición como se define en la reivindicación 6 o la población como se define en la reivindicación 8, en donde dichos modificadores de la respuesta biológica se seleccionan del grupo que consiste de una citoquina y una vitamina.

15. La composición como se define en la reivindicación 6 o la población como se define en la reivindicación 8, en donde dichos modificadores de la respuesta biológica se seleccionan del grupo que consiste de GM-CSF, interleuquina-3, interleuquina-4, vitamina D, GM-CSF, MCSF, Ligando Flt-3 y alfa TNF.

16. Células que llevan el receptor manosa y un conjugado que comprende un antígeno y manosa seleccionado del grupo que consiste de manosa completamente oxidada y aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida para uso en la preparación de una composición inmunorreguladora para inducir una respuesta inmune.

17. La composición como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, la población como se define en la reivindicación 8, o las células que llevan el receptor manosa como se define en la reivindicación 16, en donde dichas células que llevan el receptor manosa se obtienen de un animal que coincide con MHC para dicho animal receptor.

18. La composición como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, la población como se define en la reivindicación 8, o las células que llevan el receptor manosa como se define en la reivindicación 16, en donde dichas células que llevan el receptor manosa se obtienen de un animal seleccionado del grupo que consiste de dicho animal receptor, un donante no relacionado de dicho animal receptor y uno relacionado de dicho animal receptor.

19. La composición como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, la población como se define en la reivindicación 8, o las células que llevan el receptor manosa como se define en la reivindicación 16, en donde dichas células que llevan el receptor manosa se derivan de una población celular seleccionada del grupo que consiste de leucocitos de sangre periférica, médula ósea, blastocitos, células de tumor, estromacitos, células peritoneales, células de ganglio linfático, bronquios-pulmones y bazo.

20. La composición como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, la población como se define en la reivindicación 8, o las células que llevan el receptor manosa como se define en la reivindicación 16, en donde dichas células que llevan el receptor manosa comprenden células que se enriquecen para las células seleccionadas del grupo que consiste de células de macrófago y células dendríticas.

21. La composición como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, la población como se define en la reivindicación 8, o las células que llevan el receptor manosa como se define en la reivindicación 16, en donde dichas células que llevan el receptor manosa comprenden células que expresan moléculas seleccionadas del grupo que consiste de receptor manosa, CD11b, CD14, CD68, CD80 y CD86.

22. La composición como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, la población como se define en la reivindicación 8, o las células que llevan el receptor manosa como se define en la reivindicación 16, en donde dicha manosa se selecciona del grupo que consiste de manosa y un isómero configuracional y conformacional de manosa.

23. La composición como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, la población como se define en la reivindicación 8, o las células que llevan el receptor manosa como se define en la reivindicación 16, en donde dicha manosa comprende un polímero carbohidrato que comprende de dos o más unidades de carbohidrato.

24. La composición como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, la población como se define en la reivindicación 8, o las células que llevan el receptor manosa como se define en la reivindicación 16, en donde dicha manosa es aldehído que tiene manosa parcialmente reducida.

25. La composición como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, la población como se define en la reivindicación 8, o las células que llevan el receptor manosa como se define en la reivindicación 16, en donde el antígeno es un antígeno de tumor.

26. La composición como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, la población como se define en la reivindicación 8, o las células que llevan el receptor manosa como se define en la reivindicación 16, en donde dicho antígeno se selecciona del grupo que consiste de nm23, p53,Her2/neu, MUC1, BRACA1, BRACA2, antígeno MAGE, CEA, ErB2, polen, núcleo del virus de la hepatitis C (HIV), E1, E2 y proteínas NS2, proteína Plasmodium faliciparum circumsporozoite, glucoproteína de desarrollo de HIV-gp120/160, proteína Ag de superficie de estreptococo, nucleoproteína influenza, infección de superficie hemaglutinin-neuraminidasa, subunidad pilin TcpA, proteína VP1, nucleoproteína LMCV, glucoproteína de superficie Leishmania principal (gp63), proteína de superficie Bordetella pertussis, proteína G del virus de la rabia, proteína M Estreptococo, proteínas F o G (RSV) del virus sincitial respiratorio, virus Epstein Barr (EBV) gp340 o nucleoantígeno 3A, hemaglutinina, proteína de superficie exterior Borrelia burgdorferi (Osp) A, lipoproteína 38 kDa de micobacteriotuberculosis o Ag85, proteína exterior clase 1 Neisseria meningitidis, virus Varicela zoster IE62 y gpI, proteína cápsida del virus de la rubeola, virus pre S1 ag de Hepatitis B, glucoproteína G o gp D del virus Herpes simplex tipo I o CP27, glucoproteína de virus E de encefálidos Murray valley, virus VP1 de Hepatitis A, polio, proteína cápsida de virus VP1, VP2 y VP3, proteína de superficie chlamydia trachomatis, Ag pre S2 que desarrolla el virus de la Hepatitis B, cápsido (HRV) de rinovirus humano, oncogen de péptidos del virus papiloma E6 y E7, proteína de superficie Listeria, proteína que desarrolla el virus de Varicela, proteína que desarrolla el virus de Vaccinia, proteína de superficie Brucella, una combinación de uno o más de dichos antígenos, una subunidad de aminoácido de dichos antígenos que comprende cinco o más aminoácidos en longitud o combinaciones de una o más de dichas subunidades.

27. La composición como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, la población como se define en la reivindicación 8, o las células que llevan el receptor manosa como se define en la reivindicación 16, en donde dicho antígeno es un polipéptido mucina, uno o más sus unidades repetidas de este, o un fragmento de dichas subunidades repetidas.

28. La composición como se define en la reivindicación 27, en donde dicha mucina es mucina humana.

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29. La composición como se define en la reivindicación 27, en donde dicho antígeno comprende dos a ocho copias de las subunidades repetidas de mucina humana.

30. La composición como se define en la reivindicación 27, en donde dicha una o más subunidades repetidas de dicha mucina comprenden parte de un polipéptido de fusión.

31. Un vehículo de suministro de antígeno mucina, que comprende una célula que lleva el receptor manosa aislado y como conjugado que comprende antígeno mucina y un polímero de carbohidratos que comprende manosa seleccionada del grupo que consiste de manosa completamente oxidada y aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida en donde dicho antígeno mucina suministra el vehículo que provoca una respuesta inmune mediada por célula contra dicha mucina.

32. Una célula que lleva el receptor manosa aislado puesto en contacto con un conjugado que comprende mucina y manosa seleccionada del grupo que consiste de manosa completamente oxidada y aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida para uso en inducir una respuesta inmune a la mucina.

33. Una célula que lleva el receptor manosa aislado que ha sido puesta en contacto con un conjugado que comprende mucina y manosa seleccionada del grupo que consiste de manosa completamente oxidada y aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida, en donde dicha célula que lleva el receptor manosa es capaz de presentar dicha mucina a una célula T de tal manera que se provoca una respuesta de dicha célula T, para uso en suministrar mucina a un animal que tiene anticuerpos naturales allí que se unen a mucina, para inducir preferidamente una respuesta celular inmune a mucina.

34 La composición, población, antígeno mucina que suministra el vehículo, o células que llevan el receptor manosa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 para uso como un medicamento.

35. Uso de la composición, población, antígeno mucina que suministra el vehículo, o células que llevan el receptor manosa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 para preparar un medicamento para inducir una respuesta inmune.

36. Una composición farmacéutica que comprende una composición, población, antígeno mucina que suministra el vehículo, o células que llevan el receptor manosa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 y un portador farmacéuticamente aceptable.

37. Una composición, población, antígeno mucina que suministra el vehículo, o células que llevan el receptor manosa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 y un portador farmacéuticamente aceptable para uso en preparar una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune.

38. Un método para obtener una población que comprende células inmunorreguladoras que llevan el receptor manosa para provocar una respuesta inmune mediada por célula contra un antígeno, dicho método comprende cultivar una población de células enriquecidas para células que llevan el receptor manosa con un conjugado que comprende un antígeno y manosa seleccionado del grupo que consiste de manosa completamente oxidada y aldehídos que tienen manosa parcialmente reducida, para obtener dichas células inmunorreguladoras que llevan el receptor manosa.

39. El método como se define en la reivindicación 38, en donde dicha etapa de cultivar se desarrolla ex vivo.

40. El método como se define en la reivindicación 38, en donde dicho método comprende adicionalmente incubar dicha población de células enriquecidas por células que llevan el receptor manosa en la presencia de uno o más modificadores de la respuesta biológica antes de dicha etapa de cultivo.

41. El método como se define en la reivindicación 40, en donde dichos modificadores de la respuesta biológica se seleccionan del grupo que consiste de GM-CSF, interleuquina-3, interleuquina-4, vitamina D, GM-CSF, M-CSF, Ligando Flt-3 y alfa TNF.

42. El método como se define en la reivindicación 38, en donde dicho antígeno es un antígeno de tumor.

43. El método como se define en la reivindicación 38, en donde dicho antígeno se selecciona del grupo que consiste de nm23, p53,Her2/neu, MUC1, BRACA1, BRACA2, antígeno MAGE, CEA, ErB2, polen, núcleo del virus de la hepatitis C (HIV), E1, E2 y proteínas NS2, proteína Plasmodium faliciparum circumsporozoite, glucoproteína de desarrollo de HIV-gp120/160, proteína Ag de superficie estreptococo, nucleoproteína influenza, infección de superficie hemaglutinin-neuraminidasa, subunidad pilin TcpA, proteína VP1, nucleoproteína LMCV, glucoproteína de superficie Leishmania principal (gp63), proteína de superficie Bordetella pertussis, proteína G del virus de la rabia, proteína M Estreptococo, proteínas F o G (RSV) del virus sincitial respiratorio, virus Epstein Barr (EBV) gp340 o nucleoantígeno 3A, hemaglutinina, proteína de superficie exterior Borrelia burgdorferi (Osp) A, lipoproteína 38 kDa de micobacteriotuberculosis o Ag85, proteína exterior clase 1 Neisseria meningitidis, virus Varicela zoster IE62 y gpI, proteína cápsida del virus de la rubeola, virus pre S1 ag de Hepatitis B, glucoproteína tipo I del virus Herpes simplex, Gor gp D o CP27, glucoproteína de virus E de encefálidos Murray valley, virus VP1 de Hepatitis A, polio proteína cápsida de virus VP1, VP2 y VP3, proteína de superficie chlamydia trachomatis, Ag pre S2 que desarrolla el virus de la Hepatitis B, cápsido (HRV) de rinovirus humano, oncogen de péptidos del virus papiloma E6 y E7, proteína de superficie Listeria, proteína que desarrolla en virus Varicela, proteína que desarrolla el virus de Vaccinia, proteína de superficie Brucella, una combinación de uno o más de dichos antígenos, una subunidad de aminoácido de dichos antígenos que comprenden cinco o más aminoácidos en longitud o combinaciones de una o más de dichas subunidades.

44. El método como se define en la reivindicación 38, en donde dicho antígeno comprende mucina.

45. El método como se define en la reivindicación 38, en donde dicho antígeno comprende mucina humana.

46. El método como se define en la reivindicación 38, en donde dicha manosa comprende un polímero carbohidrato que comprende de dos o más unidades de carbohidrato.

47. El método como se define en la reivindicación 38, en donde dicha manosa es aldehído que tiene manosa parcialmente reducida.

48. El método como se define en la reivindicación 38, en donde dichas células que llevan el receptor manosa se derivan de una población celular seleccionada del grupo que consiste de leucocitos de sangre periférica, médula ósea, blastocitos, células de tumor, estromacito, células peritoneales, células de ganglio linfático, bronquios-pulmones y bazo.

49. El método como se define en la reivindicación 38, en donde dichas células que llevan el receptor manosa comprenden células que se enriquecen por las células seleccionadas del grupo que consiste de células de macrófago y células dendríticas.

50. El método como se define en la reivindicación 38, en donde dichas células que llevan el receptor manosa comprenden células que expresan moléculas seleccionadas del grupo que consiste de receptor manosa, CD11b, CD14, CD68, CD80 y CD86.